SZTERINEK ZSÍROS OLAJOKBAN

2.4.23. Szterinek zsíros olajokban

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.1 - 1

04/2005:20423

2.4.23. SZTERINEK ZSÍROS OLAJOKBAN A SZTERINFRAKCIÓ ELVÁLASZTÁSA A zsíros olajból kivonjuk az el nem szappanosítható anyagokat, majd ebből 0,2 – 0,5 mm rétegvastagságú R VRK szilikagél lemezen, vékonyréteg-kromatográfia segítségével (2.2.27.) elkülönítjük a szterin-frakciót. Vizsgálati oldat (a). R betulin R diklórmetános oldatából (2 g/l) a meghatározandó minta szterintartalmának kb. 10 %-ával egyenértékű betulint tartalmazó térfogatot mérünk be egy visszafolyóhűtővel ellátott 150 ml-es lombikba. (Ha pl. olivaolajat vizsgálunk, 500 μl-t, míg egyéb növényi olaj vizsgálata esetében 1500 μl-t mérünk be a betulin-oldatból). Amennyiben a cikkely az egyes szterinek mennyiségét a szterin-frakció százalékában írja elő, betulin hozzáadására nincs szükség. Az oldatot R nitrogén-áramban szárazra párologtatjuk, és a maradékhoz 5,00 g (m g) vizsgálandó anyagot mérünk. 50 ml R alkoholos 2 M kálium-hidroxid–oldatot adunk hozzá, és gyakori rázogatás közben egy órán át vízfürdőn melegítjük. A melegítés befejeztével az oldatot 25 °C alá hűtjük, majd 100 ml R vízzel választótölcsérbe öblítjük és 3 × 100 ml R peroxidmentes éterrel óvatosan kirázzuk. Az éteres fázisokat egy másik – 40 ml R vizet tartalmazó – választótölcsérbe gyűjtjük. Néhány percig tartó, óvatos rázogatás után megvárjuk a fázisok szétválását, majd a vizes fázist elöntjük. Az éteres fázist annyiszor 40 ml R vízzel mossuk, amennyi elegendő ahhoz, hogy a vizes fázisban a fenolftalein már ne jelezzen lúgosságot. Az éteres fázist R peroxidmentes éterrel egy lemért lombikba öblítjük, majd az étert a megfelelő óvórendszabályok figyelembevételével ledesztilláljuk. A maradékhoz 6 ml R acetont adunk. Az oldószert levegőárammal gondosan elűzzük, és a maradékot 100 – 105 °C-on tömegállandóságig szárítjuk. Exszikkátorban hagyjuk lehülni, majd lemérjük és ezután R diklórmetánnal egy kisméretű kémcsőbe mossuk át. Az oldatot R nitrogén-áramban kb. 1 ml-nyire bepárologtatjuk. Az oldat végső koncentrációját – aszerint, hogy mennyi az olajban az el nem szappanosítható anyag – 25 és 50 mg/ml közé állítjuk be. Vizsgálati oldat (b). 5,00 g R repceolajat – az ”50 ml R alkoholos 2 M káliumhidroxid–oldatot adunk hozzá …” kezdetű mondattól – a vizsgálandó anyagra előírtak szerint kezelünk.



Vizsgálati oldat (c). 5,00 g R napraforgóolajat – az ”50 ml R alkoholos 2 M kálium-hidroxid–oldatot adunk hozzá …” kezdetű mondattól – a vizsgálandó anyagra előírtak szerint kezelünk. Összehasonlító oldat. 25 mg R koleszterint és 10 mg R betulint 1 ml R diklórmetánban oldunk. A vizsgálati oldatok mindegyikét külön lemezen vándoroltatjuk. Az összehasonlító oldatból 10 μl-t viszünk fel, mégpedig a lemez aljától 20, a bal szélétől 10 mm távolságra, 10 mm szélességű sáv formájában; az a), a b) és a c) vizsgálati oldatból 0,5 – 0,5 ml-t viszünk fel, a lemez aljától 20 mm távolságra, 150 mm szélességű sáv formájában. A lemezeket 35 térfogatrész R éter és 65 térfogatrész R hexán elegyével 17 cm fronttávolság eléréséig kifejlesztjük, majd R nitrogén-áramban megszárítjuk. Ezután R diklórfluoreszcein R etanollal készült oldatával (2 g/l) bepermetezzük, és 254 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Az összehasonlító oldat kromatogramján a koleszterin és a betulin sávja látható. A vizsgálati oldatok kromatogramjain közel azonos Rf-értékű szterin-sávok jelennek meg. A három vizsgálati oldat kromatogramjának szterinsávok által elfoglalt területéről – melyeket az összehasonlító oldat kromatogramján látható zónák alatti és feletti 2 – 3 mm-es sávoknak megfelelő területekkel megnövelünk – leszedjük a réteget és külön-külön három 50 ml-es lombikba juttatjuk. A lombikok mindegyikébe 15 ml R diklórmetánt öntünk, és az így kapott szuszpenziókat – keverőt és visszafolyóhűtőt alkalmazva – 15 percen át melegítjük, majd zsugorított üvegszűrőn (40) vagy alkalmas szűrőpapíron egyenként megszűrjük. A szűrőket 3 × 15 ml R diklórmetánnal mossuk. A három szüredéket – a megfelelő mosófolyadékokkal egyesítve – külön-külön lombikba visszük és R nitrogén– áramban 5 – 10 ml-nyire bepárologtatjuk. A bepárolt oldatokat kisméretű kémcsövekbe visszük és R nitrogén–áramban beszárítjuk. A SZTERINEK MEGHATÁROZÁSA Gázkromatográfiás meghatározást végzünk (2.2.28.). A vizsgálat során ügyelünk a nedvesség kizárására, és az oldatokat frissen készítjük. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk.



Összehasonlító oldat (a). Az R repceolajból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez (9 rész) R koleszterint (1 rész) adunk. A keverékhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk. Összehasonlító oldat (b). Az R napraforgóolajból vékonyréteg-kromatográfiásan elkülönített szterinekhez 0,04 ml R klór-trimetilszilán, 0,1 ml R hexametildiszilazán és 0,5 ml R vízmentes piridin frissen készített elegyét adjuk. Az így nyert keveréket legalább 5 percig állni hagyjuk. A továbbiakban a folyékony fázist használjuk. Oszlop: −

anyaga: kvarcüveg,

−

méretei: l = 20 – 30 m, ∅ = 0,25 – 0,32 mm,

−

állófázis: R poli[metil(95)fenil(5)]sziloxán vagy R poli[(cianopropil)(7)(fenil)(7)(metil)(86)sziloxán] (filmvastagság: 0,25 μm).

Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hidrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium. Lineáris sebesség: 30 – 50 cm/s (hidrogén), ill. 20 – 35 cm/s (hélium). Mintaáram-elosztási arány: 1:50, ill. 1:100. Hőmérséklet: −

oszlop: 260 °C,

−

injektor: 280 °C,

−

detektor: 290 °C.

Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 μl.



Követelmények: az a) összehasonlító oldat kromatogramján négy fő csúcs – a koleszterin, a brasszikaszterin, a kampeszterin és a β-szitoszterin csúcsa – jelenik meg. A b) összehasonlító oldat kromatogramján szintén négy fő csúcs – a kampeszterin, a sztigmaszterin, a β-szitoszterin és a Δ7-sztigmasztenol csúcsa – látható. A retenciós időket – a β-szitoszterin retenciós idejére vonatkoztatva – a 2.4.23.-1 táblázat foglalja össze. A belső standard (betulin) csúcsa egyértelműen különüljön el a meghatározandó szterincsúcsoktól. A vizsgálati oldat kromatogramján a vizsgálandó anyag szterinfrakciójának minden összetevőjét azonosítjuk és az alábbi összefüggés alapján százalékban kifejezett mennyiségét is kiszámoljuk:

100

A , S

ahol A = a meghatározandó összetevő csúcsterülete, S = a 2.4.23.-1. táblázatban feltüntetett összetevők csúcsterületeinek összege. Amennyiben a cikkely előírja, kiszámoljuk az egyes szterineknek a vizsgálandó anyag 100 g-jára vonatkoztatott, milligrammban kifejezett mennyiségét. A számításhoz az alábbi képletet használjuk.

100 ⋅ A ⋅ m′ , A′ ⋅ m ahol A = a meghatározandó összetevő csúcsterülete, A’ = a betulin csúcsterülete, m = a vizsgálandó minta mennyisége grammban, m’ = a hozzáadott R betulin mennyisége milligrammban.



2.4.23.-1. táblázat.– A β-szitoszterinre vonatkoztatott retenciós idők, két különböző oszlopon mérve.

Koleszterin Brasszikaszterin 24-Metilén-koleszterin Kampeszterin Kampesztanol Sztigmaszterin Δ7-Kampeszterin Δ5,23-Sztigmasztadienol Kleroszterin β-Szitoszterin Szitosztanol Δ5-Avenaszterin Δ5,24-Sztigmasztadienol Δ7-Sztigmasztenol i Δ7-Avenaszterin Betulin

i

Poli(cianopropil)(7)(fenil)(7)(metil)(86)sziloxán 0,64 0,70 0,79 0,82 0,83 0,87 0,93 0,95 0,96 1 1,01 1,03 1,09 1,13 1,18 1,4

az irodalomban Δ7-sztigmaszterin néven is szerepel.

Poli[metil(95)fenil(5)]sziloxán 0,63 0,71 0,80 0,81 0,82 0,87 0,92 0,95 0,96 1 1,02 1,03 1,08 1,12 1,16 1,4

SZTERINEK ZSÍROS OLAJOKBAN

Recommend Documents