Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol ... (Nina Salamah dan Nurushoimah)
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOL HERBA PEGAGAN (Centella asiatica (L) Urb.) DENGAN METODE PENGHAMBATAN DEGRADASI BETA-KAROTEN Antioxidant Activity Etanolic Extract of Centella asiatica HERB Using Beta Caroten-Linoleat Method Nina Salamah dan Nurushoimah Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan (UAD), Yogyakarta Naskah diterima tanggal 2 September 2014 ABSTRACT The damages in cells and tissues are the of most diseases inductor. One of the damage caused is by free radicals. Anticipation the formation of free radical in human body was conducted by consuming the antioxidant sources. One of natural compound that is famous because it has activity as antioxidant is flavonoid. The main purpose of this research is to compare free radical scavenger activity of ethanolic extract of Centella asiatica herbs. The dry powder of Centella asiatica herbs was extracted by 70% of ethanol by maceration method. The thick extract were examined on its activity of antioxidant quantitatively that was determined by betha caroten-linoleic acid method. The series of concentration used in this research were 50; 100; 150; 200; 250 mcg/ml to quersetin as a positive control and the same concentration to ethanolic extract of Centella asiatica herbs. The Result Data was analyzed the activity of antioxidant of ethanol extract of Centella asiatica herbs, and also quersetin could be stated by persen antioxidant activity parameter. Antioxidant activity quersetin more than etanolic extract of pegagan herbs using betacaroten-linoleat method. Keywords : vine with edible leaves (Centella asiatica (L.) Urb.), antioxidant, beta caroten, quersetin. ABSTRAK Kerusakkan pada sel dan jaringan merupakan akar dari sebagian besar penyakit. Kerusakan ini salah satunya disebabkan oleh radikal bebas. Antisipasi terhadap terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh salah satunya dengan mengkonsumsi sumber antioksidan. Salah satu senyawa alam yang diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan adalah flavonoid. Secara umum tujuan penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas antioksidan fraksi air ekstrak etanol herba pegagan. Serbuk kering herba pegagan diekstraksi dengan etanol 70% dengan metode maserasi. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian diuji aktivitas antioksidan secara kuantitatif yang ditentukan dengan metode beta karoten asam linoleat. Seri kadar yang digunakan dalam penelitian ini adalah 50; 100; 150; 200 dan 250 mcg/ml untuk quersetin sebagai kontrol positif dan konsentrasi yang sama pada ekstrak etanol herba pegagan. Data yang diperoleh dianalisis dengan menghitung parameter persen aktivitas antioksidannya.Kemampuan quersetin dalam menghambat degradasi beta karoten akibat menangkap radikal bebas hidrogen peroksida yang berasal dari hasil oksidasi asam linoleat lebih besar dibanding ekstrak etanol herba pegagan Kata kunci : Pegagan , Centella asiatica (L.) Urb., antioksidan, beta karoten, quersetin PENDAHULUAN Kerusakkan pada sel dan jaringan yang merupakan akar dari sebagian besar penyakit disebabkan oleh radikal bebas. Radikal bebas reaktif sangat berbahaya sekali karena akan mencuri electron dari senyawa lain seperti protein, lipid, dan juga DNA.
