MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA
ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ FYZIOLOGIE A IMUNOLOGIE ŽIVOČICHŮ
Úloha autofagie ve vývoji a terapii solidních nádorů Bakalářská práce
Petr Štěpka
Vedoucí práce: RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph. D.
Brno 2013
Bibliografický záznam Autor:
Petr Štěpka Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Úloha autofagie ve vývoji a terapii solidních nádorů
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie
Vedoucí práce:
RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph. D.
Akademický rok:
2012/2013
Počet stran:
36
Klíčová slova:
autofagie; solidní nádor; tlusté střevo; buněčná smrt, chemoterapie
Bibliographic Entry Author
Title of Thesis:
Petr Štěpka Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology The role of autophagy in the development and therapy of solid tumors
Degree programme:
Experimental Biology
Field of Study:
Special Biology
Supervisor:
RNDr. Alena Hyršlová Vaculová, Ph. D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
36
Keywords:
autophagy; solid tumor; colon, cell death, chemotherapy
Abstrakt Autofagie je evolučně konzervovaný proces zajišťující degradaci vnitrobuněčného materiálu a recyklaci rozložených molekul. Plní důležitou roli v řadě fyziologických i patologických dějů. Autofagie může pomáhat buňkám přežívat ve stresovém prostředí, nebo naopak přispívat k programované buněčné smrti druhého typu či ovlivňovat ostatní typy buněčné smrti. Její deregulace je častým jevem u nádorových onemocnění a v závislosti na okolnostech může vznik a růst nádorů potlačovat nebo podporovat. Cílené ovlivnění autofagie se proto nabízí jako důležitá strategie pro budoucí využití v protinádorové terapii. Zbývá objasnit, ve kterých případech může autofagie nádorovým buňkám pomáhat překonat stres vyvolaný působením chemoterapeutických látek a kdy může naopak přímo zprostředkovávat jejich smrt. V této práci jsou shrnuty základní molekulární mechanismy autofagie, možnosti její regulace a její úloha v modulaci citlivosti nádorových buněk k cytotoxickému působení chemoterapeutických látek.
Abstract Autophagy is an evolutionarily conserved process enabling the degradation of intracellular material and recycling of molecules. It plays an important role in regulation of various physiological and pathological processes. Autophagy can promote cell survival, induce type II programmed cell death or affect other types of cell death. Deregulation of autophagy is a common phenomenon in cancer and depending on the circumstances it can both suppress and promote formation and growth of tumours. Targeting autophagy therefore represents a challenging strategy for future application in anticancer therapy. Autophagy may not only help cancer cells to alleviate stress induced by chemotherapy, but also act as a direct mediator of cell death. This thesis summarizes basic molecular mechanisms of autophagy, possibilities of its regulation, and its role in modulation of cancer cell sensitivity to cytotoxic effects of selected chemotherapeutic agents.
Obsah
Úvod ........................................................................................................................................... 9 1
2
Autofagie ........................................................................................................................... 9 1.1
Druhy autofagie ........................................................................................................ 10
1.2
Průběh a regulace autofagie ...................................................................................... 10
1.3
Buněčná smrt spojená s autofagií ............................................................................. 15
Autofagie a nádorová onemocnění ................................................................................ 16 2.1 Autofagie indukovaná hypoxií ..................................................................................... 17 2.2 Autofagie indukovaná nedostatkem živin .................................................................... 18
3
Autofagie v různých fázích vývoje nádoru ................................................................... 19
4
Regulace autofagie proteinem p53 ................................................................................ 21 4.1 Indukce autofagie pomocí p53 ..................................................................................... 22 4.2 Inhibice autofagie pomocí p53 ..................................................................................... 22
5 Úloha autofagie v modulaci citlivosti nádorových buněk k cytotoxickému/cytostatickému působení chemoterapeutických látek ........................ 24 Závěr ........................................................................................................................................ 28 Seznam zkratek ......................................................................................................................... 29 Seznam použité literatury ......................................................................................................... 31
8
Úvod Během transformace zdravých buněk na maligní nádorové dochází k deregulaci celé řady mechanismů ovlivňujících jejich proliferaci, buněčný cyklus nebo apoptózu. Jedním z často pozměněných mechanismů je i autofagie. Autofagie je proces vedoucí k degradaci vnitrobuněčného materiálu, který má obrovský význam v udržování homeostázy organismu. Účastní se celé řady fyziologických i patologických dějů, může pomáhat buňkám přežívat ve stresovém prostředí, nebo naopak přispívat k programované buněčné smrti druhého typu či ovlivňovat ostatní typy buněčné smrti. V současnosti je předmětem zájmu zkoumání hlavně kvůli své nejednoznačné roli ve vývoji nádorů, kdy může v závislosti na okolnostech a kontextu, vznik, progresi a metastázování nádorů jak potlačovat, tak i podporovat. Cílem této práce je shrnutí základních recentních informací o molekulárních mechanismech regulace autofagie a její úloze při vývoji a léčbě solidních nádorů. Práce je zaměřena na potenciální využití regulace autofagie během terapie, zejména pak na možnosti modulace autofagie s cílem překonat rezistenci nádorů tlustého střeva k působení vybraných chemoterapeutických látek.
1 Autofagie Termín autofagie poprvé použil v roce 1963 Christian de Duve pro popis dějů souvisejících s formací intracelulárních vezikulů obsahujících rozložený buněčný materiál. Z řečtiny by se autofagie překládala jako „sebepozření“ a jedná se o důležitý evolučně konzervovaný mechanismus plnící důležitou úlohu v regulaci normálního vývoje a udržování homeostázy prakticky všech eukaryotických organismů a o zásadní cestu degradace a recyklace proteinů a buněčných organel lysozomální cestou. Z fyziologického hlediska je autofagie důležitá jako proces umožňující rozložení intracelulárních proteinů a organel a následné využití produktů pro další fungování buňky. Také slouží pro adaptaci k nepříznivým podmínkám, jako je např. hypoxie, nedostatek živin nebo nadměrná akumulace nefunkčních organel a proteinů. Na bazální úrovni probíhá prakticky ve všech buňkách a její míra se při stresu výrazně zvyšuje. Deregulace autofagie hraje úlohu v celé řadě onemocnění, kromě nádorových také například při bakteriálních a virových infekcích, při myopatiích nebo v neurodegenerativních onemocněních spojených s poruchou odbourávání patologicky konformovaných proteinů, jako jsou Parkinsonova nebo Huntingtonova choroba (Shintani a Klionsky, 2004). Defektní 9
autofagie byla v poslední době také spojena s nenádorovými onemocněními trávicí soustavy, jakými jsou pankreatitida, hepatitida nebo Crohnova nemoc, onemocnění projevující se nejčastěji chronickým zánětem střeva (Sokollik et al., 2011).
1.1 Druhy autofagie Autofagie může probíhat neselektivně, nebo selektivně se zaměřením na určitý typ organel a struktur. Podle toho můžeme rozlišovat například mitofagii (autofagie mitochondrií), pexofagii (peroxisomů), lipofagii (lipidových kapének), retikulofagii (endoplazmatického retikula), ribofagii (ribosomů) nebo také nukleofagii (jádra) či xenofagii (autofagie infikujících bakterií a virů). Podle způsobu, jakým je materiál určený k degradaci dopraven do lysozomů, rozlišujeme tři druhy autofagie: a) autofagii zprostředkovanou chaperony, kdy za účasti chaperonových proteinů selektované proteiny prochází přes membránu do lysozomu; b) mikroautofagii, při které jsou malé buněčné komponenty přímo invaginovány lysozomální membránou; a c) makroautofagii, během které vzniká nová dvoumembránová struktura zvaná autofagozom, která odděluje část cytosolu s organelami a proteiny určenými k degradaci (viz Obr. 1). Vnější membrána autofagozomu následně fúzuje s lysozomem. Vnitřní membrána je pak spolu s obsahem v lysozomu (vakuole v případě kvasinek) rozložena. Nejvýznamnějším a nejvíce studovaným typem autofagie je makroautofagie, proto je práce zaměřena na ni a dále bude označována jen jako „autofagie“.
1.2 Průběh a regulace autofagie Autofagii lze rozdělit na několik fází: indukci a nukleaci, během které se aktivují základní molekulární mechanismy zahajující formování izolační membrány - fagoforu, elongaci a uzavření vezikulu, čímž je vytvořen autofagozom, a následnou fúzi autofagoforu s lysozomem za vzniku autolysozomu, po které následuje degradace uzavřených struktur. Po skončení degradace jsou výsledné produkty vypuštěny zpět do cytosolu buňky a lysozomy regenerují. Autofagie je regulována proteiny kódovanými skupinou genů spojených s autofagií (autophagy related genes - atg), které byly identifikovány v kvasinkách (Tsukada a Ohsumi, 1993; Inoue a Klionsky, 2010). Přestože některé selektivní dráhy vyžadují druhově specifické geny, základní sestava pro neselektivní autofagii zůstala v podobě homologních genů konzervována i u vyšších eukaryotických organismů včetně člověka (Meijer et al., 2007).
10
Takzvané základní autofagické mechanismy jsou takové, které jsou obecně nutné pro formaci autofagozomu. Mohou být rozděleny do čtyř skupin reprezentovaných těmito hlavními molekulami: 1) komplexy ULK 1 a 2 (kinázy podobné unc-51, savčí homology kvasinkových Atg1); 2) komplexem fosfatidylinositol 3-kinázy třídy III (PI3K-III; homolog Vps34 komplexu I u kvasinek); 3) dvěma konjugačními systémy proteinů podobných ubiquitinu Atg12 a LC3 (lehký řetězec 3 proteinu asociovaného s mikrotubuly, homolog kvasinkového Atg8); a 4) dvěma transmembránovými proteiny VMP1 a mAtg9 (Yang and Klionsky, 2010).
