SZENT ISTVÁN EGYETEM

SZENT ISTVÁN EGYETEM

IN VITRO SZOMATIKUS SEJTEK - ÉS EMBRIÓK KRIOPREZERVÁLÁSA Doktori (PhD) értekezés

Írta: dr. Jekkel Zsolt

Gödöllő 2000

2

A doktori program

címe:

NÖVÉNYNEMESÍTÉS ÉS BIOTECHNOLÓGIA

alprogram címe:

NÖVÉNYNEMESÍTÉS GENETIKAI ÉS BIOTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL

tudományága:

vezetője:

biológia

Dr. Heszky László egyetemi tanár, MTA lev. tagja SZTE, Genetika és Növénynemesítés Tanszék

Témavezető:

Dr. Heszky László egyetemi tanár, MTA lev. tagja SZTE, Genetika és Növénynemesítés Tanszék

...............................................

................ ........................

A programvezető jóváhagyása

A témavezető jóváhagyása

3

Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS

4 6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1 A víz fázisváltozásai 2.2. Sejtes rendszerek fagyása 2.2.1. Hipoterm (0-40 °C közötti) fagyás 2.2.1.1. Intra- és extracelluláris jégképződés 2.2.1.2. Az ozmotikus dehidratáció hatása a membrán szerkezetre 2.2.2. Ultramély (kriogén, -140 °C alatti) fagyás 2.3. A fagytűrés molekuláris szabályozása 2.3.1. Stresszgén expresszió indukciója 2.3.2. Stresszfehérjék és funkciójuk 2.4. In vitro fagyásvédelem 2.4.1. A membrán stabilitás fenntartása fagyásvédő vegyületekkel 2.5. Szomatikus sejtek, szövetek, szervek ultramélyfagyasztásos technikái 2.5.1. Előkezelési eljárások 2.5.2. Víztelenítési módszerek 2.5.3 Tárolás, felolvasztás és a túlélés meghatározása

8 8 9 9 9 9 10 11 11 13 16 17 18 19 21 22

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Szövettenyészetek 3.1.1. Tesztnövények 3.1.2 Általános tenyésztési körülmények 3.1.3. Speciális tenyésztési körülmények 3.2. Ultramélyfagyasztás 3.2.1. Előkezelés 3.2.1.1. Fagyásvédő vegyületek 3.2.1.2. Szárítás és hősokk 3.2.2. Fagyasztó oldatok 3.2.2.1. PVS- 2 vitrifikáló oldat 3.2.3. Fagyasztás, tárolás és felolvasztás 3.2.4. Utótenyésztés és a túlélés meghatározása.

24 24 24 24 25 26 26 26 27 27 28 28 29

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1. A fagyasztási program hatása a mézpázsit sejtek túlélésére 4.2. AzABS hatása a vadgesztenye embriók és kukorica sejtek túlélésére 4.2.1. A szárítás hatása a vadgesztenye embriók túlélésére 4.2.2. A hősokk hatása a vadgesztenye embriók és kukorica sejtszuszpenziók túlélésére 4.2.3. A vitrifikáló oldat és az alginát burok hatása a kivi embriók túlélésére 4.3. A szaharóz és cukoralkoholok hatása az Arabidopsis és kukorica sejtek túlélésére 4.3.1. A krioprezerválás hatása a kukorica sejtek morfogenetikai képességre 4.3.2. Az afp transzformáció hatása a transzgénikus kukorica sejtek túlélésére

32 32 38 42

5. KÖVETKEZETETÉSEK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

69

6. ABSTRACT

74

7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

78

8. IRODALOM

79

45 48 52 60 63

4

RÖVIDÍTÉSEK 2,4-D=

2,4-diklórfenoxi-ecetsav

AA2=

aminosavas alap táptalaj (Abdullah et al. 1986)

ABS=

abszcizinsav

afp=

a fagyásvédő (antifreeze) proteint szintetizáló gén

AFP=

fagyásvédő (antifreeze) fehérjék

B5=

alap táptalaj (Gamborg et al. 1968)

BA=

6-benzil-aminopurin

blt=

árpában hidegre és ABS hatásra indukálódó(barley low- temperature induced) gének

BSA=

szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumine)

C 24=

columbiai, Arabidopsis thaliana ökotípus

cor=

hideg hatásra indukálódó(cold- regulated) gének

DMSO=

dimetil-szulfoxid

E1=

alap táptalaj (Gamborg et al. 1983)

E1B5=

vadgesztenye szomatikus embrió fenntartó táptalaj (Kiss et al. 1992)

EG=

etilénglikol

FDA=

fluoreszcein-diacetát

F. Kontr.=

előkezelés és WK oldat nélkül, csak a folyékony fenntartó táptalajban fagyasztott (abszolut) kontroll

FN=

folyékony nitrogén

HSP=

hősokk fehérjék (heat shock proteins)

IVS=

indolvajsav

IP3=

foszfoinozitid

kin=

hideg hatásra indukálódó gének

LEA=

késői embriógenezis (late embryogenesis abundant) fehérjéi

LER=

Erecta, Arabidopsis thaliana ökotípus

lti=

hideg hatásra indukálódó (low temperature induced) gének

MS=

Murashige-Skoog alap táptalaj (Murashige és Skoog 1962)

MSCE/79=

kukorica sejtszuszpenziós tenyészet (Mórocz et al.1990)

N6=

alap táptalaj (Chu et al. 1975)

5

N6M=

kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek fenntartó táptalaja (módosított N6, Mórocz et al.1990)

N.F. Kontr.= nem fagyasztott, kezeletlen kontroll P5CS=

pirolin-5-karbonsav-szintáz

PVP=

poli (vinil-pirrolidon)

PVS-2=

vitrifikáló oldat (plant vitrification solution); 30% szaharóz, 15% DMSO, 15% EG (Sakai és Kobayashi, 1990)

rab=

ABS-re válaszadó (responsive to ABA) gének

rci=

hideg hatásra indukálódó (rare-cold -induced) gének

rd=

hideg hatásra indukálódó gének

SOD=

szuperoxid-diszmutáz

Tg=

üvegesedési hőmérséklet (temperature of glass transformation)

Th=

a spontán fagyás hőmérséklete (temperature of homogeneous nucleation)

Tm=

olvadáspont (melting temperature)

TTC=

trifenil-tetrazólium-klorid

WK=

krioprotektáns oldat (.0.5 M DMSO, 0.5 M glicerin, 1.0 M szaharóz). (Withers és King 1980)

WPM=

alap táptalaj (woody plant medium, Lloyd és McCown 1980)

WS=

Wassilewskija, Arabidopsis thaliana ökotípus

BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS

6

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS Az in hőmérsékleti

vitro

tenyésztett

(kriogén)

növényi

tartományban

sejtek,

történő

szövetek, fenntartása,

szervek a

ultramély

krioprezerválás

jelentősége a hagyományos és a molekuláris növénynemesítési technikák fejlődésével megnőtt. A mélyfagyasztási technikák – e területen- két irányba specializálódtak. A publikált eredmények egy része különböző genetikai tartalékok (i) fajtaazonos

tárolását

ismerteti.

A

közlemények

másik

része

viszont

a

krioprezerválást a növényi szövettenyésztés speciális technikájaként alkalmazva meghatározott (ii) sejtciklus és differenciáltsági fokú explantumok folyékony nitrogénben történő konzerválásáról számol be. (i) A megbízható fajtaazonos tárolási módszerek kialakítása a vegetatív úton szaporított és az életképességüket szárítás után elvesztő ún. rekalcitráns magvú fajok esetében a tradicionális növénynemesítés régi igénye. A differenciálódás előrehaladott szintjén álló szövetek (merisztémák), szervek (szomatikus és zigótikus embriók, hajtáscsúcsok és a magvak) krioprezervációja elsősorban ezt a célt szolgálja. A szövettenyésztési, biotechnológiai eljárások eredményeként létrejövő új szomaklónok, gametoklónok, alkaloid termelő és transzgénikus sejtvonalak stabil tárolásának szükségessége viszont a kevésbé differenciálódott sejt és kallusz tenyészetek mélyfagyasztásos tárolását indokolja. (ii) Egyes növénybiotechnológiai eljárások: a sejtszuszpenzió eredetű protoplasztálás, az idegen pollen megporzásos haploid indukció, az in vitro termékenyítésű faj- és nemzetségkeresztezések, a sejtciklus és a differenciálódás meghatározott szintjén álló sejtek, szövetek, szervek használatán alapulnak. Ez nagyszámú

törzstenyészet

és

donor

növény

folyamatos

fenntartását

teszi

szükségessé. Amennyiben a sejtszuszpenziós- és embriótenyészetek, illetve a pollen folyékony nitrogénre alapozott, megbízható tárolási technikái rendelkezésre állnak, a fenti módszerek, üvegházi és tenyésztőszobai kapacitástól függetlenül, elvileg korlátlanul alkalmazhatóak. Az explantumok kriotoleranciáját a sejtek fagyasztható víztartalma, illetve a sejtmembránok stabilitása határozza meg. Az ismert krioprezervációs technikák a tenyészetek fagytűrését részben a víztartalom csökkentésével, részben a víz fizikai tulajdonságainak módosításával, továbbá a membránstabilitás fentartásával hozzák létre.

A sejtek dehidratált fázisa a fagyasztási program elemeinek változtatásával,

BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS

7

ozmotikumot

tartalmazó

táptalajon

szárításukkal

érhető

A

el.

víz

való

tenyésztésükkel,

fagyaszthatósági

vagy

tulajdonságai,

közvetlen valamint

a

membránintegritás, a táptalajhoz adagolt fagyásvédő vegyületekkel, továbbá a környezeti sztesszhatásokra szintetizálódó védő fehérjékkel szabályozható. Disszertációm témájának a tenyésztett szomatikus növényi sejtek, szövetek, szervek krioprezerválását választottam. A kísérleteket a közönséges [Puccinellia distans (L.) Parl. és a sziki mézpázsit [Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg.], a lúdfű [Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. és a kukorica [Zea mays (L.)] sejtszuszpenziós, továbbá a vadgesztenye [Aesculus hippocastanum (L.)] és a kivi [Actinidia deliciosa (A.) Chev.] szomatikus embrió tenyészetein állítottuk be. Kísérleteim fő célja - a krioprezerváció különböző lépéseinek módosításával egyrészt a mélyfagyasztott explantumok túlélésének elérése, másrészt a túlélési százalék javítása volt. Bizonyítani kívántam: (1), hogy a fagyasztási sebesség, a transzfer hőmérséklet és a transzfer hőmérsékleten tartás optimalizálásával a sejtszuszpenziós tenyészetek túlélésének feltételei kialakíthatók, (2), hogy az abszcizinsav, cukor és prolin előkezelés megfelelő kombinációival a szomatikus embriókban és tenyésztett szomatikus sejtekben fagyvédelem alakítható ki, (3), hogy a stressz fehérjéknek és az abszcizinsavnak fontos szerepe van tenyészetek kiszáradással (deszikkáció) szembeni tűrőképességének fokozásában és így a deszikkáció hatására létrejövő kriotoleranciában Választ kívántam kapni arra: (4), hogy hősokk kezeléssel helyettesíthető –e a lassú előfagyasztás, (5), hogy a PVS-2 vitrifikáló oldat toxicitása csökkenthető-e ABS-al és alginát géllel szomatikus embriókban, (6), hogy a cukor és cukoralkohol kezelésekkel kialakítható-e kriotolerancia különböző sejtszuszpenziókban, (7), hogy az afp (anti-freeze protein) gén transzformációval a fagyásvédő fehérjét szintetizáló transzgénikus klónokban javítható-e a kriotolerancia.

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

8

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. A víz fázisváltozásai A sejtes rendszerek

anyagcserefolyamatai

tartományon

károsodnak.

(0-50°C)

kívül

Az

élet

a

kedvező

hőmérsékleti

anabiotikus

formában

a

határértékeken túl, a halálpontokig fenntartható, az extrém hőmérsékletek további változásával azonban - magas hőmérsékleten a makromolekulák hőkoagulációja, alacsony hőmérsékleten a víztartalom megszilárdulása miatt - megszűnik (Harsányi 1976). Az

optimális

növekedés

hőmérsékleti

tartományában

a

tetraéderes

vízszerkezet, a H-kötések átrendeződése révén, állandó keletkezésben és megszűnésben van. A hőmérséklet csökkenésével mérséklődik a hőmozgás és a tiszta víz, jégmag gócok jelenlétében, olvadáspontján (Tm) 0 °C-on megszilárdul. Jégmagok hiányában azonban a víz átmenetileg a Tm érték alatt is folyékony fázisban tartható, túlhűthető. Mínusz 40 °C alatti hőmérsékleten (spontán fagyás hőmérséklete Th) a túlhűtött vízmolekulák spontán aggregációjuk következtében megszilárdulnak (Meryman és Williams 1985). A víz szilárdulásának két szélsőséges lehetősége: a molekulák szabályos térszerkezetbe rendeződése a kristályosodás, illetve az üvegszerű amorf fázis kialakulása, a vitrifikáció. A fagyáspont és –80 °C között jellemző hatszöges kristályszerkezet -80 és -140 °C között köbös szerkezetűvé válik (Harsányi 1976). A vitrifikált, amorf állapot -140 °C alatt, az üvegesedési hőmérsékleten (Tg) alakul ki. A tiszta víz fagyására jellemző három kritikus hőmérsékleti érték (Tm, Th, Tg) vizes oldatokban az oldat koncentrációjának függvényében lényegesen módosul. A koncentráció növekedésével a Tm és Th értékek csökkennek, a Tg hőmérséklet viszont növekszik. Tömény oldatokban (pl. 70%-os glicerinben, vagy 55%-os PVP [poli (vinil-pirrolidon)]-ban a Th értéket azonnal, vagy csak kis hőmérséklet különbséggel követi az üvegesedési hőmérséklet (Ramussen és Luyet 1970), emiatt a túlhűtött folyadék szilárdulásakor közvetlenül amorf fázis alakulhat ki.


9

2.2. Sejtes rendszerek fagyása 2.2.1. Hipoterm (0-40 °C közötti) fagyás A sejtes rendszerek fagyása hipoterm hőmérsékleten (0-40 °C) három egymást követő folyamattal jellemezhető. Állati és növényi szövetekben a hőmérséklet csökkenés hatására a sejtközötti vizes oldatok megszilárdulnak (1). Ennek következtében a sejt ozmotikusan dehidratálódik (2), amit a sejthártya fiziológiai és struktúrális elváltozásai (3) követnek és végül a sejtek pusztulását okozzák.

2.2.1.1. Intra - és extracelluláris jégképződés Celluláris rendszerek citoplazmájában természetes körülmények között nincsenek jégképződéshez szükséges gócok, az extracelluláris járatokban viszont igen. Fagyasztás során ezért a sejtközötti járatokban kezdődik a kristályosodás, a sejtnedv azonban túlhűthető (Meryman és Williams 1985). A gyorsan fagyasztott szövetek sejtjeiben (1000-2000 °C/perc) a szabad víz hőmérséklete hamar eléri a túlhűthetőség határát és intracelluláris jég képződik (Williams 1981). A sejten belüli nagy gőznyomású kristályos szerkezetű jég fizikai nyomása (Mazur 1970), illetve a makromolekulákra gyakorolt vízelvonó hatása miatt mind a növényi, mind az állati szövetek pusztulását okozza (Harsányi 1976). A természetes fagyásra jellemző nagyon lassú fagyasztási sebesség (0.05°C/perc) mellett a víz fázisváltozása az extracelluláris térben kezdődik, a sejtközötti oldat moláris koncentrációja által meghatározott fagypont alatti hőmérséklet elérése után (Raoult törvény). Az extracelluláris jégkristályok megjelenésével a sejtközötti oldat szabad víztartalma csökken, hipertóniássá válik. A sejt felszínén kialakuló ozmotikus grádiens hatására a sejtből diffúzió útján víz távozik, dehidratálódik, ami a sejttérfogat csökkenéséhez és az intracellulárisan oldott anyagok koncentrációjának növekedéséhez (oldateffektus) vezet (Meryman 1974). A dehidratáció állandó hőmérsékleten

az

extra-

és

intracelluláris

tér

vízpotenciál

különbségének

kiegyenlítődéséig tart (Hansen és Beck 1988).

2.2.1.2. Az ozmotikus dehidratáció hatása a membrán szerkezetre Az ozmotikus dehidratáció után fellépő káros fiziológiai és strukturális változások magyarázatára több elméletet dolgoztak ki. Mindegyik azonos abban,

10


hogy a stressz fő hatása a sejtmembránhoz kapcsolódó funkciók károsodása. Dehidratált szövetekben a sejtek térfogatának csökkenése és az oldott sók koncentrációjának növekedése következik be. A minimum térfogat elmélet alapján (Meryman 1970, 1974, Williams és Hope 1981) a károsodás oka a térfogatvesztésből eredő membránfelület csökkenés. Hipertóniás közegben a sejtek a térfogatuk egy kritikus érték alá való csökkenését már nem képesek elviselni. A felolvadáskor, az extracelluláris tér hígulásával a membrán, -szerkezeti és funkcionális változásai miatt- az oldott anyagokra áteresztővé válik, és a sejt eredeti térfogatának elérése előtt szétesik (tágulás hatására bekövetkező lízis) (Steponkus 1984). A termál sokk hipotézis szerint (Daw et al. 1973) a sejtben kialakult nagy ozmolaritású, tömény oldatok hatására a sejthártya elveszti eredeti ozmózisos érzékenységét. A membránfehérjék és a kapcsolódó ATP-áz fehérjék konformációja (Wiest és Steponkus 1978), -lammeláris-hexagonális fázisváltozáson keresztüllipidekkel való kölcsönhatása megváltozik (Gordon-Kamm és Steponkus 1983, 1984). Emiatt sérül az aktív iontranszport (Palta és Li 1978). Az extracelluláris tér a fagyott víz felolvadáskor hígul. Ozmotikus gradiens mentén a vakuolumokból oldható 2+ cukrok, K és Na ionok távoznak a sejtközötti térbe. A membránt stabilizáló Ca -ot, a

nagy feleslegben jelen lévő K- ionok helyettesítik, aminek a sejthártya rendszer teljes szétesése a következménye. Az ionpumpa működésképtelensége miatt a sejtből kiáramlott elektrolitok visszajutása gátlódik, a sejtmembrán külső és belső oldalán lévő oldatok ozmotikusan kiegyenlítődnek, a szövet turgora csökken, a sejtközötti tér vizzel telítődik, a szövet végül oxigén és -a mitokondriumok és kloroplasztiszok sérülése következtében- energia ellátás hiányában elpusztul (Palta és Li 1978).

2.2.2. Ultramély (kriogén, -140 °C alatti) fagyás A sejtes rendszerek kriogénikus hőmérsékleti tartományra történő fagyasztása csak mesterséges körülmények között, a szövetek, sejtek cseppfolyós gázokba: folyékony hidrogén, oxigén, hélium, praktikus okok miatt azonban legtöbbször folyékony nitrogénbe (FN) való merítésével valósítható meg. Az élő rendszerben mínusz 140 °C alatti hőmérsékleten nem történnek fizikai és kémiai változások (Meryman és Williams 1985). A túlélés valószínűsége a hőmérséklet csökkenésével növekszik (Harsányi 1976). A kriogén zónában amorf formába szilárdult (Luyet 1966) oldatok teljes átkristályosodási ideje, a lassú diffúziós

11


sebesség miatt 108 év (Meryman 1966), ezért az állapot rendkívül stabil (kriogén stabilitás) (Finkle et al. 1985).

2.3. A fagytűrés molekuláris szabályozása A növények az alacsony hőmérsékletet eredetük és földrajzi elterjedtségük alapján eltérő mértékben viselik el. A trópusi, szubtrópusi fajok többsége hideg érzékeny, a fagypont feletti alacsony hőmérsékleten (5-10°C) is károsodnak (Lyons et al. 1979). Néhány hidegtűrő faj viszont elviseli ezt a hőmérsékletet (Levitt 1980). A fagytűrő mérsékelt égövi növények tág hipotermikus hőmérsékleti határok (-5-40°C) elviselésére képesek (Levitt 1980, Guy 1990). Többségükben rövid ideig tartó fagypont feletti alacsony hőmérsékleti kezeléssel (hidegedzés, akklimatizáció), a fagytűrés indukálható (Sakai és Larcher 1987). Hidegakklimatizáció hatására megváltozik a membránok szerkezete, zsírsav összetétele (Steponkus és Lynch 1989), a szövetek hormon, oldható szénhidrát, -aminosav és fehérje- tartalma, valamint enzimaktivitása (Levitt 1980). Bizonyított, hogy a fagyrezisztencia létrehozásában szerepet játszó anyagcsere módosulások többsége génexpressziós változások következménye (Guy 1990, Thomashow 1990).

2.3.1. Stresszgén expresszió indukciója A sejtes rendszerek abiotikus stressz (fagy, ozmotikum , és vízstressz,) hatására bekövetkező károsodása sok hasonlóságot mutat (Levitt 1980, Cloutier és Siminovitch 1982). Mindhárom folyamat következtében vízhiány alakul ki a sejtekben, ezért akklimatizációs kezeléssel kereszt-tolerancia hozható létre (pl. szárítás, ozmotikumokkal való kezelés fagytűrést eredményez). Az induktív körülmények abszcizinsav kezeléssel részben helyettesíthetők. Mindhárom stressz hatására azonos, vagy részben azonos gének aktivációja figyelhető meg, ami valószínűsíti, hogy nagyrészt közös genetikai szabályozás alatt állnak (Bray 1993, Nordin et al. 1993, Galiba 1994, Shinozaki és Yamaguchi-Shinozaki 1997). Alacsony hőmérséklet hatására indukálódó géneket (cor, lti, rd, kin, rab, rci, cap) izoláltak Arabidopsis-ból (Haleja et al. 1990, Kurkela és Franck 1990, Nordin et al. 1991, Gilmour et al. 1992, Kurkela és Borg-Franck 1992, Lang és Palva 1992, Lin és Thomashow 1992, Horvath et al. 1993, Jarillo et al. 1994), spenótból (Guy és Haskell 1987), paradicsomból (Schaffer és Fischer 1988), lucernából (Mogapatra et al. 1989), árpából (Cattivelli és Bartels 1990, Dunn et al 1991, Huges et al. 1992,


12

Goddard et al. 1993), búzából (Houdge et al. 1992), kukoricából, rizsből (Christine et al. 1991), repcéből (Vasques et al. 1993), juharból (Bertrand et al. 1997), őszibarackból (Arora és Wisniewski 1995) és Solanum commersonii-ból (Zhu et al. 1993). Az izolált gének nagy része a hideg mellett a víz stressz és exogén abszcizinsav kezelések hatására is megnyilvánult. Egyes gének termékeit viszont csak hideg akklimatizáció után lehetett kimutatni (rci1, rci2-Jarillo et al. 1994, Cor6.6, cor47, lti78 -Gilmour és Thomashow 1991, Nordin et al. 1991, Wcs120- Houdge et al. 1992, blt101 -Goddard et al. 1993, Grossi et al. 1992, cas18- Wolfraim et al. 1993, Bnc24 -Weretilnyk et al. 1993, Vasques et al. 1993). A cDNS szekvenciák összehasonlító vizsgálatai bizonyították, hogy több, hideg hatásra indukálódó fehérje homológ az embriogenezis késői fázisában (mag száradás) megjelenő LEA (Late Embryogeneis Abundant) és a vegetatív szövetek dehidratálódása során képződő dehydrin fehérjékkel (Baker et al. 1988, Gilmour et al. 1992, Guo et al. 1992, Houdge et al. 1992, Lang és Palva 1992, Lee és Chen 1993, Luo et al. 1992, Sutton et al. 1992). A

magas

hőmérséklet

hatására

indukálódó

hősokkfehérjék

(HSP)

megjelenése eukarióta szervezetekben általános. Biokémiai funkciójuk a hősokk hatására károsodó fehérjék felhalmozódásának gátlása (Howarth és Ougham 1993). Hőstressz alkalmazásával azonban fagy- és hidegtűrő képességet is sikerült kialakítani élesztő sejtekben (Kaul et al. 1992), mungó bab hipokotil szövetekben (Collins et al. 1993) és csírázó uborka magvakban (Jennings és Saltveit 1994). A hősokk kezelés a szárazság tűrés növekedését eredményezte szomatikus dohány sejtekben (Harrington és Alm 1988) és repce pollenembriókban (Andarajah et al. 1992). Hősokkfehérjék és vízstressz határa indukálódó polipeptidek génjeiben homológ szakaszokat mutattak ki lucernában (Györgyei et al. 1991), spenótban (Neven et al. 1992, Guy et al. 1994), napraforgóban (Almogurea és Jordano 1992), szójában (Czarnecka et al. 1984, 1988), burgonyában (van Berkel et al. 1994) és Arabidopsis-ban (Kiyosue et al. 1994). A környezeti jelzések érzékelésésében és génregulációs hatásában az ABS központi szerepet tölt be (Li et al. 1989, Quamaruddin et al. 1993). Bizonyos stresszgének indukciója kiváltható ABS kezeléssel. Minden géncsaládban találtak azonban olyanokat, amelyek expresszióját az ABS nem befolyásolja. Az abiotikus stresszválasz molekuláris szabályzásában ezért az ABS- függő modell (1) mellett valószínűleg az endogén ABS tartalomtól független reakció (2) utak is működnek


13

(Skriver és Mundy 1990, Bray 1993, 1997, Shinozaki és Yamaguchi -Shinozaki 1997, Ingram és Bartels 1996). Nem ismert pontosan az a jelátviteli rendszer, ami a környezeti stressz hatására kialakult fizikai jelenséget, a vízhiányt érzékelve- ABS közvetítéssel, vagy anélkül -a gének különböző megnyilvánulását eredményezi. Feltételezik, hogy az elsődleges jelzés a sejtek csökkent turgor nyomása, vagy térfogata. Ez a turgor csökkenésre indukálódó gének (Guerrero és Mullet 1988), vagy ozmoszenzorok (Madea et al. 1995) indukcióján keresztül, ion csatornák és inaktív transzport rendszerek aktiválódását eredményezi (Schroeder és Hedrich 1989, Wurgler-Murphy és Saito 1997). Az abszcizinsavtól független stresszgén szabályzásban a Ca-ionok a másodlagos hirvivők. Néhány sejt (őrsejtek) Ca-ion szintje foszfoinozitid (IP3) közvetítéssel ugrásszerűen megnő (Cote 1995). A megemelkedett Ca-ion és IP3 koncentráció fehérje foszforilációs folyamatokon keresztül a stresszrezisztencia gének indukcióját eredményezi (Shinozaki és Yamaguchi -Shinozaki 1997). Az ABS közvetítéssel szabályozott szignál transzdukció során, az őrsejtekben turgor változásra bekapcsolódó érzékelők hatására -az ABS de novo bioszintézisének, vagy a kloroplasztiszokból történő felszabadításának indukciójával- megnő a sejtek endogén ABS tartalma (Zeevaart és Creelman 1988). Membrán potenciál mérések + alapján bizonyították, hogy az ABS, a H -függő ATP-áz aktiválásával átmenetileg

hiperpolarizálja a plazma membránt, ami a K+ csatornák megnyitását eredményezi. A K-ionok fiziológiai hatása az ABS függő génregulációban nem ismert pontosan, de feltételezik, hogy a mRNS-ek stabilitásában van szerepe. (Heimovaara-Dijkstra et al. 1994, Giraudat et al. 1994).

