LAPORAN PENELITIAN
IDENTIFIKASI MUTASI FRAGMEN DNA DAERAH
REVERSE
TRANSCRIPTASE HIV-1 PADA SUBJEK ODHA DI JAYAPURA
dr. Lidwina Salim, M.Si
BALAI PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOMEDIS PAPUA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN R.I.
2014
LAPORAN PENELITIAN
REVERSE
IDENTIFIKASI MUTASI FRAGMEN DNA DAERAH HIV-1 PADA SUBJEK JAYAPURA
TRANSCRIPTASE
ODHA
dr. Lidwina Salim, M.Si
BALAI PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN BIOMEDIS PAPUA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN R.I.
2014
DI
KEPUTUSAN KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN NOMOR :HK.02.03/1.2/1876/2014 TENTANG TIM PELAKSANA PENELITIAN IDENTIFIKASI MUTASI FRAGMEN DNA REVERSE TRANSKRIPTASE HIV-1 PADA PASIEN ODHA DI JAYAPURA KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
Menimbang
: bahwa sehubungan dengan diadakannya penelitian di Jayapura, perlu menetapkan Keputusan Kepala Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan tentang Tim Pelaksana Penelitian Identifikasi Mutasi Fragmen DNA Reverse Transkriptase HIV-1 Pada Pasien Odha Di Jayapura.
Mengingat
: 1.
Undang-Undang Nomor 18 Tahun 2001 tentang. Sistem Nasional
Penelitian,
Pengembangan,
dan
Penerapan
Ilmu
Pengetahuan dan Teknologi (Lembaran Negara Tahun 2002 Nomor 84, Tambahan Lembaran Negara Nomor 4219); 2.
Undang-Undang Nomor 36 tahun 2009 tentang Kesehatan (Lembaran Negara Tahun 2009 Nomor 144, Tambahan Lembaran Negara Nomor 5063)
3.
Peraturan Pemerintah Nomor 39 Tahun 1995 tentang Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 1995 Nomor 67, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 3609);
4.
Peraturan Pemerintah Nomor 20 Tahun 2005 tentang Alih Teknologi Kekayaan Intelektual serta Hasil Penelitian dan Lembaga Penelitian dan Pengembangan (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2005 Nomor 43, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4497);
5.
Peraturan MenteriKesehatan Nomor 1144/Menkes/PER/VIII/2010
tentang
Organisasi
dan
Tata
Kerja
Kementerian Kesehatan (Berita Negara Republik Indonesia Tahun 2010 Nomor 585) sebagaimana telah diubah dengan Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 35 Tahun 2013 (Berita Negara Republik Indonesia Tahun 2013 Nomor 741); 6. Peraturan Menteri ...
6.
Peraturan
Menteri
Kesehatan
Nomor
2355/Menkes/PER/Xl/2011 Tentang Organisasi dan Tata Kerja Balai Penelitian dan Pengembangan Biomedis; 7.
Keputusan
Menteri
Kesehatan
791/Menkes/SK/VII/1999
Nomor
tentang
Koordinasi
Penyelenggaraan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan; 8.
Keputusan
Menteri
Kesehatan
Nomor
1179A/Menkes/SK/X/1999 tentang Kebijakan Nasional Penelitian dan Pengembangan Kesehatan;
M E M U T U S K A N :
Menetapkan :
KEPUTUSAN KEPALA BADAN PENILITIAN DAN PENGEMBANGAN PENELITIAN
KESEHATAN
IDENTIFIKASI
TENTANG
MUTASI
TIM
FRAGMEN
PELAKSANA
DNA
REVERSE
TRANSKRIPTASE HIV-1 PADA PASIEN ODHA DI JAYAPURA. KESATU :
Susunan keanggotaan Tim Pelaksana Penelitian Identifikasi Mutasi Fragmen DNA Reverse Transkriptase HIV-1 Pada Pasien Odha Di Jayapura sebagaimana tercantum dalam lampiran keputusan ini.
KEDUA :
Tim sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kesatu, memiliki tanggung jawab sebagai berikut: 1. Ketua
Pelaksana
bertanggung
jawab
terhadap
kelancaran
pelaksanaan penelitian mulai dari penyusunan protokol hingga laporan akYnr; 2. Peneliti bertanggung jawab terhadap pelaksanaan pengumpulan data di lapangan, melakukan analisa data sebagai bahan
penyusunan
laporan
serta
melaksanakan
kegiatan
di
laboratorium; 3. Litkayasa bertanggung jawab terhadap pelaksanaan kegiatan di lapangan. KETIGA : Tim
sebagaimana dimaksud pada Diktum Kesatu dalam melaksanakan
tugasnya
bertanggung
jawab
kepada
Kepala
Balai
Penelitian dan Pengembangan Biomedis Papua.
KEEMPAT :
-2 -
KEEMPAT
: Seluruh pembiayaan yang timbul dari pelaksanaan kegiatan Tim sebagaimana dimaksud pada Diktum Kesatu, dibebankan pada DIPA Balai Penelitian
dan
Pengembangan
Biomedis
Papua,
Badan
Penelitian
Pengembangan Kesehatan Tahun Anggaran 2014. KELIMA
: Masa kerja Pelaksana Penelitian Konfirmasi Vektor Malaria Pada Nyamuk di Provinsi Papua Barat berlaku 1 (satu) tahun anggaran. \ Keputusan ini berlaku untuk Tahun Anggaran 2014.
-3 -
dan
LAMPIRAN KEPUTUSAN KEPALA BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN NOMOR: HK.02.03/1.2/1876/2014 TENTANG TIM PELAKSANA PENELITIAN IDENTIFIKASI MUTASI FRAGMEN DNA REVERSE TRANSKRIPTASE HIV-1 PADA PASIEN ODHA DI JAYAPURA.
SUSUNAN TIM PELAKSANA PENELITIAN IDENTIFIKASI MUTASI FRAGMEN DNA REVERSE TRANSKRIPTASE HIV-1 PADA PASIEN ODHA DI JAYAPURA.
Ketua Pelaksana
:
dr.
Lidwina Salim, M.Si.
Peneliti
:
1.
Hotma Lorensi Hutapea.M.Si.
2.
Mira Widiyanti, M.Sc.
3.
Tri Nury Kridaningsih, S.Si
Litkayasa
:
Eva Fitriana, S.Ssi
- 4 -
SUSUNAN TIM PENELITI No.
Na ni a
Kesarjanaan
Kedudukan Dalam
Uraian Tugas
Tim 1.
dr Lidwina Salim, M
Master Sains
Ketua Pelaksana
Si
Penulisan proposal, koordinasi kegiatan ekstraksi RNA HIV, optimalisasi PCR untuk memperoleh
fragmen
rtase HIV, pengolahan data,
serta
penulisan
laporan
2.
Hotma Lorensi
Master Sains
Peneliti
Hutapea, M Si
Membantu pengerjaan optimalisasi PCR untuk memperoleh rtase
fragmen
HIV,
dan
pengumpulan
data
sekuens nukleotidanya
3.
Mima Widiyanti, M
Master Sains
Peneliti
Membantu pengerjaan optimalisasi PCR
Sc
untuk memperoleh rtase
fragmen
HIV.
pengumpulan
dan data
sekuens nukleotidanya.
4.
Tri Nury Kridaningsih. S.Si
Sarjana Sains
Peneliti
Membantu pengerjaan optimalisasi PCR untuk memperoleh
iii
fragmen rtase HIV
5.
Eva Fitriana. S Si
Sarjana Sains
Peneliti
Mengerjakan teknis ekstraksi RNA HIV, PCR untuk memperbanyak fragmen rtase HIV
iv
PERSETUJUAN ETIK (ETHICAL APPROVAL) Nomor: LB 0 2 . 0 1 / 5 . 2 /ke 017/2014
Yang bertanda tangan di bawah ini, Ketua Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan Litbang Kesehatan, setelah dilaksanakan pembahasan dan penilaian, dengan ini memutuskan protokol penelitian yang berjudul:
"Identifikasi Mutasi Fragmen DNA Reverse Transcriptase HIV-1 Pada ODHA Di Jayapura ”
yang mengikutsertakan manusia sebagai subyek penelitian, dengan Ketua Pelaksana I Peneliti Utama Dr. Lidwina Salim, M.Si dapat disetujui pelaksanaannya Persetujuan ini berlaku sejak tanggal ditetapkan sampai dengan batas waktu pelaksanaan penelitian seperti tertera dalam protokol dengan masa berlaku maksimum selama 1 (satu) tahun. Selama penelitian berlangsung, laporan kemajuan (setelah 50% penelitian terlaksana) harus diserahkan kepada KEPK-BPPK Pada akhir penelitian, laporan pelaksanaan penelitian harus diserahkan- kepada KEPK-BPPK. Jika ada perubahan protokol dan / atau perpanjangan penelitian, harus mengajukan kembali permohonan kajian etik penelitian (amandemen protokol).
