TheraScreen : K-RAS mutációs készlet

TheraScreen®: K-RAS mutációs készlet A K-RAS gén 7 mutációjának kimutatására A Roche LightCycler® 480 valós idejű PCR-rendszerrel (II. készülék) (katalógusszám: 05015278001) és az Applied BioSystems 7500 valós idejű PCR-rendszerrel való együttes használatra (azonosítási szám: 4351105) Tartalmazza a Roche Diagnostics LightCycler® Adapt szoftver v1.1 felhasználói kézikönyvét (katalógusszám: 05474914001) a TheraScreen®: K-RAS mutációs készlet CE-IVD számára

Használati utasítás Termékkódok Készlet mérete 20 reakció 80 reakció

DxS termékkód KR-21 KR-22

Használati utasítás verziószám:

DU001g

Verzió időpontja:

2009. május

Tárolás −18 °C és −25 °C között

1/38. oldal

Roche Diagnostics rendelési szám 05366216190 05366224190

Csak diagnosztikai célra

TheraScreen: K-RAS mutációs készlet

Tartalom 1. Felhasználás célja / Javasolt használat ................................................3 2. A vizsgálat összefoglalása és értelmezése ..........................................3 3. Technológiai alapelvek ...........................................................................4 4. Reagensek ................................................................................................6 5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK .....................................7 6. Tárolás, stabilitás és szállítási körülmények........................................9 7. Készülék ...................................................................................................9 8. Minták .......................................................................................................9 9. K-RAS mutáció-kimutatási protokoll .................................................. 14 10. A vizsgálat korlátai ............................................................................. 25 11. Vizsgálat teljesítményjellemzői ......................................................... 26 12. Technikai segítség ............................................................................. 34 13. Gyártó és forgalmazó adatai ............................................................. 35 14. Legfrissebb verzió kiadása ............................................................... 35 15. Hivatkozások ....................................................................................... 36 A vásárló figyelmébe: .............................................................................. 38

2/38. oldal



FONTOS: Felhasználás előtt figyelmesen olvassa el az útmutatót és ismerje meg a K-RAS készlet összetevőit. 1. Felhasználás célja / Javasolt használat Felhasználás célja A DxS TheraScreen®: K-RAS mutációs készlet (K-RAS készlet) egy in vitro diagnosztikai vizsgálat, amely a K-RAS onkogén hét szomatikus mutációjának kimutatására szolgál, és a mutációs státusz kvalitatív értékelését teszi lehetővé. A K-RAS készletet képzett szakemberek használhatják megfelelő laboratóriumi körülmények között formalinnal fixált, paraffinba ágyazott colorectalis szövetből kivont DNS-mintákkal. Javasolt használat A K-RAS készlet eredménye segítséget nyújt a klinikusnak azon colorectalis rákban szenvedő betegek kiszűrésére, akiknél az antiepidermális növekedési faktor (EGFR) kezelés, mint a panitumumab, illetve cetuximab nem járhat eredménnyel. A K-RAS készlet nem a colorectalis rák diagnosztizálására szolgál. Az antiEGFR kezelésre alkalmas betegek kiválasztására vonatkozó egyéb prognosztikai tényezők kiegészítéséül szolgál, a beteg mutációs státusza alapján. A terápia eldöntésére a klinikusnak mérlegelnie kell a beteg mutációs státuszát, a betegség egyéb tényezőivel együtt. A rákos beteg terápiájáról nem szabad kizárólag a K-RAS mutációs státusz alapján dönteni. 2. A vizsgálat összefoglalása és értelmezése A K-RAS készlet egy CE- jegyzett, az Európai Unió in vitro diagnosztikai orvosi készülékekre vonatkozó 98/79/EC irányelvének megfelelő diagnosztikai készülék. A K-RAS onkogén mutációi gyakran kimutathatók humán rákos megbetegedésekben (1-4). Ezen mutációk megléte összefügg egyes EGFRgátló rákellenes terápiákra adott klinikai válasz hiányával metasztatikus colorectalis rákbetegeknél (5-10)(14-21). A K-RAS gén hét mutációjának kimutatása a vad típusú genomikus DNS háttérben, DxS Scorpions technológián alapuló valós idejű PCRvizsgálattal lehetséges. Ez a módszer rendkívül szelektív. Feltéve, hogy elegendő DNS kópia áll rendelkezésre, hozzávetőleg 1%-os mutáció kimutatása lehetséges a vad típusú genomikus DNS háttérben. A K-RAS készlet hét K-RAS mutáció kimutatására alkalmas a K-RAS onkogén 12. és 13. kodonjában, lásd 1. táblázat.

3/38. oldal



1. táblázat: A DxS készlet által kimutatott K-RAS mutációk A COSMIC-azonosítók a Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (rákos szomatikus mutációk jegyzéke) adatbázisból származnak http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ Mutáció Báziscsere Cosmic-azonosító Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532

3. Technológiai alapelvek A K-RAS készlet két technológia kombinálásával (ARMS® és Scorpions® (11, 12, 13)) mutatja ki a mutációkat valós idejű PCR-reakciók során. ARMS Az allél- vagy mutációspecifikus amplifikáció az ARMS segítségével történik. A Taq DNS-polimeráz rendkívül hatékonyan különíti el a PCRprimer 3’ végén az illeszkedést a mismatchtől. A specifikus, mutálódott szekvenciák szelektíven amplifikálhatók még olyan mintákban is, ahol a szekvenciák nagy része nem hordozza a mutációt: • Ha a primer tökéletesen illeszkedik, az amplifikáció teljes hatékonysággal megy végbe. • Ha a 3’ végben bázis mismatch található, csak kismértékű háttéramplifikáció történik. Scorpions Az amplifikáció kimutatása Scorpions segítségével történik. A Scorpion egy próbához kovalensen kötött PCR-primert tartalmazó kétfunkciós molekula. A próba fluorofórja kölcsönhatásban van egy szintén a próbába épített blokkoló festékkel, amely csökkenti a fluoreszcenciát. Amikor a próba a PCR-reakció során az amplikonhoz köt, a fluorofór és a blokkoló festék szétválnak. Ennek következtében a csőben megnő a fluoreszcencia. Adatfeldolgozás: ∆Ct módszer A Scorpions valós idejű vizsgálatok a háttérjel feletti fluoreszcens jel detektálásához szükséges PCR-ciklusok száma alapján adják meg a reakció kezdetekor jelenlevő célmolekulák mennyiségét. Azt a pontot, amelynél háttér-fluoreszcencia fölötti jel mérhető, ciklus küszöbértéknek (cycle threshold, Ct) nevezzük.

4/38. oldal



A ∆Ct érték az adott minta mutációs vizsgálati és kontroll vizsgálati Ct értékének különbsége. A minták mutáció pozitívként lesznek osztályozva, ha a vizsgálat ∆Ct értékére 1%-nál kisebb ∆Ct értéket adnak. Ennél magasabb érték esetén a minta vagy kevesebb, mint 1% mutációt tartalmaz (a vizsgálati kimutatási határán kívül esik), vagy pedig negatív mutációra. Az ARMS primerek használata során előfordulhat elégtelen illeszkedés, mutációt nem tartalmazó DNS-ből származó igen késői háttér Ct értéket adva. Minden, háttér-amplifikációból származtatott ∆Ct érték nagyobb lesz, mint 1%, és a minta mutációra negatívként lesz értékelve. A K-RAS készlet in vitro diagnosztikai használatra CE-jegyzett, vagy a Roche Diagnostics LightCycler® 480 valós idejű PCR-rendszer (II. készülék) (LightCycler® 480 készülék) 96 lyukú változatával, Roche azonosítási szám: 05015278001, vagy pedig az Applied BioSystems 7500 valós idejű PCR-rendszer, azonosítási szám 4351105 (ABI7500) készülékkel együttesen használva. A LightCycler® 480 készüléken együttesen használandó a K-RAS készlet és a LightCycler® Adapt szoftver v1.1 a TheraScreen® K-RAS mutációs készlet CE-IVD számára (LightCycler® Adapt szoftver). Ezt a szoftvert a pozitív vagy negatív amplifikációs görbe automatizált elbírálására és a megfelelő, Ct értékek előállításához szükséges küszöbérték kiszámítására fejlesztették ki. Így számolja ki a minta ∆Ct értékeket, amiket összevet az 1% cut-off értékekkel. A szoftver jelentést ad egy pozitív vagy negatív mutációs eredményről, és a K-RAS készlet adatainak vizsgálata és kiértékelése során minden szubjektivitást kiküszöböl. A K-RAS készlet formátuma A K-RAS készlet nyolc vizsgálatot tartalmaz. • Egy kontroll vizsgálat. • Hét mutációs vizsgálat. Minden reakciómix tartalmaz egy HEX-jelölt exogén kontrollt (belső kontroll) is (az ABI7500 JOE detektorával mutatható ki). Ez az álnegatív eredményhez vezető inhibitorok jelenlétét ellenőrzi. Kontroll vizsgálat A FAM-jelölt kontroll vizsgálat a minta teljes DNS-tartalmának értékelésére szolgál. A kontroll vizsgálat a K-RAS gén 4. exonjának régióját amplifikálja. A primereket és próbákat úgy tervezték, hogy elkerüljön minden ismert K-RAS polimorfizmust. Mutációs vizsgálatok Minden FAM-jelölt mutációs vizsgálat tartalmaz egy Scorpion és egy ARMS primert a vad típusú és a mutáns DNS elkülönítésére, ami egy valós idejű PCR-vizsgálattal mutatható ki. 5/38. oldal



4. Reagensek A K-RAS készlet elegendő reagenst tartalmaz a minták minőségi értékelésének elvégzésére, és a készlet méretétől függően 20, illetve 80 K-RAS vizsgálat futtatására. Készlet mérete DxS termékkód Roche Diagnostics rendelési szám 20 reakció KR-21 05366216190 80 reakció KR-22 05366224190 A vizsgálható minták száma függ a minta tétel méretétől. 2. táblázat: A K-RAS készlet tartalma Biztosított reagensek Kontroll reakciómix 12ALA reakciómix 12ASP reakciómix 12ARG reakciómix 12CYS reakciómix 12SER reakciómix 12VAL reakciómix 13ASP reakciómix Kevert standard Taq DNS-polimeráz

20 reakció 80 reakció Térfogat Térfogat 1300 µl 5200 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 650 µl 2600 µl 300 µl 1000 µl 60 µl 240 µl

Cső 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A K-RAS készlethez nem biztosított felszerelés és reagensek A felhasználónak a következő felszerelésre és fogyóeszközökre lesz még szüksége: • LightCycler® 480 készülék, illetve ABI7500 valós idejű PCR-gép, amely a 9. részben leírtak szerint működtethető; K-RAS mutációkimutatási protokoll. • A Roche Diagnostics LightCycler® Adapt szoftvere v1.1 (katalógusszám # 05474914001). • 0,2 ml-es DNáz-mentes PCR-lemezek (LightCycler® 480 készülék 96 lyukú lemez, katalógusszám 04729692 001, illetve ABI MicroAmp optikai 96 lyukú reakciólemez, azonosítási szám 4306737, MicroAmp optikai adhezív film, azonosítási szám 4311971). • Steril csövek master mix készítéséhez. • Külön pipetták a PCR-mix készítéséhez. • Külön pipetták a DNS templát beméréséhez. • Steril, nukleázmentes víz.