2.3.2. Stresszfehérjék és funkciójuk A vízstressz hatására szintetizálódó fehérjékről -ismert hatású polipeptidekkel való szekvencia összehasonlító vizsgálatok- kiderítették, hogy részben a membrán és

a

makromolekulák

ozmoprotektánsok

szerkezetét

bioszintézisében,

stabilizáló a

fehérjék

denaturálódott

(1),

fehérjék

részben

az

lebontásában,

továbbá a szövetek méregteleintésében résztvevő enzimek (2), illetve részben a stresszválasszal kapcsolatos további génexpresszió regulátorai (3) (Shinozaki és Yamaguchi -Shinozaki 1997). (1) A szerkezeti LEA fehérjék közös tulajdonsága, hogy hidrofil jellegűek, hőstabilak és a citoplazmában lokalizáltak. Aminosav szekvenciájukra jellemző a


14

cisztein és triptofán hiánya és ismétlődő, lizinben gazdag szakaszok jelenléte (Dure et al. 1989, Dure 1993). Felszíni töltéssel rendelkező, amfipatikus a-helixbe rendeződnek, emiatt a vizet megkötik (vízkötő fehérjék), a makromolekulákban és a membránban a vizet helyettesítik (kísérő fehérjék, chaperonok), fenntartják a membrán a vízáteresztő képességét (vízcsatorna fehérjék), illetve a vízhiány során túltöményedő citoplazmából ionokat kötnek meg (ion befogó fehérjék) (Bray 1993). A szerkezeti fehérjék különleges csoportját alkotják az áttelelő szervezetekben: sarkköri halakban (Davies és Hew 1990), szárazföldi ízeltlábúakban (Duman et al. 1991) és növényekben (Griffith et al. 1992, Urrutia et al. 1992, Duman és

Olsen

1993)

hidegedzés

hatására

akkumulálódó

fagyásvédő

fehérjék

(AFP=antifreeze proteins). A halakból izolált AFP-k 2.5-33 KD méretű molekulák. Az (Ala-Ala-Thr)n tripeptidek ismétlődése alapján (Hon et al. 1994) 3 csoportba sorolt (I., II., III. típus) AFP molekulák közül a Pseudopleuronectes americanus-ból származó I. típus a legismertebb. Az érett fehérje 4.3 KD nagyságú, 52 aminósavat, négy 11 aminosavból álló ismétlődő szekvenciát tartalmaz és 0 °C-on is megtartja a-helix szerkezetét (Chao et al. 1996). Halakban az AFP molekulák egyik jellegzetessége, hogy nagy koncentrációban ( > 100mg/ml ) a vizes oldatok fagyáspontját anélkül csökkentik, hogy olvadáspontjukat változtatnák (termál hiszterézis) (Hon et al. 1995). Az

I.

típusba

hidrogénkötéssel

tarozó

AFP

molekulák

adszorbeálódnak

a

felületén

jégmag

elhelyezkedő

gócokon,

valamint

treoninok a

jég

kristályrácsokon, elszigetelik a kristályosodó felületeket az újabb vízmolekulák elől, ezzel fagyáspont csökkenést, illetve a jégkristályosodás ütemének lassulását okozzák (Raymond et al. 1989). További fontos tulajdonságuk, hogy kis töménységben (<10 mg/ml) gátolják az újrakristályosodást (Knight et al. 1995). Az akklimatizált növényekből izolált AFP-k termál hiszterézis aktivitása azonban nagyon alacsony (0.2-0.5 °C) (Urrutia et al. 1992, Duman és Olsen 1993), emiatt feltételezik, hogy a fagyáspont csökkentés mellett szerepük van a membránok stabilizálásában is (Rubisnsky et al. 1991a, 1991b, Hincha et al. 1997). Az I. típusú AFP hideg hatására történő akkumulációját, a jég újrakristályosodás gátlását és csökkent elektrolit kiáramlást mutatták ki afp transzgénikus dohányban (Kenward et al. 1993), paradicsom termésben (Hightower et al. 1991) és burgonya levelekben (Wallis et al. 1997). (2) Az alacsony hőmérsékleti stressz egyik legrégebben ismert hatása a tárolt növényi szervekben az oldható cukrok szintjének emelkedése (Müller-Thurgau


15

1882). A fagytűrő növényfajokban vízstressz hatására ún. kompatibilis, ozmotikusan aktív védő anyagok (cukrok, cukoralkoholok, prolin, glicin betain) halmozódnak fel (Yancey et al. 1982, Csonka 1989, Dörffling et al.1990, Santoiani et al. 1993), amelyek nem lépnek biokémiai reakcióba a környező oldatokkal, viszont stabilizálják a fehérjék nativ, klatrátburkos szerkezetét (Harsányi 1976). Alacsony hőmérséklet és szárazság hatására indukálódó géntermékekről bizonyították, hogy résztvesznek a cukrok bioszintézisében. Hidegedzett rozsnokban (Lee és Chen 1993a, 1993b) és árpában (Bartels et al. 1991) aldóz reduktáz; kukoricában, rizsben, Arabidopsis-ban alkohol dehidrogenáz (Christine et al. 1991, Kurkela és Borg-Franck 1992) gének expressziós mintázatainak változását mutatták ki. A glutamin eredetű prolin felhalmozódásban szerepet játszó pirolin-5-karbonsavszintáz (P5CS) mRNS szintjének víztstressz és ABS hatására történő gyors növekedését bizonyították Arabidopsis-ban (Strizhov et al. 1997). A P5CS gént hordozó, transzgénikus dohányban a megnövekedett prolintartalom ozmotikus stresszel szemben ellenálló fenotípus kialakulását eredményezte (Kavi Kishor et al. 1995). A hősokk fehérjék eredetileg feltételezett molekuláris chaperon funkciója a magas

hőmérséklet

hatására

denaturálódott

fehérjék

kicsomagolása

és

renaturálása. Bizonyos hsp gének (hsp 70, hsp 17.6) azonban vízstressz, ABS és hősokk hatására egyaránt expresszálódnak (Heikkila et al.1984, Kiyosue et al. 1994, Almogurea és Jordano 1992). Emiatt feltételezhető, hogy ezek a HSP molekulák résztvesznek nemcsak a magas hőmérséklet, hanem a vízhiány hatására natív konformációjukat vesztő fehérjék lebontásában is (Pelham 1986, Rothman 1989, Skowyra et al. 1990). A

biológiai

szervezetekben

az

antioxidánsok aktív

oxigén

(szuperoxid-dizmutázok, ”átöblítő”

katalázok,)

(oxygen-scavenging)

aerob

rendszerek

katalizárorai. Funkciójuk az oxidativ környezeti stresszekre képződő agresszív szuperoxid szabad gyökök hatástalanítása (Scandalios 1993). Bizonyították, hogy kukoricában vízstressz és ABS hatására is megnyilvánuló Cat1 gén terméke, kataláz aktivitású (Williamson és Scandalios 1992) továbbá, hogy a mitokondriális mangánszuperoxid dizmutáz transzkriptumok akkumulációját a Sod 3.3 és Sod 3.4 gének víz stressz és ABS indukciója szabályozza (Zhu és Scandalios 1994). (3) A regulátor fehérjék a sztresszválasszal kapcsolatos további anyagcsere módosítások -szignál transzdukciós és génexpressziós- szabályozásában játszanak szerepet (Ingram és Bartels 1996). Az Arabidopsis-ból izolált, hidegre indukálódó


16

RCI1 és RCI2 (Rare Cold-Inducible) cDNS-ekről átiródó fehérje nagy szekvencia hasonlóságot mutat az emlősökben leírt 14-3-3 proteincsaláddal (Jarilló et al. 1994). A 14-3-3 fehérjékről feltételezik, hogy szabályozó hatásuk a fehérjék foszforilálásán keresztül

érvényesül

(Aitken

et

al.

1992).

Dohány

sejttenyészetekben

a

fagytolerancia és a sejtek protein foszforilációs aktivitása közt szoros összefüggést figyeltek meg (Monroy et al. 1993). A CRI gének expresszióját az ABS nem indukálja, ezért valószinű, hogy az alacsony hőmérsékleti stressz, ABS-tól független jelátadási reakció útján keresztül a protein kinázok szintjének módosításával vesz részt a fagytűrés molekuláris szabályozásában (Jarilló et al. 1994).

2.4. In vitro fagyásvédelem Sejtes rendszerek a földi élet feltételei mellett, természetes folyamatok eredményeként soha sem kerülhetnek a kriogénikus hőmérsékleti zónába, ezért az evolució

során

a

cseppfolyós

gázok

hőmérsékletével

szembeni

védekező

mechanizmusok sem alakulhattak ki. Kriotolerancia csak összetett mesterséges kezelésekkel hozható létre. A fagyás során az intracelluláris jégkristályok megjelenése letális hatású. A kriogén hőmérsékletre fagyasztott explantumok visszanyerésének feltétele, hogy a sejtek dehidratációjával koncentrálódó vizes oldatok Th csökkenése, illetve Tg növekedése miatt, a víz-jég transzformáció során, az amorf fázis a legkevesebb kristályos jég képződésével alakulhasson ki (Meryman és Williams 1985). A krioprezreváció gyakorlatában az intracelluláris jégkristályok mennyisége a minimumra csökkenthető, amennyiben a túlhűtött sejtoldatot tartalmazó explantumok a Th hőmérsékletről (cca. -30-40 °C) közvetlenül a folyékony nitrogénbe kerülnek. Így az intracelluláris oldatok néhány másodperc alatt amorf formába szilárdulnak. A túlélés további feltétele, hogy a koncentrált sejtoldatok ne okozzák a membránok vízhiányra jellemző funkcionális zavarait. A két egymás ellen ható folyamat összehangolása a sejtek dehidratációjának szabályozásával (1) és a membránok stabilitásának fenntartásával (2) valósítható meg. Több fagyásvédő kezelés azonban mindkét szinten hat. A dehidratációval kialakított, vízhiányra indukálódó géntermékek közül sok membránvédő hatású (3.2.3 fejezet), ugyanakkor az ozmotikumként használt cukrok, cukoralkoholok is hatnak a sejthártya stabilitására, emiatt a krioprotektív kezelések nehezen sorolhatók egyik vagy másik kategóriába.


17

Az explantumok víztartalma a lassú fagyasztási programmal, illetve a tenyészetek közvetlen szárításával szabályozható (részletesen a 2.5.2 fejezetben), a membránvédelem pedig krioprotektív vegyületek alkalmazásával érhető el.

2.4.1. A membrán stabilitás fenntartása fagyásvédő vegyületekkel Az explantumok fagyásakor a sejten belül koncentrálódó elektrolitok -a membrán szerkezeti változtatásán keresztül (2.2.1.2 fejezet)- azok funkcionális (vízáteresztő képesség, aktív iontranszport) károsodásait okozzák (Gordon -Kamm és Steoponkus 1984, Palta és Li 1978). A fagyásvédő vegyületek, az un. krioprotektánsok -egyéb hatásaik- mellett elsősorban a membrán szerkezeti stabilitásának fenntartásával (membránexpanziós kapacitás) nyújtanak védelmet (Lovelock és Bishop 1959, Mazur és Miller 1976). A fagyásvédő anyagok kémiailag nagyon heterogén vegyületek (Finkle et al. 1985). Penetranciájuk alapján két csoportba sorolhatók (Tao és Li 1986). A kisméretű

molekulák

[glicerin

és

dimetil –szulfoxid,

(DMSO)]

bejutnak

az

intracelluláris térbe: intracelluláris védőanyagok (1), a nagyobb molakulák (cukrok, cukoralkoholok, prolin) bejutása viszont gátolt,: extracelluláris védő anyagok (2) Az 1000 dalton molekula tömegnél kisebb extracelluláris krioprotektánsok azonban a sejtfalba penetrálódnak, így a külső membránnal kapcsolatba kerülhetnek (Chen et al. 1984). Az ennél nagyobb méretű fagyásvédő polimerek (pl. polietilén-glikol) ozmotikus hatásuk alapján védenek, de a membrán stabilizálásában feltételezhetően nem vesznek részt. (1) Az intracalluláris védőanyagok közül a DMSO és a glicerin használata a legelterjedtebb. A DMSO valamennyi sejtmembránon gyorsan áthatol, nagyon rövid, pillanatszerű kölcsönhatásban és alacsony hőmérsékleten is aktív (Lovelock és Bishop 1959). A molekula S-O kötése miatt dipólusú. Hidrogénkötéssel kapcsolódó rendszerekben a vizet 1:1 M arányban helyettesíti (Harsányi 1976). A DMSO a membrán

fehérjék

konformációja

és

a

mebránpotenciál

reverzibilis

megváltoztatásával képes fenntartani a membrán normális permeabilitását. Krioprotektív hatásában a glicerin hasonlít a DMSO-hoz. Magasabb hőmérsékleten sem toxikus, vizes oldatokban jól oldódik. A hidrofób felszíni erők kialakításával szerepe van a makromolekulák harmadlagos és negyedleges konformációjának és a membrán kettősréteg stabilitásának fenntartásában (Tanford 1973).


18

A DMSO és a glicerin "nem-membrán" védelmen keresztül történő krioprotektív hatása a molekulák kolligatív sajátosságából ered. A kolligatív hatású fagyásvédő vegyületek a fagyasztás során töményedő elektrolitokkal -oldószer-oldott anyag - kölcsönhatásba lépnek. Ezzel csökken -a Raoult törvény alapján (az oldat koncentrációjának 1 M-al való növelése 1.86 °C-al csökkenti az oldat fagyáspontját) az oldatok sókoncentrációjából meghatározható fagyáspontja. Ezért nagyobb fagyáspont csökkenés érhető el anélkül, hogy a szövetekben az elektrolitok koncentrációja az elviselhető szint fölé emelkedne (Ramussen és Luyet 1970, Harsányi 1976, Finkle et al. 1985). Mindkét intracelluláris védőanyag gátolja a jég kristályosodását. A glicerin-víz, 1:2 arányú oldat fagyása pl. -46 °C-on kezdődik (Harsányi 1976). A víz fagyása gátolható, amennyiben a vízmolekulákhoz hidrogékötésekkel

védőanyag

kapcsolódik

(AFP

molekulák,

2.3.2.

fejezet).

Bizonyították, hogy a kristályosodást gátló hatás intenzitása szoros összefüggésben van a krioprotektív anyag magányos elektron párjainak számával, illetve hidrogén kötő kapacitásával (Doebbler és Rinfret 1962). (2) Az extracelluláris védőanyagok közül a membrán stabilizálásában a sejtfalba penetrálódó, a membránnal kapcsolatba kerülő molekulák (cukrok, cukoralkoholok) vehetnek részt. Védőhatásuk alapja, a makromolekulák és fehérjék, köztük a membrán fehérjék stabilizálása. Az extracelluláris krioprotektánsok a makromolekulák körül rendezett kötött vízzel, a natív fehérjék klatrát vizével, illetve közvetlenül a férjékkel is H-kötést alkotnak. A makromolekulák konformációjának stabilizálásával fenntartják a membrán működőképességét (Karow 1969).

2.5. Szomatikus sejtek, szövetek, szerevek ultramélyfagyasztásos technikái Az első -FN hőmérsékletét túlélő- sejtszuszpenziós tenyészetekkel végzett kísérletek közlése óta (Nag és Street 1973)

130-140 növényfaj sikeres -nagyon

változatos módszereken alapuló- fagyasztásáról számoltak be. Mindegyik technikára érvényes azonban, hogy előkezelés (1), dehidratálás (2), FN-ben való tárolás (3), felolvasztás (4), túlélés meghatározás (5), az eredeti tenyészet újraindítása (6) és működő növény-sejt-növény rendszer esetében -növényregenerálás (8) lépésekből állnak. Az egyes metodikák elsősorban az előkezelés és a dehidratáció módjában különböznek.

19


2.5.1. Előkezelési eljárások Az előkezelés során alkalmazott eljárások részben in vitro fagyásvédő vegyületek (1) használatán, részben a stresszfehérjék szintézisének indukcióján (2) alapulnak. (1) A táptalajhoz adott krioprotektív hatású vegyületekkel történő kezelés, a védőanyagok ozmotikum hatását és membrán expanziós kapacitását, használják ki. Az előkezeléssel csökken a sejtméret, a citoplazma-vakuolum arány, a membrán szerkezete stabilizálódik és a krioprotektánsok penetrálódása felgyorsul (Withers és King 1979). A védőanyagok közül az intracelluláris DMSO-t -a tenyésztési hőmérsékleten tapasztalt toxikus hatása miatt (Luo és Reed 1997)- az előkezelés fázisában, önmagában csak ritkán -10-15 %-os töménységben alkalmazzák (Marin és Duran-Vila 1988, Demeulemeester et al. 1993a , Demeulemeester 1993b, Perez et al. 1997). Nem tapasztalták azonban toxikus hatását prolinnal (Brison et al. 1996, Helliot és Boucaud 1997) és cukorral (Zhang et al. 1994, Exomtramage et al.1992, Ganapragasam és Vasil 1992, Watanabe et al. 1995, Fukai 1990, Fukai et al. 1991a, Fukai et al. 1991b) alkotott kombinációiban. Az extracelluláris védőanyagok közül a szaharóz,

mannit

és

a

szorbit

használatával

számos

növényfajban

és

szövettenyészetben sikerült krioprotekciót kialakítani (Nag és Street 1975, Crowe et al. 1990, Dumet et al. 1993b). Szaharóz tartalmú (0.4-1.0 M) táptalajon előtenyésztett cukorrépa (Vandenbussche és de Proft 1996), alma, körte, eper (Niinó és Sakai 1992, Niino et al. 1992a, Niino et al. 1992b), banán (Panis et al. 1996), kávé (Mari et al. 1995), cukornád (Paulet et al. 1993), szeder (Benson et al. 1996), tea (Kuranuki és Sakai 1995), yamgyökér (Mandal et al. 1996), Wasabia japonica (Matsumoto et al. 1995), datolya pálma (Bagniol és Engelmann 1992) merisztéma és hajtáscsúcsokat és kávé (Hatanaka et al.1994), banán (Abdelnour-Esquivel et al. 1992a), olajpálma (Dumet et al. 1993a, 1993b), sárgarépa (Lecoutex et al. 1991) juhar (Brearley et al. 1995) szomatikus és zigótikus embriókat fagyasztottak sikeresen. A mannit 0.3-0.75 M koncentráció tartományban eredményezett túlélő rizs (Lynch et al. 1994) és dohány (Reinhoud et al. 1995) sejtszuszpenziós tenyészeteket. A táptalaj 0.4-1.2 M töménységű szorbit tartalma javította a szeder (Reed 1995), fehérhere (Yamada et al.1991, Yamada et al. 1993) és a spárga (Suzuki et al. 1997) hajtáscsúcsok, valamint a Picea sitchensis (Find et al. 1993) embriógén szuszpenziós tenyészetek túlélését. (2) A tömény extracelluláris védőanyagok közvetlen membránstabilizáló szerepük mellett, - ozmotikus stressz hatáson keresztül - protektív stresszfehérje

20


szintézis indukcióját is eredményezheteik (2.3.1 fejezet). Izolált fehérjékkel történő előkezelésről azonban csak kevés publikált eredmény ismert. RAB és BSA fehérje előkezelés után kaptak túlélő burgonya (Schabel-Preikstas et al. 1991) és málna (Luo és Reed 1997) hajtáscsúcsokat. Az előkezelés során a stressz fehérjék védőhatása elsősorban a stresszgén indukció szabályzásával - exogén ABS, hideg-, hő- és víztstressz kezelésekkel - alakítható ki. ABS tartalmú előtenyésztéssel javult a Solanum tuberosum és S. commersonii (Chen és Li 1982) levélkorongok hidegtűrő képessége, az őszibúza, rozs és rozsnok szuszpenziós tenyészetek fagytűrése pedig -7 °C -ról -30 °C-ra nőtt (Chen és Gusta 1983). A krioprezervációs gyakorlatban 7.5-75.0 mM koncentrációjú ABS-t tartalmazó előkezelés túlélő szeder és málna merisztémákat (Reed 1993), búza (Kendall et al. 1993) kakaó embriókat, és spárga kalluszokat (Uragami 1991) eredményezett. A környezeti stresszorok közül az előkezelés fázisban a hidegedzés, többnyire cukor, vagy cukoralkohol kombinációkban- javítja a differenciálódás előrehaladott szintjén álló szövetek fagytűrését. Különböző időtartamú (1-21 nap) állandó alacsony hőmérsékleti (4-5°C) (Niino et al. 1992a, Niino et al.1992b, Niino és Sakai 1992, Vandenbussche és De Proft 1996, Yamada et al. 1991, Kuranuki és Sakai 1995, Brison et al. 1996, Helliot és Boucaud 1997), vagy naponta periodikusan változó (8 óra 22 °C, 16 óra -1 °C ) (Reed 1993, Reed 1995, Benson et al. 1996) akklimatizáció hatására a merisztéma, hajtás és gyökércsúcs tenyészetek túlélték a folyékony nitrogén hőmérsékletét. Bizonyított, hogy hősokkal javítható a növények fagytűrése (Collins et al. 1993, Jennings és Saltveit 1994) és ismert a HSP molekulák alacsony hőmérsékleti stressz adaptációban betöltött szerepe (Heikkila et al.1984, Kiyosue et al. 1994, Almogurea és Jordano 1992). A krioprezervációs technikákban azonban a hősokk kezelés hatását eddig csak egy publikált kísérletben vizsgálták (Reinhoud et al. 1995). Mannit kezeléssel kombinált, fagyasztás előtt 4 órával 37°C -on 2 órán keresztül inkubált dohány szuszpenziós tenyészetek sejtjei 60%-ban élték túl a kriogén hőmérsékletet. Az előkezelt tenyészetek fagyasztása általában 1-2 ml-es műanyag, vagy üveg fiolában, műszalmában, szárazon, vagy krioprotektáns fagyasztó oldatban történik. A fagyasztó oldat használata a penetrálódó intracelluláris fagyásvédő vegyületek kolligatív fagyáspont csökkentő hatásán alapul. A kezelés közvetlenül a fagyasztás előtt történik és rövid ideig (30-60 perc) tart. A krioprotektáns keverékek

21


többsége a DMSO hőmérséklettől független, gyors penetrálódását használja ki (Marin és Duran-Vila 1988, Demeulemeester et al. 1993a, Demeulemeester 1993b, Perez et al. 1997). A 10-20%-ban használt DMSO toxicitásának csökkentésére a kezelést 0 °C-on jégfürdőben végzik. A glicerint ritkán alkalmazzák önmagában (Tunthala et al. 1993), gyakoriak viszont DMSO-val, cukorral és prolinnal alkotott kombinációi (Withers és King 1980, Lynch et al. 1994, Ribeiro et al. 1996, Ishikawa et al.1996, Ogawa et al.1997) A fagyasztó oldatok speciális típusai az un. vitrifikáló oldatok. A táptalajban intracelluláris védőanyagokat nagy töménységben tartalmazó oldatok jellemző Th és Tg pontja egybe esik és fagyáskor a túlhűtött folyadék jégkristályok kialakulása nélkül vitrifikálódik. Vitrifikáló oldatok gátolják a sejtközötti oldatokban a jégkristályok kialakulását. Ennek különösen nagyobb méretű szövetek, szervek krioprezerválása során a sejt közötti plazmodezmális kapcsolatok fennmaradásában van jelentősége (Meryman és Williams 1985). A glicerin (30%) DMSO (15%) etilénglikol (15%) tartalmú vitrifikáló oldatban (PVS 2) sikeresen fagyasztottak merisztéma- (Benson et al. 1996, Reed 1995, Yamada et al. 1991, Niwata 1995, Matsumoto et al.1995), hajtáscsúcs - (Kuranuki és Sakai 1995, Niino et al. 1992a, Niino et al. 1992b) és kallusz - (Yamada et al. 1993, Kohmura et al. 1992) tenyészeteket.

