Tumorellenes hatóanyagok irányított célbajuttatása peptidekkel

⎯⎯⎯ Tudományos Diákköri Dolgozat ⎯⎯⎯

HEGEDÜS RÓZSA

Tumorellenes hatóanyagok irányított célbajuttatása peptidekkel

Témavezető: Dr.Mező Gábor tudományos tanácsadó Szerves KémiaiTanszék

⎯⎯⎯ Eötvös Loránd Tudományegyetem ⎯⎯⎯ ⎯⎯ Természettudományi Kar ⎯⎯ ⎯ Budapest, 2008 ⎯

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés .......................................................1 1.1. Daganatterápia................................................................................................................. 1 1.1.1. Sebészeti beavatkozás .............................................................................................. 2 1.1.2. Sugárterápia.............................................................................................................. 2 1.1.3. Immunterápia ........................................................................................................... 3 1.1.4. Hormonterápia.......................................................................................................... 3 1.1.5. Kemoterápia ............................................................................................................. 3 1.1.6. Irányított terápia ....................................................................................................... 4 1.2. Gonadotropin releasing hormon (GnRH)........................................................................ 6 1.2.1 A Gonadotropin releasing hormon típusai ................................................................ 6 1.2.1.1. GnRH-I.................................................................................................................. 7 1.2.1.2. GnRH-II ................................................................................................................ 8 1.2.1.3 MI-1892: H-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)DEA.................................................................................................................................... 9 1.2.1.4. GnRH-III ............................................................................................................... 9 1.3. A vinka alkaloidok ........................................................................................................ 10 1.3.1. Vinka alkaloidok hatásmechanizmusa ................................................................... 11 1.4. Daunorubicin................................................................................................................. 13 1.5. Peptidszintézis............................................................................................................... 14 1.5.1. Lépésenkénti szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) .................................................... 15 1.5.2. A SPPS két általánosan alkalmazott stratégia:....................................................... 16 1.5.2.1. Boc/Bzl stratégia ............................................................................................. 16 1.5.2.2. Fmoc/tBu stratégia:.......................................................................................... 17 1.5.3. Kapcsolási reakciók követése................................................................................. 20 1.5.4. A peptidek hasítása a gyantáról.............................................................................. 20

2. Célkitűzések ..................................................................................21 3. Eredmények ..................................................................................23 3.1 Peptidek szintézise ......................................................................................................... 24 3.1.1. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA előállítása .......................................................................................................................................... 24 3.1.2. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp(Leu-Gln-Pro-DAla-NH2)-DEA előállítása ............................................................................................... 25 3.1.3. A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-NH2 (GnRH-III(Aoa-GFLGC)) előállítása .............................................................................. 26 3.2. Biokonjugátumok előállítása......................................................................................... 26 3.2.1. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-AlaNH2)-DEA előállítása ...................................................................................................... 26 3.2.2. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA előállítása ............................................................. 27 3.2.3. A [Br-Vindolin-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Gly-Leu-Phe-Gly-Cys)-Asp-(Leu-GlnPro-D-Ala-NH2)-DEA]2 dimer előállítása ....................................................................... 27 3.2.4. A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-NH2 28 3.2.5. GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) konjugátum dimerizálása ....................................... 29 3.3. Biológiai vizsgálatok: A konjugátumok in vitro citosztatikus hatásának meghatározása MTT teszt alkalmazásával........................................................................... 30

4. Kísérleti rész .................................................................................32

4.1. H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise................................................................................................................ 33 4.2. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp((Leu-Gln-Pro-D-AlaNH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise ........................................................................... 35 4.3. GnRH-III(Aoa-GFLGC) (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Leu-Phe-GlyCys)-Pro-Gly-NH2) molekula szintézise, tisztítása, analízise.............................................. 36 4.4.Konjugátumok szintézise ............................................................................................... 36 4.4.1. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-AlaNH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise: ...................................................................... 36 4.4.2. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)-Asp((Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise.................................... 37 4.4.3. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA dimerizálása, tisztítása, analízise.......................... 38 4.4.4. GnRH-III(Aoa-GFLGC) molekula konjugálása daunorubicinhez, a konjugátum tisztítása, analízise............................................................................................................ 39 4.4.5. GnRH-III(Aoa-GFLGC) – Dau konjugátum dimerizálása, tisztítása, analízise .... 39 4.5. Citosztatikus hatásvizsgálatok MTT teszt alkalmazásával ........................................... 40

5. Összefoglalás .................................................................................42 6. Rövidítés jegyzék ..........................................................................43 7. Irodalomjegyzék ...........................................................................45

1. Bevezetés, irodalmi áttekintés A rák világszerte egyike a legfőbb halálozási okoknak. A statisztikák alapján a szív- és érrendszeri betegségek után a második leggyakoribb halálok. 2007-ben 7,9 millió ember halt meg rákban és a WHO ( Egészségügyi Világszervezet) becslései szerint a következő 10 évben 84 millió ember halálát okozza majd rákos megbetegedés, amennyiben nem tesznek megfelelő lépéseket ellene.1 1. táblázat: A haláleseteket okozó főbb ráktípusok a WHO adatai alapján 2007-ben: Daganat

tüdő

gyomor

máj

vastagbél

Emlő

Esetszám (millió)

1,4

0,866

0,653

0,677

0,548

Hazánkban is hasonló statisztikák születtek az elmúlt években (lásd függelék 2. táblázat)2, amely a népességszámot figyelembe véve az egyik legrosszabb Európában. Az orvosok és a biológusok véleménye megegyezik abban, hogy a rák keletkezésének oka az egészséges sejtek szaporodásában és érésében fennálló szabályozási egyensúly megbomlása.3 Ennek számos oka lehet (kémiai karcinogén anyagok; fizikai rákkeltők: például hő, dörzsölés; radioaktív sugárzás; onkogén vírusok), azonban a dolgozatomban részletesen ezekre nem térek ki. A munkám szempontjából sokkal fontosabb a már kialakult tumoros megbetegedések gyógyítása. Ezért az alábbiakban a terápiás módszereket foglalom össze röviden.

1.1. Daganatterápia4 Egyetlen általános gyógymódot találni a tumoros megbetegedések kezelésére nem lehet, ugyanis a rák kifejezés egy betegség osztályra vonatkozik, amely mintegy 130 féle daganatos megbetegedés gyűjtőfogalma. A malignus daganatok kezelésére többféle lehetőség van a daganat helyétől, méretétől, a betegség stádiumától függően. A gyógyítás történhet sebészeti úton, kemo-, radio-, immun-, illetve hormonterápiával, vagy ezek kombinációjával.5 Számos további rákkezelési lehetőség még kutatási fázisban van. A rák azonosítása után elsőként azt kell felmérni, hogy az milyen stádiumban van. Ezután dolgozható ki a terápia helyes stratégiája. A kezelések során a kóros sejtszaporodást próbálják kivédeni, pontosabban a sejtproliferációt megfékezni. Sajnos a jelenlegi gyógymódok nagy része ezáltal a normál sejtosztódást is érinti.

1

1.1.1. Sebészeti beavatkozás A daganatterápia során a legfőbb cél az, hogy a daganat teljes eltávolítása mellett ne okozzunk további sérülést a test egészséges szöveteiben. Ez gyakran megoldható sebészi beavatkozással, különösen a jól lokalizálható szolid tumorok esetén. A múlt században élt sebész professzor William Stewart Halsted által felállított modell szerint a daganat először lokálisan növekszik, majd átterjed a nyirokcsomókra, végül a teljes testre. A műtét sikerességét csökkentheti, ha a rák áttéteket képez távolabbi testtájakon, ugyanis ez esetben az összes tumoros szövetet nem lehet maradéktalanul eltávolítani. Ilyenkor a puszta szemmel nem látható rákos sejtek újra növekedésnek indulhatnak, és ezáltal kiújulhat a betegség. Sebészeti eljárást alkalmaznak például emlőrák esetén vagy prosztatarák esetén. A sebészeti beavatkozásnak a primer daganat eltávolításán kívül fontos szerepe van a betegség stádiumának megállapításában, továbbá, hogy megtudják a rák átterjedt-e már a szomszédos nyirokcsomókra.

1.1.2. Sugárterápia A sugárterápia (más néven radioterápia, röntgenterápia vagy sugárkezelés) a rákos sejtek elpusztításához és a tumor méretének csökkentéséhez ionizáló sugárzást használ. A sugárzást megpróbálják lokalizáltan irányítani, hogy csak a kezelni kívánt területet érintse. A kezelés során a kezelt terület sejtjei sérülnek, vagy pusztulnak el azáltal, hogy genetikai állományuk károsodást szenved, és képtelenné válnak a további növekedésre és osztódásra. A módszer hátrány, hogy a sugárzás a rákos és normál sejtekben is károsodást okoz. A sugárterápia célja az, hogy minél több rákos sejtet pusztítson el úgy, hogy közben minél kevesebb egészséges sejtben tegyen kárt. Emiatt a kezeléseket szakaszosan hajtják végre, hogy az egészséges szövetnek legyen elegendő ideje a gyógyulásra. A radioterápiát többféle szolid tumor kezelésére alkalmazzák (például agy-, emlő-, méhnyak-, gége-, tüdő-, hasnyálmirigy-, prosztata-, bőr-, gyomorrák vagy a lágyrészi szarkóma). A sugárkezelés használható leukémia és nyirokcsomódaganat kezelésére is. Az alkalmazott sugárzás dózisát számos tényező befolyásolja, mint például az egyes daganat típusok radioszenzitivitása, van-e a kezelendő terület közelében szövet vagy szerv, ami esetleg sérülhetne a sugárzás által.

2

1.1.3. Immunterápia A tumor immunterápia során a beteg saját immunrendszerét késztetik arra, hogy felvegye a harcot a daganat ellen. Jelenleg olyan vakcinák kifejlesztése a cél, amelyek specifikus immunválaszt adnak a rákos sejtek ellen. Ilyen gyógymódon dolgoznak például a malignus melanóma és a vese karcinóma ellen.

1.1.4. Hormonterápia Bizonyos hormonok túladagolásával vagy termelődésének direkt blokkolásával közvetlenül vagy több hormon egymásra hatásának folytán gátolhatjuk néhány tumortípus növekedését. A hormon-érzékeny tumorok közé tartoznak egyes emlő-, és prosztatarákok. Az ösztrogén és a tesztoszteron szint csökkentése gyakorta fontos kiegészítő kezelés a terápia során. A hormonkezelést gyakran alkalmazzák a sebészeti beavatkozás előtt a tumor visszafejlődése és jobb lokalizáltsága érdekében, vagy utána az esetleges metasztatizált tumorsejtek elpusztítására.

1.1.5. Kemoterápia A kemoterápia a rákos megbetegedések gyógyszerekkel ("antitumor hatású drogok") történő kezelésének típusa, amely során ezek a szerek elpusztítják a rákos sejteket. Néhány citosztatikum a teljesség igénye nélkül: • alkilezőszerek (DNS szintézis gátlása, vagy hibás replikáció, pl. melfalán), • antimetabolitok (a köztes anyagcsere vagy enzimek antagonistái, pl. metotrexát), • antibiotikumok (interkalációs komplexek, a DNS-be épülnek be, pl. daunorubicin), • antimitotikumok (orsómérgek, az osztódási orsó kialakulását gátolják, pl. vinblasztin).3 A kemoterápiás szerek különböző módokon zavarhatják meg a sejtosztódást például a DNS megkettőződést vagy az újonnan létrejött kromoszómák szétosztását akadályozhatják. A citotoxikus drogok minden gyorsan osztódó sejttípusra hatnak. Ezáltal nem specifikusak a rákos sejtekre, bár kis fokú specifikusság származhat abból, hogy a rákos sejtek egy része nem lesz képes a hibás DNS-ének kijavítására, ellentétben a normál sejtekkel. Ezen okok következtében a kemoterápia az egészséges szövetekre is káros lehet, különösen azokra, amelyek nagy arányban cserélődnek (például: bél hámsejtek). Ezek a sejtek a kemoterápiát követően kijavítják a kemoterápiás szer okozta károsodásaikat. Gyakran alkalmazzák ezeket a kemoterápiás gyógyszereket kombinációban, mert együtt 3

jobban hatnak az eltérő hatásmechanizmus miatt, mint külön-külön (kombinációs kemoterápia). Problémát okozhat azonban az, hogy a tumorsejtek rezisztensé válhatnak azokra a „mérgekre”, melyeket ellenük alkalmaznak (multidrog-rezisztencia, MDR). A kemoterápia a legáltalánosabban alkalmazott eljárás előrehaladott vagy áttételes rákos megbetegedések gyógyítására. A módszer hatékonyságát korlátozza a rákos sejtek kialakuló rezisztenciája, valamint a szelektivitás hiánya, mivel a kis molekulatömegű (kisebb, mint 1000 Da) hatóanyagok szabadon diffundálva a test minden szövetéhez eljuthatnak. Szintén problémát okoz a drog gyors kiürülése a véráramból, ami miatt néha nagy dózisokat kell alkalmazni, és ez jelentős toxikus mellékhatásokhoz vezethet. Az utóbbi években a rákkutatás azon megoldások felé fordult, amelyekkel, a hatóanyagokat sokkal szelektívebben, célzottan a tumorsejtekbe lehet juttatni. Így nagyobb hatékonyságú és kevesebb mellékhatással rendelkező terápiás eljárások születtek,

amelyek

többségének

bevezetése

jelentős

áttörést

jelenthet

a

21.

század

tumorterápiájában.6

1.1.6. Irányított terápia Az irányított terápia – amivel a dolgozatomban kiemelten kívánok foglalkozni – manapság a kutatások egy rendkívül aktív részét képezi. Az alapgondolat („Magic Bullet”) az éppen 100 évvel ezelőtt Nobel-díjjal jutalmazott német kutatótól, Paul Ehrlichtől származik. Ehrlich célja az volt, hogy olyan kémiai anyagot találjon, amelynek a kórokozó organizmus iránt specifikus affinitása van. Ezt úgy képzelte el, hogy a hatóanyag, mint antitoxin megtámadja a toxint, és „mágikus lövedékként” egyenesen a célzott szervezethez jut el. Mégpedig úgy, hogy olyan sejtfelszíni oldalláncokhoz kapcsolódik, amelyek a metabolizmus termékek asszimilálása miatt jelennek meg.7-9 Hosszú időnek kellett eltelnie addig, amíg ez az elv a gyógyászatban és különösen a tumorterápiában bevezetésre kerülhetett. A módszer ugyanis igényelte azt az ismeretet, amely jelentősen megkülönbözteti a rákos és egészséges sejtek felépítésében és működésében rejlő különbségeket, amelyek az irányított terápia célpontjai lehetnek. Először az 1990-es években vált lehetővé az ilyen jellegű kezelések alkalmazása, és vált jelentőssé egyes ráktípusok esetén. A terápia célkeresztjében a rákos sejtek szabályozás alól felszabadult fehérjéi állnak. A tumoros sejteknek egyedülálló biokémiai metabolizmusa van. Ezért a terápiás drogok általában a rákos sejtben található mutálódott, túlexpresszált vagy más okból kritikusnak számító fehérjék enzimatikus doménjeinek inhibitorai. Jelentős példái ennek a tirozin kináz inhibitorok pl. az imatinib és a gefitinib. Egy másik stratégia lehet a monoklonális antitest terápia, amelyben a terápiás ágens egy antitest, amely specifikusan kapcsolódik a rákos sejtek

4

egy bizonyos fehérjéjéhez. Ezen antitestekhez, mint irányító molekulákhoz további drog molekulák is kapcsolhatók a hatás fokozása érdekében. Az irányított terápiában célpontként olyan peptidhormon receptorok is szóba jöhetnek (mint pl.: GnRH, szomatosztatin, bombezin receptorai), amelyek a tumoros sejteken expresszálódnak nagy mennyiségben, és így citotoxikus ágenshez kötött peptid ligandumokkal célba vehetők. Mivel ezek a receptorok a tumoros sejteken sokkal nagyobb mennyiségben expresszálodnak, mint az egészséges sejteken, ezért segítségükkel jelentős szelektivitás érhető el a hatóanyagok rákos sejtbe juttatása során. A peptidhormonok és analógjaik a citotoxikus anyagot, mint hordozómolekula közvetlenül a tumorsejtekhez szállítják, így növelve a drog koncentrációt a tumoros sejtekben. Ezzel a módszerrel az egészséges sejtek megkímélhetők a drog felvételétől.