Alamat korespondensi: Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan (UAD), Jl. Pramuka No. 42, Yogyakarta, Email:
[email protected]
177
DNA adalah senyawa yang ada dalam inti sel, yang apabila mengalami kerusakan akan menyebabkan berbagai macam penyakit seperti katarak, kanker, dan penyakit degeneratif (Kumalaningsih,2006). Sehingga muncul pemahaman baru tentang cara berbagai penyakit dan bahan-bahan lain yang merusak tubuh manusia pada sepuluh tahun terakhir abad ke dua puluh satu ini melalui berbagai penelitian. Antisipasi terhadap terbentuknya radikal bebas di dalam tubuh dapat dilakukan dengan mengatur pola makan dan mengonsumsi makanan tambahan (suplemen) yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
antioksidan untuk meredam terbentuknya radikal bebas (Regina, 2008; Tan, 2013). Antioksidan adalah senyawasenyawa yang mampu menghilangkan, membersihkan, menahan pembentukan maupun meniadakan efek spesies oksigen reaktif atau radikal bebas (Hernani & Rahardjo, 2005). Pegagan (Centella asiatica (L) Urb. ) merupakan suatu tanaman menjalar yang tumbuh subur di daerah lembab serta tersebar luas di daerah tropis dan subtropic. Kandungan zat aktif dalam pegagan diantaranya adalah triterpen dan flavonoid diantaranya adalah kuercetin, kaempferol, katechin, rutin dan naringin (Zheng and Qin, 2007). Uji aktivitas antioksidan selama ini didominasi dengan metode DPPH, sedangkan perlu juga dilakukan uji aktivitas ini dengan analisis metode yang lain untuk memperjelas mekanisme aktivitas antioksidan pegagan, salah satunya berdasarkan kekuatan sampel dalam mencegah terjadinya degradasi β–karoten. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan pengujian aktifitas antioksidan herba pegagan menggunakan metode -karoten bleaching. Prinsip dari metode ini adalah hilangnya warna kuning akibat dari reaksi karoten dengan radikal bebas yang dibentuk oleh oksidasi emulsi asam linoleat, kecepatan pemutihan dapat diperlambat dengan adanya antioksidan (Kulisic et al, 2003). Telah dilakukan penelitian terhadap herba pegagan (Centella asiatica (L) Urb.), yaitu uji aktivitas fraksi air dan fraksi etanol herba pegagan dengan metode TBA dan dengan metode DPPH (Fatmawati, 2005). Penelitian lain menyebutkan bahwa ekstrak etanol herba pegagan mempunyai aktivitas penangkapan radikal bebas yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak etanol daun pegagan (Herlina 2007). Sehingga perlu pula dipastikan aktivitas anti oksidan herba pegagan ini dengan metode lain seperti metode beta karoten asam linoleat ini, untuk memperjelas mekanisme antioksidannya. Perlu diketahui apakah kemampuan aktivitas herba pegagan dalam menangkap radikal bebas DPPH sebanding aktivitasnya dalam mengurangi terjadinya degradasi beta karoten akibat penangkapan radikal bebas peroksid oleh betakaroten. METODOLOGI Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: spektrofotometer UV-Vis (Pharmaspec 1700, SHIMADZU), kuvet, rotary evaporator, pengaduk vortex, neraca analitik, alat-alat gelas, mikropipet. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: pegagan (C. asiatica (L) Urb.), beta-karoten, asam linoleat, etanol 96% (p.a), quersetin (p.a), dan etanol 70% (kualitas farmasi).
Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Prosedur Penelitian Pembuatan ekstrak etanol herba pegagan Sebanyak 100 gram serbuk herba pegagan dimaserasi dengan etanol 70% sebanyak 70 ml selama 5 hari, dengan sebelumnya dilakukan pengawalemakan menggunakan PE. Kemudian sari etanol yang diperoleh diuapkan dengan vakum evaporator pada temperatur yang tidak lebih dari 40 C. Analisis antioksidan Metode β-karoten bleaching a. Penyiapan larutan sampel ekstrak dan pembanding Sampel ekstrak dan quersetin dibuat larutan stok dan dibuat seri kadar yang sama yaitu : 50, 100, 150, 200, 250 mcg/ml (dalam etanol). b. Pembuatan emulsi β-karoten–linoleat Emulsi β-karoten–linoleat dibuat dengan mencampurkan 2 ml larutan β-karoten (1 mg/ml dalam kloroform), 30 mg asam linoleat dan 200 mg Tween– 80. Campuran dihomogenkan hingga terbentuk emulsi, selanjutnya kloroform diuapkan. Residu dilarutkan dalam 60 ml aqua teroksigenasi dan divortex dengan ultrasonifikasi selama 4 menit. c. Penyiapan Kontrol Untuk penyiapan kontrol, diambil 2,0 ml emulsi β-karoten–linoleat dan 0,2 ml etanol. Campuran ini kemudian diinkubasi pada suhu suhu 50ºC selama 0 dan 60 menit. Sebagai blangko, digunakan 2,0 ml emulsi asam linoleat (seperti larutan b tanpa β-karoten) dan ditambahkan 0,2 ml etanol. d. Penentuan waktu inkubasi Diambil salah satu seri larutan sampel diambil 0,2 ml. Campuran kemudian ditambahkan ke dalam 2,0 ml emulsi β-karoten–linoleat. Campuran selanjutnya diinkubasi di tempat gelap pada suhu 50ºC selama 90 menit. Setiap interval 15 menit dibaca serapannya. Inkubasi dihentikan pada saat diperoleh serapan larutan β-karoten yang stabil. Sebagai kontrol, diambil 2,0 ml emulsi β-karoten–linoleat dan ditambahkan 0,2 ml etanol. e. Penentuan aktivitas antioksidan Larutan sampel masing–masing konsentrasi diambil 0,2 ml. Campuran kemudian ditambahkan ke dalam 2,0 ml emulsi β-karoten–linoleat. Campuran selanjutnya diinkubasi di tempat gelap pada suhu 50ºC selama 0 dan 60 menit. Serapan dibaca pada λ 460 nm dalam spektrofotometer UV–Vis. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. Sebagai blangko, digunakan 2,0 ml larutan emulsi asam linoleat (seperti larutan b tanpa β-karoten) ditambahkan ke dalamnya 0,2 ml sampel dengan konsentrasi yang sama dengan konsentrasi sampel yang sedang dibaca serapannya.
178
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol ... (Nina Salamah dan Nurushoimah)
.Analisis Hasil Analisis hasil pengujian aktivitas antioksidan dengan metode β-karoten–linoleat dilakukan dengan mengitung nilai % antioksidan. Aktivitas antioksidan sampel dihitung sebagai persen inhibisi relatif terhadap kontrol setelah diinkubasi selama t menit menggunakan rumus (1) Antioxidan activity = [ 1-(A0 - At ) / ( ) ] x 100 0 ......(1) A adalah absorbansi sampel waktu 0 menit dan At adalah absorbansi sampel waktu t menit. Sedangkan adalah absorbansi control waktu 0 menit dan adalah absorbansi control waktu t menit. HASIL DAN PEMBAHASAN Pegagan (Centella asiatica L.) diperoleh dari desa Ngargosari, Kecamatan Samigaluh, Kulonprogo. Pengambilan bahan utama diambil dari satu tempat. Hal ini bertujuan untuk menghindari variasi kandungan senyawa aktif dalam tumbuhan. Apabila tumbuhan diambil pada tempat yang berbeda-beda dapat menyebabkan kandungan senyawa aktif dalam tanaman bervariasi kadarnya karena dipengaruhi oleh faktor lingkungan tempat tumbuh. Metode maserasi merupakan ekstraksi dengan pelarut cara dingin, tidak memerlukan pemanasan yang dapat merusak zat aktif dalam