Obr. 1 – Základní typy autofagie (Lynch-Day and Klionsky, 2010) Prvním krokem autofagie je vytvoření malé membránové struktury nazývané fagofor. Zdroj membrány pro jeho tvorbu je v současnosti předmětem zkoumání a data naznačují více možných míst původu membrán. Při formování fagoforu byla prokázána úloha mitochondrií (Hailey et al., 2010), endoplazmatického retikula (Hayashi-Nishino et al., 2009), Golgiho aparátu (Yen et al., 2010) i cytoplasmatické membrány (Ravikumar et al., 2010). Míra využití 11
jednotlivých zdrojů záleží na typu autofagického podnětu, druhu tkáně a buněčném kontextu. Buňka je schopna si podle situace zvolit takový rezervoár, který je schopen zajistit doručení dostatečného množství lipidů a zároveň jeho využití nenaruší fungování tkáně (Mari et al., 2011). Pro indukci formování fagoforu je potřeba aktivace komplexu ULK, k čemuž dochází po odstranění inhibičních účinků savčího cíle rapamycinu (mTOR). Tato evolučně konzervovaná
serin/threoninová
kináza
eukaryotických
organismů
reguluje
růst
a metabolismus buněk v odpovědi na širokou škálu vnějších stimulů, jako jsou růstové faktory, stres, úroveň dostupné energie, kyslíku, glukózy nebo aminokyselin (Shaw and Cantley, 2006). Funguje jako centrální uzel sítě řady signálních drah zapojených jak ve fyziologických, tak i patologických procesech. Dráha PI3K/Akt pod vlivem inzulinu, hormonů nebo růstových faktorů dále aktivuje mTOR, stejně jako dráha MAPK/ERK. Naopak signálování protein kinázy aktivované AMP (AMPK), významného regulátoru energetické homeostázy, aktivitu mTOR inhibuje (Petroulakis et al., 2006). Paralelně ke svému působení na mTOR je navíc molekula AMPK schopná spouštět autofagii i přímou aktivací ULK1 (Roach, 2011). V normálním prostředí bohatém na živiny tvoří mTORC1 (komplex mTOR a RAPTOR) komplex s ULK1/2, Atg13, FIP200 (protein o velikosti 200 kD interagující s rodinou fokálních adhezivních kináz) a Atg101. mTOR fosforyluje ULK1 a Atg13 a tím brzdí kinázovou aktivitu ULK1. Po působení rapamycinu, léčiva inhibujícího signální dráhu mTOR, nebo v podmínkách s nedostatkem živin se mTORC1 oddělí od komplexu ULK a tím již nedochází k inhibiční fosforylaci ULK. V důsledku toho se ULK1 autofosforyluje a aktivuje Atg13 a FIP200. Celý aktivovaný komplex ULK se poté lokalizuje na místo vznikajícího fagoforu (Rosenfeldt and Ryan, 2011). Pro proces nukleace je nezbytný fosfatidylinositol 3-fosfát (PI3P) produkovaný komplexem PI3K-III-hVps34 při vazbě s jeho partnery Beclin 1 a hVps35. Celý komplex se nachází na fagoforu, kam na vyvíjející se vezikul přitahuje další Atg proteiny (Pyo et al., 2012). Důležitost proteinu Beclin 1 spočívá hlavně v možnosti na jeho úrovni pozitivně i negativně regulovat autofagii pomocí jeho vazebných partnerů. Vazba s molekulami BARKOR (klíčový regulátor autofagie asociovaný s proteinem Beclin 1), UVRAG (gen asociovaný s rezistencí k UV záření) nebo Ambra1 (aktivační molekula v autofagii regulované proteinem Beclin 1) působí pro-autofagicky, zatímco současné navázání UVRAG a RUBICON (protein bohatý na cystein obsahující RUN doménu interagující s Beclin 1) autofagii inhibuje. Stejně tak autofagii inhibuje navázání molekul Bcl-2 a Bcl-XL na doménu
12
BH3 proteinu Beclin 1, čímž je zabráněno interakci Beclin 1 s PI3K komplexem (Rosenfeldt and Ryan, 2011; Pyo et al., 2012). Pro expanzi a následné dokončení tvorby charakteristické dvoumembránové struktury autofagozomu jsou potřebné dva konjugační systémy podobné ubiquitinu – Atg12 a LC3. Atg12 konjuguje k Atg5 v reakci vyžadující proteiny Atg7 a Atg10, poté se nekovalentně připojí Atg16L, čímž vzniká nový komplex Atg16L (Atg12-Atg5-Atg16L). Tento komplex dále k fagoforu naviguje protein LC3 a pomáhá jeho lipidaci. LC3 (MAP1LC3 - microtubuleassociated protein 1 light chain 3) je jen jedním z orthologů kvasinkového proteinu Atg8, mezi další patří GABARAPL1 (Atg8L), GABARAPL2 (GATE16) a GABARAP. LC3 je z nich nejlépe prozkoumaný a jeho změny v průběhu autofagických dějů jsou využívány jako spolehlivý ukazatel probíhající autofagie (Kabeya et al., 2000). Protein LC3 je na svém C konci štěpen pomocí Atg4 za vzniku cytozolové formy LC3-I, která dále konjuguje s fosfatidylethanolaminem (PE) v reakci vyžadující přítomnost Atg7 a Atg3. Lipidovaná forma LC3, nazývaná LC3-II, je pak připojována na obě strany autofagozomové membrány, kde hraje roli v jejím prodlužování a uzavírání (Yang and Klionsky, 2010). Závěrečným krokem je maturace autofagozomu, při které dochází k fúzi vnější membrány autofagozomu s lysozomem za vzniku autolysozomu (viz Obr. 2). Mechanismus fúze je aktivně zkoumán ve snaze objasnit významné události zapojené v tomto procesu. Pro úspěšný průběh je třeba aktivita GTPáz jako Rab22 nebo Rab24, stejně tak mohou být ve fúzi zapojeny savčí orthology rodiny proteinů SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor proteins receptor) známých z kvasinek (Pyo et al., 2012). Následuje degradace vnitřní membrány autofagozomu včetně jeho vnitřního obsahu lysozomálními hydrolázami. Výsledné malé molekuly jsou vypuštěny zpět do cytosolu, kde přechodně zvýší dostupné množství živin a tím zvýší aktivitu mTOR brzdícího autofagii (Yu et al., 2010). Transmembránový protein VMP1 nemá žádného známého homologa v kvasinkách, v savčích buňkách je ale molekulou nezbytnou pro spuštění autofagických procesů a jeho exprese je schopná spustit autofagii i podmínkách s dostatkem živin (Vaccaro et al., 2008). VMP1 se lokalizuje na endoplazmatickém retikulu, kde interaguje s Beclin 1. Analýza ukázala, že VMP1 je přechodně asociován již s brzkými autofagickými strukturami. Není ovšem zřejmě nutný pro aktivaci iniciačních Atg molekul, protože jeho zablokování sice neumožňovalo kompletní průběh autofagie, ale i tak docházelo k tvorbě membrán s ULK1 nebo Atg16L. To ukazuje na úlohu VMP1 v pozdějších fázích formace autofagozomů, pro přesné popsání jeho funkce však bude nutný další výzkum (Itakura and Mizushima, 2010).
13
Ani savčí Atg9 (mAtg9) není dosud dokonale prozkoumán. V buňkách bývá lokalizován na různých místech a v blízkosti mnoha znaků probíhající autofagie, jakými jsou ULK1, Atg16 nebo LC3, aniž by se ale trvale navázal na membrány. Zdá se, že jeho funkcí by tak mohla být doprava membrán nebo dalších komponent na místa určení. S fagofory a autofagozomy interaguje přechodně a je patrně odpovědný za jejich expanzi (Orsi et al., 2012).