6/38. oldal



5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK In vitro diagnosztikai célra. A K-RAS készlet nem szolgál a rák bármely típusának szűrésre, illetve diagnosztizálására, a colorectalis rákot is beleértve. A jelenleg használatos egyéb prognosztikai faktorok kiegészítésére kell használni azon betegek kiválasztására, akiknél az anti-EGFR kezelés nem járna eredménnyel. A rákos beteg kezelését nem szabad kizárólag a K-RAS mutációs státusz alapján eldönteni. A klinikusnak a betegség egyéb tényezői mellett a mutációs státuszt is figyelembe kell vennie. A K-RAS készlet összetevői legfeljebb 8 alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel a vizsgálat kimenetelére való kedvezőtlen hatás nélkül. NE fagyassza le és olvassza fel 8 alkalomnál többször a K-RAS készlet reagenseit. Vegye figyelembe, hogy a tumorminták nem homogének, ezért egy mintából kapott adatok eltérhetnek a tumor más metszeteiből származó adatoktól. A tumorminták nem tumoros szövetet is tartalmazhatnak. A nem tumoros szövetből származó DNS várhatóan nem tartalmaz a K-RAS készlet által kimutatható K-RAS mutációkat. A K-RAS készlet minden vizsgálata rövid PCR-terméket eredményez. Ennek ellenére a K-RAS készlet nem használható erősen fragmentált DNS-sel. A DNS értékelésének a PCR alapján kell történnie, és eltérhet az optikai denzitás értékei alapján meghatározott mennyiségtől. A K-RAS készlet külön kontroll reakciómixet is tartalmaz, amivel a futtatás előtt meghatározható a minta DNS minősége és mennyisége. A K-RAS készlet reagenseinek hígítása optimális. A reagens további hígítása nem javasolt, mert a vizsgálat teljesítményének csökkenéséhez vezethet. Kisebb, mint 25 µl reakció-térfogatok használata nem javasolt, mert növelheti az álnegatív eredmények kockázatát. A K-RAS készlet minden reagense specifikusan a megadott vizsgálatokkal való felhasználásra készült. A vizsgálat optimális kimenetelének érdekében a K-RAS készlet reagensei nem helyettesíthetőek. Az optimális aktivitás és teljesítmény biztosítására a Scorpions primereket (mint minden fluoreszcensen jelölt molekulát) fénytől védve kell tárolni, hogy elkerüljük a fény okozta minőségromlást. Fokozott figyelmet igényel, hogy a PCR-reakciók ne szennyeződjenek szintetikus kontrollanyagokkal. A reakciómixek előállításához, illetve a DNS-templát beviteléhez ajánlott külön-külön pipettát használni. 7/38. oldal



A reakcióelegyek elkészítését és adagolását a templát hozzáadásának helyétől elkülönítve kell végezni. A PCR-reakciót követően nem szabad a csöveket kinyitni. A K-RAS készlet minden vizsgálata külön jellemzőkkel bír. Az eredmények kiszámítását a vizsgálat megfelelő paramétereinek figyelembevételével kell végezni (lásd Jelentés/Adatok értékelése rész). A 38 vagy annál nagyobb mutációs Ct értékeket negatívnak, illetve a készlet kimutatási határa alattinak kell értékelni. A vizsgálatok a kérdéses reakción kívül egy exogén kontroll reakciót (belső kontroll) is tartalmaznak (lásd Technológiai alapelvek rész). Ha a kettő közül egyik vizsgálat sem eredményes, az adatok nem használhatóak fel, mert álnegatív eredményhez vezető inhibitorok jelenléte valószínűsíthető. A minta hígítása csökkentheti az inhibitorok hatását, de figyelembe kell venni, hogy ilyenkor a DNS koncentrációja is csökken. Az általános laboratóriumi biztonsági óvintézkedéseket kell követni, többek között, de nem kizárólag: a) Ne pipettázzon szájjal. b) Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a minták, illetve készlet reagensek kezelési területén c) A vizsgálat után mosson kezet Kizárólag a készlethez biztosított Taq polimerázt (Taq) használja, ne helyettesítse azt egyéb, hasonló vagy eltérő típusú készletből származó, sem pedig másik forgalmazótól származó Taq polimerázzal. Csak az adott futtatáshoz szükséges reagenseket olvassza fel, ne olvassza fel minden alkalommal a teljes készletet, hogy minimalizálja a fagyasztási/olvasztási ciklusokat. Biztonsági információk Figyelem: Minden vegyszert és biológiai eredetű anyagot potenciálisan veszélyesnek kell tekinteni. A minták fertőzőek lehetnek, kezelésük ennek megfelelően történjen. A K-RAS készletet csak a megfelelő laboratóriumi technikák alkalmazásában képzett személyek használják. A K-RAS készlet összetevőinek használatakor mindig viseljen megfelelő laboratóriumi köpenyt, eldobható gumikesztyűt és védőszemüveget. Felhasználás után a K-RAS készlet összetevőit klinikai hulladékként kell megsemmisíteni.

8/38. oldal



6. Tárolás, stabilitás és szállítási körülmények Tárolás A K-RAS készlet teljes tartalmát az átvételt követően azonnal −18 °C és −25 °C közötti sötét, állandó hőmérsékletű fagyasztóba kell helyezni. Kerülje a K-RAS készlet fölösleges felolvasztását. Stabilitás Ne használja a K-RAS készletet a feltüntetett lejárati idő után. A K-RAS készlet tartalma a lejárati idő eléréséig stabil, amennyiben a tárolás az eredeti csomagolásban és a megfelelő körülmények között történik. A K-RAS készlet összetevői legfeljebb 8 alkalommal fagyaszthatóak le és olvaszthatóak fel a vizsgálat kimenetelére való kedvezőtlen hatás nélkül. NE fagyassza le és olvassza fel 8 alkalomnál többször a K-RAS készlet reagenseit. Szállítási körülmények A K-RAS készlet szállítása szárazjégen történik és átvételkor fagyott állapotban kell lennie. Ha a K-RAS készlet a megérkezéskor nincs fagyott állapotban, a külső csomagolást a szállítás közben felbontották, a szállítmány nem tartalmazza a csomagolási jegyzéket, a használati utasítást, illetve a reagenseket, kérjük, lépjen kapcsolatba a Roche Diagnostics helyi irodájával, lásd 12. rész, Technikai segítség és elérhetőségek. 7. Készülék A valós idejű PCR-készülék telepítésére és használatára vonatkozó részletes tájékoztatásért tanulmányozza a készülék felhasználói kézikönyvét. 8. Minták A vizsgálati anyagnak formalinnal fixált, paraffinba ágyazott colorectalis rákból kivont humán genomikus DNS-nek kell lennie. Mintavétel és a minta előkészítése 1. A minta szállítása: szabvány patológiai eljárás a minta minőségének biztosítása érdekében. 2. Ajánlott mintakivonási eljárás: DNS kivonása a Qiagen QIAamp® DNA FFPE szöveti készlettel (katalógusszám 56404). A Qiagen protokoll alábbi módosításai szerint kell eljárni: • Az FFPE metszeteket üveg tárgylemezekre kell készíteni. • A szövetmetszet körüli paraffinfölösleget új, steril szikével le kell kaparni. • Minden kivonandó minta esetében új szikével kaparja a szövetmetszetet mikrocentrifuga-csövekbe. 9/38. oldal



•

Proteináz K-s emésztést addig kell végezni, amíg az teljes nem lesz. Ez 48 óráig is eltarthat. • A mintákat 200 µl, a Qiagen extrakciós készlethez tartozó ATE pufferben kell eluálni. A minta-előkészítés bármely egyéb módját a végfelhasználónak kell validálnia. 3. A kivont DNS tárolása: a vizsgálatot megelőzően −20 °C-on. Mintaértékelési protokoll A K-RAS készlethez mellékelt extra kontroll vizsgálati mixet a minta teljes DNS-tartalmának értékelésére kell használni. A kontroll vizsgálat a K-RAS gén 4. exonjának régióját amplifikálja. A mintákon csak a kontroll vizsgálatot kell elvégezni a kevert standard, mint pozitív kontroll és víz, mint templát nélküli kontroll segítségével. A K-RAS készlet reagenseinek optimális felhasználásához a mintákat csoportokban célszerű vizsgálni. Minden diagnosztikai futtatásnak kell kontrollokat tartalmaznia. A minták egyedi vizsgálata több reagenst használ el, és csökkenti a K-RAS készlettel vizsgálható minták számát. Mintaértékelési protokoll-Lemez elrendezése 1. A K-RAS készletből olvassza fel a kontroll reakciómixet és a kevert standardot szobahőmérsékletre. Ha felolvadt, döntögetéssel 10-szer keverjen meg minden oldatot az egyenetlen sókoncentrációk megszüntetésére. Készítsen elegendő mixet a DNS-minták, egy kevert standard reakció és egy templát nélküli kontrollreakció számára, továbbá egy 2 reakcióra elegendő tartalékot. 2. A master mix elkészítéséhez a 3. táblázatban megadott reakciónkénti mennyiségeket használja. 3. táblázat: Kontroll vizsgálat master mix térfogatok Vizsgálat Kontroll vizsgálat

Master mix Reakciómix (µl)x1 Taq (µl)x1 19,8

0,2

3. NE vortexelje a Taq-ot, vagy bármelyik Taq tartalmú reakciómixet, mert az az enzim inaktiválásához vezethet. 4. Győződjön meg arról, hogy a Taq felhasználás előtt szobahőmérsékleten van. A cső lepörgetésével biztosítsa, hogy a Taq a cső aljában gyűljön össze, majd a pipettahegyet kicsivel a Taq felszíne alá vezetve pipettázzon, hogy minimalizálja a hegy Taq felesleggel történő bevonását. 5. Keverje össze óvatos fel-le pipettázással a master mixet. 6. Mérjen azonnal 20 µl kontroll master mixet minden reakciólyukba. 10/38. oldal



7. Mérjen azonnal 5 µl mintát, kevert standardot, illetve vizet (templát nélküli kontrollnak) a reakciólyukakba. 8. A lemez A1 lyukába kevert standardot, az A2 lyukába templát nélküli kontrollt (víz) kell mérni. A mintát az összes többi lyuk tartalmazza. 9. Zárja le és röviden centrifugálja a PCR-lemezt, hogy a reagensek a lyukak aljában gyűljenek össze. 10. A megfelelő elhelyezést illetően kövesse a készülék beállítási utasításait. Mintaértékelési protokoll – LightCycler® 480 készülék beállítása 1. Helyezze azonnal a lemezt a LightCycler® 480 készülékbe. 2. Válassza ki a LightCycler® 480 szoftver ikonját a készülékhez kapcsolt munkaállomás asztalán. Jelentkezzen be a programba, és az „Overview” oldalon válassza a „New Experiment from Template” menüpontot. A felsorolt templátfuttatási opciókból válassza a „K-RAS LC480II Run Template” pontot. Ez a templát a következő paraméterekkel rendelkezik: 1. A kimutatási formátum „DxS IVD Assays”. 2. A reakció-térfogat 25. 3. A kezdő tartási lépés 95 °C-on 4 perc. 4. Egy 2-lépéses amplifikáció 45 cikluson keresztül, amely 95 °C-on 30 mp denaturációs és 60 °C-on 1 perces kapcsolódási lépésekből áll. A fluoreszcencia mérése egy egyszeri mérés a 60 °C-os lépés során. 3.