2.5.2. Víztelenítési módszerek A fagyasztásos dehidratáció (1) lényege, hogy az explantumok lassú hűtésével az extracellulárisan képződő jégkristályok hatására - a megnövekedett gőznyomás miatt - a sejtek víztartalma csökken (Chen et al. 1984). A tenyészetek lassú hűtése történhet lépcsőzetes fagyasztással, amikor az explantumok több átmeneti hőmérsékleten (-20 °C, -70 °C) való rövid idejű tartás után kerülnek a folyékony nitrogénbe (Lecoteux et al. 1991, Perez et al. 1997). A lassú fagyasztás szárító hatásán alapuló kísérletek többségében azonban a tenyészetek 0 °C alatti (30--40°C) átmeneti (transzfer) hőmérsékletre való állandó sebességű lassú (0.5-2.0 °C/perc) előfagyasztását követően közvetlenül (Sakai 1985, Withers 1985, Kartha 1985, Ogawa et al. 1997, Touchel et al. 1992, Watanabe et al. 1995, Fukai et al. 1991a,-Fukai et al. 1991b, Reed 1993, Brison et al. 1997, Ishikawa et al. 1996, Marin és Duran-Vila 1988), vagy néhány perc (10-40 perc) transzfer hőmérsékleti inkubáció után (Zhang et al. 1994, Lynch et al. 1994) kerülnek a folyékony nitrogénbe.


22

A lassú fagyasztási program elemeinek (a fagyasztási sebesség, a transzfer hőmérséklet, transzfer hőmérsékleti inkubáció időtartama) fontos szerepük van protektív dehidratáció kialakulásában (Heszky et al. 1990). Az ideálisnál lassabban, fagyasztott, és az átmeneti hőmérsékleten hosszabb ideig tartott sejtek (a természetben lezajló fagyáshoz hasonlóan) túlzottan dehidratálódnak és az intracelluláris tömény oldatok kialakulása miatt sérülnek. Ellenkező esetben a sejtnedv koncentrációja alacsony marad, nem csökken lényegesen a spontán fagyás (Th) hőmérsékleti értéke. Ennek következtében káros hatású, kristályos szerkezetű intracelluláris jég alakulhat ki (Ganapragasam és Vasil 1992, Find et al. 1993, Fukai 1990, Reinhoud et al. 1995, Eksomtramage et al. 1992, Helliot és de Boucaud 1997, Demeulemeester et al. 1993a). (2) Az explantumok közvetlen szárítása (deszikkálása) során, frisstömegük 10-30%-ra való csökkentésével védő dehidratáció alakítható ki. Az explantumok víztartalmának steril fülke légáramában (0.5-8 óra) (Abdelnour -Esquivel et al. 1992a, Assy-Bah és Engelmann 1992, Abdelnour-Esquivel et al.1992b, Normah és Vengadasalam 1992, Gonzalez-Benito és Perez 1994 Brearley et al. 1995, Dumet et al. 1993b), vagy szilikagélen (10-16 óra) (Dumet et al. 1993a, Paulet et al. 1993) történő csökkentése után fagyasztott embrió tenyészetek túlélték a folyékony nitrogén hőmérsékletét. A kiszáradásra érzékenyebb szomatikus embriók és hajtáscsúcs

tenyészetek

amennyiben

a

kezelés

kíméletesebb alginát

gélbe

deszikkációjával kapszulázott

javítható

túlélésük,

explantumokon

történik

(Vandenbussche és De Proft 1996, Niino és Sakai 1992, Mari et al. 1995, Mandal et al. 1996, Hatanaka 1994).

2.5.3 Tárolás, felolvasztás és a túlélés meghatározása A folyékony nitrogén hőmérsékletén az anyagcsere folyamatok gátoltak (Meryman és Williams 1985). Ezért a folyékony nitrogénbe helyezett tenyészetek elméletileg korlátlan ideig tárolhatók változás nélkül. A feltételezést azonban kevés irodalmi adat támasztja alá. Éveken keresztül FN-ben tárolt burgonya hajtáscsúcs tenyészetek

genetikai

stabilitását

molekuláris

módszerekkel

Harding

(1991)

bizonyította. Krioprezervált Solanum fajok hajtáscsúcsaiból regenerálódó növények kromoszómaszáma állandó maradt (Ward et al. 1993). Fagyasztott repce mikrospóra tenyészetekből regenerált növények között azonban nagy arányban találtak diploidokat (Chen és Beversdorf 1992), de feltételezik, hogy a kromoszómaszám


23

változás a krioprezerválás előkezelési és dehidratációs fázisaiban alkalmazott eljárások következménye (Benson 1995) és nincs összefüggésben a folyékony nitrogén hőmérsékletének hatásával. Az ultramélyhűtés felolvasztás szakaszában a sebességnek van jelentősége. Mínusz 140 °C feletti hőmérsékleten az amorf jég újrakristályosodik. Az ismertetett kísérletek többségében ezért - a veszélyes kristályos fázis időtartamának csökkentésére - a gyors felolvasztási sebesség használatát javasolják (Withers és Street 1977). A fagyasztott minták gyors felolvasztását a fiolák 50-60 másodperc időtartamú 37- 40 °C -os vízfürdőbe merítésével valósítják meg. Az eredeti tenyészetek újraindítása során a táptalajra helyezett explantumok tenyésztése 25-26 °C hőmérsékleten történik. A DMSO-t tartalmazó fagyasztó oldatok a tenyésztési hőmérsékleten azonban toxikusak, emiatt eltávolításuk fontos. A krioprotektáns oldatok mosással történő eltávolítása, illetve a folyékony táptalajban történő utókezelés, a sérült, szivárgó membrán, továbbá a deplazmolízis miatt káros (Withers 1984, Finkle és Urlich 1982). A felolvasztott kultúrákat ezért - az eredeti tenyészet típusától (szilárd, vagy folyékony) függetlenül - leggyakrabban mosás nélkül, néhány nap időtartamú szilárd táptalajon való inkubáció után helyezik a táptalajra, amely idő alatt a szövetekből a krioprotektásnsok a táptalajba diffundálnak. A passzálás nagyobb méretű explantumok esetében közvetlenül megoldható. A felolvasztott sejtszuszpenziós tenyészeteket viszont szilárd táptalajon lévő szűrőpapír korongra helyezik és a friss táptalajra való átoltást a szűrőpapírral együtt végzik (Chen et al. 1984, Lynch et al. 1994, Ribeiro et al. 1996). A krioprezervált explantumok túlélésének meghatározása a felolvasztott újra növekvő

explantumok

tömeggyarapodása

(sejtszuszpenziók)

és

a

növényregenerálás (embriók, merisztémák, hajtáscsúcsok) alapján történik. Gyors túlélés meghatározást tesznek lehetővé a vitális festési technikák. A trifeniltetrazólium-klorid (TTC) teszt, a tenyészetek légzésintenzitását mutatja ki a redukálódott

formazán

spektrofotométeres

meghatározásával

(Steponkus

és

Lamphear 1967). A fluoreszcein-diacetát (FDA) festési módszer a membrán sértetlen szerkezetét bizonyítja (Widholm 1972).

24

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

3.1. Szövettenyészetek

3.1. 1. Tesztnövények A kísérleteket a közönséges és a sziki mézpázsit [Puccinellia distans (L.) Parl. és Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg. (Génbank, Tápiószele)];a lúdfű [Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (C24, Erecta (LER) és a Wassilewskija (WS) ökotípusok (Nottingham, Arbidopsis Stock Center)] és a kukorica [Zea mays (L.) (MSCE/79 sejtvonal és afp transzgénikus 23, 24, 37, 44 klónok és vad típus)] sejtszuszpenziós, illetve a vadgesztenye [Aesculus hippocastanum (L.), (gödöllői ökotípus)] és a kivi [Actinidia deliciosa (A.) Chev (Matua önbeporzó fajta, Tulipa kertészet, Gödöllő)] szomatikus embrió tenyészetein állítottuk be. A kukorica szuszpenziós tenyészeteket dr. Mórocz Sándor-GKI, Szeged (MSCE/79 sejtvonal) és Prof. Dudits Dénes SZBK, Szeged (afp transzgénikus 23, 24, 37, 44 és vad típus) bocsátotta rendelkezésünkre. A vadgesztenye szomatikus embrió tenyészeteket dr. Kiss József (GATE Genetika és Növénynemesítés Tanszék) adta át. 3.1.2 Általános tenyésztési körülmények A tenyészetek indításához száraz magvakat és vegetatív fejlődési fázisban lévő növényi részeket (levél, levélér, hajtáscsúcs, porzószál) használtunk. A magokat 70 %-os etilalkoholban (1 perc) és 3:1 arányú víz: hypó keverékben (20 perc) -steril vizes mosások közbeiktatásával- sterilizáltuk. Az explantumok sterilizálását -az alkoholos kezelés kivételével-, a magvakkal azonos módon végeztük el. A sejtszuszpenziós és szomatikus embrió tenyészetek fenntartása folyékony táptalajban, Erlenmeyer lombikokban (100 ml), horizontális rázógépen (120 ford./perc), 7 napos átoltási ciklusokban történt. A tenyészetek átoltását 5 ml-es automata pipetta segítségével (2 ml ülepített sejt vagy 3 ml embrió használt táptalajban, 40 ml friss táptalajba pipettázva) végeztük el. A kallusz tenyészeteket üveg Petri csészében (Ø 9 mm), a hajtáscsúcs tenyészeteket veg-box polietilén dobozokban, szilárd táptalajon, 2 hetenként passzálva tenyésztettük. A táptalajok 3% cukrot tartalmaztak, 5.7 pH mellett. Szilárdításukra agart, gelritet és phytagélt használtunk. A táptalajok sterilizálását kuktában (1.2 atm, 120

25


°C , 20 perc) és membránszűrő használatával (nitrocellulóz membrán, 0.2 µm pólus méret ) oldottuk meg. A tenyészeteket 25 °C hőmérséklet, napi 16/8 óra fény/sötét fotoperiódusban, 44 mEm-2s-1 fényintenzitás mellett tartottuk fenn.

3.1.3. Speciális tenyésztési körülmények Közönséges mézpázsit és sziki mézpázsit sejtszuszpenziós tenyészetek A közönséges és sziki mézpázsit magokból, 2 mg/l 2,4-D-t és 0.5 mg/l kinetint tartalmazó szilárd MS (Murashige és Skoog 1962) táptalajon való - 4 hét időtartamú kallusz indukciót követően, a szuszpenziós tenyészeteket folyékony AA2 (Abdullah et al. 1986) táptalajban (L-glutamin:876 mg/l, L-arginin:774 mg/l, glicin:7.5 mg/, Laszparaginsav:266 mg/l) tartottuk fenn sötétben (Binh et al. 1989). A növényeket 10 mg/l kinetint tartalmazó N6 (Chu et al. 1975) táptalajon regeneráltuk. Arabidopsis sejtszuszpenziós tenyészetek Az Arabidopsis magokat 0.2% gelrittel szilárdított hormonmentes MS (Murashige és Skoog 1962) táptalajon csiráztattuk. A 14 napos korú, szikleveles fejlettségű csiranövények gyökereit 2 mg/l 2,4-D-t tartalmazó folyékony MS táptalajban kalluszosítottuk és tartottuk fenn sötétben (Ribeiro et al. 1996). Kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek Az éretlen embrió eredetű kukorica szuszpenziós tenyészeteket 0.5 mg/l 2.4D-t, N6 (Chu et al. 1975) makro, MS (Murashige és Skoog 1962) mikro elemeket és vitaminokat tartalmazó folyékony N6M (Mórocz et al. 1990) táptalajban tartottuk fenn. Növényregenerálásra hormonmentes szilárd N6M és 3% mannitot tartalmazó hormonmentes, szilárd N6M (Emons et al. 1993) táptalajokat használtunk.

Vadgesztenye szomatikus embrió tenyészetek A vadgesztenye járulékos embriógenezissel szaporodó, filamentum kallusz eredetű szomatikus embrió tenyészeteit E1 (Gamborg et al. 1983) makro-, B5

26


(Gamborg et al. 1968) mikroelemeket, valamint 1 mg/l NAA-át és 0.1 mg/l BA-t tartalmazó, E1B5 (Kiss et al. 1992) folyékony táptalajban tenyésztettük. A növényregenerálást azonos hormon tartalmú szilárd E1B5 táptalajon végeztük. Kivi szomatikus embrió tenyészetek A kivi 3-4 nóduszos hajtásait két éves növényekről izoláltuk in situ, április közepén. A kifejlett leveleket eltávolítása és felszíni sterilizálás után a hajtásokat nóduszokra (± 0.5 -1.0 cm internódium) vágtuk és 3/4-ed MS (Murashige és Skoog 1962) sókat, teljes töménységű vitaminokat, 0.3 mg/l IVS-t és 2 mg/l BA-t tartalmazó szilárd táptalajban, veg-box műanyag dobozokban szokszorosítottuk (Monette 1987). Az in vitro fejlődött 1.5 - 2.0 cm-es hajtásokat hormonmentes, szilárd WPM (Lloyd és McCown 1980) táptalajban gyökereztettük. A gyökeres hajtások kifejlett leveleiből -a főeret is tartalmazó, 0.7 mm átmérőjű levélkorongokból- 2 mg/l BA -val kiegészített folyékony WPM táptalajban szomatikus embriókat indukáltunk. Az embriókból ugyanebben a táptalajban gyökeres növényeket neveltünk.

3.2. Ultramélyfagyasztás A krioprotektív kezeléseket a krioprezerválás előkezelés és fagyasztás fázisaiban végeztük el.(1. ábra). 3.2.1.Előkezelés 3.2.1.1 Fagyásvédő vegyületek A sejtszuszpenziós és szomatikus embrió tenyészeteket az intenzív növekedési fázisban (a passzálási cilkus 3.-4. napja) a krioprotektív anyagokat tartalmazó folyékony táptalajba helyeztük (2 ml sejtszuszpenzió, vagy embrió 45 ml előkezelő táptalajban) 4 nap időtartamra. Az előkezelő táptalaj a krioprotrektív vegyület kivételével a 3.1.3 fejezetben ismertetett fenntartó táptalajokkal azonos összetételű volt. Az előkezelés szakaszban az alábbi krioprotektív vegyületek hatását vizsgáltuk: -ABS: (0.75-75 µM), illetve ABS-szaharóz (21%), ABS-prolin (5 %), ABS -szárítás, ABS-hősokk és ABS-vitrifikáló kezelés kombinációkban, a vadgesztenye és kivi szomatikus embriókban és kukorica sejtszuszpenziókban,

27


- cukor és cukoralkohol (szaharóz, mannit, szorbit 0.25 -1.0 M) Arabidopsis és kukorica szuszpenziós tenyészetekben. Az abszcizinsav tartalmú táptalajokat membránszűrővel, a cukor és cukoralkohol tartalmúakat autoklávban sterilizáltuk.

3.2.1.2. Szárítás és hősokk A deszikkációs kezeléseket folyékony 0.75-75 µM ABS tartalmú E1B5 (Kiss et al. 1992) táptalajon előtenyésztett vadgesztenye szomatikus embriókon, a hősokk kezeléseket 0.75 µM ABS tartalmú E1B5 (Kiss et al. 1992) táptalajban előtenyésztett vadgesztenye szomatikus embriókon és azonos ABS tartalmú (0.75 µM) N6M (Mórocz et al. 1990) táptalajban előtenyésztett MSCE/79 kukorica sejteken végeztük. A szárítást szobahőmérsékleten, (70 % relatív légnedvesség mellett) steril fülke légáramába 2-4 óra időtartamra helyezett, nyitott Petri csészékben (Æ 9 cm) oldottuk meg. A Petri csészékbe szűrőpapír korongokra (Ø 5 cm) 3-4 ml = 50-60 db, vadgesztenye szomatikus embriót (Æ 1.5-2.0 mm) helyeztünk. A deszikkált embriókat 2 ml-es polipropilén fagyasztó fiolákban (cca. 20 db embrió/fiola) szárazon fagyasztottuk közvetlenül a folyékony nitrogénbe merítéssel. A tenyészetek nedvességtartalmát 48 óra, 104 °C -os szárítószekrényben való szárítás után - a kezeletlen kontroll frisstömegéhez (100 %) viszonyítva - határoztuk meg. A hősokk kezelést, a folyékony táptalajt tartalmazó, Erlenmeyer lombikokj, 3090 percig tartó, 40 °C-os vízfürdőbe való helyezésével értük el. Az inkubáció után a tenyészeteket lassan, illetve gyorsan fagyasztottuk műanyag fiolában, (WK) (Withers és King 1980) krioprotektáns oldatban (0.5 M DMSO, 0.5 M glicerin, 1.0 M szaharóz, 1% prolin, pH 5.8).

3.2.2. Fagyasztó oldatok Az oldatban krioprezervált tenyészeteket 2 ml-es, csavaros tetejű műanyag fiolákba helyeztük (0.70-0.75 ml sejtszuszpenzió, vagy 12-15 db szomatikus embrió /fiola) és 600 µl különböző krioprotektáns keverékben fagyasztottuk: -DMSO: (12.5%, vagy 15 % az AA2 táptalajban, pH 5.8) a fagyasztási program hatásának bizonyítására mézpázsit szuszpenziós tenyészetekben,


28

- WK krioprotektáns oldat folyékony MS, N6M és E1B5 táptalajban az ABS előkezelés után vadgesztenye szomatikus embriókban és a cukor, cukoralkohol előkezelések után az Arabidopsis és a kukorica sejtszuszpenziókban. A fagyasztás előtt frissen készített krioprotektáns oldatokat 50 ml-es fecskendőre rögzíthető 0.2 µm pórus méretű membránszűrővel (MILLIPORE) sterilizáltuk. A kezelést jégfürdőben, a fagyasztás előtt 1 órán keresztül folytattuk.

3.2.2.1. PVS- 2 vitrifikáló oldat A levél explantumokon differenciálódó szikleveles (Æ 2-3 mm) kivi szomatikus embriókat - ABS-as előkezelés után - alginát burokba kapszuláztuk (5% Na-alginátot tartalmazó, Ca-ion mentes folyékony tenyésztő WPM táptalajból vágott pipetta véggel egyenként 500 µl oldatban felszívattuk, és 20 percre négyszeres Ca-ion tartalmú kicsapó WPM oldatba helyeztük) és a műanyag fiolákban (6-7 kapszulázott embrió/ fiola), 500 µl PVS-2 vitrifikáló oldatban (30% szaharóz, 15% DMSO, 15% etilén-glikol, pH 5.8, Sakai és Kobayashi 1990) 0-90 percig inkubáltuk 0 °C és 25 °Con. A PVS-2 oldatot szűréssel sterilizáltuk és frissen használtuk. A kezelt szomatikus embriókat előhűtés nélkül merítettük a folyékony nitrogénbe.

3.2.3. Fagyasztás, tárolás és felolvasztás A mézpázsit tenyészetek fagyasztásával a fagyasztási program krioprotektív hatását a fagyasztási sebesség, az előhűtés hőmérséklete és a transzfer hőmérsékleten

való

inkubálás

időtartama

kölcsönhatásában

analizáltuk.

A

fagyasztást Snowball-1400 (Sy-lab) típusú, programozható biológiai fagyasztó berendezéssel végeztük. A tenyészeteket 0.5, 0.75, 1.0, 2.0 °C/perc és 1000-2000 °C/perc sebességgel -10--50 °C transzfer hőmérsékleteken való 0-30 perc időtartamú inkubációt követően merítettük FN-be. Az Arabidopsis és kukorica sejtszuszpenziókat, valamint a vadgesztenye szomatikus embriókat egységesen 1 °C/ perc sebességgel -35 °C -ra hűtve , majd 40 perc után FN-be helyezve fagyasztottuk. A szárítás és hősokk, valamint a vitrifikációs kezelések után a tenyészeteket elöhűtés nélkül, gyorsan fagyasztottuk. A tenyészeteteket 1-7 napig tároltuk FN-ben.

29


A felolvasztására egységesen, 50-90 másodperc időtartamú 40 °C-os vízfürdőt használtunk.

3.2.4. Utótenyésztés és a túlélés meghatározása. A fagyasztó fiolákból a tenyészeteket az eredeti táptalajjal azonos összetételű szilárd táptalajra oltottuk Petri csészébe (Æ 9 cm). A sejtkultúrákat a szilárd táptalaj felszínére helyezett steril szűrőpapír korongokra (Æ 5.5 cm), a vadgesztenye szomatikus embriókat szűrőpapír nélküli táptalajra passzáltuk, mosás nélkül. A vitrifikált kivi embriókat 5 percig 1.2 M szaharózt tartalmazó folyékony táptalajban való mosás után helyeztük a szilárd táptalajra. Az embrió tenyészeteket 5 napig, a sejt tenyészeteket 14 napig sötétben tartottuk. A felolvasztás utáni a 3. és 14. napon új táptalajra oltottuk át. Két hét elteltével az Arabidopsis kultúrák kivételével a tenyésztést fényben folytattuk (16/8 -2 -1 óra fény/sötét, 44 mEm s fényintenzitás).

A túlélő explantumokból az eredeti tenyészeteket indítottuk újra, illetve növényeket regeneráltunk. A tenyészetek túlélését TTC-teszttel és a frisstömeg-változás mérésével, illetve a túlélő szomatikus embriók arányával értékeltük. A TTC-teszt során a felolvasztás utáni 1., 5. 10. és 15. napon 50 mg frisstömegű szövetből, 1.5 ml, 0.05 M foszfát pufferben (pH. 7.4) készített 0.6%-os TTC oldat hatására képződő, etilalkohollal kioldott formazan optikai denzitását 490 nm-en spektrofotométerrel (Jenway UV/VIS) határoztuk meg (Steponkus és Lamphear 1967). A sejt tenyészetek frisstömegét a hetente steril fülkében a szűrőpapírral együtt elvégzett méréssel fejeztük ki. A szomatikus embriók túlélését a közvetlen és járulékos embriógenezist folytató zöld és elpusztult barna embriók arányával határoztuk meg a felolvasztás utáni 6. héten. A TTC-tesztet kezelésenként 4 Petri csészéből vett 12 ismétlésben (3 minta/ Petri csésze), a frisstömeg-változás és az explantum színén alapuló túlélés meghatározást 5 Petri csésze/kezelés ismétlésszámmal állítottuk be. Az adatokat, véletlen blokk elrendezésben többtényezős variancia analízissel elemeztük (Sváb 1973).

30


1. ábra. Az alkalmazott krioprezervációs módszerek összefoglalása

31

EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK

4. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK

4.1 A fagyasztási program hatása a mézpázsit sejtek túlélésére A kísérletet folyékony AA2 táptalajban fenntartott közönséges- és sziki mézpázsit tenyészeteken állítottuk be. A fagyasztási program elemeinek analizálása során, a fagyasztási sebességeket (0.5, 0.75, 1.0, 2.0 °C /perc, 1000-2000 °C /perc) és FN-be merítés előtti átmeneti hőmérsékleten (transzfer hőmérséklet) történő tartási periódusok (10, 20, 25, 30 perc) hatását, a transzfer hőmérsékletek (-10, -20, -30, -40, -50°C) függvényében értékeltük. A fagyasztási sebességek tesztelésekor a sejteket krioprotektáns nélküli folyékony táptalajban fagyasztottuk. A felolvasztott tenyészetek életképességét TTC-teszt alapján mutattuk ki, amit a növényregeneráció meghatározásával egészítettünk ki. A 4 fagyasztási sebességgel különböző transzfer hőmérsékletekre előhűtött és ezekről közvetlenül FN-be helyezett tenyészetekben a –10 °C-ról történő áthelyezés kivételével minden transzfer hőmérséklet az 1 °C/perc sebesség kombinációban eredményezte a TTC-teszttel meghatározott legnagyobb arányú túlélést (2. ábra). Az 1 °C/perc sebességgel -40 °C-ig előhűtött, majd a folyékony nitrogénbe helyezett sejtek 45%-ban élték túl a folyékony nitrogén hőmérsékletét. A fagyasztási sebesség kis változtatása (1°C/percről 0.75 °C/perc-re csökkentése, vagy 2 °C/percre növelése) drasztikusan rontotta az életképes sejtek arányát. A kísérletben a közvetlenül (átmeneti hőmérséklet nélkül) FN-be helyezett sejtekben is lehetett TTC aktivitást kimutatni. A lassú előfagyasztáson alapuló krioprezervációs technikák többsége a 0.52.0 °C/perc tartományon belüli fagyasztási sebességet alkalmazza (Sakai 1985, Withers 1985, Kartha 1985, Ogawa et al. 1997, Touchel et al. 1992, Watanabe et al. 1995, Fukai et al. 1991a, Fukai et al. 1991b, Reed 1993, Brison et al. 1997, Ishikawa et al. 1996, Marin és Duran-Vila 1988). Bizonyították, hogy az optimális sebességtől való néhány tized °C/perc eltérés a túlélés 20-30%-os csökkenését okozza szamóca és borsó merisztéma tenyészetekben (Kartha et al. 1980, Kartha et al. 1979). Megfigyeléseinkkel összhangban burgonya (Bajaj 1977a), édesburgonya (Bajaj 1977b) és csicseri borsó (Bajaj 1979) merisztémákból is sikerült növényeket felnevelni, előhűtés nélkül a folyékony nitrogénbe helyezett tenyésztekből.


