SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA KLINIKAI ORVOSTUDOMÁNYOK TUDOMÁNYÁGI DOKTORI ISKOLA Vezető: Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanár „BŐRGYÓGYÁSZAT ÉS VENEROLÓGIA” CÍMŰ PROGRAM
ÚJ MEGFIGYELÉSEK AUTOIMMUN HÓLYAGOS BŐRBETEGSÉGEKBEN
Dr. Preisz Klaudia Doktori értekezés (Ph.D.) tézisei
Budapest, 2005.
Programvezető: Prof. Dr. Kárpáti Sarolta Ph.D., D.Sc. Témavezető:
Prof. Dr. Kárpáti Sarolta Ph.D., D.Sc.
1
BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK A SE Bőr-Nemikórtani és Bőronkológiai Klinika nagy forgalmú járó- és fekvőbeteg osztályain 1998 és 2003 között több, mint 4000 olyan beteg fordult meg, akiknél autoimmun bőrbetegség fennállásának lehetősége merült fel. Az 5 éves periódus alatt a betegek vér- és szövetmintáin elvégzett 2180 direkt és 4435 indirekt immunfluoreszcens (IF) vizsgálat értékelése során lehetőségem nyílt arra, hogy a szokatlan lefolyású kórképeket, ritka kórformákat részletesen tanulmányozzam. Az immunhisztológiai vizsgálatok segítségével 108 bullosus pemphigoidot, 21 linearis IgA dermatosist, 2 herpes gestationist, 2 epidermolysis bullosa acquisitát, 2 bullosus szisztémás lupus erythematosust, 48 pemphigus vulgarist, 8 pemphigus foliaceust, 5 IgA pemphigust, 5 paraneoplasticus pemphigust azonosítottam. 116 esetben igazoltam dermatitis herpetiformist, valamint 103 glutén-szenzitív enteropathia gyanújával vett bélmintán 53 esetben igazoltam a bélbetegséget. A szokatlan klinikai kórformákat rögzítettem. A rutin feladatok elvégzése mellett kapcsolódtam a klinika immunfluoreszcens laboratóriumában működő kutatócsoport munkájához, melynek tudományos tevékenysége nyomán az elmúlt években az autoimmun hólyagos kórképek területén számos új megfigyelés született: A pemphigus vulgaris antigén desmosomalis lokalizációjú protein (1993). A desmoglein 1 antigénje lehet az IgA pemphigusnak (2000). Ultrastruktúrális vizsgálatok elsőként igazolták, hogy a linearis IgA dermatosis egy összetett betegségcsoport, melyben az anchor rostok is antigének (1992). Szintén ultrastruktúrális vizsgálatok bizonyították, hogy herpes gestationisban a basalis membrán elleni, IgG ellenanyagok a lamina lucidában lévő anchor filamentumokhoz kapcsolódnak (1991). Dermatitis herpetiformisban (DHD) vékonybélhez kötődő, IgA típusú antitestek mutathatók ki, melyek az enteropathiára jellemzőek, és glutén-szenzitív bélbetegségekben a bélben is kimutathatók (1988, 1990). DHD-ban szenvedő betegek bőrében a dermalis IgA csapadék antigénje az epidermalis transzglutamináz (2002). Kutatócsoportunk bullosus dermatózisok területén elért eddigi eredményeihez csatlakozva, elsősorban a dermatitis herpetiformis és a paraneoplasticus pemphigus (PNP) pathomechanizmusát tanulmányoztam. Paraneoplasztikus pemphigusban a lichenoid bőrtünetekkel és súlyos tüdőszövődménnyel járó kórformák immunológiai sajátosságait vizsgáltam: új, vagy tünet-specifikus ellenanyagokat kerestem. Dermatitis herpetiformisban és coeliakiában szenvedő betegeknél a vékonybélben detektálható, kóros IgA depozitum és a szöveti transzglutamináz (TGc) eloszlását hasonlítottam össze. DHD-s betegekben emellett a klinikailag sokszor sejthető vasculitis meglétét vizsgáltam, és a dermalis papillákban kimutatható IgA csapadék keletkezéséről szerettem volna információt nyerni: mennyiben igazolható az erekben egy esetleges immunkomplex kicsapódás során az immunglobulinok, komplement jelenléte, mint vasculáris reakció. A betegek jelentős részében kimutatható vascularis immunglobulin és komplement csapadék miatt ezt követően vizsgáltam az epidermalis transzglutamináz (TGe) kimutathatóságát is az erekben.
2
BETEGEK ÉS MÓDSZEREK Beteganyag Az elvégzett több, mint 6500 IF vizsgálat során 116, kezeletlen DHD-s beteg bőrmintáján (életkoruk:4-79 év, átlagéletkor:28 év, férfi/nő=61/55) vizsgáltam, hogy részt vesznek-e a dermalis erek a kezdeti bőrtünetekben. A hagyományos DIF vizsgálat mellett 16 beteg esetében kettős immunfluoreszcens módszer alkalmazásával analizáltam az epidermalis transzglutamináz megoszlását az erekben. 15 beteg (5 DHD, 5 coeliakia, 5 egyéb gastroenterális betegség) felső panendoscopia során vett biopsziás vékonybélmintáját tanulmányoztam azzal a céllal, hogy összehasonlítsam a vékonybélben a TGc és a szövetekhez kötött IgA megoszlását. Paraneoplasticus pemphigusban szenvedő betegek autoantigénjeinek és tüdő elleni keringő antitestjeinek vizsgálata során egy esetben (48 éves nőbeteg) állt módomban új immunológiai megfigyeléseket tenni. Dolgozatomban ritkasága és a klinikai tünetek sajátságai miatt külön tárgyalom 3 IgA pemphigusban, 2 nyálkahártya pemphigoidban, 1 nodularis pemphigoidban és 2 linearis IgA dermatosisban szenvedő beteg kórtörténetét. Módszerek Direkt immunfluoreszcens vizsgálatok Direkt immunfluoreszcens vizsgálatokat végeztem a leggyakrabban vizsgált bőrminta mellett conjunctiván, száj-genitalis nyálkahártyán, és vékonybél metszeteken. DHD-s betegek bőr-és bélmintáit kettős immunfluoreszcens módszerrel is analizáltam: anti-TGe, illetve anti-TGc antitestekkel is megfestettem a metszeteket. A TGe lokalizálására rekombináns humán TGe proenzim elleni, affinitás-tisztított nyúl antiszérumot használtam. A TGc-t kétféle antitestből álló, egér monoklonális antitest keverékkel, az IgA ellenanyagokat poliklonális, antihumán IgA-val detektáltam. A metszeteket hagyományos immunfluoreszcens és konfokális mikroszkóp segítségével értékeltem. Indirekt immunfluoreszcens vizsgálatok Az indirekt IF vizsgálatokhoz a beteg tüneteinek, illetve a DIF hisztológia eredményének megfelelően választottam szubsztrátot. Leggyakrabban majom, egyes esetekben nyúl nyelőcsövet, normál humán bőrt, tengerimalac oesophagust, patkány vizelethólyagot és patkány tüdő szövetet használtam. Az endomysium, basalmembrán, illetve desmosoma ellenes keringő antitestek vizualizálása antihumán IgG és IgA ellenanyagok, a rutin vizsgálatok negativitása esetén a megfelelő alcsoportú (IgG1, IgG4, IgA1), jelzett antitestek segítségével történt. A pemphigoid csoportba tartozó kórképek analízisét salt-split skin (SSK) indirekt immunfluoreszcens módszer alkalmazásával egészítettem ki, melynek során egészséges egyénből származó, 1 M-os NaCl oldattal hasított bőrmintához adtam a bullosisban szenvedő beteg szérumának hígítási sorát. PNP-ban szenvedő betegeinknél a kórkép ritkasága miatt különböző módszerekkel: cDNA transzfekciós vizsgálatok sejttenyészetben, immunoblot, ELISA próbáltuk az autoantigéneket azonosítani.
3
cDNA transzfekciós vizsgálatok sejttenyészetben (kollaborációban végzett vizsgálat) COS-7 sejtek tranziens transzfekciója a gyári előírás szerint történt a Lipofectamin segítségével. A humán desmocollin 1 (Dsc1) és Dsc2 konsztraktja a teljes kódoló szekvenciát tartalmazta, melyeket a pcDNAI/Amp eukarióta expressziós vektorba szubklónoztunk. A teljes kódoló szekvenciát tartalmazó Dsc3 a pcDL-SRa296 eukarióta expressziós vektorba került beillesztésre. A kettős festéshez a Dsc1, 2, 3-mal transzfektált COS-7 sejteket hígított betegsavóval és nyúlban termelt anti-Dsc ellenanyagokkal inkubáltuk, majd jelzett antihumán IgA, illetve anti-nyúl IgG ellenanyagokkal hoztuk össze. Immunoblot technika (kollaborációban végzett vizsgálat) A humán epidermis homogenizátumából gélen szeparált, majd blottolt proteineket a betegek, illetve kontroll individuumok szérumával inkubálva, az IgG ellenanyagok kötődését peroxidáz reakcióval vizualizáltuk. A vizsgálatokat patkány tüdő extraktumon, valamint BP180 NC16a protein blottolt preparátumain is elvégeztük. ELISA (kollaborációban végzett vizsgálat) Dsg1 és Dsg3, valamint Dsc1, Dsc2, Dsc3 rekombináns proteinekkel végeztünk ELISA vizsgálatot IgG és IgA antitestek kimutatására, PNP-ban szenvedő betegeinknél. Az expressziós vektorok a Dsg1, Dsg3 és a Dsc1,2,3 teljes extracellularis doménjét tartalmazták. Az Sf9 rovarsejteket a rekombináns baculovírussal transzfektáltuk. Az így előállított, tisztított rekombináns proteinekkel végeztük az ELISA-t. A betegek hígított savóját a megfelelő antigénekkel fedett ELISA tálcában inkubáltuk, majd peroxidázzal jelzett, antihumán IgG-vel vagy IgA-val követtük az ellenanyagok kötődését. A színreakció kiváltásához tetramethylbenzidint, polyethylenglycol 4000-t, hydrogénperoxydot használtunk. EREDMÉNYEK ÚJ MEGFIGYELÉSEK PARANEOPLASTICUS PEMPHIGUSBAN 1. Új autoantigének azonosítása: Dsc2, Dsc3, BP180 Több paraneoplasticus pemphigusban szenvedő beteg vérmintájának vizsgálata során egy betegnél sikerült a kórképben eddig még nem publikált, „új” antigének ellen irányuló antitesteket azonosítanom. A direkt és indirekt IF vizsgálattal verifikált PNP-s beteg savójának humán epidermalis extraktumokon végzett immunoblot vizsgálatakor a szérum IgG a 210 kDa envoplakin és a 190 kDa periplakin mellett a BP180 NC16a doménjéhez is kötődött. Dsg1, 3 ELISA vizsgálatokkal Dsg3 ellenes, IgG és IgA típusú antitestek jelenlétét igazoltuk. Dsc1, 2, 3 ELISA technikával Dsc3 elleni, IgG ellenanyagot detektáltunk. Dsc1, 2, 3-mal transzfektált COS-7 sejteken végzett IIF vizsgálat igazolta, hogy a páciens savója Dsc3 elleni IgG és IgA, valamint Dsc2 ellenes IgG típusú antitesteket egyaránt tartalmaz. Hasonló eredményeket, illetve újonnan azonosított autoantigéneket azóta nem publikáltak a kórképben.
4
2. Tüdő elleni keringő antitestek kimutatása PNP-s beteg savójának patkány tüdő szöveten végzett IIF vizsgálata során a bronchiális epitheliumhoz kötődő, keringő IgG (1:320) és IgA (1:80) típusú antitestek jelenlétét igazoltam. A szérum patkány tüdő extraktumon elvégzett immunoblot vizsgálatával nem tudtuk a pulmonalis antigént (vagy antigéneket) azonosítani. ÚJ MEGFIGYELÉSEK DERMATITIS HERPETIFORMIS DUHRINGBAN 1. A bél immunológiai vizsgálatának eredményei Vizsgálataim során megállapítottam, hogy a glutén-szenzitív enteropathiára jellemző, specifikus IgA festődés mind coeliákiában, mind DHD-ban a szöveti transzglutaminázzal (TGc) kolokalizálódik a vékonybélben. A vizsgálatra 5 DHD-ban és 5 coeliakiában (CD) szenvedő beteg szövetmintáját választottam, akiknél kimutatható volt a tubularis IgA festődés a vékonybélben a bolyhok és a crypták basalmembránja (BM) mentén. A bélbopszián átesett, nem gluténszenzitív enteropathiában szenvedő betegek (kontroll csoport) közül egynél sem (5/5) észleltem kóros IgA festődést a bélbolyhokban a lamina propria mentén. A TGc eloszlása, festődési mintázata az összes betegnél (DHD, CD és kontroll csoport) gyakorlatilag megegyező képet mutatott a vékonybélben. Kettős festéssel végzett DIF vizsgálat során DHD-s és CD-s betegekben a monoklonális anti-TGc és az IgA elleni anitestek kötődése azonos festődési mintázatot adott a vizsgált bélbolyhokban. Konfokális mikroszkóppal vizsgálva az extracellularis, szövetekhez kötött IgA és a TGc kolokalizációját figyeltem meg a vizsgált glutén-szenzitív (DHD és CD) betegekben. 2. A dermatitis herpetiformis Duhring-os bőrben észlelhető érfestődések vizsgálata A 116, kezeletlen DHD-s beteg közül 74 esetben (64%) figyeltem meg szignifikáns érfestődést a dermisben a DHD-ra jellemző granuláris, IgA pozitív csapadék mellett DIF-val: IgA pozitív érfestődést 18 betegben, IgA és C3 fluoreszcenciát 39-ben, IgA, C3 és IgM pozitív érfestődést 5 esetben verifikáltam. 12 beteg bőrmintájában kizárólag IgM pozitív fluoreszcenciát detektáltam. IgG-vel kórjelző eltérést nem találtam. 68 betegben (92%) az érfestődés kizárólag a papillaris dermis kis ereiben volt megfigyelhető. 6 betegben (8%) emellett subpapillaris IgA és C3 pozitív érfestődést is találtam. Kettős immunfluoreszcens vizsgálattal (16/16) az IgA és a TGe egyértelmű kolokalizációját figyeltem meg az érfalakban és a jellegzetes papillaris IgA granulumokban egyaránt. Ezzel ellentétben a C3 és a TGe csak részben kolokalizálódott, több ér kizárólag TGe-vel festődött, C3-mal negatív maradt. A TGe és az IgM megoszlása nem volt identikus a vizsgált mintákban. A TGc dermalis festődése sem az immunglobulinokéval, sem a komplementével nem esett egybe.
5
KÖVETKEZTETÉSEK ÉS AZ EREDMÉNYEK HASZNOSÍTÁSA PARANEOPLASTICUS PEMPHIGUS 1. Eredményeim alátámasztják, hogy a PNP pathomechanizmusa egy igen komplex folyamat, melyben a már ismert, diagnosztikus autoantigének mellett egyéb desmosomális és basalmembrán proteinek is antigénként szerepelhetnek. 2. Vizsgálataim igazolták, hogy a Dsg ellenes antitestekhez hasonlóan a Dsc2 és Dsc3 desmosomális autoantigénekhez kötődő ellenanyagok is szerepet játszanak a kórkép pathomechanizmusában bizonyos PNP-s betegekben. 3. Kimutattam, hogy a BP180 elleni antitestek nem kizárólag a pemphigoid csoportba sorolt kórképeknél jelenhetnek meg. A BP230 molekulával „keresztreagáló” desmoplakin ellenes antitestek mellett betegünkben a BP180 ellen irányuló antitestek jelenléte magyarázza a keratinocyta sejtmembrán mellett a BM mentén is megfigyelhető, szignifikáns ellenanyag kötődést. 4. A bronchushám elleni keringő, IgG és IgA típusú ellenanyagok kimutatása PNP-ban valószínűsíti a tüdő ellenes antitestek pathogenetikai szerepét a súlyos pulmonális tünetek kialakulásában. DERMATITIS HERPETIFORMIS DUHRING 1. A kóros IgA depozitum DHD-s és coeliákiás betegek vékonybélbolyhaiban a TGcvel kolokalizálódik, és a keringő IgA antitesteknek felel meg. 2. A dolgozat lezárását követő vizsgálataink a fenti eredményeket nagy beteganyagon is megerősítették, így új immunhisztokémiai módszer széleskörű bevezetésére van lehetőség a glutén-szenzitív enteropathia diagnosztikájában. 3. A DHD-s betegek bőrében detektált IgA és C3 pozitív érfestődés, elsősorban a dermis superfitialis kis ereiben alátámasztja azt a hypotézist, hogy a DHD pathomechanizmusában fontos szerepet játszanak a keringő, majd a bőr ereiben precipitálódó immunkomplexek. 4. Az IgA és a TGe kolokalizációja az érfalakban tovább erősíti a TGe (és nem a TGc) jelentőségét a bőrtünetek kialakulásában.
6
AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Preisz K, Kárpáti S, Hársing J, Horváth A: Nodularis pemphigoid. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 2001, 77: 87-89. A Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 2001. évi nívódíját elnyert közlemény Preisz K, Kárpáti S, Marschalkó M, Horváth A: Mit tudunk az IgA pemphigusról? Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 2001, 77:57-60. Torma K, Szalai Zs, Török É, Preisz K, Hársing J: Pemphigus vegetans gyermekkorban. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 2002, 78:193-196. Preisz K, Holló P, Szakonyi J, Kárpáti S, Horváth A: Malignomához társult linearis IgA dermatosis. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 2003, 79:107-109. Holló P, Preisz K, Nemes L, Bíró J, Kárpáti S, Horváth A: Linear IgA dermatosis associated with chronic clonal myeloproliferative disease. Int J Dermatol 2003, 42:143146. IF: 0,736 Preisz K, Horváth A, Sárdy M, Somlai B, Hársing J, Amagai M, Hashimoto T, Nagata Y, Fekete S, Kárpáti S: Exacerbation of paraneoplastic pemphigus by cyclophosphamide treatment: detection of novel autoantigens and bronchial autoantibodies. Br J Dermatol, 2004, 150:1018-24. IF: 2,445 Preisz K, Sárdy M, Horváth A, Kárpáti S: Immunoglobulin, complement and epidermal transglutaminase deposition in the cutaneous vessels in dermatitis herpetiformis. J Eur Acad Dermatol Venereol 2005, 19:74-79. IF: 1,401 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT ABSZTRAKTOK Preisz K, Kárpáti S, Sárdy M, Zágoni T, Horváth A: Codistribution of tissue transglutaminase and tissue-bound IgA in jejunum of patients with dermatitis herpetiformis. J Invest Dermatol 2000, 115:580. Preisz K, Kárpáti S: Analysis of vascular immunoglobulin and C3 deposition in skin of 116 dermatitis herpetiformis patients. J Invest Dermatol, 2001, 117:779. Preisz K, Hashimoto T, Amagai M, Horváth A, Kárpáti S: Detection of circulating IgG and IgA antibodies against pulmonary tissue in paraneoplastic pemphigus. J Invest Dermatol 2002, 119:725. EGYÉB KÖZLEMÉNYEK Marschalkó M., Preisz K., Hársing J., Horváth A.: Report on a case and review of data on pyoderma vegetans and cutaneous botryomycosis. Acta Dermatovenerologica A.P.A 4: 55-9, 1995
7
Preisz K, Kárpáti S, Baló-Banga JM, Somlai B, Horváth A: Gorlin-Goltz syndroma. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 72: 229-32, 1996 Preisz K., Bíró J., Szigeti Á., Horváth A.: Polycythaemia rubra vera talaján kialakult ulcus cruris. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 73: 81-2, 1997 Preisz K., Marschalkó M., Horváth A.: Salmonella fertőzéssel társult Reiter syndroma. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 73:135-8, 1997 Barabás É., Nagy K., Várkonyi V., Preisz K., Horváth A.: Hepatitis koinfekció HIV fertőzésben. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 73: 51- 5, 1997 Preisz K., Török I., Bíró J., Horváth A.: Sárga köröm syndroma és alopecia areata együttes előfordulása. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 74: 185-6, 1998 Kárpáti S., Csikós M., Cserhalmi-Friedmann P., Szalai Zs., Szőcs H., Körmendy M., Becker K., Preisz K., Burcsi N., Horváth A.: Az Országos Epidermolysis Bullosa Centrum megalakulása és ötéves működése. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 76:283-5, 2000 Preisz K., Temesvári E., Podányi B., Soós Gy., Kárpáti S., Horváth A.: Ketoprofen tartalmú gél használatát követően kialakult kontakt ekzema. Orvosi Hetilap 142:28412844, 2001 Hídvégi B., Preisz K., Hársing J., Marschalkó M., Horváth A.: Amyopathiás dermatomyositis dermalis calcinosissal. Esetismertetés és irodalmi áttekintés. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 77: 215-8, 2001 Preisz K., Kárpáti S., Kovács J., Horváth A.: Acrokeratosis paraneoplastica Bazex. Bőrgyógyászati és Venerológiai Szemle 78:199-200, 2002 Preisz K., Vámos R., Kárpáti S., Vadasdi K., Folyovich A., Podányi B., Horváth I., Várkonyi V., Horváth A.: Uveitissel társult korai syphilis. Magyar Venerológiai Archívum 5:135-138, 2002 Preisz K, Kárpáti S, Horváth A: Launois-Bensaude syndrome and Bureau-Barriére syndrome in a psoriatic patient: successful treatment with carbamazepine. Eur J Dermatol, 12(3):267-269, 2002 IF:0,807 EGYÉB ABSZTRAKTOK Sárdy M, Csikós M, Geisen C, Preisz K, Tomsits E, Töx U, Wieslander J, Kárpáti S, Paulsson M, Smyth N: Tissue transglutaminase (TGc) is a minor antigen in autoimmun disease independent of gluten sensitive enteropathy. J Invest Dermatol 117: 779, 2001
8
AZ ÉRTKEZÉS TÉMÁJÁBAN ELHANGZOTT NEMZETKÖZI ELŐADÁSOK Preisz K: Detection of autoantibodies in autoimmun bullous skin diseases. VI. Consensus Workshop of Central and Eastern European Countries: Autoantibody testing. Budapest, 1999. november 3-5. Preisz K., Kárpáti S., Sárdy M., Horváth A.: Codistribution of tissue transglutaminase and tissue-bound IgA in jejunum of patients with dermatitis herpetiformis. 3. Tagung der Deutsch-Ungarischen Dermatologischen Gesellschaft Lillafüred, 2000. aug. 25. Preisz K., Kárpáti S., Sárdy M., Hashimoto T., Amagai M., Nagata Y., Somlai B., Hársing J., Horváth A.: Graft versus host disease like, cyclophosphamide induced paraneoplastic pemphigus with autoantibodies against Dsc3 and BP180. XX. Bőrgyógyászati Világkongresszus, Párizs 2002. július 1-5. AZ ÉRTEKEZÉS ELŐADÁSOK
TÉMÁJÁBAN
ELHANGZOTT
TOVÁBBKÉPZŐ
Bullosus bőrbetegségek diagnosztikája és kezelése. Bőrgyógyászati szakvizsga előkészítő tanfolyam 2000.szeptember, HIETE Budapest Autoimmun bullosisok. Bőrgyógyászati szakmai továbbképző, szintentartó tanfolyam, SE Bőrgyógyászati Klinika 2000.október, Budapest Immunfluoreszcencia alkalmazása a bőrpathológiai diagnosztikában. Bőrpathológiai Elváltozások interdiszciplináris megközelítése. Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Pathológiai Intézet szakmai továbbképző tanfolyam 2001.03.21-23. IgA Pemphigus. A Magyar Immunológiai Társaság és a Magyar Allergológiai és Klinikai Immunológiai Társaság XI. Továbbképzése, Salgóbánya, 2001.04. 27-28. Ritka pemphigoid variánsok.Bőrgyógyászati szakmai továbbképző és szintentartó tanfolyam, SE Bőrgyógyászati Klinika, 2002. június 5-7., Budapest
9