Obr. 2 - Schéma signálních drah autofagie (http://www.cellsignal.com/reference/pathway/Autophagy.html)
14
1.3 Buněčná smrt spojená s autofagií Autofagie je nejčastěji popisována jako jev přímo podporující přežívání buněk, v posledních letech je ale aktivně diskutována i její úloha v programované buněčné smrti. Otázkou zůstává, zdali autofagie buněčnou smrt pouze doprovází a je morfologicky sledovatelným projevem snahy buňky o vyrovnání se se stresem, nebo jestli je její přímou příčinou. Ačkoli v řadě případů byla v buňkách pozorována probíhající autofagie a následná smrt, nelze vždy s jistotou prohlásit, že je mezi těmito jevy jednoznačná funkční souvislost (Bursch, 2001; Tsujimoto and Shimizu, 2005). Protože výsledkem autofagie může být rozklad celé řady buněčných struktur, příliš intenzívní autofagie by po překonání určité hranice mohla vést ke kolapsu buněčných funkcí a buněčné smrti. Na tuto možnost ukazuje například studie, kdy v buněčné linii odvozené od nádoru prsu s mutantním proteinem Beclin 1 neschopným vázat Bcl-2 docházelo i bez vystavení stresovým podmínkám k nadměrné indukci autofagie. K její indukci ve vysoké míře docházelo i při inkubaci nádorových linií tlustého střeva HT-29 a Caco2 s látkou bufalin. Následkem v obou případech byla forma buněčné smrti s morfologickými znaky autofagie, které bylo možno zabránit použitím siRNA cílené na autofagický protein Atg5 (Pattingre et al., 2005; Xie et al., 2011). Zatímco v některých podmínkách autofagie apoptózu potlačuje, v jiných s ní může spolupracovat a podporovat umírání buněk, nebo dokonce působit jako záložní mechanismus buněčné smrti, pokud je apoptotická dráha poškozena. Můžeme pak mluvit o programované buněčné smrti druhého typu s účastí autofagie. Ta se morfologicky projevuje především výraznou tvorbou autofagozomů degradujících buněčný materiál. Nastávají i další změny, například kondenzace chromatinu, ale na rozdíl od apoptózy nedochází k fragmentaci DNA a tvorbě apoptotických tělísek (Gozuacik and Kimchi, 2007). Během vývoje Drosophila melanogaster je v řadě tkání pro správný vývoj a odumírání buněk nutná autofagie a Atg geny. Výzkumy ukázaly, že k autofagické buněčné smrti dochází při vývoji slinných žláz (Lee and Baehrecke, 2001), ovárií (Nezis et al., 2009) nebo serózní membrány embrya (Mohseni et al., 2009). Autofagická smrt je také nezbytná pro odstranění částí středního střeva během metamorfózy Drosophily (Denton et al., 2009). Inhibice Atg genů tudíž zpomalovala vývojové odumírání buněk, podobný vliv ale měla i inhibice kaspáz. Tato data ukazují na společný podíl Atg genů a kaspáz na buněčné smrti ve vývoji Drosophil a naznačují vzájemnou souhru a ovlivňování autofagické a apoptotické dráhy (Ryoo and Baehrecke, 2010). 15
I některé savčí buňky, jako například myší fibrosarkomové L929 nebo lidské myeloidní U937, se k autofagické smrti uchylují v případě, kdy je jim znemožněna smrt apoptotická (Tsujimoto and Shimizu, 2005), po eliminaci autofagických proteinů pomocí RNA interference může u takových buněk docházet k potlačování buněčné smrti (Gozuacik and Kimchi, 2007). Myší embryonální fibroblasty (MEF) postrádající proteiny Bax a Bak jsou k apoptóze rezistentní, ale po terapii nadále dochází k buněčné smrti asociované s tvorbou autolysozomů. K programované buněčné smrti druhého typu dochází také u nádorových buněk kolonu HCT116 s narušenou expresí Bax a Puma, inkubovaných v přítomnosti chemoterapeutických látek. Tento typ buněčné smrti je potlačován inhibitory autofagie jako je 3-methyladenin (3-MA) (Shimizu et al., 2004; Xiong et al., 2010). Apoptóza může být znemožněna také působením kaspázového inhibitoru z-VAD-fmk. Po jeho použití dochází u myších fibrosarkomových buněk L929 k smrti nezávislé na aktivaci kaspáz a spojené s morfologickými znaky nekrózy i autofagie (Chen et al., 2011). Po inhibici autofagických proteinů Atg7 a Beclin 1 pomocí interferenčních RNA dochází ke snížené tvorbě autofagozomů a nižší míře umírání buněk, což naznačuje, že autofagie indukovaná z-VADfmk k buněčné smrti u linie L929 přispívá (Yu et al., 2004). Mezi autofagickými a apoptotickými drahami funguje intenzívní komunikace a molekulární mechanismy obou drah mají mnoho společných proteinů, proto je při snahách o regulaci jedné dráhy nutno brát v potaz změny, které by působením na ni mohly vést k nezanedbatelným změnám v dráze druhé (Hou et al., 2010; Kang et al., 2011).
2 Autofagie a nádorová onemocnění Nádorová onemocnění jsou typická poruchami buněčných funkcí, jakými jsou například reparační mechanismy DNA, regulace buněčného dělení nebo odstraňování poškozených buněk pomocí programované buněčné smrti. Následkem těchto defektů vzniklých působením řady vnějších jevů pak dochází k nekontrolovatelnému množení populace buněk a vzniku nádorů s různě zhoubným vlivem na celý organismus. Tato práce je zaměřena na solidní nádory, především na nádorová onemocnění tlustého střeva. Indukce autofagie během tumorigeneze je často označována jako „dvousečná zbraň“, protože může vznik a přežití nádoru jak potlačovat, tak i podporovat. Ve fyziologických podmínkách napomáhá odstraňování poškozených struktur, čímž snižuje úroveň stresu a tím i pravděpodobnost
transformace
buněk
na
nádorové.
Mutace
genů
odpovědných
za autofagické proteiny je častým jevem v lidských nádorech (Qu et al., 2003), včetně nádorů 16
kolonu (Liang et al., 2007). Zároveň ale autofagie přežívání již přeměněných nádorových buněk napomáhá, protože jim, stejně jako buňkám zdravým, umožňuje překonat stresové podmínky, přežít a pokračovat v proliferaci (Degenhardt et al., 2006). Nádorové onemocnění tlustého střeva patří celosvětově k nejrozšířenějším typům nádorového onemocnění (Jemal et al., 2010), konkrétně v České republice incidence výskytu rakoviny tlustého střeva v posledních letech podle údajů Ústavu zdravotnických informací a statistiky ČR stabilně stoupá, i když díky pokrokům v léčbě je zvyšování celkové mortality nižší než zvyšování incidence. K léčbě je v současné době používána řada různých přístupů, kromě operativního odstraňování nádorů a ozařování je častým postupem i chemoterapie různými léčivy jako jsou například oxaliplatina, vorinostat, leukovorin, cetuximab nebo 5-fluorouracil (5-FU). Tyto látky mají bohužel v organismu celou řadu vážných vedlejších účinků, navíc k nim mohou být některé typy nádorových buněk rezistentní. Z těchto důvodů je zdokonalování léčby v centru zájmu mnoha vědeckých pracovišť. Nadějným kandidátem pro budoucí využití v terapii je v poslední době indukce apoptózy se současnou regulací autofagie v nádorových tkáních. Kombinace chemoterapeutik s látkami ovlivňujícími autofagii by mohla vést k překonání případné rezistence nádorů, zvýšit účinnost látek způsobujících smrt nádorových buněk, nebo dosáhnout podobných účinků s možností užití nižších koncentrací jednotlivých cytotoxických látek.
2.1 Autofagie indukovaná hypoxií V mnoha typech solidních nádorů může rychlost proliferace a růstu buněk převyšovat rychlost, s jakou ve tkáni vznikají nové cévy. V důsledku toho mohou být nádorové buňky nedostatečně zásobovány kyslíkem a dochází k hypoxii až anoxii. Jako odpověď na hypoxický stres buňka aktivuje v závislosti na míře nedostatku kyslíku různé signální dráhy, které vedou ke stabilizaci transkripčního faktoru HIF-1, aktivaci odpovědi na přítomnost „nesložených“ proteinů (UPR) a inhibici dráhy mTOR. Tyto dráhy se mohou významně zapojovat v modulaci autofagie v podmínkách hypoxie. Při nedostatku kyslíku je stabilizován transkripční faktor HIF-1 (faktor indukovaný hypoxií), což vede k expresi regulačních proteinů BNIP3 a BNIP3L (protein interagující s Bcl-2/E1B 19 kDa a jemu podobný protein). Tyto proteiny z rodiny Bcl-2 pomocí BH3 domén váží proteiny Bcl-2 a Bcl-XL, tím je uvolňují z komplexu s Beclinem 1 a ruší tak jejich inhibiční účinky na autofagii v řadě buněčných linií včetně linií DLD-1 a LS174, odvozených od lidských nádorů tlustého střeva (Bellot et al., 2009). BNIP3 byla původně považována za molekulu podporující umírání buněk, nové výzkumy ale tuto roli nepotvrzují 17
(Papandreou et al., 2005; Bellot et al., 2009) a ukazují na její funkci v přežívání buněk odstraňováním poškozených mitochondrií, bráněním vyčerpání zásob ATP a právě indukcí autofagie (Tracy and Macleod, 2007). Zvýšené množství proteinů BNIP3 a BNIP3L během hypoxie indukovalo selektivní degradaci mitochondrií (mitofagii), která napomáhá přežití buněk snížením produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) poškozenými mitochondriemi. Při inhibici autofagie ROS poškozují DNA a dochází tak k úmrtí většího množství nádorových buněk v porovnání s liniemi s funkční autofagií (Zhang et al., 2008a). Nezávisle na dráze HIF může být autofagie indukována pomocí proteinové kinázy aktivované AMP (AMPK), významného regulátoru energetické homeostázy. Během hypoxie nejsou buňky schopny produkovat dostatečné množství ATP pro zajištění všech buněčných pochodů, což vede ke zvýšení poměru AMP/ATP v buňce při vyčerpání energie a k aktivaci AMPK. Tato kináza následně indukuje autofagii jak přímou fosforylací ULK1, tak pomocí aktivace komplexu tuberózní sklerózy 2 (TSC2), který funguje jako negativní regulátor mTOR, přispívá ke snížení aktivity mTOR a narušení jeho inhibičních účinků. Nezávislost této dráhy aktivace autofagie na HIF byla ukázána experimenty s buněčnými liniemi bez HIF-1 a s potlačenou expresí jeho cílových proteinů BNIP3 a BNIP3L (Papandreou et al., 2008). Další možností reakce při výrazné hypoxii (0,01 % kyslíku až anoxie) je aktivace receptorů reagujících na přítomnost nesložených proteinů, související se stresem endoplazmatického retikula. Následkem stresu se v lumen ER hromadí nesprávně složené nebo nesložené proteiny. Po jejich zaznamenání receptory dochází ke spuštění UPR signálování a pomocí faktoru EIF2AK3 jsou aktivovány transkripční faktory CHOP (C/EBP homologní protein) a ATF4 (aktivační transkripční faktor 4), které zvyšují expresi esenciálních autofagických proteinů Atg5 a LC3 (Rouschop et al., 2010).