Lembaran Persetujuan Kepala Unit Kerja dan Ketua PPI
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa. karena hanya kasih karuniaNya maka penulis telah menyelesaikan dan menulis laporan penelitian yang berjudul “Identifikasi Mutasi Fragmen DNA Reverse Transkriptase HIV-1 pada Pasien ODHA di Jayapura' Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada DNA reverse transkriptase HIV-1 sebelum atau sesudah pemberian antiretroviral golongan NNRTI dan NRTI. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan kelemahan dari penelitian ini
Dengan rendah hati penulis mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah membantu dari awal pengerjaan hingga selesainya penulisan laporan penelitian ini
Akhirnya penulis berharap agar laporan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
vii
RINGKASAN EKSEKUTIF
Penemuan antiretroviral (arv) telah mampu meningkatkan harapan dan kualitas hidup penderita
Human Immunodeficiency Virus -Acquired Immunodeficiency Syndrom (HIV- AIDS) Terapi arv ini telah digunakan untuk menurunkan jumlah HIV di dalam sel CD4 manusia. Kemampuan tersebut menyebabkan arv menjadi pilihan utama dalam usaha pengobatan pasien AIDS. Salah satu kelompok arv yang digunakan dalam terapi adalah inhibitor Reverse Transcriptase (RT) yang bekerja dengan menghambat aktifitas enzim RT virus yang berperan penting dalam multiplikasi HIV Inhibitor RT terdiri atas 2 kelompok, yaitu kelompok analog nukleotida. dan non-analog vang digunakan sebagai pengobatan lini pertama di Jayapura. Jenis arv yang umum digunakan di Jayapura adalah Lamivudine (3TC) dan Tenofovir Disoproxil Fumarate (TDF), inhibitor yang non analog nukleotida yaitu Efavirenz (EFV) Terapi arv dalam jangka waktu tertentu ternyata dapat menyebabkan HIV termutasi sehingga menjadi kebal terhadap obat yang diberikan Hal tersebut menyebabkan arv harus diganti Penelitian ini berfokus pada mutasi terkait resistensi yang terjadi pada DNA daerah rt HIV dengan mengacu pada data-data penelitian terdahulu vang telah dipublikasikan. Pengujian resistensi HIV terhadap inhibitor RT tidak dilakukan baik secara in vitro maupun in vivo. Dengan diperolehnya data mutasi pada DNA daerah rt HIV, maka dapat ditentukan apakah arv dan kombinasinya yang telah digunakan di VCT di Jayapura masih efektif bagi penderita H1V/A1DS di Jayapura. Penelitian ini berjenis laboratorik non eksperimental yang telah dilaksanakan pada tahun 2014. Sampel berupa plasma dari 50 subyek ODHA dari semua kelompok umur yang dikumpulkan dari RSUD Dok II Jayapura pada tahun 2013. Sebanyak 13 di antaranya belum pernah menerima arv. Sampel yang terkumpul diekstraksi RNA-nya menggunakan teknik filtrasi membran di Laboratorium Biologi Molekuler Balai Litbang Biomedis Papua. Primer yang digunakan telah dirancang secara khusus
untuk
mengamplifikasi
DNA
daerah
rt secara spesifik Amplifikasi telah dilakukan
menggunakan sepasang primer RNA dikonversi menjadi cDNA dengan teknik transkripsi balik dengan menginkubasi reaksi pada suhu 50°C selama 30 menit dan inaktivasi dilakukan pada 95°C selama 5 menit. Amplifikasi dilakukan pada kondisi 35 x (95°C, 1 menit denaturasi awal, 53°C. 1 menit penempelan primer; 72 CC, 1 menit elongasi), 72 CC, 7 menit elongasi akhir Penentuan urutan nukleotida daerah r/HIV dilakukan dengan sekuenser yang protokolnya disesuaikan
viii
dengan protokol alat yang tersedia di Laboratorium Bioteknologi BPPT, Serpong. Hasil sekuensing dianalisis resistensinya secara /// si/ico menggunakan program Stanford HI\' Drug Resistance
Interpretation Mutasi dengan motif Ml84V, Y115F. dan K70R yang terkait resistensi arv muncul pada 3 sampel subyek yang menerima arv, 2 di antaranya terinfeksi HIV yang termutasi pada 2 titik, yaitu M184V. dan VI15F. Mutasi dengan motif M41L, dan D67E teridentifikasi pada I subyek yang tidak menerima arv Polimorfisme VI061 teridentifkasi pada I subyek yang juga tidak menerima arv.
ix
ABSTRAK
Pemberian antiretroviral (arv) golongan penghambat Reverse Transcriptase! Reverse Transcriptase Inhibitor (RT1) terbukti mampu meningkatkan kualitas hidup penderita HIV dan AIDS. Hasil penelitian menyatakan bahwa RT1 memberikan harapan dalam penanggulangan infeksi retrovirus karena kemampuannya menurunkan jumlah virus di dalam plasma Namun penelitian-penelitian juga menunjukkan adanya mutasi terkait resistensi virus yang terpapar RTI baik secara in vitro maupun in
vivo. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh data mutasi yang terjadi pada virus yang menginfeksi subyek ODHA di Jayapura. RNA HIV-1 diperoleh dari sampel plasma subyek ODHA di Jayapura. RNA HIV-1 diinkubasi pada 50°C selama 30 menit dengan enzim RT dari SSIII invitrogen untuk memperoleh complementary DNA (cDNA). Fragmen DNA n HIV diperoleh dengan menambahkan 25ul
Green RC R ready mix ke dalam larutan berisi cDNA. Reaksi PC R dilakukan pada kondisi 95°C, 4 menit. 35x (95°C\ 1 menit; 53°C, 1 menit; 72°C, 1 menit); 72°C, 7 menit. Mutasi dengan motif Ml 84V, Y115F, dan K70R yang terkait resistensi arv teridentifikasi pada 3 sampel subyek yang menerima arv Mutasi dengan motif M4IL, dan D67E teridentifikasi pada I subyek yang tidak menerima arv. Polimorfisme VI061 teridentifkasi pada I subyek yang juga tidak menerima arv
Kata Kunci: Antiretroviral, Mutasi, Resisten, reverse transcriptase HIV-1
x
ABSTRACT
Antiretroviral therapy, especially Reverse Transcriptase Inhibitor (RTI) has been proven to increase the quality of life of people living with Hl\ and AIDS. Studies have shown that RTI provides possibilities in reducing retroviral evading since us ability to decrease the viral load in blood plasma. However, recent studies also have shown the incidence of mutation associated to RTI in vitro and in vivo. This studies was conducted to obtain the data of mutation occur in HI]'-1 derived from people living with AIDS in Jayapura. The RNA was extracted from blood plasma and incubated with on 50°C for 30 minutes with using RT enzyme from SSI 11 invitrogen to obtain complementary DNA (cDNA). DNA fragment encoding rtHIl' was obtained by adding 25ul Green PCR ready mix into cDNA solution. PCR was programmed on 95 ° ( - 4 minutes, 35x (95°C, I minute; 53°C, I minute; 72°C, I minute); 72°C, 7 minutes. Mutation M184 V, YII5F, and K70R were identified on 3 subject taking arv. Mutation M41L, and D67E were identified on I arv naive subject. Polymorphism VI06 was
identified on / arv naive subject. Keywords: Antiretroviral, Mutation, Resistant, reverse transcriptase HIV-1
xi
DAFTAR ISI
JUDUL PENELITIAN ........................................................................................................................................ i SK PENELITIAN ............................................................................................................................................. ii SUSUNAN TIM PENELITI ................................................................................................................................ iii PERSETUJUAN ETIK ...................................................................................................................... , ............... v PERSETUJUAN ATASAN ................................................................................................................................. vi KATA PENGANTAR ........................................................................................................................................ vii RINGKASAN EKSEKUTIF ................................................................................................................................ viii ABSTRAK ....................................................................................................................................................... x ABSTRACT ..................................................................................................................................................... xi DAFTAR ISI ..................................................................................................................................................... xii D.AFTAR TABEL ............................................................................................................................................. xiv DAFTAR GAMBAR .........................................................................................................................................
xv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................................................................... xvi
BAB I
PENDAHULUAN .............................................................................................................................. 1
A
Latar Belakang ................................................................................................................................... 1
* B Perumusan Masalah* ...................................................................................... ; ...................................