Az irányított tumorterápia számos előnnyel bír: ™ megnövekedett drog szelektivitás ™ oldékonyság növelése ™ a hatóanyag lassabb távozása a véráramból ™ stabilitásnövekedés a normál lebontó folyamatokkal szemben ™ retard/késleltetett hatás: egyenletes vérkoncentráció érhető el ™ kontrollált hatóanyag felszabadulás ™ csökkent toxikus mellékhatások ™ a rákos sejtek multidrog-rezisztenciájának elkerülése Fluid endocitózis

Milyen molekulákkal vehetjük célba a sejteket? Diffúzió/aktív transzport

cukor molekulák

Receptor mediált endocitózis

lektinek receptor ligandumok antitestek

lizoszóma

hormonok

receptor

Hatás kifejtés helye

lizoszóma

degradáció degradáció

1. ábra: Hatóanyagok irányított célbajuttatásának mechanizmusa. 5

1.2. Gonadotropin releasing hormon (GnRH) A gonadotropin releasing hormon, vagy más néven luteinizáló hormon releasing hormon (LHRH) a hipotalamuszban képződő és szekretálódó dekapeptid hormon. A hipofízisen keresztül jut el az adenohipofízisbe, majd a GnRH receptorokhoz kapcsolódva szabályozza a gonadotróp hormonok (FSH, LH) szekrécióját.10 Az FSH szabályozza az emberi szervezet növekedését, fejlődését, pubertáskori érését és a szaporodási folyamatokat. A nők esetén a FSH a petefészekben a primer follikulusokat (tüszőket) serkenti érésre, valamint az ösztrogén termelődését szabályozza. A tűsző növekedés hatására inhibin szabadul fel, amely leállítja az FSH termelődését. A férfiaknál a herében található Sertoli-féle dajkasejtek androgénkötő fehérjéinek termelődését fokozza ezáltal a spermatogenezisben is fontos szerepet tölt be. A LH hirtelen megnövekedése váltja ki a nők szervezetében az ovulációt.11 A férfiak esetében a LH, vagy ICSH (intersticiális sejt stimuláló hormon) a Leydig sejtek tesztoszteron termelését stimulálja.

1.2.1 A Gonadotropin releasing hormon típusai Az előgerinchúrosokban és gerincesekben 23 GnRH variánst azonosítottak. Számos gerincesben 3 különböző GnRH-t és azok receptorait ismerték fel, amelyek eltérő módon oszlanak el a szervezetben, és funkciójuk is más és más. Az elsőként izolált Glp-His-Trp-SerTyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH213 szekvenciájú emlős GnRH-nak már számos természetes analógját azonosították. Mivel a GnRH az emlősök szaporodásában rendkívül fontos szerepet játszik, ezért más állatfajok szervezetében is megpróbálták ugyanezen családba tartozó változatokat fellelni. A gerincesek szervezetében talált néhány GnRH-analógot a függelék 3. táblázatában foglaltam össze. Az összes típus megegyezik abban, hogy 10 aminosavból épül fel, és szekvenciájuk legalább 50%-a azonos. A különbségek az 5.-8. aminosavakban vannak.14 Kezdetben azt gondolták, hogy az elsőkent felfedezett, a hipofízisben található GnRH az egyetlen fajtája az emlősökben megtalálható hormonnak. Ezért a későbbiekben, a további GnRH peptidek felfedezése után a humán GnRH-t nevezték el GnRH-I-nek, amely a mai napig párhuzamosan használatos az irodalomban a hGnRH es az LHRH jelölésekkel. Később egy újabb formáját is azonosították a hormonnak az emberi agyban és a perifériás szövetekben, amelyet azonban először a csirke agyból izolálták (innen a név: cGnRH). Ez a típus a halaktól az emberi szervezetig mindenhol azonos szerkezetben található meg, amely azt sugallja, hogy fontos szerepe és saját receptora(i) van(nak). Ez a típus kapta a GnRH-II

6

elnevezést. A harmadik típust a tengeri ingolában találtak meg (ingola/lamprey GnRH-III, lGnRH-III), de az emberi szervezetben még nem mutatták ki.15 Abból, hogy többféle megjelenési formája is fellelhető a GnRH-nak ugyanabban a szervezetben arra következtethetünk, hogy az egyes változatok más és más funkcióval rendelkeznek. A GnRH peptidek amellett, hogy lényeges szerepet töltenek be a neuroendokrin rendszer szabályozásában, lehetséges, hogy a központi idegrendszerben neurotranszmitterként és neuromodulátorként

vagy

néhány

perifériás

szövetben

autokrin/parakrin

faktorként

szerepelnek.

1.2.1.1. GnRH-I A hipotalamusz neuronjaiban termelődő, onnan pedig pulzusszerűen a keringéssel a hipofízisbe kerülő GnRH-I tulajdonságait már korábban tárgyaltam. Ha alacsony dózisban pulzáló jelleggel adagolnak szintetikus GnRH-t hipogonadizmusban szenvedő nőknek és férfiaknak, akkor ezzel a terápiával visszaállítható a kezeltek termékenysége azáltal, hogy stimulálják az endogén GnRH termelődését, de magas dózisú GnRH vagy agonista analógok érzéketlenítik a gonádokat. Ezt a jelenséget széles körben alkalmazzák hormonfüggő megbetegedések kezelése során, ugyanis ilyenkor leáll a LH, FSH szekréció, a petefészek-, és here-funkciók (kémiai kasztráció), amelyek ezáltal nem termelnek szteroid hormonokat. Tumoros megbetegedések esetén ennek eredményeként a hormonfüggő tumor növekedése csökken.12 Az emlős GnRH-t a célzott daganatterápiában is alkalmazhatjuk, mint hordozó molekulát, de endokrin hatása nem mindig kedvező a tumorterápiában. A kezdeti feltételezések alapján a GnRH analógok rákos sejtekre gyakorolt hatásukat indirekt módon a szex szteroidok gátlásával fejtik ki. A GnRH analógok különböző humán tumorsejtekre gyakorolt antiproliferatív hatása azt sugallja, hogy a tumoros sejteken található GnRH receptorokon keresztül direkt hatást is kifejtenek. Az elmúlt 30 évben több mint 3000 GnRH származékot állítottak elő, amelyek többsége GnRH-I agonista, illetve antagonista származék. Ezek közül számos vegyület bizonyult fontos terápiás

eszköznek

a

nőgyógyászatban

és

az

onkológiában.

A

tumorterápiában

legáltalánosabban használt GnRH-I analógok a Triptorelin: [D-Trp6]GnRH; Leuprolide, [DLeu6, Pro9-NHEt]GnRH; Buserelin: [D-Ser(tBu)6, Pro9-NHEt]GnRH (szuperagonisták) és Cetrorelix, Ganirelix, és az Abarelix (szuperantagonisták).14,18 Az irányított tumorterápiával kapcsolatos kísérletekben pedig legáltalánosabban a [D-Lys6]GnRH-I vegyületet használják, amelyben a Lys oldalláncához kapcsolnak drog molekulákat. Egy vegyület, amelyben

7

doxorubicint kapcsoltak észter-kötéssel glutársav spaceren keresztül a [D-Lys6]GnRH-I peptidhez a klinikai kísérletek III. fázisában van jelenleg.19

1.2.1.2. GnRH-II A

GnRH-II

(Glp-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2)

a

GnRH-I

aminosav

szekvenciájával 70%-ban megegyezik, de más gén kódolja. A peptidhormon megtalálható a központi idegrendszerben csakúgy, mint számos perifériás szövetben. Az agyban hasonlóan a GnRH I-hez, elsősorban a hipotalamuszban fordul elő, de különösen nagy mennyiségben expresszálódik a középagyban és a limbikus rendszer részeiben is. A perifériás szövetekben szignifikánsan nagyobb mennyiségben expresszálódik, mint az agyban. Megtalálható többek között a vesében, a csontvelőben, a prosztatában és a női szaporító szervekben. Ez az elterjedés neurotranszmitter/neuromodulátor funkciókra enged következtetni. A GnRH-II különböző feladatokat lát el a test különböző területein. A feltételezett feladatait a függelék 4. táblázatában foglaltam össze. Az, hogy a szervezetben ilyen széles körben megtalálható a hormon, arra sarkallta a kutatókat, hogy megkeressék a GnRH-II receptorát. Az eredmények azt mutatták, hogy hasonlóan az egyes típusú receptorhoz, ez is a 7TM doménnel rendelkező receptorok (GPCR) családjához tartozik. Ellentétben az előbbivel ez rendelkezik karboxil-terminális citoplazmatikus doménnel, amelyen számos treonin és szerin részlet található, amely részletek nyilvánvalóan foszforilációs helyek és így fontosak lehetnek a gyors deszenzibilizálásában, de a gyors internalizációban is. A 328 aminosavból álló GnRH-IR nem rendelkezik C-terminális citoplazmatikus végződéssel.16,17 Ez lehet az oka annak, hogy a receptorok nem deszenzibilizálódnak olyan gyorsan és lassan internalizálódnak. Ez a különbség fontos lehet a hatóanyagok

célzott

sejtbejuttatása

esetén.

Feltételezhető,

hogy

a

GnRH-IIR-ok

alkalmasabbak lehetnek az irányító hormonmolekulához kapcsolt drog tumorsejtbe juttatására. A GnRH-II receptorhoz20 a GnRH II nagy specifitással kapcsolódik, míg a GnRH-I csak kis mértékben és fordítva: a GnRH-IR jobban köti a GnRH-I hormont, mint a GnRH-II-t. A lGnRH-III és a lazacból származó sGnRH is kötődik mind az I-es mind a II-es típusú receptorhoz, és aktiválja azokat. A GnRH-II hormon és annak receptora a szaporító szervek tumoros szöveteiben is megtalálható.

Ezen

szövetekben

antiproliferatív

tulajdonsága

már

bizonyított.

Humán petefészekből és méhnyálkahártyából izolált sejteken kimutatták, hogy a GnRH-II és 8

agonistái jelentősen nagyobb mértékben gátolják a sejtproliferációt, mint a GnRH-I agonistái. Az antagonisták közül egy molekulát szeretnék kiemelni, amelyet Mező Imre állított elő korábban.21 Ezt az MI-1892 kóddal jelzett GnRH-II antagonistát használtam fel GnRH-drog konjugátumok előállítására.

1.2.1.3 MI-1892: H-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)DEA Kis koncentrációban adagolva in vitro (10 nM-1 μM koncentráció) LH szekréció nem történt. Kis LH kibocsátás volt tapasztalható miután 10 μM MI-1892-t adagoltak 3 perces pulzusban. Az in vitro LH-felszabadító aktivitásvizsgálatok alapján ez azt jelenti, hogy a GnRH-hoz képest a hatás 0,01%-os. A további állatkísérletekben kiderült, hogy az egyszeri 10 vagy 50 μg-os MI-1892 adagolás nem gátolta az egerekben az ovulációt. MCF-7 sejtvonalakon vizsgálva a hatóanyag 34%-kal (30 μg ) illetve 38%-kal (50 μg ) csökkentette a sejtek túlélőképességét, míg MDA-MB-231 sejtvonalakon vizsgálva az eredmény 60% és 64% volt. Tehát az MI-1892 alacsony endokrin hatással, és magas antitumor aktivitással rendelkezik.21 A vegyület további előnye, hogy a vizsgálatok során immunstimuláns hatást is mutatott, ami fontos lehet a drog molekulák okozta immunszupresszió kivédése vagy csökkentése érdekében.

1.2.1.4. GnRH-III Az irányított tumorterápiában alkalmazni kívánt, új GnRH származékok fejlesztése során a cél a hormonális hatás csökkentése mellet magasabb antitumor aktivitás és szelektivitás elérése. A legígéretesebbnek tűnő természetes GnRH analóg, a tengeri ingolából (Petromyzon marinus, 2. ábra) izolált lGnRH-III analóg.15,22

2. ábra: A tengeri ingola22 A lGnRH-III (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2) a humán gonadotropin releasing hormontól az 5.-8. aminosavakban különbözik, és az emlősökben elhanyagolhatóan kicsi endokrin aktivitást mutat.23 Az LH és FSH felszabadító hatása 500-1000-szer kisebb,

9

mint a GnRH-I-nél tapasztalt mennyiség.24,25 Ez a variáns egyaránt kapcsolódik a GnRH-I és GnRH-II receptorhoz, és gátolja különféle ráktípusok sejtjeinek proliferációját. Ez a dekapeptid hormon már mikromólos dózisban elnyomja a sejtproliferációt a humán emlő-, prosztata-, hasnyálmirigy-, méhnyálkahártya-, és vastagbélrák esetén dózis-függő módon. Közvetlen és specifikus tumornövekedést gátló hatása van, valamint az lGnRH-III nem rendelkezik endokrin aktivitással a sejtproliferációt gátló dózisban. A GnRH-III további előnye a többi jelentős antitumor hatású GnRH-analóggal szemben, hogy csak Laminosavakat tartalmaz. Mivel az lGnRH-III 8-as helyzetben lévő Lys nem tölt be fontos szerepet a tumorellenes hatás szempontjából,26 ezért a lizin oldallánc módosításával megnövelt antitumor hatású származékok állíthatók elő. Ezen hormonszármazékokból készített dimer vegyületek és konjugátumok amellett, hogy megnövelt antiproliferatív hatást mutattak különböző rákos sejteken, a hormonális aktivitásuk is alacsonyabb volt, mint az eredeti hormonnak. Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a szabad lizin oldallánc jelenléte szükséges az endokrin hatás kifejtéséhez. Az lGnRH-III dimer származékok nagyobb hatékonyságát az indokolhatja, hogy a vegyület stabilabb a lebontó enzimekkel szemben, továbbá elképzelhető, hogy a dimer mindkét monomer részegysége hozzákötődik a receptor molekulákhoz, és így a receptorok mikroaggregációját, a receptor- ligandum komplex képződését és internalizációját növeli.27 A GnRH-III receptor a másik két típus közül szerkezetében inkább a II-es típusra hasonlít, sugallva ezzel azt, hogy a II-es és III-as receptorok talán egy ősi gén duplikációval jöttek létre az egyszerűbb gerincesekben (halak, kétéltűek, hüllők), azonban emberben még nem találták meg.28 Mivel a lGnRH-III az 1-es és 2-es típusú GnRH receptorokhoz is kötődik, ezért az irányított terápia során hordozó molekulaként konjugátumokban alkalmazható. Nehány daunorubicint illetve doxorubicint, továbbá metotrexátot tartalmazó GnRH-III-drog konjugátumot korábban már előállították laboratóriumunkban.29

1.3. A vinka alkaloidok A vinka alkaloidok a Madagaszkáron őshonos rózsás meténgből (Catharantus roseus 3. ábra) kivont N-tartalmú bázisok. A rózsás meténg szubtrópusi és trópusi területeken széles körben termesztett örökzöld növény, amely a monoterpén alkaloid vindolint és katarantint termeli. A vindolin a fő alkaloid a növényben.30 A madagaszkári

őslakosok

hagyományosan

3. ábra: A rózsás meténg (Catharantus roseus) 10

diabétesz

elleni

gyógyszerként alkalmazták. Valójában az egész világon évszázadokon keresztül a legkülönbözőbb

betegségek

kezelésére

használták

a

darázs

csipéstől

(India)

a

szemfertőzésekig (Karibi térség). Amikor a kutatók az 1950-es években elkezdték vizsgálni a növényt, felfedezték, hogy 70 féle alkaloidot tartalmaz. Ezek közül néhány a vér cukor szintjét csökkenti, míg mások vérzéscsillapítóként viselkednek. A legérdekesebbnek mégis a Vinblasztin és Vinkrisztin bizonyult, amelyekről kiderült, hogy a vér fehérvérsejtjeinek számát csökkentik, ezáltal a leukémia ellen hatásos gyógyszer lehet. A vinka alkaloidok dimer szerkezetű molekulák. Két többgyűrűs egységből állnak: az indolmagból (katarantin mag) és egy dihidro-indolmagból (vindolin mag), amely egységek komplexeket alkotnak (4. ábra). A két molekularészlet közül a vindolin szerkezete összetettebb, és ez szolgál prekurzorként a vinka alkaloidok bioszintézisében.31 Bár számos vinka alkaloid biológiai aktivitását megvizsgálták, közülük csak a természetes vinblasztin (VBL) és a vinkrisztin (VCR), valamint a félszintetikus vindezin (VDS) és vinorelbin (VRL) került forgalomba. A vinblasztin főleg a non-Hodgkin limfóma gyógyítására, az előrehaladott hererák, és mellrák gyógyítására használatos. A vinkrisztint főként akut leukémia és más típusú limfómák kezelésére alkalmazzák.