2.2 Autofagie indukovaná nedostatkem živin Rychle proliferující nádorové buňky často potřebují pro své fungování větší množství živin než zdravé buňky, zároveň je ale jejich přísun živin omezen nedostačující angiogenezí v nádoru. Buňky se proto uchylují k alternativním metabolickým procesům pro získání potřebné energie. Mnoho typů nádorových buněk, včetně linií odvozených od kolorektálních nádorů (SW480, DLD-1, WiDr, SW620, LoVo), vykazuje vyšší odolnost ke stresu vyvolanému nedostatkem živin v porovnání s lidskými fibroblasty (Sato et al., 2007). Nádorové buňky kolonu mohou jako zdroj energie využívat aminokyseliny vzniklé rozkladem 18
buněčných struktur během autofagie, její aktivace je tak po určitou dobu může udržovat při životě i v nepříznivých podmínkách nádoru (Sato et al., 2007). Při přítomnosti živin ve vnějším prostředí aminokyseliny pomocí membránových transportérů rodiny SLC vstupují dovnitř buněk, kde jsou registrovány komplexem mTORC1, který je následně fosforylován a brání indukci autofagie (He and Klionsky, 2009). V prostředí s nedostatkem aminokyselin nedochází k vazbě GTPázy Rheb (homolog Ras obohacený v mozku) na katalytickou doménu mTOR a je tak narušena mTOR dráha, následkem čehož dochází k aktivaci autofagie (Long et al., 2005). Další studie naznačují, že mTOR je také aktivován prostřednictvím PI3K-III. Přítomnost aminokyselin stimuluje PI3K-III, což vede k aktivaci mTOR a inhibici autofagie. Tato úloha PI3K-III se liší od její úlohy při formování autofagozomu, možným vysvětlením by mohla být existence různých subpopulací nebo proteinových komplexů PI3K-III, které v buňce plní různé funkce (He and Klionsky, 2009).
3 Autofagie v různých fázích vývoje nádoru Autofagie je velmi heterogenní proces, jehož vliv na nádorová onemocnění se liší podle aktuálního buněčného kontextu a stádia vývoje nádoru. Existují práce dokazující její pozitivní vliv na přežívání buněk i na indukci buněčné smrti, pro případnou regulaci autofagie v rámci terapie je tak nutné rozlišit, kdy proces udržující buněčnou homeostázu a zabraňující vzniku neoplazie přechází ve faktor chránící již přeměněné buňky před apoptózou a působením léčiv (viz Obr. 3). U normálních buněk a během počátečních fází vývoje nádoru autofagie často působí jako ochranný faktor bránící před množstvím vlivů podporujících tumorigenezi, jako jsou například nekróza, vznik chronického zánětu, akumulace poškozených mitochondrií a s ní spojené poškození DNA. Defekty autofagie jsou spojeny se zvýšenou náchylností k nádorovým onemocněním, např. myši s experimentálně deaktivovanou alelou pro Beclin 1, důležitou molekulou v regulaci autofagie, vykazovaly větší incidenci spontánního vzniku nádoru než myši s nepoškozeným genem (Qu et al., 2003). Poškozená alela Beclin 1 je častým jevem v mnoha typech lidských nádorů, například prsu nebo prostaty (Choi, 2012). I v nádorových onemocněních kolonu je narušená regulace Beclin 1 spojena se špatnou prognózou pro pacienty, ať už kvůli aktivaci anti-apoptotických drah při ztrátě exprese, nebo vyšší agresivitě rozvoje nádoru při nadměrném množství tohoto proteinu (Koukourakis et al., 2010). U řady molekul známých svou schopností potlačovat vznik nádoru bylo prokázáno 19
také pozitivní ovlivnění autofagie, celkově tak lze v řadě případů prohlásit, že defektní autofagie by mohla přispívat k vývoji nádorových onemocnění (Choi, 2012).
Obr. 3 - Úloha autofagie v různých fázích tumorigeneze (upraveno podle Liu and Ryan, 2012)
V pozdějších fázích vývoje nádoru může vysoká míra stresu spojeného se zvýšenými metabolickými nároky a nedostatečným zásobením tkáně kyslíkem a živinami vést buňky ke snaze získat energii a metabolity z alternativních zdrojů a tím k indukci autofagie (Sato et al., 2007). Dále může být autofagie indukována jako adaptační odpověď buněk na různé typy protinádorové terapie a tím způsobovat chemorezistenci a přežívání nádorových buněk (Hu et al., 2012). Jejich přežití se tak může stát závislým na autofagii a nádorové buňky jsou k inhibici zranitelnější než buňky zdravé, čehož lze využít pro preferenční zabíjení nádorových buněk s omezením vedlejších účinků na zdravou tkáň (Chen and KarantzaWadsworth, 2009). Společné účinky některých aktuálně používaných chemoterapeutik v kombinaci s různými inhibitory autofagie jsou uvedeny v kapitole 5. Během metastázování jsou nádorové buňky po celou dobu vystaveny zátěžovým faktorům, jako je hypoxie nebo metabolický stres. Metastázující nádorové buňky také musí překonat další významnou překážku – stres spojený se ztrátou kontaktu s ostatními buňkami a mezibuněčnou hmotou. Zdravé buňky při oddělení od populace okolních buněk a ztrátě kontaktu s extracelulární matrix podléhají programované buněčné smrti zvané anoikis. 20
Mechanismy, kterými je indukce buněčné smrti během metastázy znemožněna, nejsou dodnes plně známy. Jako jedna z možností se nabízejí ochranné vlivy autofagie, které by buňku mohly udržovat naživu i po oddělení od původní tkáně. Nicméně podobně jako v mnoha dalších případech, i při vzniku metastáz může mít autofagie dvojí úlohu. Zmírňováním účinku hypoxického a metabolického stresu omezuje zánět a následnou nekrózu buněk, čímž brzdí růst nádoru a také příliv velkého množství makrofágů spojených s indukcí metastázy prostřednictvím produkce řady cytokinů (Degenhardt et al., 2006; Kenific et al., 2010). Na druhou stranu ale může autofagie metastázování podporovat, neboť zprostředkovává ochranu buněk před stresem během jejich transportu oběhovými systémy. Tomu nasvědčují výsledky experimentů, kde indukce autofagie napomáhala přežití buněk, které ztratily kontakt s extracelulární matrix. Odpovídajícím způsobem pak inhibice autofagie po ztrátě kontaktu s okolím
posiluje
aktivaci
programované
buněčné
smrti
v myších
fibroblastech
a v epiteliálních lidských prsních liniích MCF-10A a HMEC-1 (Fung et al., 2008). Také v kolorektálních nádorech má patrně autofagie pozitivní vliv na metastázování. Při analýze kolorektální buněčné linie AMC5, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO a CaCo2 vykazovaly zvýšenou expresi esenciálního autofagického proteinu Atg10 v porovnání s normální kolorektální buněčnou linií CCD841. Zvýšená hladina Atg10 byla zaznamenána i ve vzorcích kolorektální nádorové tkáně odebrané operativně z pacientů, kde silně korelovala s vysokou invazivitou tumoru a metastázováním do lymfatických uzlin (Jo et al., 2012).
4 Regulace autofagie proteinem p53 Protein p53 je významný transkripční faktor ovlivňující expresi široké škály cílových proteinů, které následně mohou regulovat řadu buněčných dějů jako apoptóza, zástava buněčného cyklu nebo oprava DNA. Pro svůj rozsáhlý vliv na výše uvedené děje je p53 často označován jako „strážce genomu“. V buňce může být p53 rozsáhle modifikován pomocí fosforylace, acetylace nebo ubiquitinace, čímž se dále mění jeho funkce a vliv na cytokinetiku a reakci buňky na akutní stres (Bai, 2006). Všeobecně je p53 považován za jeden z hlavních nádorových supresorů a jeho mutace nebo ztráta funkce je předpokládána zhruba v polovině všech případů nádorových onemocnění, při testování buněčných linií kolorektálních nádorových linií toto číslo dosahovalo i více než 75 % (Liu and Bodmer, 2006). V poslední době mnoho studií ukazuje i na významnou úlohu p53 v regulaci autofagie, která může být dvojí, jak pozitivní, tak negativní. Protein p53 tak má při regulaci autofagie důležitou, 21
ale nejednoznačnou úlohu, kdy rozdíl mezi inhibicí nebo aktivací závisí na úrovni a druhu stresu, lokalizaci p53 v buňce a jeho post-translačních modifikacích (viz Obr. 4).
