Transdermální a dermální permeace acyklických nukleosidfosfonátů

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra anorganické a organické chemie

Transdermální a dermální permeace acyklických nukleosidfosfonátů (diplomová práce)

Hradec Králové, 2008

Martina Líbalová

1

PROHLÁŠENÍ O SAMOSTATNÉM VYPRACOVÁNÍ PRÁCE Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura, z níž jsem při zpracování čerpala, je uvedena v seznamu použité literatury a v práci řádně citována. Martina Líbalová V Hradci Králové 1. května 2008

2

OSNOVA ÚVOD A CÍL PRÁCE ............................................................................................ 5 TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................ 6 2.1. Transdermální podání léčiv ........................................................................... 6 2.2. Stavba kůže ...................................................................................................... 7 2.3. Stratum corneum jako kožní bariéra............................................................ 8 2.4. Permeační cesty léčiv kůží .............................................................................. 9 2.5. Faktory ovlivňující permeaci ....................................................................... 10 2.6. Optimalizace transdermálního podání léčiv............................................... 12 2.6.1. Výběr vhodného léčiva, či proléčiva ....................................................... 12 2.6.2. Úprava chemického potenciálu .............................................................. 12 2.6.3. Iontové páry a komplexní koacervace .................................................... 12 2.6.4. Eutektický systém .................................................................................... 12 2.6.5. Lipozómy a jiné vesikuly ......................................................................... 12 2.6.6. Modifikace stratum corneum .................................................................. 13 2.6.7. Fyzikální a elektrické metody ................................................................. 14 2.7. Acyklické nukleosidfosfonáty ...................................................................... 15 2.7.1. Mechanismus účinku ............................................................................... 16 2.7.2. Proléčiva ANP ........................................................................................ 17 2.7.3. Zástupci ANP .......................................................................................... 18 6 2.8. N -Cyklopropyl-9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin (N6-CyPrPMEDAP a jeho metabolit 9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]guanin (PMEG) ........... 20 3. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................ 24 3.1. Použité suroviny ............................................................................................ 24 3.2. Permeační pokusy ......................................................................................... 26 3.2.1. Příprava kůže .......................................................................................... 26 3.2.2. Akceptorová fáze ..................................................................................... 26 3.2.3. Donorové vzorky ..................................................................................... 27 3.2.4. Uspořádání permeačních pokusů ........................................................... 27 3.2.5. Stanovení koncentrace donorových vzorků v kůži .................................. 28 3.2.6. Stanovení účinnosti extrakce .................................................................. 28 3.2.7. Srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži ........................ 28 3.3. HPLC stanovení ............................................................................................ 29 3.3.1. Analytická metodika ................................................................................ 29 3.3.2. Příprava standardů pro kalibraci ........................................................... 30 3.3.3. Parametry kalibrační křivky ................................................................... 30 3.4. Vyhodnocení dat ........................................................................................... 32 4. VÝSLEDKY .......................................................................................................... 33 4.1. Permeační pokusy: ........................................................................................ 33 4.1.1. Srovnání transdermální permeace a dermální penetrace různých ANP: 33 4.1.2. Vliv pH a permeačního akcelerantu DDAK na permeaci a penetraci N6CyPr-PMEDAP ....................................................................................................... 36 4.1.3. Vliv koncentrace N6-CyPr-PMEDAP ..................................................... 40 4.2. Srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži: ........................ 44 5. DISKUSE ............................................................................................................... 45 6. ZÁVĚR .................................................................................................................. 48 7. POUŽITÉ ZKRATKY A SYMBOLY ................................................................ 49 8. LITERATURA ...................................................................................................... 51 1. 2.

3

ABSTRAKT .................................................................................................................. 54 ABSTRACT ................................................................................................................... 55

PODĚKOVÁNÍ Děkuji PharmDr. Kateřině Vávrové, Ph.D. za odborné vedení při vypracování mé diplomové práce, cenné rady a pomoc při psaní teoretické části a získávání a zpracování experimentálních výsledků.

4

1.

ÚVOD A CÍL PRÁCE Acyklické

nukleosidfosfonáty

(ANP)

jsou

nová

perspektivní

skupina

nukleotidových analog, úspěšně používaných k terapii virových infekcí. Účinně inhibují replikaci širokého spektra DNA virů a retrovirů. Některé sloučeniny mají navíc cytostatické, imunomodulační a antiparazitické vlastnosti. Mezi zástupce se silnou protinádorovou aktivitou patří nadějný N6-cyklopropyl-9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]2,6-diaminopurin (N6-CyPr-PMEDAP), který inhibuje růst řady nádorových buněčných linií. Transdermální podání léčiv nabízí oproti ostatním způsobům podání řadu výhod, které mohou vést ke zlepšení pacientovy compliance, zvýšení biodostupnosti léčivé látky a snížení některých nežádoucích účinků. Proto je tato aplikační cesta potenciálně výhodná i pro podání ANP. Při transdermálním podání léčiva penetrují do spodních vrstev kůže, kde dojde k jejich vstřebání kapilárami do systémové cirkulace. Vysoká polarita a hydrofilní charakter ANP omezuje jejich průnik přes biologické membrány, tedy i přes kůži. Flux ANP přes kůži však může být několikanásobně zvýšen při použití permeačního akcelerantu, který přechodně sníží bariérové vlastnosti kůže. Některé ANP včetně N6-CyPr-PMEDAP jsou také účinné při lokální léčbě různých nemocí kůže. Cílem diplomové práce bylo stanovit schopnost transdermální permeace a dermální penetrace vybraných ANP přes prasečí kůži in vitro ve Franzově difúzní cele. V první části jsem srovnávala řadu ANP, zda jejich průnik přes kůži a do kůže ovlivní rozdílná polarita rozpouštědel isopropyl-myristátu (IPM) a vody. Ve druhé části práce jsem studovala látku N6-CyPr-PMEDAP – jaký je vliv pH, koncentrace donorového vzorku a přítomnosti 1% permeačního akcelerantu dodecylesteru kyseliny 6dimethylaminokapronové (DDAK) na transdermální a dermální podání této látky.

5

2.

TEORETICKÁ ČÁST

2.1.

Transdermální podání léčiv Zájem o transdermální podání léčiv v posledních letech výrazně vzrostl

vzhledem k řadě výhod, které tato aplikační cesta nabízí. Jsou to například: 

Absorpce léčiv při transdermálním podání není ovlivněna interakcí s potravou, hodnotou pH a enzymatickou aktivitou v gastrointestinálním traktu.



Nedochází k first pass efektu (inaktivaci léčiv jaterními a trávícími enzymy).



Transdermální podání umožňuje aplikaci léčiv s nízkým terapeutickým indexem.



Účinek léčiva může být snadno a rychle přerušen.



Průběžné dávkování léčiva zajišťuje stabilní plazmatický profil i u léčiv s krátkým poločasem účinku a snižuje tak systematické nežádoucí účinky.



Snadná aplikace, neinvazivní charakter podání a snížená frekvence dávkování vedou ke zlepšení pacientovy compliance.1,2 První transdermální náplast se skopolaminem byla schválena v USA v roce

1979. Dnes existuje řada náplastí s léčivy jako klonidin, fentanyl, lidokain, nikotin, nitroglycerin, estradiol, oxybutinin, skopolamin a testosteron. Používají se také kombinované náplasti pro kontracepci nebo jako hormonální substituce.3 Nevýhodou je, že počet léčiv, které lze podat pomocí konvenčních náplastí je velmi omezen. Všechny látky v současnosti podávané transdermálně splňují následující tři charakteristiky: 

malá molekulová hmotnost (do 500 Da)



vyvážená lipofilita



malá terapeutická denní dávka (max 10 mg/den) daná omezenou velikostí náplasti.3 Další nevýhodou transdermálního podání léčiv je možnost kontaktní alergizace

po aplikaci transdermální náplasti. Okluzivní efekt může způsobit kožní podráždění a kůže se může stát prostředím pro množení mikrobů.2

6

2.2.

Stavba kůže Kůže je tvořena ze dvou odlišných vrstev (Obr. 1). Spodní vrstva kůže-dermis je

složená z fibroblastů a extracelulární hmoty tvořené kolagenem, elastinem a glykosoaminglykany. Je bohatě prokrvená. Obsahuje mazové a potní žlázy, vlasové folikuly a nervy. V dermis jsou dále kožní tukové buňky, žírné buňky a infilrující leukocyty.4 Vrchní vrstva kůže-epidermis je naproti tomu nevaskularizovaná. Je tvořená z 95% keratinocyty. Zbytek tvoří melanocyty, Langerhansovy buňky a Merkelovy buňky (mechanoreceptory). Epidermis, která je široká přibližně 100 až 150 μm se dělí do čtyř vrstev odlišených strukturálně i funkčně.4 Tyto vrstvy reprezentují různá diferenciační stadia buněk vzniklých ve stratum basale. Buňky migrují směrem ke kožnímu povrchu, oplošťují se a postupně v nich dochází ke snižování koncentrace kyslíku a živin, akumulaci lipidů a keratinu a zániku organel. Tento proces vedoucí k vytvoření kožní bariéry se nazývá keratinizace.5 Nejspodnější stratum basale je tvořeno jednou řadou cylindrických množících se buněk, připojených hemidesmozomy k bazální membráně, která odděluje epidermis od dermis.4 Stratum spinosum je tvořeno buňkami, které mají díky velkému počtu desmosomů trnitý vzhled. Oproti stratum basale se zde zvyšuje počet keratinových vláken a v cytoplazmě buněk se objevují organely zvané lamelární tělíska. Buňky epidermis nově vzniklé ve stratum basale a ve spodní vrstvě stratum spinosum postupují směrem k povrchu kůže za postupného oplošťování ve vyšších vrstvách stratum spinosum.4 Pro stratum granulosum je typický výskyt keratohyalinových granul. Postupná buněčná diferenciace je doprovázena zvýšenou lipogenezí (zvyšuje se počet lamelárních tělísek). V horních vrstvách stratum granulosum dochází k extruzi lipidového materiálu do mezibuněčného prostoru a k enzymaticky řízenému zesítění keratinu. Granulocyty se zde mění na mrtvé, zploštělé keratinizované buňky, korneocyty.4 Korneocyty (keratinocyty v konečné vývojové fázi) obklopené multilamelární lipidovou dvojvrstvou tvoří nejsvrchnější vrstvu epidermis nazvanou stratum corneum, která je zodpovědná za bariérovou funkci kůže. 4

7

Obrázek 1.

Stavba kůže

Stratum corneum jako kožní bariéra

2.3.

Struktura stratum corneum připomíná strukturu zdi. Korneocyty („cihly“) tvoří klikatou dráhu pro molekuly procházející přes stratum corneum, zatímco hydrofobní lipidy, organizované do těsné lamelární struktury („malta“), tvoří nepropustnou bariéru a stmelují jednotlivé korneocyty. Stratum corneum má v lidské kůži obvykle 18-21 vrstev. Jednotlivé korneocyty mají rozměr od 20 do 40 μm. Mohou se lišit svou tloušťkou, uspořádáním keratinových vláken, počtem desmosomů a stupněm hydratace (od 10 do 30% vázané vody), podle umístění ve stratum corneum a podle místa na těle.4 Složení mezibuněčných lipidů Mezibuněčné lipidy pochází z lamelárních tělísek. 

Asi z 50% jsou tyto lipidy tvořeny ceramidy. Podle struktury se ceramidy dělí do devíti heterogenních skupin. Obecně jsou kožní ceramidy složené z polární hlavičky a dvou hydrofobních řetězců. Tvoří hlavní a nejvýznamnější součást kožní bariéry a stabilizují multilamelární mezibuněčné uspořádání.



Cholesterol zaujímá asi 25% z celkových lipidů.



Volné mastné kyseliny, převážně nasycené, nerozvětvené s počtem uhlíků nad 18 tvoří kolem 10% celkových lipidů.



Zbytek

tvoří

v malém

množství 5

cholesterolu a cholesterol sulfát.

8

triglyceridy,

glykosfingolipidy,

estery

Lipidy mohou být ve stavu tekutého krystalu, směsi tekutého krystalu a gelové fáze, nebo samotné koherentní gelové fáze.4 Důvodem mimořádně nízké propustnosti stratum corneum oproti jiným biologickým membránám je: a) neobvyklá délka volných mastných kyselin a acylových řetězců v ceramidech b) relativně malé polární hlavy ceramidů (v porovnání s fosfolipidy), které umožňují těsnější spojení c) vysoká soudržnost ceramidů díky vodíkovým vazbám mezi polárními částmi d) uspořádání lipidů do multilamelární dvojvrstvy, která slouží jako primární bariérová funkce stratum corneum.5

2.4.