32

40

SZD

5%

0

túlélés (%)

35 30

-10

25

-20

20

-30 -40

15

-50

10 5

transzfer hőmérséklet (°C)

45

0 0.5

0.75

1.0

2.0

10002000

fagyasztási sebesség (°C/perc) 2. ábra. A fagyasztási sebesség (0.5-2.0 °C /perc és 1000-2000°C /perc) hatása a fagyásvédő anyagokat nem tartalmazó folyékony táptalajban, a különböző transzfer hőmérsékletekről (0--50 °C) tartás nélkül közvetlenül FN-be helyezett közönséges mézpázsit sejtek TTC-teszttel meghatározott túlélésére. A mézpázsitok halofita fajok, extrém nagy só tartalmú szikes talajokon is megélnek (Simon 1992). Ilyen körülmények között a szövetek intracelluláris oldataiban felhalmozódó oldható cukrok, és aminosavak védik a protoplazmát tömény elektrolitok okozta sokktól (Srtizhov et al. 1997). A hideg akklimatizáció hasonló biokémiai változásokat eredményez a fagytűrő fajokban is. Kísérleteinkben, a mézpázsit sejtekben vegyszeres fagyásvédő kezelés nélkül is TTC aktivitást lehetett kimutatni, ami a növényfaj jelentős fagytűrő képességét, valamint a só- és fagystressz tolerancia feltehetőleg közös genetikai szabályozását jelzi. A transzfer hőmérséklet és a tartási időtartamok összehangolása során a közönséges mézpázsit sejteket már csak a legnagyobb túlélést eredményező 1°C/ perc sebességgel fagyasztottuk, 12.5 % és 15 % DMSO-t tartalmazó AA2 táptalajban. A DMSO hatására lényegesen javult az 1 °C/ perc sebességgel fagyasztott tenyészetek túlélése minden transzfer hőmérsékleti kombinációban (3. ábra). A legnagyobb arányú túlélést a 12.5% DMSO tartalmú táptalajban -40 °C ra fagyasztott, majd FN-be helyezett sejtek mutatták. A -40 °C -nál magasabb, vagy alacsonyabb hőmérsékletekről történő áthelyezés rontotta az életképes sejtek


33

arányát. A kísérlet körülményei közt a DMSO-ban -30 °C-ig fagyasztott, majd FN-be merített sejtek a kezeletlen kontrollnál kisebb túlélést mutattak. DMSO 0%

DMSO 15%

DMSO 12.5%

70 SZD 5 %

60

túlélés (%)

50 40 30 20 10 0 -10

-20

-30

-40

-50

transzfer hõmérséklet (°C)

3. ábra. A DMSO tartalmú (12.5 % és 15%) krioprotektáns oldat hatása az 1 °C /perc sebességgel különböző (-10--50 °C )transzfer hőmérsékletekre fagyasztott, majd közvetlenül FN-be helyezett közönséges mézpázsit sejtek TTC-teszttel maghatározott túlélésére. A dimetil-szulfoxiddal kezelt közönséges mézpázsit sejtek túlélése tovább javult, ha a tenyészeteket a folyékony nitrogénbe merítés előtt a transzfer hőmérsékleten 10-30 percig inkubáltuk (4. ábra). A transzfer hőmérsékletről azonnal -196 °C -ra helyezetett kontroll csoporthoz képest az életképes sejtek arányát a magasabb transzfer hőmérsékleteken (-20 °C, -10 °C) már a rövidebb inkubáció is (10 perc) ugrásszerűen javította. A maximális túlélést a krioprezerválás előtt -40°Con 30 percig tartott tenyészetekben találtuk mindkét DMSO koncentráció mellett. A -30 °C transzfer hőmérsékleten azonban, tartási periódustól függetlenül a túlélés minden esetben csökkent.


34

Transzfer hőmérséklet 80

-10 °C

-20 °C

-30 °C

-40 °C

-50°C

70 60

túlélés (%)

50 40 30

12,5 % DMSO

20

15.0 % DMSO

10

SZD 5 %

0 0 10 20 25 30

0 10 20 25 30

0 10 20 25 30

0 10 20 25 30

0 10 20 25 30

Tartási periódus (perc) 4. ábra. A különböző transzfer hőmérsékleteken (-10 - -50 °C) történő tartási periódusok (0-30 perc) hatása a dimetil-szulfoxid tartalmú (12.5 %, 15.0 %) fagyasztó oldatban, 1 °C/perc sebességgel fagyasztott közönséges mézpázsit sejtek TTC-teszttel meghatározott túlélésére. A lassú előhűtés után a transzfer hőmérsékletről közvetlenül folyékony nitrogénbe merítéssel általában csak a finom méretű szuszpenziós tenyészetekben tudtak túlélést kimutatni (Withers és King 1980). A nagyobb szemcseméretű szuszpenziókban a transzfer hőmérséklet elérésével csak ez explantumok felületi sejtjeiben alakul ki a védő dehidratáció, az átmeneti hőmérsékleten történő tartással azonban a minta mélyebb rétegeiben levő sejtek is dehidratálódnak. A krioprezervált mézpázsit tenyészetek 2-3 mm átmérőjű sejtaggregátumokból álltak (5/B ábra), ezért feltételezhető, hogy a transzfer hőmérsékleti inkubáció után tapasztalt lényeges túlélés növekedés az aggregátumok belsejében is kialakult protektív dehidratációval van összefüggésben. A transzfer hőmérsékleti inkubáció hasonló hatását bizonyították retek és dohány (Hauptmann és Widholm 1982) szuszpenziós tenyészetekben is. A kísérletekben sokszor eltérő transzfer hőmérsékleti és tartási periódus kombinációk azonos szintű túlélést eredményeztek (pl. -20°C -on 30 perc és -40 °Con 0 perc). Ezekben az esetekben a hasonló túlélés feltételezhetően a hasonló dehidratáltsági körülmények kialakulására vezethető vissza.


35

A túlélő közönséges mézpázsit tenyészetek 40-60 %-a - 10 mg/l kinetint tartalmazó szilárd N6 (Chu et al. 1975) táptalajon - növényeket regenerált (az eredmények nincsnek bemutatva), ezek azonban kivétel nélkül albínók voltak. Az egyszikű fajok szomatikus sejt tenyészeteiből regenerált növények között az albínók megjelenését többen megfigyelték (rizs: Abe és Futsuhara 1986, közönséges mézpázsit: Binh et al. 1989). A zöld kalluszok kiválogatásán alapuló szelekciós módszer sziki mézpázsitban lényegesen javította a regenerálódó zöld növények arányát (Heszky et al. 1989). A

krioprezervált

aggregátumokon

regenerálódó

albínók

arányának

csökkentésére a zöld kalluszra szelektált és újra szuszpenzióba vont sziki mézpázsitsejtekkel megismételtük a fagyasztást. A DMSO oldatban 1 °C/perc sebességgel -20 °C- transzfer hőmérséklet és 30 perc tartás kombinációval krioprezervált túlélőkből regenerálódó növények azonban szintén albínók maradtak (1. táblázat), (5. ábra) 1. Táblázat. Különböző DMSO tartalmú (12.5 %, 15.0 %) fagyásvédő oldatban, 1°C /perc sebességgel -20 °C-ra fagyasztott és 30 perc után a folyékony nitrogénbe helyezett sziki mézpázsit (P. limosa) sejt-aggregátumok zöldnövény regeneráló képessége 10 mg/l kinetint tartalmazó szilárd N6 (Chu et al. 1975) táptalajon. DMSO %

Aggregátu-

Túlélő

Túlélés

Regenerán-

Zöld

mok száma

aggregátu-

(%)

sok

növé-

száma

nyek

mok száma

száma

12.5

38±6

28±3.5

73±8.2

68±3.5

0

15.0

47±3.8

45±4.3

94±3.6

92±5.3

0

NF.Kontrol

32±6.2

32±5.2

100±2.4

75±2.6

47±4.5

NF= nem fagyasztott, kezeletlen kontroll A táblázat adatai 5 Petri csésze/kezelés átlagát és szórást mutatják. SZD 5%= 9.66 %

36


5. ábra. A krioprezervált közönséges és sziki mézpázsit kallusz regenerációja. Közönséges mézpázsit telepek (sötétzöld sáv) sókiválásos szikesen (A). Közönséges mézpázsit sejtaggregátumok (Æ=2-3 mm) AA2 táptalajban (B). Zöld kalluszra szelektált, nem fagyasztott zöld és albínó sziki mézpázsit regeneránsok (C). Krioprezervált sziki mézpázsit aggregátumokból regenerálódó albínó növények (D, E, F).


37

4.2 Az ABS hatása a vadgesztenye embriók és kukorica sejtek túlélésére A kísérletet E1B5 folyékony táptalajban fenntartott - járulékos embriógenezissel szaporodó, porzószál eredetű - vadgesztenye szomatikus embriókkal és éretlen embrió eredetű folyékony N6M táptalajban tenyésztett kukorica sejtszuszpenziós (MSCE/79) tenyészetekkel állítottuk be. A vadgesztenye tenyészeteket szaharóz, prolin, ABS-szaharóz és ABS-prolin kombinációkat tartalmazó előtenyésztő táptalajban kezeltük a fagyasztás előtt négy napig (6. ábra). A kukorica sejtek előkezelésére csak abszcizinsavat használtunk (7. ábra) 4 napig. A tenyészeteket WK krioprotektáns oldatban, lassú (1 °C/ perc, sebességgel -35 °C-ig, majd 40 perc tartás

után FN-be merítés) és gyors (a jégfürdőből transzfer

hőmérséklet és transzfer hőmérsékleti tartás nélkül közvetlenül FN-be merítés) sebességgel fagyasztottuk. A tenyészetek életképességét TTC-teszttel határoztuk meg. Az előkezelés és WK krioprotektáns nélkül, csak folyékony táptalajban fagyasztott kontroll vadgesztenye tenyészetek (F.

Kontr.) túlélését

minden

előkezelési típus javította. A legnagyobb túlélési rátát a normál cukor (3%) tartalmú, 0.75 mM abszcizinsavval kiegészített táptalajon előtenyésztett, lassan fagyasztott vadgesztenye embriók mutatták (6. ábra, alsó). Ebben a fagyasztási rendszerben a 0.75 mM-tól nagyobb ABS koncentráció hatására csökkent a tenyészetek TTCteszttel

kimutatott

túlélése.

ABS

nélkül

5%

prolint

tartalmazó

táptalajon

előtenyésztett szomatikus embriók életképessége kismértékben javult. A hétszeres dózisú szaharóz (21 %) önmagában és ABS kombinációban sem eredményezett lényeges túlélés növekedést. A jégfürdőből közvetlenül FN-be helyezett, gyorsan fagyasztott vadgesztenye szomatikus embriók a fagyasztott kontrollhoz (F. Kontr.) viszonyítva

minimális

légzésintenzitás-növekedést

mutattak

(6.

ábra,

Túlélésük azonban előkezelési típustól függetlenül alacsony szinten maradt.

felső).


38

gyors fagyasztás

túlélés (%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

SZD 5 %

0

0,75

7,5

75

abszcizinsav (uM) 3% szah.

21%szah.

NF. Kontr.

F. Kontr.

5% prol.

túlélés (%)

lassú fagyasztás 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

SZD 5 %

0

0,75

7,5

75

abszcizinsav (uM) 3% szah.

21%szah.

NF. Kontr.

F. Kontr.

5% prol.

6. ábra. Az ABS-szaharóz és ABS-prolin előkezelés kombinációk hatása a gyorsan (felső ábra) és lassan (alsó ábra) fagyasztott vadgesztenye szomatikus embriók TTC teszttel meghatározott túlélésére. (NF. Kontr.: nem fagyasztott kezeletlen kontroll, F. Kontr.: Krioprotektáns kiegészítést nem tartalmazó, csak a folyékony táptalajban fagyasztott, kontroll, Gyors fagyasztás: közvetlen FN-be merítés, Lassú fagyasztás: 1 °C/perc, sebességgel -35 °C-ig, majd 40 perc

tartás után FN-be merítés) Az ABS előkezelés a kukorica sejtek TTC redukcióval meghatározott túlélését csak kis mértékben javította (7. ábra). Az ABS kezelések között egyik fagyasztási sebesség

mellet

koncentrációt.

sem

lehetett

egyértelműen

maghatározni

az

optimális


túlélés (%)

39

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

lassú fagy. gyors fagy.

SZD 5 %

0

0,75

7,5

75

NF. F. Kontr. Kontr.

abszcizinsav (uM) 7. ábra. Az ABS tartalmú előkezelés hatása a lassan és gyorsan fagyasztott MSCE/79 kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek TTC-teszttel meghatározott túlélésére. (NF. Kontr.: nem fagyasztott kezeletlen kontroll, F. Kontr.: Krioprotektáns kiegészítést nem tartalmazó, csak a folyékony táptalajban fagyasztott, kontroll, Gyors fagyasztás: közvetlen FN-be merítés, Lassú fagyasztás: 1 °C/perc, sebességgel -

35 °C-ig, majd 40 perc tartás után FN-be merítés)

A kombinált ABS és szaharóz előkezelés túlélésre gyakorolt szinergista hatását többen megfigyelték. A kakaófa ABS-al előkezelt zigótikus embrióinak túlélését a táptalaj 21 %-os szaharóz kiegészítése lényegesen javította (Pence 1991). ABS és 18 % szaharóz együttes használata eredményezte a körte hajtáscsúcsok (Moriguchi 1995) és spárga kalluszok (Uragami 1991) maximális túlélését is. Ezeket a megfigyeléseket nem támasztják alá a lassan fagyasztott vadgesztenye szomatikus embriók krioprezerválásával kapott eredményeink, ahol az ABS hatását a 21 % cukor, illetve 5% prolin kombinációk rontották. Irodalmi adatok alapján valószínű, hogy az abszcizinsav eredetű krioprotekció a stressz fehérjék indukciójával van összefüggésben. A fagyasztás hatására kialakuló vízhiány tolerálására expresszálódó stresszgének szabályozásában azonban ABS függő és ABS független utak is ismertek (Skriver és Mundy 1990, Bray 1993, 1997, Shinozaki és Yamaguchi-Shinozaki 1997, Ingram és Bartels 1996). Feltételezhető, hogy a vadgesztenye fagytűrő képességének kialakulása elsősorban az abszcizinsav közvetítette mechanizmust követi.

40


Kísérleteinkben az abszcizinsav hatására a kukorica sejtek kriotoleranciája csak

mérsékelten

nőtt.

Ez

a

kukorica

természetes

fagyérzékenységével

magyarázható. Bizonyították, hogy ABS kezelésekkel elsősorban azokban a fajokban alakítható ki fagytolerancia, amelyekben a hidegedzés is hasonló hatású [őszi búza, rozs, rozsnok: (Chen és Gusta 1983), lucerna: (Orr et al. 1985)]. A prolin előkezelés viszont krioprotektív hatást biztosított fagyasztott kukorica sejtekben is (Withers és King 1979). Hipotézisünk szerint, a fagytűrő fajokban a krioprotekció kialakulásában az ABS függő, a melegigényes növényekben pedig az ABS független jelátadási utak dominálnak. Ez a feltételezés – bizonyítás után - alátámasztaná a fentiekben, a vadgesztenye esetében levont következtetéseinket is.

41


4. 2.1. A szárítás hatása a vadgesztenye embriók túlélésére A kísérletet vadgesztenye szomatikus embriókon végeztük el. A tenyészeteket eltérő ABS tartalmú szilárd E1B5 táptalajon előkezeltük, majd 2, 3 és 4 óra időtartamú, szoba hőmérsékleten, lamináris fülkében történő szárítás után fagyasztó oldat nélkül, a szobahőmérsékletről közvetlenül FN-be helyeztük. Kezeléstől függetlenül a szilárd táptalajra helyezett explantumok a felolvasztás után 1-2 nappal megbarnultak. A látszólag elhalt, barna embriók az utótenyésztés 25. hetén indultak újra fejlődésnek, ezért az embriókat folyamatosan figyeltük és túlélésüket a 6. héten mutatott differenciáltságuk alapján határoztuk meg. A túlélő embriók (S túlélő embr.) egy csoportjából közvetlenül szikleveles növénykék fejlődtek (szikl. embr.), másik részükön újabb szomatikus embriók képződtek (járulékos embr.), amelyekből szintén intakt növények fejlődtek (8. ábra). A tenyészetek szárítása ABS előkezelés után lényegesen javította a WK krioprotektáns nélkül közvetlenül FN-be helyezett embriókhoz képest a túlélését (2. táblázat). Az ABS kezelések nem befolyásolták az embriók víztartalmát, a 2, 3 és 4 órás szárítási periódusok viszont 53 %, 22 % és 13 %-ra csökkentették az embriók frisstömegét. A víztartalom csökkenésével párhuzamosan csökkent a nem fagyasztott kontroll embriók túlélése, viszont nőtt a fagyasztás után az életképes embriók száma. Három óra időtartamú deszikkálás után kismértékben nőtt a túlélő embriók száma az ABS előkezelés nélkül fagyasztott tenyészetekben is, ezekhez képest azonban az ABS előtenyésztés után lényegesen több túlélő embriót figyeltünk meg. A legnagyobb számú életképes embriót a 4 óra időtartamú szárítás ereményezte, ami az embriók frisstömegét 13 %-ra csökkentette. A 4 órás deszikkációt megelőző ABS előkezelés - az ABS vizsgált 0.75-75.0 µM koncentráció tartományában - koncentrációtól függetlenül nagy túlélési arányt eredményezett. A 3 óránál rövidebb idejű, 22 %-nál nagyobb frisstömeget hagyó szárítás után kevés életképes embriót figyeltünk meg. A szárításra alapozott fagyasztási technika használatával számos faj zigótikus és szomatikus tenyészeteiben sikerült kriotoleranciát kialakítani. A vadgesztenye szomatikus embriókkal kapott eredményeinkhez hasonlóan a frisstömeg 12-16%-ra való szárítása eredményezte a maximális túlélő Coffea canephora, [13%: (Hatanaka et al. 1994)] szomatikus embriót és Coffea liberica [15%: (Normah és Vengadasalam


42

1992, Coffea arabica [16%: ( Abdelnour-Esquivel et al. 1992b)] és Fraxinus excelsior [12% (Brearley et al. 1995)] zigotikus embriót. Ezekben a kísérletekben a tenyészeteket 0.5-1.0 M cukor tartalmú táptalajon tenyésztették deszikkáció előtt. A cukor kedvező hatását a deszikkáció tolerancia fokozásával magyarázzák. 2.

Táblázat. A szobahőmérsékleten, lamináris fülkében történő különböző időtartamú (0-4 óra) deszikkáció és az ABS kezelések (0.75 - 75.0 µM) hatása a krioprotektáns oldat nélkül, gyorsan fagyasztott vadgesztenye szomatikus embriók túlélésére.

szárítás víztart. (óra) (frisstömeg %-a) 0

80

2

53

3

22 13

4

ABS µM

túlélési % túlélési % túlélési % túlélési %

S túlélő embr. szikl. embr. járulékos embr. Stúlélő embr. szikl. embr. járulékos embr. S túlélő embr. szikl. embr. járulékos embr. S túlélő embr. szikl. embr. járulékos embr.

0 2±1.8 2±1.8 0 8±2.5 6±1.9 2±0.6 14±3.3 13±2.9 1±0.4 11±2.0 11±2.0 0

0.75 6±2.5 5±2.0 1±0.5 6±2.3 6±2.2 0 34±1.9 22±0.8 12±1.1 46±5.2 37±4.2 9±1.0

7.5 4±1.9 2±1.0 2±0.9 11±1.7 8±0.7 3±1.0 32±2.6 18±2.0 4±0.6 40±4.8 30±1.8 10±3.0

75.0 5±4.0 5±3.1 1±0.9 21±4.1 13±1.4 8±2.7 26±4.9 20±3.4 6±1.5 44±3.4 36±2.1 8±1.3

NF. Kontr 97±5.9 72±3.0 25±2.9 96±6.2 68±4.1 28±2.1 76±4.7 49±3.2 27±1.5 45±5.3 33±4.8 12±0.5

SZD 5%= 5.7 % A táblázat adatai kezelésenként 100 embrió ( 20 embrió /Petri csésze, 5 Petri csésze/kezelés) átlagát és szórását mutatják. (járulékos embr. =járulékos embriógenezist mutató túlélő embriók, szikl. embr.= közvetlen embriógenezist mutató túlélő embriók, S túlélő embr. = járulékos embr. + szikl. embr.). (NF. Kontr.= nem fagyasztott kontroll) Az ABS szerepét viszont a zeller (Kim és Janick 1991) és a lucerna (Senaratna et al. 1989) szomatikus embriók víz stresszel szembeni toleranciájának kialakításában bizonyították. Feltételezhető, hogy az ABS hatása a stressz fehérjék indukcióján keresztül -a cukor előkezeléshez hasonlóan- szintén a vízhiány tűrésének fokozásán keresztül érvényesül.

43


8. ábra. A krioprezervált vadgesztenye szomatikus embriók regenerálódása. Virágzó vadgesztenye fa (48-50 éves) (a). Járulékos embriógenezis folyékony táptalajban (b). Túlélő csírázó embriók szilárd táptalajon 4 héttel a felolvasztás után. (c). Szikleveles nem fagyasztott (d) és fagyasztott (e) embriók a felolvasztás után 6 héttel. Túlélő embriók járulékos embriógenezise pásztázó elektron- (f) és fény (g) mikroszkópos felvételen (szakasz=1mm). Kifejlődött apikális merisztéma (h) (szakasz=1mm) és vadgesztenye növény (i) fejlődés 12 héttel a felolvasztás után.


44

4.2.2. A hősokk hatása a vadgesztenye embriók és kukorica sejtszuszpenziók túlélésére A kísérleteket vadgesztenye szomatikus embriókon és az MSCE/79 kukorica sejtszuszpenziókban állítottuk be. A tenyészeteket 0.75 µM ABS tartalmú táptalajban való 4 nap időtartamú előkezelés után a táptalajjal együtt, Erlenmeyer lombikban 40 °C -os vízfürdőben rázattuk 30, 60 és 90 percig. A hősokk kezelések után az embriókat és sejteket WK krioprotektáns oldatban történő 1 óra inkubáció után fagyasztottuk lassú (1 °C/perc, sebességgel -35 °C-ig, majd 40 perc tartás után FNbe merítés) és gyors (az előkezelés hőmérsékletéről közvetlenül a FN-be merítés) sebességgel ( 9. ábra). A tenyészetek életképességét TTC – teszttel határoztuk meg. ABS előkezelés nélkül alkalmazott hőinkubáció egyik fagyasztási rendszerben sem javította szignfikánsan a különböző explantumok túlélését (az eredmények nincsenek bemutatva). Az ABS előkezelés után alkalmazott különböző időtartamú hősokk kombinációk viszont javították tenyészetek TTC redukcióját. A maximális kriotolerancia mind a vadgesztenye embriókban, mind a kukorica sejtekben 60 perc időtartamú hősokk kezelés hatására alakult ki, mindkét fagyasztási rendszerben. A lassan fagyasztott vadgesztenye embriók túlélését 30 perc időtartamú hősokk kezelés a hősokk nélkül fagyasztott (hősokk kezelés időtartama 0 perc) tenyészetekhez képest nem befolyásolta, a 90 percen át folytatott hőinkubáció viszont

kismértékben

csökkentette.

A

gyorsan

fagyasztott

vadgesztenye

tenyészetek túlélésében minden hősokk kezelés szignifikáns javulást okozott. A 60 perces inkubáció után gyorsan fagyasztott vadgesztenye tenyészetek túlélése a lassan fagyasztott tenyészetek túlélésével azonos szintű volt. Ebben a fagyasztási rendszerben azonban a 30 perces hősokk a 0 perces kontrollhoz képest is lényegesen növelte az embriókban kimutatott TTC redukció mértékét. A 90 perc időtartamú hőkezelés utáni túlélés átlaga az optimumhoz (60 perc) képest csökkent (p=5%). A fagyasztott MSCE/79 kukorica szuszpenziók túlélésében mérsékeltebb, de hasonló

tendenciájú

növekedést

lehetett

megfigyelni

ABS

előkezelés

és

hőinkubációt követően. A lassú fagyasztás előtt azonban már a 30 perces hősokk kezelés is növelte a tenyészetek TTC aktivitását. A gyorsan fagyasztott MSCE/79 sejtek életképessége viszont a hősokk kezelések hatására nem javult lényegesen.