4.1 Indukce autofagie pomocí p53 Po vystavení stresu dochází v buňce k modifikacím p53, které vedou k jeho stabilizaci, přesunu do jádra, změně konformace a následné aktivitě jako transkripční faktor po navázání p53 na promotorové regiony řady genů (Kruse and Gu, 2009). Transkripční aktivita p53 v jádře se může významně uplatňovat v regulaci exprese řady genů zapojených v pozitivní stimulaci autofagie. Protein p53 zvyšuje genovou expresi AMPK, senzoru úrovně energie v buňce. Zároveň s ním pak posiluje autofagii fosforylací TSC proteinových komplexů, které snižují aktivitu mTOR (Maiuri et al., 2010). Zvýšení exprese po genotoxickém stresu bylo pozorováno i u molekul sestrin 1 a 2, cílových genů p53 a aktivátorů AMPK, které ve výsledku také inhibují mTOR a tím posilují autofagii (Budanov and Karin, 2008). Významným cílem p53 je i DRAM (modulátor autofagie regulovaný poškozením), lysozomální protein kritický pro indukci autofagie zprostředkované p53, který je kromě toho také známý pro svou úlohu v indukci apoptózy (Crighton et al., 2007). Podpora autofagie prostřednictvím p53 je popsána i u řady proapoptotických členů rodiny Bcl-2, jako jsou Bax, Bad, BNIP3 nebo Puma. Zvýšení jejich exprese, spolu s dalšími aktivátory autofagie, například DAPK-1 (protein kináza asociovaná se smrtí), je také způsobeno působením p53 v jádře (Maiuri et al., 2010).
4.2 Inhibice autofagie pomocí p53 Aktivace transkripce genů v jádře není jediným způsobem, kterým p53 ovlivňuje autofagii. V běžných fyziologických podmínkách je protein p53 v buňkách pomocí ubiquitinace
a
následné
proteazomální
degradace
udržován
v bazální
koncentraci
a lokalizován v cytoplazmě. Při snížení hladiny p53 v cytoplazmě buněk docházelo k akumulaci autofagozomů a autolysozomů, což naznačuje úlohu p53 jako negativního regulátoru autofagie. Buněčné kultury normálně neschopné autofagie ji neaktivovaly ani v reakci na snížení hladiny p53, ale při obnovení exprese nezbytných autofagických proteinů byla obnovena i autofagická dráha (Tasdemir et al., 2008). V experimentech buňky s nefunkčním p53 vykazovaly vyšší odolnost k metabolickému stresu, tato odolnost byla ale narušena při inhibici AMPK dráhy nebo deaktivaci tvorby esenciálních autofagických proteinů. Stabilizace p53 v buňce pomocí farmakologických látek inhibovala aktivaci 22
autofagie vyvolanou stresem endoplazmatického retikula, nedostatkem živin nebo rapamycinem. Dohromady tyto výsledky ukazují na aktivaci cytoprotektivní autofagie v reakci na inhibici nebo deleci proteinu p53. Různé induktory autofagie navíc zároveň způsobovaly i posílenou degradaci p53, což naznačuje, že snížení hladiny p53 v cytoplazmě je pro aktivaci autofagie za určitých podmínek klíčové (Tasdemir et al., 2008).
Obr. 4 – Schéma regulace autofagie proteinem p53 (Maiuri et al., 2010)
23
5 Úloha autofagie v modulaci citlivosti nádorových buněk k cytotoxickému/cytostatickému působení chemoterapeutických látek 5-fluorouracil je léčivo ze skupiny antimetabolitů, látek poškozujících metabolismus cílových tkání. Jde o analog pyrimidinu používaný několik desítek let pro léčbu nádorových onemocnění, nejčastěji tlustého střeva a slinivky břišní. Působí jako inhibitor thymidylát syntetázy, enzymu odpovědného za tvorbu thymidinu, nukleosidu nezbytného pro replikaci DNA. Jako pyrimidinový analog je také zabudováván do struktury DNA a RNA, kde následně indukuje zastavení buněčného cyklu a apoptózu prostřednictvím blokace syntézy nové DNA. Největšího účinku tak dosahuje v silně proliferujících tkáních jako jsou tkáně nádorové, ale například i kostní dřeň nebo střevní epitel. V současné době je v kombinaci s leukovorinem standardně používán pro léčbu kolorektálního karcinomu, v souvislosti s jeho užíváním se ale začaly často objevovat problémy spojené s rezistencí nádorů k jeho účinkům (Zhang et al., 2008b). Po inkubaci nádorových buněk s 5-FU může dojít k zástavě buněčného cyklu, indukci apoptózy a/nebo autofagie. Úloha autofagie v tomto kontextu bývá většinou popisována jako protektivní a inhibice tohoto procesu by mohla vést k vyššímu účinku 5-FU, případně i k překonání rezistence některých buněk k cytotoxickému působení této látky. Tomu nasvědčují experimenty využívající 5-FU v kombinaci s inhibitory autofagie. Jedním z těchto inhibitorů je chloroquin difosfát (CQ), antimalarické léčivo známé i svými inhibičními účinky na pozdní fáze autofagie. Protože i samotný CQ má určitý efekt na proliferaci a umírání buněk, byly stanoveny dávky inhibující fúzi autofagozomů s lysozomy bez většího vlivu na viabilitu buněk. Při použití těchto dávek CQ u lidských buněčných linií nádoru tlustého střeva HT-29 a DLD-1 v kombinaci s 5-FU docházelo k posílení apoptózy nebo zástavě buněčného cyklu, ve srovnání s vlivem samotného 5-FU (Sasaki et al., 2010; Choi et al., 2012). Dalším inhibitorem autofagie, jehož účinky na buněčnou smrt v kombinaci s 5-FU jsou v současnosti zkoumány, je 3-methyladenin. Tato látka je intenzivně používána pro výzkum autofagie a na rozdíl od CQ ji inhibuje již během jejích úvodních fází. Konkrétně narušuje funkci PI3K-III, kinázy nezbytné pro formaci autofagozomu. Některé studie ukázaly posílení apoptózy indukované 5-FU prostřednictvím 3-MA u kolorektálních nádorových buněčných linií colon26, HT29, HCT116, DLD-1 a DLD-1/5-FU (specifická linie rezistentní k 5-FU) (Li et al., 2009). Kultury inkubované s kombinací látek vykazovaly nižší procento přežívajících buněk ve srovnání s působením samotného 5-FU, při použití samotného 3-MA 24
k výrazným změnám viability nedocházelo. Tyto výsledky byly následně potvrzeny in vivo u myší s implantovanými lidskými nádorovými buňkami tlustého střeva (DLD-1), u nichž kombinace látek výrazně redukovala růst nádoru ve srovnání s působením samotného 5-FU. Posílení apoptózy indukované 5-FU bylo dosaženo i při inhibici autofagie s využitím specifické Atg7 siRNA, což opět poukazuje na protektivní úlohu autofagie před působením 5-FU (Li et al., 2010a). Objevují se ovšem i názory, že přestože je 3-MA znám především pro své inhibiční působení na autofagii, jeho účinky nemusí být vždy zcela specifické a synergický efekt s 5-FU by mohl být nezávislý na autofagii. U nádorových linií MCF-7 a Hela indukoval 3-MA v závislosti na koncentraci a délce působení buněčnou smrt, a přestože při samostatném působení snižoval úroveň autofagie způsobenou hladověním buněk, neovlivňoval již autofagii zvýšenou působením chemoterapeutik jako je 5-FU (Hou et al., 2012; Sheng et al., 2013). Kromě ochranné funkce může mít autofagie v nádorech tlustého střeva i funkci opačnou, může např. působit jako alternativní mechanismus buněčné smrti v případě, že cílová buňka je rezistentní k apoptóze (tj. vyskytují se u ní závažné defekty na úrovni regulačních molekul apoptotické signální dráhy). U nádorové buněčné linie tlustého střeva HCT116 Bax-/- a Puma -/- byla po inkubaci s 5-FU pozorována prakticky stejná úroveň buněčné smrti jako u buněk HCT116 s funkční apoptotickou dráhou. Morfologicky však buňky Bax-/- a Puma -/- vykazovaly formaci autofagosomů a postrádaly fragmentaci jádra typickou pro apoptózu. Při inkubaci buněk Bax-/- a Puma -/- s kombinací 5-FU a 3-MA byla buněčná smrt blokována a morfologie buněk se podobala buňkám kontrolním. Autofagie tak v tomto případě nahrazovala nefunkční apoptózu a přispívala k programované buněčné smrti druhého typu (Xiong et al., 2010). Oxaliplatina patří mezi skupinu derivátů platiny s protinádorovým účinkem, používaných v současnosti v klinické praxi. Užívá se k léčbě zhoubných nádorů tlustého střeva v pokročilých stádiích, po kompletním odstranění původního nádoru nebo k léčbě metastázujícího karcinomu tlustého střeva a konečníku. Podává se v kombinaci s jinými protinádorovými léky, obvykle 5-FU a leukovorinem. Mechanismus působení spočívá v tvorbě můstků v rámci jednoho vlákna nebo i mezi oběma vlákny molekuly DNA, což znemožňuje jejich replikaci a transkripci a indukuje buněčnou smrt (Woynarowski et al., 2000). Existují studie, které poukazují na úlohu autofagie v regulaci odpovědi různých typů nádorových buněk k cytotoxickým účinkům oxaliplatiny. Oxaliplatina v těchto buňkách může 25