Válassza ki a „Sample Editor” fület, és a „Step 1: Select Workflow” opció alatt jelölje be az „Abs Quant” jelölőnégyzetet. Bizonyosodjon meg arról, hogy a „Select Filter Combinations” fül alatt mindkét filtert kiválasztotta (465-510 nm és 533-580 nm). A Step 2 és Step 3 alatt állítsa be a minták nevét. A Quantification Sample Type beállítása „unknown”. A másolat oszlopot hagyja üresen.

4.

Válassza ki az „Experiment” gombot, és a vizsgálat mentéséhez, valamint a PCR-reakció elindításához nyomja meg a „Start Run” gombot.

5.

A futtatás végeztével válassza ki az „Analysis” fület és a „Create New Analysis” ablakban válassza az „Abs Quant/2nd Derivative Max” opciót. Fogadja el a „Create New Analysis” oldal alapértelmezett beállításait. Bizonyosodjon meg arról, hogy a „Filter Comb” gombon „465-510” látható, és válassza ki a „Calculate” gombot. A Ct értékek a „Samples” táblázatban jelennek meg. 11/38. oldal


6.


Válassza ki a „Filter Comb” gombot, és változtassa meg a filtereket 533-580 nm-re. Válassza ki a „Calculate” gombot, és a „Samples” táblázatban olvassa le az exogén kontroll Ct értékeket.

Mintaértékelési protokoll-ABI7500 készülék beállítása 1. Helyezze azonnal a lemezt az ABI7500 készülékbe. 2. Válassza ki a 7500 System szoftver ikonját a készülékhez kapcsolt munkaállomás asztalán. Nyisson egy új futtatási fájlt a 7500 Sequence Detection szoftver 1.4-es verziójának fájl menüjéből. 3. Az „Assay” pont alatt válassza ki a „Standard Curve (Absolute Quantification)” lehetőséget. A „Run Mode” alatt válassza ki a „Standard 7500” lehetőséget. 4. Haladjon tovább a detektor beállítási ablakba a „Next” gomb kiválasztásával. A detektorok listájához adjon hozzá egy FAM és egy JOE detektort, a gátló festékek „none” beállítása mellett. Amennyiben ezek a detektorok még nem léteznek, válassza ki a „New Detectors” gombot és állítson be egy FAM és egy JOE detektort a gátló festékek „none” beállítása mellett. 5. Állítsa a „Passive Reference” lehetőséget „None” állásba, és válassza ki a „Next” gombot. 6. Válassza ki a teljes lemezt, és jelölje be a FAM és JOE detektorok jelölőnégyzeteit, ezzel biztosítva minden lyukban mindkét festék mérését. Válassza ki a „Finish” gombot. 7. Az „Instrument” fül alatt állítsa be a PCR-reakciót a 4. táblázatban megadottak szerint. 4. táblázat: ABI7500 PCR-reakció feltételei Hőmérséklet 1. szakasz 95oC 2. szakasz 95oC 60oC

Idő

Ciklusok

4 perc

1

30 mp 1 perc

40

Adatgyűjtés

FAM, JOE

8. Válassza ki az „Start” gombot a vizsgálat mentéséhez és a PCRreakció elindításához. 9. A futtatás végeztével győződjön meg arról, hogy a „passive reference” beállítása „none” a lyukak ellenőrző oldalán. Az Amplification Plot fül alatt jelöljön ki minden használatban levő lyukat, és a detektor legördülő menüjéből válassza ki a JOE festéket. 12/38. oldal



10. Ellenőrizze minden minta JOE jelét, és hasonlítsa össze az NTC lyuk JOE jelével. Jegyezze fel minden, NTC-hez képest későn amplifikálódó, illetve nem amplifikálódó mintát az exogén kontrollra. 11. Az Amplification Plot fül alatt jelöljön ki minden használatban levő lyukat, és a detektor legördülő menüjéből válassza ki a FAM festéket. Használja az automata alapvonal és a manuális Ct beállítást, majd az exponenciális fázis közepén az Y tengely log beosztása segítségével állítsa be manuálisan a küszöbértéket az ABI7500 felhasználói útmutatójának leírása szerint. 12. Válassza ki az „Analyse” gombot a Ct értékek leolvasásához. Mintaértékelés értelmezése Állapítsa meg az NTC Ct értékeket és meggyőződjön arról, hogy nem szennyeződése okozta a pozitív amplifikációt a FAM csatornában (Ct kevesebb. mint 40), illetve az exogén kontroll sikertelen reakcióját a HEX csatornában (nincs Ct), amely beállítási hibára utal. A kevert standard kontroll várható Ct értéke (FAM csatorna) az ABI7500 készüléken 26-29 között, a LightCycler® 480 készüléken ≤ 29 között van. Az adatok nem használhatóak fel, amennyiben a 2 futtatási kontroll közül bármelyik eredménye hibás. Kontroll vizsgálat Ct 29-35 között: körültekintően értékelje, mivel lehet, hogy az igen alacsony szintű mutációt nem sikerült kimutatni. Kontroll vizsgálat Ct 35-38 között: az ilyen mintákban kevés amplifikálható DNS kópia-van jelen, és a mutációk csak akkor láthatóak, ha a legtöbb kópia mutálódott. Kontroll vizsgálat Ct ≥ 38: a minimális mennyiségű DNS miatt a minta nem alkalmas a K-RAS készlettel való mutáció-kimutatásra. Ügyeljen rá, hogy ha egy minta késői kontroll vizsgálati Ct értéket ad, a minta exogén kontroll Ct értékét hasonlítsa össze az NTC exogén kontroll értékével. Inhibitor jelenlétére utal, ha a minta exogén kontroll értéke az NTC-hez képest késik vagy negatív. Lehetséges a minta hígítása az inhibitor hatásának csökkentése érdekében, bár így a DNS is hígítódni fog. Mintahígítás: Egy Ct < 24 értékű kontroll túlterhelné a mutációs vizsgálatokat. A Ct < 24 értékű mintákat hígítani kell. Ügyelni kell arra, hogy a LightCycler® 480 készülék a Ct értékeket 2. derivált módszerrel adja meg, amely kissé eltérhet a LightCycler® Adapt szoftver által kapottaktól. Javasolt a > 24 és < 29 tartományba eső (Ct értékek a 7500 Sequence Detection szoftver vagy LightCycler® 480 készülék szoftver alapján) koncentrált minták hígítása aszerint, hogy az 1:2-höz hígítás a Ct értékét 1-gyel növeli.

13/38. oldal



9. K-RAS mutáció-kimutatási protokoll Felhasználás előtt figyelmesen olvassa el az útmutatót és ismerje meg a K-RAS készlet összetevőit. A K-RAS készlet hatékony felhasználása érdekében a mintákat 10-es csoportokban kell feldolgozni (egy 96 lyukú lemez megtöltéséhez). Kisebb mintacsoportok feldolgozása kevesebb minta vizsgálatát jelenti a K-RAS készlettel. LightCycler® 480 készülék vizsgálati beállítása A futtatások közötti eltérések elkerülése érdekében minden DNS-minta, kontroll és mutációs vizsgálatot ugyanabban a PCR-futtatásban kell vizsgálni. 1. A K-RAS készletből olvassza fel a reakciómixeket és a kevert standardot szobahőmérsékletre. Ha felolvadt, döntögetéssel 10szer keverjen meg minden oldatot az egyenetlen sókoncentrációk megszüntetésére. Készítsen elegendő mixet a DNS-minták, a kevert standard és a templát nélküli kontroll számára, továbbá egy mixenként 2 reakcióra elegendő tartalékot, ahogy azt az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat: K-RAS master mix térfogatok

Vizsgálat Kontroll vizsgálat Mutációs vizsgálatok

Reakciómix (µl)x1

Master mixek Reakciómix (µl) Taq (µl)x1 lemezenként (x14)

Taq (µl)lemezenként (x14)

19,8

0,2

277,2

2,8

19,8

0,2

277,2

2,8

2. NE vortexelje a Taq-ot, vagy bármelyik Taq tartalmú reakciómixet, mert az az enzim inaktiválásához vezethet. 3. Győződjön meg arról, hogy a Taq felhasználás előtt szobahőmérsékleten van. A cső lepörgetésével biztosítsa, hogy a Taq a cső aljában gyűljön össze, majd a pipettahegyet kicsivel a Taq felszíne alá vezetve pipettázzon, hogy minimalizálja a hegy Taq felesleggel történő bevonását. 4. Keverje össze óvatos fel-le pipettázással a master mixeket. 5. Mérjen azonnal 20 µl-t a master mixekből minden reakciólyukba. 6. Mérjen azonnal 5 µl mintát, kevert standardot, illetve vizet (templát nélküli kontrollnak) a reakciólyukakba. Minden DNS-mintát meg kell vizsgálni mind a kontroll-, mind az összes mutációs vizsgálattal. A lemez elrendezését a 6. táblázat adja meg. 14/38. oldal



6. táblázat: K-RAS lemez elrendezése 96 lyukas elrendezés Vizsgálat A Kontroll B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

7. Zárja le és röviden centrifugálja a PCR-lemezt, hogy a reagensek a lyukak aljában gyűljenek össze. 8. Helyezze azonnal a lemezt a LightCycler® 480 készülékbe. LightCycler® 480 készülék beállítása 1. Válassza ki a LightCycler® 480 készülék szoftver ikonját a készülékhez kapcsolt munkaállomás asztalán. Jelentkezzen be a programba, és az „Overview” lapon válassza a „New Experiment from Template” menüpontot. 2. A Run Templates listából válassza a „K-RAS LC480II Run Template” lehetőséget (részletekért lásd a LightCycler® 480 készülék mintaértékelési részt). 3. Válassza ki a „Sample Editor” fület, és a „Step 1: Select Workflow” opció alatt jelölje be az „Abs Quant” jelölőnégyzetet. Bizonyosodjon meg arról, hogy a „Select Filter Combinations” fül alatt mindkét filtert kiválasztotta (465-510 nm és 533-580 nm). A Step 2 és Step 3 alatt állítsa be a minták nevét. Az 1. oszlopban a minta neve mixed standard legyen. A 2. oszlopban a minta neve NTC legyen. A 3-12. oszlopba kell írni a minták nevét. A neveknek 1 oszlopban található összes lyuk esetében egyezniük kell. A Quantification Sample Type beállítása „unknown”. A másolat oszlopot hagyja üresen, mivel a másolatokat a LightCycler® Adapt szoftver nem veszi számításba. 4. Válassza ki az „Experiment” gombot, és a vizsgálat mentéséhez, valamint a PCR-reakció elindításához nyomja meg a „Start Run” gombot. 15/38. oldal