pegagan. Sebelum dilakukan proses maserasi dengan etanol 70%, serbuk pegagan terlebih dahulu dilakukan pengawalemakan yaitu direndam dengan petroleum eter. Pengawalemakan bertujuan untuk menarik zat yang bersifat non polar seperti lemak dan zat non polar lainnya. Filtrat hasil maserasi dikumpulkan, kemudian diuapkan dengan rotary evaporator dengan suhu tidak lebih dari 60 C hingga diperoleh ekstrak kental. Penggunaan rotary evaporator akan mempermudah pengontrolan suhu dan untuk meminimalkan resiko terjadinya oksidasi oleh udara yang mungkin terjadi selama proses penguapan yang akan merusak senyawa-senyawa antioksidan. Selain manfaat tersebut, dilihat dari segi ekonomi, cairan penyari hasil penguapan dapat digunakan kembali. Ekstrak kental yang diperoleh ditimbang dan dihitung rendemennya. Hasil rendeman ekstrak 13,197 %. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol herba pegagan secara kuantitatif ditentukan dengan metode penghambatan degradasi beta karoten dengan alasan bahwa herba pegagan mengandung senyawa antioksidan yang dapat menstabilkan radikal bebas. Prinsip dari metode ini adalah hilangnya warna kuning akibat dari reaksi -karoten dengan radikal bebas yang
dibentuk oleh oksidasi emulsi asam linoleat, kecepatan pemutihan dapat diperlambat dengan adanya antioksidan. Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol herba pegagan dibandingkan dengan kontrol positif quersetin yang merupakan senyawa yang telah diketahui mempunyai aktivitas antioksidan yang tinggi. Quersetin dipilih sebagai kontrol positif karena dilihat dari strukturnya memiliki 5 gugus OH yang dapat menangkap radikal bebas. Quersetin merupakan suatu senyawa flavonoid yang termasuk dalam derivat seyawa polifenol dan diketahui memiliki aktivitas antioksidan pada pengujian dapat menghambat penyerangan radikal bebas asam linoleat terbentuk melalui abstraksi atom hidrogen dari satu gugus metilen diallilik. Radikal bebas tersebut menyerang ikatan rangkap tidak jenuh β–karoten. Adanya sampel yang mempunyai daya antioksidan akan menetralkan radikal bebas asam linoleat, sehingga mencegah terjadinya degradasi β–karoten. Hal tersebut dibuktikan dengan absorbansi beta karoten jika ditambah dengan quercetin lebih besar dari absorbansi kontrol sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini dapat digunakan untuk menentukan aktifitas antioksidan sampel. Sedangkan pada ekstrak etanol herba pegagan diketahui mengandung senyawa polifenol dan flavonoid. Mekanisme reaksi dari aktivitas antioksidan dapat dilihat dari seberapa besar antioksidan dapat memperlambat kecepatan pemutihan dari beta karoten yang semula berwarna kuning terang. Atom H dari senyawa flavonoid dapat menstabilkan radikal peroksida sehingga degradasi beta karoten dapat dihambat. Senyawa flavonoid yang terkandung dalam ekstrak kehilangan atom H akan menjadi radikal bebas yang stabil akibat adanya efek resonansi aromatik. Kemampuan antioksidan pada ekstrak etanol herba pegagan dalam memperlambat kecepatan pemutihan beta karoten dapat diukur secara kuantitaif dengan melihat absorbansi beta karoten yang tidak terdegradasi. Semakin besar konsetrasi sampel uji maka semakin besar absorbansi beta karoten yang dihasilkan. Pengukuran aktifitas antioksidan dengan metode penghambatan degradasi beta karoten pada penelitian ini menggunakan spektrofotometri visibel Alat instrumen tersebut sering digunkan dalam analisis kuantitatif karena bersifat sensitif dan spesifik. Tahap pertama yang dilakukan adalah penentuan waktu inkubasi. Penentuan waktu inkubasi dilakukan tiap 45 menit sampai absorbansi beta karoten yang dihasilkan mendekati 0, Pada penelitian ini sulit untuk mencapai absorbansi mendekati 0, sampai pada menit ke 225
