UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK PETROLEUM ETER BIJI JALI ( Coix lacryma jobi, L. ) DAN HERBA BANDOTAN ( Ageratum conyzoides ) PADA SEL HELA SECARA IN VITRO CYTOTOXICITY TEST OF Coix lacryma jobi, L. AND Ageratum conyzoides PETROLEUM ETHER EXTRACT, ON HELA CELL BY IN VITRO METHOD Endang Sri Rejeki Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi Jl. Let. Jen. Sutoyo, Mojosongo, Surakarta 57127 ABSTRAK Kegunaan biji jali adalah antiradang, antitoksik, peluruh kencing, pengeluaran nanah dan bisul. Kegunaan herba bandotan adalah antitoksik, mencegah kehamilan dan menghentikan perdarahan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui sitotoksisitas ekstrak petroleum eter biji jali ( Coix lacryma jobi,L ) dan herba bandotan ( Ageratum conyzoides ) terhadap sel HeLa secara in viro dengan metode MTT ( Microculture Tetrazolium Salt ). Metode penyarian yang digunakan adalah maserasi dengan menggunakan penyari petroleum eter. Ekstrak yang diperoleh dilakukan uji sitotoksisitas dengan metode MTT menggunakan sel HeLa dengan metode analisis deret sel baku. Efek sitotoksisitas dihitung sebagai LC 50 yang didapatkan dari persamaan garis linier kurva hubungan probit versus log C, dimana nilai probit merupakan hasil konversi % kematian sel HeLa yang diperoleh berdasarkan deret sel baku. Berdasarkan percobaan di atas diperoleh harga LC 50 ekstrak petroleum eter biji jali 1051±74,98 µg/ml, harga LC50 ekstrak petroleum eter herba bandotan 200,299 ± 13,628 µg/ml. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak petroleum eter biji jali dan herba bandotan tidak mempunyai efek sitotoksisitas terhadap sel HeLa. Kata kunci : biji jali, herba bandotan, sitotoksisitas, petroleum eter, sel HeLa ABSTRACT The use of jali seed (Coix lacryma-jobi L.) is anti-inflammatory, antitoxic, diuretic, ulcer and pus excrete. And the use of bandotan herb (Ageratum conyzoides, L.) is antitoxic, antipregnancy, and haemostatic. The experiment was aimed to know the cytotoxicity of jali seed (Coix lacryma-jobi L.) and bandotan herb (Ageratum conyzoides, L.) petroleum ether extract on HeLa cell by MTT (Microculture Tetrazolium Salt) method in vitro. The extraction method used was maceration using petroleum ether. The obtained extract was tested its toxicity using MTT method on HeLa cell by standard cell progression analysis. The effect of cytotoxicity was calculated as LC50 obtained from linier equation of probit correlation curve versus log C where probit value was % conversion result of HeLa cell death obtained from standard cell progression. According to the experiment, it was obtained the LC50 value of jali seed petroleum ether extract 1051 ± 74,98 µg/ml, LC 50 value of bandotan herb petroleum ether extract 200,299 ± 13,628 µg/ml. It was shown that petroleum ether extract of jali seed and bandotan herb had no cytotoxicity effect on HeLa cell. Keywords: Jali seed, bandotan herb, cytotoxicity, petroleum ether, HeLa cell.
PENDAHULUAN Tanaman bandotan mempunyai khasiat sebagai antitoksik, menghentikan perdarahan, mencegah kehamilan. Tanaman biji jali mempunyai kegunaan sebagai mengobati tumor pada saluran cerna, bengkak, beri-beri, memperkuat limpa dan paru, antiradang, peluruh kencing, pengeluaran nanah dan bisul, sakit tulang, sakit sendi, antitoksik ( Wijayakusuma dkk., 1996; Dalimarta, 2001 ). Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling sederhana ( Voight, 1994 ). Keuntungan cara ekstraksi maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan ( Depkes, 1986 ). Kerugian cara maserasi adalah pengerjaan lama dan penyarian kurang sempurna, membutuhkan banyak pelarut, waktu yang dibutuhkan berhari-hari dan hasil ekstraksi kurang akurat ( Ansel, 1989 ). Petroleum eter merupakan pelarut yang bersifat non polar, berupa cairan tidak berwarna, mudah menguap dan sangat mudah terbakar ( Depkes, 1995 ). Petroleum eter dapat melarutkan minyak atsiri, lemak, asam lemak tinggi, steroid, triterpenoid dan karotenoid ( Harbone, 1987 ). Uji sitotoksisitas merupakan perkembangan untuk mengidentifikasi obat sitotoksik baru atau deteksi obat dengan aktifitas antitumor. Uji obat baru dilakukan melalui serangkaian uji farmakologi dan toksikologi baik yang dilakukan pada hewan uji (pra klinik) maupun uji klinik ( Doyle and Griffiths, 2000 ). Penelitian ini menggunakan HeLa cell line yang diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim manusia. HeLa cell line cukup aman dan umum digunakan untuk kepentingan kultur sel ( Lab Work, 2000 ) dan dilakukan secara in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji yang mempunyai relevansi yang cukup baik untuk mendeteksi potensi ketoksikan obat pada manusia ( Doyle and Griffiths, 2000 ). MTT ( Microculture Tetrazolium Salt ) merupakan senyawa garam tetrazolium yang berupa zat berwarna kuning yang larut air, diabsorbsi sel hidup dan direduksi secara
enzimatik oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan yang berwarna ungu yang tidak larut dalam air tetapi larut dalam SDS 10%. Keuntungan MTT adalah dapat dikerjakan dengan cepat dan teliti dan tidak menggunakan radioisotop. METODE PENELITIAN Bahan Sampel yang digunakan antara lain serbuk biji jali diambil dari daerah Tawangmangu pada bulan Desember 2006, serbuk herba bandotan diambil dari daerah Tawangmangu pada bulan Desember 2006. Bahan kimia yang digunakan antara lain petroleum eter, HeLa cell line, larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N, MTT, FBS ( Fetal Bovine Serum ), DMSO dalam ependof Alat Panci maserasi, blender, eksikator, ayakan no 20, evaporator, hemocytometer, inkubator CO2, ELISA reader, mikroplate 96 sumuran, LAF- Cabinet, Prosedur 1. Pembuatan serbuk biji jali dan herba bandotan Bahan yang sudah kering diserbuk dengan mesin penyerbuk kemudian serbuk yang didapat diayak dengan ayakan no 20 2. Pembuatan ekstrak Seratus lima puluh gram serbuk dimaserasi dengan 1,125 liter petroleum eter selama 5 hari dan sesekali dikocok lalu filtrat yang didapat dikeringkan dengan evaporator dan ditimbang. 3. Pembuatan deret sel baku Deret sel baku dibuat dengan memvariasi jumlah sel dalam suspensi sel yang mengabsorbsi MTT menjadi formazan berupa zat warna ungu yang memberikan serapan absorbansi pada panjang gelombang 595 nm. Jumlah sel dihitung menggunakan hemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium kultur sehingga diperoleh sejumlah sel sebesar
: 50000, 40000, 30000, 20000, 10000 sel/100 µl. 4. Pembuatan larutan senyawa uji Menimbang senyawa uji sebanyak 10 mg dilarutkan dalam 100 µl DMSO dalam ependof. Pembuatan larutan stok dan seri kadar larutan untuk perlakuan dilakukan secara aseptis di dalam LAF- Cabinet. Memipet larutan stok 10 µl ditambah 90 µl media kultur sehingga konsentrasi akhir 10.000 µg/ml, selanjutnya dibuat variasi konsentrasi. 5. Uji sitotoksisitas MTT Sel HeLa disuspensi dengan kepadatan 3 x 104 sel/sumuran sebanyak 100 µl kemudian sel dimasukkan dalam mikroplate 96 sumuran berbeda diinkubasi dalam inkubator CO 2 pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam. Sumuran ditambah 100 µl larutan ekstrak petroleum eter dalam medium tiap sumuran. Diperoleh kadar akhir dengan konsentrasi 100; 50; 25; 12,5; 6,25 µg/ml tiap/sumuran. Sebagai kontrol digunakan sel tanpa penambahan larutan uji kemudian sel diinkubasi pada inkubator CO2 5% pada suhu 37 ⁰C selama 24 jam. Pada akhir inkubasi medium masingmasing sumuran dibuang dan dicuci dengan FBS ( Fetal Bovine Serum ) kemudian ditambahkan 100 µl media baru dan 10µl MTT 5 mg/ml dalam FBS. Mikroplate diinkubasi kembali selama 4 jam pada inkubator CO2 5% pada suhu 37 ⁰C. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk formazan berwarna ungu dan untuk menghentikan reaksi antara sel dengan MTT serta melarutkan formazan maka ditambah 100 µl SDS ( Sodium
Dodecyl Sulphate ) 10% dalam 0,01 N HCl, diinkubasi selama 24 jam pada suhu kamar dan serapan dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. 6. Analisis data Harga persentase kematian ditentukan berdasarkan regresi linear deret sel baku dengan menghitung jumlah sel hidup sebagai kontrol dikurangi jumlah sel hidup dengan adanya perlakuan kemudian dibagi jumlah sel hidup sebagai kontrol dikalikan 100%. Persen kematian sel HeLa dicari nilai probitnya menggunakan tabel konversi kemudian dibuat kurva baku hubungan antara log konsentrasi dengan nilai probit. Harga LC50 dihitung dari persamaan y = a + bx. Harga LC50 dihitung dengan taraf kepercayaan 95%. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Pembuatan serbuk Bahan biji jali sebanyak 1000 gram dikeringkan didapatkan hasil kering sebanyak 315 gram kemudian didapatkan serbuk sebanyak 300 gram. Herba bandotan sebanyak 3500 gram dikeringkan didapatkan hasil kering sebanyak 340 gram kemudian didapatkan serbuk sebanyak 310 gram. 2. Pembuatan ekstrak Berat serbuk biji jali sebanyak 150 gram didapatkan berat ekstrak sebanyak 6,845 gram, Berat serbuk herba bandotan sebanyak 150 gram didapatkan berat ekstrak sebanyak 13,02 gram.
3. Pembuatan deret sel baku Kelompok Jumlah Sel Absorbansi Absorbansi rata(jumlah deret sel rata kontrol sel/100 µl ) media 1 5 x 104 1,605 0,174 2 4 x 104 1,366 0,174 3 3 x 104 1,281 0,174 4 4 2 x 10 1,054 0,174 5 1 x 104 0,659 0,174 a = 0,3578 b = 2,204 x 10-5 r = 0,9741 4. Pembuatan larutan uji % DMSO Absorbansi DMSO 0,00625 0,0125 0,025 0,05 0,1
Absorbansi kontrol media 0,174 0,174 0,174 0,174 0,174
1,146 1,125 1,107 1,085 1,066
Absorbansi deret sel Absorbansi rata-rata kontrol media 1,431 1,192 1,107 0,880 0,485
Absorbansi DMSO Absorbansi kontrol media 0,972 0,951 0,933 0,911 0,892
% kematian
7,11 10,28 13,01 16,33 19,21
5. Uji sitotoksisitas Tabel 1. Perhitungan LC50 ekstrak petroleum eter biji jali Konsentrasi Kelompok µg/ml 1 2 3 4 5
6,25 12,5 25 50 100
Absorbansi sampel 1 2 3 1,143 1,139 1,137 1,111 1,104 1,107 1,074 1,07 1,084 1,054 1,047 1,05 1,025 1,028 1,029
Absorbansi kontrol media 0,174 0,174 0,174 0,174 0,174
Absorbansi sampel kontrol media 1 2 3 0,969 0.965 0,963 0,936 0,93 0,933 0,9 0,896 0,91 0,88 0,873 0,876 0,851 0,854 0,855
Tabel 2. Perhitungan LC50 ekstrak petroleum eter herba bandotan konsentrasi Log C (µg/ml)
1
2
3
Kematian Kematian Kematian (%) Probit (%) Probit (%) Probit 0,625 0,796 10 3,72 10 3,72 11 3,77 12,5 1,097 17 4,05 16 4,01 17 4,05 25 1,398 26 4,36 25 4,33 29 4,45 50 1,699 33 4,56 32 4,53 34 4,59 100 2 37 4,67 37 4,67 38 4,69 persamaan garis y = 3,153 + 0,801 x y = 3,128 + 0,804 x y = 3,205 + 0,791 x r 0,981 0,988 0,970 LC50* 202,302 212,814 185,780 LC50 = ( x ± SD ) µg/ml = 200,299 ± 13,628 µg/ml
LC50* = LC50 hasil ekstrapolasi persamaan garis r tabel ( P = 0,95; Ø = 3 ) = 0,878 ( r hitung > r tabel )
Sel HeLa yang digunakan untuk uji sitotoksisitas ditumbuhkan pada mikroplate 96 sumuran dengan kerapatan sel 3 x 10 4 sel/100µl. Pemilihan kerapatan sel didasarkan pada rentang kerapatan yang ditetapkan yaitu 2 – 5 x 104. Pemilihan ini dimaksudkan agar jumlah sel HeLa tidak terlalu sedikit sehingga akan mempengaruhi pertumbuhan sel yang lambat dan agar sel tidak terlalu banyak karena jika jumlah sel yang digunakan terlalu banyak akan mengakibatkan sel banyak yang mati karena kekurangan medium pertumbuhan dan sel terlalu penuh dalam mikroplate. Dari hasil yang didapat bahwa ekstrak petroluem eter dari biji jali tidak poten dalam membunuh sel HeLa hal ini dapat dilihat dari tabel 1 dan tabel 2, harga LC50 yang lebih besar dari 100 µg/ml yaitu 1051 ± 74,98 µg/ml. Ekstrak petroleum eter dari herba bandotan juga tidak poten dalam membunuh sel HeLa hal ini dapat dilihat dari harga LC 50 yang lebih besar dari 100 µg/ml yaitu 200,299 ± 13,628 µg/ml. Batasan toksik dalam membunuh sel HeLa jika mempunyai harga LC50 kurang dari 100 µg/ml. KESIMPULAN Berdasarkan harga LC50 yang diperoleh dari hasil penelitian maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak petroleum eter dari biji jali dan herba bandotan tidak bersifat sitotoksisitas pada sel HeLa, hal ini dapat dilihat dari masing – masing harga LC50 yaitu harga LC50 ekstrak petroleum eter dari biji jali sebesar 1051 ± 74,98 µg/ml dan harga LC50 ekstrak petroleum eter dari herba bandotan sebesar 200,299 ± 13,628 µg/ml.
DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Hal. 10 – 16 Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Ansel HC, 1989, Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi, Edisi IV, Jakarta : Universitas Indonesia, Hal. 605 – 608 Dalimarta, 2001, Tumbuhan Obat Anti Kanker, Jakarta : Pustaka Kartini, Hal. 75 Doyle A and Griffiths SB, 2000, Cell and Tissue Cultur for Medical Research, New York : John Willey and Sons Ltd. Hal. 403 – 423 Harbone, 1987, Metode Fitokimia, terjemahan dari Phitochemical Methods, oleh Institut Teknologi Bandung, Penerbit : ITB press, Hal. 147 -145, 244 Lab Work Study Guide and Lecture Note, 2000, Henrietea Lacks, wwwmicro.msb.le.ac.uk/LabWork/Lacks /Lacks.htm.2004 Voight R, 1994, Buku Teknologi Farmasi, Edisi V, diterjemahkan dari Lehrbuch Der PharmazeutischenTechnologie, oleh Soendani Noerono Soewandi, Yogyakarta : Universitas Gajah Mada Press, Hal. 564 – 569 Wijayakusuma H, Dalimarta S, Wirian AS, 1996, Tanaman berkhasiat Obat di Indonesia, Jilid III, Jakarta : Pustaka Kartini, Hal. 52 - 54