Permeační cesty léčiv kůží Permeant může procházet do svrchních vrstev dermis, kde dochází k absorpci do

systémového oběhu třemi různými způsoby (Obr. 2): přes vlasové folikuly spojené s mazovými žlázami, přes potní žlázy nebo přes stratum corneum. Kožní adnexa (mazové, potní žlázy a vlasové folikuly) však zaujímají pouze 0,1% z celkového povrchu kůže a permeace tímto způsobem je pro většinu látek zanedbatelná. Důležitá je zejména pro ionty, vysoce polární molekuly a látky s velkou molekulovou hmotností.6

Obrázek 2.

Permeační cesty přes kůži

1. Potní žlázou

2. Přímo přes stratum corneum

9

3. Vlasovým folikulem

Permeace látek přes intaktní stratum corneum je možná dvěma způsoby (Obr.3): 1) intracelulární (transcelulární) transport přes korneocyty 2) intercelulární transport přes mezibuněčné lipidy. V obou případech musí permeant v určité fázi vstoupit do mezibuněčného prostoru. Multilamelární lipidová dvojvrstva je hlavní faktor určující stupeň permeace látek přes kůži.7

Obrázek 3.

2.5.

Permeace přes stratum corneum

Faktory ovlivňující permeaci Faktory ovlivňující permeaci můžeme odvodit z Fickova prvního zákona.

Směrnice lineární části grafu závislosti kumulativního množství permeantu m, prošlého přes jednotku plochy membrány, na čase t, vyjadřuje flux (tok v ustáleném stavu) J. 6 Dle Fickova prvního zákona je J přímo úměrný difuznímu koeficientu D léčiva v membráně, rozpustnosti léčiva v membráně cs,m a koncentraci látky rozpuštěné ve

10

vehikulu cv. Naopak J klesá s rostoucí šířkou membrány L a rozpustností léčiva ve vehikulu cs,v. 7

J

D  cs , m cv  L cs , v

Zlepšení permeace léčiv přes stratum corneum může být podle Fickova zákona dosaženo: 

zvýšením difúzního koeficientu (D) rozrušením lipidů ve stratum corneum



zvýšením rozpustnosti permeantu v kůži (cs,m )



zvýšením nasycenosti vehikula léčivem (poměru cv/cs,v).

Stupeň nasycenosti může být zvýšen zvýšením koncentrace nebo snížením rozpustnosti léčiva ve vehikulu, což vede ke zvýšení termodynamické aktivity léčivé látky ve vehikulu a ke zvýšení permeačního procesu.7 Ideální fyzikálně-chemické vlastnosti molekuly penetrující přes kůži se dají vyčíst z následujícího vzorce:

J

dm D  Co  K  dt L

Co je konstantní koncentrace léčiva v donorovém vzorku K je rozdělovací koeficient rozpuštěné látky mezi membránou a roztokem Vlastnosti ideálního permeantu jsou: 

Nízká molekulová hmotnost, nejlépe pod 500 Da (látka má vysoký D).



Adekvátní rozpustnost ve vodě a v oleji, kdy membránový koncentrační gradient je vysoký, (Co je vysoký). Ideální jsou saturované roztoky, nebo suspenze s maximální termodynamickou aktivitou, které vykazují nejvyšší flux. Molekula s přiměřeně vysokým rozdělovacím koeficientem (K) má dobrou rozpustnost v mezibuněčných lipidech stratum corneum a zároveň je dostatečně hydrofilní, aby se dostala do živé části epidermis.



Nízká teplota tání korelující s dobrou rozpustností a stabilitou léčiva.6

11

2.6.

Optimalizace transdermálního podání léčiv

2.6.1. Výběr vhodného léčiva, či proléčiva Pokud molekula léčiva nemá vhodné fyzikálně-chemické vlastnosti (obvykle rozdělovací koeficient je příliš nízký), lze použít proléčivo. Proléčivo se zvýšenou rozpustností v tucích projde přes stratum corneum a po dosažení živé epidermis esterázy hydrolýzou aktivují proléčivo na látku s dobrou rozpustností ve vodné epidermis.6 2.6.2. Úprava chemického potenciálu Maximální penetrační stupeň je dosažen tehdy, pokud má léčivo nejvyšší možnou termodynamickou aktivitu, jako je tomu v případě supersaturovaného roztoku. Supersaturace, tedy nasycení až přesycení vehikula léčivem se dosáhne odpařením rozpouštědla z kožního povrchu, odnětím vody z kůže vehikulem nebo tvorbou kosolventního systému bezprostředně před aplikací.7 2.6.3. Iontové páry a komplexní koacervace Nabité molekuly pronikají do kůže nebo přes kůži špatně. Přidáním opačně nabitého iontu k nabitému léčivu vznikne lipofilní iontový pár. Ten difunduje do vodné, živé epidermis, kde dojde opět k disociaci na původní nabité léčivo, které difunduje dále.6 Komplexní koacervace je oddělení opačně nabitých iontů do olejové fáze, kde vzniknou iontové páry. Ty difundují přes stratum corneum a disociují v živých tkáních. Flux léčiva je zvýšen.6 2.6.4. Eutektický systém Teplota tání léčivého systému může být snížena vytvořením eutektické směsi: směsi dvou složek, které v určitém poměru inhibují vzájemnou krystalizaci. Díky tomu je teplota tání směsi nižší než teplota tání jednotlivých složek. Nižší teplota tání vede k vyšší rozpustnosti léčiva v rozpouštědle včetně kožních lipidů.8 2.6.5. Lipozómy a jiné vesikuly Lipozómy jsou koloidní částice, složené obyčejně z fosfolipidů a cholesterolu, které tvoří koncentrické bimolekulární vrstvy. V nich je enkapsulováno léčivo a dodáno do kůže. 12

Flux léčiv může být dále zvýšen enkapsulací léčiv do transferozomů, ethosomů nebo niosomů.6

2.6.6. Modifikace stratum corneum

1) Hydratace Hydratace stratum corneum zvyšuje penetrační stupeň většiny substancí. Voda naruší kompaktní strukturu stratum corneum a zvýší propustnost. Pro svou bezpečnost a účinnost je voda nejlepší permeační akcelerant. Hydratace může být zvýšena okluzí. Parafíny, oleje a vosky jako součásti mastí a emulzí voda v oleji brání transepidermálním ztrátám vody. Emulze typu olej ve vodě naopak vodu do epidermis dodávají.8 2) Chemické urychlovače penetrace Urychlovače penetrace, neboli permeační akceleranty usnadňují absorpci léčiv přes kůži tím, že přechodně sníží bariérovou funkci kůže. Ideální akcelerant by měl být netoxický, nedráždivý, nealergizující a farmakologicky inertní. Po odstranění z kůže by se bariérové vlastnosti měly rychle a úplně obnovit. Obecně lze akceleranty rozdělit na malá polární rozpouštědla (ethanol, propylenglykol, dimethylsulfoxid a ethylacetát) a na amfifilní sloučeniny (mastné kyseliny a alkoholy, Azon a další). 5 Akceleranty působí různými mechanismy účinku: 

Interakce s lipidy

Malé polární molekuly rozrušují vodíkové vazby mezi molekulami ceramidů. Amfifilní molekuly se včlení svou hydrofilní částí mezi polární hlavičky a hydrofobním řetězcem mezi hydrofobní řetězce lipidů ve stratum corneum. To vede k rozrušení lipidové dvojvrstvy, ztekucení lamel a ke snížení bariérových vlastností kůže. Některé akceleranty (kyselina olejová a terpeny) mohou ve vysokých koncentracích způsobit fázovou separaci v lamelách a vytvořit tak póry pro permeaci polárních molekul. Některá rozpouštědla a micelární roztoky mohou extrahovat lipidy a tím zvýšit propustnost vyšších vrstev. 5 

Interakce s proteinovými strukturami

Kromě interakce s lipidy ve stratum corneum mohou některé sloučeniny změnit konformaci keratinu v korneocytech nebo proteinů v desmozomech.8 

Zvýšení rozpustnosti ve stratum corneum 13

Řada rozpouštědel zvyšuje rozdělování permeantu do stratum corneum a rozpustnost permeantu v kůži.8 2.6.7. Fyzikální a elektrické metody Mezi elektrické metody usnadňující permeaci léčiv přes kůži patří: a) Iontoforéza (podání nabitých molekul do kůže pomocí procházejícího elektrického proudu). b) Sonoforéza (kavitace způsobená nízkofrekvenční ultrazvukovou energií, která zvyšuje fluiditu lipidů). c) Elektroporace (aplikace krátkých mikro- až mili- sekundových elektrických impulzů vede v lipidové dvojvrstvě ke vzniku přechodných pórů naplněných vodou. d) Fotomechanické vlnění (laserem vytvořené tlakové vlnění způsobuje přechodné zvýšení permeability stratum corneum). 8 Dále se používají metody k překonání nebo odstranění stratum corneum, jako jsou: a) Mikrojehly (zařízení obsahující 400 plných nebo dutých silikonových jehel dlouhých asi 150 μm, které penetrují přes stratum corneum. b) Tryskem poháněné částice (vysokorychlostní proud stlačeného plynu, nesoucího částice léčiva). c) Odstranění stratum corneum (pomocí laseru, adhezivní páskou nebo chemicky).8

14

2.7.

Acyklické nukleosidfosfonáty Analoga nukleosidů tvoří významnou skupinu léčiv působících jako antivirotika

nebo cytostatika. V buňkách jsou fosforylovány na monofosfáty (nukleotidy), které jsou následně přeměněny na aktivní antimetabolity (trifosfáty). Modifikované nukleotidy jako takové přímo terapeuticky použít nelze, protože jsou během membránového transportu, v buňkách i v krevním řečišti rychle enzymaticky defosforylovány. Enzymatická stabilita esterové vazby v molekule nukleotidu může být dosažena pouze změnou povahy této vazby. Důležitou podmínkou je zachování stejné disociovatelnosti, jako mají přirozené nukleotidy (princip izopolarity) a přítomnost atomu kyslíku v okolí vazby atomu fosforu. 9 Tyto podmínky splňují O-fosfonomethylethery nukleosidů, neboli acyklické nukleosidfosfonáty (ANP). Na ekvivalentu sacharidu, místo esterově vázaného fosfátu, etherovou vazbou poutají fosfonomethylovou skupinu (Obr.4). Etherová vazba je chemicky stabilní a in vivo není enzymaticky hydrolyzována. Tato nová perspektivní skupina nukleotidových analog má různorodé biologické (antivirové, cytostatické, antiparazitické a imunomodulační) účinky.9 NH2

NH 2 N

N

O HO P O

N O

N

N

N N

N

OH

O OH

Adenosinmonofosfát

Obrázek 4.

P(O)(OH)2

OH Adefovir

Srovnání nukleosidmonofosfátu (adenosinmonofosfát) a ANP (adefovir).

Aktivita ANP je limitována na N9 izomery adeninu, guaninu a 2,6diaminopurinu. U pyrimidinové řady jsou účinné pouze deriváty cytosinu. 9

15

2.7.1. Mechanismus účinku ANP jsou v buňkách fosforylovány buněčnou nukleosidkinázou na monofosfát (ANPp) a následně na difosfát (ANPpp), analog deoxynukleosidtrifosfátu (dNTP), který interferuje s polymerázami při syntéze nukleové kyseliny de novo. Jejich inkorporace do rostoucího řetězce DNA vede k jeho předčasnému ukončení. 9 Antivirový účinek Na rozdíl od acyklických nukleosidových analog (acyklovir, pencyklovir, gancyklovir atd.) ANP v buňkách podléhají pouze dvěma (místo tří) fosforylačním krokům, za účelem dosažení aktivního metabolického stavu. (Obr.5) ANP tak nejsou závislé na virové tymidin kináze (pro herpes simplex virus a varicella zooster virus) nebo protein kináze (pro cytomegalovirus), které zajišťují první, nejdůležitější fosforylační krok u acyklických nukleosidových analog. Díky tomu ANP působí proti širokému spektru DNA virů a retrovirů, včetně virů, které jsou díky mutaci nebo nepřítomnosti těchto virových kináz rezistentní k acyklickým nukleosidovým analogům. ANP působí proti hepadnavirům (virus hepatitidy B), retrovirům (virus HIV) herpesvirům (herpes simplex virus typ 1 a typ 2, varicella zooster virus, virus Epsteina a Baarové), papillomavirům a adenovirům. Tedy všem virům, které ke své replikaci využívají DNA polymerázu (nebo reverzní transkriptázu), díky které aktivní metabolity ANP kompetují s normálními substráty (dNTP). Selektivní antivirový účinek je důsledkem vyšší afinity k virem indukované DNA polymeráze než k buněčné DNA polymeráze α, β, γ, δ a ε. 10

16

Obrázek 5.