Tabel I. Penentuan Waktu Inkubasi Waktu (Menit) 45 90 135 180 Kontrol 0,416 0,404 0,355 0,345 Replikasi 1 0,518 0,481 0,462 0,449 Replikasi 2 0,514 0,480 0,466 0,446 Replikasi 3 0,515 0,482 0,465 0,443 179
225 0,324 0,432 0,438 0,431
FARMASAINS Vol 2 No. 4, Oktober 2014
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Tabel II. Persen Aktivitas Antioksidan Quercetin % aktivitas antioksidan 50 100 mcg/ml 150 mcg/ml 200 mcg/ml mcg/ml 79,4% 88,06% 95,82% 97,91% 78, 51% 88,36 % 95,82% 96,72% 78,51% 89,55% 96,42% 98,81%
250 mcg/ml 98,21% 97,02% 99,10%
Tabel III. Persen Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Herba Pegagan % aktivitas antioksidan 50 100 150 200 250 mcg/ml mcg/ml mcg/ml mcg/ml mcg/ml Replikasi 1 67,73 % 62,4% 71,73% 66,4% 69,07% Replikasi 2 59,47% 60 % 75,2% 68,27% 67,2% Replikasi 3 62,93% 67,47% 78,9% 67,2% 68,53%
absorbansi yang didapat konstan pada 0,324 sehingga pada menit ke 225 ditetapakan sebagai waktu inkubasi. Waktu inkubasi digunakan juga sebagai operating time. Tahap selanjutnya adalah penentuan panjang gelombang maksimal. Setiap kali pembacaan absorbansi harus dibaca panjang gelombang beta karoten, karena beta karoten mudah terdegradasi sehingga dimungkinkan panjang gelombangnya berubah. Prinsip dari metode ini adalah membaca sisa beta karoten yang tidak terdegradasi sehingga jika dibaca pada panjang gelombang maksimal pada tiap pembacaan akan diperoleh serapan beta karoten yang maksimum. Panjang gelombang maksimum beta karoten secara teoritis adalah sebesar 470 nm. Pada percobaan panjang gelombang maksimum beta karoten yang didapat adalah 459,40 nm dengan absorbansi 0,820. Kontrol positif pada penelitian ini adalah quersetin. Aktifitas antioksidan quercetin akan dibandingan dengan aktifitas antioksidan dari ekstrak etanol herba pegagan. Aktifitas antioksidan quercetin dan ekstrak etanol herba pegagan sebagai penghambat degradasi beta karoten dinyatakan dalam persen, dapat dilihat pada tabel II dan III. Dari Tabel II persen aktivitas antioksidan quercetin tersebut semakin besar konsentrasi quercetin m aka semakin besar % akitivitas antioksidannya, Hal ini menunjukkan bahwa quersetin memiliki kemampuan dalam menghambat degradasi betakaroten akibat adanya radikal bebas peroksid yang berasal dari peristiwa oksidasi asam linoleat. Dari Tabel III persen aktifitas antioksidan ekstrak etanol herba pegagan, semakin tinggi konsentrasi tidak berbanding lurus dengan % aktivitas antioksidan. Hal tersebut kemungkinan terjadi karena konsentrasi masing-masing ekstrak tidak selalu menunjukkan konsentrasi senyawa flavonoid yang terkandung didalamnya. Ekstrak etanol herba
pegagan mengandung senyawa lain selain flavonoid yang ikut tersari dalam ekstrak yang perlu penelitian lebih lanjut terkait aktivitasnya sebagai antioksidan. Pada konsentrasi yang sama terlihat jelas bahwa kemampuan antioksidan quersetin yang merupakan senyawa flavonoid lebih besar dibanding ekstrak etanol herba pegagan apabila dilihat dari nilai persen aktivitas antioksidan yang diperoleh. Sehingga kemampuan quersetin dalam menghambat degradasi beta karoten akibat menangkap radikal bebas hidrogen peroksida yang berasal dari hasil oksidasi asam linoleat lebih besar dibanding ekstrak etanol herba pegagan. Tapi dalam penelitian ini belum dapat ditentukan harga