LightCycler® 480 készülék minta vizsgálata 1. A LightCycler® 480 készülék futtatásának végeztével használja a navigátor ablakot a vizsgálat exportálásához (.ixo fájl) egy LightCycler® Adapt szoftver által hozzáférhető helyre. 2. FONTOS: A LightCycler® Adapt szoftvert egy adott, egyedi kontroll egységként (munkaállomás) definiált számítógéprendszeren történő felhasználásra hitelesítették, amelyet a Roche Diagnostics biztosít egy adott LightCycler® 480 II. készülékkel való együttes használatra. A LightCycler® Adapt szoftvernek ez a hitelesítése jelenleg csak a kontrollegységre vonatkozik, amely egy „egyedülálló” számítógép (azaz nem egy hálózat része). Bármilyen másik számítógép használata tilos, mivel lehet, hogy a szoftver nem a megfelelő módon fog működni. 3. Kattintson a munkaállomás asztalán a LightCycler® Adapt szoftver ikonjára, és nyissa meg a LightCycler® Adapt szoftvert, majd töltse ki a felhasználónév mezőt. Ez a név fog szerepelni a jelentés szerzőjeként. 4. A fő ablakban a „Browser” gomb segítségével válasszon ki egy LightCycler® 480 készülék futtatási fájlt (a kiválasztás eltávolításához a szoftvert be kell zárni, és újra megnyitni). 5. Válassza ki a jelentés típusát (pdf vagy csv). Ha a csv típust választotta, egy pdf változatot a szoftver kiegészítésként akkor is létrehoz. 6. Az eredményekről készült jelentés létrehozásához válassza az „Analyse” lehetőséget. A jelentést a program automatikusan menti a futtatási fájlt tartalmazó mappába, és a futtatáséval megegyezős névvel látja el. 7. A jelentés automatikusan megjelenik. 8. A jelentésre váró eredmények a „Sample Result Table” „Mutation Status” oszlopában láthatóak. LightCycler® Adapt szoftver jelentés értékelése 1. A LightCycler® Adapt szoftver jelentése a vizsgálatra vonatkozó általános információkat tartalmaz. 1.1. A jelentés szerzőjeként az a személy jelenik meg, aki a szoftvert elindította és a jelentést létrehozta. 1.2. A vizsgálat dátuma és időpontja adott. 2. A jelentés a vizsgálat áttekintéséról ad információt, részletezve a futtatási fájl nevét, továbbá az algoritmust definiáló fájlt és szekvenciát. Az algoritmus részletei rögzítettek, és nem változtathatóak meg. 3. Az eredmények rész tartalmazza a LightCycler® 480 készülék futtatásának nevét és elérési útvonalát, továbbá a következő részleteket: 3.1. A LightCycler® 480 készülék sorozatszámát. 3.2. Instrument Name – a LightCycler® 480 készülék szoftverben a LightCycler® 480 készüléknek adott azonosító. 16/38. oldal



3.3. Run Date – a LightCycler® 480 készülék futtatásának dátuma és időpontja. 3.4. Run Operator – a vizsgálat futtatása idején a LightCycler® 480 készülék szoftverbe bejelentkezett személy neve. 3.5. Experiment Name – futtatási fájl neve. 3.6. Software Version – a LightCycler® 480 készüléken használt szoftver verziója. 3.7. Lot Number – a LightCycler® 480 készülék szoftver „Experiment setup” oldalának „Lot No” mezőjéből származik. 4. A lemez elrendezése a LightCycler® 480 készülék szoftver „Sample editor” oldaláról származó mintanevekkel van megadva. 5. A „Run Summary Result” adat futtatást Valid, illetve Invalid kimenetelűként értékeli. Ez a 1. és 2. oszlop futtatási kontrolljaitól függ. 6. Futtatási kontrollok 6.1. A LightCycler® Adapt szoftver a képlet alapján automatikusan kiszámítja a kevert standard ∆Ct értékeit. Mutációs Ct-Kontroll Ct=∆Ct 6.2. A LightCycler® Adapt szoftver az értékeket összehasonlítja a 7. táblázatban megadott várható értékekkel. 7. táblázat: LightCycler® Adapt szoftver várható ∆Ct értékek Vizsgálat Kevert standard ∆ Ct 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. A Ct és ∆Ct értékek megjelennek a jelentésen. 6.4. Az alábbi, 1. és 2. oszlop futtatási kontrolljaira vonatkozó Flags/Warnings (jelzők/figyelmeztetések) jelenhetnek meg: 8. táblázat: LightCycler® Adapt szoftver futtatási kontrollokra vonatkozó jelzők/figyelmeztetések Jelzők/Figyelmeztetés CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID

Jelentés Kontroll vizsgálat FAM Ct értéke a mérési tartományon kívül esik. A keverd standard exogén kontrolljának értéke Ct < 30 vagy negatív, ha a FAM eredmény negatív. Mutációs ∆Ct értékek a beállított tartományon kívül esnek. Az exogén kontroll NTC reakciója sikertelen. A FAM reakció NTC Ct értéke pozitív.

17/38. oldal


6.4.1.


A jelzők/figyelmeztetések következő:

részletes

magyarázata

a

6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE – A kevert standard kontroll vizsgálatára kapott Ct érték 26,60 ± 2 kell, hogy legyen. Ha a vizsgálat eredménye ezen az tartományon kívül esik, a kevert standard minden lyukára ez a jelző/figyelmeztetés jelenik meg, mivel ∆Ct értékek nem lesznek kiszámítva, és a kevert standard futtatása érvénytelen. A kontroll vizsgálat nem megfelelő működésére utal. 6.4.1.2. EXO_FAIL – Ez a jelző/figyelmeztetés akkor jelek meg, ha az exogén kontroll vizsgálat értéke a kevert standard lyukak bármelyikében 30 alatt van, ami a mix PCRszennyeződésére utal. Az EXO_FAIL jelző/figyelmeztetés akkor is megjelenik, ha az exogén kontroll vizsgálat hibája egybeesik a kevert standard lyukak bármelyikében a FAM reakciót hibájával. A vizsgálat problémájára utal, ami álnegatív eredményhez vezethet. A kevert standard már a FAM hiba során érvénytelennek számít. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE – Ha a kevert standard ∆Ct értéke a 7. táblázatban megadott tartományon (±2,00) belül van, a szoftver érvényes futtatást fog jelenteni. Ha a ∆Ct értéke a várható tartományon kívül esik, a futtatás érvénytelenségét ez a jelző/figyelmeztetés jelzi. Arra utal, hogy probléma van egy vizsgálattal, ami hamis eredményhez vezethet. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID – Az exogén kontroll vizsgálatnak mind a 8 templát nélküli kontroll lyukban pozitív eredményt kell adnia (Ct < 41). Ha negatív az eredmény, ez a jelző/figyelmeztetés jelenik meg és az érvénytelen státusz látható. Arra utal, hogy probléma van a vizsgálattal, ami hamis eredményhez vezethet. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID – A 8 kontroll nélküli lyukban a FAM eredményének negatívnak kel lennie (Ct > 38). Bármilyen amplifikáció szennyeződésre utal. Már egy pozitív eredmény esetén is megjelenik ez a jelző/figyelmeztetés, és érvényteleníti a templát nélküli kontrollt. 6.5. Bármely kevert standard lyuk, illetve templát nélküli kontroll lyuk érvénytelen státusza esetén a „Run Summary Result” pont „Run Invalid” lesz. A „Sample Result Table” feltünteti a mintaneveket és a kontroll Ct értékeket, de mutációs státusz „invalid” lesz. A kevert standard mutatja, hogy minden vizsgálat megfelelően működik. Ha ez megjelenik, nem lesz álnegatív vagy álpozitív a mutáció elbírálása. A templát nélküli kontroll azt mutatja, hogy a master mixek nem szennyezettek, és az exogén kontroll a várt módon működik. 18/38. oldal



6.6. Abban az esetben, ha a LightCycler® Adapt szoftver hibaüzenetet írna ki, tanulmányozza a 12. Technikai segítség c. részt. 7. Minta eredmények 7.1. A „Sample Result Table” megjelenít minden LightCycler® 480 készülék szoftverből vett mintanevet és kontroll vizsgálat Ct értéket. 7.2. A LightCycler® 480 Adapt szoftver kiszámítja a ∆Ct értékeket, és a 9. táblázatban megadott 1% cut-off értékek alapján meghatározza, hogy a minta mutáció pozitív, illetve negatív-e. 9. táblázat: LightCycler® Adapt szoftver 1% cut-off értékek Vizsgálat 1% delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09 7.3. Ha egy mintában egy mutáció ∆Ct értéke a megfelelő 1% ∆Ct cutoff érték alatt, a minta mutáció pozitív. A LightCycler® Adapt szoftver jelenti, hogy mi a jelenlevő mutáció, de jelentést csak egy mutációról ad. 2 pozitív ∆Ct érték esetén a kisebbik értékről ad jelentést. Feltételezhető, hogy a második érték keresztreakció eredménye, ahol egy másik mutáció primere kötött be és indított átírást. Azon ritka esetekben, ahol dupla mutáció van jelen, a klinikai döntés azonos lesz az egy mutációt hordozó esetekével. 7.4. Ha a minta ∆Ct értékei az 1% ∆Ct értékeknél nagyobbak, a minta eredménye mutáció negatív lesz (tartalmazhat mutációt, de annak szintje a készlet kimutatási határa alá esik). 7.5. Jelzők/Figyelmeztetések 7.5.1. A LightCycler® Adapt szoftver számos jelzőt/figyelmeztetést jelenthet a „Sample Result Table” mintáiról, ahogy azt a 10. táblázat mutatja. 10. táblázat: LightCycler® Adapt szoftver jelzők/figyelmeztetések Jelző/Figyelmeztetés REP_DILUTION CONF_LEVEL LIMITED EXO_FAIL FAIL

Jelentés A kontroll Ct kisebb, mint 24. A kontroll Ct nagyobb, mint 28,9 és nincs jelentés mutációról. A kontroll Ct nagyobb, mint 35. Az exogén kontroll vizsgálat és a FAM reakció is hibás egy mutáció vizsgálat során, vagy az exogén kontroll Ct kisebb, mint 30. A szoftver nem tudja a görbét pozitívként vagy negatívként elbírálni.

19/38. oldal



7.5.2.

A jelzők/figyelmeztetések részletes magyarázata a következő: 7.5.2.1. REP_DILUTION – Kontroll Ct < 24. A vizsgálatok olyan mennyiségű DNS-re validáltak, aminél a kontroll Ct értéke legalább 24. Ha egy minta kisebb kontroll vizsgálati Ct értéket ad, úgy kell hígítani hogy az beleessen az érvényes munkatartományba. 7.5.2.2. CONF_LEVEL – Kontroll Ct > 28,9. Egy CONF_LEVEL jelző/figyelmeztetés jelenik meg, ha a negatív minta kontroll Ct értéke > 28,9. Ha a mutációs Ct értékek 38, vagy annál nagyobbak, besorolásuk negatív, illetve a készlet kimutatási határa alatti. Az 1% mutáció kimutatásához elegendő DNS-hez 28,9 vagy annál kisebb kontroll Ct érték szükséges, az adott 1% cut-off értékek és Ct cut-off=38 érték alapján. Ha a kontroll Ct értéke nagyobb, mint 28,9 és kimutatható mutáció, pozitív mutációs eredmény jelenik meg és ez a jelző/figyelmeztetés nem jelenik meg, mivel a minta egyértelműen mutációt tartalmaz. Azonban, ha a kontroll Ct értéke nagyobb, mint 28,9 és a minta mutáció negatívnak tűnik, megjelenik ez a jelző/figyelmeztetés és felhívja a figyelmet arra, hogy előfordulhat, hogy alacsony szintű mutációk nem lettek kimutatva. A kontroll Ct értéke minél nagyobb, mint 28,9, annál kisebb a mutáció kimutatás érzékenysége. 7.5.2.3. LIMITED – Kontroll Ct > 35. Arra utal, hogy nagyon kevés amplifikálható DNS van a mintában, és csak a nagy mennyiségben jelenlevő mutációk mutathatóak ki. A LIMITED minták esetében, ha egy pozitív mutáció Ct < 38 értéked ad, akkor is érvényes státuszt fog kapni, és jelentésre kerül. A negatív mutációs eredményű mintában jelenlevő alacsony szintű mutációt és a LIMITED jelző/figyelmeztetést nem lehet beszámítani. 7.5.2.4. EXO_FAIL – A szoftver megvizsgálja az exogén kontroll vizsgálat amplifikációját az álnegatív vizsgálathoz vezető inhibitor jelenléte végett. A következő logikát követi: a. Az exogén kontroll reakció értékelése a mutációs reakció lyukakban történik, nem a kontroll vizsgálat lyukban, kivéve a kevert standard és NTC oszlopok esetében (lásd 6. pont), illetve akkor, ha egy Ct < 30 értékű exogén kontroll van jelen. b. Ha a mutáció elbírálása pozitív, de az exogén kontroll vizsgálat a mutációra pozitív lyukban hibás, az EXO_FAIL jelző/figyelmeztetés nem jelenik meg, mert a FAM reakcióból származó kompetitív inhibitor lehet jelen. A mutációs státusz érvényes.