Buněčný

metabolismus

acyklických

nukleosidových

fosforylační kroky) a ANP (pouze dva fosforylační kroky). Symboly:

analog

(tři

fosfát;

fosfonát Inhibice buněčné eukaryotické DNA polymerázy α, β, γ, δ a ε je podstatou cytostatickéko účinku některých nukleosidových analog.9 Bylo zjištěno, že některé ANP mají kromě antimetabolického mechanismu účinku také imunostimulační a imunomodulační vlastnosti, které ovlivňují replikaci virů. Obrana proti virovým infekcím je v lidském organismu zprostředkována nespecifickou buněčnou imunitou, zajišťovanou převážně NK buňkami a makrofágy. Role imunokompetentních buněk u vrozené i získané imunity je zprostředkována řadou cytotoxických a imunomodulačních cytokinů. ANP stimulují sekreci různých cytokinů (IL-10, IFN-γ a TNF-α), chemokinů a interferonem indukovanou produkci virostatické molekuly oxidu dusnatého. Tyto faktory hrají hlavní roli v hostitelské obraně proti virům. 11 2.7.2. Proléčiva ANP Biologický efekt ANP závisí na jejich transportu přes buněčné membrány. Vysoká polarita a hydrofilní charakter ANP omezuje jejich resorpci ze žaludku a střeva a tím vylučuje možnost perorálního podání. Z tohoto důvodu se používají jejich

17

neutrální diestery se sníženou polaritou, které se lépe resorbují, mají zachovalou biologickou stabilitu a v cílových buňkách jsou degradovány na volný fosfonát. 9 2.7.3. Zástupci ANP

(S)-9-[3-Hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]cytosin ((S)-HPMPC) (Obr.6) (S)-HPMPC (Cidofovir) má široké spektrum účinku proti všem DNA virům. Je schváleno jeho parenterální podání při cytomegalové retinitidě u pacientů s AIDS (VistideTM). Podává se intravenózně jednou týdně nebo jednou za dva týdny díky výhodnému poločasu účinku. Hlavní nežádoucí účinek, nefrotoxicitu, lze minimalizovat současným podáváním probenicidu a intravenózní hydratací. Dále se používá jak celkově, tak lokálně v terapii acyklovir- a foscarnet-rezistentních herpesvirových infekcí,

u nazofaryngeálního karcinomu a

účikuje i

proti

papillomavirům,

polyomavirům a adenovirům.10 Cidofovir je v současnosti lékem volby proti orthopoxvirům (virus varioly-pravých neštovic a opičí poxviry), které představují velkou hrozbu v případě zneužití formou bioteroristického útoku. Výhodné se v tomto případě zdá být podání ve formě aerosolu, kdy se uplatňuje jak profylaktický, tak terapeutický účinek cidofoviru na plicní buňky.12

9-[2-(Fosfonomethoxy)ethyl]adenin (PMEA) (Obr.6) PMEA (Adefovir) je účinný proti DNA virům (hepadnaviry, herpesviry) a retrovirům. Kromě antivirového účinku má i cytostatické vlastnosti. Původně byl určen ve vyšších dávkách k terapii HIV infekcí, ale byl stažen kvůli nefrotoxicitě, která se objevila jako nežádoucí účinek limitující aplikovanou dávku. Adefovir se kumuluje v proximálních tubulech ledvin a ve vysoké dávce způsobuje jejich poškození. Od roku 2002 se používá orální proléčivo adefovir dipivoxil (HepseraTM) k léčení chronické hepatitidy B u dospělých pacientů pozitivních i negativních na hepatitida B e antigen a u dospělých pacientů s klinicky prokázanou rezistencí na Lamivudin. Lék je též účinný u HBV/HIV koinfekcí a u pacientů po transplantaci jater s hepatitidou B. Při dávkování 10mg jednou denně dochází ke klinickému zlepšení bez vážných vedlejších účinků, či vzniku rezistence. Adefovir má také imunomodulační efekt. Zvyšuje aktivitu NK buněk a indukuje tvorbu IFNγ .9,13

18

(R)-9-[2-(Fosfonomethoxy)propyl]adenin ((R)-PMPA) (Obr.6) Spektrum účinku (R)-PMPA (tenofoviru) je namířeno proti retrovirům a hepadnavirům. Působí jako inhibitor reverzní transkriptázy. Jeho proléčivo tenofovir disoproxil fumarát (VireadTM) se od roku 2001 používá pro léčení pacientů s AIDS v dávce 300 mg jednou denně. Účinek PMP-derivátů je specifický pro (R) enantiomery.9,10

(S)-9-[3-Hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]adenin ((S)-HPMPA) (Obr.6) (S)-HPMPA je aktivní proti všem DNA virům. Inhibuje herpesviry a má vysokou účinnost proti adenovirům. Navíc má ojedinělý antiprotozoální účinek. Společně se svým 3-deaza analogem inhibuje růst Plazmodium falciparum a Plazmodium bughei. s (S)-9-[3-Hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]-2,6-diaminopurinem

Společně

((S)-

HPMPDAP) také účinkuje proti parazitu Trypanosoma spp.9

9-[2-(Fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin (PMEDAP) (Obr.6) PMEDAP je širokospektrá antivirová látka s výrazným účinkem proti DNA virům. Silně inhibuje replikaci viru HIV. Kromě toho má výrazné cytostatické účinky.9 NH2

NH2

NH2

N

N

N

N

O

N

N

N

N

N

N

CH3

OH

PMEA

(S)-HPMPC NH2

(R)-PMPA

NH2 N

N

P(O)(OH)2

P(O)(OH)2

P(O)(OH)2

N

O

O

O

N

N

N

OH

H2N

NH2

N

N

OH

O P(O)(OH)2

Obrázek 6.

H2N

O

(S)-HPMPA

N

N N

N

O P(O)(OH)2

(S)-HPMPDAP

Zástupci ANP

19

P(O)(OH)2 PMEDAP

N6-Cyklopropyl-9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin

2.8.

(N6-CyPr-

PMEDAP a jeho metabolit 9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]guanin (PMEG) N6–substituované deriváty PMEDAP jsou látky s výraznou cytostatickou a antivirovou aktivitou.9 Nejslibnější sloučenina této řady N6-CyPr PMEDAP má silné antiproliferativní účinky na široké rozmezí nádorových buněčných linií.14 Jeho cytostatická aktivita je 8-20 násobně více vyjádřena než u 2,6-diaminopurinového analoga PMEDAP a rovnocenná guaninovému derivátu PMEG.15 Metabolismus těchto tří látek byl zkoumán na buněčné linii lidského karcinomu pankreatu BxPC-3. Bylo zjištěno, že N6-CyPr PMEDAP je v buňkách deaminován na PMEG a následně fosforylován buněčnými kinázami na monofosfát (PMEGp) a difosfát (PMEGpp). Množství PMEGpp získané z buněk léčených N6-CyPr PMEDAP bylo o 50 % vyšší než množství získané z buněk inkubovaných s PMEG. Naopak PMEDAP nebyl deaminován, ale přímo fosforylován na PMEDAPp a PMEDAPpp. Bylo tedy potvrzeno že N6-CyPr PMEDAP působí jako proléčivo PMEG a že konverze je nutná pro jeho antiproliferativní účinek.14 Následně bylo zjištěno že za přeměnu N6-CyPr PMEDAP na biologicky aktivní guaninový derivát je zodpovědný buněčný enzym N6-methyl-AMP-aminohydroláza (Obr.7). Tento enzym je vysoce specifický pro 5’fosfáty a jejich strukturální analogaANP a k přítomnosti alifatického substituentu v poloze N6 purinového základu. Působí jako 6-(N-substituovaný amino)purin 5‘-nukleotid aminohydroláza. Je inhibován deoxycoformycin 5‘-fosfátem.16

O

NH N

N H2N

N

N6-methyl-AMP-aminohydroláza

H2N

N

N

HN N

O

O

P(O)(OH)2

P(O)(OH)2 N6-CyPr PMEDAP

Obrázek 7.

N

PMEG 6

Přeměna N -CyPr PMEDAP na PMEG

20

PMEG má oproti ostatním ANP mnohem silněji vyjádřenou cytostatickou aktivitu. Inhibuje růst širokého spektra nádorových buněčných linií. Blokuje buňky v Sfázi buněčného cyklu a tím indukuje jejich apoptózu. Ve formě difosfátu působí jako kompetitivní inhibitor inkorporace deoxyguanosintrifosfátu. Replikační enzymy DNA polymeráza α, δ a ε rozeznávají PMEGpp jako substrát, který inkorporují do DNA. Díky nedostatku 3‘ hydroxylové skupiny, která je nutná pro další prodloužení řetězce DNA, funguje PMEG jako absolutní terminátor řetězce při replikaci DNA.14 PMEG má z ANP nejvyšší afinitu k lidské DNA polymeráze a proto nejsilněji inhibuje buněčnou proliferaci.15 Z difosfátů ANP PMEGpp nejúčinněji inhibuje lidskou telomerázu z leukemických HL-60 buněk. Telomeráza je enzym zodpovědný za dosyntetizování opakujících se sekvencí (telomer) na konci chromozomů. Kompenzuje tak telomerové ztráty, které doprovázejí chromozomální replikaci a buněčné dělení. Telomeráza je neregulovaná u téměř 90% ze všech malignit a zdá se být slibným tumor-specifickým markrem a zároveň cílem pro protinádorovou léčbu. Inhibiční potenciál PMEGpp vůči telomeráze odpovídá schopnosti PMEG indukovat apoptózu a jeho silné cytostatické účinnosti a protinádorové aktivitě.17 U buněk lidské leukémie PMEG v nízkých koncentracích reverzibilně inhibuje růst (dochází k plynulé opravě poškozené DNA), zatímco ve vyšších koncentracích indukuje apoptózu u nenávratně poškozených buněk.18 PMEG byl účinný in vivo proti modelu intraperitoneální P388 leukemie u myší. Optimální terapie PMEG prodloužila délku života a zabránila růstu nádoru u myší se subkutánně implantovaným B16 melanomem.19 PMEG také in vitro inhibuje virus spalniček, virus parainfluenzy 3 a herpes simplex virus 1 a 2 9 a potlačil růst papillomavirem indukovaného kondylomu na štěpu lidské předkožky u myší.20 PMEG a N6-cykloalkylderiváty PMEDAP mají také imunomodulační účinek. PMEG stimuluje sekreci TNFα a IL-10 a zvyšuje produkci oxidu dusnatého vytvořeného exogenním interferonem γ.9 11 Cytostatická aktivita N6-substituovaných derivátů PMEDAP byla testována in vitro na různých buněčných liniích. N6-CyPr PMEDAP patří mezi nejsilnější inhibitory růstu buněk myší leukémie L1210 a L929, buněk lidské rakoviny čípku HeLa S3 a buněčné linie lidského T-lymfoblastu CCRF-CEM.21 Působí také cytostaticky na 21

standardní a PMEA/PMEDAP-rezistentní typ buněk lidské erytroleukemie K562 a na lidské lymfoidní MOLT4/C8, Raji a CEM buněčné linie. N6-CyPr PMEDAP je induktor diferenciace buněk K562 a buněk potkaního choriokarcinomu RCHO.15 U potkanů s choriokarcinomovým ložiskem bylo při léčbě N6-CyPr PMEDAP v denní dávce 10 mg dosaženo kompletního zastavení nádorového bujení. Účinek přetrvával ještě dva týdny po skončení léčby. Při porovnání maximálně tolerovaných dávek byl N6-CyPr PMEDAP účinnější než PMEG a PMEDAP.22 Protinádorová aktivita N6-substituovaných derivátů PMEDAP byla zkoumána in vivo na modelu hematologické malignity T-buněčného lymfomu u inbredních SpragueDawley potkanů. N6-substituované deriváty PMEDAP byly méně účinné nebo prokázaly stejný antineoplastický efekt jako PMEDAP. N6-CyPr PMEDAP významně snížil přežití potkanů s lymfomem vzhledem k vysoké toxicitě, která byla přibližně shodná jako u PMEG. Proto se ANP substituované v poloze 6 2,6-diaminopurinového cyklu nezdají být vhodnými léčivy pro léčbu těchto hematologických malignit.23 Aktivita ANP proti papillomavirům byla testována in vivo na králících s papillomem indukovaným králičím papillomavirem. Cidofovir při podání 1% roztoku do postiženého místa nebo topické aplikaci způsobil úplné vyléčení papillomů. Systematické podání cidofoviru bylo méně účinné. PMEG prokázal také silnou protivirovou aktivitu, ale systémová i místní toxicita byla velmi závážná a vyloučila tuto sloučeninu z klinického zkoušení proti papillomavirovým infekcím. N6-CyPr PMEDAP měl in vivo pouze mírný efekt proti papillomavirům.24 N6-CyPr PMEDAP (stejně jako ostatní fosfonomethoxyethyl deriváty ANP) neprokázal schopnost inhibovat růst viru vakcinie na epiteliální buněčné monovrstvě.25 V jiné studii byl N6-CyPr PMEDAP ve tkáňové kultuře buněk účinný proti viru vakcinie ale méně působil proti viru kravských neštovic.12 Aktivita N6-CyPr PMEDAP proti viru orf, členu rodu parapoxvirů, který způsobuje nakažlivou postulární dermatitidu koz, ovcí a lidí, na buněčné monovrstvě byla minimální.26 Genotoxické vlastnosti projevující se jako získané chromozomové aberace a indukce apoptózy po léčbě PMEG a N6-CyPr PMEDAP byly zkoumány in vitro na 22