Katarantin (CTN) mag: R1

Vindolin (VDN) mag:

C2H5

N

N

C2H5 HO

H

H3CO H COOCH3

R2

R3

R4

-OH -OH -OH -H

-CH3 -CHO -CH3 -CH3

-CONH2 -CO2CH3 -CO2CH3 -CO2CH3

-OH -OCOCH3 -OCOCH3 -OCOCH3

R4

N N H

Vindezin Vinkrisztin Vinblasztin Vinorelbin

R1

R2

R3

4. ábra: A vinka alkaloidok kémiai szerkezete

1.3.1. Vinka alkaloidok hatásmechanizmusa A vizsgálatok azt mutatták, hogy a vinka alkaloidok a sejtekben lévő mikrotubulusok szintézisének gátlásán keresztül fejtik ki tumorellenes hatásukat. A mikrotubulusok a sejtek intracelluláris vázának alkotói közé tartoznak; feladatuk, hogy fenntartsák a sejt belső rendezettségét, a sejtmag és az organellumok jellegzetes elhelyezkedését, továbbá a kapcsolódó motorfehérjék segítségével lehetővé teszik az egyes 11

sejtalkotók között a transzportot, a kromoszómák szegregációját a sejtosztódás során és általában a belső átrendeződést eredményező mozgásokat. A mikrotubulusok felépítésében két féle, egymáshoz hasonló 55 kDa tömegű polipeptid, az αés a β-tubulin vesz részt. A tubulin egységek polimerizációja során „fej-farok” illeszkedés jön létre az alegységek között és fonalszerű struktúrákat (protofilamentum) alkotnak. Tizenhárom ilyen protofilamentum egymáshoz kapcsolódva és egymáshoz képest 0,9 nm-rel elcsúsztatva helyezkedik el egy henger palástja mentén. A mikrotubulusok polimerizációjára a dinamikus instabilitás jellemző: folyamatosan rövidülnek, és nőnek a heterodimerek disszociációjával, illetve asszóciációjával. Emiatt a sejt mikrotubuláris apparátusa folyamatos „átszerelődésen” megy keresztül. Különösen gyors ez a folyamat osztódó sejtek esetén, ahol a kromoszómák szállítását a mikrotubulusokból felépülő magorsó végzi. A gyorsan osztódó rákos sejtek osztódásának szelektív gátlását a dinamikus instabilitás megzavarásával érhetjük el.34 A vinka alkaloidok citotoxikus hatása a tubulinnal való kölcsönhatásukkal és a mikrotubuláris rendszer gátlásával függ össze. A tubulin molekulákhoz kötődve blokkolják a mikrotubulusok dinamikáját, ami a sejtek pusztulásához vezethet. Mind a vinka alkaloidok, mind más antimikrotubuláris vegyületek (metotrexát, citozin arabinozid) a mitózis során a sejt ciklus DNS szintézis fázisában (S fázis) működnek, továbbá hatással vannak a G1, és G2 fázisban lévő daganatos és egészséges sejtekre egyaránt, mivel a mikrotubuláris rendszernek számos nem mitotikus funkciója is van.35-37 Korábbi feltételezések szerint a dimer szerkezetű vinka alkaloidok katarantin részlete kapcsolódik a tubulin fehérjékhez, míg a vindolin magnak szerkezetstabilizáló, horgonyzó szerepe van. Megvizsgálták külön-külön a katarantin és a vindolin citotoxikus és kötődési tulajdonságait a vinkrisztin-nel és a vinblasztin-nal összehasonlítva. Eredményként azt kapták, hogy a katarantin antimitotikus hatása a VBL és a VCR-éhez képest azok hatásának ezrede. Mind a katarantin mind pedig a vindolin csak nagy dózisban mutatott tubulin polimerizációt gátló hatást. A katarantin 1,6×10-4 M koncentrációig nem volt hatással a tubulin polimerizációjára, a vindolin esetében ez az érték 5×10-4 M volt. Ennél magasabb koncentrációk esetén a fenti anyagok gátolták a mikrotubulusok képződését. 38 A monomerek külön - külön történő alkalmazását azok rossz oldhatósága is nagyban megnehezíti. Azonban az újabb vizsgálatok szerint, ha a vindolinhoz aminosavszármazékokat kapcsolnak, akkor javul a vegyület oldhatósága, és citosztatikus hatást is tapasztaltak. Azonban kevés irodalmi adat áll rendelkezésre az olyan vindolin analógok előállításáról, amelyek nem bisz-indol típusú vinka vegyületek. A BME Szerves Kémiai Tanszékén Dr.

12

Szántay Csaba professzor kutatócsoportja előállított különböző vindolin származék – aminosav konjugátumokat. Ezek in vitro antitumor hatását vizsgálva azt találák, hogy az egyik legjobb hatású vegyület a Br-vindolin-Trp származék. Ennek magyarázata az lehet, hogy a Trp mimikálhatja a katarantin váz indol-csoportját, így növelve a vegyület kötődését a tubulinokhoz. Ezt a vegyületet az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában oligoarginin sejtpenetráló peptidekhez kapcsolták és vizsgálták, hogy a konjugátum vízoldékonysága és sejtbejutási képességének fokozása befolyásolja-e a vindolin-származék tumorellenes hatását HL-60 sejteken.

1.4. Daunorubicin A daunorubicin (daunomicin, Dau) az epirubicin és a doxorubicin mellett az antraciklinek családjába tartozik. Ezen antitumor hatású szereket széles körben alkalmazzák a rák elleni terápiában. A daunorubicin biológiai hatásait először DiMarco és munkatársai írták le 1964-ben. Megállapították, hogy a Dau a DNS szintézisének gátlásával fejti ki hatását, így okozva a sejtek osztódásának gátlását vagy pusztulását.39 Újabb vizsgálatok azt mutatták ki, hogy a hatóanyag a sejtek DNS szintézisét az alkalmazott dózistól függően többféleképpen is gátolhatja. Szabadgyökök keletkezhetnek, és szerepe lehet a lipidperoxidációban is; kötődhet a DNS-hez, továbbá alkilezheti is azt; interkalálodhat a DNS-ben; befolyásolhatja a DNSszálak szeparációját és a helikáz enzim aktivitását, valamint a topoizomeráz II-vel stabil komplexet képezhet, ezáltal gátolja annak működését.40 Ezek a hatások az egészséges sejtekben is érvényesülnek, így a aunorubicin azonban számos toxikus mellékhatással is rendelkezik (hasmenés, hányás, hajhullás, étvágytalanság, kardiotoxicitás). Annak érdekében, hogy a káros mellékhatásokat elkerüljék és az alkalmazott dózist emelhessék, a daunorubicint számos peptidhez/proteinhez és egyéb molekulához konjugálták. Az alkalmazott hordozó molekulák kétfélék voltak: célfelismerő egységet tartalmazó vegyületek (pl.: GnRH és transzferrin) és a célfelismerő egységet nem tartalmazók (pl. HPMA és DIVEMA szintetikus kopolimerek)

.

A korábban már ismertetett GnRH molekula felhasználható felismerő egységet tartalmazó hordozóként is, amellett, hogy tumorellnes hatása is van. Korábban már sikerült különböző kemoterápiás szereket (pl.: D-melfalán, metotrexát, doxorubicin) amid és észter -kötésen keresztül [D-Lys6] -GnRH molekulához kapcsolni.40,41 A GnRH származék szuperagonista volta miatt azonban mellékhatásként az agyalapimirigy részleges károsodása lépett fel.19 Hasonló kísérletek töréntek szuperantagonista GnRH származékok felhasználásával is, de

13

ebben az esetben mellékhatásként ovulációgátlást tapasztaltak. A mellékhatások kiküszöbölése érdekében tehát egy olyan GnRH analógra van szükség, amely gyenge endokrin tulajdonságokkal rendelkezik, ennek a feltételnek a lGnRH-III megfelel. Ez amellett, hogy gyenge agonista, specifikusan kapcsolódik a rákos sejteken lévő receptorokhoz. Az antraciklinek közül mind daunorubicinnel, mind doxorubicinnel kialakított lGnRH-III konjugátumok készültek már. A doxorubicinhez amid-, észter-, oxim- és hidrazon--kötéssel is kapcsolhatunk hordozó molekulát (pl.: [D-Lys6]GnRH-hoz kapcsolt Dox-14-O-hemiglutarát), míg a daunorubicinhez csak amid-. oxim- és hidrazon--kötésen keresztül (5. ábra). A doxorubicin a daunorubicinhez képest nagyobb kardiotoxikus hatással rendelkezik.42 CH3

CH3 OH

OH

O H3CO

O

OH

O

O

NH2

amid-kötés H3CO

O

OH

O

OH

NH2

OH CH3

O

O

O

oxim-és hidrazon-kötés

OH CH2

amid-kötés

észter-kötés

O

oxim- és hidrazon- kötés

5.ábra: A daunorubicin és doxorubicin konjugálási reakcióban résztvevő csoportjai

Azon Dau konjugátumok, amelyekben a -kötést az aminocukor részlet amino csoportján keresztül alakították ki, biológiai hasznosíthatósága jelentősen csökkent. A hidrazon--kötésen keresztül kapcsolt vegyületeket kis kitermeléssel sikerült előállítani, és a hidrazon--kötés labilitása miatt a vegyület tisztíthatósága is nehézkes. Ezzel szemben az oxim--kötéssel előállított Dau-GnRH-III (a daunorubicin keto-csoportja és GnRH-III-(Aoa-GFLG) aminooxiacetil-csoportja között alakították ki a -kötést) konjugátum in vitro és in vivo antitumor hatással rendelkezik, és a szabad drogmolekuláhozképest mellékhatása is kevesebb volt a konjugált formának.42,43

1.5. Peptidszintézis A peptidek előállításának két fő módja van: az oldatban végzett és a szilárdfázisú peptidszintézis. Munkám során szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő különböző GnRH származékokat, ezért részletesebben ezt a módszert ismertetném.

14

Két alternatív eljárás alkalmazható a peptidek szilárd hordozón történő felépítésére. Az elterjedtebb, és az általam is használt módszert a lépésenkénti (stepwise) szintézist Bruce Merrifield fejlesztette ki, és publikálta 1963-ban.44 A másik módszer a konvergens szilárdfázisú peptidszintézis (CSPPS), amely során védett (esetleg részlegesen védett) peptid fragmenseket kapcsolnak össze szilárd hordozón.45

1.5.1. Lépésenkénti szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) Merrifield az oldatfázisú technika során felmerülő problémák (a peptidlánc növekedésével kialakuló oldékonysági, tisztítási nehézségek) kiküszöbölésére dolgozta ki a szilárdfázisú peptidszintézis. Manapság ez az általános módszer peptidek és kisebb fehérjék előállítására laboratóriumi körülmények között, melynek alapja, hogy oldhatatlan szilárd porózus gyantaszemcséket látnak el funkciós csoportokkal vagy funkcionalizált linkerekkel, melyekhez kovalens kötésen keresztül hozzáépíthetik a növekvő peptidláncokat. Így az épülő lánc a szintézis végéig a szilárd hordozóhoz van rögzítve és így az oldott reagensek és a melléktermékek egy szűrő segítségével eltávolíthatók mellőle, kikerülve az oldatfázisú szintézisnél alkalmazott tisztítási

lépéseket

(pl.:

kikristályosítás).

A

technika

nemcsak

leegyszerűsíti,

de

nagymértékben meg is gyorsítja a szintézist. A szilárdfázisú peptidszintézis kifejlesztése óta számos polimert (cellulóz, polivinil-alkohol, polimetakrilát, szulfonált polisztirol) próbáltak ki. A legjobbnak a klórmetilezett sztirol 1,4divinilbenzol (1-2%) kopolimer bizonyult. Ezt a gyantatípust különböző linkerekkel módosítják attól függően, hogy milyen petidet (karboxil- vagy karboxamid C-terminális) és milyen módszerrel kívánnak felépíteni a gyantán. Kereszt-kötéseket létrehozó ágensként újabban 1,2-divinilbenzol tartalmú gyantákat alkalmaznak azok jobb duzzadóképessége miatt. A SPPS általános eljárása a karboxilcsoportján aktivált, védett aminosavszármazék kapcsolásának és az α-amino-csoporton lévő védőcsoport eltávolításának ismétlődő ciklusából áll. A szintézis menetét a 6. ábrán foglaltam össze. A SPPS során alkalmazott acilező szerek nagy feleslege miatt elkerülhetetlen, hogy az aminosavak oldalláncában lévő funkciós csoportokat védőcsoporttal lássuk el (ellentétben az oldatban végzett szintézissel). Mivel a szintézis során az intermedierek izolálására és azonosítására nincs lehetőség, a szintetikus lépések közel 100 %-os hatásfokának elérése érdekében az aminosavszármazékokat és a kapcsoláshoz szükséges reagenseket nagy feleslegben (3-5 ekvivalens a gyanta kapacitásra számolva) kell alkalmaznunk.