3
C
Tujuan Penelitian.. .........................................................................................................................
3
D
Manfaat Penelitian..........................................................................................................................
3
BAB II
METODE PENELITIAN ........................................................................................................................ 4
A
Kerangka konsep ........................................................................................................................... .. 4
B
Jenis dan desain penelitian.. ............................................................................................................
4
C
Tempat dan waktu penelitian ..........................................................................................................
4
D
Populasi dan Sampling ....................................................................................................................
5
*
E
Bahan dan prosedur pengumpulan data ...........................................................................................
5
F
Pengolahan dan analisis data .........................................................................................................
9
BAB III
HASIL ............................................................................................................................................. 10
BAB IV
PEMBAHASAN ................................................................................................................................ 15
BAB V
KESIMPULAN ...............................................................................................................................
A
Kesimpulan ...............................................................................................................................
xii
20 20
B Saran ............................................................................................................................................................... 20 DAFTAR KEPUSTAKAAN ......................................................................................................................... 21 LAMPIRAN .................................................................................................................................................................... 24
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar I Kerangka Konsep Penelitian ......................................................................................................................... 4 Gambar 2. Elektroforegram Hasil Elektroforesis Optimalisasi PCR cDNA rt HIV-1 ................................................... 10 Gambar 3. Elektroforegram Hasil Elektroforesis rl HIV-1 .......................................................................................... 11 Gambar 4. Hasil Pensejajaran rt HIV-1 ....................................................................................................... ; ............... 13
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I Motif Mutasi yang Muncul pada Subyek Penelitian ........................................................................................ 14
XV
DAFTAR LAMPIRAN
Data Subyek Penelitian ................................................................................................................................................. 24 Hasil Analisis Data Mutan HIV-1 .................................................................................................................................. 25
xvi
BAB I. PENDAHULUAN A Latar belakang Penemuan
antiretroviral
(ARV)
memberikan
harapan
dalam
penanggulangan
Human
Immunodeficiency Virus tipe I(HIV-I) Pada dasarnya ARV bekerja dengan menurunkan jumlah virus di dalam plasma hingga mencapai angka dibawah ambang batas deteksi dan jumlah sel CD4 meningkat ARV yang sudah umum digunakan sebagai terapi lini pertama adalah inhibitor rtase Obat-obat ini terbagi ke dalam 2 kelompok obat, yaitu Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitor (NRT1) seperti lamivudine (3TC), Tenofovir Disoproxil Fumarate (TDF), zidovudine (ZDV/ AZT)), stavudine (d4T), abacavir (ABC), emtricitabine (FTC). Golongan lainnya adalah Non Nucleoside
Reverse Transcriptase Inhibitor (NNRTI) seperti nevirapin (NVP) dan Efavirenz (EFV)
1
Di VCT yang
terdapat di Jayapura, ARV yang biasa diberikan kepada pasien adalah 3TC, EFV, dan TDF. Penurunan tingkat replikasi HIV di dalam darah harus berkesinambungan dan tahan lama sehingga pasien bisa mengalami perbaikan sistem pertahanan tubuh. Hal itu bisa dicapai dengan penggunaan obat-obatan yang poten dan program pengobatan yang harus dipatuhi pasien. Kepatuhan pasien penting untuk mengurangi tingkat resistensi virus terhadap obat dan penyebaran HIV galur mutan Pemberian ARV pada penderita biasanya dilakukan berupa kombinasi ARV untuk mengurangi tingkat resistansi virus terhadap ARV. Resistensi virus terhadap ARV terjadi karena adanya mutasi pada titik tertentu pada DNA virus sehingga terjadi perubahan asam amino ' Mutasi adalah perubahan DNA pada gen atau kromosom yang dapat diturunkan. Mutasi terkait resistensi obat adalah mutasi yang menyebabkan perubahan DNA pada patogen yang dijadikan target pengobatan sehingga karakternya berubah dan tidak dikenali lagi oleh obat. Mutasi yang terkait resistensi HTV terhadap ARV golongan NRTI adalah M41 L, E44A/D, A62/V, K65R, D67N, T69D/G/N, T69 insertions, K70R,L74V, V75IA/M/S/T, Y115F, F116Y, VI181, Q151M. MI84V/I, L210W,T215F/Y, dan K219Q/N/E. Mutasi yang terkait resistensi HIV terhadap ARV golongan NNRTI adalah A98G, L1001, K101E/Q, K103N.V106A/I, VI081, V179D/E, Y181C/I, Y188L/C/H, G190A/S/E/T, P225H.M230L, and P236L/
1
Selain menyebabkan resistensi virus terhadap arv, mutasi juga dapat mengubah karakter RT pada virus Menurut penelitian yang dilakukan oleh Dunn pada tahun 2013, mutasi pada rt menurunkan kerentanan RT virus terhadap enzim protease (PR), yang memotong poliprotein polimerase menjadi enzim tunggal pada suhu 37°C yang merupakan suhu umum tubuh manusia Hal tersebut dapat terjadi karena PR memotong RT pada sisi vang salah, atau karena terjadi kesalahan dalam pembentukan lipatan PR sehingga membentuk konformasi yang tidak normal. Menurunnya kerentanan RT terhadap pemotongan oleh PR berakibat menurunnya aktifitas RT dalam pembentukan pregenonuk virus. 4 Mutasi yang kerap terjadi pada subvek ODHA adalah mutasi selektif karena pemberian senyawa 3TC. Mutasi tersebut adalah mutasi yang menyebabkan metionin di kodon posisi 184 berubah menjadi valin (M184V) Perubahan tersebut menyebabkan kerentanan virus terhadap 3TC menurun Terapi menggunakan 3TC juga ternyata dapat membatasi penggunaan ARV dari golongan serupa kedepannva. Hal ini terlihat dan uji resistensi HIV terhadap 3TC yang dilakukan oleh Miller
et al pada tahun 1998 yang menunjukkan bahwa mutasi yang menyebabkan resistensi HIV terhadap 3TC juga memicu resistensi HTV terhadap abacavir, emtricitabine, dan didanosine.1 Hasil penelitian yang dilakukan oleh Bansode di distrik Karonga. Malawi pada tahun 2011 menunjukkan tingginya tingkat mutasi terkait resistensi terhadap inhibitor rtase. Dari 75 individu yang darahnya diambil, 15 orang ditemukan membawa HIV yang resisten terhadap ARV. Resistensi tersebut dikaitkan dengan mutasi yang terjadi pada kodon 118 dimana kodon pengkode valin berubah menjadi isoleucin sehingga membentuk motif VI181. Mutasi yang lain adalah Y181C dan G190A/E, K103K/N, Y181N/Y, VI901/V, dan H221H/Y Berdasarkan database resistensi obat Stanford, mutasi G190A menyebabkan tingkat resistensi yang tinggi terhadap EFV ' Menurut data yang diperoleh dari database resistensi obat HIV Stanford, mutasi terkait resistensi terhadap TDF adalah K65R. Y115F, M41L. K70R. L210W, T215Y/F, T69 insersi, Q151M.6 Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wainberg pada tahun 1998. motif K65R terjadi secara selektif saat HIV-1 dikultur bersama TDF yang konsentrasinya dinaikkan Penelitian lain yang dilakukan oleh Rhee pada tahun 2006 menunjukkan
2
bahwa keberadaan K65R menurunkan efikasi TDF sekitar 2 kali saat diukur menggunakan uji PhenoSense
s
Penelitian ini akan berfokus pada mutasi terkait resistensi yang terjadi pada DNA daerah rtase HIV dengan mengacu pada data-data penelitian terdahulu yang telah dipublikasikan Pengujian resistensi HIV terhadap inhibitor rtase tidak dilakukan baik secara in vitro maupun in vivo Dengan diperolehnya data mutasi pada DNA daerah rtase HIV, maka dapat ditentukan apakah ARV dan kombinasinya yang telah digunakan di VCT di Jayapura masih efektif bagi penderita HIV/AIDS di Jayapura
B Perumusan Masalah Penelitian ini dilakukan oleh karena tingginya kasus HIV/AIDS di Jayapura, dan belum pemah dilakukan penelitian tentang menurunnya efektivitas arv.