CCRF-CEM, HeLa S3, MRC-S a Reh buněčných liniích. Obě látky prokázaly vysoký genotoxický a cytostatický potenciál. Potlačují dělení buněk a indukují u nich apoptózu. Převládající vliv N6-CyPr PMEDAP na vývoj plodu je embryoletální.27 PMEG ve formě difosfátu silně inhibuje purinovou nukleosidfosforylasu, což může vysvětlit vysokou toxicitu guaninových derivátů v důsledku kumulace toxických purinových nukleotidů.21 Genotoxicita PMEG je srovnatelná s genotoxicitou mitomycinu C. 28 N6-CyPr PMEDAP je od 17.4.2003 patentován firmou REED & EBERLE LLP (patent.č. US20030072814), jako látka k topické aplikaci, společně s transdermálním akcelerantem (bazí, která upraví pH systému na hodnotu 8-13, lépe 8-11,5 a nejlépe 8,510,5) pro léčbu infekcí způsobených lidským papillomavirem, zejména kožních bradavic. Dále je N6-CyPr-PMEDAP od 9.2.2006 patentován firmou GILEAD SCIENCES (patent č. US20060030545) jeko antiproliferativní sloučenina použitelná zejména proti lidskému papillomaviru. Od 2.3.2006 jsou amidy N6-CyPr-PMEDAP patentovány firmou GILEAD SCIENCES (patent č. US20060046981) jako sloučeniny účinné proti nonmelanomové rakovině kůže. Inhibují abnormální buněčnou proliferaci karcinomových buněčných linií, které nejsou transformovány lidským papillomavirem.

23

3.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1.

Použité suroviny

NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4 a NaCl byly zakoupeny od firmy LachNer (Neratovice, ČR). Azid sodný, tetrabutylamonium-hydrogensulfát a acetonitril vysokoúčinnou

pro

kapalinovou

chromatografii

(HPLC)

od

Sigma-Aldrich

(Schnelldorf, Německo), isopropyl-myristát (IPM) od Kulich (Hradec Králové, ČR) a dodecylester kyseliny 6-dimethylaminokapronové (DDAK) byl připraven na KAOCH (Hradec Králové, ČR) Ultračistá voda pro HPLC byla vyrobena systémem Milli-Q-Water Filtration (Millipore, Bedford, MA) Studované látky : 

9-[2-(Fosfonomethoxy)ethyl]adenin (PMEA) NH2 N

N N

N

O P(O)(OH)2



9-[2-(Fosfonomethoxy)ethyl]guanin (PMEG) O N

HN H2N

N

N

O P(O)(OH)2

24



N6-Cyklopropyl-9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin (N6-CyPr-PMEDAP)

NH N

N

N

N

H2N

O P(O)(OH)2



(S)-9-[3-Hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]adenin ((S)-HPMPA) NH2 N

N

N

N

OH O P(O)(OH)2



(S)-9-[3-Hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]-2,6-diaminopurin ((S)-HPMPDAP) NH2 N

N H2N

N

N

OH O P(O)(OH)2

25



(S)-N6-Cyklopropyl-9-[3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]-2,6-diaminopurin ((S)-N6-CyPr-HPMPDAP)

NH N

N H2N

N

N

OH O P(O)(OH)2

Studované látky byly laskavě poskytnuty prof. A. Holým (Ústav organické chemie a biochemie, Akademie věd, Praha,ČR)

3.2.

Permeační pokusy

3.2.1. Příprava kůže Ke studiu permeací byla použita prasečí kůže (Zemko, k.s., Česká Skalice). Kůže plné tloušťky byla odpreparována pomocí skalpelu z dorzální strany ucha, chlupy byly odstraněny zastřihovačem a kůže byla na 5 minut ponořena do 0,05% konzervačního

roztoku

azidu

sodného.

Jednotlivé

kůže

byly

uchovávány

v evakuovaných polyethylenových sáčcích při –20°C, maximálně po dobu dvou měsíců. 3.2.2. Akceptorová fáze Jako akceptorová fáze byl použit izotonizovaný fosfátový pufr pH 7.4 (PBS) s 0,03 % azidem sodným. Zásobní roztok pufru byl připraven rozpuštěním 2,1 g NaH2PO4 v 500 ml vody pro HPLC a 19,1 g Na2HPO4 ve 400 ml vody pro HPLC. Asi 300 ml roztoku Na2HPO4 bylo přidáno k 500 ml NaH2PO4 a pH bylo upravena na hodnotu 7,4 přidáním potřebného množství roztoku Na2HPO4. Pufr byl izotonizován přidáním 4,4 g NaCl na litr roztoku a konzervován azidem sodným o koncentraci 0,3 g/l.

26

Hodnota pH byla měřena digitálním pH metrem s mikroelektrodou HC 153 (Fischer Scientific, Pardubice, ČR.) 3.2.3. Donorové vzorky Pokus č.1: 1% (w/v) donorové vzorky testovaných látek byly připraveny rozpuštěním (rozsuspendováním) příslušného množství studované látky v IPM a ve vodě. Poté byly zhomogenizované roztoky vzorků uloženy 48 hod v termostatu při teplotě 37°C. Těsně před aplikací na kůži byly suspenzní vzorky zhomogenizovány pomocí třepačky. Pokus č.2: Donorové 1% vzorky N6-CyPr-PMEDAP byly připraveny rozpuštěním příslušného množství látky, případně s 1% akcelerantu DDAK ve 100mM fosfátovém pufru a pH jednotlivých vzorků bylo upraveno na hodnotu 3; 4; 5; 6; 7; a 8 pomocí roztoku NaOH a H3PO4. Poté byly zhomogenizované roztoky vzorků uloženy 48 hod v termostatu při teplotě 37°C. Těsně před aplikací na kůži byly suspenzní vzorky zhomogenizovány pomocí třepačky Pokus č.3: 2; 3; a 5 % roztok N6-CyPr-PMEDAP byl připraven rozpuštěním příslušného množství látky, případně s 1% akcelerantu DDAK ve 100mM fosfátovém pufru a pH jednotlivých vzorků bylo upraveno na hodnotu 6. 1% roztoky N6-CyPr-PMEDAP byly připraveny rozpuštěním příslušného množství látky, případně s 1% akcelerantu DDAK ve 100mM fosfátovém pufru a pH jednotlivých vzorků bylo upraveno na hodnotu 4; 5; 6 a 7. Poté byly zhomogenizované roztoky vzorků uloženy 48 hod v termostatu při teplotě 37°C. Těsně před aplikací na kůži byly suspenzní vzorky zhomogenizovány pomocí třepačky 3.2.4. Uspořádání permeačních pokusů

27

K in vitro měření permeací přes kůži byly použity Franzovy difuzní cely. Kůže byly rozmraženy těsně před použitím a nařezány na kousky o velikosti přibližně 2 x 2 cm. Následně byly nasazeny do cel, dermální částí dolů a fixovány pomocí silikonového tuku. Otvor o velikosti 1 cm2 představoval difuzní plochu. Akceptorová část cel byla naplněna přibližně 18 ml PBS, přesný objem byl změřen pro každou celu a zahrnut do výpočtu. Cely byly temperovány na teplotu 32°C ve vodní lázni po dobu 30 min. Poté byly naneseny na povrch kůže donorové vzorky v objemu 150 l a donorový oddíl byl uzavřen krycím sklíčkem. Akceptorová fáze byla po celou dobu pokusu míchána magnetickým míchadlem a cely byly umístěny ve vodní lázni se stálou teplotou 32°C, zajištěnou termostatem. Vzorky akceptorové fáze byly odebírány v množství 600 l v časových intervalech po 16; 20; 24; 28; 40; 44 a 48 hodinách a analyzovány pomocí HPLC. Úbytek akceptorové fáze byl nahrazen stejným objemem PBS. 3.2.5. Stanovení koncentrace donorových vzorků v kůži Na konci permeačního pokusu, po 48 hodinách byly difuzní cely rozebrány a kožní povrch byl opláchnut v PBS k odstranění zbytku donorových vzorků na povrchu. 1 cm2 z kůže vystavený donorovému vzorku byl vyseknout, osušen, přesně zvážen, umístěn do vialky a extrahován 5 ml PBS při 32°C na vodní lázni po dobu 48 hodin, za stálého míchání. Po přefiltrování extraktu přes vatu byla koncentrace donorových vzorků extrahovaných z kůže měřena pomocí HPLC. 3.2.6. Stanovení účinnosti extrakce Účinnost extrakce N6-CyPr-PMEDAP z kůže byla stanovena nanesením známého množství 1% roztoku N6-CyPr-PMEDAP v PBS (50 a 10 l) na povrch kůže o velikosti 1 cm2, umístěný ve vialce. Kousek kůže byl pak 48 hodin umístěn v termostatu při 32 °C, aby mohl roztok proniknout do hlubších vrstev kůže. Extrakce N6-CyPrPMEDAP z kůže byla provedena stejným způsobem jako v předchozím odstavci. Pokus byl proveden třikrát a porovnán s kontrolním vzorkem upraveným stejným způsobem, pouze bez přítomnosti kůže. 3.2.7. Srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži

28

Pokus č.1: Z čerstvě rozmražené kůže byly pomocí skalpelu nařezány kousky (36) o hmotnosti přibližně 100 mg. Roztok N6-CyPr-PMEDAP o koncentraci 200 µg/ml byl připraven rozpuštěním příslušného množství látky v PBS pH 7,4 bez azidu sodného. 2krát 500 l tohoto roztoku bylo ve vialce ihned (čas 0) smícháno s 500 l acetonitrilu a zmraženo. Zbytek roztoku N6-CyPr-PMEDAP byl po 500 l rozdělen do 3-krát 8 vialek s kousky kůže a do 2-krát 8 vialek bez přítomnosti kůže. Do dalších 8 vialek byly vloženy kousky kůže s 500 l PBS bez azidu. Všechny vzorky byly míchány při 32°C na vodní lázni. V časech 0; 15; 30 min, 1; 2; 4; 8; 24 a 48 hodin byly vždy 3 vzorky roztoku N6-CyPr-PMEDAP s kůží, 2 vzorky roztoku N6-CyPr-PMEDAP bez kůže a 1 vzorek PBS s kůží vyjmuty z vodní lázně a přidáním 500 l acetonitrilu byly případné enzymatické reakce zastaveny. Vzorky obsahující kůže byly zfiltrovány a všechny vzorky byly zmraženy a nebo ihned analyzovány pomocí HPLC při 4 °C. Pokus č. 2, 3 a 4: Z čerstvě rozmražené kůže byly pomocí skalpelu nařezány kousky přibližně stejné velikosti. Roztok N6-CyPr-PMEDAP o koncentraci 20 µg/ml byl připraven rozpuštěním příslušného množství látky v PBS pH 7,4 bez azidu sodného. 3-krát 1ml tohoto roztoku byl odebrán do vialek (čas 0) a zmražen. 30 ml (respektive 3-krát 10 ml u pokusu 3a 4) roztoku N6-CyPr-PMEDAP a 30 ml (respektive 3-krát 10 ml u pokusu 3a 4) tohoto roztoku s 24 kousky kůže bylo za stálého míchání inkubováno ve vodní lázni při teplotě 32 °C. V časech 0; 0,5; 1; 2; 4; 8; 24 a 48 hodin byl odebrán vždy 3krát 1 ml vzorku, zfiltrován a stanoven pomocí HPLC při 4 °C. Zároveň byly odebrány vždy 3 kousky kůže, osušeny, zváženy a extrahovány 5 ml PBS bez azidu po dobu 2 dní. Extrakty z kůže byly poté zfiltrovány a hodnoceny metodou HPLC.