45

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

túlélés

túlélés (%)

túlélés (%)

vadgesztenye embriók

0

30

60

90

SZD 5 hősokk kezelés időtartama (perc) lassú fagy.

gyors fagy.

NF. Kontr. F. Kontr.

kukorica sejtek

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

30

60

90

SZD hősokk kezelés időtartama (perc) 5 % lassú fagy.

gyors. fagy

NF. Kontr.

F. Kont.

9. ábra. A különböző időtartamú hősokk (40 °C) kezelések hatása a 0.75 µM abszcizinsavat tartalmazó táptalajon előtenyésztett vadgesztenye szomatikus embriók és kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek TTC-teszttel meghatározott túlélésére lassú és gyors fagyasztás után. (NF. Kontr.: nem fagyasztott kezeletlen kontroll, F. Kontr.: Krioprotektáns kiegészítést nem tartalmazó, csak a folyékony táptalajban fagyasztott, kontroll, Gyors fagyasztás: közvetlen FN-be nerítés, Lassú fagyasztás: 1 °C/perc, sebességgel -

35 °C-ig, majd 40 perc tartás után FN-be merítés) Intakt növényekben és in vitro tenyészetekben a hősokk kezelések hatására javult a szárazság és fagytűrő képesség (Collins et al. 1993, Andarajah et al. 1991, Harrington és Alm 1988). A Saccharomices cerevisiae sejtek cseppfolyós nitrogénben történő tárolás utáni túlélése 20-30 szorosára nőtt hősokk-kezelés után (Kaul et al. 1992). A hősokk alkalmazása az explantumok kriotoleranciájának kialakításában azonban nincs elterjedve. Reinhoud és csoportja (Reinhoud et al. 1995) 37 °C on 2 óráig hőkezelt dohány sejtszuszpenziós tenyészeteket, majd PVS 2 vitrifikáló oldatban gyorsan és módosított WK krioprotektáns keverékben lassan fagyasztotta. A hősokk kezelés krioprotektív vegyülettel való előkezelés nélkül nem javította a kontroll sejtek túlélését. Mannit-hősokk kombinációban azonban a gyorsan fagyasztott sejtek nagyobb arányú túlélést mutattak, mint a lassú előfagyasztás után FN-be helyezettek. A hősokkfehérjéknek a membrán - és enzimfehérjék szerkezeti stabilizálásában van szerepük. Feltételezik, hogy a mannit hatására kialakult enyhe

46


ozmotikus stressz következtében indukálódó stressz fehérjék, és HS proteinek szinergista hatásban javítják a dohány sejtek kriotoleranciáját (Reinhoud et al. 1995). Ezeket az eredményeket megerősítik a vadgesztenye szomatikus embriók és kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek fagyasztásával kapott eredményeink. Az ABS hatására aktiválódó stressz és hősokk fehérjék közti szinergizmus a HS proteinek chaperon funkciójával magyarázható (Howarth és Ougham 1993). Feltételezhető, hogy az ABS hatására indukálódó proteinek közvetlen fagyásvédők. A hősokk fehérjék azonban elsősorban közvetett krioprotektív hatásukkal, a fagyás során denaturálódott fehérjék, renaturálásával (Pelham 1986, Rothman 1989, Skowyra et al. 1990) javítják a krioprezervált tenyészetek túlélését.


47

4.2.3. A vitrifikáló oldat és az alginát burok hatása a kivi embriók túlélésére A kísérletet 2.5 mg/l BA tartalmú folyékony WPM-táptalajban fenntartott szikleveles stádiumú kivi szomatikus embrió tenyészeteken állítottuk be. Az embriókat 0.75 µM ABS-at tartalmazó szilárd WPM táptalajon tenyészettük 4 napig, majd közvetlenül, illetve alginát gélbe kapszulázás után PVS-2 vitrifikáló oldatban FN-be helyeztük. A felolvasztott embriókat 1.2 M szaharóz tartalmú folyékony tenyésztő táptalajban mostuk 5 percig. Az utótenyésztést szilárd 2.5 mg/l BA tartalmú WPM táptalajon folytattuk. ABS előkezelés nélkül a PVS-2 vitrifikáló oldat a hőmérséklettől függetlenül már 5 perc után rontotta az embriók túlélését (nincs bemutatva). ABS előkezelés azonban a vitrifikáló oldat toxicitását a PVS 2 kezelés időtartama és hőmérséklete függvényében mérsékelte, mind a kapszulázott mind a nem kapszulázott embriókban (10. ábra). A kapszulázás nélkül 25 °C-on 20 percnél hosszabb ideig kezelt tenyészetekben a fejlődést mutató szikleveles embriók aránya ugrásszerűen csökkent. A jégfürdőben végzett vitrifikációs kezelés hatására az embriók életképességének jelentős romlása csak 30 perc után következett be. A vitrifikáló oldat toxicitását lényesen csökkentette amennyiben a kezelést alginát gélbe kapszulázott embriókon végeztük. A 0°C-on PVS-2 oldatban kezelt, kapszulázott embriók 50 perc kezelés után is tovább fejlődtek.

nem kapszulázott embrió

kapszulázott embrió

100 90

0 °C 25 °C

80 70 60 50 40 30 20

SZD 5%

SZD 5%

10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

PVS-2 kezelés idõtartama (perc)

10. ábra. A 0 °C –on és 25°C-on végzett különböző időtartamú PVS-2 kezelések hatása a 0.75 mM ABS tartalmú táptalajon előtenyésztett nem fagyasztott, kapszulázott és kapszulázatlan kivi embriók túlélésére.

48


11. ábra. Krioprezervált kivi szomatikus embriók regenerálódása. Steril levelekből (a) indított hajtástenyészetek (b) folyékony táptalajban. Szilárd táptalajon a levélkorongokon képződő szomatikus embriók (c). Alginát gélbe kapszulázott FN tárolást túlélő (nyíl) és elhalt (fekete nyíl) embriók (d). A túlélő embriókból fejlődő növénykék (e,f) és kiültetett növény (g).


49

Az ABS előkezelés, PVS-2 vitrifikáló oldat kombináció után a folyékony nitrogénbe merített, kapszulázott embriók a felolvasztás utáni 5.-7. naptól folytatták differenciálódásukat. Az utótenyésztés 3. hetére 1.5-2. cm-es mikrohajtásokká fejlődtek. Folyékony 2.5 mg/l BA tartalmú WPM táptalajba kalszula nélkűl visszahelyezve a hajtásokon gyökerek képződtek. A 6 hetes, 4-5 lombleveles fejlettségű gyökeres hajtások perlites tőzegben történő 2 hét adaptáció után normális növényekké fejlődtek (11. ábra)

35

fejlődő embriók (%)

30

SZD 5 %

25 20

0 °C 25 °C

15 10 5 0 0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

PVS 2 kezelés idõtartama (perc) 12. ábra. A 0 °C és 25 °C-on elvégzett különböző időtartamú PVS-2 kezelések hatása 0.75 µM ABS előkezelés után kapszulázott embriók túlélésére. Külön kísérletben vizsgáltuk a PVS-2 előkezelések hatását a kapszulázott embriók fagyasztás utáni túlélésére. A legnagyobb számú túlélő embriót a 0 °C-on PVS-2 oldatban 50 perc időtartamú inkubáció eredményezte (12. ábra). A PVS-2 oldat 25 °C-on történő alkalmazásával a maximális túlélést a 30 perc kezelési idő után tapasztaltuk. Irodalmi adatok alapján a vitrifikációs technikával PVS-2 oldatban fagyasztott fokhagyma merisztémák krioprotektív előtenyésztés nélkül is túlélték a fagyasztást (Niwata 1995), az ismertetett kísérletek többségében túlélő explantumokat azonban csak - a vitrifikáló oldat hatására fellépő dehidratációs stressz csökkentésére használt -, cukor, cukoralkohol tartalmú táptalajon történő előkezelés (Niino et al.

50


1992a, 1992b, Reed 1995, Yamada et al. 1993), illetve hidegedzés (Kuranuki és Sakai 1995) után figyeltek meg. Kísérleteink alapján a kivi embriók nagyon érzékenyek a PVS-2 oldatra, azonban PVS-2 toleranciájuk növelhető ABS előkezeléssel és alginát gélbe történő kapszulázással. Ezért feltételezhető, hogy a védő stressz proteinek aktivációja a kiviben szintén az ABS függő utakon keresztül történik, illetve az embriókat beburkoló alginát gél a PVS-2 fokozatos és kevésbé ártalmas penetrálódását biztosítja. Az alginát gél hasonló hatását bizonyították Wasabia japonioa merisztémák vitrifikációs fagyasztásával (Matsumoto et al. 1995).


51

4.3. A szaharóz és cukoralkoholok hatása az Arabidopsis és a kukorica sejtek túlélésére A kísérleteket mannitot 0.25 -1.0 M koncentrációban tartalmazó folyékony MS táptalajban előkezelt Arabidopsis három ökotípusán (C24, LER, WS) és szaharózt, mannitot és szorbitot 0.5-0.75 M-ban tartalmazó N6M táptalajban előtenyésztett MSCE/79 kukorica sejtszuszpenziós tenyészeten állítottuk be. A kultúrákat 4 nap időtartamú szaharóz, cukoralkohol kezelés után, fagyasztás előtt jégfürdőben egy órán át 1 % prolinnal kiegészített WK krioprotektáns oldatban inkubáltuk. A sejteket lassú előfagyasztás után helyzetük FN-be (1 °C/perc, -35 °C-ig, majd 40 perc után FN-be merítés). A tenyészetek túlélését a felolvasztás utáni 1., 5. és 10. napon

elvégzett TTC- teszttel és a felolvasztás

utáni 1. és 20. napon mért frisstömeg változással határoztuk meg. A TTC-teszt eredményeit 50 mg frisstömegű sejtből kioldott formazán 490nm-en mért optikai denzitásával (OD 490nm) fejeztük ki. Az előkezelés hatását a szaharóz és cukoralkohol előtenyésztés és WK krioprotektáns nélkül, csak a folyékony táptalajban fagyasztott (F. Kontr.) és a kezeletlen, nem fagyasztott (NF. Kontr.) kontroll típusokhoz hasonlítottuk. Az Arabidopsis sejtek krioprezerválása során a fagyasztott kontroll tenyészetek (F Kontr.)

TTC-teszttel

meghatározott

túlélése

(14.

ábra)

mindhárom

ökotípusban

következetesen kisebb volt, mint a kombinált mannit - WK krioprotektáns előkezelés után fagyasztott sejteké. A fagyasztott kontrollcsoport (F. Kontr.) alacsony TTC redukciója összefüggést mutatott a sejtek felolvasztás utáni gyors elhalásával. A felolvasztás utáni 5. napra a szürkéssárga kolóniák elfolyósodtak és a 20. napon elvégezett frisstömeg méréssel sem lehetett tömegükben gyarapodást kimutatni. A túlélő sejteket eredményező kezelések után viszont a szilárd táptalajon, szűrőpapír korongokra szélesztett kolóniák a felolvasztás utáni 5. és 10. napok között növekedésnek indultak (13. ábra). A legnagyobb arányú TTC redukciót (14. ábra) minden estben a 0.63 M mannit előkezelés után kaptuk. Az ennél nagyobb mannit koncentráció csökkentette a sejtek TTC aktivitását. Az Arabidopsis ökotípusok közül a C24-es típus sejtjeiben alakult ki a legnagyobb kriotolerancia. A mannitot 0.5 M koncentrációban tartalmazó táptalajon való előtenyésztés után fagyasztott tenyészetek túlélési átlaga csökkent, de a két kezelés között (0.63 és 0.5 M) statisztikailag lényeges különbség (p=5%) nem volt. A 0.5 M-nál kisebb mannit koncentrációk a LER ökotípus kivételével kevesebb túlélő sejtet eredményeztek. A kísérletben a formazán különböző időpontokban kimutatott meghatározott OD. értékében nem tudtunk tendenciát, vagy szignifikáns különbségeket meghatározni.

52


13. ábra. Arabidopsis thaliana sejtszuszpenziós tenyészetek krioprzerválása. Petri csészében csírázó 10 napos növények (A) gyökerei (B) folyékony táptalajban 3 hónap tenyésztés után finom méretű sejtszuszpenziókká (C) alakultak. Túlélő C24 sejtek megjelenése fagyasztás után 5-7 nappal (E). Fagyasztott, szűrőpapírra szélesztett C24 sejtek (D): felső-NF. Kontroll, középső 0.63M mannit előtenyésztés után fagyasztott , alsó- F. Kontroll. TTC színreakció:TTC pozitív (vörös) és TTC negatív (fehér) sejtek (F).


53

C 24 TTC-teszt időpontok a felolvasztás után

1. nap

5. nap

10. nap

1,2

OD. 490 nm

1

C 24

0,8 0,6 0,4

SZD 5 %

0,2 0 0

0,34

0 0,25 0,34 0,5

0,63

1

0,63 0,75 1,0

Mannitol (M)

F. Kontr.

NF. F. Kontr.

Mannit (M) LER TTC-teszt időpontok a felolvasztás után

1. nap

5. nap

10. nap

OD. 490 nm

1,2

LER

1 0,8 0,6 0,4

SZD 5 %

0,2 0 00

0,34 0,5 0,63 0,63 0,75 1,0 1 0,25 0,34

Mannitol (M)

NF.F. Kontr. F. Kontr.

Mannit (M)

WS TTC-teszt időpontok a felolvasztás után

1. nap

5. nap

10. nap

OD. 490 nm

1,2 1

WS

0,8 0,6

SZD 5 %

0,4 0,2 0 0

0,34

0,63

1

F. Kontr.

0 0,25 0,34 0,5 0,63 0,75 1,0 NF. F. Mannitol (M) Kontr.

Mannit (M) 14. ábra. A mannitot tartalmazó táptalajon való előkezelés hatása a C 24, LER és WS. Arabidopsis thaliana sejtszuszpenziós tenyészetek TTC redukciójára a felolvasztás utáni 1., 5. és 10. napon. (NF. Kontr: nem fagyasztott kontroll; F. Kontr: fagyasztott kontroll)


54

Az Arabidopsis ökotípusok frisstömeg-változással kimutatott túlélési értékei (3. táblázat)

pozitív

összefüggést

mutattak

a

TTC-tesztben

kimutatott

légzés

intenzitással. A legnagyobb arányú tömegnövekedést a 0.63 M mannit előkezelés eredményezte minden típusban. Az előkezelő táptalaj 0.63 M-nál több, vagy kevesebb mannit tartalma ehhez képest kisebb arányú tömeggyarapodást okozott. A fagyasztás után tömeggyarapodást mutató kalluszokból, a 20. napon újra indított szuszpenziós tenyészetek sejtjei a nem fagyasztott kontroll kolóniákból indított szuszpenziókhoz hasonló morfológiájúak voltak. A 7 napos passzálási ciklusban fenntartott tenyészetek, a hatodik átoltás után az eredeti szuszpenzióra jellemző krémsárga színűvé és finom méretűvé váltak. Erre az időre az eredeti és az újraindított tenyészetek tömegnövekedési rátájában (210% tömeggyarapodás/hét) nem mutatkozott különbség (nincs bemutatva). 3. Táblázat. A mannit előkezelés hatása a C 24, LER és WS Arabidopsis thaliana ökotípusok sejtszuszpenziós tenyészetei frisstömegének %-os változására, a felolvasztás utáni 20. napon. Ökotípus

mannit (M)

0 C24

LER

WS

NF.

F.

Kontr.

Kontr.

0.25

0.34

0.5

0.63

0.75

1.0

42.51

56.98

75.89

98.34

46.52

25.89

152.59

-1.25

±9.6

±5.3

±8.4

±9.3

±12.3

±9.5

±5.3

±17.8

±0.9

48.67

45.24

58.21

57.27

62.52

42.89

36.54

128.36

0.96

±7.9

±8.3

±10.3

±8.5

±5.9

±8.6

±7.5

±20.8

±1.2

35.23

45.22

48.65

52.69

89.36

68.25

45.63

145.63

-0.98

±9.6

±4.5

±8.6

±10.2

±14.2

±10.2

±14.5

±25.3

±0.5

48.52

-1

SZD 5% = 6.2 % A táblázat adatai kezelésenként öt Petri csésze átlagát és szórását mutatják. (NF.Kontr.: nem fagyasztott kontroll; F.Kontr.: fagyasztott kontroll)

55


A szilárd táptalajra helyezett szűrőpapír korongokra passzált az eredeti szuszpenzióban krémsárga MSCE/79 sejtek a felolvasztás után 1-2 nappal kifehéredtek, vagy világos barna színűekké váltak. A fehér kolóniák nem nyerték vissza jellemző színüket, tömegük nem változott és a 6. hét végére nyálkás, szerkezet nélküli, elhalt telepekké váltak. A túlélő, krémsárga sejtek a világosbarna kolóniákon jelentek meg a felolvasztás utáni 2.-3. héten (16. ábra). Az MSCE /79 sejtek túlélését - a fagyasztott kontrollokhoz képest - mindhárom előkezelés ugrásszerűen javította. A TTC redukció (15. ábra) és a frisstömeg mérés (4. táblázat) alapján a maximális túlélést a szaharóz tartalmú táptalajon előtenyésztett sejtek mutatták. A TTC-teszttel (15. ábra) azonban - a különböző szaharóz koncentrációk hatásaként - nem

tudtunk

szignifikáns

eltéréseket

meghatározni. A szaharóz tartalmú előtenyésztéssel kapott TTC aktivitáshoz képest a szorbit és a mannit kezelések hatására alacsonyabb értékek mutatkoztak. A kukorica

sejtek

TTC

redukció

mértékével

meghatározott

túlélése

jelentős

különbségeket mutatott a felolvasztás utáni 1. és 15. napon. Az első napi mérések túlértékelték az életképes sejtek arányát. Az így kapott értékek a 15. napra felére, harmadára csökkentek. A frisstömeg-változással meghatározott tényleges túlélési értékekhez a 15 napon elvégzett TTC-teszt eredményei jobban illeszkedtek. A krioprezervált kukorica sejttenyészetek frisstömeg-változását a felolvasztás utáni 2. héttől hetente mértük 4 héten keresztül. Az utótenyésztés 3. hetében az egyes

kezelések

között

nem

tapasztaltunk

szignifikáns

különbségeket.

A

statisztikailag bizonyítható (p =5%) különbségek már a felolvasztást követő 4. héten is mutatkoztak, de a 6. hétre váltak egyértelművé. A tömegváltozás alapján a maximális túlélést a szaharóz 0.63 M koncentrációja eredményezte. Az ettől eltérő szaharóz tartalom - az előkezelő táptalajban - rontotta a sejtek túlélését. A TTCteszttel meghatározott túléléshez hasonlóan a túlélő sejtek aránya a szorbit és mannit előkezelésekhez képest a szaharóz előkezelések után volt a nagyobb. Krioprotektív hatás optimumát mindkét cukoralkohol 0,75 M koncentrációban mutatta.


Mannit (M)

F. Kontr. 1. nap NF. Kontr. 15. nap

0,75 0,63 0,5

TTC-teszt időpontok a felolvasztás után

56

SZD 5 %

0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Szorbit (M)

F. Kontr. 1. nap

NF. Kontr. 0,75

15. nap

0,63 0,5

SZD 5 %


túlélés (%)

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

F. Kontr. 1. nap

Szaharóz (M)

NF. Kontr. 0,75

15. nap

0,63 0,5

SZD 5 %

0


túlélés (%)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

túlélés (%) 15. ábra. A cukor (szaharóz), cukoralkohol (mannit, szorbit) előkezelés hatása a fagyasztott MSCE/79 kukorica sejtek, felolvasztás utáni 1. és 15. napon mért TTC-teszttel meghatározott túlélésére. NF.Kontr.: nem fagyasztott kontroll; F.Kontr.: fagyasztott kontroll


57

3. táblázat. Az előkezelő táptalaj szaharóz, szorbit és mannit tartalmának hatása a kukorica (MSCE/79) sejtek frisstömeg gyarapodására a 3-6 hetes utótenyésztés között.

0.5 0.63 0,75 0.5 0.63 0.75 0.5 0.63 0.75

Mannit (M) Szorbit (M)

3. -1.8±4.8 2.6±6.3 3.9±2.7 1.7±1.6 6.2±7.2 8.5±9.5 4.8±3.2 14.4±4.3 4.5±4.2 -0.4±2.7 43±6.7

Frisstömeg változás (%) felolvasztás utáni hetek 4. 5. -1.3±4.7 -2,4±5.2 1.9±8.9 -1,9±4.3 2.5±3.3 7.2±4.8 4.4±4.8 6.9±6.3 8.5±7.2 8.5±5.6 15.3±11.7 24.8±9.2 8.7±2.7 15.3±4.8 27.9±3.2 42.2±7.5 9.0±5.3 17.7±4.0 -2.8±3.0 -3.7±2.1 89±5.2 150±6.6

6. -4.9±7.5 -5.7±4.9 11.7±8.7 7.1±9.8 8.5±7.2 35.2±10.0 20.2±6.3 61.8±10.1 24.5±8.6 -5.0±1.9 280±10.5

Szaharóz (M) F. Kontr. NF. Kontr. SZD 5% = 10.8 % A frisstömeg változási adatok kezelésenként 5 Petri csésze átlagát és szórást mutatják.

NF.Kontr.: nem fagyasztott kontroll; F.Kontr.: fagyasztott kontroll Szaharóz és cukoralkohol tartalmú táptalajon történő előtenyésztés számos növényfaj fagyasztás utáni túlélését javította (Withers 1992). Mannit előkezelés (0.33-0.5 M) hatására a paprika, juhar (Withers és Street 1977) rizs (Lynch et al. 1994) sejtszuszpenziós tenyészetekben és a szegfű hajtáscsúcsokban (Dereuddre és Tannaoury 1995) sikerült kriotoleranciát kialakítani. Szorbit és szaharóz (0.2-0.5 M) tartalmú táptalajon előtenyészetett hajtáscsúcsok és szomatikus embriók túlélték a vitrifikációs fagyasztást. Szaharóz, szorbit és mannit kezelések után fagyasztottak spárga hajtáscsúcsokat (Suzuki et al. 1997). A cukor típustól fűggetlenül a legnagyobb számú túlélő hajtáscsúcsot a 0.5 M koncentrációnál tapasztalták. Kísérleteinkben a 0.63 M mannit koncentráció az Arabidopsis thaliana mindhárom öktotípusa, ugyanilyen szaharóz koncentráció pedig a kukorica sejtek maximális kriotoleranciáját alakította ki. A cukoralkohol tartalmú előkezelések viszont 0.75 M koncentrációban javították a legjobban az MSCE/79 tenyészetek túlélést. A

cukrok

fagyásvédő

hatását

a

molekulák

ozmotikus

aktivitásával

magyarázzák. A kriogén hőmérsékletet túlélő juhar sejtekben bizonyították, hogy a mannit előkezelés csökkentette a sejtek és vakuólumok méretét (Pritchard et al. 1986).

Kísérleteinkben

a

szaharóz

előkezelés

a

mannit

és

szorbit


58

összehasonlításban szignifikánsan több túlélő sejtet eredményezett. A szaharózról ismert, hogy a növényi sejtekben más cukrokká metabolizálódik (Caboche 1987), a mannit és szorbit azonban nem. Ezért feltételezhető, hogy a cukor az ozmotikus hatáson túl más módon is hat. Kimutatták pl., hogy a szaharóz a kukorica sejtek membránjait a foszfolipidek poláros csoportjaihoz kapcsolódva stabilizálja (Leborgne et al. 1995) és csökkenti a membrán, oldatokra való átjárhatóságát (Bakaltcheva et al. 1994). Kísérleteinkben

az

Arabidopsis

sejtek

frisstömeg-változás

alapján

meghatározott túlélését a különböző időpontokban elvégzett TTC-teszttel kapott eredmények arányukban és tendenciájukban is követték. Az MSCE/79 kukorica sejtekben kimutatott TTC redukció mértéke azonban a felolvasztás utáni napok számának függvényében lényegesen változott. A sejtek 1. napon meghatározott TTC aktivitása a 15 napon mért érték 2-3 szorosa volt. A TTC-teszt használatával képződött formazán a szövetek légzésintenzitását, a folyamatban résztvevő redox enzimek működését jelzi. Fajtól és tenyészettől függően különböző időtartamú enzim aktivitás azonban elhalt szövetekben is kimutatható. A kukorica sejtek túlélésének meghatározására az 1. napon elvégzett TTC-teszt feltételezhetően a korai időzítés miatt túlértékelte az életképes sejtek arányát. A 15. napon kimutatott TTC redukció megbízhatóbban fejezte ki a túlélést, azonban a tömegméréssel kapott adatoknál kisebb arányban. Eredményeinkkel megegyezően a köles sejtek túlélését a TTCteszt hasonló arányban értékelte alul (Ganapragasam és Vasil 1992). A frisstömeg mérési periódus végére felszaporodott túlélő telepekből N6M folyékony

táptalajban

a

szuszpenziós

tenyészetet

újra

indítottuk,

illetve

hormonmentes szilárd N6M táptalajon növényregenerálási kísérletet állítottunk be. A visszanyert szuszpenziós tenyészetek négy – hetente elvégzett - passzálással a felolvasztás utáni 10. hétre az eredeti tenyészetre jellemző fenotípust vették fel (finom szuszpenzió méret, krémsárga szín). A cukor, cukoralkohol előkezelések nem befolyásolták a túlélő kolóniákból újra indított szuszpenziók szaporodási rátáját. A hetente passzált tenyészetek a 7. 8., 9., és 10 héten sorrendben 102, 103, 113 és 163 % tömeggyarapodást mutattak. Az ezt követő átoltások után szaporodási ütemük megegyezett az eredeti szuszpenzióra jellemző rátával (200-220% tömeggyarapodás/hét).