20/38. oldal



c. Ha a mutáció elbírálása pozitív a mutációs lyukban levő mintára és az exogén kontroll vizsgálat hibás ugyanazon minta egy másik lyukában, az előbbi lyuk lesz elbírálva és az eredmény érvényes. Ennek ellenére meg fog jelenni egy EXO_FAIL jelző/ figyelmeztetés. Arra utal, hogy a hibás eredményű exogén kontroll lyukban probléma van a vizsgálattal, és előfordulhat, hogy egy mutáció nem lett kimutatva. Lehetséges, hogy az elbírált mutáció inkább a vizsgálatok közötti keresztreakció eredménye, és nem valódi mutáció, ami nem lett kimutatva. Ennek ellenére a vizsgálat mutációs státusza, mely a mutáció pozitív elbírálásáról ad jelentést, érvényes marad, mivel mutáció egyértelműen jelen van, és a klinikai döntés azonos lesz attól függetlenül, hogy melyik mutáció van jelen. d. Ha a minta negatív, de az exogén kontroll reakció bármelyik mutációs vizsgálat esetében hibás, az EXO_FAIL jelző/figyelmeztetés jelenik meg, és a státusz érvénytelen lesz. Lehetséges, hogy egy mutáció nem lett kimutatva. e. Ha az exogén kontroll vizsgálat Ct értéke a 8 lyuk bármelyikében < 30, egy EXO_FAIL jelző/ figyelmeztetés jelenik meg, és a státusz érvénytelen lesz. Lehetséges, hogy a vizsgálat PCR-termékkel szennyeződött. f. A LightCycler® 480 készülék futtatási fájlját meg lehet vizsgálni az exogén kontroll vizsgálat hibájának lehetséges okai végett. Egy oszlop összes exogén kontroll reakciójának hibája inhibitor jelenlétére utalhat. Csak 1 lyuk hibája a lemez bemérésekor történt problémára utalhat. 7.5.2.5. FAIL – Egy FAIL jelző/figyelmeztetés jelenik meg, ha a rendszer képtelen egy amplifikációt pozitívként, illetve negatívként elbírálni, például, ha abnormális a görbe alakja. 7.5.3. A LightCycler® Adapt szoftver ellenőrzi, hogy egy oszlopon belül megegyeznek-e a mintanevek, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a ∆Ct kiszámítására használt mutációs és kontroll vizsgálat Ct értékek azonos mintából származnak. A mintanevek a LightCycler® 480 készülék „Sample editor” oldalának vizsgálati futtatási fájljából származnak. Ha az oszlopban eltérést talál, a szoftver a „Sample Result Table” „Sample Name” oszlopában SAMPLE MISMATCH üzenetet jelent. A lemez elrendezésénél a szoftver jelenti a minta nevét, majd a (MISMATCH) üzenetet.

21/38. oldal



Ha ez csak egy gépelési hiba, a név a LightCycler® 480 készülék futtatási fájljában kijavítható, és az adatok újra kiértékelhetőek a LightCycler® Adapt szoftverrel. ABI7500 vizsgálati beállítás A futtatások közötti eltérések elkerülése érdekében minden DNS-minta, kontroll és mutációs vizsgálatot ugyanabban a PCR-futtatásban kell vizsgálni. 1. A K-RAS készletből olvassza fel a reakciómixeket és a kevert standardot szobahőmérsékletre. Ha felolvadt, döntögetéssel 10szer keverjen meg minden oldatot az egyenetlen sókoncentrációk megszüntetésére. Készítsen elegendő mixet a DNS-minták, a kevert standard és a templát nélküli kontroll számára, továbbá egy mixenként 2 reakcióra elegendő tartalékot, ahogy azt az 11. táblázat mutatja. 11. táblázat: K-RAS master mix térfogatok

Vizsgálat Kontroll vizsgálat Mutációs vizsgálatok

Master mixek Reakciómix (µl) Taq (µl)lemezenként Reakciómix (µl)x1 Taq (µl)x1 lemezenként (x14) (x14) 19,8

0,2

277,2

2,8

19,8

0,2

277,2

2,8

2. NE vortexelje a Taq-ot, vagy bármelyik Taq tartalmú reakciómixet, mert az az enzim inaktiválásához vezethet. 3. Győződjön meg arról, hogy a Taq felhasználás előtt szobahőmérsékleten van. A cső lepörgetésével biztosítsa, hogy a Taq a cső aljában gyűljön össze, majd a pipettahegyet kicsivel a Taq felszíne alá vezetve pipettázzon, hogy minimalizálja a hegy Taq felesleggel történő bevonását. 4. Keverje össze óvatos fel-le pipettázással a master mixeket. 5. Mérjen azonnal 20 µl-t a master mixekből minden reakciólyukba. 6. Mérjen azonnal 5 µl mintát, kevert standardot, illetve vizet (templát nélküli kontrollnak) a reakciólyukakba. Minden DNS-mintát meg kell vizsgálni mind a kontroll-, mind a mutációs vizsgálattal. A lemez elrendezését a 12. táblázat adja meg.

22/38. oldal



12. táblázat: ABI7500 K-RAS lemez elrendezése 96 lyukas elrendezés Vizsgálat A Kontroll B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

Kevert standard

NTC

1. minta

2. minta

3. minta

4. minta

5. minta

6. minta

7. minta

8. minta

9. minta

10. minta

7. Zárja le és röviden centrifugálja a PCR-lemezt, hogy a reagensek a lyukak aljában gyűljenek össze. 8. Helyezze azonnal a lemezt az ABI7500 készülékbe. ABI7500 készülék beállítása 1. Válassza ki a 7500 System szoftver ikonját a készülékhez kapcsolt munkaállomás asztalán. Nyisson egy új futtatási fájlt a 7500 Sequence Detection szoftver 1.4-es verziójának fájl menüjéből. 2. Az „Assay” pont alatt válassza ki a „Standard Curve (Absolute Quantification)” lehetőséget. A „Run Mode” alatt válassza ki a „Standard 7500” lehetőséget. 3. Haladjon tovább a detektor beállítási ablakba a „Next” gomb kiválasztásával. A detektorok listájához adjon hozzá egy FAM és egy JOE detektort, a gátló festékek „none” beállítása mellett. Amennyiben ezek a detektorok még nem léteznek, válassza ki a „New Detectors” gombot, és állítson be egy FAM és egy JOE detektort a gátló festékek „none” beállítása mellett. 4. Állítsa a „Passive Reference” lehetőséget „None” állásba, és válassza ki a „Next” gombot. 5. Válassza ki a teljes lemezt, és jelölje be a FAM és JOE detektorok jelölőnégyzeteit, ezzel biztosítva minden lyukban mindkét festék mérését. Válassza ki a „Finish” gombot. 6. Az „Instrument” fül alatt állítsa be a PCR-reakciót a 13. táblázatban megadottak szerint. 23/38. oldal



13. táblázat: ABI7500 PCR-reakció feltételei Hőmérséklet 1. szakasz 95oC 2. szakasz 95oC 60oC

Idő

Ciklusok

4 perc

1

30 mp 1 perc

40

Adatgyűjtés

FAM, JOE

7. Válassza ki az „Start” gombot a vizsgálat mentéséhez és a PCRreakció elindításához. ABI7500 minta vizsgálata 1. Győződjön meg arról, hogy a „passive reference” beállítása „none” a lyukak ellenőrző oldalán. 2. Ellenőrizze, hogy minden lyuk ad JOE jelet az exogén kontroll vizsgálatból. a. Ha az exogén kontroll vizsgálat pozitív eredményt ad, folytassa a vizsgálatot. b. Ha az exogén kontroll vizsgálat hibás, de a FAM reakció amplifikációja erős, folytassa a vizsgálatot, mert a FAM reakció elnyomta az exogén kontroll reakciót. c. Ha a FAM és az exogén kontroll reakció is hibás, at adatokat el kell vetni, mert inhibitor lehet jelen. Ezek az inhibitorok álnegatív eredményhez vezethetnek. 3. Az Amplification Plot fül alatt jelöljön ki minden használatban levő lyukat, és a detektor legördülő menüjéből válassza ki a FAM festéket. Használja az automata alapvonal és a manuális Ct beállítást, majd az exponenciális fázis közepén az Y tengely log beosztásának segítségével állítsa be manuálisan a küszöbértéket az ABI7500 felhasználói útmutatójának leírása szerint. 4. Elemezze az adatokat és számítsa ki a ∆Ct értékeket a következők szerint [minta mutációs vizsgálat Ct] – [minta kontroll vizsgálat Ct] =∆Ct Az elemzés megkönnyítésére az adatokat Microsoft Excelbe exportálhatja. ABI7500 adatok értékelése 1. Kontroll Ct értékek: 1.1. A kontroll Ct értéke a vizsgálat túlterhelésének elkerülésére ≥ 24 kell, hogy legyen. 1.2. Kontroll Ct < 29: a K-RAS készlet már a minták 1%-os mutációját képes kimutatni.