3.3.

HPLC stanovení

3.3.1. Analytická metodika Pro určení množství donorového vzorku v akceptorové fázi a jeho koncentraci v kůži a pro stanovení koncentrace N6-CyPr-PMEDAP a rozkladných produktů v kůži a pufru byla použita metoda HPLC. Vzorky byly analyzovány systémem skládajícím se z

29

vysokotlakého čerpadla Shimadzu LC-20AD, autosampleru Shimadzu SIL-20-AC (Kyoto, Japonsko), UV detektoru LCD 2083 (Ecom, Praha, ČR) a integračního software CSW v. 1.7 pro Windows (Data Apex, Praha, ČR). 3.3.2. Příprava standardů pro kalibraci Kalibrační standardy byly připraveny rozpuštěním příslušné látky v PBS na roztok o koncentraci 20mg/100 ml a byly uchovávány stejným způsobem jako donorové vzorky. Před vlastním měřením byly standardní roztoky naředěny pufrem na koncentrace 10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1 a 0,05 mg/100 ml. Standard o koncentraci 0,01 mg/100 ml byl připraven naředěním extraktem z kůže. Srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži: Kalibrační standardy byly připraveny naředěním roztoků N6-CyPr-PMEDAP v PBS o koncentracích 10, 1 a 0,1 mg/100 ml na koncentrace 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1 a 0,01 mg/100 ml vždy s přidáním 500 l acetonitrilu u pokusu č.1. 3.3.3. Parametry kalibrační křivky Kalibrační roztoky byly nastříknuty na kolonu a odezva detektoru byla odečtena jako plocha pod píkem. Ze získaných dat byly sestrojeny kalibrační křivky, jejichž parametry byly stanoveny metodou lineární regrese. Hodnota x odpovídá koncentraci analyzované látky, hodnota y představuje plochu pod píkem, r2 je korelační koeficient. Metoda 1 (pokus č. 1 a 2): Stacionární fázi představovala náplň Lichrospher RP-18 o velikosti částic 5 m v koloně LichroCART (Merck) o průměru 4 mm a délce 250 mm. Mobilní fáze protékala kolonou rychlostí 1,5 ml/min. Na kolonu bylo nastříknuto vždy 50 l vzorku a detekce byla prováděna při vlnové délce 260 nm.

Kalibrace :

30

PMEA

y = 2541,9x

r2 = 0,9998

PMEG

y = 1787,3x

r2 = 1,0000

N6-CyPr-PMEDAP

y = 1203,5x

r2 = 0,9996

(S)-HPMPA

y = 2524,3x

r2 = 0,9998

(S)-HPMPDAP

y = 1255,3x

r2 = 0,9998

(S)-N6-CyPr-HPMPDAP

y = 1068,1x

r2 = 0,9978

Mobilní fáze se skládala z roztoku 10 mM KH2PO4 a 2 mM tetrabutylamoniumhydrogensulfátu o pH 6. Se 7% acetonitrilu pro látky PMEA, (S)-HPMPA a (S)HPMPDAP a s 10% acetonitrilu pro látky N6-CyPr-PMEDAP, (S)-N6-CyPr-HPMPDAP a PMEG. Mobilní fáze byla připravena rozpuštěním 2,72g KH2PO4 a 1,36 g tetrabutylamonium-hydrogensulfátu ve 2 l vody pro HPLC. pH roztoku bylo upraveno na hodnotu 6 pomocí roztoku NaOH, roztok byl přefiltrován za sníženého tlaku přes filtr 0,22 µm a smíchán s daným objemem acetonitrilu, důkladně zhomogenizován a odplyněn na ultrazvukové lázni. Metoda 2 (pokus č.3): Stacionární fázi představovala náplň Purospher STAR RP-8 o velikosti částic 5 m v koloně LichroCART (Merck) o průměru 4 mm a délce 125 mm. Mobilní fáze protékala kolonou rychlostí 2 ml/min. Na kolonu bylo nastříknuto vždy 20 l vzorku a detekce byla prováděna při vlnové délce 260 nm.

Kalibrace: N6-CyPr-PMEDAP

y = 354,14x

r2 = 0,9995

Mobilní fáze se skládala z roztoku 10 mM KH2PO4 a 2 mM tetrabutylamoniumhydrogensulfátu o pH 6 se 6,5 % acetonitrilu. Metoda 3 (srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži):

31

V tomto pokusu byla použita monolitická kolona Chromolith Performance o průměru 4 mm a délce 100 mm a předkolona o průměru 4,6 mm a délce 10 mm. Mobilní fáze protékala kolonou rychlostí 2 ml/min. U vzorků ředěných acetonitrilem bylo na kolonu nastříknuto 5 l, u neředěných 20 µl. Detekce byla prováděna při vlnové délce 260 nm.

Kalibrace: Pokus č.1 (nástřik 5 µl):

y = 110,79x

r2 = 0,9963

Pokus č.2-4 (nástřik 20 µl)

y = 352,12x

r2 = 0,9998

Mobilní fáze se skládala roztoku 10 mM KH2PO4 a 2 mM tetrabutylamoniumhydrogensulfátu pH 7,5 se 6,5 % acetonitrilu.

3.4.

Vyhodnocení dat Ze změřených ploch pod píkem a kalibračních parametrů byla vypočítána nejprve

nekorigovaná koncentrace akceptorových vzorků cnk (g/100ml). Z ní pak byla vypočtena korigovaná koncentrace ckor (g/100ml) zohledňující odběr a doplňování nové akceptorové fáze do cel a mírné odchylky v objemu jednotlivých difuzních cel a kumulativní množství dané látky Qt (g/cm2) prošlé přes kůži. Z hodnot Qt byla sestrojena tzv. permeační křivka (závislost Qt na čase). Z dalšího zpracování byla vyloučena data, z jejichž hodnot zanesených do grafu závislosti Qt na čase vyplynulo, že při jejich zisku došlo k náhodné či systematické chybě. Oblast ustáleného toku permeantu, tedy lineární oblast křivky, byla využita pro výpočet příslušných hodnot fluxů J (ug/cm2/h). Pro stanovení lag-time LagT (h) byl prodloužen lineární úsek permeační křivky na osu x a byla odečtena hodnota průsečníku osy x a směrnice dané permeace. Akcelerační poměr AP vypovídá o účinnosti použitého akcelerantu. Byl získán jako podíl fluxu léčiva v přítomnosti akcelerantu a fluxu léčiva bez přítomnosti akcelerantu.

32

4.

VÝSLEDKY

4.1.

Permeační pokusy:

4.1.1. Srovnání transdermální permeace a dermální penetrace různých ANP: Studovali jsme schopnost transdermální permeace a dermální penetrace vybraných ANP z lipofilního roztoku IPM a z hydrofilního vodného roztoku. Transdermální permeace ANP Permeační profily ANP (Obr. 8-13) zobrazují kumulativní množství Qt (µg/cm2), prošlé přes prasečí kůži plné tloušťky z 1% roztoku v IPM a ve vodě, v závislosti na čase (h). Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.1. (S)-HPMPA

90

voda

80 70

IPM

60 50 40 30 20 10 0 0

10

20

25

2

kumulativní množství (µg/cm )

2

kumulativní množství (ug/cm )

PMEA

30

40

IPM 15 10 5 0 0

50

10

20

30

40

50

čas (h)

čas (h)

Obrázek 8. Permeační profil PMEA

voda

20

Obrázek 9. Permeační profil (S)-HPMPA

33

12

(S)-HPMPDAP kumulativní množství (µg/cm )

voda

10

2

2

kumulativní množství (µg/cm )

PMEG

IPM

8 6 4 2 0 0

10

20

30

40

4

IPM

3 2 1 0 0

50

10

Obrázek 10. Permeační profil PMEG

kumulativní množství (µg/cm )

3 2 1 0 10

12

2

2

kumulativní množství (µg/cm )

IPM

0

20

30

50

(S)-N6-CyPr-HPMPDAP

voda

4

40

Obrázek 11. Permeační profil (S)-HPMPDAP

N6-CyPr-PMEDAP

5

30

čas (h)

čas (h)

6

20

40

voda

10

IPM

8 6 4 2 0 0

50

10

20

30

40

50

čas (h)

čas (h)

Obrázek 12 a 13. Permeační profil N6-CyPr-PMEDAP a (S)-N6-CyPr-HPMPDAP Nejlépe ze všech ANP procházel přes kůži PMEA z vodného prostředí, jeho permeace z lipofilního roztoku IPM byla výrazně menší. Druhá nejvyšší hodnota fluxu byla naměřena u (S)-HPMPA z vodného prostředí, zatímco z roztoku IPM procházela tato látka přes kůži ze všech testovaných ANP nejméně. PMEG také permeuje lépe z vodného roztoku. Flux PMEG z vody byl přibližně poloviční oproti fluxu (S)-HPMPA ze stejného prostředí a permeace PMEG z IPM je podobná jako u (S)-HPMPDAP a vyšší než u (S)-HPMPA. U (S)-HPMPDAP jsme stanovovali pouze permeaci z IPM, kvůli nedostatečnému množství testované látky. Cyklopropyl deriváty ANP lépe procházejí z vehikula IPM. Permeace (S)-N6-CyPr-HPMPDAP z IPM je podobná jako u PMEA a větší než u N6-CyPr-PMEDAP. (Obr.14)

34

Flux ANP

voda

2,4

IPM

2,2 2

Flux (ug/cm2//h)

1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 PMEA

Obrázek 14.

PMEG

N6-CyPrPMEDAP

(S)-HPMPA

(S)HPMPDAP

(S)-N6-CyPrHPMPDAP

Graf popisuje hodnoty fluxů (µg/cm2/h) ANP po topickém podání 1%

vzorků ANP v IPM a ve vodě. Chybové úsečky znázorňují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.2.

lagT ANP

voda IPM

35

30

lagT (h)

25

20

15

10 PMEA

Obrázek 15.

PMEG

N6-CyPrPMEDAP

(S)-HPMPA

(S)HPMPDAP

(S)-N6-CyPrHPMPDAP

Graf zobrazuje hodnoty lag-time ANP (h) po topickém podání 1%

vzorků v IPM a ve vodě. Chybové úsečky znázorňují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.2. 35

Dermální penetrace ANP Ze studovaných ANP nejlépe penetruje do kůže PMEG, následován svým proléčivem N6-CyPr-PMEDAP, z vodného roztoku. (S)-N6-CyPr-HPMPDAP a PMEA penetrují do kůže méně, lépe z prostředí IPM. Obsah (S)-HPMPDAP v kůži byl malý. Nejmenší obsah v kůži byl stanoven u (S)-HPMPA jak z vodného roztoku, tak z roztoku IPM. (Obr. 16)

Obsah ANP v kůži po 48 h

voda IPM

3500 3000

Obsah v kůži (ug/g)

2500 2000 1500 1000 500 0 PMEA

Obrázek 16.

PMEG

N6-CyPrPMEDAP

(S)-HPMPA

(S)HPMPDAP

(S)-N6-CyPrHPMPDAP

Graf vyjadřuje obsah jednotlivých ANP v prasečí kůži (µg/g) po

topickém podání 1% vzorků ANP v IPM a ve vodě stanovený po 48 hodinách. Chybové úsečky znázorňují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.2. 4.1.2. Vliv pH a permeačního akcelerantu DDAK na permeaci a penetraci N6-CyPrPMEDAP Sledovali jsme vliv pH na transdermální permeaci a dermální penetraci N6CyPr-PMEDAP z 1% roztoku ve fosfátovém pufru. Dále jsme sledovali zda permeaci a penetraci ovlivní přítomnost 1% transdermálního akcelerantu DDAK.

36

Transdermální permeace N6-CyPr-PMEDAP Permeační profily N6-CyPr-PMEDAP (Obr. 17-22) zobrazují kumulativní množství Qt N6-CyPr-PMEDAP (µg/cm2), prošlé přes prasečí kůži plné tloušťky z 1% donorového vzorku testované látky ve 100 mM fosfátovém pufru při pH 3; 4; 5; 6; 7 a 8 s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK, v závislosti na čase (h). Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.3.