59


4.3.1. A krioprezerválás hatása a kukorica sejtek morfogenetikai képességre

Az MSCE/79 kukorica szuszpenzió tenyészet morfogén képességét 17 éve elvesztette. Az előző fejezetben ismertetett módon történt krioprezerválást követően azonban a hormonmentes N6M táptalajra oltott túlélő kolóniákon 4 hét tenyésztés után gyökérmerisztémák differenciálódtak és átlagosan 2-3 gyökér fejlődött 350400mg kalluszból. (16 ábra). Hasonló differenciálódást sem a kezelt, sem a kezeletlen nem fagyasztott kontrollokon nem tapasztaltunk. A gyökerek megjelenését nem befolyásolta az előkezelésben alkalmazott cukor, cukoralkohol típusa, vagy koncetrációja, a folyékony nitrogén - stressznek azonban döntő hatása volt (5. táblázat). 4. Táblázat. Gyökérdifferenciálódás az előkezelt-nem krioprezervált (LN-) és előkezelt-krioprezervált (LN+) MSCE/79 kalluszokon 4 hetes növényregeneráló táptalajon való tenyésztés után.

Szorbit (M) Szaharóz (M)

gyökeret fejlesztő kalluszok (%) FN FN + 0 8.0±2.0 0 10.3±11.8 0 9.8±0.6 0 7.7±1.4

0.75 0.5 0.63 0.75

SZD 5% 2.1 % Az adatok 5 Petri csésze (20 db kallusz/ Petri csésze) átlagát és szórását mutatják. (A 80-100 mg tömegű túlélő kalluszok az értékelés időpontjára 350-400 mg frisstömeget értek el.) Többen megfigyelték az explantumok embriógén képességének visszaállását különböző előkezelések után. A táptalaj megnövelt ionos: nátrium (Binh és Heszky 1990), foszfor (Gyulai et al. 1992) és ozmotikus: mannit, agar (Jain et al. 1996) koncentrációjának

hatására

nőtt

a

regeneránsok

száma.

A

kezelések

valószínűsíthető közös hatása a sejtek dehidratációja. Rizs szomatikus embrió tenyészetek differenciálódása szárítással fokozódott (Tshukahara és Hirosawa 1992). Kukorica sejtek szomatikus embriógenezisében bizonyították a dehidratáció hatására megnövekvő ABS és prolin tartalmat, aminek feltételezhetően az embriógenezis szabályozásában van szerepe (Emons et al. 1993). Bebizonyosodott, hogy a különféle környezeti stressz hatások indukálják a sejtekben az embriogenezis programját (Dudits et al. 1991). Ezek közt a krioprezerválás feltehetően a lassú

60


előfagyasztás szárító hatásán keresztül aktiválhatja az ontogenezist. Szójában az éretlen hüvelyek folyékony nitrogénbe merítésével az embriogén kalluszindukció fokozódását figyelték meg (Li et al. 1985). Kísérleteinkben az MSCE/79 kukorica sejtekből ugyan nem tudtunk növényeket regenerálni, de részben sikerült az ontogenezis folyamatát beindítani a sejtek gyökér regenerációs képességének reaktiválásával. A morfogenezis alternatív útjainak pontos tisztázása, - a gyökér, esetleg hajtásprimordium differenciálódási és fejlődési folyamatainak pontosításához további részben külső alaktani (SEM), részben belső alaktani (metszet) vizsgálatokat igényel.

61


16.ábra. A gyökér morfogenetikai képességének reaktivációja fagyasztott MSCE/79 kukorica sejtekben. Embriógén képességét 17 éve vesztett MSCE/79 szuszpenzió (szakasz=10mm A). A krémsárga túlélő sejtek megjelenése a világos barna kolóniákon

felolvasztás

után

3

héttel

(szakasz=5mm

B).

Sokszorozódó

sejtaggregátumok regeneráló táptalajon (szakasz=2mm C). Gyökér merisztéma differenciálódás 2 héttel, (szakasz=10mm D), elsődleges gyökerek (szakasz= 5mm, E) és valsószínűleg abnormális hajtás (F) tenyésztés után.

4 héttel a regeneráló táptalajon való

62


4.3.2. Az afp transzformáció hatása a transzgénikus kukorica sejtek túlélésére A kísérlet elvégzésével arra kívántunk választ kapni, hogy az afp gén transzformációval javítható –e a kukorica sejtek kriotoleranciája. A kísérletet sarkköri halakból származó afp I. típusú fagyásvédő fehérjét termelő transzgénikus kukorica sejtszuszpenziókkal állítottuk be. A protoplaszt transzformációt Dudits Dénes csoportja végezte Szegeden. A négy különböző transzformációból származó transzgénikus klón (afp 23, afp 24, afp 37, afp 44) és a kontroll sejtvonal (vad típus Æ), fagyasztására az MSCE/79 sejtek krioprezerválása során eredményesnek bizonyult módszert alkalmaztuk. A 4 nap időtartamú abszcizinsav (0.75 - 75.0 µM), szaharóz és cukoralkohol (0.5-0.75 M) előkezelés után fagyasztás előtt jégfürdőben egy órán át 1 % prolinnal kiegészített WK krioprotektáns oldatban inkubált sejteket lassú előfagyasztás után helyzetük FN-be (1 °C/perc, -35 °C-ig, majd 40 perc után FN-be merítés). A sejtek túlélését TTC-teszttel és frisstömeg változással határoztuk meg. A kísérletekhez három kontroll típust használtunk. Az F. Kontroll (fagyasztott kontroll) sejtjeit előkezelés (ABS, szaharóz, cukoralkohol) és WK kiegészítés nélkül csak a folyékony kultúrtáptalajban fagyasztottuk. Az előkezelések kontrolljait (0 M ABS, szaharóz, cukoralkohol) WK kiegészítéssel fagyasztottuk a folyékony táptalajban. Az NF. Kontroll (nem fagyasztott kontroll) tenyészeteit fagyasztás, előkezelés és WK kiegészítés nélkül a tenyésztő táptalajból a fagyasztott tenyészetek felolvasztásával egyidőben szilárd táptalajra helyeztük. A transzformáns klónok kezeletlen, nem fagyasztott kontrolljaiban is (NF Kontr.) a TTC-teszttel rendkívül alacsony szintű TTC aktivitást lehetett kimutatni (17. ábra). A nem fagyasztott 23-as, 24-es, 37-es és 44-es klónok TTC redukciójának mértéke az MSCE/79

OD

490 nm-en mért 0.980 abszorbciójának egy ötöde (0.230,

0.209, 0.190, 0.171) volt. A nem fagyasztott vad típusú kontroll (Æ,) sejtvonal TTC redukciója (OD 490 nm-en 0.58) is szignifikánsan meghaladta a transzgénikus klónokban meghatározott értékeket. A krioprezervált-felolvasztott tenyészetekben a TTC-teszt alacsony túlélést és a kezelések között kis különbséget mutatott ki, ugyanakkor a szilárd táptalajra oltott kolóniák folytatták növekedésüket. A TTC-teszt az

afp

transzgénikus

kukorica

sejtek

életképességének

meghatározására

alkalmatlan volt, ezért a tenyészetek túlélését a frisstömeg-változás alapján határoztuk meg.


63

nm+ 1 0,9 0,8

SZD 5 %

OD. 490 nm

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 23

24

37

44

vad típus

MSCE/79

kukorica sejt vonalak 17. ábra A nem fagyasztott afp transzgénikus (23,24,37,44) és kontroll vad típusú kukorica tenyészetek TTC – teszttel meghatározott életképessége. A felolvasztott, szilárd táptalajra passzált, szuszpenzióban világos sárga transzgénikus sejtek 2-3 nap után jellegzetes okkersárga színűekké váltak, vagy kifehérdtek (18. ábra). A nem fagyasztott kontrollok színe a szilárd táptalajon való tenyésztés hatására nem változott. A túlélő sejtek a fehér és okkersárga színű kolóniákon is megjelentek. A tömegváltozást az utótenyésztés 6. hetében határoztuk meg. A csak folyékony táptalajban, WK krioprotektáns oldat nélkül fagyasztott (Fagyasztott. Kontr.), illetve az ABS, szaharóz, cukoralkohol előkezelés nélkül (0 M), csak WK oldatban fagyasztott transzformált klónok - a vad típushoz (Æ) hasonlóan nem élték túl a kriogén hőmérsékletet. Az előkezelések közül az ABS tartalmú előtenyésztés után nem találtunk túlélő sejteket (nincs bemutatva). A szaharóz és cukoralkohol előkezelések életképes sejteket eredményeztek minden transzgénikus klónban (6. táblázat), a vad típusú sejtvonalak túlélése azonban - a 0.5 M mannit kivételével- nem javult. Az afp 44-es klón legnagyobb frisstömeg növekedését a szaharóz, szorbit és a mannit 0.63 M koncentrációja eredményezte. Az afp 24-es sejtek túlélésének lényeges javulást figyeltük meg 0.75 M szaharóz és mannit előkezelés után is. Az afp 24-es transzgénikus klónban a szaharóz és a szorbit 0.63 és 0.75 M, valamint a mannit 0.5 és 0.75 M koncentrációi szintén nagy arányú túlélést eredményeztek. Az 37-és tenyészetek 0.75 M szaharóz és 0.63 M szorbit, a 23-as klónok pedig a 0.5 és 0.75 M mannit tartalmú táptalajon való előtenyésztés után maradtak életképesek a legnagyobb mértékben.

64


6. táblázat. Az afp transzformáció hatása a kukorica sejtek frisstömeg-változással meghatározott túlélésére szaharóz, szorbit és mannit előtenyésztés után

23 98±5.6

Nem Fagyasztott Kontr. Fagyasztott Kontr.

-5±2.5 -4±3.1 -8±1.5 -10±1.7 -3±1.8 -4±2.5 -5±3.2 -1±2.7 -7±3.1 -5±3.4 77±6.1 4±3.2 50±5.6

Frisstömeg-változás (%) Transzgénikus vonalak 24 37 44 150±7.2 120±4.3 135±9.8 -3±3.2 -4±2.8 -23±3.5 58±7.8 174±21.6 -3±1.6 2±2.9 97±5.4 45±2.4 -2±1.9 90±17.5 0±3.0 123±30.4

-6±.1.9 -5±4.9 -4±3.4 -2±2.5 93±3.8 -4±3.1 -4±4.9 94±5.2 -5±5.3 -4±2.7 3±2.3 6±2.0 -1±5.6

-4±3.9 -6±3.5 84±2.9 160±31.0 65±9.6 -5±1.1 13±3.6 28±2.6 11±6.2 -6±3.5 51±16.5 130±23.4 94±7.2

Æ 102±6.5 -7±4.8 -5±3.5 -7±3.3 -8±5.8 -4±4.0 - 3±2.7 2±5.8 -3±5.3 -1±4.2 -5±0.6 34±17.0 -3±2.3 -4±4.3

0 Szaha0.5 róz (M) 0.63 0.75 0 Szor0.5 bit (M) 0.63 0.75 0 Man0.5 nit (M) 0.63 0.75 SZD 5% = 15.2 % A frisstömeg-változás %-os értékei a felolvasztás utáni 6. héten mért tömegváltozást fejezik ki, kezelésenként 5 Petri csésze átlagából számolva ± szórás.

A fagyásvédő polipeptidek krioprotektív hatása a fagyáspont csökkentéssel, illetve jég átkristályosodásának gátlásával magyarázható (2. fejezet.). Az AFP mindkét

hatása

a

sejtes

rendszerek

megnövekedett

kriotoleranciáját

eredményezheti. A fagyáspontcsökkentés hatására a jégképződés kritikus pontjai a Tm és Th alacsonyabb hőmérsékleten következnek be, a sejt rövid idő alatt jut túl a veszélyes kristályos szerkezeten az amorf fázisba (Tg). A fagyásvédő polipeptidek krioprotektánsként való használatával elért eredmények azonban nem egyértelműek. A vörös vértestek krioprezerválása során az AFP sikeres és sikertelen (Hansen et al. 1993) alkalmazásáról is beszámoltak. Az AFP következetlen fagyásvédő hatását a fehérje molekula méretével magyarázzák. A leggyakrabban használt AFP I. típus, relatív nagy molekulatömege miatt, feltételezhetően nem jut be az intracelluláris térbe, emiatt hatását csak a sejtközötti járatok oldatában fejti ki. A fagyásvédő polipeptidet szintetizáló transzformánsokban azonban ez a probléma nem jelentkezik. Az afp transzgénikus dohányban - hideg előkezelés után - jelentős hipoterm fagytűrő képesség alakult ki (Kenward et al.

65


1993). A fagyásvédő fehérjék hidegedzés hatására történő akkumulációját poszttranszkripcionális

szabályozási

mechnaizmusokkal

magyarázzák.

Az

afp

transzgénikus explantumok kriogén hőmlérsékleti toleranciájáról azonban nincs ismert irodalmi forrás. Kísérleteinkben a fagyasztott kontroll sejtek a felolvasztás után elpusztultak. A cukor, cukoralkohol előkezelés után krioprezervált transzformált sejtvonalak - a nem transzformált kontrollhoz képest - nagyarányú túlélést mutattak. A szénhidrát tartalmú előkezelések - az ozmotikus nyomás mérsékelt növelésével - hatásukban azonosak a hideg előkezeléssel (2. fejezet). Feltételezésünk szerint az AFP a cukor előkezelés hatására, poszt-traszkripciós foszforiláláson keresztül aktiválódott. Következésképpen a transzgénikus vonalakban meghatározott, - a vad típusnál lényegesen nagyobb - túlélési ráta az AFP krioprotektív hatásával magyarázható. Az a megfigyelés, hogy az ABS előkezelés egy transzgénikus vonalban sem alakított ki kriotoleranciát valószínűsíti, hogy ezekben a kukorica sejtekben is a szignál transzdukció az abszcizinsavtól független alternatív utat követ.

66


18. ábra. Az afp transzgénikus, krioprezervált kukorica sejtek regenerációja. Fagyasztás után sárguló (a, b-felső) és kifehéredő (a, b-alsó) afp 44-es klón. A fehér telepeken megjelenő túlélő sejtek (c) és teljes regenerálódásuk (d). Túlélő kalluszok növényregeneráló táptalajon: nem fagyasztott (e-bal) fagyasztott (e-jobb). A krioprezervált afp 44-es klón szomatikus embriógenezise (f), gyökér (g), hajtás (h) és léggyökér (j) regeneráció.


67

Az előzőekben ismertetett, a mannit előkezelés után krioprezervált, túlélő 24 és 44-es klónok kolóniáin 3% mannitot tartalmazó hormonmentes szilárd N6H táptalajon, a felolvasztás utáni 10. héten intenzív hajtás differenciálódást figyeltünk meg. Azonos előkezelés után, a nem fagyasztott kontrollokon, azonban ebben az időpontban csak kis számú hajtás regenerálódott (19. ábra) és a regeneráló kalluszok aránya később sem érte el a krioprezervált kolóniák gyakoriságát. A legtöbb differenciálódó sejtaggregátumot az afp 24-es klónban, a 0.5 M mannit előkezelés után kaptuk. Az afp 44-es vonalban, a különböző mannit

Hajtást differenciáló kalluszok (%)

koncentrációk szignifikáns különbségeket nem eredményeztek.

60

SZD

50

5%

40 30 20 10 FN +

0 0,5M 24

0,5M 44

0,63M 44

FN 0,75M 23

0,75M 24

0,75M 44

mannit koncentráció transzgénikus klón

Mannit koncentráció-transzgénikus vonal

19. ábra. A hajtást regeneráló kalluszok aránya mannit előkezelés után, a krioprezervált (FN+) és a nem fagyasztott (FN-) tenyészetekben.

68

KÖVETKEZTETÉSEK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

5. KÖVETKEZETETÉSEK, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA A krioprezerválható növényfajok körének bővítése A disszertációban a sziki és közönséges mézpázsit (Puccinellia distans (L.) Parl, Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg.); a lúdfű (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) C 24, LER és WS ökotípusai; a kukorica (Zea mays L.) MSCE/79 vonala és afp transzgénikus 23, 24, 37, 44 geno- és vad típusa sejtszuszpenziós, továbbá a vadgesztenye (Aesculus hippocastanum L.) és az egylaki kivi (Actinidia deliciosa A. Chev) szomatikus embrió tenyészeteit krioprezerváltam. A mézpázsitok fajainak fagyasztására nincs irodalmi utalás. Az Arabidopsis ökotípusok

közül

csak

a

WS

protoplasztjainak

lassú

előhűtésen

alapuló

krioprezervációját ismertették (Ford 1990). A vadgesztenye zigótikus embriókban (Jörgensen 1990) és a kivi szárszegmentekben (Jian és Sun 1989) szintén a lassú fagyasztással kaptak túlélő explantumokat. A kukorica pollen krioprezervációs tehnikáját kidolgozták (Barnabás 1994). Szomatikus sejt és kallusz tenyészeteik lassú fagyasztásáról beszámoltak (Withers és King 1979, Sun és Jian 1989), nincs azonban ismert közlemény sem kukoricában, sem más fajban, ami az afp transzgénikus vonalak krioprezervációját mutatná be. A krioprezerválás új elméleti és gyakorlati eredményei A kísérletek során a kriogén hőmérsékleti tartomány túlélését befolyásoló kezelések hatását elemeztem. A kriotolerancia létrehozásában döntő hatású, védő dehidratációt és membrán stabilizálást a lassú előhűtéssel (1); abszcizinsav kezelésekkel kombinált szárítással, hősokkal, és vitrifikációval (2); továbbá fagyásvédő szénhidrátokkal (3) ( szaharóz, szorbit, mannit) alakítottam ki. (1) A lassú előhűtésen alapuló fagyasztási program szerepét a protektív dehidratáció kialakításában a halofita mézpázsitok sejtszuszpenziós tenyészeteinek krioprezerválásával

bizonyítottam.

A

fagyasztási

sebességek,

transzfer

hőmérsékletek és transzfer hőmérsékleti tartási periódusok lépésről lépésre történő optimalizálásával

meghatároztam

a

P.

distans

sejtek

maximális

túlélését

eredményező kezeléskombinációt. Az 1°C/perc sebességgel -40 °C-ra hűtött és 30 perc után a folyékony nitrogénbe merített tenyészetek felolvasztás után 78%-ban életképesek maradtak.

69

A

transzfer

hőmérsékletek

és


tartási

időtartamok

kölcsönhatásának

vizsgálatában bebizonyítottam, hogy magasabb transzfer hőmérsékleten hosszabb tartási periódus után krioprezervált tenyészetek túlélése, azonos szintű az alacsonyabb áthelyezési hőmérsékletről rövidebb tartás után folyékony nitrogénbe merített tenyészetek túlélésével. Feltételezhető, hogy a fenti transzfer hőmérséklet és tartási periódus kombinációk a szövetek hasonló hidratáltságát okozva eredményezték az azonos túlélést. A közönséges mézpázsit sejtek azonban vegyszeres fagyásvédő kezelések nélkül is jelentős kriotoleranciát mutattak, ami a fagy- és sótűrés feltételezhetően hasonló genetikai szabályozottságát támasztja alá. (2)

Az

ABS,

ABS-prolin,

ABS-cukor,

ABS-deszikkáció,

ABS-hősokk

kombinációk hatását a vadgesztenye szomatikus embriók és az MSCE/79 kukorica sejtvonal, az ABS-vitrifikációs kezelések hatását a kivi szomatikus embriók krioprezerválása során elemeztem. (2/a) A vadgesztenye embriókban önmagában alkalmazott abszizinsav kezeléssel csak a lassú fagyasztási sebesség használatával lehetet jelentős kriotoleranciát kialakítani. A 0.75 µM ABS tartalmú táptalajon 4 napig tenyészetett, majd WK krioprotektáns oldatban 1 °C/perc sebességgel -35 °C-ra fagyasztott és 40 perc után a folyékony nitrogénbe merített embriók 59 %-a maradt életképes. Az ABS krioprotektív hatását a cukor és prolin kombinációk -más fajokban pl. kakaófában javították-, kísérleteim alapján azonban a vadgesztenyében csökkentették. A krioprezervált embriókban, az abszcizinsav lassú fagyasztással kombinálva, feltételezhetően a védő stresszproteinek indukciójával okozott fagyvédelmet. Ebből arra lehet következtetni, hogy a vadgesztenyében a fizikai stresszjelzések biokémiai reakciókká alakítása az ABS függő jelátviteli utakon történik. Az abszcizinsav hatására a melegigényes kukorica sejtek kriotoleranciája csak mérsékelten nőtt. Irodalmi adatok alapján azonban a kukoricában prolinnal valószínűleg abszcizinsavtól független alternatív utakon keresztül - krioprotekció alakítható ki. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy a növényfajok eltérő fagytűrése az ABS-függő és független jelátviteli utakkal van összefüggésben. (2/b) Az ABS-deszikkáció kezeléskombinációkban, a szárítással helyettesíteni lehetett a lassú fagyasztás vízelvonó hatását. A 0.75 µM abszcizinsavat tartalmazó táptalajon előtenyésztett vadgesztenye szomatikus embriók lamináris fülkében történő, 4 óra időtartamú szárítása után, a szobahőmérsékletről - WK krioprotektáns nélkül – FN-be helyezett tenyészetekben kialakult kriotolerancia a lassú fagyasztás után megfigyelt értékkel azonos szintű volt. A 4 órás szárítással kialakult

70


dehidratációs szintre (a frisstömeg 87%-os csökkenésére) volt szükség a fagyasztás utáni maximális túléléshez, ami azonban a nem fagyasztott kontroll tenyészetek életképességét szignifikánsan csökkentette. Az eredmények alapján az ABS előkezelések hatása a szárításos krioprezervációs tehnikában a deszikkációval szembeni tolerancia fokozásával magyarázható. (2/c) A 0.75 µM ABS tartalmú táptalajon előtenyésztett vadgesztenye szomatikus embriókban és az MSCE/79 kukoricasejtekben bizonyítottam a hősokk kezelések krioprotektív hatását. A vadgesztenye embriók fagyasztás előtti 60 perces 40 °C-os inkubációja a lassú fagyasztással 83%, a gyors fagyasztással

75 %

túlélést eredményezett. A 60 perces hősokk kezelés után a kísérletben - az ABS kezelésre egyébként kevésbé érzékeny - kukoricasejtek túlélése is jelentősen nőtt (lassú fagyasztással 52%, gyors fagyasztással 20%). Ez valószínűsíti, hogy az abszcizinsav és a hősokk kezelések más védelmi mechanizmusokon keresztül hatnak. A hősokk hatására termelődő HSP molekulákkal közvetlenül krioprotekció alakítható

ki.

géntermékekkel,

Ellentétben amelyek

a

más

hatása

környezeti elsősorban

sztresszekre a

expresszálódó

közvetett,

helyreállító

mechanizmusok indukciójával magyarázható. Feltételezhető, hogy a hősokk hatásra megjelenő túlélő explantumokban, a HS fehérjék - a fagyás során sérült proteinek reaktiválásával - növelik az tenyészetek túlélését. (2/d) Az ABS előkezelés-alginát gél kapszulázás-PVS-2 vitrifikáló oldat kezelés kombináció krioprotektív hatását, a gyorsan fagyasztott kivi szomatikus embriókon bizonyítottam. A 0.75 µM ABS tartalmú előkezelés után alginát burokba kapszulázott és 0 °C-on 50 percig PVS-2 vitrifikáló oldatban inkubált kivi szikleveles embriók 31 %-ban élték túl a kriogén hőmérsékleti tartományt. A vitrifikációs technikában embriogenezisüket folytató embriókat, csak az ABS előkezeléskapszulázás kombináció eredményezett, feltehetően az embriók PVS-2 oldattal szembeni toleranciájának fokozásával. (3) A C24, LER és WS Arabidopsis ökotípusok, az MSCE /79, és az afp transzgénikus kukorica sejtszuszpenziós tenyészetek krioprezervációja során a cukor, cukoralkohol előkezelések hatását elemeztem. (3/a) Az Arabidopsis 3 ökotípusa szuszpenzióiban mannit, az MSCE/79 és afp transzgénikus kukorica szuszpenziókban pedig szorbit, mannit és szaharóz előkezeléssel alakítottam ki a krioprotekciót a lassú előhűtéssel fagyasztott tenyészetekben. Mindhárom lúdfű típusban a mannit 0.63 M koncentrációja

71


eredményezte a legtöbb életképes sejtet (C24-98%, LER-62%, WS-89% 3. heti frisstömeg gyarapodás). A szénhidrátok az MSCE/79 sejtek túlélésre gyakorolt hatásában a 0.63 M szaharóz >0.75 M szorbit > 0.75 M mannit sorrendet határoztam meg. A nem metabolizálódó cukoralkoholok krioprotektív hatása ozmotikus aktivitásukkal magyarázható. A túlélés meghatározója elsősorban a cukoralkohol moláris koncentrációja és nem a típusa. Az MSCE/79 sejtekben legnagyobb túlélést adó szaharóz azonban - ozmotikus hatása mellett - az anyagcserefolyamatokban is résztvesz. Feltételezett hatása a membrán stabilizálás, illetve - a membrán lipidekkel történő interakcióban - a membrán oldatspecifikus átjárhatóságának csökkentése. (3/b) Az afp transzgénikus kukorica vonalak közül a 44-es és 24-es klónokban felolvasztás után intenzív tömeggyarapodást mértünk de a szénhidrátok típusában nem lehetett egyértelmű sorrendet felállítani. Az afp transzgénikus kukorica sejtek fagyasztás utáni nagy túlélési rátája feltételezhetően a szénhidrát előkezelés, - hideg akklimatizációhoz hasonló - víztartalom csökkentő hatásával magyarázható. A felolvasztás után különböző időpontokban végzett TTC-teszt a frisstömeg változással azonos szintű és tendenciájú túlélést mutatott az Arabidopsis sejtekben. A kukoricában azonban az 1. és 15. napon meghatározott TTC redukció mértéke jelentős eltéréseket eredményezett. Feltételezhető, hogy a felolvasztás utáni 1. napon még az elhaló sejtek légzése is mérhető, ezért az MSCE/79 sejttenyészetek túlélése a 15. napon végzett TTC-teszttel megbízhatóbban mutatható ki. Az afp transzgénikus kukorica vonalak rendkívül alacsony TTC aktivitásának magyarázata további a vizsgálatok folytatását igényli. Az

MSCE/79

kukorica

szuszpenziós

tenyészet

sejtjei,

embrió-

és

morfogenetikai képességüket 17 éve elveszítették. A krioprezerválás után azonban a tenyészet sejtjeiben gyökér regenerációt figyeltem meg, míg az azonos szénhidrát tartalmú táptalajon előkezelt nem fagyasztott sejtek nem mutatták ezt a képességet. Megnövelt elektrolit, illetve ozmotikus nyomású közegben fenntartott sejtekben bizonyították az embriógén képesség visszaállíthatóságát. Feltételezhető, hogy a krioprezerváció

-

a

lassú

előhűtés

fázisában

kialakuló

dehidratált

állapot

eredményeként cukor, cukoralkohol kezelés kombinációkban - reaktiválta a sejtek morfogenetikai képességét. Ehhez hasonló jelenséget figyeltem meg az afp transzgénikus kukorica sejtekben, ahol a nem fagyasztott kontrollhoz képest a fagyasztott túlélő kolóniák intenzívebb növényregenerálást mutattak.