15

A peptidet a szintézis végén a gyantáról lehasítjuk, lehetőleg úgy, hogy egy lépésben eltávolítsuk az oldallánc funkciós csoporton található védőcsoportokat is. t

Aminosav oldallánc védőcsoport: pl.: Bu, Bzl α-amino védőcsoport: pl.: Boc, Fmoc aktiváló csoport pl.: HOBt*, DCC**, DIC***,BOP**** szilárd hordozó = gyanta újonnan kialalkított peptid-kötés

,

*HOBt: **DCC :

,

DIC***:

, N N N

PF6

O P

BOP****

(H3C)2N

N(CH3)2 N(CH3)2

6. ábra: A szilárdfázisú peptidszintézis folyamata

1.5.2. A SPPS két általánosan alkalmazott stratégiája: 1)

Boc/Bzl stratégia: amelyben az aminosav-származékok α-amino-csoport védelmére terc-butil-oxikarbonil-csoportot alkalmazunk46

2)

Fmoc / tBu stratégia: amelyben az aminosavszármazékok α-amino-csoport védelmét 9fluorenil-metoxikarbonil-csoport látja el47

1.5.2.1. Boc/Bzl stratégia47 A módszer (7. ábra) különböző erősségű savakra hasadó savérzékenyebb (átmeneti) és kevésbé érzékeny (állandó) védőcsoportokon (Függelék: 5. táblázat) alapszik. Az α-aminocsoport

védelmére

alkalmazott

terc-butil-oxikarbonil-csoport

lúgokkal

és

nukleofil

reagensekkel szemben stabil, de szervetlen vagy szerves savakkal eltávolítható. Eltávolítása 30-50 térfogat%-os TFA/DCM (trifluorecetsav/diklórmetán) -oldatban 20-30 perces reakcióidővel történik (8. ábra). 16

8. ábra: A Boc védőcsoport hasítása Mivel az acidolízis során az α-amino-csoport trifluor-acetát sója jön létre, ezért a hasítást követően semlegesíteni kell a reakcióközeget. Erre a célra alkalmazhatunk 5-10 térfogat%-os DIEA (diizopropil-etil-amin) DCM-os oldatát. Mivel a peptid-gyanta -kötésnek stabilnak kell lennie a szintézis során, ezért olyan -kötés kialakítása szükséges az első aminosav és a gyanta között, amely nem bomlik TFA hatására. Ennek megfelelően a peptidet a gyantáról csak erős savval (HF, TFMSA, TMSOTf) tudjuk hasítani, amelyek során az oldallánc védőcsoportok is lehasadnak. A módszer hátránya, hogy a savas körülmények között érzékeny (oxidábilis és könnyen alkileződő) aminosavakra (Trp, Met, Cys, Tyr) csak korlátozottan és megfelelő körültekintéssel (gyökfogók, redukálószerek) alkalmazható.48 A szintézis módszer során alkalmazott gyantatípusok a következők: hasítás után a Cterminálison szabad karboxilcsoportot eredményezők: klórmetil (Merrifield)-, PAM-gyanták és az amid csoportot adók: BHA-, MBHA - gyanták.

Bzl

7. ábra: Boc/Bzl stratégia:

CH2 Bzl O C

Boc

O

CH2 CH3 H3C

C

O O

C

H3C

CH2 NH

CH3

CH

HF

C O

NH

Boc-Glu(OBzl)-Thr(Bzl)-Merrifield gyanta

CH2 O CH CH

C

O

CH2

R

O

TFA

HF

1.5.2.2. Fmoc/tBu stratégia: Az Fmoc /tBu stratégia (9. ábra) élőnye az előzőleg ismertetett Boc/Bzl módszerrel szemben, hogy az oxidációra, alkileződésre hajlamos aminosavak (Trp, Met, Cys, Tyr) ezen mellékreakciói visszaszoríthatóak. Védett peptidek szintézisére szintén ez a módszer kínál megfelelő megoldást49, továbbá ezzel a stratégiával elkerülhetjük a HF használatát a gyantáról

17

való hasításhoz és az oldallánc védőcsoportok eltávolításához. A módszer során az aminosavszármazékok α-amino-csoportjait 9-fluorenil-metiloxikarbonil (Fmoc) csoporttal védjük, amely savakkal szemben stabil, bázisokra viszont érzékeny. t

Bu

CH3 H3C

Fmoc

C

TFA CH3

t

Bu R

O CH3 C

C

O CH3

C

H3C CH2

O

H3C C O

H2C

H t

C

CH

CH2

O NH

CH

C

NH

CH

Bu

H2 C

O

O

CH2

O

O

NH

C

Wang-gyanta

t

t

t

9. ábra: Fmoc/ Bu stratégia: Fmoc-Glu(O Bu)-Thr( Bu)-Wang-gyanta A hasítás történhet 20-55 térfogat% piperidin DMF-os elegyével (10. ábra). A hasításkor dibenzofulvén átmeneti termék keletkezik, mely reaktív, de a piperidinnel stabil adduktot képez, ezáltal elkerülhetők az alkileződési mellékreakciók. A keletkező termék egyben alkalmas a védőcsoport hasadásának követésére is, mivel 301 nm-en jelentős abszorpciót mutat. Bizonyos peptidszekvenciák esetében a kísérletek azt igazolták, hogy a 2% piperidint és 2% 1,8-diazabiciklo[5.4.0]-undek-7-ént (DBU) tartalmazó DMF-os eleggyel gyors, hatékony hasítás érhető el, ezen kívül csökkenthető az enantiomerizáció valószínűsége és nagyobb az effektív hasítás mértéke térbeli gátlás esetén is.50,51 Az állandó oldallánc védőcsoportok (6. táblázat, lásd függelék) eltávolítását rendszerint a peptidek gyantáról történő hasításával (80-95% TFA oldattal) egy időben végzik. Mivel a hasítás során reaktív karbokationok keletkeznek gyökfogókat kell alkalmazni. Mivel ilyen körülmények között nem történik meg a petidlánc hidrolízise, ezért a víz, mint a terc-butil kation legjobb semlegesítője alkalmazható gyökfogóként (kation befogóként). Mivel a szintézis során kíméletes, savat nem igénylő bázissal történik a hasítás, kifejlesztettek olyan típusú gyantákat, amelyekről a peptid már „gyenge” savak hatására is lehasad. Ilyen gyanták a következők: hasítás után a C-terminálison szabad karboxilcsoportot eredményező pl.: Wang-, Rink sav-, klórtritil-gyanta; és a hasítás után amid véget eredményező Rink-amid típusú gyanták, Sasrin gyanta. A felsorolt gyanta típusoknak polietilénglikolt tartalmazó változatai is ismertek. Ezek számos előnnyel rendelkeznek: kitűnő nyomás stabilitás; remek duzzadó tulajdonságok (akár vízben is); magas diffúziós arány, számos funkciós csoporttal ellátott változata létezik; 18

alacsony a gyantakapacitása (0.2-0.6 mmol/g); ezáltal jól alkalmazható aggregálódó peptidek szintézisére; és gyantán történő ciklizálásra; valamint fragmens kondenzációra. Védett peptid előállítása esetén úgy kell megválasztani a gyantát és a védőcsoportokat, hogy a gyanta és a peptid közötti -kötés hasítása közben az oldallánc védőcsoportok ne hasadjanak. Erre a legalkalmasabb a ClTrt gyanta. H N

H+

N H

O

+

CH 2 C

H

O

O H

O

O

N HN

O

R

N

H+H

R

O R

HN

C

R

+ H2N

O

10. ábra: Az Fmoc-csoport hasítása Mind a Boc/Bzl, mind az Fmoc/tBu technikánál a felkapcsolandó aminosavat aktiválni kell. Mindkét esetben in situ aktív észteres aktiválást alkalmaznak leggyakrabban. Az előbbinél kapcsoló reagensként DCC és HOBt elegyét alkalmazzák, míg az utóbbinál DIC és HOBt kapcsolási reagenseket (11. ábra). A különbség elsősorban abból adódik, hogy az első esetben keletkező rossz oldékonyságú DCU a TFA-s hasítás során feloldódik és eltávolítható a gyanta mellől, míg az Fmoc-csoport piperidines hasításakor nem. Ezért ilyenkor a szerves oldószerben karbamid formájában (DIU) is jól oldódó DIC reagenst alkalmazzák. A kialakított HOBt észter nem izolálható, így a kialakítása közvetlenül a kapcsolás előtt (in situ) történik.52 O Boc

H N

N

+

Aaa C

C

N

11. ábra: az aktív észter kialakítása

OH Boc-aminosav Diciklohexil-karbodiimid H N

C

N

O C

O

N N

Aaa Boc

1-hidroxi-benztriazol

N

NH

OH O Boc

H N

Aaa C

N +

N O

N

H N

C

H N

O Diciklohexil-urea

H2N

Aaa

19

1.5.3. Kapcsolási reakciók követése Mindkét stratégia esetén megfelelő érzékenységű módszerre van szükségünk, hogy követni tudjuk a reakciót, elkerülendő, hogy a szintézis végén az esetleges sikertelen kapcsolásokból adódóan összetett termék elegyet kapjunk (hiányos szekvenciák). A legelterjedtebb módszer erre a Kaiser-teszt.53 Itt a ninhidrin és a szabad aminocsoport között zajlik le reakció, amely színváltozással jár. Ez már 1% aminocsoport jelenléte esetén is intenzív kék elszíneződést mutat. Prolin esetében azonban izatint (2,3 indolin-dion) is adnunk kell a teszt reakcióhoz, ugyanis a prolin iminosav, amely szintén reagál a ninhidrinnel, de a keletkező termék nem ad jól érzékelhető színreakciót. Izatinnal reagálva a szabad iminocsoport vöröses, barnás színű lesz.

1.5.4. A peptidek hasítása a gyantáról A peptidek szilárdfázisú szintézisét azok gyantáról történő hasítása zárja. Általában ebben a lépésben távolítjuk el az aminosav oldalláncok védőcsoportjait is. ¾ Boc/Bzl-stratégia esetén hidrogén-fluoriddal végezzük a gyantáról történő hasítást speciális teflon készülékben. A hasítás során gyökfogókat alkalmazunk a peptidről szintén lehasadó védőcsoportokból származó karbokationok befogására.54 Bizonyos esetekben alkalmazhatók más erős savak is a hasításra pl.: TFMSA vagy TMSOTf/TFA elegy. Ezek alkalmazásakor azonban nem minden védőcsoport hasad kielégítően (pl. OcHex, Tos, Meb) 0°C-on. Ezen védőcsoportokat csak magasabb hőmérsékleten lehet tökéletesen eltávolítani ez utóbbi hasító reagensekkel, ami mellékreakciókhoz vezethet. ¾ Fmoc/tBu stratégia esetén trifluor-ecetsavval hasítjuk le a gyantáról a peptidet. A hasítóelegy összetételét, az alkalmazott gyökfogók minőségét és mennyiségét a szekvenciában található aminosavak és védőcsoportok típusa határozza meg.

20

2. Célkitűzések A dolgozatban összefoglalt munka célja olyan GnRH – hatóanyag konjugátumok előállítása volt, amelyek alkalmasak hatóanyagok szelektív célbajuttatására, így alkalmas vegyületek lehetnek az irányított tumorterapiában.

Br-Vindolin-Trp

Célbajuttató egység (GnRH analóg)

Hatóanyagok CH3 OH O H3CO

O

OH

O

NH2 .HCl

Receptor mediált endocitózis

OH CH3 O

O

Daunorubicin

Céljaim voltak: 1. Br-Vindolin-D-Trp és daunorubicin kapcsolása GnRH analógokhoz. 2. Olyan GnRH analógok előállítása, amelyek nagy specifitással kapcsolódnak a tumoros sejteken nagy mennyiségben expresszálódott receptorokhoz, ugyanakkor maguk is antitumor hatással rendelkeznek. A másik fontos szempont a hordozó molekula kiválasztásánál az alacsony endokrin hatás volt. 3. A Br-Vindolin-D-Trp vegyület beépítése GnRH származékba: mivel az MI-1892 vegyület az N-terminálisán D-Trp aminosavat tartalmaz, felmerült annak a lehetősége, hogy a BrVindolin-D-Trp vegyületet ebbe a GnRH származékba építsem be. Ezért célul tűztem ki egy [des-Trp1]-MI-1892 peptid felépítését és a vindolin származék konjugálását ezen peptidhez. Szintén tervbe vettem a konjugátum dimer származékának szintézisét megfelelően módosított MI-1892 származék segítségével. 4. Olyan GnRH-III származék (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-GlyCys)-Pro-Gly-NH2) szintézise, amely alkalmas mind a daunorubicinnel való konjugációra, mind pedig két peptidlánc összekapcsolására diszulfidhídon keresztül: Mivel korábban a Dau21

GnRH-III oxim-kötést tartalmazó konjugátum hatásosnak bizonyult in vitro és in vivo tumornövekedés gátlásban, ezért szerettem volna kipróbálni, hogy a vegyület dimer változata hogyan befolyásolja a tumorellenes hatást. Ezért készítettem el a fenti származékot. 5. Az előállított konjugátumok citosztatikus hatásának vizsgálata MTT teszttel, és a kapott eredmények összehasonlítása a szabad hatóanyagok és a korábban előállított vegyületek hatásával.

22

3. Eredmények Célkitűzéseimnek megfelelően előállítottam olyan kétkomponensű tumorellenes hatású molekulákat, amelyekben a célbajuttató szerepet GnRH analóg tölti be. A hordozó molekulához a hatóanyag vagy közvetlenül amid-kötéssel, vagy egy enzimlabilis spacer molekulán (GFLGC) keresztül oxim--kötéssel kapcsolódik. A spacer szerkezetét úgy választottam meg, hogy a konjugátumból dimereket is elő lehessen állítani. A konjugátumok előállítása és vizsgálata öt részből tevődött össze: 1. GnRH analógok szintézise szilárdfázisú peptidszintézissel 2. Az

antiproliferatív

hatású

molekula

(Br-vindolin-D-Trp,

daunorubicin)

hozzákapcsolása az előállított peptidekhez 3. A konjugátumok dimerizálás diszulfid -kötésen keresztül 4. A vegyületek tisztítása és jellemzése 5. Az elkészült konjugátumok in vitro biológiai vizsgálata A konjugációhoz szükséges peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel (SPPS) manuálisan építettem fel. A peptidek aminosav szekvenciájától függően alkalmaztam a SPPS két általánosan használt stratégiáját (Boc/Bzl, Fmoc/tBu). A vindolin-származékot amid--kötéssel kapcsoltam a peptidhez, míg a daunorubicint oxim-kötéssel konjugáltam a GnRH származékhoz. A dimerizálás során diszulfid -kötést alakítottam ki a peptidek spacer részletében található ciszteinek tiol-csoportjai között. Az elkészült konjugátumok és azok dimerizált változatainak in vitro biológiai vizsgálatát MTT teszt segítségével végeztem el (a dolgozatom beadásáig nem sikerült minden tesztet végrehajtani, ezen kísérletek folyamatban vannak).

23

3.1 Peptidek szintézise 3.1.1. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA előállítása (későbbiekben [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac) néven szerepel) A szintézist manuálisan vegyes Boc/Bzl és Fmoc/tBu technikával végeztem MBHA gyantán. Azért alkalmaztam vegyes technikát az előállításnál, mert a peptid Trp aminosavat tartalmaz, amely savas körülmények között a levegő oxigénjének hatására oxidálódni képes, továbbá Boc védőcsoport hasadásakor keletkező karbokation által alkileződhet. Másrészt egyszerűbb az oldallánc részletet Boc/Bzl technikával elkészíteni, és a vegyes technikából adódó kétlépéses hasítás is előnyökkel jár. Ezért az első öt aminosavat Boc/Bzl technikával kapcsoltam egymáshoz DCC/HOBt kapcsolószerek segítségével.53 Boc-Asp-DEA aminosavszármazékot az irodalom szerint állítottam elő19 és 5. aminosavként ezt a származékot β-karboxilcsoportján keresztül kapcsoltam az épülő peptidlánchoz. A DEA védőcsoport előnye, hogy peptid-kötést imitálva (olyan mintha itt még folytatódna a szekvencia), enzimekkel szemben stabilabbá teszi a molekulát.