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

1% N6-CyPr-PMEDAP

pH 3,0

2

kumulativní množství (µg/cm )

2

kumulativní množství (µg/cm )

1% N6-CyPr-PMEDAP

pH 3,0 + 1% DDAK

0

10

20 30 čas (h)

40

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

pH 4,0 pH 4,0 + 1% DDAK

0

50

10

20

30

40

50

40

50

čas (h)

Obrázek 17 a 18. Permeační profil N6-CyPr-PMEDAP při pH 3 a pH 4

6

2

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

1% N -CyPr-PMEDAP

kumulativní množství (µg/cm )

2 kumulativní množství (µg/cm )

1% N6-CyPr-PMEDAP

pH 5,0 pH 5,0 + 1% DDAK

0

10

20

30

40

50

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

pH 6,0 pH 6,0 +1%DDAK

0

čas (h)

10

20

30 čas (h)

Obrázek 19 a 20. Permeační profil N6-CyPr-PMEDAP při pH 5 a pH 6

37

2

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

1% N6-CyPr-PMEDAP

kumulativní množství (µg/cm )

2

kumulativní množství (µg/cm )

1% N6-CyPr-PMEDAP

pH 7,0 pH 7,0 + 1%DDAK

0

10

20

30

40

50

440 400 360 320 280 240 200 160 120 80 40 0

pH 8,0 pH 8,0 + 1%DDAK

0

10

20

čas (h)

30

40

50

čas (h)

Obrázek 21 a 22. Permeační profil N6-CyPr-PMEDAP při pH 7 a pH 8 Permeace N6-CyPr-PMEDAP přes kůži bez přítomnosti akcelerantu DDAK byla nízká a relativně nezávislá na pH donorového vzorku. Přítomnost 1% permeačního akcelerantu DDAK v donorovém vrorku zvýšila flux N6CyPr-PMEDAP přes kůži několikanásobně při všech hodnotách pH. Maximální aktivitu měl DDAK při pH 6, kdy zvýšil flux N6-CyPr-PMEDAP 23 krát. (Obr.23)

Flux N6-CyPr-PMEDAP bez akcelerantu

12

1% DDAK

Flux (ug/cm2/h)

10 8 6 4 2 0 2

Obrázek 23.

3

4

5

pH

6

7

8

Graf popisuje závislost fluxu N6-CyPr-PMEDAP (µg/cm2/h) na pH po

topickém podání 1 % roztoku s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.4.

38

lagT N6-CyPr-PMEDAP 20 18 16 lagT (h)

14 12 10 8 6

bez akcelerantu

4

1% DDAK

2 0 2

Obrázek 24.

3

4

5 pH

6

7

8

Graf popisuje závislost lag-time N6-CyPr-PMEDAP (h) na pH po

topickém podání 1 % roztoku s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.4. Dermální penetrace N6-CyPr-PMEDAP Penetrace N6-CyPr-PMEDAP do kůže bez přítomnosti akcelerantu je větší při vyšších hodnotách pH. Nejvyšší obsah v kůži byl stanoven při pH 7. Přítomnost 1% DDAK penetraci zvyšuje přibližně dvojnásobně. Nejvyšší obsah N6CyPr-PMEDAP v kůži po topické aplikaci s 1% DDAK byl stanoven při pH 3, 6 a 7. (Obr.25) Účinnost extrakce N6-CyPr-PMEDAP z kůže byla 71 ± 3 % a 72 ± 3 % z 500 a 100 µg/cm2.

39

Obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži po 48 h bez akcelerantu 700

1% DDAK

Obsah v kůži (ug/g)

600 500 400 300 200 100 0 2

3

4

5

6

7

8

pH

Obrázek 25.

Graf zobrazuje obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži (µg/g) po topickém

podání 1 % roztoku při pH 3-8 s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.4. 4.1.3. Vliv koncentrace N6-CyPr-PMEDAP Sledovali jsme vliv koncentrace donorového vzorku N6-CyPr-PMEDAP při pH 6 na jeho transdermální a dermální permeaci a zda permeaci ovlivní přítomnost 1% transdermálního akcelerantu DDAK. Transdermální permeace N6-CyPr-PMEDAP Permeační profily N6-CyPr-PMEDAP (Obr. 26-29) popisují kumulativní množství Qt N6-CyPr-PMEDAP (µg/cm2), prošlé přes prasečí kůži plné tloušťky z 1; 2; 3 a 5% donorového vzorku testované látky ve 100 mM fosfátovém pufru při pH 6 s a bez přítomnosti 1% akcelerantu DDAK, v závislosti na čase (h). Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.5.

40

2% N6-CyPr-PMEDAP

450

0% DDAK

350

1% DDAK

300 250 200 150 100 50 0 0

10

20

30

700

2

400

kumulativní množství (µg/cm )

2

kumulativní množství (µg/cm )

1% N6-CyPr-PMEDAP

40

50

0% DDAK

600

1% DDAK

500 400 300 200 100 0 0

10

čas (h)

20

30

40

50

40

50

čas (h)

Obrázek 26 a 27. Permeační profil 1 a 2% N6-CyPr-PMEDAP při pH 6

5% N6-CyPr-PMEDAP

800 700

0% DDAK

600

1% DDAK

kumulativní množství (µg/cm2)

2

kumulativní množství (µg/cm )

3% N6-CyPrPMEDAP

500 400 300 200 100 0 0

10

20

30

40

50

1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

0% DDAK 1% DDAK

0

čas (h)

10

20

30

čas (h)

Obrázek 28 a 29. Permeační profil 3 a 5% N6-CyPr-PMEDAP při pH 6 Transdermální permeace N6-CyPr-PMEDAP bez přítomnosti akcelerantu DDAK je nízká z 1, 2, 3 i 5% donorového vzorku. Hodnota fluxu zůstává s rostoucí koncentrací konstantní. Přítomnost 1% akcelerantu DDAK několikanásobně zvyšuje permeační stupeň N6CyPr-PMEDAP, který stoupá s rostoucí koncentrací vzorku (Obr.30).

41

Flux N6-CyPr-PMEDAP 35,0

bez akcelerantu

Flux (ug/cm2/h)

30,0

1% DDAK

25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0 0

1

2

3

4

5

6

% N -CyPr-PMEDAP v donorovém vzorku

Obrázek 30.

Graf popisuje závislost fluxu N6-CyPr-PMEDAP (µg/cm2/h) na

vzrůstající koncentraci vzorku při pH 6 po topickém podání 1; 2; 3 a 5 % roztoku s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.6.

lagT N6-CyPr-PMEDAP 30 25

lagT (h)

20 15 10

bez akcelerantu 5

1% DDAK

0 0

1

2

3

4

5

6

% N -CyPr-PMEDAP v donorovém vzorku

Obrázek 31.

Graf popisuje závislost lag-time N6-CyPr-PMEDAP (h) na vzrůstající

koncentraci vzorku při pH 6 po topickém podání 1; 2; 3 a 5 % roztoku s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.6

42

Dermální penetrace N6-CyPr-PMEDAP Obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži stanovený bez přítomnosti akcelerantu DDAK je i přes vzrůstající koncentraci vzorku přibližně stejný. Přítomnost 1% akcelerantu DDAK dermální penetraci výrazně zvyšuje. Penetrace do kůže se zvyšuje s rostoucí koncentrací až do 3% koncentrace vzorku. U 5 % vzorku se obsah v kůži oproti 3% vzorku již výrazně nezvýšil. (Obr.32)

Obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži po 48 h 1600

bez akcelerantu

Obsah v kůži (ug/g)

1400

1% DDAK

1200 1000 800 600 400 200 0 0

1

2

3

4

5

% N6-CyPr-PMEDAP v donorovém vzorku

Obrázek 32.

Graf zobrazuje obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži (µg/g) po topickém

podání 1; 2; 3 a 5 % roztoku při pH 6 s a bez přítomnosti 1 % akcelerantu DDAK. Chybové úsečky zobrazují směrodatné odchylky. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.6.

43

4.2.

Srovnání rozkladu N6-CyPr-PMEDAP v pufru a v kůži: Při sledování stability N6-CyPr-PMEDAP v roztoku fosfátového pufru pH 7,4

bez azidu sodného jsme zjistili, že při 32°C se látka rozkládá a tento rozklad je urychlen za přítomnosti kůže. Při 4°C je N6-CyPr-PMEDAP relativně stabilní. (Obr.33)

Rozklad N6-CyPr-PMEDAP 100 90

% N6-CyPr-PMEDAP

80 70 60 50 40

PBS+kůže; 32°C

30 20

PBS; 4°C

10

PBS; 32°C

0 0

12

24

36

48

60

čas (h)

Obrázek 33.

Rozklad N6-CyPr-PMEDAP (%) v roztoku PBS pH 7,4 bez azidu

sodného při 32 a 4°C za časovou jednotku, ve srovnání s rozkladem N6-CyPr-PMEDAP (%) v roztoku PBS pH 7,4 s přítomností kůže při 32°C. Zdrojová data jsou uvedena v příloze č.7

44

5.

DISKUSE Pro studium schopnosti ANP proniknout přes a do kůže jsme zvolili in vitro

pokusy ve Franzově difúzní cele. Pro počáteční výběr vhodných podmínek jsme použili kůži prasečí, která je, co se týče permeability, lidské kůži velmi podobná, je snadno získatelná a na rozdíl od lidské kůže nepodléhá etickým požadavkům. Jako akceptorovou fázi jsme zvolili izotonický fosfátový pufr o pH 7,4, který svými vlastnostmi vhodně napodobuje plazmu a všechny studované látky se v něm dobře rozpouští, což je důležité pro správný průběh pokusu v in vitro podmínkách. Nevýhodou této akceptorové fáze však je, že během pokusu extrahuje z kůže celou řadu látek, které mohou být problematické při HPLC stanovení daného léčiva. Pro stanovení ANP v akceptorové fázi i kůži jsme používali iontově párovací chromatografii, protože retence těchto hydrofilních fosfonátů je na reverzní fázi velmi nízká a nebylo by možné je separovat od endogenních látek z kůže. Mobilní fáze skládající se z 10 mM fosfátového pufru a 2 mM tetrabutylamonium-hydrogensulfátu byla použita pro všechna HPLC měření, během práce jsme však museli upravovat množství acetonitrilu, případně použít jinou kolonu k dostatečné separaci sledovaných látek. V první části práce jsme sledovali vliv rozpouštědla různé polarity na transdermální permeaci ANP. Voda je jako hydrofilní vehikulum vhodnější pro transdermální podání PMEA, (S)-HPMPA a PMEG, které z vody procházely přes kůži výrazně lépe než z prostředí IPM. (S)-N6-CyPr-HPMPDAP a N6-CyPr-PMEDAP jsou díky lipofilní substituci diaminopurinového jádra cyklopropylem méně polární a lépe procházely přes kůži z lipofilního prostředí IPM. Obecně však byla transdermální permeace těchto látek nízká. N6-CyPr-PMEDAP jako nejméně polární látka procházel přes kůži ze všech studovaných ANP překvapivě nejhůře. Co se týče prostupu ANP do kůže, PMEG a jeho proléčivo N6-CyPr-PMEDAP nejlépe ze všech ANP penetrovaly z hydrofilního vodného prostředí. Tato kombinace vlastností, tedy dobrá penetrace do kůže a nízká systematická absorpce jsou výhodné vlastnosti pro potenciální topickou aplikaci těchto cytostatických sloučenin. (S)-N6CyPr-HPMPDAP a PMEA penetrovaly do kůže málo a lépe z roztoku IPM. (S)HPMPA procházel do kůže lépe z vody, ale pouze v malém množství. 45

Ve druhé části práce jsme sledovali vliv pH na transdermální permeaci a dermální penetraci N6-CyPr-PMEDAP. Z fosfátového pufru procházel 1% N6-CyPrPMEDAP přes kůži málo a hodnoty fluxu při pH 3, 4, 5 a 6 byly srovnatelné. Toto zjištění je překvapivé, vzhledem k rozdílné ionizaci této látky při daných hodnotách pH. Při nízkém pH je většina látky je ve formě zwitteriontu s kationtem na N1 2,6diaminopurinového cyklu a hydrogenfosfonátovým aniontem. Se stoupajícím pH dochází postupně k odštěpení protonu na N1 a vytvoření monoaniontu a následně ke vzniku fosfonátového dianiontu.Vyšší hodnoty fluxu, které byly stanoveny při pH 7 a 8, mohou být důsledkem narušení bariérové funkce kůže při tomto pro kůži nepříznivém pH. Proto pravděpodobně N6-CyPr-PMEDAP také lépe penetroval do kůže při vyšších hodnotách pH (6, 7 a 8). Dále jsme se pokusili zvýšit prostup N6-CyPr-PMEDAP přes a do kůže pomocí permeačního akcelerantu DDAK. Tato látka byla vybrána na základě předchozí práce, kde byl sledován vliv různých akcelerantů na permeaci adefoviru (PMEA).29 Přítomnost 1% permeačního akcelerantu DDAK v donorovém vzorku zvýšila flux N6-CyPrPMEDAP přes kůži několikanásobně při všech studovaných hodnotách pH, což je výhodné, protože při případném technologickém zpracování látky do náplasti či topického přípravku bude možné upravit pH podle aktuálních pořadavků bez ztráty účinku akcelerantu. Maximální aktivitu měl DDAK při pH 6, kdy byl flux zvýšen 23krát. Na rozdíl od transdermálního průniku, dermální penetraci 1% N6-CyPrPMEDAP zvýšil DDAK pouze přibližně dvojnásobně. Nejvyšší obsah N6-CyPrPMEDAP v kůži po topické aplikaci s 1% DDAK byl nalezen při pH 3, 6 a 7. Bez akcelerantu neměla rostoucí koncentrace N6-CyPr-PMEDAP v donorového vzorku vliv na transdermální permeaci, ani na dermální penetraci této sloučeniny. Flux i obsah v kůži byl přibližně stejný u 1, 2, 3 i 5% roztoku. Naopak, v přítomnosti 1% DDAK flux N6-CyPr-PMEDAP výrazně rostl se zvyšující se koncentrací donorového vzorku, což je v souladu se zvyšující se termodynamickou aktivitou látky v donorovém vzorku. Obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži s 1% DDAK se také zvyšoval se vzrůstající koncentrací ale pouze do 3% N6-CyPr-PMEDAP. Penerace 3% a 5% N6-CyPrPMEDAP byla přibližně stejná.