72

ABSTRACT

6. ABSTRACT In present theses saltmarsh-grass (Puccinellia sp), Arabidopsis (Arabidopsis tahiliana) (3 ecotypes), corn (Zea mays - MSCE/79 and afp transgenic lines) cell suspension, and

horse-chestnut (Aesculus hippocastanum) and kiwifruit (Actinidia

delitiosa) somatic embryo cultures were cryopreserved. These are the first published results on the cryopreservation of Puccinellia species, C24 and LER Arabidopsis ecotypes and also the first report on the cryopreservation of transgenic cells synthesising the antifreeze protein (AFP). The cryogenic treatments were approached and analysed from the development of protective dehydration and the stabilisation of plasma membrane. The interaction of the elements of freezing program (1) and the effects of abscisic acid (ABA), ABA-combinations (ABA-sucrose, ABA-proline, ABA-desiccation and ABA-heat shock and ABA-vitrification solution-alginate bed) (2), sugar, sugar alcohol pretreatments and the afp-transformation (3) were studied. (1) The role of freezing program in the acquisition of protective dehydration was proved with the cryopreservation of Puccinellia sp. cells. The interaction of the freezing rates, and holding time periods were studied as the function of transfer temperatures. A "step by step" method was developed for the optimisation of the critical points of the freezing program. The maximum survival rate was (78 %) found among cells frozen in 12.5% of dimethil sulfoxide (DMSO) with a freezing rate of 1C/min till -40C, than plunged into liquid nitrogen after 30 min holding. It was evidenced however, that at lower transfer temperatures in combination with shorter holding time periods result in the same survival as higher transfer temperature with longer holding time, suggesting the importance of cell dehydration in the survival. Puccinellia species are naturally salt-tolerant grasses. A close correlation between salt and freeze tolerance has been supposed. Here this feature has been extended to a new crop, reflecting a common control mechanism of freeze and salt tolerance. (2) The effect of ABA and ABA combination were analysed on horse chestnut somatic embryos and maize cell suspensions. The 0.75 µM of ABA treatment in combination with 3% of sucrose resulted in high number (59%) of surviving horsechestnut embryos, when frozen slowly with 1C/min till -35 C, than after 40 min holding plunging them into LN. The viability did not increase either with 21 % of sucrose or 5% of proline ABA combinations. ABA treatments had only slight effect on

73

ABSTRACT

the improvement of survival rate of maize cell suspensions. Horse-chestnut plants in vivo show much higher ability for the toleranceof low temperature than maize. Horsechestnut embryos are responsive to ABA treatments, but maize cells show only limited freeze tolerance on the effect of ABA. It could be supposed, that in horsechestnut the signal transduction follows an ABA dependent pathways, while in maize not. This suggests, that the freeze tolerant characters of plants are connected to an altering proportion of the ABA dependent and independent signal transduction pathways. The effect of ABA-desiccation combination was analysed in the horsechestnut embryos. Embryos pre-treated on medium containing ABA (0.75 µM), and desiccated in a laminar hood for 4 h, than immersed in liquid nitrogen (i.e. frozen quickly) showed as high survival rate (60 %) as were found among non-desiccated embryos with slow freezing regime. A 87% reduction in the initial water content of the embryos was necessary for the elevated survival. The ABA treatments did not result changes in the water content, but increased the desiccation tolerance of the embryos. The ABA-heat shock treatments were studied on horse-chestnut somatic embryos and maize cell suspension. The TTC reduction of the horse-chestnut embryos after 0.75 µM ABA pre-treatment and heat shocked for 60 min, 2 hours before freezing was as high as 83% and 75 % in slow and fast freezing respectively. The observation, that similarly long heat shock treatment increased the viability of maize cells also, - which are non responsive to ABA – suggest, that freezing tolerance raised by abscisic acid and heat shock are controlled different ways. The heat shock induced cryoprotection could be explained with the restoring function of HSPs. The role of HSPs probably is the renaturation of proteins, having been denaturated through the freezing process. The effect of ABA treatments and encapsulation-vitrification freezing were analysed in kiwi somatic embryos. The toxicity of the highly concentrated PVS-2 vitrification solution was reduced with the synergism effect of ABA and alginate beds. Embryos survived the vitrification procedure only when preconditioned on medium containing 0.75 µM of ABA and encapsulated into alginate gel. An exposure of 50 min in PVS-2 solution at 0 C, resulted in maximum survival rate of 31%. The vitrified-cryopreserved embryos developed into properly differentiated plants. After ABA-desiccation, ABA-heat shock and ABA-encapsulation-vitrification treatment combinations explants survived the fast freezing method, which is much

74

ABSTRACT

easy to carry on, compared to slow freezing. These treatments could substitute the use of the expensive programmable biological freezer, therefore allow a wider application of cryopreservation. In freezing experiments of Arabidopsis thaliana and Zea mays cell suspensions the effect of sugar and sugar alcohol treatments were studied. The 0.63 M of mannitol perculture resulted in the maximum TTC reduction and fresh weight increase in all of the tested Arabidoposis ecotypes, frozen slowly. In the preteratment phase of MSCE/79 maize cells, the cryoprotective effect of mannitol, sorbitol and sucrose was tested. In comparison of these carbohydrates an efficiency row of sucrose (0.63 M), >sorbitol (0.75 M) > mannitol (0.75 M) was determined. Sugar alcohols are functioning probably mainly as osmoprotectants, while the metabolising sucrose can interact with membrane polar groups of phospholipids, thus stabilising the membrane structure by the reduction of solute permeability, resulting in an increase of freeze tolerance. In analysing the effect of afp transformation, four afp transgenic and the wild type maize cells were preconditioned on medium containing mannitol, sorbitol and sucrose and frozen slowly. Transgenic lines of afp 44 and afp 24 exhibited intensive fresh weight increase, while the wide type showed low level of survival. The carbohydrate preculture was necessary for the appearance of survival cell, but there were not found clear correlation between survival and type of carbohydrates. This suggests, that primary role of sugars in acquisition of cryotolerance in afp transgenic maize is probably the activation of AFPs through post-transcriptional regulation. In these experiments the survival rate was determined by TTC assay and by regrowth potential. Survival rate determined by TTC test in Arabidopsis cells followed the data expressed by fresh weight changes, independently of timing of measurement. However for maize cells the TTC activity varied as the test was carried out on the 1st or 15th day of regrowth. Data from 15th day application was more reliable than the 1st day timing. The frozen MSCE/79 cell suspension lost its embryogenic character over a 17 year of in vitro culture. The cryopreservation however restored the root morphogenic competence in this cells, while after the same pretreatments in the nonfrozen control there were no root formation observed. Significant differences were found in the frequency of somatic embryogenesis in afp transgenic cells also. Cryopreserved cells exhibited more intensive plant regeneration compared to nonfrozen cells. This suggest that cryopreservation might has a key role in controlling embryo

75

developmental program.

ABSTRACT

76

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton mondok köszönetet Prof. Dr. Heszky László tanszékvezető egyetemi tanárnak a témáért és a sokoldalú témavezetésért. Dr. Kiss Erzsébet egyetemi tanárnak és Dr. Gyulai Gábor habilitált egyetemi docensnek egy-egy probléma megoldásában nyújtott segítségét és a dolgozat kritikus bírálatát, Kiss József tudományos munkatársnak a számítógépes tanácsokat és a rendelkezésemre bocsátott vadgesztenye rendszert köszönöm. Prof. Dr. Bálint Andor egyetemi tanárnak, Dr. Hajós Lászlóné habilitált egyetemi docensnek, Mázikné Dr. Tőkei Katalin egyetemi adjunktusnak, Dr. Geczki István , Dr. Do Quang Binh és Dr. Abdel Hamid Ali, a tanszék korábbi tudományos munkatársainak kutatói együttműködésüket köszönöm. Köszönettel tartozom Dr. E.C. Cocking professzornak (Nottinghami Egyetem), amiért csoportjában dolgozva az Arabidospsis tenyésztetek krioprezervációján dolgozhattam, Dr. Mórocz Sándornak az MSCE/79 sejt vonalért és Prof. Dudits Dénesnek az afp transzgénikus kukorica klónokért és az OTKA együttműködésért. Pongrácz Sándorné, Ádám Zoltánné és Katona Katalin közvetlen munkatársaimnak, továbbá Bakos Györgyné és Horváth Péterné tanszéki kollégáknak a kiváló technikai asszisztenciát, Dr. Bellus Zoltánnénak és Zámbó Lászlónénak az adminisztrativ ügyintézést köszönöm. Köszönettel tartozom volt hallgatóimnak Dr. Mozsár Józsefnek, Bradly Rauh-nak, Zalai Ferencnek, Kovács Domonkosnak, Barócsi Zsoltnak, Pók Istvánnak, Nagy Andrásnak inspiráló érdeklődésükért és aktív együttműködésükért. A kísérleteket mindvégig OTKA támogatással végeztük (OTKA 880, 1571, T016366) amít ezúton is megköszönök.

77

IRODALOM

7. IRODALOM Abdelnour-Esquivel A., Mora A., Villalobos V. (1992a) Cryopreservation of zygotic embryos of Musa acuminata (AA) and M. balbasiana (BB). Cryo. Lett. 13: 159-164. Abdelnour-Esquivel A., Villabos I.V., Engelmann F. (1992b) Cryopreservation of zygotic embryos of Coffea spp. Cryo. Lett. 13: 297-302. Abdullah R., Thompson J.A., Cocking E.C. (1986) Efficient plant regeneration from rice protoplasts through somatic embryogenesis. Bio/tehnology. 4: 1087-1090. Abe T., Futsuhara Y. (1986) Genotypic variability for callus formation and plant regeneration in rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 4: 3-10. Aitken A., Collinge D.B., van Heusden B.P.H., Isobe T., Roseboom P.H., Rosenfeld G., Soll G. (1992) 14-3-3 proteins: a highly conserved, widespread family of eucariotic proteins. Trends. Biochem. Sci. 17: 498-501. Almogurea C. and Jordano J. (1992) Developmental and environmental concurrent expression of sunflower dry-seed-stored low-molecular heat-shock protein and LEA mRNAs. Plant. Mol. Biol. 19: 781-782. Andarajah K., Kott K., Beversdorf W.D. Mc Kersie B.D. (1991) Induction of desiccation tolerance in microspore-derived embryos of Brassica napus (L.) by thermal stress. Plant Sci. 77: 119-123. Arora R., Wisniewski M.E. (1995) Ultrastructural and protein changes in cell suspension cultures of peach associated with low temperature-induced cold acclimatisation on and abscisic acid treatment. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 40: 17-24. Assy-Bah B., Engelmann F. (1992) Cryopreservation of mature embryos of coconut (Cocos nucifera L.) and subsequent regeneration of plantlets. Cryo. Lett. 13: 117126. Bagniol S, Engelmann F. (1992) Effect of thawing and recovery conditions on the regrowth of meristems of date palm (Phoenix dactilifera L.) after cryopreservation in liquid nitrogen. Cryo. Lett. 13: 253-260. Bajaj Y.P.S. (1977a) Clonal multiplication and cryopreservation of cassava through tissue culture . Crop Improv. 4: 198-200. Bajaj Y.P.S. (1977b) Initiation of shoot and callus from potato tuber sprouts and axillary buds frozen at -196 °C. Crop Improv. 4: 48-53.

78

IRODALOM

Bajaj Y.P.S. (1979) Freeze preservation of meristems of Arachis hypogaea and Cicer arientium. Indian J. Exp. Biol. 17: 1405-1407. Bakaltcheva I., Williams W.O., Schmitt J.M., Hincha D.K. (1994) The solute permeability of thylakoid membranes is reduced by low concentration of trehalose as a co-solute. Biochim. Biophys. Acta. 1189: 38-44. Baker J., Steele C., Dure III L. (1988) Sequence and characterisation of 6 LEA proteins and their genes from cotton. Plant Mol. Biol. 11: 277-291. Barnabás B. (1994) Preservation of maize pollen., in: Y.P.S. Bajaj (ed.) Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 25. Maize. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 607-618. Bartels D., Engelhardt K., Roncarati R., Schneider K., Rotter M., Salamini F. (1991) An ABA and GA modulated gene expressed in the barley embyo encodes an aldose reducatse related protein. EMBO J. 10: 1037-1043. Benson E.E. (1995) Cryopreservation of Brassica species., in: Y.P.S. Bajaj (ed.) Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 32. Cryopreservation of plant germplasm. Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 309-318. Benson E.E., Reed B.M., Brennan R.M., Clacher K.A., Ross D.A. (1996) Use of thermal analysis in the evaluation of cryopreservation protocols for Ribes nigrum L. germplasm. Cryo. Lett. 17: 347-362. Bertrand A, Robitaille G., Castonguay Y., Nadeau P., Boutin R. (1997) Changes in ABA and gene expression in cold-acclimated sugar maple. Tree Physiol. 17: 3137. Binh B.Q., Heszky L.E., Gyulai G., Kiss E., Csillag F. (1989) Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 18: 195-200. Binh D.Q., Heszky L.E. (1990) Restoration of the regeneration potential of long term culture in rice (Oryza sativa L.) by salt pretreatment. J. Plant Physiol. 136: 336-340. Bray A.E. (1997) Plant response to water defficit. Trends Plant Sci. 2: 48-54. Bray E.A. (1993) Molecular response to water deficit. Plant Physiol. 103: 1035-1040. Brearley J., Henshaw G.G., Davey C., Taylor N.J., Blakesley D. (1995) Cryopreservation of Fraxinus excelsior (L.) zygotic embryos. Cryo. Lett. 16: 215-218. Brison M., de Boucaud M-T. Pierronnet A, Dosba F. (1996) Effect of cryopreservation on the sanitary state of a cv. Prunus rootstock experimetally contaminated with Plum Pox Potyvirus . Plant Sci. 123: 189-196.

IRODALOM

79

Caboche M. (1987) Nitrogen, carbohydrate and zinc requirement for the efficient induction of shoot morphogenesis from protoplast derived colonies of Nicotiana plumbaginifolia. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 8: 197-206. Cattivelli L., Bartels D. (1990) Molecular cloning and characterization of coldregulated genes in barley. Plant Physiol. 93: 1504-1510. Chao H., Hodges R., Kay C.M., Gauthier Y. and Davies P.L. (1996) A natural variant of type I antifreeze protein with four ice-binding repeats is a particularly potent antifreeze. Protein Soc.: 1150-1156. Chen H.H., LiP.H. (1982) Potato cold acclimation., in: P.H Li, A. Sakai (eds.) Plant cold hardiness and freezing stress: Mechanisms and crop implications. vol. 2. Academic Press New York pp.5-23. Chen J.L., Beversdorf R.A. (1992) Production of spontaneous diploid lines from isolated microspore following cryopreservation in spring rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breed. 108: 324-327. Chen T. H. H., Gusta L.V. (1983) Abscisic acid induced freezing resistance in cultured plant cells. Plant Physiol. 73: 71-76. Chen T.H.H., Kartha K.K., Leung N.L., Kurz G.W.G, Chatson K.B. Constabel F. (1984)

Cryopreservation

of

alkaloid-producing

cell

cultures

of

periwinkle

(Catharanthus roseus). Plant Physiol. 75: 726-729. Christine P.J., Hahn M., Walbot W. (1991) Low-temperature accumulation of alcohol dehydrogenase I mRNA and protein activity in maize and rice seedlings. Plant Physiol. 95: 699-706. Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Chu C.Y., Bi F.Y. (1975) Establishment of an efficient medium for anther culture of rice through comparative experiments on the nitrogen source. Sci. Sin. 18: 659-668. Cloutier Y., Siminovitch D. (1982) Correlation between cold - and drought - induced frost hardiness in winter wheat and rye varieties. Plant. Physiol. 69: 256-258. Collins G.G., Nie X. and Saltveit M.E. jr (1993) Heat shock increases chilling tolerance of mung bean hypocotil tissue. Phys. Plant. 89: 117-124. Cote G.G. (1995) Signal trasduction in leaf movement. Plant Physiol. 109: 727-734. Crowe J.H., Carpenter J.F., Crowe L., Anchordoguy T.J (1990) Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology. 27: 219-231.

80

IRODALOM

Czarnecka E., Nagao R.T., Key J.L., Gurley W.B. (1988) Characterization of Gmhsp26-A, a stress gene encoding a divergent heat shock protein of soybean: heavy-methal-induced inhibition of intron processing. Mol. Cell. Biol. 89: 1113-1122. Czarnecka E., Edelman L., Schöffl F., Key J.L. (1984) Comparative analysis of physical stress responses in soybean seedlings using cloned heat shock cDNAs. Plant Mol. Biol. 3: 45-58. Csonka L.N. (1989) Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev. 53: 121-147. Davies P.L., Hew C.L. (1990) Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4: 2460-2468. Daw A., Farrant J., Morris G.J. (1973) Membrane leakage of solutes after thermal shock or freezing. Cryobiology 10: 126-128. Demeulemeester M.A.C. Panis B.J., De Proft M.P. (1993a) Cryopreservation of in vitro shoot tips of chicory (Cichorium intybus). Cryo. Lett. 13:165-174. Demeulemeester M.A.C., Vandenbussche B., De Proft M.P. (1993b) Regeneration of chicory plants from cryopreserved in vitro shoot tips. Cryo. Lett. 14 :57-64. Dereuddre J., Tannoury M. (1995) Cryopreservation of germplasm of carnation (Dianthus caryophyllus L.)., in: Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in agriculture and forestry. vol. 32. Cryopreservation of plant germplasm. Springer. Berlin, Heidelberg, New York, pp. 458-475. Doebbler G.F. Rinfret A.P. (1962) Influence of protective compounds on cooling and warming conditions on hemolysis of erytrocytes by freezing and thawing. Biochim. Biophys. Acta. 58: 449. Dörffling K., Schulenburg S., Lesselich G., Dörffling H. (1990) Abscisic acid and proline levels in cold hardened winter wheat leaves in relation to variety-specific differences in freezing resistance. J. Agronomy Crop Sci. 165: 230-239. Dudits D., Bögre L., Györgyey L. (1991) Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro. J. Cell. Sci. 99: 473-482. Duman J.G. Xu L., Neven L.G., Tursman D., Wu D.W. (1991) Hemolymph proteins involved in insect subzero-temperature tolerance: ice nucleators and antifreeze proteins., in: R.E. jr Lee, D.R. Denlinger (eds) Insects at low temperature. Chapmann and Hall, New York, pp. 94-127.

81

IRODALOM

Duman J.G., Olsen M.T. (1993) Thermal hysteresis protein activity in bacteria, fungy, and phylogenetically diverse plants. Cryobiology 30: 322-328. Dumet D., Engelmann F., Chabrillage N., Duval Y. (1993a) Cryopreservation of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) somatic embryos involving a desiccation step. Plant Cell Rep. 12: 352-355. Dumet D., Engelmann F., Chabrillage N. Duval Y., Dereuddre J. (1993b) Importance of sucrose for acquisiton of tolerance to desiccation and cryopreservation of oil palm somatic embryos. Cryo-Letts. 14: 243-250. Dunn M.A., Hugnes M.A., Zhang L., Pearce R.S., Quigley A.S., Jack P.L. (1991) Nucleotide cequence and molecular analysis of the two low temperature induced cereal gene, BLT4. Mol. Gen. Genet. 229: 389-394. Dure III L., Crouch M., Harada J., Ho T.D.H., Mundi J., Quatrano R., Thomas T., Sung C.R. (1989) Common amino acid sequence domains among LEA proteins of higher plants. Plant Mol. Biol. 12: 475-486. Dure L III (1993) Structural motifs in Lea proteins., in: T.J. Closed, T.J Bray T.J. (eds) Plant responses to cellular dehydration during environmental stress. Current topics in plant Physiology vol.10, Am. Soc. Plant Phys. Rockwille, MD. pp. 91-103. Emons A.M.C., Samallo-Droppers A., van der Toorn C. (1993) The influence of sucrose, mannit, L-proline, abscisic acid and gibberellic acid on the maturation of somatic embryos of Zea mays L. from suspension cultures. J. Plant. Physiol. 142: 597-604. Eksomtramage T., Paulet F., Guiderdoni E., Glaszmann J.C., Engelmann F. (1992) Development of a cryopreservation process for embryogenic calluses of a commercial hybrid of sugarcane (Saccharum sp.) and application to different varieties. Cryo. Lett. 13: 239-252. Find J.I., Fléoto F., Krostrup P., Moller J.D., Norgaard J. V., Kristensen M.H. (1993) Cryopreservation of an embryogenic suspension culture of Picea sitchensis and subsequent plant regeneration. Scan. J. For. Res. 8: 156-162. Finkle B.J., Urlich J.M. (1982) Cryoprotectant removal temperatures a factor in the survival of frozen rice and sugarcane cells. Cryobiology. 19: 329-335. Finkle B.J., Zavala M.E., Ulrich J.M. (1985) Cryoprotective compounds in the viable freezing of plant tissues., in: K.K. Kartha (ed.) Cryopreservation of plant cells and organs. CRC Press. Boca Raton, FL. pp. 76-107.

82

IRODALOM

Ford K.G. (1990) Plant regeneration from Arabidopsis thaliana protoplasts. Plant Cell Rep. 8: 534-537. Fukai F. (1990) Cryopreservation of chrisanthemum shoot tips. Sci. Hort. 45: 167174. Fukai S., Goi M., Tanaka M (1991a) Cryopreservation of shoot tips of Chrysanthemum morifolium and related species native to Japan. Euphytica 54: 201204. Fukai S., Goi M., Tanaka M. (1991b) Cryopreservation of shoot tips of Caryophyllaceae ornamentals. Euphytica 56: 149-153. Galiba G. (1994) In vitro adaptation for drought and cold hardiness in wheat., in: J. Janick (ed.) Plant breeding reviews. vol 12. John Willy and Sons. London, pp. 115161. Gamborg O.L., Davies B.P. Stahlhut R.W. (1983) Cell division and differentiation in protoplast from cell cultures of Glycine species and leaf tissues of soybean. Plant Cell Rep. 2: 213-215. Gamborg, O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158. Ganapragasam S. Vasil I.K. (1992) Cryopreservation of immature embryos, embryogenic callus and cell suspension cultures of gramineous species. Plant Sci. 83: 205-215. Gilmour S.J., Thomashow M.F. (1991) Cold acclimation and cold-regulated gene expression in ABA mutants of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 17: 1233-1240 Gilmour S.J., Artus N.N., Thomashow M.F. (1992) cDNA sequence analysis and expression of two cold-regulated genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 18:13-21. Giraudat J., Parcy F., Bertauche N., Gosti F., Leung J., Morris P.C., BouvierDurand M., Vartanian M. (1994) Current advances in abscisic acid action and signalling. Plant Mol. Biol. 26: 1557-1577. Goddard N.J., Dunn M.A., Zhang L., White A.J., Jack P.L., Huges M.A. (1993) Molecular analysis and spatial expression pattern of a low-temperature-specific barley gene , blt101. Plant Mol. Biol. 23: 871-879. Gonzalez-Benito M.E., Perez C. (1994) Cryopreservation of embryonic axes of two cultivars of hazelnut (Corylus avellana L.). Cryo. Lett. 15: 41-46.