A

hatodik

beépítésre

kerülő

aminosavszármazék

(Fmoc-Lys(Boc)-OH)

kapcsolásakor DIC/HOBt elegyét alkalmaztam, ugyanis az Fmoc/tBu technika során alkalmazott hasítóelegy (2% piperidin, 2% DBU/DMF) nem képes eltávolítani a reakcióelegyből a kapcsolás során a DCC-ből képződő DCU-t (ellentétben a Boc/Bzl – technika hasítóelegyével: 33%TFA/DCM), amely csökkenti a kapcsolás sikerességét. A védett aminosavszármazékokból és a kapcsolási reagensekből a gyantakapacitásra számolva egyaránt háromszoros felesleget használtam. Ez a mennyiség az összes kapcsolás során elegendőnek bizonyult, nem volt szükség újrakapcsolásra. A szintézislépések sikerességét a kapcsolási lépések és néhány esetben a hasítási lépések után is Kaiser-teszttel ellenőriztem. A szekvencia befejezése után lehasítottam a Boc-csoportot a 6. pozícióban lévő lizin ε-aminocsoportjáról. A hasítást olyan hasítóeleggyel végeztem, amellyel a Boc csoporton kívül a szerin oldallánc védőcsoportja is hasad (tBu), de ez a további szintetikus lépésekben nem okoz gondot. A hasítószer etán-ditiolt (EDT) tartalmazott redukáló ágensként, továbbá gyökfogóként desztillált vizet adagoltam a TFA-hoz. A hasítóelegy a peptid-gyanta -kötést ugyancsak nem hasította. A lizin ε-amino-csoportja így szabaddá vált, ezáltal a alkalmas lett a peptid oldallánc hozzáépítésére. 24

Ezután a gyantát két részre osztottam és a két gyantarészen külön-külön folytattam a szintézist. Az egyik részleten a lizin ε-amino-csoportját ecetsavanhidriddel acetileztem. Erre azért volt szükség, mert a Br-vindolin-D-Trp kapcsolásakor a Lys oldallánca is reagálhatna, ezért célszerű blokkolni. Végül az utolsóként beépített D-p-klór-fenilalaninról lehasítottam az Fmoc védőcsoportot. Ezt követően erről a gyanta részletről HF-dal lehasítottam peptidet. Ezen lépéshez a peptidet tartalmazó gyantához p-krezol gyökfogót és DTT (ditiotreitol) redukálószert adtam. A nyers peptidet éterben csaptam ki, majd szűrés, és többszöri éteres mosás után 100%-os ecetsavban oldottam fel. A kapott peptid-oldat liofilizálásával megkaptam a nyers peptidet, amely tisztaságát analitikai HPLC-vel ellenőriztem. A nyers peptidet RP-HPLC-vel tisztítottam (Termelés: 19,4%), és MALDI-TOF-MS készülékkel ellenőriztük a kapott frakciókat (a termék analitikai adatai a 6. táblázatban, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található).

3.1.2. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp(Leu-Gln-Pro-DAla-NH2)-DEA előállítása (későbbiekben [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG) néven szerepel) Az előzőekben leírt kettéválasztott gyanta második részét használtam fel ennél a szintézisnél. A gyantán már felépített Fmoc-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-gyanta)DEA szekvenciához a lizin szabaddá vált ε-amino-csoportján folytattam a peptid tovább építését. A Cys-Gly-Phe-Leu-Gly aminosav sorrendű enzimlabilis peptidet Boc/Bzl-stratégiával építettem fel. A szintézis során a hasítóelegyhez (33%TFA/DCM) 3%-ban anizolt és kis mennyiségben indolt adtam gyökfogóként az alkileződésre és savas körülmények között oxidációra hajlamos triptofán miatt. A spacer felépítése során ugyancsak három ekvivalens aminosavszármazékot és kapcsolószert alkalmaztam. A cisztein aminocsoportját védő Boccsoport lehasítása után ecetsavanhidriddel acetileztem a spacer N-terminálisát, majd a D-Cpa Fmoc-védőcsoportját is eltávolítottam. A peptidet a gyantáról ugyancsak HF-os hasítással távolítottam el. Gyökfogóként p-krezolt és DTT-t adagoltam a gyantához. A liofilizálás után kapott nyers peptidet analitikai HPLC-vel vizsgáltam. A kapott terméket szemipreparatív HPLC segítségével tisztítottam (Termelés: 8,27 %), majd a frakciókat

25

liofilizálást követően MALDI-TOF-MS-sel ellenőriztük (a termék analitikai adatai a 6. táblázatban, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található).

3.1.3. A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-GlyNH2 (GnRH-III(Aoa-GFLGC)) előállítása A szintézist manuálisan Fmoc/tBu technikával végeztem Rink-Amid MBHA gyantán. A kapcsolásokhoz DIC/HOBt elegyét használtam. Az aminooxiecetsav kapcsolásakor BOP/HOBt elegyét alkalmaztam. Az Fmoc csoport lehasítása 2% piperidin, 2% DBU/DMF eleggyel történt. A lizin ε-amino-csoportját védő Mtt csoport eltávolítását 1% TFA/DCM oldattal végeztem. Mind a védett aminosavszármazékokból, mind a kapcsolási reagensekből számolva háromszoros felesleget használtam. A szekvencia befejezése után a peptidet lehasítottam TFA/EDT/desztillált víz elegyével. A liofilizálás után a kapott peptidet analitikai HPLC-vel ellenőriztem. Az aminooxiacetil peptidek nagyon érzékenyek aceton jelenlétére, ezért a liofilizáláshoz az anyag lefagyasztását folyékony nitrogénben és nem aceton-szárazjeges hűtés mellett végeztem. Mivel a nyers termék megfelelő tisztaságú volt, ezért további tisztítás nélkül használtam a daunorubicinnel történő konjugálási reakcióhoz. Ezzel kivántam megelőzni a tisztitáskor is fellépő, az Aoa elreagálásával járó mellékreakciót. (A kapott termék analitikai adatai a 6. táblázatban, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található).

3.2. Biokonjugátumok előállítása 3.2.1. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-AlaNH2)-DEA előállítása (későbbiekben Br-Vindolin-MI-1892(Ac) néven szerepel) A konjugátum előállítását DMF-os oldatban végeztem. A Vindolin-D-Trp (12.ábra) és a [desD-Trp1]-MI-1892(Ac) molekula között amid-kötést alakítottam ki. A kapcsolási reakció során BOP/HOBt reagenseket, valamint DIEA-t alkalmaztam. A peptidet a Br-Vindolin-D-Trp vegyülethez képest kétszeres mennyiségben adtam a reakcióelegyhez. A konjugálást szobahőmérsékleten folyamatos kevertetés mellett végeztem. A reakció előrehaladtát, illetve lejátszódását analitikai HPLC segítségével követtem. A kapott kromatogramokat a kiindulási peptid kromatogramjával hasonlítottam össze, így látható volt, hogy a konjugálás milyen mértékben játszódott le. A konjugálás egy napot vett igénybe.

26

(Z)

N (R)

H Br

(R)

OH

(R)

(R)HO (R)

(S)

N

O

NH

H O

COOH (R)

H N H

12. ábra: A Br-Vindolin-D-Trp A kapott terméket szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam, majd a frakciókat liofilizálást követően ESI-MS-sel ellenőriztük. (a kapott termék analitikai adatai a 6. táblázatban, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található).

3.2.2. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA előállítása (későbbiekben Br-Vindolin-MI-1892(AcGFLGC) néven szerepel) A reakciót az előző konjugáláshoz hasonlóan végeztem: DMF-os oldatban BOP/HOBt kapcsolási

reagensek,

valamint

DIEA

jelenlétében

egy

ekvivalens

peptiddel,

szobahőmérsékleten, állandó kevertetés mellett. A konjugálási reakció egy napig tartott. A kapott termék (13. ábra) komponenseit szemipreparatív HPLC-vel történő tisztítással széválasztottam, majd a frakciókat liofilizáltam. A frakciókat tömegspektrometriával ellenőriztem. N H Br

OH

HO N

O

Ac -Cys -Gly -Phe -Leu -Gly

D-Trp -D-Cpa - D-Trp - Ser -D-Lys -Asp -DEA

H O

Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2

13.ábra: Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)

3.2.3.

A

[Br-Vindolin-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Gly-Leu-Phe-Gly-Cys)-Asp-(Leu-

Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA]2 dimer előállítása (későbbiekben [Br-Vindolin-MI-1892(AcCGFLG)]2 néven szerepel) A dimerben a két peptid diszulfid-kötéssel kapcsolódik egymáshoz. A diszulfid-kötés kialakítását szobahőmérsékleten 0,1M Tris pufferben végeztem (a peptidet kismennyiségű

27

DMSO-ban oldottam, majd Tris-pufferrel higítottam) az oldat folyamatos kevertetése mellett. A kapott terméket szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam. A frakciókat liofilizálást követően ESI-MS-sel ellenőriztük (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található). N H Br

OH

HO N

O

D-Trp -D-Cpa - D -Trp -Ser -D-Lys-Asp -DEA

H O

Ac -Cys -Gly -Phe -Leu -Gly Ac -Cys -Gly -Phe -Leu -Gly

O O

H

N

D-Trp -D-Cpa - D -Trp -Ser -D-Lys-Asp -DEA

HO

Br

Leu-Gln - Pro-D-Ala - NH2

Leu-Gln - Pro-D-Ala - NH2

OH

H N

14.ábra: [Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2

3.2.4.

A

Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-

NH2 molekula konjugálása daunorubicinhez; GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) A konjugálást DMF-ben végeztem. A GnRH-III származék oldalláncán lévő aminooxiecetsav és a daunorubicin 13-as pozíciójában lévő C-atomon lévő keto csoportja kapcsolódott össze oxim -kötéssé folyamatos kevertetés mellet. A konjugálás 3 nap alatt ment végbe. A kapott terméket (15.ábra) szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam meg. A liofilizált frakciókat tömegspektrometriával vizsgáltuk (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található). Glp-His-Trp-Ser-His -Asp-Trp-Lys -Pro -Gly -NH2

N

O

O

CH2 CO

Gly -Phe - Leu -Gly -Cys

CH3 OH CH3O O

OH

O

NH2 O

OH CH3

15.ábra: GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)

28

3.2.5. GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) konjugátum dimerizálása A dimerizálás során a két peptid között diszulfid-kötést alakítottam ki az oldalláncban található ciszteinek között. A diszulfid-kötés kialakítása szobahőmérsékleten 0,1M Tris pufferben történt (a peptidet kis mennyiségű DMSO-ban oldottam, majd Tris pufferrel higítottam) az oldat folyamatos kevertetése mellett. A terméket (16. ábra) szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam. A frakciókat liofilizálást követően ESI-MS-sel ellenőriztük(a vegyület analitikai eredményei összefoglalva 6. táblázatban, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található). CH 3 OH

O CH 3 O O

OH

O

NH 2 OH CH 3

O

N

O

N

Glp-His-Trp-Ser-His -Asp-Trp-Lys -Pro -Gly -NH 2

O

CH 2

CO

Gly -Phe - Leu -Gly -Cys

O

CH 2

CO

Gly -Phe - Leu -Gly -Cys

CH 3

Glp-His-Trp-Ser-His -Asp-Trp-Lys -Pro -Gly -NH 2

OH CH 3 O O

OH

O

NH 2 O

OH CH 3

16.ábra: [GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)]2 7. táblázat: A peptidek analitikai adatainak összefoglalása Peptidek

tR (perc)

[M+H]+(számított) [M+H]+(mért)

[des-D-Trp1]-MI-1892(Ac)

26,36

1180,7

1180,8

[des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG)(I)

33,03

1700,3

1700,5

[des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG) (II)

33,55

1700,3

1742,5

Br-Vindolin-MI-1892 (Ac) (I)

26,58

1828,4

1179,8

Br-Vindolin-MI-1892 (Ac) (II)

35,98

1828,4

1828,6

Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)

43,17

2348,1

2347,9

[Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2

41,25

4694,0

4693,8

GnRH-III(Aoa-GFLGC)

22,08

1827,9

1828,0

GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)

31,31

2320,2

2320,2

[GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)]2

31,05

4638,2

4637,1

29

3.3. Biológiai vizsgálatok: A konjugátumok in vitro citosztatikus hatásának meghatározása MTT teszt alkalmazásával Citosztatikusnak nevezzük azokat az anyagokat, amelyek gátolják a sejtek osztódását, ezáltal. A citosztatikus hatás a vizsgált hatóanyagra jellemző és sejttípus-függő. A munkám során az előállított vegyületek in vitro citosztatikus aktivitását MTT-teszt segítségével határoztam meg. Az MTT az élő sejtek mitokondriális dehidrogenáz enzimje alakítja át (sárga Îlila). A sárga tetrazol MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid) lila színű formazán származékká redukálódik az élő sejtek mitokondriumaiban (17. ábra). A lila formazán kristályokat DMSO-ban feloldják és így egy színes oldatot kapunk, melynek abszorbanciáját spektrofotométerrel határozzuk meg (λ= 620nm). Citosztázis mértéke: citotoxicitás/citosztázis [%] = 100× 1 - A kezelt sejtek A kontroll sejtek , ahol A

kezelt

a kezelt sejtek, míg A

a kezeletlen kontroll sejtek esetében mért

kontroll

abszorbanciát jelenti. A reakció csak akkor megy végbe, ha a mitokondriális dehidrogenáz enzim aktív, és emiatt ez a színváltozás használható az élő sejtek mennyiségének mérésére. Amikor a hatóanyaggal kezelt sejtek által termelt lila formazán mennyiségét a kezeletlen kontroll sejtek által produkált formazán mennyiségével hasonlítjuk össze, megtudhatjuk az okozott sejthalálból vagy a sejt metabolizmus megváltozásából, hogy a vizsgált anyag mennyire hatásos. A citosztázis mértékét (%) a koncentráció függvényében ábrázolva a kapott görbék segítségével meghatározhatók az IC50 értékek, tehát az a koncentrációérték, amely a sejtek 50%-ának sejtosztódását gátolja a vizsgált sejtkultúrában.

N

N Br

mitokondriális dehidrogenáz

N N

NH

N

N N

N

N

S S

17. ábra: Az MTT átalakulása a mitokondriumban 30

Az előállított konjugátumok citosztatikus hatását humán emlőkarcinóma (MCF-7), humán vastagbél karcinóma (HT-29) és humán leukémia (HL-60) sejtvonalakon vizsgáljuk MTTteszt segítségével. A konjugátumok in vitro citosztatikus hatását összehasonlítottam a szabad hatóanyagokéval. A vizsgálatok jelenleg is folyamatban vannak. A Br-Vindolin-D-Trp szabad hatóanyag esetén az MCF-7 és a HL-60 sejtvonalakon kaptam értékelhető IC50 értékeket (19., 20. ábra, lásd függelék), ez is alátámásztotta azt a döntést, hogy ezt a származékot alkalmazzam a konjugátumok elkészítéséhez.