46

V průběhu permeačních pokusů jsme zjistili přítomnost nových píků v chromatogramech akceptorové fáze. Vzhledem k tomu, že N6-CyPr-PMEDAP je proléčivem PMEG, nejprve jsme předpokládali, že dochází k metabolizaci v kůži na tuto látku. Nicméně porovnání retence se standardem PMEG tuto možnost vyloučilo. Studovali jsme tedy rozklad této látky – zda k němu dochází v kůži, či je látka sama o sobě nestabilní. N6-CyPr-PMEDAP se sice mírně rozkládal již v roztoku fosfátového pufru pH 7,4 při 32°C, ale za přítomnosti kůže byl rozklad výrazně vyšší. Později bylo zjištěno, že působením kožní mikroflóry dochází k dealkylaci N6-CyPr-PMEDAP na PMEDAP.

47

6.

ZÁVĚR V této diplomové práci jsme srovnávali schopnost transdermální permeace a

dermální penetrace vybraných ANP. Zjistili jsme poměrně velké rozdíly v absorpci jednotlivých látek a výrazný vliv lipofility donorového vehikula. Dále jsme se zaměřili na protinádorově působící látku N6-CyPr-PMEDAP. Tato látka proniká přes neporušenou kožní bariéru poměrně málo a tento proces nevykazuje žádnou zřetelnou závislost na pH donorové fáze. Navíc ani zvýšení donorové koncentrace N6-CyPr-PMEDAP nezvýšilo jeho flux. S přidáním 1% permeačního akcelerantu DDAK do donorového vzorku však došlo k několikanásobnému nárůstu permeace i penetrace N6-CyPr-PMEDAP, a to při všech sledovaných hodnotách pH. Nejvyšší aktivitu měl DDAK při pH 6. Zvýšení donorové koncentrace N6-CyPr-PMEDAP v přítomnosti akcelerantu vedlo k nárůstu trandermálního fluxu i koncentrace v kůži. Dále jsme identifikovali rozkladnou reakci, která však vyžaduje další studium. Tyto výsledky budou podkladem ke studiu permeace N6-CyPr-PMEDAP přes lidskou kůži a penetrace do různých kožních vrstev.

48

7.

POUŽITÉ ZKRATKY A SYMBOLY

ANP

acyklické nukleosidfosfonáty

AP

akcelerační poměr

C0

konstantní koncentrace léčiva v donorovém vzorku

ckor

korigovaná koncentrace permeantu

cnk

nekorigovaná koncentrace permeantu

cs,m

rozpustnost léčiva v membráně

cs,v

rozpustnost léčiva ve vehikulu

cv

koncentrace léčiva ve vehikulu

dNTP

deoxynukleosidtrifosfát

D

difuzní koeficient

DDAK

dodecylester kyseliny 6-dimethylaminokapronové

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

IPM

isopropyl-myristát

J

flux permeantu

K

rozdělovací koeficient permeantu

L

šířka membrány

LagT

lag-time

m

kumulativní množství permeantu

N6-CyPr-PMEDAP

N6-cyklopropyl-9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6diaminopurin

p

monofosfát

pp

difosfát

PBS

fosfátový pufr

PMEA

9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]adenin

PMEDAP

9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurin

PMEG

9-[2-(fosfonomethoxy)ethyl]guanin

Qt

kumulativní množství permeantu

r2

korelační koeficient

(R)-PMPA

(R)-9-[2-(fosfonomethoxy)propyl]adenin

(S)-HPMPA

(S)-9-[3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]adenin

(S)-HPMPC

(S)-9-[3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propyl]cytosin

49

(S)-HPMPDAP

(S)-9-[3-hydroxy-2-(fosfonomethoxy)propylyl]-2,6diaminopurin

(S)-N6-CyPr-HPMPDAP

(S)-N6-cyklopropyl-9-[3-hydroxy-2(fosfonomethoxy)propyl]-2,6-diaminopurin

t

čas

x

koncentrace analyzované látky

y

plocha pod píkem

50

8.

LITERATURA

1. El-Kattan A, Asbill CS, Haider S. 2000. Transdermal testing: practical aspects and methods. Pharm Sci Technol Today 3(12):426-430 2. Thomas BJ, Finnin BC. 2004. The transdermal revolution. Drug Discov Today 9(16):697-703 3. Prausnitz MR, Mitragotri S, Langer R. 2004. Current status and future potential of transdermal drug delivery. Nat Rev Drug Discov 3(2):115-123 4. Menon GK. 2002. New insights into skin structure: scratching the surface. Adv Drug Deliv Rev 54(1):S3-S17 5. Vávrová K, Zbytovská J, Hrabálek A. 2005. Amphiphilic transdermal permeation enhancers: structure-activity relationships. Curr Med Chem 12:22732291 6. Barry BW. 2001. Novel mechanisms and devices to enable succesful transdermal drug delivery. Eur J Pharm Sci 14:101-114 7. Moser K, Kriwet K, Naik A, Kalia YN, Guy RH. 2001. Passive skin penetration enhancement and its quantification in vitro. Eur J Pharm Biopharm 52:103-112 8. Benson HAE. 2005. Transdermal drug delivery: penetration enhancement techniques. Curr Drug Deliv 2:23-33 9. Holý A. 2003. Phosphonomethoxyalkyl analogs of nucleotides. Curr Pharm Des 9:2567-2592 10. De Clercq E. 2003. Clinical potential of the acyclic nucleoside phosphonates cidofovir, adefovir, and tenofovir in treatment of DNA virus and retrovirus infections. Clin Mikrobiol Rev 16(4):569-596 11. Zídek Z, Potměšil P, Kmoníeková E, Holý A. 2003. Immunobiological activity of N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl]derivates of N6-substituted adenines, and 2,6diaminopurines. Eur J Pharm 475(15):149-159 12. Keith KA, Hitchcock MJM, Lee WA, Holý A, Kern ER. 2003. Evaluation of nucleoside phosphonates and their analogs and prodrugs for inhibition of orthopoxvirus replication. Antimicrob Agents Chemother 47(7):2193-2198 13. Danta M, Dusheiko G. 2004. Adefovir dipivoxil: review of a novel acyclic nucleoside analogue. Int J Clin Pract 58(9):877-886

51

14. Compton ML, Toole JJ. Paborsky LR. 1999. 9-(2-Phosphonylmethoxyethyl)-N6cyclopropyl-2,6-diaminopurine

(cpr-PMEDAP)

as

a

prodrug

of

9-(2-

Phosphonylmethoxyethyl)guanine (PMEG). Biochem Pharm 58(4):709-714 15. Hatse S, Naesens L, De Clercq E, Balzarini J. 1999. N6-cyclopropyl-PMEDAP: a

novel

derivative

of

9-(2-phosphonylmethoxyethyl)-2,6-diaminopurine

(PMEDAP) with distinct metabolic, antiproliferative, and differentiationinducing properties. Biochem Pharm 58(2):311-323 16. Schinkmanová M, Votruba I, Holý A. 2006. N6-Methyl-AMP aminohydrolase activates N6-substituted purine acyclic nucleoside phosphonates. Biochem Pharm 71:1370-1376 17. Hájek M, Matulová N, Votruba I, Holý A, Tloušťová E. 2005. Inhibition of human telomerase by diphosphates of acyclic nucleoside phosphonates. Biochem Pharm 70(6):894-900 18. Franek F, Holý A, Votruba I, Eckschlager T. 1999. Acyclic nucleotide analogues supress growth and induce apoptosis in human leukemia cell lines. Int J Oncol 14(4):745-752 19. Rose WC, Crosswell AR, Bronson JJ, Martin JC. 1990. In vivo antitumor activity of 9-[(2-Phosphonylmethoxy)ethyl]-guanine and related phosphonate nucleotide analogues. J Natl Cancer Inst 82(6):510-512 20. Kramata P, Downey KM. 1999. 9-(2-Phosphonylmethoxyethyl) derivates of purine nucleotide analogs: a comparsion of their metabolism and interaction with cellular DNA synthesis. Mol Pharmacol 56:1262-1270 21. Holý A, Votruba I, Tloušťová E, Masojídková M. 2001. Synthesis and cytostatic activity of N-[2-(phosphonomethoxy)alkyl] derivatives of N6-substituted adenines, 2,6-diaminopurines and related compounds. Collect Czech Chem Commun 66:1545–1592 22. Naesens L, Hatse S, Segers C, Verbeken E, De Clercq E, Waer M, Balzarini J. 1999.

9-(2-Phosphonylmethoxyethyl)-N6-cyclopropyl-2,6-diaminopurine:

a

novel prodrug of 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)guanine with improved antitumor efficacy and selektivity in choriocarcinoma-bearing rats. Oncol Res 11(4):195-203 23. Valerianová M, Votruba I, Holý A, Mandys V, Otová B. 2001. Antitumour activity of N6-substituted PMEDAP derivatives against T-cell lymphoma. Anticancer Res 21(3B):2057-2064 52

24. Christensen ND, Pickel MD, Budgeon LR, Kreider JW. 2000. In vivo antipapillomavirus activity of nucleoside analogues including cidofovir on CRPVinduced rabbit papillomas. Antiviral Res 48(2):131-142 25. Snoeck R, Holý A, Dewolf-Peeters C, Van Den Oord J, De Clercq E, Andrei G. 2002. Antivaccinia activities of acyclic nucleoside phosphonate derivatives in epithelial cells and organotypic cultures. Antimicrob Agents Chemother 46(11): 3356-3361 26. Dal Pozzo F, Andrei G, Holý A, Van Den Oord J, Scagliarini A, De Clercq E, Snoeck R. 2005. Activities of acyclic nucleoside phosphonates against orf virus in human and ovine cell monolayers and organotypic ovine raft cultures. Antimicrob Agents Chemother 49(12):4843-4852 27. Valeriánová M, Otová B, Bílá V, Hanzalová J, Votruba I, Holý A, Eckschlager T, Krejčí O, Trka J. 2003. PMEDAP and its N6-substituted derivatives: genotoxic effect and apoptosis in in vitro conditions. Anticancer Res 23(6C):4933-4939 28. Otová B, Holý A, Votruba I, Sladká M, Bílá V, Mejsnerová B, Lesková V. 1997. Genotoxicity of purine acyclic nukleotide analogs. Folia Biol(Praha) 43(6):225-229 29. Vávrová K, Lorencová K, Klimentová J, Novotný J, Holý A, Hrabalek A. 2008. Transdermal and dermal delivery of adefovir: Effects of pH and permeation enhancers, Eur J Pharm Biopharm In press; doi:10.1016/j.ejpb.2007.1012.1005.

53

ABSTRAKT Cílem diplomové práce bylo stanovit schopnost transdermální permeace a dermální penetrace acyklických nukleosidfosfonátů, nové skupiny širokospektrých antivirotik. Transport vybraných acyklických nukleosidfosfonátů přes a do prasečí kůže a vliv rozpouštědla různé polarity byl studován in vitro ve Franzově difúzní cele. Zjistili jsme poměrně velké rozdíly v absorpci jednotlivých látek a výrazný vliv lipofility donorového vehikula: isopropyl-myristátu a vody. Ve druhé části práce byl studován vliv pH, koncentrace donorového vzorku a přítomnosti 1% permeačního akcelerantu dodecylesteru kyseliny 6-dimethylaminokapronové (DDAK) na transdermání a dermální podání perspektivní protinádorově působící látky: N6-cyklopropyl-9-[2(fosfonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurinu (N6-CyPr-PMEDAP). Tato látka proniká přes neporušenou kožní bariéru poměrně málo a bez zřetelné závislosti na pH donorového vzorku, či na koncentraci donorového vzorku. Přidáním 1% permeačního akcelerantu DDAK do donorového vzorku však došlo k několikanásobnému zvýšení permeace a přibližně dvojnásobnému zvýšení penetrace při všech sledovaných hodnotách pH (3-8). Nejvyšší aktivitu měl DDAK při pH 6. Zvyšování koncentrace N6CyPr-PMEDAP v donorovém vzorku v přítomnosti akcelerantu vedlo k výraznému nárůstu fluxu i obsahu v kůži. Dále jsme identifikovali rozkladnou reakci, která však vyžaduje další studium. Výsledky této práce budou podkladem ke studiu permeace N6CyPr-PMEDAP přes lidskou kůži a penetrace do různých vrstev kůže.

54

ABSTRACT

The objective of this diploma thesis was to determine the transdermal permeation and dermal penetration of acyclic nucleoside phosphonates, a new class of broad-spectrum antivirals. Transport of selected acyclic nucleoside phosphonates through and into porcine skin and the effect of solvents of different polarities was studied in vitro using Franz diffusion cell. We found relatively large differences in the absorption of the individual substances and a marked influence of lipofility of donor vehicle: isopropyl myristate and water. In the second part of this work we studied the influence of pH, concentration in the donor sample and the presence of 1% permeation enhancer 6dimethylaminohexanoic acid dodecyl ester (DDAK) on the transdermal and dermal delivery

of

perspective

anticancer

substance:

N6-cyklopropyl-9-[2-

(phosphonomethoxy)ethyl]-2,6-diaminopurine (N6-CyPr-PMEDAP). This substance permeates through intact skin barrier relatively slowly and without any dependence on the donor sample pH or its concentration. The addition of 1% permeation enhancer DDAK to the donor sample resulted in an order-of-magnitude increase of permeation and approximately in double increase of penetration at all pH values. The maximum activity of DDAK was observed at pH 6. Increasing the N6-CyPr-PMEDAP concentration in the donor sample with the enhancer led to considerable increase of flux and concentration in the skin. Furthermore, we identified a degradation, which; however, needs further study. The results of this work will serve for prospective studies of permeation of N6-CyPr-PMEDAP through the human skin and its penetration into the individual skin layers.

55

Příloha č.1 Kumulativní množství Qt (µg/cm2) ANP prošlé přes prasečí kůži plné tloušťky z 1% roztoku IPM a z 1% roztoku vody za časovou jednotku (h).

Čas (h) PMEA - IPM PMEA - voda

16

20

24

28

40

44

48

0,9 ± 1,0 1,2 ± 1,6 1,8 ± 2,1 2,3 ± 2,7 4,9 ± 5,1 5,8 ± 5,8 6,8 ± 6,2 13,7 ±

16,4 ±

19,5 ±

21,3 ±

39,2 ±

47,7 ±

58,6 ±

7,8

10,8

11,9

12,8

19,5

20,9

21,7

HPMPA - IPM

0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,6 ± 0,0 1,3 ± 0,2 1,5 ± 0,2 1,7 ± 0,2

HPMPA - voda

1,3 ± 0,6 1,7 ± 0,9 4,0 ± 0,9 5,8 ± 1,6

11,7 ±

13,3 ±

15,3 ±

3,2

3,6

3,9

HPMPDAP - IPM 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,8 ± 0,3 1,1 ± 0,3 1,5 ± 0,5 PMEG - IPM

0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 0,8 ± 0,0 1,1 ± 0,1 2,2 ± 0,3 2,5 ± 0,3 2,6 ± 0,3

PMEG - voda

0,0 ± 0,0 0,7 ± 0,2 1,4 ± 0,2 2,3 ± 0,7 5,5 ± 2,3 6,3 ± 2,9 6,8 ± 2,9

N6-CyPr-PMEDAP - IPM N6-CyPr-PMEDAP - voda N6-CyPrHPMPDAP - IPM N6-CyPrHPMPDAP - voda

0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,6 1,9 ± 1,0 2,7 ± 1,3 3,5 ± 1,5 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 1,2 ± 0,0 1,5 ± 0,1 1,8 ± 0,1 0,0 ± 0,0 0,8 ± 1,2 0,9 ± 1,3 1,4 ± 2,0 3,6 ± 2,8 5,0 ± 3,5 6,4 ± 4,3 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,2 ± 0,3 1,4 ± 1,0 2,1 ± 1,5 2,6 ± 2,1

56

Příloha č.2 Permeační charakteristiky 1% vzorků ANP v IPM a ve vodě přes prasečí kůži plné tloušťky a jejich koncentrace v kůži.

J (μg/cm2/h)

Obsah v kůži (μg/g) voda PMEA

PMEG

IPM

294 ± 75 386 ± 161 2261 ± 884

514 ± 307

N6-CyPr

1255 ±

PMEDAP

262

HPMPA

210 ± 23

82 ± 38

HPMPDAP

0±0

218 ± 134

N6-CyPr HPMPDAP

812 ± 471

283 ± 141 620 ± 499

voda

IPM

1,85 ±

0,23 ±

0,51

0,15

0,27 ±

0,08 ±

0,11

0,01

0,09 ±

0,16 ±

0,01

0,05

0,48 ±

0,06 ±

0,13

0,01

0±0

0,07 ± 0,03

0,12 ±

0,24 ±

0,09

0,11

57

lagT (h) voda

IPM

26 ± 2

24 ± 8

19 ± 2

15 ± 1

28 ± 0

27 ± 2

16 ± 1

18 ± 0

0±0

25 ± 2

26 ± 2

26 ± 5

Příloha č.3 Kumulativní množství Qt (ug/cm2) N6-CyPr-PMEDAP prošlé přes kůži z 1% vzorku ve 100mM fosfátovém pufru za časovou jednotku (h) při pH 3-8 s a bez 1% akcelerantu DDAK. Čas (h)

16

20

24

28

40

44

48

pH 3,0

4±5

5±6

8 ± 10

11 ± 13

20 ± 23

21 ± 24

21 ± 22

14 ± 14

25 ± 20

42 ± 29

48 ± 28

92 ± 36

81 ± 34 110 ± 47

0±0

0±0

3±1

4±1

8±1

30 ± 49

43 ± 61

57 ± 60

1±1

4±5

6±6

26 ± 23

41 ± 34

66 ± 50

1±1

1±1

4±2

pH 3,0 + 1% DDAK pH 4,0 pH 4,0 + 1% DDAK pH 5,0 pH 5,0 + 1% DDAK pH 6,0 pH 6,0 + 1%DDAK pH 7,0 pH 7,0 + 1%DDAK pH 8,0 pH 8,0 + 1%DDAK

40 ± 39 3±1 47 ± 33

69 ± 63 126 ± 97 10 ± 8

10 ± 2

8±2

135 ±

158 ±

103

106

17 ± 16

24 ± 22

83 ± 59 159 ± 88 168 ± 94 6±2

70 ± 59 104 ± 82 120 ± 79 6±1

19 ± 18

5±0

15 ± 3

82 ± 51 107 ± 58 132 ± 72

191 ±109

9±3

8±3

10 ± 3

234 ±

251 ±

274 ±

103

112

135

31 ± 5

29 ± 7

38 ± 9

234 ±

260 ±

277 ±

108

111

113

47 ± 35

42 ± 33

52 ± 36

5±4

8±5

15 ± 9

21 ± 12

39 ± 27

63 ± 36

78 ± 38

83 ± 36 111 ± 48 112 ± 42 153 ± 65

58

Příloha č.4 Permeační charakteristika 1% vzorku N6-CyPr-PMEDAP ve 100 mM fosfátovém pufru přes kůži plné tloušťky při pH 3-8 s a bez 1% akcelerantu DDAK a obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži.

Obsah v kůži (μg/g) bez pH

akceleran tu

1% DDAK

J (μg/cm2/h) bez

ER bez

1%

akceleran

akceleran

DDAK

tu

lagT (h)

tu

1% DDAK

3

180 ± 55

475 ± 57

0,7 ± 0,7

3,1 ± 1,0

4,6

15 ± 3

13 ± 5

4

203 ± 65

338 ± 90

0,3 ± 0,1

4,2 ± 2,1

14,6

16 ± 0

14 ± 5

5

181 ± 108 363 ± 84

0,7 ± 0,7

5,7 ± 2,4

7,9

16 ± 1

14 ± 4

6

269 ± 56

484 ± 77

0,4 ± 0,1

8,4 ± 2,3

23,0

15 ± 1

13 ± 5

7

346 ± 91

480 ± 97

1,1 ± 0,3

7,8 ± 2,8

7,0

14 ± 1

11 ± 4

8

253 ± 74

319 ± 27

1,6 ± 1,1

4,2 ± 1,5

2,7

13 ± 1

7±4

59

Příloha č.5 Kumulativní množství Qt (ug/cm2) N6-CyPr-PMEDAP prošlé přes kůži ze 100mM fosfátového pufru za časovou jednotku (h) při pH 6 s a bez 1% akcelerantu DDAK.

Čas (h)

16

20

24

28

40

44

48

1% N6-CyPr-PMEDAP

1±1

1±1

4±2

6±2

9±3

8±3

10 ± 3

1 % N6-CyPr-PMEDAP

40 ±

70 ±

104 ±

120 ±

234 ±

251 ±

274 ±

+ 1%DDAK

39

59

82

79

103

112

135

2% N6-CyPr-PMEDAP

1±1

1±2

2±2

6±4

10 ± 7

9±8

9±8

2% N6-CyPr-PMEDAP

52 ±

92 ±

126 ±

181 ±

369 ±

416

452 ±

+ 1%DDAK

40

65

81

91

151

±161

161

3% N6-CyPr-PMEDAP

1±2

2±1

4±3

4±5

10 ± 6

9±9

3% N6-CyPr-PMEDAP

52 ±

84 ±

136 ±

194 ±

421 ±

487 ±

568 ±

+ 1%DDAK

35

55

70

90

116

103

116

5% N6-CyPr-PMEDAP

3±2

4±3

6±5

6±4

12 ± 7

12 ± 7 15 ± 5

5% N6-CyPr-PMEDAP

81 ±

139 ±

227 ±

313 ±

619 ±

702 ±

774 ±

+ 1%DDAK

70

114

171

211

330

334

349

60

11 ± 12

Příloha č.6 Permeační charakteristika 1; 2 ;3 a 5% vzorku N6-CyPr-PMEDAP ve 100 mM fosfátovém pufru přes kůži plné tloušťky při pH 6 s a bez 1% akcelerantu DDAK a obsah N6-CyPr-PMEDAP v kůži.

Obsah v kůži (μg/g) % N6CyPrPMEDA P 1 2

3

5

bez akceleran tu

1% DDAK

269 ± 56

484 ± 77

288 ±

696 ±

337

172

165 ±

1082

172

±266

331 ±

1120

234

±312

J (μg/cm2/h) bez akceleran tu 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,1

61

ER bez

1%

akceleran

DDAK

8,4 ± 2,3 13,6 ± 3,7 17,9 ± 1,8 23,8 ± 8,8

lagT (h)

tu

1% DDAK

23,0

15 ± 1

13 ± 5

33,9

20 ± 7

15 ± 3

36,9

19 ± 6

17 ± 4

47,9

15 ± 10

16 ± 4

Příloha č.7 N6-CyPr-PMEDAP (%) v roztoku PBS pH 7,4 bez azidu sodného při 32 a 4 °C za časovou jednotku a rozklad N6-CyPr-PMEDAP (%) v roztoku PBS pH 7,4 při 32°C s přítomností kůže.

PBS

PBS + kůže

PBS

32°C

32°C

4 °C

0

100 ± 2

100 ± 2

100

0,5

99 ± 0

95 ± 7

1

98 ± 3

94 ± 5

2

97 ± 2

91 ± 8

4

94 ± 6

87 ± 9

8

91± 7

79 ± 12

24

87 ± 7

55 ± 15

97 ± 2

48

80 ± 11

49 ± 17

94 ± 2

Čas (h)

62