83

IRODALOM

Gordon -Kamm W.J., Steponkus P.L. (1984) Lamellar -to-hexagonal phase transitions in the plasma membrane of isolated protoplasts after freezing -induced dehydration. Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 81: 67-73. Gordon-Kamm W.J. and Steponkus P. L. (1983) Freeze-fracture morphology of the plasma membrane of isolated protopast of following contraction: influence of cold acclimation. Abst. Proc. Ann. Meet. Am. Soc. Plant Physiol., Fort Collins Colo., pp.96. Griffith M., Ala P., Yang D.S.C., Hon W.C., Moffatt B.A. (1992) Antifreeze proteins produced endogenously in winter rye leaves. Plant Physiol. 100: 593-596. Grossi M., CativelliL., Terzi V., Stanca A.M. (1992) Modification of gene expression induced by ABA in relation to drought and cold stress in barley shoots. Plant Physiol. Biochem. 30: 97-103. Guerrero F.D., Mullet J.E. (1988) Reduction of turgor induces rapid changes in leaf translatable RNA. Plant Physiol. 88: 401-408. Guo W., Ward R.W., Rthomashow M.F. (1992) Characterization of a cold regulated wheat gene related to Arabidopsis cor 47. Plant Physiol. 100: 593-596. Guy C.L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187-223. Guy C.L., Haskell D. (1987) Induction of freezing tolerance in spinach is associated with the synthesis of cold acclimatisation induced protein. Plant Physiol. 84: 872-878. Guy C.L., Anderson J.V., Haskell D.W., Li Q.B., Lin Q.B., herry J.H. (1994) CAPS, CORS, dehydrins, and molecular chaperones: their relationship with low temperature responses in spinach. Biochemical and cellular mechanisms of stress tolerance in plants. Proc. NATO ASI Series H: Cell Biology, Springer-Verlag. Berlin. 86: 479-499. Györgyei J., Gartner A., Németh K., Magyar Z., Hirt H., Heberle -Bors E., Dudits D. (1991) Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis . Plant Mol. Biol. 16: 999-1007. Gyulai G., Janovszky J., Kiss E., Lelik L., Csillag F., Heszky L.E. (1992) Callus initiation and plant regeneration from inflorescece primordia of the intergeneric hybrid Agropyron repens (L.) Beauv X Brumus inermis (Leyss.) cv. nanus on a modified nutritive medium. Plant Cell Rep. 11: 166-269. Haleja R.K. Horvath D.P. Gilmour S.J. Thomashow M.F. (1990) Molecular cloning of and expression of cor (cold-regulated ) genes in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 93: 1246-1252.

84

IRODALOM

Harding K.E. (1991) Stability of cryopreserved cultures: an assessment using Southern blot analysis., in: Plant cryopreservation-a practical introduction., Course Book, Nottingham, pp. 32-40. Hansen J., Beck E. (1988) Evidence for ideal and non-ideal equilibrum freezing of leaf water in frosthardy ivy (Hedera helix) and in winter barley (Hordeum vulgare). Bot. Acta. 101: 76-82. Hansen T.N., Smith K.M., Brockbank K.G.M. (1993) Type I antifreeze protein attenuates cell recoveries following cryopreservation. Transplantation Proc. Vol. 25, 6: 3182-3184. Harrington H.M., Alm D.M.(1988) Interaction of heat and salt stress in cultured tobacco cells. Plant Physiol. 88: 618-625. Harsányi V. (1976) Kriobiológia., in: Gy. Csaba (ed.) A biológia aktuális problémái. Anyagcsere zavarok és fejlődési rendellenességek. Vol. 6. Medicina. Budapest, pp. 217-270. Hatanaka T., Yasuda T., Yamaguchi T., Sakai A. (1994) Direct regrowth of encapsulated somatic embryos of coffee (Coffea canephora) after cooling in liquid nitrogen. Cryo. Lett. 15: 47-52. Hauptmann R.M., Widholm J.M. (1982) Cryostorage of cloned amino acid analogresistant carrot and tobacco suspension cultures. Plant Physiol. 70: 30-34. Heikkila J.J., Papp J.E.T., Scultz G.A., Bewley J.D. (1984) Induction of heat shock protein messenger RNA in maize mesocotyls by water stress, abscisic acid and wounding. Plant Physiol. 76: 270-274. Heimovaara-Dijkstra S., Van Duin B., Libbenga K.R., Heidekamp F., Wang M. (1994) Abscisic acid-induced membrane potential changes in barley aleuron protoplast: a possible relevance for the regulation of rab gene expression. Plant Cell Physiol. 35 (5): 743-750. Helliot B., de Boucaud M.T. (1997) Effect of various parameters on the survival of cryopreserved Prunus ferlenain in vitro plantlets shoot tips. Cryo. Lett. 18: 133-142. Heszky L.E. Binh D.Q., Kiss E., Gyulai G. (1989) Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur) Holmb. Plant Cell Rep. 8: 174-177. Heszky L.E., Jekkel Zs., Ali A.H.(1990) Effect of cryoprotectant and holding time at different transfer temperatures on the survival of cryopreserved cell suspension culture of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell. Tiss. Org. Cult. 21: 217-226.

85

IRODALOM

Hightower R., Baden C., Penzes E., Lund P., Dunsmuir P. (1991) Expression of antifreeze proteins in transgenic plants. Plant Mol. Biol. 17:1013-1021. Hincha D.K., Heber U., Schmitt I.M. (1990) Proteins from frost hardy leaves protect thylakoids against mechanical freeze-thaw damage in vitro. Planta 180: 416-419. Hincha D.K., Meins F., jr Schmitt J.M. (1997) a-1,3-gluccanase is cryoprotective in vitro and is accumulated in leaves during cold acclimation. Plant Physiol. 114: 10771083. Hon W.C., Griffith M., Chong P., Yand D.S.C. (1994) Extraction and isolation of antifreeze proteins from winter rye (Secale cereale L.) leaves. Plant Physiol. 104: 971-980. Hon W.C., Griffith M., Mlynarz A., Kwok Y.C., Yand D.S.C.(1995) Antifreeze protein in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins. Plant Physiol. 109: 879-889. Horvath D.P., McLarney B.K., Thomashow M.F. (1993) Regulation of Arabidopsis thaliana L. (Heyn) cor78 in response to low temperature. Plant Physiol. 103: 1047153. Houdge M., Danyluk J., Laliberte J.F., Rassart E., Dhindsa R.S., Sarhan F. (1992) Cloning, characterisation and expression of a cDNA encoding a 50-kilodalton protein specifically induced by cold acclimatisation in wheat. Plant Physiol. 99: 13811387. Howarth C.J., Ougham H.J. (1993) Gene expression under temperature stress. New Phytolologist 125: 1-26. Huges M.A., Dunn M.A., Pearce R.S., White A.J., Zhang L. (1992) An abscisicacid-responsive, low temperature barley gene has homology with a maize phospholipoid transfer protein. Plant Cell Environ. 15: 861-865. Ingram J., Bartels D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 377-403. Ishikawa M. Tandon P., Sizuki M., Yamaguishi-Ciampi A. (1996) Cryopreservation of bromegrass (Bromus inermis Leyss ) suspension cultured cell using slow prefreezing and vitrification procedures. Plant Sci. 120: 81-88. Jain R.K.S., Jain X.H., Wu R. (1996) Stimulatory effect of water stress on plant regeneration in aromatic indica rice varieties. Plant Cell Rep. 15: 449-454. Jarillo J.A., Capel J., Leyva A., Martinez-Zapater J.M., Salinas J. (1994) Two related low-temperature -inducible genes of Arabidopsis encode protein showing

86

IRODALOM

high homolgy to 14-3-3 proteins of putative kinase regulators. Plant Mol. Biol. 25: 639-704. Jennings P., Saltveit M.E. (1994) Temperature and chemical shocks induce chilling tolerance in germinating Cucumis sativus (cv. Poinsett 76) seeds. Physiol. Plant. 91: 703-707. Jian L.C., Sun L.H. (1989) Cryopreservation of the stem segments in chinese goosberry. Acta Bot. Sin. 31: 66-68. Jörgensen J. (1990) Conservation of valuable gene resources by cryopreservation in some forest tree species. Plant Physiol. 136: 373-376. Karow A.M. Jr. (1969) Cryoprotectants -a new class of drugs. J. Pharm. Pharmac. 21: 209. Kartaha K.K, Leung N.L., Pahl K. (1980) Cryopreservation of strawberry meristems and mass propagation of plantlets. J. Am. Soc. Hortic. Sci. 150: 481. Kartha K.K. (1985) Meristem culture and germplasm preservation., in: K.K.Kartha (ed). Cryopresevation of plant cells and organs. CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 115-134. Kartha K.K., Leung N.L., Gamborg O.L. (1979) Freeze preservation of pea meristems in liquid nitrogen and subsequent plant regeneration. Plant Sci. Lett. 15: 7-13. Kavi Kishor P.B., Hong Z., Miao G.-H., Hu A.-A.A., Verma D.P.S. (1995) 1 Overexpression of D -pirroline-5-carboxylate synthase increases proline production

and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol. 108: 1387-1394 Kaul S.C. Obuchi K., Iwahashi H., Komatsu Y. (1992) Cryoprotection provided by heat schock treatment in Saccharomyces cerevisiae. Cell. Mol. Biol. 38:135-143. Kendall E.J., Kartha K.K., Qureshi J.A., Chermak P. (1993) Cryopreservation of immature spring wheat zygotic embryos using an abscisic acid pretreatment. Plant Cell. Rep. 12: 89-94. Kenward K.D., Altschuler M., Hildebrand D., Davies P.L. (1993) Accumulation of type I fish antifreeze protein in transgenic tobacco is cold-specific. Plant Mol. Biol. 23: 377-385. Kim Y.H., Janick J. (1991) Abscisic acid and proline improve desiccation tolerance and increase fatty acid content of celery somatic embryos. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 24: 83-89.

87

IRODALOM

Kiss J., Heszky L.E., Kiss E. and Gyulai G. (1992) High efficiency adventive embryogenesis on somatic embryos of anther, filament and immature proembryo origin in horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) tissue culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 30: 59-64. Kiyosue T., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1994) Cloning of cDNA-s for genes that are early-responsive to dehydration stress (RRDs) in Arabidopsis thaliana (L.): identification of the ERDs as HSP cognate genes. Plant Mol. Biol. 25: 791-798. Knight C.A., Wen D., Laurse R.A. (1995) Nonequilibrum antifreeze peptides and the recristallization of ice. Cryobiology.32: 23-34. Kohmura H., Sakai A., Chokyu S., Yakuwa T (1992) Cryopreservation of in vitromultiple bud clusters of asparagus (Asparagus officinalis L. cv Hiroshimagreen (2n=30) by the techniques of vitrification. Plant Cell Rep. 11:433-437. Kuranuki Y., Sakai A (1995) Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of tea (Camellia sinensis) by vitrification. Cryo. Lett. 16: 345-352. Kurkela S., Borg-Franck M. (1992) Structure and expression of kin2 , one of two cold- and ABA-induced genes of Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 19: 689-692. Kurkela S., Franck M. (1990) Cloning and characterisation of a cold- and ABAinducible Arabidopsis gene. Plant Mol. Biol. 15:137-144. Lang V., Palva E. T. (1992) The expression of a rab-related gene, rab 18, is induced by abscisic acid during the cold acclimation process of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol. Biol. 20: 951-962. Leborgne L., Teulieres C., Travert S., Rols M.P., Teissie J. , Boudet A.M. (1995) Introduction of specific carbohydrates into Eucaliptus gunnii cells increase their freezing tolerance. Eur. J. Bioshem. 229: 710-717. Lecoteux C., Florin B., Tessereau H., Bollon H. and Petierd V. (1991) Cryopreservation of carrot somatic embryos using a simplified freezing process. Cryo. Lett. 12: 319-328. Lee S.P., Chen T.H.H. (1993a) Molecular cloning of abscisic acid -responsive mRNAs expressed during the induction of freezing tolerance in bromegrass (Bromus inermis Leyss) suspension culture. Plant Physiol. 101: 1089-1096. Lee S.P., Chen T.H.H. (1993b) Expression of an aldose reductase-regulated gene during the induction of freezing-tolerance in bromegrass cell suspension cultures. J. Plant Physiol. 142:749-753

88

IRODALOM

Levitt J. (1980) Responses of plants to environmental stresses: chilling, freezing and high temperature stresses. in: T.T. Kozlowsky (ed.) Physiological ecology: A series of monographs, Texts and treatises, vol. 1-2nd Academic Press, New York, pp.23-64. Li P., Ryu S.B., Tseng M.J., Chen T.H.H. (1989) Induction of plant cold hardiness. Curr. Top. Plant Biochem. Physiol. Univ. Missouri-Columbia 8: 21-40. Li B.J., Langridge W.H.R., Szalay A.A. (1985). Somatic embryogenesis and plantlet regeneration in the soybean Glycine max. Plant Cell. Rep. 4: 344-347. Lin C., Thomashow M.F. (1992) DNA sequence analysis of a complementary DNA for cold regulated Arabidopsis gene cor and characterisation of the COR 15 polypeptide. Plant Physiol. 99: 519-525. Lloyd G.B., McCown B.H. (1980) Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture. Comb. Proc. Intern. Propag. Soc. 30: 421-427. Lovelock J.E., Bishop M.W.H. (1959) Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulfoxide. Nature, 183:1394-1959. Luo J., Reed B.M. (1997) Absisic acid responsive protein, bovine serum albumin, and proline pretreatments improve recovery of in vitro currant shoot-tip meristems and callus cryopreserved by vitrification. Cryobiology. 34: 240-250. Luo M., Liu J.H., Mohapatra S., Hill R.D., Mohapatra S.S. (1992) Characterisation of gene family encoding abscisic acid and environmental stress-inducible proteins of alfalfa. J. Biol. Chem. 267:15367-15374. Luyet B.J. (1966) Anatomy of the freezing process in physical systems., in: H.T.Meryman (ed.) Cryobiology. Academic press, New York, London, pp.56-69. Lynch P.T., Benson E.E., Jones J., Cocking E.C. Power J.B., Davey M.R. (1994) Rice cell cryopreservation: the influence of culture methods and the embryogenic potential of cell suspensions on post-thaw recovery. Plant Sci. 98:185-192. Lyons J. M., Raison J. K., Steponkus P.L. (1979) The plant membrane in response to low temperature: An overview., in: J.M. Lyons, D. Graham, K. Raison (eds.), Low temperatures stress in crop plants. Academic press, New York. pp. 1-24. Madea T., Takehara M., Saito H. (1995) Activation of yeast PBS2 MAPKK by MAPKKs or by binding of an SH-3 containing osmosensor. Science. 269: 554-558. Mandal B.B., Chandel K.P.S., Dwivedi S. (1996) Cryopreservation of yam (Discorea spp.) shoot apices by encapsulation-dehydration. Cryo. Lett. 17: 165-174.

IRODALOM

89

Mari S., Engelmann F., Chabrillange N., Huet C., Michaux-Ferriere N. (1995) Histo-cytological study of apices coffee (Coffea racemosa and C. sessiliflora) in vitro plantlets

during

their

cryopreservation

using

the

encapsulation-dehydration

technique. Cryo. Lett. 16: 289-298. Marin M. L., Duran-Vila N. (1988) Survival of somatic embryos and recovery of plants of sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osb.) after immersion in liquid nitrogen. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 14: 51-57. Matsumoto T., Sakai A., Takahashi C., Yamada K. (1995) Cryopreservation of in vitro-grown apical meristems of wasabi (Wasabia japonica) by encapsulationvitrification method. Cryo. Lett. 16:189-196. Mazur P. (1970) Cryobiology. The freezing of biological systems. Science 168: 939. Mazur P., Miller R.H. (1976) Survival of frozen-thawed red cells as a function of permeation of glycerol and sucrose. Cryobiology, 13: 523. Meryman H.T (1971) Cryoprotective agents. Cryobiology 8:173. Meryman H.T. (1966) Review of biological freezing. in. H.T. Meryman (ed.) Cryobiology Academic Press, New York, London, p.158. Meryman H.T. (1970) The exceeding of minimum tolerable cell volume in hypertonic suspensions: a cause of freezing injury., in: G.E.W. Wolstenholme, M. O˘Connor (eds.) The frozen cell. Churchill J.& A. London. pp. 245-273. Meryman H.T. (1974) Freezing injury and its prevention in living cells. Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 3: 314. Meryman H.T., Williams R.J. (1985) Basic principles of freezin injury to plant cells; natural tolerance and approaches to cryopreservation., in: K.K.Kartha (ed.), Cryopreservation of plant cells and organs. CRC Press. Boca Raton, FL, pp.14-44. Mogapatra S.S., Wolfraim L., Poole R.J., Dhindsa R.S. (1989) Molecular cloning and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation-specific genes of alfalfa . Plant Physiol. 89:375-380 Monette P.L. (1987) Organogenesis and plantlet regeneration following in vitro cold storage of kiwifruit shoot tip cultures. Sci. Hort. 31: 101-106. Monroy A.F., Sarhan F., Dhindsa R.S. (1993) Cold-induced changes in freezing tolerance, protein phosphorylation, and gene expression. Plant Physiol. 102: 12271235. Moriguchi T. (1995) Cryopreservation and minimum growth storage of pear (Pyrus species)., in: Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in agricilture and forestry. , vol. 32.

90

IRODALOM

Cryopreservation of plant germplasm I., Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 117-129 Mórocz S., Donn G., Németh J., Dudits D. (1990) An improved system for the obtention of fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture. Theor. Appl. Genet. 80: 721-726. Murashige T., Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-479. Müller-Thurgau H. (1882) Über Zuckeranhaufung in Pflanzentheilen in Folge niedere Tamperatur. Landw. Jahrb. Schweitz 11: 751-828. Nag K.K., Street H.E. (1975) Freeze-preservation of cultured cells. I. The pretreatment phase. Physiol. Plant. 15: 473-497. Nag K.K., Street H.E. (1973) Carrot embryogenesis from frozen cultured cells. Nature. 145: 270. Neven L.G., Haskell W., Guy C.L., Denslow N., Klein P.A., Green L.G., Silverman (1992) Association of 70-kilodalton heat-shock cognate proteins with acclimation to cold. Plant Physiol. 99: 1362-1369. Niinó T., Sakai A. (1992) Cryopreservation of alginate-coated in vitro grown shoot tips of apple, pear and mulberry. Plant Sci. 87:199-206. Niino T., Sakai A., Nojiri K. (1992a) Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of apple and pear by vitrification. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 28: 261-266. Niino T., Sakai A., Enomoto S., Magosi J., Kato S. (1992b) Cryopreservation of in vitro-grown shoot tips of mulberry by virtification. Cryo. Lett. 13: 303-312. Niwata E. (1995) Cryopreservation of apical meristems of garlic (Allium sativum L.) and high subsequent plant regeneration. Cryo-Lett. 16:102-107. Nordin K., Heino P., Palva E.T. (1991) Separate signal pathway regulate the expression of a low- -temperature -induced gene in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol. Biol. 16:1061-1071. Nordin K., Valaha T. and Pavla E.T. (1993) Differential expression of two related, low-temperature-induced genes in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Mol. Biol. 21: 641-653. Normah M.N., Vengadasalam M. (1992) Effects of moisture content on cryopreservation of Coffea and Vigna seeds and embryos. Cryo. Lett. 13:199-208.

IRODALOM

91

Ogawa R., Ishikawa M., Niwata E., Oosawa K. (1997) Cryopreservation of shoot primordia cultures of melon using a slow prefreezing procedure. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 49:171-177. Orr W., Singh J., Brown D.C.W. (1985) Induction of freezing tolerance in alfalfa cell suspension cultures. Plant Cell Rep. 4:15-21. Palta J.P., Li P.H. (1978) Cell membrane properties in relation to freezing injury., in: P.H. Li, A. Sakai (eds.) Plant cold hardiness and freezing stress, Academic Press, New York, pp. 93-115. Panis B., Totté N., van Nimmen K., Withers L.A., Swennen R. (1996) Cryopreservation of banana (Musa spp.) meristem cultures after preculture on sucrose. Plant Sci. 121:95-106 Paulet F., Engelmann F., Glaszmann J.C. (1993) Cryopreservation of apices of in vitro

plantlets

of

sugarcane

(Saccharum

sp.)

hybrids

using

encapsulation/dehydration. Plant Cell Rep. 12: 525-529. Pelham H.R.B. (1986) Speculations on the functions of the major heat shock and glucose regulated proteins. Cell. 46: 959-961. Pence V.C. (1991) Cryopreservation of immature embryos of Theobroma cacao . Plant Cell Rep. 10: 144-147. Perez R.M., Navarro L., Duran-Vila N. (1997) Cryopreservation and storage of embryogenic callus cultures of several Citrus species and cultivars. Plant Cell Rep. 17: 44-49. Pritchard H.W., Grout B.W.W., Reid D.D., Short K.C. (1986) The effrect of growth under water stress on the structure, metabolism and cryopreservation of cultured sycamore cells. in: F. Fanks (ed.), Biophysics of water. John Wiley and Sons. New York. pp. 127-138. Quamaruddin M., Dormling I., Ekberg I., Eriksson G., Tillberg E. (1993) Abscisic acid content at defined levels of bud dormancy and frost tolerance in two contrasting populations of Picea abies grown in a phytotron. Physiol. Plant. 87: 203-210. Ramussen D.H., Luyet B.J. (1970) Contribution of the establishment of the temperature -concentration curves of homogenous nucleation in solution of some cryoprotective agent. Biodynamica, 11: 33. Raymond J.A., Wilson P., de Vries A.L. (1989) Inhibition of growth of nonbasal planes of ice by fish antifreezes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 881-885.

92

IRODALOM

Reed B.M. (1995) Cryopreservation of in vitro-grown gooseberry and currant meristems. Cryo. Lett. 16: 131-136. Reed B.M. (1993) Responses to ABA and cold acclimation are genotype dependent for cryopreserved blackberry and raspberry meristems. Cryobiology 30: 179-184. Reinhoud P.J., Schrijnemakers W.M., van Iren F., Kijne W. (1995) Vitrification and a heat-shock treatment improve cryopreservation of tobacco cell suspensions compared to two step freezing. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 42: 261-267. Ribeiro R.C.S., Jekkel Z., Mulligan B.J., Cocking E.C., Power J.B., Davey M.R. Lynch P.T. (1996) Regeneration of fertile plants from cryopreserved cell suspensions of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Sci. 115: 115-121. Rothman J.E. (1989) Polypeptide chain binding proteins: catalysis of protein folding and related process in cells. Cell. 59: 591-601. Rubisnsky B., Arav A., de Vries A.L. (1991a) Cryopreservation of oocytes using directional cooling and antifreeze glycoproteins. Cryo-Lett. 12: 93-106. Rubisnsky B., Arav A., Fletcher G.L. (1991b) Hypothermic protection -a fundamental property of antifreeze proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 566-571. Sakai A. (1985) Cryopreservation of shoot-tips of fruit trees and herbaceous plants., in: K.K. Kartha (ed), Cryopresevation of plant cells and organs. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 135-138. Sakai A., Kobayashi S. (1990) A simple and efficient procedure for cryopreservation of nucellar cells of navel orange by vitrification. Cryobiology 27: 657. Sakai A., Larcher W. (1987) Frost survival of plants: Responses and adaptation to freezing stress. Springer -Verlag, Berlin, Heidelberg, New York pp.1-328. Santoniani C.S., Tognetti J.A., Pontis H.G., Salarno G.L. (1993) Sucrose and fructan metabolism in wheat roots at chilling temperatures. Physiol. Plant. 87: 84-88. Scandalios J.G. (1993) Oxygen stress and superoxide dismutase. Plant Physiol. 107: 7-12. Schabel-Preikstas B., Earle E.D., Steponkus P.L. (1991) Cryopreservation of sweet potato shoot tips by vitrification. Cryobiology. 28: 738-739. Schaffer M.A., Fischer R.L. (1988) Analysis of mRNAs that accumulate in response to low temperature identifies a thiol-protease gene in tomato. Plant Physiol. 87: 431436.

93

IRODALOM

Schroeder J.I Hedrich R. (1989) Involvement of ion channels and active transport in osmoregulation and signaling in higher plant cells. Trends. Biochem. Sci. 14:187192. Senaratna T., McKerie B.D., Bewley S.R. (1989) Desiccation tolerance of alfalfa (Medicago sativa L.) somatic embryos. Influence of ABA, stress pretreatment and drying rates. Plant Sci. 65: 253-260. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (1997) Gene expression and signal transduction in water stress response. Plant Physiol. 115: 327-334. Simon T. (1992) