Temu Teknfs Fungsiornl ran Penedd 2000
TEKNIK PENGAWETAN BAKTERI, KHAMIR DAN KAPANG DENGAN METODE PENGERING-BEKUAN (FREEZE DRYING) Balm Penclidan
Wawan sugiawwn Veteriner, A
RE Martadinata No.
30, Bogor 16114
RINGKASAN
Tujuan pembuatan makalah ini ialah untuk menjelaAan tentang tekmk pengawetan mikroba dengan cars pengering-bekuan (freeze drying). Teknik ini merupakan salah sate cats pengawetan mikroba melalui prows sublimaa. Suspensi mikroba (lrakteri, khamir, atau kapang) dalam medium cair yang berfungsi pula sebagai medium pelindung (cryoprotective medium) diisikan sebanyak t 0,2 ml ke dalam ampul-ampul stern yang sudah diberi kertas label di dalamnya, lalu dibekukan hingga mencapai suhu -45 °C, kemudian disentrifus pads kecepatan rendah. Bersamaan dengan itu, mspensi mikroba beku tersebut diuapkan dengan cara dihisap menggunakan pompa hisap berkekuatan tinggi. Dalam waktu 5-10 menit pada saat tekanan udara mencapai 6,7 mbar, mean sentrifus dimatikan, sedangkan proses pengisapan dibiarkan berlangsung hingga tekanan udara mencapai 1,3 x 10-' -b°`, setelah itu prows dihentikan. Suspensi mikroba dalam ampul yang sudah kering secara asePik ditutup dengan kapas geril I= lam 2 mm di atas kertas label. Ampul-ampul tersebut kemudian dibentuk sedemikian rupa (constrict) hingga terbentuk leher ampul . Selanjutnya amPul-ampul disambungkan pada putmg-puting (nipples) mean pengering-beku (freeze dryer), lalu dilakukan prose, pengeringan wimp akhir . Proses ini diakhiri dengan penutupan ampul-ampul (ampoule sealing) dalam keadaan hampa udara dengan cara membakar leper ampul menggunakan alat penyembur api (sealing torch flame). Produk akhtr dan proses ini adalah awetan mikroba dalam bentuk kering beku yang dikemas dalam ampul tertutup dan hampa udara. Awetan mikroba ini mampu bertahan hidup bertahun-tahun, bahkan ada beberapa jenis mikroba yang mampu bertahan hingga 20-40 tahun . Katy kmd : Baktai, Khoink don kapang
PENDAHULUAN Biakan mikroba atau komponen enzim mikroba adalah elemen-elemen dasar dalam penerapan prows mikrobiologi dan bioteknologi (Sly, 1985) . Keberadaan mikroba isolat atau galur murm yang mempunym stabilitas genetik yang bail, makin hari makin sangat dipedukan karena semakin banyak diketahui kegunaannya sesuai dengan perkembangan bioteknologi, yaitu banyak menunjang dalam kegiatan
29
Tear
Tebw
Fwwgsfowd wow PewdM 2000
penehtlen veterrner, pertanian, industrl farm8S1, 1ndustri makananlmlnuman dan 18inlain. Dalam mmlpelt8h8nk8r1 keberedaan mikroba imhit murnl lni ads beber~ kmdela den 581811 astt k=dalany8, yertu sfglan dari mikroba memplmyal kencenderongan terjad! mutas yang dmkrfetkm oleh pmgaruh hngkungm Kematlan den mutest mikroba dapat terjadl karma mdaoba mmrh aW melakukan metabohsme, namun ddak atau kurang mendapat dulatngan dari fasilitas iingktrngannya, (misalnya. : medium, suhu, atau kondisi gas). Untuk mengatag den mengurangi terjadinya kematian stall pmm nrutasi irk make dicwi metodo-metode pengawetm milQOba yang mamplt mernpertahaniran days hiduP (viability) den slat-sift mikroba (Sty, 1984). Banyak metode pengawvtan mikroba yang satu same lain mempmyai perbedaan den pem;lihan moods yang akan dip" hams disesueikan dmgan hijuan atau pemarlfwm pengawcan tersebtrt serfs hsihtas yang ads balk peralatan, bahan mauptm sumber days ntamrsianya. Selain itu dipertimbangkan pub dengan kebutahan mihoba- Kebanyakan koleksi biakan lebih cendmtmg kepada pmtimbangan kebuwhan galtu (sir=) daripada faailitas slat den bahan (Sugiavven, 1986). Senlva metode pmgawwem memplmyei pin* kerja yang lama, yaitu mmbadm p O ) pada faktor4aktor yang metbolisme m&oba s loegiatan metaboHsme m&mba terllambat atau terfenti untuk wekta tutentm Perlalaran dalam purses im antara lain dengan cars penunutan sift (PeogewWtan sistem pembelaran), pengursngan udara (pengavwetan sistem kondisi gas (pmgawetan sistem penlrhlpan dengan pmgahWn) den P minyak parafin). Salah sate cars pmgawetan yang mmlpunyai ketiga perlalnran temeMrt adalah pengawetan dengan metode pengering-bektan (Freeze shying) (Sly, 1985).