31

4. Kísérleti rész A dolgozatomban szereplő peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel állítottam elő, az alábbi két táblázatban összefoglalt protokoll szerint. 8. táblázat: A Boc/Bzl stratégia protokollja alkalmazott reagens Mosás DCM Boc védőcsoport hasítása 33% TFA/DCM Mosás Semlegesítés Mosás Kapcsolás Mosás Kaiser-teszt

DCM 10% DIEA/DCM DCM 3 ekv. Aminosavszármazék +3 ekv. DCC/HOBt (DCM-DMF) DMF DCM Ninhidrin oldat, KCN oldat, fenol oldat (izatin oldat)

Idő 3× 0,5-1 perc 1×2 perc 1×20 perc 5× 0,5-1 perc 4×1 perc 4×0,5-1perc 60 perc 2×0,5-1 perc 2×0,5-1 perc 1×5 perc

Sikertelen kapcsolás esetén a szintézis potokollt a semlegesítési lépéstől ismeteltem 9. táblázat: Az Fmoc/tBu stratégia protokollja alkalmazott reagens Mosás DMF Fmoc védőcsoport hasítása 2% piperidin, 2% DBU/DMF Mosás Mosás Kapcsolás Mosás Kaiser-teszt

Idő 3× 0,5-1 perc 2×2 perc 1×5 perc 1×10 perc 8× 0,5-1 perc 4×0,5-1perc 60 perc

DMF DCM 3 ekv. Aminosavszármazék +3 ekv. DIC/HOBt (DMF) DMF 2×0,5-1 perc DCM 2×0,5-1 perc Ninhidrin oldat, KCN oldat, fenol oldat 1×5 perc (izatin oldat)

Amennyiben a kapcsolás sikertelen volt a DMF-os mosás után megismételtem a kapcsolási lépést.

32

4.1. H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise A szintézist vegyes Boc/Bzl és Fmoc/tBu technikával végeztem, 0,86 mmol/g kapacitású, 0,5 g mennyiségű MBHA gyantán. Az aminosav származékokból és a kapcsolási reagensekből egyaránt három ekvivalensnyi mennyiséget használtam fel. Jelen esetben ez 1,29 millimólnyi anyagmennyiséget jelent. A D-lizin α-amino-csoportján Fmoc, ε-aminocsoportján Boc védőcsoportot tartalmazott, a szerin hidroxil-csoportját tBu csoport védte. A többi aminosavszármazék esetén nem volt szükség oldallánc védőcsoportra. A lizin oldallánc Boc védőcsoportjának lehasításához alkalmazott hasítóelegy 95% TFA-t, 2,5% EDT-t és 2,5% desztillált vizet tartalmazott. A hasítást két részletben végeztem (2 perc +1 óra) szobahőmérsékleten. Majd DCM-nal mostam a gyantát, semlegesítettem 10%-os DIEA/DCM elegyével, ezután újra DCM-nal mostam. Majd a gyantát elfeleztem, és a további lépéseket csak a gyantamennyiség felével végeztem. A lizin ε-amino-csoportját acetileztem. Az acetilezés szobahőmérsékleten 30 percig folyt. A reakció végbemenetelét Kaiser-teszttel ellenőriztem. Ezt követően lehasítottam a D-Cpa Fmoc védőcsoportját. A [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac) molekula szintézisének befejeztével a gyantát etanollal mostam és egy éjszakán át exszikkátorban szárítottam. A peptid hasítása a gyantáról: a hasítást 10 ml HF-dal történt p-krezol (500mg) és DTT (50 mg) gyökfogók jelenlétében. A hasítást egy órán keresztül 0°C-on végeztem. A hasítást és a HF elpárologtatását követően a peptidet 50 ml éterben kicsaptam, majd a csapadékot üvegszűrőn szűrtem, 3× 10 ml éterrel mostam, végül a peptidet 20 ml 100% ecetsavban feloldottam. A kapott peptid oldatot lefagyasztottam és liofilizáltam. Nyers termékként 248 mg peptidet kaptam, amit szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam. Analízis: Minden előállított peptidszármazék esetén a nyers peptidet fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) vizsgáltam azonos programot használva és szemipreparatív rendszerben tisztítottam. A szemi-preparatítv oszlop típusa: Phenomenex Jupiter C18, 10μ, 300 Ǻ mérete: 250 × 10 mm

33

Eluensek: A: 0,1%TFA/desztillált víz; B: 0,1%TFA/CH3CN-víz,80:20 térfogat% (minden az analitikai, mind a szemi preparatív HPLC mérésekhez ugyanezeket az eluenseket használtam) Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

15% B

5. perc

15% B

50. perc 60% B Áramlási sebesség: 4 ml/perc. A tisztítást KNAUER HPLC rendszeren (2db K120 pumpa, nagynyomású keverőegység, K2501 típusú monokromátoros UV detektor, adatgyűjtő szoftver) végeztem. UV detektálást alkalmaztam, λ=280 nm hullámhosszon. Az nyers terméket megtisztítottam. A tiszta termék tömege: 48,1 mg Termelés: 19,4% -analitikai HPLC-vel felvett kromatogramok és a tömegspektrumok a függelékben találhatóak Az alkalmazott analitikai oszlop típusa: Phenomenex Synergi C12 4μ MAX-RP 80Ǻ Mérete: 250 × 4,60 mm Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

0 B%

5. perc

0 B%

50. perc

90 B%

Az áramlási sebesség: 1 ml/perc Detektálási hullámhossz: λ=220 nm A tömegspektrometriás mérések MALDI-TOF-MS-Bruker Daltonics készülékkel történtek. Mátrixként α-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat alkalmaztunk. A mátrixot 0,1% TFA-t tartalmazó acetonitril – víz 2:1 arányú elegyében , a mintát desztillált vízben oldottuk fel. (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és a tömegspektrum a függelékben található).

34

4.2. A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp((Leu-GlnPro-D-Ala-NH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise Az oldalláncot tartalmazó [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG) előállítását a gyantán korábban előállított [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac) szintézise után a gyantamennyiség felén folytattam. A lizin ε-amino-csoportján építettem tovább a peptidet oldallánc elágazásként, amelyet Boc/Bzl-stratégiával készítettem el. Az aminosavszármazékokból és a kapcsolószerekből egyaránt az eredeti (0,5g) gyanta gyantakapacitására számolt három ekvivalensnyi mennyiség felét mértem be. Jelen esetben ez 0,645 milimólnyi anyagmennyiséget jelent. A cisztein Boc védőcsoportjának lehasítása után a reakcióelegyet semlegesítettem 10%-os DIEA/DCM eleggyel, majd DCM-nal mostam a gyantát. A szabad aminocsoportot acetileztem 30 percen át. Az acetilezés sikerességét Kaiser-teszttel ellenőriztem. Ezt követően lehasítottam a D-Cpa Fmoc védőcsoportját, majd a gyantát DMF-dal, DCM-nal, metanollal mostam és egy éjszakán át exszikkátorban szárítottam. A gyantáról a peptidet 10ml HF-dal gyökfogók (p-krezol (0,5 g) és DTT (50 mg)) jelenlétében hasítottam le. A hasítás 0°C-on 1 órán át történt. A hasítást követően a peptidet éterrel kicsaptam, szűrtem, éterrel mostam. A peptidet 100%-os ecetsavval oldatba vittem, majd a peptid oldatot liofilizáltam. A kapott nyerstermék tömege: 300 mg Ezt

analitikai

HPLC-vel

vizsgáltam

az

előző

peptidnél

alkalmazott

gradienssel.

A peptidet szemipreparatív RP-HPLC-vel tisztítottam az előző peptidhez hasonlóan. (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és az MS spektrum a függelékben található). A tiszta termék tömege: 24,8 mg Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

20% B

5. perc

20 % B

50. perc

65% B

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm Termelés: 8,27 %

35

4.3. GnRH-III(Aoa-GFLGC) (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-GlyLeu-Phe-Gly-Cys)-Pro-Gly-NH2) molekula szintézise, tisztítása, analízise A szintézist Fmoc/tBu technikával végeztem 0,65 mmol/g kapacitású 0,5 g mennyiségű RinkAmid MBHA gyantán. Az aminosavszármazékokból és a kapcsolási reagensekből egyaránt négy ekvivalensnyi mennyiséget használtam fel. Jelen esetben ez 1,3 millimólnyi anyagmennyiséget jelent. A lizin ε-amino-csoportján Mtt védőcsoportot tartalmazott, a szerin hidroxil-csoportját és az aszparaginsav ωCOOH csoportját terc-butil-csoport, míg a hisztidin imidazol-csoportját tritil-csoport védte. A többi aminosavszármazék esetén nem volt szükség oldallánc védőcsoportra. Először az alapláncot építettem fel, majd lehasítottam a lizin oldallánc védőcsoportját (0,1 térfogat% TFA/DCM: 2+2+20 perc). A szabaddá vált aminocsoporton

tovább

építettem

az

enzim-degradábilis

spacer

részletet,

amely

aminooxiecetsavban végződött. Ezt BOP/HOBt reagensek segítségével kapcsoltam a gyantamennyiség két részletre osztása után. A gyantáról az elkészült molekulát 10 ml hasítóeleggyel távolítottam el. A hasítóelegy, amelyet jeges hűtés közben készítettünk el (15 perc jeges hűtés), 95%TFA-t, 2,5%EDT-t és 2,5% desztillált vizet tartalmazott. A reakció 1,5 órán át tartott szobahőmérsékleten. A hasítás után a keveréket hideg éterbe szűrve kicsapattam, majd 10 perces 4000/perc fordulatszámú centrifugálással ülepítettem. Az üledékről az étert dekantálással eltávolítottam, majd a peptidet az előzőekhez hasonlóan hideg éterben kétszer mostam. Ezután 10%-os ecetsavban feloldottam a peptidet, az oldatot folyékony N2-ben fagyasztottam le, majd liofilizátam. (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és az MS spektrum a függelékben található). A kapott nyerstermék tömege: 200 mg. Termelés: 66,09 % Ezt analitikai HPLC-vel vizsgáltam. A terméket tisztítás nélkül használtam fel a következő

4.4.Konjugátumok szintézise 4.4.1. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-AlaNH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise: A konjugálást DMF-os oldatban szobahőmérsékleten, 24 órán keresztül végeztem BOP, HOBt kapcsolószerek és DIEA segítségével, állandó kevertetés mellett. A BOP (benzotriazol1-yl-oxi-tris(dimetilamino)- foszfonium hexafluoro foszfát) kapcsolóreagens előnye, hogy alkalmazása esetén nem kell DCC-et vagy DIC-et is adagolnunk a reakcióhoz az in situ aktív

36

észterforma kialakításához. A reakció előrehaladtát analitikai HPLC segítségével követtem. 10. táblázat: Alkalmazott reagensek a konjugálási reakció során: Anyag [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac) Br-Vindolin-D-Trp HOBt.12H2O (2 ekv.) DIEA (4 ekv.) BOP (2 ekv.)

Moláristömeg (g/mol) 1180,80 665,57 151,00 129,25 442,00

Anyagmennyiség (mmol) 0,030 0,015 0,030 0,060 0,030

Tömeg /Térfogat 35,48 mg 10,00 mg 4,53 mg 10,27 μl 13,26 mg

A peptidet szemipreparatív RP-HPLC-vel tisztítottam az előző peptidhez hasonlóan. Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0.perc 20% B 5.perc 20% B 50.perc 70% B

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm A tiszta termék tömege: 10,3 mg Termelés: 37,56 % A tömegspektrometriás mérésekhez elektrospray ionizációs (ESI-MS) Bruker Daltonics Esquire 3000 Plus típusú készüléket használtam. Folyamatos mintaadagolás mellett (sebesség 240μl/h) 50-2000 m/z tartományban, pozitív üzemmódban vettem fel a spektrumokat. A vegyületeket 50% acetonitril-víz elegyében oldottam fel. (a kapott analitikai eredményeket a 6. táblázat tartalmazza, a HPLC kromatogram és az MS spektrum a függelékben található)..

4.4.2. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA szintézise, tisztítása, analízise A konjugálást DMF-os oldatban szobahőmérsékleten BOP, HOBt kapcsolási reagensekkel, DIEA-nal 1 napon keresztül végeztem állandó kevertetés mellett.

37

11. táblázat: Alkalmazott reagensek a konjugálási reakció során: Anyag [des-D-Trp1]-MI1892(Ac-GFLGC) Br-Vindolin-D-Trp HOBt.12H2O (2 ekv.) DIEA (4 ekv.) BOP (2 ekv.)

Moláristömeg (g/mol) 1700,50

Anyagmennyiség Tömeg /térfogat (mmol) 0,01458 24,8 mg

665,57 151,00 129,25 442,00

0,01458 0,02917 0,05834 0,02917

9,7 mg 4,4 mg 9,9 μl 12,9 mg

A reakciót analitikai HPLC-vel követtem a kiindulási anyagok kromatogramjai alapján. A peptidet szemipreparatív RP-HPLC-vel tisztítottam az előző peptidhez hasonlóan. Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

20% B

5. perc

20% B

50. perc

70% B

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm A tiszta termék tömege: 7,5 mg Termelés: 21,91%

4.4.3. A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Leu-Phe-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA dimerizálása, tisztítása, analízise A dimerizálást szobahőmérsékleten 0,1M pH=8,1, Tris-pufferben állandó kevertetés mellett 24 órán keresztül végeztem. A 7,5 mg monomer peptidet először 100μl DMSO-ban oldottam, majd ezt higítottam Tris pufferrel úgy, hogy a végtérfogat 1ml legyen. A reakciót analitikai HPLC-vel követtem, majd a terméket szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam. Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

20% B

5. perc

20% B

50. perc

70% B

38

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm

4.4.4. GnRH-III(Aoa-GFLGC) molekula konjugálása daunorubicinhez, a konjugátum tisztítása, analízise A peptidet 10 ml 0,2M pH=5,08 nátrium-acetát pufferben oldottam fel, majd hozzáadtam a Daunorubicint, és további puffert adagoltam a reakcióelegyhez úgy, hogy a végtérfogat 20 ml legyen. Állandó kevertetés mellett a reakció 3 nap alatt játszódott le. A reakciót analitikai HPLC-vel követtem, majd szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam a konjugátumot. Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0.perc 10% B 5.perc 10% B 10.perc 25% B 60. perc 75 B%

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm A termék sztatikussága miatt nem tudtam lemérni a tömegét, ezért kioldva rögtön használtam fel a következő reakcióhoz. 12. táblázat: Az alkalmazott reagensek mennyisége a konjugálási reakció során: Anyag GnRH-III (CGFLG-Aoa) Daunorubicin.HCl

Moláristömeg (g/mol) 1827,9 563,99

Anyagmennyiség Tömeg /térfogat (mmol) 0,1094 200 mg 0,1094 61,7 mg

4.4.5. GnRH-III(Aoa-GFLGC) – Dau konjugátum dimerizálása, tisztítása, analízise A dimerizálást szobahőmérsékleten 0,1M pH=8,1, Tris pufferben állandó kevertetés mellett 6 napon keresztül végeztem. A monomer peptidet először kis mennyiségű DMSO-ban oldottam,

39

majd ezt higítottam Tris pufferrel. Mivel a pufferben a peptid kicsapódott, ezért további DMSO adagolásával visszaoldottam. A reakciót analitikai HPLC-vel követtem, majd szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam. Gradiens elúciót alkalmaztam: Az alkalmazott gradiens:

0. perc

10% B

5. perc

10% B

10. perc

25% B

60. perc

75 B%

Áramlási sebesség: 4 ml/perc. Detektálási hullámhossz: λ=280 nm A tiszta termék tömege: 8,2 mg Termelés (kiindulási nyers termékre számolva): 4,1%

4.5. Citosztatikus hatásvizsgálatok MTT teszt alkalmazásával A Vindolin-D-Trp, a Vindolin-L-Trp MI-1892 (Ac), az MI-1892-(CGFLG)(Ac) dimer in vitro tumorellenes hatását vizsgáltuk MCF-7 humán emlőkarcinóma-, HT-29 humán vastagbél karcinóma-, és HL-60 humán leukémia sejtvonalon. A sejtek kultúrában tartása, növesztése 37°C-on, 5% CO2 atmoszféra mellett, komplett RPMI 1640 médiumban történt. A teljes (komplett) médium 10% FCS-t (magzati borjú szérum), Lglutamint (2 μg/ml), nátrium-piruvátot (1 μmol/ml) és gentamicint (160 μg/ml) tartalmazott. A kísérletet megelőző napon a sejteket 96 lyukú szövettenyésztő lemezre osztottuk 100 μl szérumtartalmú, komplett médiumban (5*103 sejt/lyuk). Következő nap 50 μl médium eltávolítását követően, a negatív kontroll sejtekre 150 μl szérummentes médiumot, míg a kezelt sejtekre 50 μl szérummentes médiumot és 100 μl szérummentes médiumban oldott különböző koncentrációjú hatóanyagot (Vindolin-D-Trp, Vindolin-L-Trp) adagoltunk. A kezeléseket c= 1*10-4 – 2,56*10-10 M koncentrációtartományban végeztük el. Az MCF-7 és a HT-29 esetében hat óra, a HL-60 esetében három óra kezelési idő elteltével a sejteket 135-135 μl szérummentes médiummal mostuk 2-szer, majd lyukanként ugyanennyi teljes médiumot adtunk a sejtekhez. Három nap inkubálás után 45 μl MTT-oldatot (c=2 mg/ml, szérummentes médiumban oldva, 0,22 μm filterrel szűrve) adtunk a sejtekhez lyukanként, majd a lemezeket 37°C-on, 3,5 órán 40

át inkubáltuk. Az inkubálási idő letelte után centrifugálással a sejtekről a felülúszót óvatosan eltávolítottuk és a lila kristályokat 100 μl DMSO-ban oldottuk. Az optikai denzitást Elisa Reader (Labsystems, Finnország) segítségével (λ=540 nm és 620 nm) mértük. A mélyedésekben található sejtek szaporodásának/osztódásának mértékét a mért abszorbanciák segítségével határozhattuk meg. A citosztázis mértékét (%) a koncentráció függvényében ábrázoltuk és a kapott görbék segítségével határoztuk meg az 50%-os citosztázis értékhez tartozó koncentráció (IC50) értékeket. Az MCF-7 és a HL-60 sejtvonalakon kaptam értékelhető IC50 értékeket (18. és 19. ábra, lásd függelék) a Br-Vindolin-D-Trp esetén, ezért döntöttem úgy, hogy a konjugátumok elkészítéséhez is ezt a származékot alkalmaztam.

MTT-teszt

5000 sejt/lyuk/ 100 μl médium 3/6 óra

18. ábra: a tetrazólium módszer elve

41

5. Összefoglalás Munkám során kétkomponensű peptidkonjugátumokat állítottam elő, amelyekben a komponensek önmagukban is tumorellenes hatással rendelkeznek. Vizsgáltam, hogy a tumorellenes hatásra milyen befolyással van a komponensek konjugálása, illetve a konjugátumok dimerizálása. ™ Szilárdfázisú peptidszintézissel GnRH-II antagonista származékot ([des-D-Trp1]-MI1892: H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA, spacer részletet tartalmazó ([des-D-Trp1]-MI-1892: H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-GlyPhe-Leu-Gly)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA), és aminooxiecetsavat tartalmazó GnRH-III analógot (Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)Pro-Gly-NH2) szintetizáltam. Az előállított peptidekhez, mint irányító molekulákhoz kapcsoltam a antitumor hatású drogokat. ™ Br-Vindolin-D-Trp

illetve

daunorubicin

antitumor

hatású

szerekkel

peptidkonjugátumokat állítottam elő. (Br-Vindolin-MI-1892 (Ac), Br-Vindolin-MI1892(Ac-GFLGC), GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) ™ A konjugátumok dimer változatait is elkészítettem. A monomer egységeket diszulfidhíd segítségével kapcsoltam össze. Így elsőként sikerült olyan GnRH dimerszármazékokat előállítanom, amelyek további tumorellenes hatóanyagokat tartalmazott. ([Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2, [GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)]2) ™ A konjugátumok tisztaságát HPLC-vel vizsgáltam és MS segítségével azonosítottam őket.

™ Az

előállított molekulák biológiai aktivitását a sejtek életképességét vizsgáló MTT

teszttel vizsgáltam. A kapott eredményeket összehasonlítottam a szabad hatóanyagok illetve korábban előállított analógok tumorellenes hatásával

42

.

6.Rövidítés jegyzék α-CHCA

α-ciano-4-hidroxi-fahéjsav

CH3CN

Acetonitril

Aoa

Aminooxiecetsav

BHA

Benzhidrilamin

Boc

terc-butil-oxikarbonil

BOP

benzotriazol-1-yl-oxi-tris(dimetilamino)- foszfonium hexafluoro foszfát

t

Bu

terc-butil

Bzl

4-benzil

ClTrt

klór-tritil

Cpa

p-klór-fenilalanin

CTN

Katarantin

CSPPS

konvergens szilárd fázisú peptidszintézis

Dau

Daunorubicin

DBU

1,8-diazabiciklo[5.4.0]-undek-7-én

DCC

N,N'-diciklohexil-karbodiimid

DCM

Diklórmetán

DCU

N,N'-diciklohexil-urea

DEA

N,N dietil-amin

DIC

N,N'-diizopropil-karbodiimid

DIEA

N-diizopropil-etil-amin

DIU

N,N'-diizopropil-urea

DIVEMA

divinil éter és maleinsav anhidrid kopolimere

DMF

N,N-dimetilformamid

DMSO

Dimetilszulfoxid

Dox

Doxorubicin

DTT

1,4-DL-ditiotreitol

EDT

1,2-etán-ditiol

ESI-MS

elektrospray ionizációs tömegspektrométer

FCS/FBS

foetal calf serum=magzati borjú szérum

Fmoc

9-fluorenil-metoxi-karbonil

FSH

folliklus stimuláló hormon

43

Glp

piroglutaminsav

GnRH

gonadotropin releasing hormon

GnRH-R

gonadotropin releasing hormon receptor

GPCR

G-potein coupled receptor (G fehérjéhez kapcsolódó receptor)

7TM

hét transzmembrán (receptortípus)

HF

hidrogén-fluorid

HOBt

1-hidroxi-benztriazol

HPLC HPMA

high performance liquid chromatography (nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia) 2-hidroxipropil-metakrilát

IC50

median inhibitory 50 concentration

ICSH

intersticiális sejt stimuláló hormon

LH

luteinizáló hormon

MALDI

Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

MBHA

4-metil-benzhidrilamin

Mbzl

4-metil-benzil

MDR

multidrog-rezisztencia

MTT

(3-(4,5-Dimetilltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid

PAM

4-Hidroximetil-fenilacetamidometil

SPPS

szilárd fázisú peptidszintézis

TFA

Trifluorecetsav

TFMSA

trifluor-metánszulfonsav

TMSOTf

trimetil-szilil-trifluor-metánszulfonát

TOF

time of flight (repülési idő)

UV

Ultraviola

VBL

Vinblasztin

VCR

Vinkriszitn

VDN

Vindolin

VDS

Vindezin

VRL

Vinorelbin

44

7. Irodalomjegyzék [1.] http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ [2.] Központi statisztikai hivatal [3.] Balázs András, Daganatbiológia, Gondolat kiadó, Budapest,1984 [4.] http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer#Treatment [5.]

http://www.cancer.org/docroot/CRI/content/CRI_2_6x_the_history_of_cancer_72.asp

[6.] Hirsch J.,An anniversary for cancer chemotherapy, The Journal of the American Medical Association, 2006, 296 (12): 1518–20. [7.] http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1908/ehrlich-bio.html [8.] Bosch F., Rosich L.,The contribution of Paul Erlich to Pharmacology: A tribute on the occasion of the centenary of his Nobel Prize, Pharmacology, 2008, 82, 171-179 [9.] http://nfs.unipv.it/nfs/minf/dispense/immunology/loci.html Paul Erlich’s side chain theory [10.] Fonyó Attila, Élettan gyógyszerészhallgatók részére, Medicina Könyvkiadó Rt.,Budapest,1998 [11.] Horváth Cs. Dr., Tabularium Endocrinologiae, Melania Kiadó, Budapest, 2002 [12.] http://www.lib.mcg.edu/edu/eshuphysio/program/section5/5ch8/s5ch8_5.htm [13.] Schally AV., Hypothalamic regulation of FSH and LH secretion, Res Reprod. 1970, 2(4):2-3. [14.] Limonta P.,Moretti R. M., Marelli M.M:, Motta M., The biology of gonadotropin hormone releasing hormone: role int he contol of tumor growth and progression in humans, Frontiers in Neuroendocrinology, 2003, 24, 279-295 [15.] Sower, S. A.; Chiang, Y-C.; Lovas, S.; Conlon, J. M. Primary structure and biological activity of a third gonadotropin-releasing hormone from lamprey brain. Endocrinol. 1993, 132, 1125-1131. [16.], Millar, R.P., GnRHs and GnRH receptors, Animal Reproduction Science, 2005, 88, 528 [17.]Kraus S.,Naor Z., Seger R., Gonadotropin-releasing hormone in apoptosis of prostate cancer cells, Cancer Letters, 2006, 234, 109-123 [18.] http://en.wikipedia.org/wiki/Gonadotropin-releasing_hormone_antagonist [19.] Nagy, A.; Schally, A. V.; Armatis, P.; Szepesházi, K.; Halmos, G.; Kovács, M.; Zarándi, M.; Groot, K.; Miyazaka, M.; Jungwirth, A.; Horváth, J. Cytotoxic analogs of luteinizing hormone-releasing hormone containing doxorubicin or 2-pyrrolinodoxorubicin, a derivative 500-1000

times

more

potent,

Proc.

Natl. 45

Acad.

Sci.,

1996,

93,

7269-7273

[20.] Neill J.D., Musgrove L.C., Duck W.L., Newly recognised GnRH receptors: function and relative role, TRENDS in Endocrinology and Metabolism, 2004, 15, 385-390 [21.] Mező I.,Seprődi J.,Vincze B., Pályi I.,Kéri Gy., Vadász Zs.,Tóth G., Kovács M., Koppán M.,Horváth E.J.,Kálnay A.,Teplán I., Synthesis of GnRH analogs having direct antitumor and low LH-releasing activity, Biomedical Peptides,Proteins & Nucleic Acids, 1996, 2., 33-40, [22.] http://hu.wikipedia.org/wiki/Ingolaf%C3%A9l%C3%A9k [23.] Lovas, S.; Pályi, I.; Vincze, B.; Horváth, J.; Kovács, M.; Mező, I.; Tóth, G.; Teplán, I.; Murphy, R. F. Direct anticancer activity of gonadotropin-releasing hormone-III. J. Pept. Res. 1998, 52, 384-389. [24.] Kovács, M.; Seprődi, J.; Koppán, M.; Horváth, J. E.; Vincze, B.; Teplán, I.; Flerkó, B.,Lamprey gonadotropin hormone-releasing hormone-III has no selective follicle-stimulating hormone-releasing effect in rats, J. Neuroendocrinol., 2002, 14, 1-14. [25.] Kovács, M.; Vincze, B.; Horváth, J. E.; Seprődi, J. Structure-activity study on the LH and FSH-releasing and anticancer effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-III analogs, Peptides, 2007, 28, 821-829. [26.] Pályi, I.; Vincze, B.; Lovas, S.; Mező, I.; Pató, J.; Kálnai, A.; Túri, G.; Gaál, D.; Mihalik, R.; Péter, I.; Teplán, I.; Murphy, R. F. Gonadotropin-releasing hormone analogue conjugates with strong selective antitumor activity, Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 23612366. [27.] Mező, G.; Czajlik, A.; Manea, M.; Jakab, A.; Farkas, V.; Majer, Z.; Vass, E.; Bodor, A.; Kapuvári, B.; Boldizsár, M.; Vincze, B.; Csuka, O.; Perczel, A.; Przybylski, M.; Hudecz,F. Structure, enzymatic stability and antitumor activity of sea lamprey GnRH-III and its dimer derivatives, Peptides, 2007, 28, 806-820. [28.] Millar, R.P., Lu, Z.,Pawson, A., Flanagan, C.A.,Morgan K., Maudsley S.R., Gonadotropin-Releasing Hormone Receptors, Endocrin Reviews, 2004, 25, 235-275 [29.] Mező G., Manea M., Szabó I., Vincze B., Kovács M. , New derivatives of GnRH as potential anticancer therapeutic agents, Curr Med Chem. 2008, 15, 2366-79. [30.] http://www.chm.bris.ac.uk/webprojects2002/jjones/Content/vincristine.htm [31.] Hayato Ishikawa,Elliott G.I., Velcicky J., Choi Y.,Boger D.L.: Total Synthesis of (-)-and ent-(+)-Vindoline and Related alkaloids, J Am Chem Soc., 2006, 16, 10596-612. [32.] http://phy.asu.edu/phy598-bio/Class/D6%20Notes_files/image034.jpg [33.] http://www.daviddarling.info/images/cell_cycle.jpg [34.] Kovács János, Sejttan, Eötvös Kiadó, 2007, 45-46 [35.] Casado P., Prado MA, Zuazua-Villar P, Del Valle E, Artime N, Cabal-Hierro L, Rupérez 46

P, Burlingame AL, Lazo PS, Ramos S. ,Microtubule interfering agents and KSP inhibitors induce the phosphorylation of the nuclear protein p54(nrb), an event linked to G2/M arrest, Journal of Proteomics, 2008,(közlés alatt) [36.] Duflos A. Kruczynski A., Barret J-M., Novel Aspects of Natural and Modified Vinca Alkaloids, Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents, 2002 , 21, 55-70 [37.] Crowther,D.,Blood and neoplastic diseases (A Rational Approach to the Chemotherapy of Human Malignanat Disease-I, British Medical Journal, 1974, 4, 156-159 [38.] V.Prakash,Timasheff S.N.Mechanism of interaction of vinca alkaloids with tubulin: catharantine and vindoline, Biochemistry, 1991, 30, 873-880 [39.] DiMarco A., Soldati M., Fioretti A., Dasdia T.,: Activity of Daunomicin, A new antitumor antibiotic, on normal and neoplastic cells grown in vitro, Cancer Chemother Rep., 1964, 38, 39-47. [40.] Gewirtz DA, A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics Adriamycin and daunorubicin, Biochem Pharmacol 1999, 57, 727-741. [41.] Janáky, T.; Juhász, A.; Bajusz, S.; Csernus, V. J.; Skralovic, G.; Bokser, L.; Milovanovics, S.; Redding T. W.; Rékasi, Z.; Nagy, A.; Schally, A. V. Analogues of luteinizing hormone-releasing hormone containing cytotoxic groups, Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 89, 972-976. [42.] Szabó I., Manea M., Orbán E., Csámpai A., Bősze Sz., Szabó R., Tejeda M., Gaál D., Kapuvári B., Radnai L., Pryzbylski M., Hudecz F., Mező G., Development of an oxime bond containing daunorubicin-gonadotropin-releasing hormone-III conjugate as a potential multivalent anicancer drug, Journal of Medical Chemistry, 2008, (beküldve) [43.] Kovács, M.; Schally, A.V.; Nagy, A.; Koppán, M.; Groot, K. Recovery of pituitary function after treatment with a targeted cytotoxic analog of luteinizing hormone-releasing hormone, Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 1420-1425. [44.] R. B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem.Soc, 1963, 85, 2149–2154. [45] Lloyd-Williams P, Albericio F, Giralt E., Convergent solid-phase peptide synthesis. XI. Synthesis and purification of protected peptide segments spanning the entire sequence of the uteroglobin monomer using the photolabile nbb-resin, Tetrahedron, 1993, 49, 11065-11133 [46.] Barany,G.,Merrifield R.B. In The Peptides (Gross and J. Meienhofen,Eds.),Academic Press, 1979, 2, 1-284 [47.] Carpino,L.A., Han,G.Y.,The fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group, J. Org. 47