vyvolávat stres endoplazmatického retikula a zvýšenou produkcí reaktivních metabolitů kyslíku (ROS), na kterou buňka odpovídá aktivací autofagie. Experimenty využívající siRNA proti P8 a CHOP, molekulám zprostředkovávajícím ER stres, a látek pro snižování hladiny ROS v buňce (N-acetylcystein, Tiron), poukazují na omezení autofagie po působení oxaliplatiny u nádorových buněk tlustého střeva (Shi et al., 2012). V nádorových buňkách tlustého střeva Caco-2 po inhibici autofagie farmakologickými prostředky 3-MA a bafilomycinu A1 docházelo v reakci na vystavení oxaliplatině k zvýšení tvorby ROS a k posílení buněčné smrti oproti oxaliplatině samotné, stejně jako v případě použití siRNA deaktivujících nezbytné autofagické molekuly Atg5 a Beclin 1. Na druhou stranu buňky po použití oxaliplatiny v kombinaci s induktorem autofagie rapamycinem vykazovaly nižší úroveň buněčné smrti. Společně tyto výsledky ukazují na ochrannou funkci autofagie proti cytotoxickému působení oxaliplatiny v nádorových buňkách Caco-2 (Shi et al., 2012). Podobných výsledků bylo dosaženo i u dalších typů nádorů, konkrétně u nádorových buněk žaludku (Xu et al., 2011) a jater (Ding et al., 2011). I v těchto případech by tak inhibice autofagie mohla být potenciálním cílem pro regulaci odpovědi nádoru k působení oxaliplatiny. Cetuximab je chimérická monoklonální protilátka působící proti receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR), jehož exprese bývá často zvýšena v metastázujících nádorech tlustého střeva, kde spouští signální kaskády vedoucí k syntéze DNA a posílení proliferace. Podle závislosti buněk na EGFR v nich může cetuximab indukovat apoptózu, částečné nebo úplné zastavení buněčného cyklu, nebo žádný efekt na proliferaci a přežívání (Lenz, 2007). V buněčných liniích, které jsou na jeho působení citlivé, jako je například kolorektální adenokarcinomová linie DiFi, vyvolává inkubace s cetuximabem kromě apoptózy i autofagii, a to dvěma různými způsoby. Zaprvé cetuximab blokuje signální dráhu PI3K třídy I/Akt/mTOR, na jejímž konci mTOR normálně působí jako negativní regulátor autofagie. Důležitost této dráhy byla ukázána experimenty, při kterých konstitutivní aktivace signální dráhy PI3K třídy I/Akt/mTOR, na rozdíl od konstitutivní aktivace jiných drah, zabraňovala autofagii vyvolané použitím cetuximabu (Li and Fan, 2010). Dalším mechanismem aktivace autofagie v buňkách inkubovaných s cetuximabem je oslabení exprese HIF-1α a Bcl-2 a současná aktivace komplexu Beclin 1/PI3K třídy III. Méně exprimovaný Bcl-2 uvolňuje Beclin 1 ze svých inhibičních účinků a umožňuje tak posílení vazeb komplexu Beclin 1/PI3K třídy III. Odpovídajícím způsobem pak zvýšení exprese Bcl-2 brání indukci autofagie v buňkách inkubovaných s cetuximabem. Stejně jako v dříve zmíněných případech, i zde 26
kombinace cetuximabu s inhibitorem autofagie 3-MA, chloroquinu nebo interferenčních RNA zaměřených na esenciální autofagické molekuly výrazně snižuje množství přežívajících buněk. I v tomto konkrétním případě tak autofagie patrně plní ochrannou úlohu u nádorových buněk proti účinkům cetuximabu (Li and Fan, 2010). Zároveň ale stojí za zmínku i fakt, že u některých nádorových linií, které jsou na cetuximab méně citlivé a místo apoptózy a indukce autofagie v nich dochází pouze k zastavení buněčného cyklu, kombinace s inhibitorem autofagie přinášela prakticky stejné výsledky jako cetuximab samotný. Naopak kombinace s induktorem autofagie, například rapamycinem, vykazovala výrazně nižší množství přežívajících buněk než působení cetuximabu nebo rapamycinu samotného. Data ukazují, že autofagie není spuštěna, pokud nedochází k buněčné smrti, ale její indukce rapamycinem může přispívat k umírání buněk prostřednictvím autofagické buněčné smrti (Li et al., 2010b). Vorinostat (suberoylanilid hydroxamová kyselina, SAHA)
je inhibitor histonové
deacetylázy, způsobuje akumulaci acetylovaných histonů v buňkách a protinádorově ovlivňuje genovou expresi. Blokuje signální dráhy odpovědné za růst a proliferaci v celé řadě buněčných linií, včetně linií odvozených od nádorů kolonu (Richon, 2006). Současně se nachází ve fázi I/II klinických zkoušek s ohledem na léčbu některých solidních nebo hematologických malignit. U nádorových buněčných linií tlustého střeva HCT8 a HT29 použití CQ zcitlivovalo k apoptóze vyvolané vorinostatem, kombinace látek navíc výrazně zvyšovala produkci ROS a přispívala tak dále k umírání buněk. V souladu s těmito výsledky i po implantaci HCT8 linie do myši následná inkubace s kombinací vorinostatu a CQ snižovala velikost nádoru a posilovala odumírání nádorových buněk v porovnání s působením obou látek samostatně (Carew et al., 2010).
27
Závěr Autofagie je evolučně konzervovaný proces probíhající v eukaryotických organismech od kvasinek až po člověka. Je regulována rodinou proteinů Atg a prostřednictvím některých regulačních molekul může interagovat s celou řadou dalších buněčných procesů, například signálními drahami regulujícími buněčnou smrt. Ve fyziologických podmínkách autofagie obecně chrání tkáně před působením různých typů stresu, v závislosti na situaci a buněčném kontextu se ale v různých tkáních může chovat rozdílně. V některých případech může nad ochrannou rolí převládnout její úloha při indukci programované buněčné smrti druhého typu. Na bazální úrovni ve zdravých tkáních autofagie chrání před nádorovou transformací, v již přeměněných buňkách jim však často pomáhá vyrovnat se se stresovým mikroprostředím nádoru, které bývá charakteristické nedostatkem živin a kyslíku. Deregulace autofagických procesů je jedním z typických znaků mnoha typů nádorových tkání a cílené zásahy do tohoto procesu by mohly být účinným nástrojem zefektivnění protinádorové terapie. Chemoterapeutické a jiné látky běžně používané pro léčbu nádorových onemocnění tlustého střeva (například 5-fluorouracil, oxaliplatina, cetuximab, vorinostat) v podmínkách inhibice autofagie vykazují v řadě in vitro i in vivo studií zvýšený podíl umírajících buněk. Účinná regulace autofagie by proto mohla být využita pro léčbu nádorů rezistentních k chemoterapii nebo ke snížení nežádoucích vedlejších účinků cytotoxických léčiv při zachování jejich protinádorových účinků. Proces autofagie je proto nadějným kandidátem pro další vědecká zkoumání s cílem budoucího využití v terapii. Tato práce shrnuje molekulární mechanismy autofagie a dosavadní poznatky o úloze autofagie ve vývoji některých solidních nádorů (zejména tlustého střeva) a jejich terapii s využitím vybraných chemoterapeutických látek.
28
Seznam zkratek: 3-MA – 3-methyladenin 5-FU – 5-fluorouracil Ambra1 – aktivační molekula v autofagii regulované proteinem Beclin 1 (activating molecule in Beclin 1-regulated autophagy) AMPK – protein kináza aktivovaná AMP ATF4 – aktivační transkripční faktor 4 (activating transcription factor 4) Atg – geny spojené s autofagií (autophagy-related genes) BARKOR – klíčový regulátor autofagie asociovaný s proteinem Beclin 1 (Beclin 1associated autophagy-related key regulator) Bcl-2 – protein rodiny Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) Bcl-XL – protein rodiny Bcl-2 (B-cell lymphoma extra large) BNIP3 – protein rodiny Bcl-2 (Bcl-2/E1B 19 kDa interacting protein 3) BNIP3L – protein rodiny Bcl-2, podobný BNIP3 CHOP – C/EBP homologní protein (C/EBP homologous protein) CQ - chloroquin DAPK-1 – protein kináza asociovaná se smrtí (death-associated protein kinase) DRAM – modulátor autofagie regulovaný poškozením (damage-regulated autophagy modulator) EIF2AK3 – kináza eukaryotického translačního iniciačního faktoru 2 alfa (eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) ERK – kinázy regulované extracelulárními signály (extracellular signal regulated kinases) FIP200 – protein o velikosti 200 kD interagující s rodinou fokálních adhezivních kináz (focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD) HIF-1 – faktor indukovaný hypoxií (hypoxia induced factor) LC3 – lehký řetězec 3 proteinu 1 asociovaného s mikrotubuly (microtubule-associated protein 1 light-chain 3) MAPK – mitogeny aktivovaná protein kináza (mitogen-activated protein kinase) mAtg – savčí geny spojené s autofagií (mammalian autophagy related genes) MEF – myší embryonální fibroblasty (mouse embryonal fibroblasts) mTOR – savčí cíl rapamycinu (mammalian target of rapamycin) mTORC – komplex savčího cíle rapamycinu (mammalian target of rapamycin complex) PE – fosfatidylethanolamin 29
PI3K-III – fosfatidylinositol 3-kináza třídy III (phosphatidylinositol 3-kinase class III) PI3P – fosfatidylinositol 3-fosfát (phosphatidylinositol 3-phosphate) Rab – proteinová rodina GTPáz ROS – reaktivní formy kyslíku (reactive oxygen species) RUBICON – protein bohatý na cystein obsahující RUN doménu interagující s Beclin 1 (Run domain Beclin 1 interacting and cystein-rich containing protein) TSC – komplex tuberózní sklerózy (tuberous sclerosis complex) ULK – kináza podobná Unc-51 (Unc-51-like kinase) UPR – odpověď na přítomnost nesložených proteinů (unfolded protein response) UVRAG – gen asociovaný s rezistencí k UV záření (UV radiation resistance-associated gene) VMP1 – membránový protein vakuol 1 (vacuole membrane protein 1) z-VAD-fmk – karbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]-fluoromethylketon, inhibitor kaspáz
30
Seznam použité literatury: Bai, L., 2006: p53: Structure, Function and Therapeutic Applications. In Zhu, W.-G. (ed.). Journal of Cancer Molecules, 141-153. Bellot, G., Garcia-Medina, R., Gounon, P., Chiche, J., Roux, D., Pouysségur, J., and Mazure, N. M., 2009: Hypoxia-induced autophagy is mediated through hypoxia-inducible factor induction of BNIP3 and BNIP3L via their BH3 domains. Mol Cell Biol, 29(10): 2570-2581. Budanov, A. V. and Karin, M., 2008: p53 target genes sestrin1 and sestrin2 connect genotoxic stress and mTOR signaling. Cell, 134(3): 451-460. Bursch, W., 2001: The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ, 8(6): 569-581. Carew, J. S., Medina, E. C., Esquivel, J. A., Mahalingam, D., Swords, R., Kelly, K., Zhang, H., Huang, P., Mita, A. C., Mita, M. M., Giles, F. J., and Nawrocki, S. T., 2010: Autophagy inhibition enhances vorinostat-induced apoptosis via ubiquitinated protein accumulation. J Cell Mol Med, 14(10): 2448-2459. Chen, N. and Karantza-Wadsworth, V., 2009: Role and regulation of autophagy in cancer. Biochim Biophys Acta, 1793(9): 1516-1523. Chen, S. Y., Chiu, L. Y., Maa, M. C., Wang, J. S., Chien, C. L., and Lin, W. W., 2011: zVAD-induced autophagic cell death requires c-Src-dependent ERK and JNK activation and reactive oxygen species generation. Autophagy, 7(2): 217-228. Choi, J. H., Yoon, J. S., Won, Y. W., Park, B. B., and Lee, Y. Y., 2012: Chloroquine enhances the chemotherapeutic activity of 5-fluorouracil in a colon cancer cell line via cell cycle alteration. APMIS, 120(7): 597-604. Choi, K. S., 2012: Autophagy and cancer. Exp Mol Med, 44(2): 109-120. Crighton, D., Wilkinson, S., and Ryan, K. M., 2007: DRAM links autophagy to p53 and programmed cell death. Autophagy, 3(1): 72-74. Degenhardt, K., Mathew, R., Beaudoin, B., Bray, K., Anderson, D., Chen, G., Mukherjee, C., Shi, Y., Gélinas, C., Fan, Y., Nelson, D. A., Jin, S., and White, E., 2006: Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis. Cancer Cell, 10(1): 51-64. Denton, D., Shravage, B., Simin, R., Mills, K., Berry, D. L., Baehrecke, E. H., and Kumar, S., 2009: Autophagy, not apoptosis, is essential for midgut cell death in Drosophila. Curr Biol, 19(20): 1741-1746. Ding, Z. B., Hui, B., Shi, Y. H., Zhou, J., Peng, Y. F., Gu, C. Y., Yang, H., Shi, G. M., Ke, A. W., Wang, X. Y., Song, K., Dai, Z., Shen, Y. H., and Fan, J., 2011: Autophagy activation in hepatocellular carcinoma contributes to the tolerance of oxaliplatin via reactive oxygen species modulation. Clin Cancer Res, 17(19): 6229-6238. 31
Fung, C., Lock, R., Gao, S., Salas, E., and Debnath, J., 2008: Induction of autophagy during extracellular matrix detachment promotes cell survival. Mol Biol Cell, 19(3): 797-806. Gozuacik, D. and Kimchi, A., 2007: Autophagy and cell death. Curr Top Dev Biol, 78217245. Hailey, D. W., Rambold, A. S., Satpute-Krishnan, P., Mitra, K., Sougrat, R., Kim, P. K., and Lippincott-Schwartz, J., 2010: Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation. Cell, 141(4): 656-667. Hayashi-Nishino, M., Fujita, N., Noda, T., Yamaguchi, A., Yoshimori, T., and Yamamoto, A., 2009: A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat Cell Biol, 11(12): 1433-1437. He, C. and Klionsky, D. J., 2009: Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy. Annu Rev Genet, 4367-93. Hou, H., Zhang, Y., Huang, Y., Yi, Q., Lv, L., Zhang, T., Chen, D., Hao, Q., and Shi, Q., 2012: Inhibitors of phosphatidylinositol 3'-kinases promote mitotic cell death in HeLa cells. PLoS One, 7(4): e35665. Hou, W., Han, J., Lu, C., Goldstein, L. A., and Rabinowich, H., 2010: Autophagic degradation of active caspase-8: a crosstalk mechanism between autophagy and apoptosis. Autophagy, 6(7): 891-900. Hu, Y. L., Jahangiri, A., Delay, M., and Aghi, M. K., 2012: Tumor cell autophagy as an adaptive response mediating resistance to treatments such as antiangiogenic therapy. Cancer Res, 72(17): 4294-4299. Inoue, Y. and Klionsky, D. J., 2010: Regulation of macroautophagy in Saccharomyces cerevisiae. Semin Cell Dev Biol, 21(7): 664-670. Itakura, E. and Mizushima, N., 2010: Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins. Autophagy, 6(6): 764-776. Jemal, A., Center, M. M., DeSantis, C., and Ward, E. M., 2010: Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 19(8): 1893-1907. Jo, Y. K., Kim, S. C., Park, I. J., Park, S. J., Jin, D. H., Hong, S. W., Cho, D. H., and Kim, J. C., 2012: Increased expression of ATG10 in colorectal cancer is associated with lymphovascular invasion and lymph node metastasis. PLoS One, 7(12): e52705. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T., Yamamoto, A., Kirisako, T., Noda, T., Kominami, E., Ohsumi, Y., and Yoshimori, T., 2000: LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J, 19(21): 57205728. Kang, R., Zeh, H. J., Lotze, M. T., and Tang, D., 2011: The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis. Cell Death Differ, 18(4): 571-580.
32
Kenific, C. M., Thorburn, A., and Debnath, J., 2010: Autophagy and metastasis: another double-edged sword. Curr Opin Cell Biol, 22(2): 241-245. Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Sivridis, E., Pitiakoudis, M., Gatter, K. C., and Harris, A. L., 2010: Beclin 1 over- and underexpression in colorectal cancer: distinct patterns relate to prognosis and tumour hypoxia. Br J Cancer, 103(8): 1209-1214. Kruse, J. P. and Gu, W., 2009: Modes of p53 regulation. Cell, 137(4): 609-622. Lee, C. Y. and Baehrecke, E. H., 2001: Steroid regulation of autophagic programmed cell death during development. Development, 128(8): 1443-1455. Lenz, H. J., 2007: Cetuximab in the management of colorectal cancer. Biologics, 1(2): 77-91. Li, J., Hou, N., Faried, A., Tsutsumi, S., Takeuchi, T., and Kuwano, H., 2009: Inhibition of autophagy by 3-MA enhances the effect of 5-FU-induced apoptosis in colon cancer cells. Ann Surg Oncol, 16(3): 761-771. Li, J., Hou, N., Faried, A., Tsutsumi, S., and Kuwano, H., 2010a: Inhibition of autophagy augments 5-fluorouracil chemotherapy in human colon cancer in vitro and in vivo model. Eur J Cancer, 46(10): 1900-1909. Li, X. and Fan, Z., 2010: The epidermal growth factor receptor antibody cetuximab induces autophagy in cancer cells by downregulating HIF-1alpha and Bcl-2 and activating the beclin 1/hVps34 complex. Cancer Res, 70(14): 5942-5952. Li, X., Lu, Y., Pan, T., and Fan, Z., 2010b: Roles of autophagy in cetuximab-mediated cancer therapy against EGFR. Autophagy, 6(8): 1066-1077. Liang, C., Feng, P., Ku, B., Oh, B. H., and Jung, J. U., 2007: UVRAG: a new player in autophagy and tumor cell growth. Autophagy, 3(1): 69-71. Liu, E. Y. and Ryan, K. M., 2012: Autophagy and cancer--issues we need to digest. J Cell Sci, 125(Pt 10): 2349-2358. Liu, Y. and Bodmer, W. F., 2006: Analysis of P53 mutations and their expression in 56 colorectal cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(4): 976-981. Long, X., Ortiz-Vega, S., Lin, Y., and Avruch, J., 2005: Rheb binding to mammalian target of rapamycin (mTOR) is regulated by amino acid sufficiency. J Biol Chem, 280(25): 23433-23436. Lynch-Day, M. A. and Klionsky, D. J., 2010: The Cvt pathway as a model for selective autophagy. FEBS Lett, 584(7): 1359-1366. Maiuri, M. C., Galluzzi, L., Morselli, E., Kepp, O., Malik, S. A., and Kroemer, G., 2010: Autophagy regulation by p53. Curr Opin Cell Biol, 22(2): 181-185. Mari, M., Tooze, S. A., and Reggiori, F., 2011: The puzzling origin of the autophagosomal membrane. F1000 Biol Rep, 325.