Pengawetan mikroba dengan metode pmgering-bekuan (freeze drying) a&lah metode pengllwetan yang berteknologi fnggi, tetapi relatif mudah dalam Karma produk awe= yang dihasilkan mampu bertahm dalam jangka waktu lama (bertahim-tahun), den kemasan yang praktis serta tidak memerlukan periakuan khusus loam penyimpanm hingga memudabkan dalam pendistnbusjannya, make metode ini mgat cocok diterapkan di laboratorium koleksi biakan mikmba di mans purl. Dalam makalah ini diuraikan teknik pengeringfiekuan mikroba, khususnya bakteri, khamir den kapang yang lazim d1kerjakan di laboratorium BCC (Balavet Culture Collection) Balm Penchtian Veteriner Bogor, yang selain melayani kebutuhm intern, jugs MMy8m permintaan dari luar. METODE DAN PRINSIP PENGERINGBEKUAN
Teknik pmgawetan mdmba dengan metode pengering-bekuan (freeze telah dikenal den dipergunakan sejak 3 dasawarsa yang lalu (Lapage et al., 1970) den dimggap cocok untuk msngawetkan sebagian besar jems bakteri, khamir
drying)
30
Teem 7w=5 Fungsfonal non Peneb0 2000
dan "pang yang berspora serta virus, namun tidak cocok untuk mengawetkan jems kapang yang Mk berspom ganggang, protozoa, sel mamaha dan bakteri tertentu. Pada umumiWa mikroba hasil pengawetan dengan metode pengering-bekuan mampu bertahan dal-am jangka waktu yang lama (tahunan) dengan kemampuan daya hidup (viability) dan sifat-sifat yang relatif stabil . Bahkan ada beberapa jenis miktnba yang mampu bertahan hingga 20-40 tahun (Sly, 1985) . Ada dua metode dalam pengering-belNan yang dibedakan menurut tahapan perlakuannya (Lapage et al., 1970), yaitu: a. Metode sentrifugasi, yaitu suspensi mikroba dipusing untuk menghindan terjadinya gelembung-gelembung udara ketika berlangsung proses pengisapan sampai suspensi menjadi bdku, yang kemudian terjadi proses sublimasi. b. Metode prapembekuan, yaitu mspensi mikroba dibekukan terlebih dahulu, lalu dilakukan proses pengisapan, kemudian proses sublimasi . Prinsip pengermg-bekuan adalah sebagai berikut: Pertama, latntan mikroba dibekukan dan kandungan airnya dikeluarkan atau dikurangi dengan cars subhmasi, yaitu penguapan langsung dan bentuk es menjadi gas (uap). Dalam proses pembekuan ini, akan terbentuk kristal-kristal es yang mengakibatkan terjadinya pemngkatan konsentrasi elektrolit dan proses ini akan memmdahkan air dari protein dan DNA sehingga akan merusak sel-sel mikroba . Untuk menghindari kerusakan ini, maka suatu medium pelindung berupa pelanit (cryoprotective medium/suspending fluid) perlu ditambahkan . BAHAN DAN PERALATAN YANG DIPERLUKAN Biakan mikroba Mikrvba yang akan diawetkan harus sudah murni, teridentifikasi 'serta mempunyai data yang lengkap. Umur in"basi mikroba yang balk dan slap diawetan dengan pengering-bekuan ini yaitu umur yang sudah melewati fase kulminasi (logarithmic growth phase) . Banyaknya biakan mikroba yang dikeuukan disesuaikan dengan kebutuhan, sedangkan konsentrasi sel mikmba yang dianjurkan adalah sekitar 108-10'° per ml. Misalnya, untuk Escherichia coli dengan konsentrasi >10" sel per ml memerlukan 10 tabung biakan agar miring untuk ddamtkan dalam 2-2,5 ml medium pelarat (Lapage et al., 1970) . Medium pelarut Medium pelarut merupakan cairan yang banyak mengandung protein dan ditambah glukosa atau gula laimya sebanyak 7,5%. Jems-jenis medium pelarut yang biasa digunakan di laboratorium BCC Balitvet antara lain:
31
Tenor Tekms Frrngsfonal nonPenebd 1000
a. Kal;Iu glukosa 7,5% Kaldu nutrien ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. .. . . .. ...... . ........ . .. ..... 400 ml Glukosa (dekstrose, anhidrida) . . . . . .. .. . ... ... ... . .. ...... ... ...... ... 30 g pH . ... . .. ...... . .. .... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... . . . ... ... ... ... ...... ...... ... ... ... 7,6 b. Serum glukosa 7,5% Serum kuda steril . ... . ...... ... .. . .. . . .. ...... ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... . 400 ml Glukosa . ... ... ... ...... . ... ... ... ...... . . . ...... ... ........................ . ........ . 30 g c. Mist. dessicans Serum kuda steril ... ...... ... ...... ......... ... ... ... .. .... ......... ......... ... 300 ml Glukosa ..... ..... .. . . . ...... ... ...... ............................ .... . . ... ...... ... .. 30 g Kaldu nutrien ... . ...... ... ...... ......... . ......... ......... .... ..... ...... ...... . 1,3 g Air suling steril ... ... ... ... ... ... ... ......................... ..... . . ........ ... .. 100 ml c. Serum janin sapi-glukosa 7,5% (Murray, 1986) Serumjanin sapi (fetal calfserum, FCS) . . . ............... . ....... 400 ml Glukosa . . . .... . ...... ... ...... ... ... ... ..... . . . . ...... ... ...... ......... ... ...... . 30 g e.Susu skim (Arx dan Schipper, 1978) Susu skim . ...... ... ...... . .. .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... ... ... ... ... . Air suling steril ... . .. .... .. . ... ...... ... ... ... ... ... ... ... ... ...... . .. .....
50 g 500 nil
Dalam prakteknya, pemakaian ketiga jems medium pelarut pertama tersebut disesuaikan dengan marga (genus) dan jenis (spesies) mikroba yang sudah tersusun dalam panduan yang merupakan hasil pengalaman tiga koleksi biak yaitu National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), National Collection of Marine Bacteria (NCMB) dan National Collection of Type Culture (NCTC) sejak tahun 1950, 1957 dan 1920 (Lapage et al., 1970) . Selanjutnya, untuk medium pelarut serum janin sapi (fetal calf serum)-glukosa 7,5% hanya dipakai untuk pengawetan mikroba yang menurut pengalaman BCC kurang cocok bila menggunakan ketiga jenis medium pelarut pertama tadi, misalnya untuk Pasteurella multocida galur tertentu (uji coba BCC) pada tahun 1993, yaitu patogenisitas galur ini akan lebih terjaga bila menggunakan medium pelarut tersebut . Medium pelarut skim milk hanya digunakan untuk pengawetan jenis khamir dan kapang (Arx dan Schipper, 1978). Ampul Ampul terbuat dari bahan gelas netrai yang tidak terlalu tahan panas dan bebas garam. lems ampul dari pyrex tidak dapat dipakai, karena terlalu tahan panas 32
Temu Tekros Fungsional non Penefin 2009
sehingga akan menyulitkan dalam proses penutupan dan pembentukan leher ampul (dengan dibakar) atau ketika membuka ampul pada saat akan menghidupkan kembali awetan nukroba. Ukuran ampul adalah bagian dalam ampul bergaris tengah 6 mm, panjang 100 mm dan teba10,5 mm. (Gambar la). Selama ini ampul yang dipakai oleh BCC adalah ampul impor dari Inggris dan Australia. Bahan penunjang Di dalam ampul perlu dimasukkan kertas label sebagai identitas biakan nomor berupa kode isolat (kode koleksi BCC) dan tanggal proses pengering-bekuan. Kertas label ini terbuat dari kertas HVS 80 g atau kertas saring Whatman berukuran 5 mm x 35 mm (Gambar lb dan 1c). Selain itu, dalam proses pengering-bekuan dibutuhkan kapas sebagai penyumbat mulut ampul. Kain penutup ampul terbuat dari kain flanel (berbentuk sebuah tudung yang dijahit) perlu disiapkan untuk menutupi kelompok (batch) mat terdiri atas 20 ampul. Peralatan Beberapa peralatan penting untuk proses pengering-bekuan mikroba adalah: " mesin pengering-beku (freeze dryer) (Gambar 2) " mesin pembentuk leher ampul (ampoule constrictor) " alat penutup ampul (ampoule sealing torchflame) " alat pengujilpendeteksi kehampaan ampul (vacuum tester) " alat pemotong ampul. TEKNIK DAN TAHAP-TAHAP PENGERINGBEKUAN Persiapan 1.
2.
Biakan mikroba murm pada media agar cawan petri atau media agar miring dalam tabling yang telah cukup umur dipanen dengan cara disuspensikan dalam medium pelarut yang Sesual dengan jenis mikrobanya, yaitu kaldu glukosa 7,5%, serum glukosa 7,5%, mist dessicans atau serum anak sapi-glukosa 7,5% digunakan untuk pelarut bakteri sesuai dengan panduan medium pelarut. Sementam itu, untuk khamir dan kapang menggunakan medium pelarut susu skim. Banyaknya biakan mikroba yang dibutuhkan adalah 3-4 pupukan agar cawan petri atau 8 pupukan agar miring dalam tabling (pupukan subur) dan medium pelarutnya adalah 2-2,5 ml. Sebanyak t 0,2 ml suspensi mikroba diisikan ke dalam ampul-ampul steril yang sudah berisi label di dalamnya, keemudian, ampul-ampul ditempatkan pada rak
33
Tenw Te ws Fungsional nor Penelib 2000
3.
ampul (Gambar 3) per kelompok galur lalu ditutup dengan kain flanel penutup steril dan dukat dengan karet gelang . Rak ampul yang sudah berisi ampul dimasukkan ke dalam ruang silinder sentnfugasi (centrifuge chamber) yang ada di atas ruang cylinder refrigerator mesin pengermg-beku, dan selanjutnya mesin dioperasikan .
Pengeringan tahap pertama (primary drying) 1. 2.
3.
4.
5.
Semua katup pembocor pada mesin pengering-beku ditutup, lalu refrigerator dijalankan hingga kondensor mencapai suhu -t5°C. Setelah suhu itu tercapai, maka sentrifus dijalankan. Katup gas ballast pads pompa Pengisap (vacuum PumP) dibuka, kemudian Pompa dijalankan dan setelah 5-10 merit, slat pengukur kehampaan udara (pirani gauge) akan menunjukkan angka 6,7 mbar, yang berarti mspensi mikroba dalam ampui sudah sempurna membeku, selanjutnya mesin sentrifuse dinotikan. Prows pengermg-bekuan terus berlanjut hmgga mencapai tekanan 1,3 x 10-1 mbar. Lama waktu yang dikeuakan untuk proses pengeringan tahap ini bervanasi bergantung pada volume dan sifat atau jems bahan. Suspensi yang bersifat biasa dengan jumlah ampul sebanyak 96 buah memerlukan waktu t 12 jam, sedangkan untuk suspensi yang bersifat lebih lengket (seperti lem) memerlukan waktu 13-14 jam. Proses ini berakhir dengan mematikan mesin pompa pengisap dan mesin refrigerator serta membuka katup pembocor secara perlahan. Rak ampul dikeluarkan dari mean pengering-beku, kemudian secara aseptik ampul-ampul tersebut dusi kapas steril (kapas penutup) yang sudah disediakan dengan cars tutup kapas diambil dengan pmset dan ampul kosong bertutup kapas stern, lalu dipindahkan atau ditutgPkan pada ampul-ampul boric mikroba hasil pengeringan tahap pertama . Sisa kapas yang tidak masuk digummg, kemudian kapas tersebut ditekan ke dalam ampul tiengan menggunakan batang besi yang sudah dibakar dahulu sebelum dipergunakan hingga mencWai letak 1-2 mm di atas kertas label (Gambar ld). Ampul-ampul yang sudah berisi kapas di daamnya kemudian dibentuk agar berleher (Gambar le) dengan menggunakan mesin pembentuk leher ampul (ampoule constrictor). Tujuan dari PembeMilcan leher amPul ini adalah untuk memudahkan dalam prows penutupan (sealing) atau pemotongan pada proses akhir pengeringan tahap kedua (Anon., 1983) .
Pengeringan tahap kedua (secondary drying) 1.
34
Tangkai puting (nipple) dipasangkan di atas ruang kondensor mesin pengeringbeku. Katup pembocor ditutup, lalu mean refrigerator serta pompa hisapnya dijalankan. Ampul-ampul yang sudah berleher dipasangkan pads putingPuting tadi (Gambar 4). Proses pengisapan terus berlangsung MAW mikroba menjadi
Temu Teknis Fungnonal nonPenefitl 2000
2.
3.
lebih kering . Dalam proses ini waktu yang diperlukan relatif bervanasi bergantung pada volume serta sifat ataujenis bahannya yaitu 2 jam untuk suspensi berstfat pada umumnya dan 3 jam untuk suspensi yang bersifat lengket . Bila bahan diperkirakan sudah cukup keying, maka proses kedua ini dapat diakhiri dengan penutupan atau pemotongan ampul-ampul dalam kondisi hampa udara di dalamnya dengan menggunakan alat pengelas ampul (Edward flamemaster hand torch flame) (Garnbar If) . Proses ini berakhir dengan mematikan mesin refrigerator serta pompa hisapnya, kemudian membuka katup pembocor. Kehampaan udara di dalam masing-masing ampul dipenksa dengan menggunakan alat pendeteksi kehampaan yang disebut spark tester model Edwards ST 4M. Dalam pengujian ini ampul yang di dalamnya hampa udara akan memancrarkan smar berwarna ungu, sedangkan arnpul yang tidak hampa udara misalnya karena bocor, tidak memancarkan smar tersebut (Rudge, 1984).
Penyimpanan 1. 2.
Ampul-ampul bensi awetan mikroba tersebut disimpan dalam leman berlaci yang disusun dalam kelompok (batch) dan diurut berdasarkan nomor yang tertera pada label . Dalam proses pengering-bekuan ini kandungan air bahan tidak dihilangkan secara total, tetapi disisakan . Pada pengenngan tahap awal (primary drying) kandungan air bahan adalah 5-10%, sedangkan pada pengeringan tahap kedua (secondary drying) kandungan air yang tersisa berkisar antara 1-2% (Lapage et al., 1970) .
HASIL
Adanya pengawetan dengan metode p=genng-bekuan, Balitvet Culture Collection (BCC) telah banyak melakukan pengawetan mikroba . Sejak tahun 1982 hingga tahun 2000 yaitu sebanyak lebih dari 2300 isolat bakteri dan 200 lebih isolat kapang dan khamir telah diawetkan dan dikoleksi oleh BCC .
PEMBAHASAN
Walaupun metode pengering-bekuan merupakan metode yang efektif dan efisien, namun dalam investasi awalnya cukup besar sehingga cukup menyulitkan bagi yang menginginkan tetapi mempunyai dana terbatas. Disamping itu, tidak semua jenis mikroba cocok dengan metode ini sehingga pemakaian jenis metode lain masih punya peranan penting sesuai dengan kemampuan metode, dana, sumber daya manusia, dan rencana pemanfaatan dari pengawetan ini . Untuk biakan kerja (working culture), yaitu biakan pokok yang sexing dipergunakan sehan-han misalnya, maka akan lebih cocok bila digunakan metode pengawetan sistem pemindahbiakan (subculture) pada agar miring yang disimpan pada suhu rendah (refrigerator) atau sistem pembekuan atau cara lainnya. 35
Tenw Tekms Frngsional non Peneltti 1000
Di dalam laboratorium koleksi biakan terdapat berbagai macam atau jenis mikroba yang ditangam yang tentunya satu sama lain ada kecenderungan saling mencemari baik antar biakan maupun kepada operator atau teknisinya sehingga keselamatan kerja (teknisi den biakan) harus diperhatikan. Hal ini sangat erat kaitannya dengan fasilitas laboratorium, misainya alat biohazard (laminar flow/safety cabinet), isolasi niang antara permesinan den tempat inokulasi den lain-lain . Dengan dernildan pengadaan fasilitas pun harus ditingkatkan. Di laboratorium BCC kedua fasilitas tersebut tidak ada .
UCAPAN TEREWA KASIH
term kasih dituJukan kepada Bapak Drh. Sukardi H., MS; Bapak Ucapan Dr. Supar, MS. den IN Sri Rachmawati, BSc . atas petunjuk, bimbingan, dorongan den pengarahan yang diberikah kepada penulis.
DAFTAR PUSTAKA Anonimus. 1983 . Edward High Vacuum. Edward EF4 Modulyo Freeze Dryer Instruction. Manor Royal, Crawley, Sussex, England Arx J.AV. and MAA Schipper . 1978 . The CBS Fungus Collection. Advanced Appl. Microbiol . The CBS Fungus Collection . Acad. Press. Inc. 24, p. 221 . Lapage, S.P., J.E. Shelton, T.G. Mitchell, and A.R Marckenzic. 1970. Method in Microbiology. Acad. Press, London. 3A, pp. 1-2, 170-194 . Murray, C. 1986. Salmonella Reference Lab., Adelaide, Australia . (Konsultasi pribadi). Rudge, RH. 1984. Maintenance of Bacteria by Freeze Drying. Maintenance of Microorganisms . Acad. Press London . 1984. Ch. 4. p. 27. Sly, L.I . 1984 "Maintenance and Preservation of Microbial Culture in a Laboratory Culture Collection" . Special arlicle. Culture Collection, Dept. of Microbiology, University ofQueensland. Sly, L.I. 1985 . The Conservation of Our Microbial Heritage. Applied Micobiology. D. Riedel Publish . Co. UNESCO, Paris. Pp. 1-3. Sugiawan, W. 1986. "Teknik den Manajemen Koleksi Biakan7 . Laporan kursus pendek di koleksi kultur di Salmonella Reference Laboratory, Institute ofMedical Veterinary Science, Adelaide den Dept. of Microbiology, University of Queensland.
Temu Tekms Fungsfonal non Penefti 2000
l amplran 1 . a.
b. 10 Aug.'00 BCC 689 C. 10 Aug.'00 BCC 689
~Aug .'00 BCC 689
e.
f.
Gambar 1. Ampul dan kertas label Keterangan : a. b. c. d. e. f.
Ampul gelas, ukuran 0 dalam 6 mm, panjang 100 mm, tebai 0,5 mm Kertas label berisikan tanggal proses pengering bekuan dan nomor kode isolat Ampul yang berisi kertas label Ampul yang sudah berisi biakan kering dan kertas label serta sumbat kapas Ampul yang sudah berleher (constricted ampoule) Ampul yang sudah dipotong/ditutup (sealed ampoule)
t
Temu Tekms FungsionWwn Penelitz 2000
Lamphan 3 .
Gambar 3. Rak ampul
Gambar 4. Tangkai puling (nipples)
39