24/38. oldal



1.3. A kontroll Ct ≥ 29 értékű mintáknál a készlet nem fogja kimutatni az 1%-os mutációt, de még mindig képes lesz magasabb szintű mutációkat kimutatni. 1.4. Ha a kontroll Ct ≥ 35, kevés amplifikálható DNS-kópia van a mintában, és a mutációk csak akkor láthatóak, ha a legtöbb kópia mutálódott. 1.5. Ha a kontroll Ct ≥ 38, a DNS kis mennyisége limitáló és az adatokat nem szabad használni. 2. Kevert standard ∆Ct értékek 2.1. A kevert standard ∆Ct értékeit a 14. táblázat szerint kell megadni, de az érték ±2 variációja előfordulhat a különböző készülékek eltérő küszöbérték beállításai miatt. 14. táblázat: ABI7500 kevert standars ∆Ct értékek és 1% cut-off pontok

Vizsgálatok

Kevert standard ∆Ct

12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

-0,70 -1,04 -0,02 -0,98 0,02 -0,19 -1,12

Kevert standard elfogadható tartomány -2,70-től 1,30-ig -3,04-től 0,96-ig -2,02-től 1,98-ig -2,98-től 1,02-ig -1,98-től 2,02-ig -2,19-től 1,81-ig -3,12-től 0,88-ig

Minta 1% ∆Ct 6,5 8 8 7 9 6,5 9

3. Minta ∆Ct értékek: 3.1. Ha a minta ∆Ct értéke nagyobb, mint az 1%-os érték (ahogy a 14. táblázatban látható), a DNS-minta mutációs negatívnak illetve a K-RAS készlet kimutatási határa alattinak lesz osztályozva. 3.2. Ha a minta ∆Ct értéke kisebb, mint az 1%-os érték, a DNS-minta pozitívként lesz osztályozva. 3.3. A 38 vagy annál nagyobb mutációs Ct értékeket negatívnak, illetve a készlet kimutatási határa alattinak kell értékelni. 10. A vizsgálat korlátai A szükséges minta kontroll vizsgálat Ct értéke 1% mutáció kimutatására a vad típusú DNS hátterében az ABI7500 esetében < 29, a LightCycler® 480 készülék esetében < 28,9 kell, hogy legyen. Nagyobb kontroll értékek mellett a vizsgálatok nem tudnak 1% mutációt kimutatni, és a mutációk kimutatásának érzékenysége a kontroll Ct ezen értékek fölé emelkedésével csökken. A minta DNS kontroll Ct értéke a PCR által meghatározott koncentráción alapul. Fragmentált DNS-minták optikai denzitás leolvasásán alapuló értékei nem felelnek meg a kontroll vizsgálat Ct értékeinek.

25/38. oldal



A készlet külön kontroll reakciómixet is tartalmaz, amivel a futtatás előtt meghatározható a minták Ct értéke. Ha egy minta pozitív mutációs Ct eredménye ≥ 38, a vizsgálatot negatívnak, illetve a készlet kimutatási határa alattinak kell értékelni. Ezt a LightCycler® Adapt szoftver automatikusan elvégzi Néha előfordulhat kereszt-reaktivitás a mutációs reakciók között. Például magas szintű 12ALA mutáció észlelésekor néhány másik mutációs reakció szintén pozitív eredményt ad. Ennek az az oka, hogy az ARMS primerek további mutációkat detektálnak egymástól néhány bázisnyi távolságra. Szintetikus kontroll anyagon a kereszt-reaktivitás az ABI7500 készüléken olvasható mintázatot alakít ki, amely különböző jelek által lehetővé teszi a valós pozitív meghatározását (lásd 15. táblázat). 15. táblázat: Szintetikus kontroll anyag kereszt-reaktivitási mintázata az ABI7500 készüléken Az Igen a valós jelre utal. A számok a valós jel utáni ciklusok körülbelüli számát mutatják, amikor kereszt-reaktivitási jel látható lehet. A 9 cikluson túli értékek nincsenek feltüntetve, mert a negatív tartományba esnek. Pozitív minta 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP jel jel jel jel jel jel jel Igen 9 6 3 6 9 Igen Igen 7 4 Igen 9 6 9 Igen 8 4 Igen Igen

Megjegyzés: A kereszt-reaktivitási mintázat különböző lehet a DNSmintákon, pl. a paraffinba ágyazott mintákon. A K-RAS készlet a DNS-minta egy mutációjának kimutatására tervezték. Egy második mutációs vizsgálat pozitív eredményét valószínűleg keresztreaktivitás okozza. Ennek ellenére, bár ritkán, de kettős mutációt is megfigyeltek. Ha a mintázat nem illik be a kereszt-reaktivitási mintába, további vizsgálatokra lehet szükség. 11. Vizsgálat teljesítményjellemzői A K-RAS készlet vizsgálati teljesítményét az ABI7500 készüléken és a LightCycler® 480 készüléken (a Ct értékek számítására a LightCycler® Adapt szoftvert használva) határozták meg. Mindkét készüléken sokféle vizsgálatot végeztek. Ezen tesztek eredményeit az alábbiakban foglaltuk össze.

26/38. oldal



1% cut-off validálás: LightCycler® 480 készülék: Az 1% mutáció kimutatását a K-RAS mutáció negatív sejtvonal DNS hátterében három, különböző koncentrációjú sejtvonal DNS sorozat segítségével határozták meg, és minden egyes mutációs vizsgálatra felállították a cut-off ∆Ct értéket. Minden egyes vizsgálat során 3 különböző futtatásban, hármasával vizsgálták az 1%-os standardot, mind a kontroll, mint a mutációs vizsgálat esetében. Ezt 3 különböző felhasználó ismételte meg. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftver szolgáltatta. Az 1% ∆Ct értékeket az egy futtatáson belüli ismétlések mutációs és kontroll Ct értékeinek összes kombinációjából számították ki. A cut-off ∆Ct értékeket az futtatások és koncentrációk átlagaként állapították meg. A vizsgálat eredményének összefoglalása az adatok értékelése részben szerepel. ABI7500: Minden egyes vizsgálat során 3 különböző futtatásban, 3 készlettételre, hármasával vizsgálták az 1%-os hígításokat, mind a kontroll, mint a mutációs vizsgálat esetében. A kevert standardot minden lemezen használták, hogy biztosítsák a vizsgálatok megfelelő feltételek szerinti lefolyását. Az 1% ∆Ct értékeket az egy futtatáson és tételen belüli ismétlések Ct értékeinek átlagából számították ki. A cut-off ∆Ct értékeket a tételek, futtatások és koncentrációk átlagaként (a legközelebbi 0,5 értékre kerekítve) állapították meg azon koncentrációk esetében, ami mellett minden ismétlés adott Ct értéket. A vizsgálat eredményének összefoglalása a 16. táblázatban alább látható. 16. táblázat: ABI7500 1% cut-off értékek validálási eredménye 1% ∆Ct értékek 12ALA 6,68 6,5 12ASP 8,2 8 12ARG 8,16 8 12CYS 6,94 7 12SER 8,83 9 12VAL 7,67 7,5* 13ASP 8,89 9 * A 12Val 1% cut-off értékét 6,5-re módosították az áttörési tanulmány alapján. Lásd alább. Vizsgálat

Átlag

27/38. oldal



Kevert standard ∆Ct meghatározása: LightCycler® 480 készülék: A kevert standard ∆Ct értékek 50 futtatás átlagértékei, amelyek során a kevert standardot vizsgálták. A Ct értékeket a LightCycler® 480 Adapt szoftver szolgáltatta. A kevert standard várható ∆Ct értékei az adatok értékelése részben láthatóak. ABI7500: A kevert standard értékeit 422 ∆Ct érték átlagaként állapították meg. Ezeket sok különböző készlettétel és futtatás során számolták ki. A kevert standard várható ∆Ct értékei az adatok értékelése részben láthatóak. Áttörési validálás: Az áttörés egy adott mintában jelenlevő vad típusú DNS target nem specifikus amplifikációja a mutációs vizsgálatok során. Ez mérhető szintű háttérzajt okoz. A vad típusú DNS áttörését minden mutációs vizsgálat esetében értékelték. Az áttörési tanulmány biztosította, hogy az előre felállított 1% cut-off értékek az áttörési szint alatt vannak, és meggátolnák az álpozitív eredmény jelentését. LightCycler® 480 készülék: Tíz K-RAS mutáció negatív sejtvonal DNSmintát különböző koncentrációit, 5 FFPE K-RAS mutáció negatív mintát és 5 FFPE K-RAS mutáció pozitív mintát vizsgáltak két példányban, 5 lemezen keresztül. A mutáció pozitív minták egy adott mutációra voltak pozitívak, a többi mutációt az áttörési vizsgálatához használták. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftver szolgáltatta, és a ∆Ct értékek kiszámítása a Ct értékek összes kombinációjával történt. A sejtvonal DNS és FFPE minták mutáció negatív vizsgálataiból kapott ∆Ct értékek mind az 1% cut-off értékek fölött voltak, ami az 1% cut-off értékek állékonyságát mutatja. A 17. táblázat mutatja az 5 futtatás legnagyobb mértékű áttöréseit. 17. táblázat: Áttörési eredmények Vizsgálat 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Legnagyobb áttörési ∆Ct értékek 12,35 11,36 Nincs áttörés Nincs áttörés 11,74 12,29 11,29

ABI7500: Az áttörés értékelése K-RAS mutáció negatív sejtvonalak összesített sejtvonal DNS-ének 3 különböző mennyiségével történt. Három azonos PCR-lemezt vizsgáltak. 28/38. oldal



Minden egyes lemez 3 reagenstételt tartalmazott. Pozitív kontrollként kevert standardot használtak. Ezen felül pozitív FFPE mintákat is vizsgáltak két példányban. A mutáció pozitív minták többsége csak egy mutációra pozitív. A többi mutációs vizsgálat az áttörés értékelésére használható (bár némi kereszt-reaktivitás is várható néhány vizsgálat és pozitív mutáció között. Azonban ez ismert mintázatot hoz létre). A kapott Ct és ∆Ct értékeket összehasonlították az 1% cut-off értékekkel. A sejtvonal DNS és FFPE minták vizsgálati adataiból kapott ∆Ct értékek az 1% cut-off értékek felett voltak egy FFPE minta kivételével, aminek ∆Ct értéke (6,84) kicsivel a 7,5-es cut-off érték alatt volt. Ahogy az 1% cut-off meghatározási adatok tartománya lefedte a 6,84 értéket, a 12VAL vizsgálat 1% ∆Ct értékét 7,5-ről 6,5-re módosították, hogy elkerüljék az álpozitív eredmény lehetőségét. A 18. táblázat mutatja a jelenlegi, áttörési validálási eredményeken alapuló 1% ∆Ct értékeket 18. táblázat: Áttörési validálási eredmények Vizsgálat 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

1% ∆Ct értékek 6,5 8 8 7 9 6,5 9

Pontossági validálás: LightCycler® 480 készülék: A pontosságot 1% szintetikus kontroll alkalmazásával K-RAS negatív sejtvonal DNS 3 különböző szintjén vizsgálták. A megfelelő vizsgálatokhoz minden kontrollt három példányban teszteltek egy lemezen, amely még két példányban tartalmazott kevert standardot és egy példányban NTC-t, a reakciók előírt körülményeinek biztosítására. Ilyen mintatálcát 6 nap alatt 54 alkalommal futtattak. A futtatások ezen mátrixába belevettek még 3 készüléket, 3 reagenstételt és 3 üzemeltetőt. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftver szolgáltatta, és a ∆Ct értékek kiszámítása a Ct értékek összes kombinációjával történt. Minden olyan ∆Ct értéket, amely háromszor meghaladta az interkvartilis tartományt kiugrónak tekintettek, és eltávolították a vizsgálatból. Az átlagok, szabványos hibák és szórások kiszámítását követően az adatokat készlettétel, készülék és üzemeltető szerint csoportosították a változók okozta variációk kiértékelése céljából. A vizsgálatok teljes megismételhetőségét is értékelték. Az adatok azt mutatják, hogy a vizsgálatokon belüli teljes variabilitás alacsony, és az átlag körüli 2 szórás lefedi a maximális szórású vizsgálat átlagától számított ±1,4 ciklus tartományt.

29/38. oldal



Minden vizsgálat átlag ∆Ct értéke minden üzemeltető esetén az egész adatállomány teljes átlagától számított 0,15 cikluson belül esett. Az üzemeltetők közötti eltérések 0,2 Ct értékeknél nem volt nagyobbak, megmutatva, hogy az üzemeltetők közötti variáció nem nagyobb, mint a teljes adatállomány variációja és a vizsgálatok elég állékonyak ahhoz, hogy kibírják az üzemeltetők közötti variabilitást. Minden vizsgálat esetében az egyéni készülékek átlaga és a teljes átlag eltérése ±0,097 volt, és az egyéni készülékek átlaga közötti eltérés nem volt nagyobb, mint ±0,186, megmutatva, hogy a készülékek közötti variáció nem nagyobb, mint a teljes adatállomány variációja és a vizsgálatok elég állékonyak ahhoz, hogy kibírják a készülékek közötti variabilitást. Minden vizsgálat esetében a legnagyobb eltérés egy tétel és a teljes átlag között ±0,195 volt, és a legnagyobb, tételek közötti eltérések ±0,38, megmutatva, hogy a tételek közötti variáció nem nagyobb, mint a teljes adatállomány variációja és a vizsgálatok elég állékonyak ahhoz, hogy kibírják a tételek közötti variabilitást. ABI7500: Kísérleteket végeztek minden vizsgálat pontosságának megállapítására egy PCR-lemez ismételt mérésével, magas és alacsony DNS-koncentráció tartományú, valamint magas és alacsony mutációs szintű mintákon, 3 reagenstétel azonos napon, különböző üzemeltetők által és különböző készülékeken való felhasználásával. Egyirányú ANOVA segítségével értékelték ki az ismétlések, reagenstételek, futtatások, vizsgálat napja, készülékek és üzemeltetők közötti varianciát. A nullhipotézis szerint a kategóriák átlagértékei egyenlőek. A Ct értékek teljes átlag, SD és %CV értékeit is kiszámították. Egyik vizsgálat sem mutatott szignifikáns eltérést a p=0,05 szinten a nullhipotézisétől, a kategóriák átlaga egyenlő. Ez azt mutatja, hogy a vizsgálatok elég állékonyak ahhoz, hogy kibírják a készülékek, üzemeltetők, tételek, napok, valamint futtatások közötti variabilitást. Helyességi validálás: LightCycler® 480 készülék: A helyességet 92 FFPE minta és 28 mutáció pozitív sejtvonal hígítás segítségével értékelték. Ezeket a K-RAS készlettel vizsgálták, valamint Sanger módszerrel szekvenálták. Összevetették a két módszer által kapott K-RAS mutációkat, és az eredmények között 18 eltérést találtak (5 FFPE és 13 sejtvonal), ahol a szekvenálás negatív eredményt, a DxS vizsgálat pedig pozitív eredményt mutatott. A mutációk jelenlétének igazolására ennek a 18 mintának a mutáció körüli régióit klónozták. A mutáció pozitív klónok megjelenését használták az eltérések megoldására. ABI7500: A helyességet szintetikus kontrollok 2 szintű K-RAS mutáció negatív sejtvonal DNS-be hígításával értékelték, hogy a mutációk 3 különböző százaléka mind a pozitív, mind a negatív mutációs szinteket lefedje. Minden egyes mutációra három egyforma lemezt, mindegyiken 3 reagenstételt használtak. 30/38. oldal



25%, 5%, és 0,5% mutációs szinteket vizsgáltak. (A 25%- és 5%-os mintáknak mutáció pozitív eredményt kell adniuk. (∆Ct érték az 1% cut-off értékek alatt); a 0,5%-os mintának mutáció pozitív eredményt kell adnia (∆Ct érték az 1% cut-off értékek fölött)). Az eredményeket alább a 19. táblázat foglalja össze. 19. táblázat: ABI7500 Helyességi validálási eredmények Vizsgálat

25%

5%

0,5%

Vizsgálat

100%

100%

94%

12ALA

100%

100%

100%

12ASP

100%

100%

100%

12ARG

100%

100%

100%

12CYS

100%

100%

100%

12SER

100%

100%

100%

12VAL

100%

100%

100%

13ASP

100%

100%

100%

A 12ALA vizsgálat helyességének csökkenését a DNS egyik szintjének ismétlései közötti variancia okozza. Linearitási validálás: LightCycler® 480 készülék: A linearitást szintetikus standardok használatával értékelték minden vizsgálat esetén 100%, 1% és 0% mutációs szinteken. Minden mutációs százaléknál egy hígítási sort végeztek, hogy a mutációs szint fenntartása mellett csökkentsék a DNS mennyiségét. A standard görbéket úgy kapták, hogy a kontroll vizsgálat és a megfelelő mutációs vizsgálat minden egyes hígítását három példányban, 3 lemezen ismételve futtattak. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftverével hozták létre. Minden egyes mutáció esetében létrehoztak egy grafikont (adat nincs közölve), amely a kontroll vizsgálat Ct értékeit és a mutációs vizsgálat Ct értékeit egymáshoz képest ábrázolja, és minden mutációs szinten regressziót végeztek. A 95%-os konfidencia intervallumokat is ábrázolták minden mutációs szinten. A 0%-os vizsgálatból nem kaptak mutációs Ct értéket. A 100%-os és 1%-os grafikonok az adatállományok egyértelmű különbözőséget mutatták és a görbék meredeksége lényegében megegyezett, amely a mutációs koncentrációk különböző tartományaiban hasonló amplifikációs hatékonyságra utal. ABI7500: Ez a tanulmány a mutációs vizsgálatok hatékonyságát értékeli a DNS-koncentrációk sorozatán keresztül vad típusú DNS és víz hátterében. Minden mutációs vizsgálat hatékonysága 90 - 110% (100% + 10%) kell, hogy legyen.

31/38. oldal



Standard görbéket 5 nagyságrendű hígítási sorozat alapján állították fel, és egy PCR-lemezen három tételből származó készlet reagenseket használtak minden egyes vizsgálat futtatásához. A 100% mutációs standardokat minden vizsgálat esetében vízben hígított 50 ng, 10 ng, 2 ng, és 0,4 ng DNS-sel vizsgálták. A mutációs vizsgálatokat 10 ng/µl sejtvonal DNS 5 nagyságrendű hígítási sorával is elvégezték, hogy értékeljék az áttörés hatását. Minden mutációs vizsgálatra kapott adatból standard görbéket hoztak létre. A PCR hatékonyságát a következő egyenletből számolták ki:

100((10-1/meredekség)-1) A 10 ng/µl sejtvonal hígítások esetében a magasabb szintű áttörés 100%-os hatékonyságot mutatott. Kiszámolták a reagenstételek közötti összhatásfokot. Minden érték hasonló volt és a kontroll vizsgálat hatékonyságának 10%-án belüli. A kontroll vizsgálatok és mutációs vizsgálatok párhuzamos standard görbéi alapján a vizsgálat ∆Ct módszere használatra alkalmas. A linearitás elfogadhatóan fennmaradt a 0,4 ng DNS - 50 ng DNS tartalmú sorozatban. Kereszt-reaktivitási validálás: LightCycler® 480 készülék: A kereszt-reaktivitás validálását nem végezték el, mivel a LightCycler® Adapt szoftver csak egy, a legkisebb ∆Ct értékű mutációról ad jelentést. ABI7500: Mivel minden, K-RAS készlet által kimutatott mutáció egy 5 bázispárnyi régióban fordul elő, a primerek között lehet számítani némi kereszt-reaktivitásra. Ez a tanulmány a K-RAS készlet kereszt-reaktivitási mintázatát határozta meg. A vizsgálatokat szintetikus mutációs kontrollokkal végezték annak meghatározására, hogy a valós pozitív után hány cikluson keresztül mérhető a kereszt-reaktivitási jel. Minden egyes mutációs reakciómixet hat ismétlésben futtatták a hét egyéni, 100% mutációs kontrollra. Ezen felül minden egyes kontrollt megvizsgáltak a hozzá való reakciómixszel és az azonos futtatás minden egyéb reakciómixével is. A kereszt-reaktivitási mintázat meghatározásához kiszámították a megfelelő kazetta valódi amplifikációs Ct értékének és az összes többi primer kereszt-reaktivitási jelének különbségét. A várható kereszt-reaktivitási mintázatot a 20. táblázat mutatja. A keresztreaktivitási mintázat egyenletesnek mutatkozott, és lehetővé teszi, hogy a helyes vizsgálati eredmény érdekében a felhasználó leolvassa az amplifikáció mintázatát, ha egynél több vizsgálat ad pozitív eredményt. A számok a cellákban egy valós pozitív jel detektálását követő ciklusok körülbelüli számát mutatják, amikor kereszt-reaktivitási jel látható lehet. 32/38. oldal



A 9 cikluson túli értékek nincsenek feltüntetve, mert azok mutáció negatívként lesznek osztályozva. 20. táblázat: ABI7500 Kereszt-reaktivitási validálási eredmények Pozitív minta

12ALA jel

12ASP jel

12ARG jel

12CYS jel

12SER jel

12VAL jel

13ASP jel

12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP

Igen 9 9 4 -

9 Igen 7 6 -

Igen 4 9 -

6 Igen -

3 Igen -

6 Igen -

8 Igen

Ciklusok toleranciájának validálása: LightCycler® 480 készülék: Ezek a tanulmányok a mutációs vizsgálatok toleranciáját határozták meg a PCR-ciklusok hőmérsékletének változásaival szemben. Mivel a kapcsolódási hőmérséklet a legkritikusabb, vizsgálat kimenetelét leginkább befolyásoló hőmérséklet, a kapcsolódási hőmérséklet paramétereit változtatták. A PCR-reakció toleranciáját 1%-os szintetikus standardokkal értékelték a DNS 3 különböző szintje mellett. Minden mutáció esetében ezeket a mintákat három példányban futtatták, a kevert standardot két példánya és az NTC egy példánya mellett, hogy a vizsgálatok az előírt körülmények szerint menjenek végbe. Minden lemezt 59 °C, 60 °C és 61 °C kapcsolódási hőmérsékleteken vizsgáltak. 60 °C a vizsgálat futtatásának optimális hőmérséklete de a PCR-blokkokon belüli vagy közötti eltérések megkívánják a vizsgálat egy adott tartományon belüli állékonyságát. Minden lemez minden hőmérsékleten három példányban futtattak. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftver szolgáltatta, és a ∆Ct értékek kiszámítása minden minta kontroll és mutációs vizsgálatára kapott Ct értékeinek összes kombinációjával történt. Minden vizsgálat megfelelt az elfogadhatósági feltételeknek, ahol a 59 °C-on és 61 °C-on kapott értékek nem térhetnek el a 60 °C ± szórás 60 °C-hoz tartozó érték átlagától. Ez azt mutatja, hogy a vizsgálatok elég állékonyak ahhoz, hogy kibírják a kapcsolódási hőmérséklet 1 °C-os eltérését. ABI7500: Minden kapcsolódási hőmérsékleten három egyforma PCRlemezt, mindegyiken 3 reagenstételt futtattak. A kevert standardot vizsgálták és 50 ng egyesített mutáció negatív sejtvonal DNS-t. Mivel 60 °C a javasolt kapcsolódási hőmérséklet, a lemezeket 58 °C, 60 °C és 62 °C-on futtatták. 33/38. oldal



Ha a vizsgálatok elég állékonyak, ahhoz, hogy elviseljék a kísérleti hőmérsékletet, a kevert standard ∆Ct értékei a beállított értékekhez képest +1,5 tartományon belül, a kevert standard és az egyesített sejtvonal ∆Ct értékei az 1% cut-off pontok fölött kell, hogy legyenek. A 12ASP mutatta a hőmérséklet változásaival szembeni legnagyobb érzékenységet; azonban minden vizsgálat elfogadhatóan végbement mind a 3 hőmérsékleten, ami a vizsgálatok állékonyságára utal a futtatási hőmérséklet optimális hőmérsékletének 2 °C-kal való növekedése, illetve csökkenésével szemben. Taq tolerancia validálás: LightCycler® 480 készülék: Ezek a tanulmányok a mutációs vizsgálatok Taq-polimeráz szintjének változásával szembeni toleranciát határozzák meg, amelynek forrása a felhasználó változása, mivel ő végzi a Taq hozzáadását. A vizsgálatok különböző szintű Taq toleranciájának értékelése 1%-os szintetikus standardok és 3 különböző szintű DNS használatával történt. Minden mintát 3 példányban vizsgáltak a Taq magas, normál és alacsony szintjével (a magas szintet 20%-kal több Taq, az alacsony szintet 20%-kal kevesebb Taq jelentette a normálisan használthoz képest). Kevert standard két példányát és az NTC egy példányát is futtatták, hogy a vizsgálatok az előírt körülmények szerint menjenek végbe. Minden lemezt három példányban, 3 különböző tételszámú Taq-kal futtatak. A Ct értékeket a LightCycler® Adapt szoftver szolgáltatta, és a ∆Ct értékek kiszámítása egy lemez ismétléseire mért Ct értékek összes kombinációjával történt. Minden vizsgálat megfelelt az elfogadási feltételeknek, a magas szintű Taq és az alacsony szintű Taq minták átlagai nem különböztek a normál szintű Taq átlagától a normál Taq adatok 1 szórásánál többel. ABI7500: Három azonos PCR-lemez, amely 3 különböző tételszámú reagenst tartalmazott, futtattak minden mutációs vizsgálatra a Taq polimeráz ajánlott mennyiségének +10% és -10%-os változtatása mellett; az ajánlott mennyiséget is vizsgálták. A kevert standardot vizsgálták, valamint 1% standardot a DNS 2 szintje mellett és 50 ng mutáció negatív sejtvonal DNS-t. A vizsgálat adataiból átlagot, szórást és variációs együtthatót számoltak. Az eredmények a vizsgálatok alacsony varianciáját mutatták (vizsgálatok SD értéke egyenlő, %CV < 10%) a Taq szintjének +10%-os változására, megmutatva, hogy a vizsgálatok a Taq-polimeráz szintjének akár 10%-os változását is tudják tolerálni. 12. Technikai segítség Technikai segítségért és további információért kérjük, lépjen kapcsolatba a Roche helyi képviselőjével. A fontosabb Roche képviseletek elérhetőségeinek felsorolása a 13. részben található. 34/38. oldal



13. Gyártó és forgalmazó adatai DxS Limited 48 Grafton Street, Manchester M13 9XX, United Kingdom Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA A Roche csoport tagja EGYESÜLT KIRÁLYSÁG

FRANCIAORSZÁG

SPANYOLORSZÁG

Roche Diagnostics NÉMETORSZÁG Charles Avenue Burgess Hill, West Sussex, United Kingdom RH15 9RY Roche Diagnostics S.A. SVÁJC 2 Avenue du Vercors BP 59, Meylan Cedex, 38240 Roche Diagnostics S.L. OLASZORSZÁG Av. de la Generalitat, s/n Sant Cugat del Valles Barcelona, E-08190

Roche Diagnostics GmbH Sandhoferstr. 116 Dept. VM-G Mannheim, D-68298, Roche Diagnostics (Schweiz) AG Industriestr. 7 Rotkreuz, CH-6343 Roche Diagnostics – Italy V. le G.B. Stucchi 110 Monza (MI), I-20052

Ha a készletet olyan országban vásárolta, amely nem szerepel a Roche Diagnostics irodák fönti listájában, kérjük, lépjen kapcsolatba Roche Diagnostics GmbH vállalattal Mannheimben, az alábbi címen. FŐ KÉPVISELETI KÖZPONT

Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim

14. Legfrissebb verzió kiadása A legfrissebb verzió dátuma: 2009. február Változtatások összefoglalása: Az 5. és 11. táblázat értékei megváltoztak. Apró tipográfiai változások.

35/38. oldal



15. Hivatkozások 1. R.A. Hilger, M.E. Scheulen, D. Strumberg. (2002). The Ras-Raf-MEKERK Pathway in the Treatment of Cancer. Onkologie 25: 511-518. 2. Pavan Bachireddy, Pavan K. Bendapudi, Dean W. Felsher. (2005). Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res 11(12):4278-4281. 3. Sae-Won Han, Tae-You Kim, Yoon Kyung Jeon, Pil Gyu Hwang, SeockAh Im, Kyung-Hun Lee, Jee Hyun Kim, Dong-Wan Kim, Dae Seog Heo, Noe Kyeong Kim, Doo Hyun Chung, Yung-Jue Bang. (2006). Optimization of Patient Selection for Gefitinib in Non-Small Cell Lung Cancer by combined analysis of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation, K-ras Mutation, and AKT Phosphorylation. Clin Cancer Res 12(8):2538-2544. 4. William Pao, Theresa Y. Wang, Gregory J. Riely, Vincent A. Miller, Qiulu Pan, Marc Ladanyi, Maureen SF. Zakowski, Robert T. Heelan, Mark G. Kris, Harold E. Varmus. (2005). KRAS Mutations and Primary Resistance of Lung Adenocarcinomas to Gefitinib or Erlotinib. PloS Medicine 2(1):57-61. 5. Astrid Lievre, Jean-Baptiste Bachet, Delphine Le Corre, Valerie Boige, Bruno Landi, Jean-Francois Cote, Gorana Tomasic, Christophe Penna, Michel Ducreux, Philippe Rougier, Frederique Penault-Llorca, Pierre Laurent-Puig. (2006). KRAS Mutation Status is Predictive of Response to Cetuximab Therapy in Colorectal Cancer. Cancer Res 66 (8): 39923995. 6. Silvia Benvenuti, Andrea Sartore-Bianchi, Federica Di Nicolantonio, Carlo Zanon, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Salvatore Siena, Alberto Bardelli. (2007). Cancer Res 67 (6): 2643-2648. 7. W. De Roock, J. De Schutter, G. De Hertogh, M. Jannsens, B. Biesmans, N. Personeni, K. Geboes, C. Verslyp, E. Van Cutsem, S. Tejpar. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4132. 8. G. Finocchiaro, F. Cappuzzo, P.A. Janne, K. Bencardino, C. Carnaghi, W.A. Franklin, M. Roncalli, L. Crino, A. Santoro, M. Varella-Garcia. (2007). Journal of Clinical Oncology 25 (18S): 4021. 9. F. Di Fiore, F. Blanchard, F. Charbonnier, F. Le Pessot, A. Lamy, M.P. Galais, L. Bastit, A. Killian, R. Sesboue, J.J. Tuech, A.M. Queuniet, B. Paillot, J.C. Sabourin, F. Michot, P. Michel, T. Frebourg (2007). British Journal of Cancer 96: 1166-1169. 10. Shirin Khambata-Ford, Christopher R. Garrett, Neal J. Meropol, Mark Basik, Christopher T. Harbison, Shujian Wu, Tai W. Wong, Xin Huang, Chris H. Takimoto, Andrew K. Godwin, Benjamin R. Tan, Smitha S. Krishnamurthi, Howard A. Burris III, Elizabeth A. Poplin, Manuel Hidalgo, Jose Baselga, Edwin A. Clark, David J. Mauro. (2007). Journal of Clinical Oncology 25(22): 3230-3237. 11. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C et al. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) Nucleic Acids Res. 17 (7): 2503-16. 12. Whitcombe, D., Theaker J., Guy, S.P., Brown, T., Little, S. (1999). Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17: 804-807.

36/38. oldal



13. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. and Brown, T. (2000). Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection. Nucleic Acids Research 28(19): 3752-3761 14. De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, Janssens M, De Hertogh G, Personeni N, Biesmans B, Van Laethem JL, Peeters M, Humblet Y, Van Cutsem E, Tejpar S. KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol. 2007, Nov. 12. 15. Lièvre A, Bachet JB, Le Corre D, Boige V, Landi B, Emile JF, Côté JF, Tomasic G, Penna C, Ducreux M, Rougier P, Penault-Llorca F, LaurentPuig P. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66:3992-5. 16. Lièvre A, Bachet JB, Boige V, Cayre A, Le Corre D, Buc E, Ychou M, Bouché O, Landi B, Louvet C, André T, Bibeau F, Diebold MD, Rougier P, Ducreux M, Tomasic G, Emile JF, Penault-Llorca F, Laurent-Puig P. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 2008;26:374-9. 17. C. Bokemeyer et al., K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4000) 18. E. Van Cutsem et al., K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 2) 19. S. Tejpar et al., Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mCRC), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26: 2008 (May 20 suppl; abstr 4001). 20. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer: Abstract o-037. Presented June 27, 2008. "KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care". Christos Karapetis et al. 21. Rafael G. Amado, Michael Wolf, Marc Peeters, Eric Van Cutsem, Salvatore Siena, Daniel J. Freeman, Todd Juan, Robert Sikorski, Sid Suggs, Robert Radinsky, Scott D. Patterson and David D, Chang. WildType KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients with Metastatic Colorectal Cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1626-1634.

37/38. oldal



A vásárló figyelmébe: Sem ezt a terméket, a TheraScreen® K-RAS mutációs készletet, sem annak összetevőit nem lehet újra eladni vagy más módon átruházni, vagy viszonteladás céljából módosítani a DxS Limited írásbeli hozzájárulása nélkül. A TheraScreen® és a Scorpions® a DxS Limited bejegyzett védjegyei. Az ARMS® az AstraZeneca UK Limited bejegyzett védjegye. A LIGHTCYCLER és a ROCHE a Roche védjegyei. Az ABI7500 az Applied BioSystems védjegye. Ez a termék egy CE-vel jelölt, az Európai Unió in vitro diagnosztikai orvosi készülékekre vonatkozó 98/79/EK irányelvének megfelelő diagnosztikai készülék. A termék megvásárlása egy korlátozott, nem átruházható engedéllyel jár az ARMS® és a Scorpions® technológiák kizárólag in vitro diagnosztikai célokra való felhasználására. Az ARMS® az 5,595,890 USA-szabadalom és az EP 332435 által védett, a Scorpions® a 6,326,145 USA-szabadalom és az EP1088102 által védett. A jelen dokumentumban található információ változhat. A DxS Limited nem vállal felelősséget a jelen dokumentumban esetlegesen fellelhető hibákért. A DxS Limited semmilyen módon nem vonható felelősségre (legyen az árlejtés, kár (ide értve a gondatlanságot), vagy más) semmilyen hivatkozással a termék használatával kapcsolatos vagy abból eredő káreseményért. Jelen dokumentumban semmi nem zár ki vagy korlátoz olyan felelősséget, amelyet a DxS Limited törvényesen nem zárhat ki vagy nem korlátozhat. © Copyright 2009. DxS Limited. Minden jog fenntartva. DxS Limited, 48 Grafton Street, Manchester, M13 9XX UK www.dxsdiagnostics.com

38/38. oldal

TheraScreen : K-RAS mutációs készlet

Recommend Documents