C Tujuan penelitian
1. Tujuan l'mum Mengidentifikasi terjadinya mutasi di fragmen DNA pengkode rt HIV-1
2. Tujuan Khusus Merancang primer yang akan digunakan untuk amplifikasi fragmen DNA /vHIV, -
Mengamplifikasi fragmen DNA / /HIV, Menganalisis ada atau tidaknya mutasi terkait resistensi pada amplikon yang diperoleh
D Manfaat penelitian Data yang diperoleh dan hasil penentuan urutan nukleotida dapat memberikan informasi mengenai rentan atau resistennya HIV terhadap inhibitor rt. Informasi tersebut akan membantu petugas kesehatan untuk menentukan apakah pemberian inhibitor rt masih dapat diberikan kepada penderita.
3
BAB II. METODE PENELITIAN
A Kerangka konsep
Penelitian berfokus pada kondisi amplifikasi fragmen DNA /7 HIV untuk mengidentifikasi mutasi terkait resistensi HIV terhadap 3TC, EFV, dan TDF berdasarkan data-data yang sudah dipublikasi.
B Desain penelitian Penelitian ini adalah laboratorik noneksperimental dan potong lintang dimana fragmen DNA /7 yang diperoleh diobservasi untuk mengidentifikasi ada atau tidaknya mutasi terkait resistensi HJV terhadap inhibitor RT
C.
Tempat dan waktu Teknis penelitian dan analisis data hasil sekuensing dilakukan di Laboratorium Biologi molekuler Balai Penelitian dan Pengembangan Biomedis Papua di Jayapura dalam kurun waktu 8 bulan pada tahun 2014. Sekuensing akan dilakukan di laboratorium bioteknologi Balai Pengkajian dan Penerapan Teknologi, Serpong.
4
D. Populasi dan sampling Sampel yang digunakan adalah 50 plasma penderita ODHA yang telah dikumpulkan pada tahun 2013 untuk penelitian mengidentifikasi mutasi fragmen DNA pengkode integrase HIV-1 pada pasien ODHA di Jayapura Sebanyak 13 di antaranya belum menerima arv, dan 37 sampel subyek telah menerima arv golongan inhibitor RT.
E Bahan dan prosedur pengumpulan data Persiapan Penelitian a.
Perancangan primer spesifik untuk daerah rt HIV Primer dirancang secara manual dan dikonfirmasi menggunakan beberapa perangkat lunak
hingga diperoleh primer yang benar dan spesifik untuk mengidentifikasi mutasi mayoritas pada daerah rt HIV Perancangan primer dilakukan pada daerah terpelihara di bagian hulu dan hilir fragmen DNA Rt untuk memperoleh gambaran mutasi terkait resistensi secara keseluruhan. Sekuen acuan yang digunakan dalam perancangan primer adalah AY586544.2, AY180905.1, AY162225.1, AY16223.1, AF530576.1, KC990126.1, U46016.1, A Y3 22187.1, dan AY167123.1.
b Ekstraksi RNA virus dan sampel plasma darah. RNA virus diekstraksi dari plasma darah menggunakan kit ekstraksi Qiagen viral RNA minikit dengan menerapkan metode ultrasensitive, 9 sehingga diperoleh RNA virus yang murni dan dengan konsentrasi tinggi. Pemisahan RNA dan debris dilakukan menggunakan teknik filtrasi membrane dengan langkah-langkah sebagai berikut:
1.
Sejumlah 500ul plasma disentrifugasi 14.000rpm selama 1 jam pada 4°C. Buang sebanyak 450ul supematan sehingga tersisa 50ul plasma mengandung pellet konsentrat.
2.
Sebanyak 560ul larutan pelisis AVL+5,6ul RNAcarrier ditambahkan ke dalam tabung sampel, vortex selama 15 detik, inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Lalu
5
sebanyak 560ul etanol absolut ditambahkan ke dalam tabung sampel, lalu dihomogenkan dengan vortex selama 15 detik 3.
Kolom silica diletakkan di dalam tabung penampung (2 ml) dan 630 ul sampel ditambahkan ke dalamnya. Lalu tabung disentrifuga selama 1 menit dengan kecepatan 8000 x g. Cairan tertampung dibuang, lalu diulangi pada sisa sampel.
4
Kolom silika dicuci menggunakan 500ul dapar AW1 dan disentrifuga selama 1 menit dengan kecepatan 8 OOOrpm, lalu cairan yang tertampung dibuang.
5.
Pencucian kolom diulangi menggunakan dapar AW2 sebanyak 500ul, lalu disentrifuga selama 3 menit pada kecepatan I3.000rpm Cairan yang tertampung dibuang, dan tabung penampung diganti.
6.
Kolom disentrifuga lagi selama 1 menit pada 13.OOOrpm untuk menghilangkan residu etanol.
7 Kolom silika diletakkan ke dalam tabung microcentrifitge baru (1,5 ml) steril Lalu 50 ul dapar AVE yang sudah dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 70°C ditambahkan tepat di tengah membran silika. Lalu kolom diinkubasi selama 1 menit, lalu disentrifuga selama 1 menit dengan kecepatan 13.OOOrpm.
c. Sintesis cDNA Sintesis cDNA dilakukan menggunakan sepasang primer spesifik yang dirancang, untuk penelitian ini. Reaksi sintesis cDNA dilakukan dengan metode transkripsi balik dengan tahapan sebagai berikut: 1.
Campuran berisi lOuM dNTP, 0,5uM pRTHTVF, 0,5uM pRTHIVR, 200ng templat RNA, dan 5U enzim MuLV RT dari qiagen one step RT-PCR dibuat di dalam tabung 200ul.
2.
Reaksi transkripsi balik dilakukan dengan menginkubasi tabung reaksi pada suhu 50°C selama 30 menit.
3.
Enzim MuLV RT dinonaktifkan dengan menginkubasi tabung reaksi pada suhu 95°C selama 15 menit.
4.
Reaksi dihentikan dan dilanjutkan dengan proses amplifikasi dengan teknik PCR Reaksi PCR dilakukan menggunakan 2 jenis enzim polimerase, yaitu
6
polimerase Taq pada kit campuran siap pakai green PC R, dan polimerase phnsion
high fidelity. a Reaksi PCR yang dilakukan dengan menambahkan 25ul Green PCR ready mix ke dalam larutan berisi cDNA dan reaksi transkripsi balik. Reaksi PCR dilakukan pada kondisi 95°C, 4 menit, 35x (95°C, 1 menit; 53°C, I niemt; 72°C. 1 menit); 72°C, 7 menit b Reaksi PCR yang dilakukan menggunakan polimerase phnsion high fidelity terdiri atas komponen produk cDNA hasil transkripsi balik sebanyak 2ul, 5x dapar HF, pRTHlVF 0,4uM, pRTHlVR 0,4uM, enzim polimerase phnsion high fidelity 0,5U Reaksi PCR dilakukan pada program 95°C, 10 detik; 35x(95°C, 10 detik; 63°C, 30 detik, 72°C, 45 detik), 72°C, 7 menit. d Elektroforesis produk PCR dan pemurniannya Produk PCR selanjutnya dikarakterisasi dengan metode analisis migrasi pada gel agarosa 1% dengan langkah-langkah sebagai berikut: 1.
Agarosa dibuat dengan melarutkan serbuk agarosa pada larutan TAE IX melalui pemanasan hingga larutan menjadi bening.
2.
Etidium Bromida (EtBr) ditambahkan pada larutan agarosa dengan konsentrasi 1% dan diaduk hingga homogen.
3.
Larutan agarosa lalu dituang ke dalam cetakan sehingga membentuk gel padat dengan sumur-sumur di dalamnya.
4.
Gel dimasukkan ke dalam tanki elektroforesis yang berisi dapar TAE IX. Produk PCR dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel sesuai dengan kode sampelnya. Lalu alat dijalankan selama 60 menit pada 75mV.
5.
Selanjutnya gel dianalisa menggunakan UV transluminator, dan didokumentasikan.
6.
Fragmen DNA yang terlihat berupa pita terang dipotong dari gel dan dipindahkan ke tabung mikro l,5ml.
7
DNA selanjutnya dimurnikan dari gel menggunakan kit Promega SV w izard PCR clean
up dengan menambahkan lOul dapar pengikat ke dalam setiap lOOmg potongan gel agarosa.
7
8.
Larutan diinkubasi pada suhu 65°C selama 10 menit sambil digoyang bolak- balik Setelah terlarut sempurna, larutan agar diinkubasi di suhu ruang selama 10 menit, lalu dipindahkan ke kolom pengikat DNA dan disentnfugasi 13.000rpm selama 1 menit. Cairan tertampung dibuang.
9.
Sebanyak 700ul dapar pencuci yang mengandung etanol ditambahkan ke dalam kolom dan disentnfugasi 13.000rpm selama 1 menit. Cairan tertampung dibuang dan tabung disentnfugasi I3.000rpm selama 3 menit untuk membuang residu etanol pada sampel.
10. Sebanyak 40ul air bebas RNAse ditambahkan pada kolom dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang Selanjutnya kolom dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga baru dan steril, lalu disentnfugasi 13.000rpm selama 1 menit untuk mengelusi DNA pada kolom Larutan DNA selanjurnya digunakan untuk sekuensing. e. Sekuensing DNA Penentuan urutan nukleotida daerah rt HIV dilakukan dengan sekuenser yang protokolnya disesuaikan dengan protokol alat yang tersedia di Laboratorium Bioteknologi BPPT, Serpong dengan langkah-langkah sebagai berikut: 1.
Produk PCR dimurnikan dengan cara mengambil 2ul reaction mix dan ditambahkan 50ng produk PCR sesuai dengan perlakuan yaitu 1,5 ul (perlakuan Ong) dan 0,75 ul (perlakuan dilusi), dimasukkan ke dalam tabung mikro yang telah dilabel, kemudian ditutup rapat.
2.
Reaksi dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan spin down. Lalu tabung mikro dimasukkan ke dalam mesin thermal cycler (PCR) yang telah dinyalakan kira-kira 15 menit sebelumnya dan semua tabung dipastikan tertutup rapat.
3.
Amplifikasi dilakukan menggunakan PCR dengan protokol yang terdaftar pada alat. Setelah proses amplifikasi selesai, sebanyak 60ul isopropanol 75% ditambahkan kedalam masing-masing tabung, lalu tabung ditutup dan diinkubasi pada suhu 4°C selama 15 menit.
4.
Tabung disentrifuga selama 15 menit dengan kecepatan maksimum, kemudian supernatant dibuang pada kertas tissue tanpa serat.
8
5.
Sebanyak 60 ul ethanol 70% ditambahkan ke dalam masing-masing tabung kemudian disentrifuga kembali dengan kecepatan maksimum. Lalu supernatant dibuang pada tissue, dan dikeringkan di depan kipas angin kurang lebih 60 menit hingga bau alkohol tidak tercium.
6
Setelah kering, molecular grade water sebanyak 10 ul ditambahkan ke dalam masingmasing tabung, kemudian dihomogenkan dengan vortex, dan masing - masing tabung dispin down sekitar 30 detik Produk dimasukkan ke dalam sequencing plate yang telah disediakan tutup dengan septa
F Pengolahan dan analisis data Hasil
sekuensing
berupa
peak
urutan
nukleotida
dianalisis
dengan
menguji
tingkat
homologinya terhadap data yang tersedia di genbank Fragmen DNA yang terkonfirmasi r/HIV diidentifikasi mutasinya menggunakan aplikasi HIVdb mutation mtepretation pada situs jaringan Setiap sampel
yang teridentifikasi
mutan terkait
resistensi dirujuk kembali kepada sekuen nukleotidanya untuk memastikan kebenaran mutasi
9
BAB III. HASIL
Primer dirancang secara manual untuk mengenali fragmen DNA /vHlV secara spesifik pada posisi 1839 - 2569 pada genom lengkap HIV-1 hingga menghasilkan produk PCR sepanjang 730 pb. Urutan primer yang digunakan adalah Prthivf 5’- TGTAC AG AG AT GGA A A AGG A AGGG A A-3 ’ dan Prthivr 5-CCTCT AAGGAGTTT AC AT AATT GccttA-3’ Nukleotida primer dikonfirmasi dengan mensejajarkannya menggunakan Basic Local Alignment Search Tool pada situs jaringan tip
nci n n
menunjukkan homologi 100% dengan fragmen DNA Rtyang dideposit di genbank Materi genetik HIV berupa RNA diekstraksi dari 50 sampel yang dikumpulkan dalam penelitian riset binaan kesehatan berjudul Deteksi Mutasi Fragmen DNA pengkode Integrase HIV-1 pada Subyek ODHA di Jayapura pada tahun 2013. RNA dari 3 sampel plasma yang diperoleh digunakan sebagai cetakan untuk optimalisasi PCR untuk memperoleh fragmen DNA /vHIV-1 yaitu sample 60121264, 60121266 dan 60121270. Hasil PCR paling optimal diperoleh dan teknik RT-PCR 2 langkah dimana sintesis cDNA dilakukan terlebih dahulu menggunakan enzim RT yang tersedia di kit qiagen RT-PCR I langkah, dan dilanjutkan dengan langkah kedua yaitu amplifikasi menggunakan polimerase Taq yang terdapat di campuran siap pakai green PCR.
Gambar 2. Elektroforegram hasil elektroforesis optimalisasi PCR DNA rt HIV-1 M = Marker DNA lOOpb; K1264 = Kontrol (/mHlV) sampel 60121264; S1264 = /yHIV sampel 60121264;
10
dan
K1266 = Kontrol (WJ/HIV) sampel 60121266; S1266 = //HIV sampel 60121266; K1270 = Kontrol (/w/HIV) sampel 60121270; S1270 = /vHIV sampel 60121270. (-) = Kontrol negatif.
Percobaan RT-PCR menggunakan enzim RT yang tersedia di kit transkripsi balik, dan diikuti dengan penambahan polimerase Taq yang terdapat di campuran siap pakai green PCR tidak memberikan hasil yang diharapkan Percobaan lain juga dilakukan menggunakan metode transkripsi balik yang sama, namun amplifikasi dilakukan menggunakan enzim phusion high fidelity untuk menurunkan kemungkinan kesalahan dalam memasangkan nukleotida saat polimerisasi dilakukan untuk membandingkan hasilnya dengan produk PCR dari campuran siap pakai green PCR Elektroforegram hasil elektroforesis DNA menunjukkan pita DNA yang hampir sejajar dengan marker DNA berukuran 800 pb (gambar 2), dimana produk PCR hasil polimerisasi menggunakan polimerase phusion berukuran lebih besar dibandingkan produk PCR hasil dan green PCR
Fragmen yang diperoleh selanjutnya dieksisi dan gel agarosa untuk dimurnikan. Fragmen DNA yang telah murni dikarakterisasi urutan nukleotidanya dengan teknik sekuensing Hasil sekuensing menunjukkan bahwa fragmen DNA yang diperoleh memiliki
11
tingkat homologi yang tinggi dengan rt HIY-I yang dideposit di genbank namun terdapat perbedaan urutan nukleotida pada beberapa titik (gambar 3). Melalui hasil ini, kit polimerase Taq dan green PCR dipilih untuk pengerjaan sejumlah 48 sampel. Hasil identifikasi mutasi pada sampel 601264 baik menggunakan enzim polimerase green PCR maupun polimerase phusion ternyata membawa motif mutasi yang sama, yaitu VI 061
12
Prosedur transkripsi balik, dan amplifikasi fragmen DNA rt menggunakan kit Oiagen RT-PCR I langkah untuk transkripsi balik, dan kit campuran siap pakai green PCR untuk amplifikasi fragmen DNA rt HIV diterapkan terhadap 48 sampel. Seluruh sampel dimurnikan dari gel untuk disekuensing. Sejumlah 50 sampel disekuensing, dan 14 diantaranya disekuensing 2 arah untuk mengonfirmasi mutasi yang terjadi dan sebanyak 5 sampel dikonfirmasi sebagai mutan seperti yang terlihat pada tabel 1. Mutasi yang paling sering muncul adalah mutasi yang menyebabkan perubahan metiomn pada asam amino 184 menjadi valin atau leucine yang membentuk motif Ml84V atau M184L Mutan M184V menyebabkan resistensi tingkat tinggi terhadap 3TC dan FTC, dan resistensi tingkat rendah terhadap DDI dan ABC. Mutasi dengan motif Y115F muncul pada 2 sampel subyek bersamaan dengan mutan M184V. Kombinasi mutasi tersebut mengakibatkan tingginya resistensi terhadap 3TC, namun masih dapat menjalani terapi dengan AZT dan atau D4T Mutan K70R muncul hanya sekali »
pada 1 sampel subyek yang menerima kombinasi arv D4T dan EFV. Subyek tersebut masih dapat melanjutkan terapi dengan kombinasi arv yang sama. Mutasi juga muncul pada 2 subyek yang tidak menerima arv di mana salah satunya membawa HIV-1 resisten tingkat rendah terhadap beberapa jenis NRT1. namun masih rentan terhadap 3TC dan FTC serta arv golongan NNRTI Pemberian kombinasi arv mengandung
13
3TC dan FTC dapat dipertimbangkan untuk terapi arv pada subyek tersebut. Subyek lainnya mengalami mutasi alami berupa polimorfisme VI061 yang tidak memberikan pengaruh nyata terhadap resistensi arv. Tabel 1 Motif mutasi yang muncul pada sampel subyek penelitian Mutan motif Ml 84V dan Y i 15F muncul pada 2 sampel subyek
No
Kotle Sampel
Jenis Kelamin (P/L)
Usia (tahun)
ARV/ Lama terapi
1.
601229
P
26
TDF, 3TC 6 Y115F MI84V bulan
2
601 243
P
23
Motif Mutasi
Status Mutasi terhadap an
NRTI Lamivudine (3TC)
Resistensi tingkat tinggi
Abacavir (ABC)
Resistensi intermediet Rentan
Zidovudine (AZT)
Rentan
Stavudine (D4T)
: Resistensi tingkat rendah :
Didanosine (DDI)
Resistensi tingkat tinggi
Emtricitabine (FTC) Tenofovir (TDF)
: Resistensi intermediet
Du\i, Nevi 3 K70R
NRTI
bulan
Lamivudine (3TC)
: Resistensi intermediet : Rentan :
Abacavir (ABC)
Rentan : Rentan : Rentan Rentan :
Zidowdme (AZT)
Tidak ada data
: Rentan : Renlan
Stavudine (D4T) Didanosine (DDI) Emtricitabine (FTC) Tenofov ir (TDF) Efavirenz (EFV) Duviral (Duvi) 3.
601250
L
56
Duvi. Nevi 2 Y115F M184V tahun
Lamivudine (3TC)
: Resistensi tingkat tinggi
Abacavir (ABC)
Resistensi intermediet : Rentan :
Zidovudine (AZT)
Rentan
Stavudine (D4T)
: Resistensi tingkat rendah :
Didanosine (DDI)
Rentan Resistensi intermediet
Emtricitabine (FTC)
Rentan
Tenofovir (TDF)
: Tidak ada data
Nevirafme Duviral (Duvi) 4.
601253
P
30
M41L D67E
f
Lamivudine (3TC) Abacavir
: Rentan
(AZT)
Resistensi tingkat rendali :
Stavudine (D4T) Didanosine
Resistensi tingkat rendah
(ABC)
(DDI)
Zidovudine
Emtricitabine
Tenofov ir (TDF)
(FTC)
Resistensi tingkat rendah Resistensi tmgkat rendah : Rentan Resistensi tmgkat rendah
5.
601264
L
27
*
VI061
Polimorfisme, tidak ada efek terhadap resistensi
14
BAB IV. PEMBAHASAN
Replikasi HTV-1 rawan kesalahan sehingga mengakibatkan variasi genetik Variasi genetik penting bagi virus untuk meloloskan diri dan sistem imun mang, dan juga untuk penyebaran varian resisten obat. Ada 3 tahap pada siklus hidup virus di mana mutasi dapat terjadi, pertama saat sel terinfeksi membelah, bentuk proviral genom virus disalin oleh mesin replikasi DNA sel mang. Kedua, saat virus diproduksi oleh sel terinfeksi, genom RNA virus dihasilkan oleh RNA polimerase mang. Ketiga, saat virus menginfeksi sel inang, RT inang mengubah genom RNA virus menjadi DNA Secara keseluruhan, tingkat kesalahan proses- proses tersebut relatif tinggi, yaitu sekitar 10 pasang basa dalam 1 kali siklus replikasi
11
1
kesalahan per
'l“ Tingginya variasi sekuens HIV-1 tidak hanya terjadi di
antara individu virus tersebut, tapi juga pada subyek terinfeksi Variasi tersebut dapat terlihat juga pada subyek yang menunjukkan temvata seorang subyek terinfeksi hanya 1 jenis virus, hal ini menunjukkan bahwa keragaman dari sekuens virus umumnya terjadi setelah pasien terinfeksi Meskipun alasan utama keragaman virus yang tinggi ini adalah karena banyaknya sel yang terinfeksi, dan cepatnya pergantian sel terinfeksi, mutasi yang muncul selama siklus hidup virus adalah sumber utama keragaman virus. 11 12 RT yang dikode oleh virus adalah komponen penting yang diperlukan untuk replikasinya, dimana aktivitas tersebut adalah agen etiologi Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS. Enzim RT memiliki 3 situs katalitik yang menyebabkan RT mampu mengubah genom RNA virus menjadi cDNA Namun demikian, RT merupakan enzim polimerase yang memiliki akurasi yang paling rendah sehingga mudah menyebabkan mutasi. Uji akurasi yang dilakukan pada 3 enzim RT rekombinan menunjukkan bahwa RT HIV-1 memiliki tingkat kesalahan yang paling tinggi, yaitu I di dalam 1700 nukleotida yang termkorporasi, sementara enzim RT dengan akurasi tertinggi adalah RT Moloney Leukemia Virus (MLV), yaitu 1 di dalam 30.000 nukleotida yang termkorporasi 1' Variasi sekuens genom HIV-1 yang cukup tinggi tersebut menjadi tantangan tersendiri dalam merancang primer dalam mendapatkan desain yang tepat untuk mengamplifikasi n seluruh subtipe HTV-1. Untuk itu. perwakilan sekuen n dari seluruh subtipe dikumpulkan dan disejajarkan menggunakan alat perangkat lunak clustalW untuk melihat tingkat homologi sekuens dan posisi nukleotida dengan homologi tertinggi. Selanjutnya primer dirancang di
15
daerah yang paling tinggi tingkat homologinya dengan memperhatikan panjang oligonukleotida. suhu titik
lebur
oligonukleotida,
kemungkinan
pembentukan
konformasi
sekunder,
kemungkinan
pembentukan dimer primer, dan kemungkinan misprinting. Perbanyakan DNA rt HIV-1 selanjutnya dilakukan dengan teknik PCR pada suhu penempelan primer 53°C PCR tidak dilakukan secara nested untuk menghindari munculnya mutasi karena kesalahan inkorporasi dNTP pada saat polimerisasi oleh polimerase Taq. Optimalisasi perbanyakan DNA rt dilakukan menggunakan 2 jenis enzim polimerase, yaitu pfii dan Tat/. Meskipun polimerase pfn memiliki aktifitas proofreading di mana kesalahan polimerisasi dapat diperbaiki, namun penyisipan fragmen DNA yang cukup panjang dapat mengganggu analisis mutasi di bagian tersebut Belum diketahui mengapa penambahan basa yang cukupa banyak dapat terjadi pada proses PCR Untuk menghindari kerancuan dalam analisis data sekuensing dan interpretasi data mutasi, polimerase Taq dipilih untuk digunakan dalam proses polimerisasi fragmen DNA. Sebagai kompensasi dari tidak adanya aktifitas proofreading pada polimerase Taq, sampel yang teridentifikasi mutan resisten arv disekuensing 2 arah untuk memastikan kesamaan data. Penelitian ini menggambarkan ada atau tidaknya mutasi yang terjadi pada sample subyek yang diidentifikasi. Subyek penelitian ini adalah pasien HIV' yang menerima arv dan yang tidak. Arv yang diberikan pada pasien adalah kombinasi TDF+3TC+EFV, TDF+3TC+NVP. D4T+TDF, dan D4T+EFV (tabel 2) Pengobatan pasien terinfeksi HIV dilakukan dengan pemberian kombinasi 2 atau 3 arv dengan alasan untuk menurunkan laju mutasi yang dapat menyebabkan munculnya mutasi, dan memperpanjang penggunaan obat. Kontribusi arv dalam menurunkan jumlah muatan virus di dalam darah pasien memang sangat membantu dalam meningkatkan kesehatan dan kualitas hidup pasien HTV. Arv yang digunakan pada subyek penelitian adalah golongan inhibitor RT yang memang merupakan target ideal obat. Jika virus tidak menyelesaikan tahap transkripsi balik yang difasilitasi oleh RT, maka kompleks preintegrasi tidak akan mungkin terbentuk sehingga virus tidak dapat memperbanyak diri Dengan ketaatan yang baik dalam terapi, arv dapat menekan penumbuhan virus hingga puluhan tahun walaupun tidak dapat mengeliminasi virus tersebut " Pada penelitian ini. sebanyak 50 sampel subyek diidentifikasi keberadaan mutasinya Sejumlah 37 sampel adalah subyek yang menerima arv golongan NRTI dan NNRTI, dan sejumlah 13 sampel adalah subyek yang tidak menerima arv sama sekali. Hasil identifikasi
16
menunjukkan 5 subyek terinfeksi HIV-1 yang termutasi dan terkait dengan resistensi arv dengan mutasi yang muncul pada 2 sample subyek adalah M1841. yaitu yang merupakan mutasi substitusi. Mutasi ini melibatkan mekanisme peningkatan dalam membedakan dN'TP normal dari analog nukleotida pada saat NRT1-TP bennkorporasi, dimana RT memilih untuk mengurangi mkorporasi 3TC dan FTC oleh steric hindrance. 1'10 MI84V secara selektif terjadi pada HIV-1 galur murni yang terpapar arv jenis 3TC. Hal ini terlihat pada penelitian yang dilakukan oleh Petrella pada tahun 2004 yang menunjukkan bahwa HIV -1 galur murni yang ditumbuhkan dalam sel mengalami mutasi substitusi seiring peningkatan konsentrasi 3TC. M184V juga berkaitan dengan beberapa perubahan fungsi enzim RT secara in vitro yang mempengaruhi kapasitas replikasi
1
Mutasi M184V menurunkan kerentanan virus terhadap ABC 2
hingga 3 kali lipat, dan lebih terhadap 3TC secara in vitro.2s Mutasi M184V sendiri tidak mempengaruhi respon virus terhadap ABC secara nyata. 19'20 Namun mutasi M184V yang muncul dengan mutan analog timidin seperti M41L, D67N, K70R, L210W, T215F/Y dan K2I9Q/E meningkatkan kerentanan virus terhadap AZT.“ ] Penelitian untuk mengetahui tingkat mutasi pada daerah rt dan protease juga dilakukan di Surabaya. Penelitian ini melibatkan 66 pasien yang telah mendapatkan terapi lebih dari I tahun yang diambil dari salah satu klinik di Surabaya. Hasilnya menunjukkan bahwa mutasi yang paling sering muncul adalah motif Ml 84V sebanyak 28,3%. Hal tersebut sejalan dengan penelitian ini yang menunjukkan bahwa motif M184V ditemukan 40% dari jumlah mutan yang ditemukan Hal tersebut juga sejalan dengan hasil penelitian Fibnani pada tahun 2013 yang dikutip oleh Khairunisa yang menyatakan bahwa motif M184V ditemukan sebanyak 35,3% pada pasien yang telah menerima arv di Bandung. 22 Mutasi lain yang teridentifikasi adalah mutasi pada posisi 115 yang terjadi pada 2 sampel subyek Posisi 115 pada RT adalah bagian dari kantong pengikatan dNTP Selam mengakibatkan resistensi terhadap ABC dan TDF, mutasi pada posisi ini menyebabkan meningkatnya keakuratan RT Pada golongan lentivirus, asam amino pada posisi 115 RT adalah Y, sementara pada retrovirus yang lain, posisi ini diisi oleh F Pada HIV-1, mutasi Y115F dikaitkan dengan resistensi tingkat rendah virus terhadap analog nukleotida Perubahan dan Y menjadi F pada posisi 115 menyebabkan hilangnya grup hidroksil Tingkat kesalahan RT motif Y115F adalah 1.0 x 10 4, lebih rendah dibandingkan RT galur murninya.1"
17
Mutasi dengan motif K70R teridentifikasi pada 1 sampel subyek yang mendapatkan terapi d4T dan EPV selama 3 bulan Mutasi tersebut merupakan mutan analog timidin dan menyebabkan resistensi terhadap AZT, ABC, d4T, dan DDI AZT adalah analog timidin yang bekerja dengan menghentikan pembentukan rantai DNA rt secara spesifik sehingga proses translasi rt untuk membentuk protein RT tidak terjadi. 2' Pada dosis yang sangat tinggi, zidovudin juga dapat menghambat aktivitas DNA polimerase sel manusia pada saat pembelahan sel, namun sel manusia mampu memperbaiki kerusakan A
DNA karena AZT, sementara HIV tidak memiliki kemampuan tersebut r Tidak diketahui apakah mutasi pada sample subyek memang terjadi karena pemberian arv, atau ditularkan dari penderita lain karena tidak dilakukan identifikasi mutasi pada sampel subyek sebelum menerima arv Penelitian ini juga melibatkan subyek yang tidak menerima arv dengan asumsi tidak terjadi mutasi terkait resistensi arv pada HIV yang menginfeksi subyek, namun hasil sekuensing menujukka n 2 diantaranya membawa HIV-1 mutan, 1 terkait resistensi terhadap arv dan yang lain adalah mutan polimorfisme. Mutasi-mutasi yang berpotensi menyebabkan resistensi terhadap arv lebih banyak ditemukan pada subyek yang menerima arv. Mutasi lain yaitu motif M41L adalah mutasi yang diketahui karena pemberian analog timidine dapat menyebabkan menurunnya tingkat kerentanan virus terhadap semua NRTI yang telah disetujui. Pada penelitian ini, subyek yang terinfeksi mutan M41L belum pernah mendapatkan arv, dan memiliki jumlah CD 4 54 ketika sampel diambil Selain mutasi pada posisi 41, HIV-1 yang menginfeksi subyek ini juga mengalami mutasi pada posisi D67E. Perbedaan sekuens HTV-1 yang menyebabkan perubahan asam amino dapat terjadi secara alami pada pasien yang tidak diobati. Perubahan polimorfik tersebut dapat terjadi bahkan pada gen yang mengkode protein virus yang dijadikan target obat. Selain itu, beberapa mutasi terkait resistensi obat juga terjadi pada pasien yang tidak diobati Resistensi minor yang disebabkan o leh mutasi dianggap sebagai kompensasi karena kesalahan RT dalam menginkorporasikan dNTP. dan tidak memiliki pengaruh substansial terhadap fenotipe virus. 25 Pada penelitian ini, diperoleh 1 mutan polimorfisme Y1061 yang secara sendiri tidak mampu mengubah respon RT terhadap arv Penelitian yang dilakukan gatanaga tahun 2010 menunjukkan kombinasi mutan polimorfisme V106I dengan V179D mampu mengubah kerentanan virus terhadap EFV dan NVP secara signifikan.
18
Mutasi terkait resistensi juga diidentifikasi pada sampel subyek yang tidak menerima arv, dan diidentifikasi membawa HIV-1 subtype non B Prasangka telah dibuat bahwa virus yang mengandung mutasi penyebab resistensi memiliki tingkat penularan yang lebih rendah dibandingkan virus yang sensitif. Namun publikasi terbaru menunjukkan bahwa 10,4% dan 2208 pasien HIV-1 yang dipelajari pada penelitian yang dilakukan oleh Wensing pada tahun 2005 di 19 negara di Eropa terinfeksi HIV -1 dengan lebih dari I titik mutasi dan paling banyak terjadi pada HIV-1 subtipe B yang memang berasal dan Eropa dan Amerika Utara. Subyek terinfeksi HIV-1 subtype non-B yang mengandung mutasi terkait resistensi adalah 4,8%. 26 Mutasi yang muncul pada virus dapat menyebabkan resistensi virus terhadap arv yang diberikan. Hal tersebut menjadi tantangan di dalam terapi HIV karena virus resisten dapat ditularkan dan dapat meningkatkan prevalansi virus resisten pada pasien HIV-1 yang tidak mendapatkan terapi. RT HIV-1 harus mampu menyelesaikan sintesis cDNA virus sehingga virus dapat berephkasi dan ditularkan dan RT yang resisten terhadap NRTI harus tetap mempertahankan kemampuannya dalam menginkorporasikan dNTP normal secara efisien Hal tersebut berarti RT yang resisten terhadap NRTI harus mampu membedakan nukleosida yang normal dan NRTI. Mekanisme lainnya melibatkan penghilang NRTI secara selektif dari ujung DNA virus, contohnya resistensi terhadap AZT disebabkan oleh mutasi M41L, D67N, K70R, L210W, T215F/Y, K219E/Q
15,6
19
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah: 1 Primer berhasil dirancang untuk memperoleh fragmen DNA n HIV dengan identitas primer pRTHIVF dan pRTHIVR 2.
Fragmen DNA rt HIV berhasil diperbanyak secara PCR menggunakan primer pRTHIVF dan pRTHIVR
3
Mutan HIV-1 terkait resistensi arv telah teridentifikasi pada 3 subyek ODHA yang telah menerima arv dan pada 2 subyek yang tidak menerima arv di Jayapura Namun dengan pemberian kombinasi arv yang telah diterima oleh subyek ODHA, multiplikasi HIV masih dapat ditekan
B. SARAN Saran yang dapat diberikan melalui penelitian ini adalah 1.
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang mutasi terkait resistensi FTTV dengan desain cohort.