Chem., 1972, 37, 3404-3409 [48.]Barany,G.,Kneib-Cordonier,N.and Mullen,D.G., Solid-phase peptide synthesis: a silver anniversary report, Int.J.Pept.Prot.Res., 1987, 30, 705-739 [49] Walker B.”Solide Phase Peptide Synthesis”.in: Peptide antigens. A practical approach .Ed: Wisdom,G.B, Oxford University Press,1994, 27-81 [50.]Fields,G.B.,Tian,Z. and Barany, G. Synthetic peptides. Ed:Grant,G.A.Freeman,and Co, New York, 1992, 77-183 [51.] Newcomb R, Szoke B, Palma A, Wang G, Chen X, Hopkins W, Cong R, Miller J, Urge L, Tarczy-Hornoch K, Loo JA, Dooley DJ, Nadasdi L, Tsien RW, Lemos J, Miljanich G. , Selective peptide antagonist of the class E calcium channel from the venom of the tarantula Hysterocrates gigas. Biochemistry, 1998, 3;37, 15353-62. [52.] Grant, A.G., Principles and Practice of Solid- Phase Peptide Synthesis, Synthetic Peptides a User’s Guide, Oxford, University Press, 1992, 88-96 [53.]. König,W.,Geiger,R. Eine neue Methode zur Synthese von Peptiden: Aktivierung der Carboxylgruppe mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-l.2.3benzotriazin ,Chem.Ber.,1970,103,788-798 [54.] Kaiser E. Colescott R.L. Bossinger C.D. and Cook P.I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides, Anal. Biochem., 1970, 34., 595-598 [55.]Tam,J.P.,Merrifield,R.B.: Strong acid deprotection of synthetic peptides, Mechanism and methods in Peptides. (Undenfriend and Meienhofer, I. Eds), Academic Press, 1987, 185-248

48

8. Köszönetnyilvánítás Tisztelettel köszönöm Dr. Perczel András tanszékvezető egyetemi tanárnak, és Dr Hudecz Ferenc rektornak az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport vezetőjének, hogy lehetővé tették számomra a kutatómunkát a Szerves Kémiai Tanszéken működő kutatócsoportban. Hálásan köszönöm Dr. Mező Gábor témavezetőmnek, hogy tanácsaival és kritikai észrevételeivel segített munkámban. Köszönöm továbbá, hogy iránymutatásával és rengeteg türelmével segítette a TDK dolgozatom elkészültét. Köszönöm Bai Katalinnak, Dr. Bánóczi Zoltánnak, Marilena Maneanak és Szabó Ildikónak a tömegspektrometriás mérések elvégzését, továbbá Orbán Erikának a biológiai vizsgálatok elvégzésében nyújtott segítségét, valamint mindannyiuknak a munkám során nyújtott sok segítséget. Köszönetet mondok Dr. Szántay Csabának a rendelkezésemre bocsátott és vindolin származékokért. Köszönettel tartozom továbbá az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoport valamennyi tagjának.

9. Függelék 2. táblázat: Magyarországi mindkét nemre vonatkozó daganathalálozási sorrend az 19992000-es évben. [2.] Daganat

Esetszám

1. Tüdő

7853

2. Kolorektális (vastag- és végbél) 4911 3. Emlő

2371

4. Gyomor

2236

5. Nyirok- és vérképzőrendszer

1946

6. Ajak- és szájüreg

1653

7. Hasnyálmirigy

1554

8. Prosztata

1393

9. Máj

959

10. Nyelőcső

883

11. Epehólyag

841

12. Húgyhólyag

758

13. Agy

717

3. táblázat: a különböző GnRH formák elsődleges szerkezete [14.] GnRH forma

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

GnRH – I (mGnRH)

p-Glu

His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Leu

Arg

Pro

Gly-NH2

GnRH – II (cGnRH-II)

p-Glu

His

Trp

Ser

His

Gly

Trp

Tyr

Pro

Gly-NH2

cGnRH – I

p-Glu

His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Leu

Gln

Pro

Gly-NH2

rGnRH

p-Glu

His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Leu

Trp

Pro

Gly-NH2

lGnRH – I

p-Glu

His

Tyr

Ser

Leu

Glu

Trp

Lys

Pro

Gly-NH2

lGnRH – III

p-Glu

His

Trp

Ser

His

Asp

Trp

Lys

Pro

Gly-NH2

sGnRH

p-Glu

His

Trp

Ser

Tyr

Gly

Trp

Leu

Pro

Gly-NH2

cfGnRH

p-Glu

His

Trp

Ser

His

Gly

Leu

Pro

Pro

Gly-NH2

dfGnRH

p-Glu

His

Trp

Ser

His

Gly

Trp

Leu

sPro

Gly-NH2

m=mammalian=emlős, c=chicken=csirke, r: amphibian=kétéltű, l: lamprey=ingola, s: salmon=lazac, cf: catfish=törpeharcsa, df: dogfish=tüskéscápa 4. táblázat: a GnRH-II szöveti megjelenései és feltételezett fiziológiai funkciói Szövet

Feltételezett feladat

Központi és perifériás idegrendszer

Neuromoduláció

Medio-bazális hipotalamusz

Gonadotropin szekréció

Limbikus szervzetek

A reprodukciós viselkedés stimulálása

Méhnyálkahártya Méhlepény

Endokrin funkciók szabályozása

Emlő Petefészek A női szaporítószervek rosszindulatú daganatai Sejt proliferáció gátlás Normál T sejtek Tumor T sejtek

Sejt adhézió és migráció fokozása

5. Táblázat: A Boc/Bzl stratégiában alkalmazott oldallánc védőcsoportok: Funkciós csoport -OH

Aminosav

Védőcsoport

Szerin Treonin Tirozin

Benzil (Bzl)

CH2

O C

2-brómbenzil-oxy-karbonil (2-Br-Z)

CH2

O

Br

Cl

2,6-diklór-benzil (2,6 di- Cl-Bzl )

CH2

Cl

-SH

Cisztein

Ciklohexil (cHex)

CH2

CH2

OCH3

CH2 NH

-εNH2

Lizin

4-metil-benzil (Meb)

CH3

C

CH3

O

O C

2-klór-benzil-oxi-karbonil (2-Cl-Z)

O C

-ωCOOH

glutaminsav aszparagin

-imidazol

glutamin Hisztidin

CH2

Cl

aszparaginsav

-ωCONH2

O

O

CH2

O

CH2

Acetamido-metil (Acm) benzil-oxi-karbonil (Z)

CH2

O

4-metoxi-benzil (Mob)

Benzil-észter (OBzl) Ciklohexil-észter (OcHex) Xantil (Xan)

O

O2S

CH3

Tozil (Tos) Dinitrofenil (Dnp)

O2N NO2

H2C

-guanidino

Arginin

O

Benzil-oxi-metil (Bom)

CH2

O2S

CH3

H3C O

2,3,6-trimetil-benzolszulfonil (Mts)

S

CH3

O H3C H3C O S

Triptofán

4-metoxi-2,3,6-trimetilenzolszulfonil(Mtr)

OCH3

O H3C

-indol

CH3

Formil (For)

O H

C

Ciklohexil-oxi-karbonil (Hoc)

O C

-szulfid

Metionin

Tozil (Tos)

O

Oxidálás, szulfoxid

O CH2 CH2 S

CH3

6. táblázat: Az Fmoc/tBu stratógiában alkalmazott oldallánc védőcsoportok:

Funkciós csoport -OH

Aminosav

Védőcsoport

szerin,treonin,tirozin

terc-butil (tBu)

CH3 C

H3C

CH3

-SH

Cisztein

tritil (Trt)

acetamido (Acm) CH2 NH

-εNH2

C

CH3

Lizin H 3C

C

CH3

O

O

O

tercier-butil-oxi-karbonil (Boc)

C

CH3

4-metil-tritil (Mtt) H3C

allil-oxi-karbonil (Alloc)

O C

ω

- COOH

H2 C

O

Aszparaginsav,glutaminsav

O

CH3

CH2

tercier-butil-észter (OtBu)

C

O

C

H3C

C H

CH3

-ωCONH2

aszparagin,glutamin

tritil (Trt)

-imidazol

Hisztidin

tritil (Trt)

CH3 C

H3 C

Guanidino

Arginin

H 3C

H2 C

O

CH3

CH3

O

CH3 O

S O CH3

H3C

Indol

CH3

Triptofán H 3C

C CH3

O

O C

Tercier-butil-oxi-metil (Bum) 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofurane-6sulfonyl (Pbf) tercier-butil-oxi-karbonil (Boc)

19. ábra: A Br-Vindolin- D-Trp citosztatikus hatása a koncentráció függvényében humán emlőkarcinóma sejteken:

100

A Vindolin-D-Trp citosztatikus hatásaz MCF-7 sejteken (IC50=83,6)

80

Citosztázis %

60

40

20

0

1E-4

1E-3

0,01

0,1

1

10

100

Koncentráció (μM)

20. ábra: A Br-Vindolin-D-Trp citosztatikus hatása a koncentráció függvényében humán leukémia sejteken:

A Vindolin-D-Trp citosztatikus hatása HL-60 sejteken IC50 =91,83 100

80

Citosztázis %

60

40

20

0

1E-4

1E-3

0,01

0,1

Koncentráció (μM)

1

10

100

Kromatogramok és spektrumok

Abszorbancia

21. ábra: A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja

2,5

[des-D-Trp1]-MI-1892(Ac)

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

idõ t / perc 0

10

20

30

40

50

tR ([des-D-Trp1]-MI-1892(Ac))=26,36 perc 22. ábra: A tiszta frakció MS spektruma:

500

1000

1500

2000

2500

3000

A molekula várt tömege: [M+H]+: 1180,7 g/mol mért tömege: [M+H]+: 1180,8 g/mol

3500

m/z

23. ábra: A H-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)-Asp(Leu-Gln-Pro-DAla-NH2)-DEA analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja [des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG) 1.

Abszorbancia

0,12

2.

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

0,00

-0,02 0

10

20

30

40

50

idõ t / perc

tR1 ([des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG))= 33,03 perc (a tömegspektrometriás mérés alapján az egyes számú frakció volt a termék) tR2 ([des-D-Trp1]-MI-1892(Ac-CGFLG)) = 33,55 perc (a tömegspektrometriás mérés alapján ez a frakció olyan származékot tartalmazott, amelyben valamelyik aminosav pluszban acetileződött) 24. ábra: A tiszta frakció MS spektruma:

[M+H]+: 1700,5

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

A molekula várt tömege: [M+H]+: 1700,32 g/mol mért tömege: [M+H]+: 1700,5 g/mol

5000

5500

m/z

25. ábra: A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-NH2 analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja GnRH-III (Aoa-GFLGC) 0,5

Abszorbancia

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

0

10

20

30

40

50

idõ t / perc

tR GnRH-III(Aoa-GFLGC) =22,08 perc 26. ábra: Br-Vindolin-D-Trp analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja: Br-Vindolin-D-Trp 1,8 1,6

Abszorbancia

1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0

10

20

30

idõ t / perc

tR (Br-Vindolin-D-Trp)=34,65 perc

40

50

27. ábra: Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac)-Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)DEA analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja: Br-Vindolin-MI-1892(Ac) 3.

Abszorbancia

2,0

2.

1,5

1. 1,0

0,5

0,0

0

10

20

30

40

50

idõ t / perc

tR1 (Br-Vindolin-MI-1892 (Ac))=15,32 perc (p-krezol gyökfogó) tR2 (Br-Vindolin-MI-1892 (Ac))=26,58 perc (kiindulási anyag: MI-1892(Ac)) tR3 (Br-Vindolin-MI-1892 (Ac))=35,98 perc (a tömegspektrometriás mérés alapján ez a frakció tartalmazza a terméket) 28. ábra: A tiszta frakció MS spektruma: [M+H]+: 1826,68

A molekula várt tömege: [M+H]+: 1826,4 g/mol mért tömege: [M+H]+: 1826,68 g/mol

29. ábra: A Br-Vindolin-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Ac-Cys-Gly-Phe-Leu-Gly)Asp(Leu-Gln-Pro-D-Ala-NH2)-DEA analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja: Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)

1.

Abszorbancia

3,0

3.

2,5

2,0

4. 2.

1,5

1,0

0,5

0,0

-0,5 0

10

20

idõ t / perc

30

40

50

tR1 (Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)) = 15,20 perc (p-krezol gyökfogó) tR2 (Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)) = 35,73 perc (nem beazonosított melléktermékek az MS készülék leterheltsége miatt) tR3 (Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)) = 38,03 perc (nem beazonosított melléktermékek az MS készülék leterheltsége miatt) tR4 (Br-Vindolin-MI-1892(Ac-GFLGC)) = 43,17 perc (a tömegspektrometriás mérés alapján ez a frakció tartalmazza a terméket) 30. ábra: A tiszta frakció MS spektruma: [M+H]+: 2347.99

A molekula várt tömege: [M+H]+: 2348,0 g/mol mért tömege: [M+H]+: 2347,99g /mol

31 ábra: A [Br-Vindolin-D-Cpa-D-Trp-Ser-D-Lys(Gly-Leu-Phe-Gly-Cys)-Asp-(Leu-GlnPro-D-Ala-NH2)-DEA]2 dimer analitikai HPLC-vel felvett kromatogramja: [Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2

Abszorbancia

1,6 1,4 1,2 1,0

3.

1.

0,8

2.

0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0

10

20

30

40

idõ t / perc

50

tR1 ([Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2) = 36,18 perc (nem beazonosított melléktermékek az MS készülék leterheltsége miatt) tR2 ([Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2) = 38,78 perc (nem beazonosított melléktermékek az MS készülék leterheltsége miatt) tR3 ([Br-Vindolin-MI-1892(Ac-CGFLG)]2) = 41,25 perc (várakozásaimnak megfelelően az MS is bizonyította, hogy a termék ebben a frakcióban van) 32. ábra: A tiszta frakció MS spektruma: 6+

[M+H]+: 4694

4+

A molekula várt tömege: [M+H]+: 4694,0 g/mol mért tömege: [M+H]+: 4694,0 g/mol 33.ábra: A Glp-His-Trp-Ser-His-Asp-Trp-Lys(Aoa-Gly-Phe-Leu-Gly-Cys)-Pro-Gly-NH2 molekula konjugálása daunorubicinhez: GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)

0,18

Abszorbancia

0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 -0,02 0

10

20

30

idõ t / perc

40

tR(GnRH-III(Dau=AoaGFLGC))=31,31 perc 34.ábra: GnRH-III(Dau=AoaGFLGC) konjugátum dimerizálása: 2,0

[GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)]2

1,8

Abszorbancia

1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 0

10

20

30

idõ t / perc

tR[GnRH-III(Dau=AoaGFLGC)]2=31,05 perc

40

50