ES50 yaitu kadar berapa dari herba pegagan yang memiliki kemampuan 50% dalam menangkap radikal bebas karena dengan kadar terkecil saja sudah diperoleh persen antioksidan lebih besar dari 50 % dan apabila dilakukan ekstrapolasi maka aktivitas yang diperoleh menjadi negatif. Berdasarkan hasil penelitian ini, sebenarnya sudah bisa memberikan gambaran bahwa mekanisme antioksidan ekstrak etanol herba pegagan dalam menangkap radikal bebas dengan metode DPPH (Herlina, 2007) ternyata sebanding dengan kemampuan antioksidan dalam menghambat degradasi beta karoten linoleat akibat kemampuan betakaroten dalam menangkap radikal bebas dari hidrogen peroksida, sehingga kemampuan herba pegagan bila dimanfaatkan sebagai antioksidan selain memiliki kemampuan untuk menangkal radikal bebas juga dapat digunakan menghambat degradasi senyawa anti oksidan akibat adanya radikal bebas. KESIMPULAN Aktivitas antioksidan Ekstrak etanol pegagan ( Centella asiatica L.) memiliki dengan mekanisme menghambat degradasi senyawa antioksidaan akibat adanya radikal bebas lebih kecil dibanding quersetin. Perbedaan kandungan flavonoid dalam ekstrak etanol
180
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol ... (Nina Salamah dan Nurushoimah)
herba pegagan dan standart quersetin memberikan perbedaan persen aktivitas antioksidan. SARAN Perlu dilakukan uji aktivitas antioksidan terhadap ekstrak etanol herba pegagan dengan metode antioksidan mekanisme yang lain dan juga uji antioksidan secara in vivo untuk lebih memperjelas mekanismenya. DAFTAR PUSTAKA Fatmawati., Nur, 2005, Uji Aktifitas Antioksidan Fraksi Air dan Fraksi Etanol Infusa Herba Pegagan (Centella asiatica (L) (urb), Skripsi, Fakultas Farm asi Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta, Yogyakarta:44. Herlina, Tetie. 2007. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas Ekstrak Etanol Daun dan Herba Pegagan (Centella asiatica (L.) Urb.) dengan Metode DPPH (1,1-difenil- 2-pikrilhidrazil), Pharmaciana, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta. Hernani, Rahardjo M., 2005, Tanaman Berkhasiat Antioksidan, Penebar Swadaya Wisma Hijau, 9–15. Kulisic,T., Radonic, A., Katalinic, V.,Milos, M., 2003, Use of Different Methods For Testing Antioxidative Activity Of Oregano Essential Oil , Food Chemistry : 633–640 Kumalaningsih, Sri., 2006, Antioksidan Alami Penangkal Radikal Bebas Sumber, Manfaat,
181
Cara Penyediaan dan Pengolahan. Surabaya, Trubus Agrisarana. Kusumawati, Ratna., 2007, Pemberian Infusa Pegagan (Centella asiatica L Urban) terhadap Proliferasi Sel Fibroblast pada Proses Penyembuhan Luka: : Eksperimental Laboratoris Pada Tikus Putih Strain W istar, Tesis, Universitas Airlangga, Surabaya Pourmorad, F., Hosseinimehr, SJ., Shahabimajd, N, 2006, Antioxidant Activity, Phenol and Flavonoid Contents of Some Selected Iranian Medical Plant, African Journal of Biotechnology, 5 (11): 1142-1145 Regina, A., Yovita, L., dan Maimunah, 2008, Penentuan Aktivitas Antioksidan, Kadar Fenolat Total, dan Likopen Pada Buah Tomat (Solanum lycopersicum L), Jurnal Sains dan Teknologi, Vol. 13. No. 1. Tan, DX., Reiter, RJ., Manchester, LC., Yan, MT., Sainz, MERM., Mayo, JC., Kohen, R., Allegra, MC., Hardelan, R., 2013, Chemical and Physical Properties and Potential Mechanisms: Melatonin as a Broad Spectrum Antioxidant and Free Radical Scavenger, University of Texas Health Sciene Center, Texas. Zheng CJ, Qin LP., 2007, Chemical components of centella asiatica and their bioactivities. J Chin Integr Med ; 5(3): 348-351