33
Meijer, W. H., van der Klei, I. J., Veenhuis, M., and Kiel, J. A., 2007: ATG genes involved in non-selective autophagy are conserved from yeast to man, but the selective Cvt and pexophagy pathways also require organism-specific genes. Autophagy, 3(2): 106-116. Mohseni, N., McMillan, S. C., Chaudhary, R., Mok, J., and Reed, B. H., 2009: Autophagy promotes caspase-dependent cell death during Drosophila development. Autophagy, 5(3): 329-338. Nezis, I. P., Lamark, T., Velentzas, A. D., Rusten, T. E., Bjørkøy, G., Johansen, T., Papassideri, I. S., Stravopodis, D. J., Margaritis, L. H., Stenmark, H., and Brech, A., 2009: Cell death during Drosophila melanogaster early oogenesis is mediated through autophagy. Autophagy, 5(3): 298-302. Orsi, A., Razi, M., Dooley, H. C., Robinson, D., Weston, A. E., Collinson, L. M., and Tooze, S. A., 2012: Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy. Mol Biol Cell, 23(10): 1860-1873. Papandreou, I., Krishna, C., Kaper, F., Cai, D., Giaccia, A. J., and Denko, N. C., 2005: Anoxia is necessary for tumor cell toxicity caused by a low-oxygen environment. Cancer Res, 65(8): 3171-3178. Papandreou, I., Lim, A. L., Laderoute, K., and Denko, N. C., 2008: Hypoxia signals autophagy in tumor cells via AMPK activity, independent of HIF-1, BNIP3, and BNIP3L. Cell Death Differ, 15(10): 1572-1581. Pattingre, S., Tassa, A., Qu, X., Garuti, R., Liang, X. H., Mizushima, N., Packer, M., Schneider, M. D., and Levine, B., 2005: Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1dependent autophagy. Cell, 122(6): 927-939. Petroulakis, E., Mamane, Y., Le Bacquer, O., Shahbazian, D., and Sonenberg, N., 2006: mTOR signaling: implications for cancer and anticancer therapy. Br J Cancer, 94(2): 195-199. Pyo, J. O., Nah, J., and Jung, Y. K., 2012: Molecules and their functions in autophagy. Exp Mol Med, 44(2): 73-80. Qu, X., Yu, J., Bhagat, G., Furuya, N., Hibshoosh, H., Troxel, A., Rosen, J., Eskelinen, E. L., Mizushima, N., Ohsumi, Y., Cattoretti, G., and Levine, B., 2003: Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene. J Clin Invest, 112(12): 1809-1820. Ravikumar, B., Moreau, K., Jahreiss, L., Puri, C., and Rubinsztein, D. C., 2010: Plasma membrane contributes to the formation of pre-autophagosomal structures. Nat Cell Biol, 12(8): 747-757. Richon, V. M., 2006: Cancer biology: mechanism of antitumour action of vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid), a novel histone deacetylase inhibitor. Br J Cancer, 95(S1). Roach, P. J., 2011: AMPK -> ULK1 -> autophagy. Mol Cell Biol, 31(15): 3082-3084.
34
Rosenfeldt, M. T. and Ryan, K. M., 2011: The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis, 32(7): 955-963. Rouschop, K. M., van den Beucken, T., Dubois, L., Niessen, H., Bussink, J., Savelkouls, K., Keulers, T., Mujcic, H., Landuyt, W., Voncken, J. W., Lambin, P., van der Kogel, A. J., Koritzinsky, M., and Wouters, B. G., 2010: The unfolded protein response protects human tumor cells during hypoxia through regulation of the autophagy genes MAP1LC3B and ATG5. J Clin Invest, 120(1): 127-141. Ryoo, H. D. and Baehrecke, E. H., 2010: Distinct death mechanisms in Drosophila development. Curr Opin Cell Biol, 22(6): 889-895. Sasaki, K., Tsuno, N. H., Sunami, E., Tsurita, G., Kawai, K., Okaji, Y., Nishikawa, T., Shuno, Y., Hongo, K., Hiyoshi, M., Kaneko, M., Kitayama, J., Takahashi, K., and Nagawa, H., 2010: Chloroquine potentiates the anti-cancer effect of 5-fluorouracil on colon cancer cells. BMC Cancer, 10370. Sato, K., Tsuchihara, K., Fujii, S., Sugiyama, M., Goya, T., Atomi, Y., Ueno, T., Ochiai, A., and Esumi, H., 2007: Autophagy is activated in colorectal cancer cells and contributes to the tolerance to nutrient deprivation. Cancer Res, 67(20): 9677-9684. Shaw, R. J. and Cantley, L. C., 2006: Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth. Nature, 441(7092): 424-430. Sheng, Y., Sun, B., Guo, W. T., Zhang, Y. H., Liu, X., Xing, Y., and Dong, D. L., 2013: 3Methyladenine induces cell death and its interaction with chemotherapeutic drugs is independent of autophagy. Biochem Biophys Res Commun, 432(1): 5-9. Shi, Y., Tang, B., Yu, P. W., Hao, Y. X., Lei, X., Luo, H. X., and Zeng, D. Z., 2012: Autophagy protects against oxaliplatin-induced cell death via ER stress and ROS in Caco-2 cells. PLoS One, 7(11): e51076. Shimizu, S., Kanaseki, T., Mizushima, N., Mizuta, T., Arakawa-Kobayashi, S., Thompson, C. B., and Tsujimoto, Y., 2004: Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes. Nat Cell Biol, 6(12): 12211228. Shintani, T. and Klionsky, D. J., 2004: Autophagy in health and disease: a double-edged sword. Science, 306(5698): 990-995. Sokollik, C., Ang, M., and Jones, N., 2011: Autophagy: a primer for the gastroenterologist/hepatologist. Can J Gastroenterol, 25(12): 667-674. Tasdemir, E., Maiuri, M. C., Galluzzi, L., Vitale, I., Djavaheri-Mergny, M., D'Amelio, M., Criollo, A., Morselli, E., Zhu, C., Harper, F., Nannmark, U., Samara, C., Pinton, P., Vicencio, J. M., Carnuccio, R., Moll, U. M., Madeo, F., Paterlini-Brechot, P., Rizzuto, R., Szabadkai, G., Pierron, G., Blomgren, K., Tavernarakis, N., Codogno, P., Cecconi, F., and Kroemer, G., 2008: Regulation of autophagy by cytoplasmic p53. Nat Cell Biol, 10(6): 676-687. Tracy, K. and Macleod, K. F., 2007: Regulation of mitochondrial integrity, autophagy and cell survival by BNIP3. Autophagy, 3(6): 616-619. 35
Tsujimoto, Y. and Shimizu, S., 2005: Another way to die: autophagic programmed cell death. Cell Death Differ, 12 Suppl 21528-1534. Tsukada, M. and Ohsumi, Y., 1993: Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett, 333(1-2): 169-174. Vaccaro, M. I., Ropolo, A., Grasso, D., and Iovanna, J. L., 2008: A novel mammalian transmembrane protein reveals an alternative initiation pathway for autophagy. Autophagy, 4(3): 388-390. Woynarowski, J. M., Faivre, S., Herzig, M. C., Arnett, B., Chapman, W. G., Trevino, A. V., Raymond, E., Chaney, S. G., Vaisman, A., Varchenko, M., and Juniewicz, P. E., 2000: Oxaliplatin-induced damage of cellular DNA. Mol Pharmacol, 58(5): 920-927. Xie, C. M., Chan, W. Y., Yu, S., Zhao, J., and Cheng, C. H., 2011: Bufalin induces autophagy-mediated cell death in human colon cancer cells through reactive oxygen species generation and JNK activation. Free Radic Biol Med, 51(7): 1365-1375. Xiong, H. Y., Guo, X. L., Bu, X. X., Zhang, S. S., Ma, N. N., Song, J. R., Hu, F., Tao, S. F., Sun, K., Li, R., Wu, M. C., and Wei, L. X., 2010: Autophagic cell death induced by 5FU in Bax or PUMA deficient human colon cancer cell. Cancer Lett, 288(1): 68-74. Xu, L., Qu, X. J., Liu, Y. P., Xu, Y. Y., Liu, J., Hou, K. Z., and Zhang, Y., 2011: Protective autophagy antagonizes oxaliplatin-induced apoptosis in gastric cancer cells. Chin J Cancer, 30(7): 490-496. Yang, Z. and Klionsky, D. J., 2010: Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation. Curr Opin Cell Biol, 22(2): 124-131. Yen, W. L., Shintani, T., Nair, U., Cao, Y., Richardson, B. C., Li, Z., Hughson, F. M., Baba, M., and Klionsky, D. J., 2010: The conserved oligomeric Golgi complex is involved in double-membrane vesicle formation during autophagy. J Cell Biol, 188(1): 101-114. Yu, L., Alva, A., Su, H., Dutt, P., Freundt, E., Welsh, S., Baehrecke, E. H., and Lenardo, M. J., 2004: Regulation of an ATG7-beclin 1 program of autophagic cell death by caspase-8. Science, 304(5676): 1500-1502. Yu, L., McPhee, C. K., Zheng, L., Mardones, G. A., Rong, Y., Peng, J., Mi, N., Zhao, Y., Liu, Z., Wan, F., Hailey, D. W., Oorschot, V., Klumperman, J., Baehrecke, E. H., and Lenardo, M. J., 2010: Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. Nature, 465(7300): 942-946. Zhang, H., Bosch-Marce, M., Shimoda, L. A., Tan, Y. S., Baek, J. H., Wesley, J. B., Gonzalez, F. J., and Semenza, G. L., 2008a: Mitochondrial autophagy is an HIF-1dependent adaptive metabolic response to hypoxia. J Biol Chem, 283(16): 1089210903. Zhang, N., Yin, Y., Xu, S. J., and Chen, W. S., 2008b: 5-Fluorouracil: mechanisms of resistance and reversal strategies. Molecules, 13(8): 1551-1569.
36