2.
Melakukan identifikasi mutasi terkait resistensi terhadap ODHA yang sudah menerima arv di atas 6 bulan, atau yang mengalami peningkatan jumlah muatan virus dalam jangka waktu tertentu.
20
Daftar Kepustakaan I
Miller V, Martin S. Schlomo S, Bettina G, 1998 The M184V Mutation in HIV-1 Reverse Transcriptase (RT) Conferring Lamivudine Resistance Does Not Result in Broad CrossResistance to Nucleoside Analogue RT Inhibitors. AIDS 1998, 12: 705 -712.
2.
Departemen Kesehatan R.I. 2007. Pedoman Nasional Terapi Antiretroviral; Panduan Tatalaksana Klinis Infeksi HIV pada Orang Dewasa dan Remaja, Ed.2.
3.
Ravela J, Bradley J B. Francoise BV, Anne MV, 2003. HIV-1 Protease and Reverse Transcriptase Mutation Patterns Responsible For Discordance Between Genotypic Drug Resistance Interpretation Algorithms J Acquir Immune Defic Syndr 33(1): 8 - 14.
4
Dunn. L.L, Paul L B. Patrick K.C, Hughes, S.H., 2013. Mutations in HIV-1 reverse transcriptase cause misfolding and nnscleavage by the viral protease, J Virol 444: 241-249.
5.
Bansode VB, Simon AAT, Amelia CC, Bagrey N, 2011 Reverse Transcriptase Drug Resistance Mutations in HIV-1 Subtype C Infected Patients on ART in Karonga District. Malawi. AIDS Research and Therapy 2011, 8:38
6.
Stanford HIV Resistance Data Base, 2012. Major HIV Drug Resistance Mutations, http/'/hivdb.Stanford edu
7
Wainberg, M.A., M.D Miller. Y Quan, H. Salomon. A S Mulato, P D Lamy, N A Margot, K.E Anton, and J.M. Cherrmgton. 1999. In vitro selection and characterization of HIV -1 with reduced susceptibility to PMPA. Antivir.Ther. 4: 87- 94.
8
Rhee. S.Y., J Taylor, G. Wadhera, A. Ben-Hur. D.L. Brutlag. and R W Shafer. 2006. Genotypic predictors of human immunodeficiency virus type 1 drug resistance. Proc Natl Acad Sci USA 103: 17355-17360.
9.
Mulder J . R Resnick, B Saget, S. Scheibel, S Herman, H. Payne, R Harngan, and S Kwok, 1997 A rapid and simple method for extracting human immunodeficiency virus type I RNA from plasma: enhanced sensitivity. Journal of Clinical Microbology, 35 (5): 1278 - 1280.
21
10
Boyer, P L, Hughes, S.H., 2000. Effects of Amino Acid Substitutions at Position 115 on The Fidelity of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Transcriptase,./. Virol. 2000,74(14)6494-6500
11
Hu, W.S., Hughes, S.H., 2012. HIV-1 Reverse Transcription, (. 'old Spring Harb Perspect Med 2012 (2): a006882.
12
Keele. B.F, Elena E Giorgi. Jesus F. Salazar-Gonzalez, Julie M. Decker, 2008. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes m primary HIV-1 infection, PNAS 105 (21): 7552 - 7557
13
Roberts, J.D. K. Bebenek, Kunkel, T A. 1988 The Accuracy of Reverse Transcriptase From HIV-1 Science 242 (4882) I 171-11 73.
14. Arts, J E, and D J Hazuda, 2012. HIV-1 Antiretroviral Drug Therapy, cshperspect.a007161 15
Kohlstaedt LA, Wang J, Friedman JM, Rice PA, Steitz TA, 1992 Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor. Science 256:17831790.
16
Ding J, Das K, Hsiou Y, Sarafianos SG, Clark AD Jr, Jacobo-Mohna A, Tantillo C, Hughes SH. Arnold E. Structure and functional implications of the polymerase active site region in a complex of HIV-1 RT with a double-stranded DNA template- primer and an antibody Fab fragment at 2.8 A resolution J Mol Biol 1998;284:1095-1 111
17. Petrella, M., Maureen O, Damela M, M Detorio, 2004. Differential Maintenance of the Ml84V Substitution in the Reverse Transcriptase of Human Immunodeficiency Virus Type 1 by Various Nucleoside Antiretroviral Agents in Tissue Culture, ASM, 48 No. 11 4189-4194. 18 Tisdale M, Kemp SD, Parry NR, Larder B, 1993. Rapid in vitro selection of human immunodeficiency virus type 1 resistant to 3'-thiacytidine inhibitors due to a mutation in the YMDD region of reverse transcriptase Proc Natl Acad Sci U S A 90(12):5653-5656. 19. Lanier, E. R., S. Glenn, M. Daniel. B. Stephen, 2001 HIV-1 reverse transcriptase sequence in plasma and cerebrospinal fluid of patients with AIDS dementia complex treated with Abacavir. .AIDS 15 (6): 747 - 751.
22
20. Stone C, M Ait-Khaled, C C. P Griffin, Tisdale, M, 2004. Human Immunodeficiency Virus Type I Reverse Transcriptase Mutation Selection during In Vitro Exposure to Tenofovir Alone or Combined with Abacavir or Lamivudine, AMC 48 (4): 1413-1415. 21. Clavel, F., and A. Hance, 2004. HIV Drug Resistance. N Engl J Med 350:1023 - 1035. 22. Khaiaimsa, SQ, T Kotaki, A M Witaningrum, M Q Yumfiar., el a/., 2014. Appearance of Drug Resistance-Associated Mutation in Human Immunodeficiency Virus Type I Protease and Reverse Trancriptase Derived from Drug-Treated Indonesian Patients. AIDS Res Hum. Retroviruses, volume 30, doi:10.1089/aid.2014 0221 23. Mitsuya H, Weinhold K, Furman P. St Clair M. Li, Lars, Lehrman S, Gallo R, Bolognesi D, Barry D, Broder S, 1985._3'-Azido-3'-deoxythymidine (BW A509U): an antiviral agent that inhibits the infectivity and cytopathic effect of human T- lymphotropic virus type Ill/lymphadenopathy-associated virus in vitro. Proc Nall AcaJSci USA 82 (20): 7096-100. 24. Ostertag, W., G. Roesler, C. J Krieg, J. Kind, T Cole, T Crozier. G. Gaedicket, G. Steinheider, N. Kluge, and Dube, S., 1974. Induction of Endogenous Virus and of Thymidline Kinase by Bromodeoxyuridine in Cell Cultures Transformed by Friend Virus.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71, (12): 4980-4985 25. Gatanaga H., H. Ode. A. Hachiya . T Hayashida, 2010. Efavirenz and Nevirapine but Not Etravirine Transcriptase Confers Resistance to Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Polymorphic Mutations in Human, Antimicrob. Agents Che mother.. 54(4): 1596- 1602. 26. Wensing, A.M.J., D A. van de Vijver, Gioacchino A.. Birgitta A, 2005. Prevalence of Drug Resistant HIV-1 Variantsin Untreated Individuals in Europe: Implicationsfor Clinical Management. JID 192 958-966
23
LAMPIRAN
24
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report 1229 Date: 03-Nov-20J4 01:52:33 UTC
Seq ID: 601229 Summary Data
Sequence includes RT: codons: 42 - 263
There are no insertions or deletions
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report: 1229 Date: 03-Nov-2014 02:1-4:02 UTC
Seq ID 601229(Reverse) Summary Data
Sequence includes RT: codons: 59 - 280
There are no insertions or deletions
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report: 1243 Date: 03-Nov-20I4 02.16:26 UTC
Seq ID 601243 Summary Data
Sequence includes RT: codons: 61 - 282
There are no insertions or deletions
Sequence Quality Assessment
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report: 1250 Date: 03-Nov-2014 01.08:24 UTC
Seq ID: 601250 Summary Data
Sequence includes RT: codons: 42 - 260
There are no insertions or deletions
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report 1264. If
Date: 04-Nov-2014 06.16:16 UTC
Seq ID 601264.If Summary Data
Sequence includes RT: codons: 23 - 280
There are no insertions or deletions
HIVdb: Genotypic Resistance Interpretation Algorithm Report 1264 Ir
Date: 04-Nov-20J4 06:35 47UTC
Seq ID 601264.Ir Summary Data
Sequence includes RT: codons: 6 - 262
There are no insertions or deletions
Sequence Quality Assessment
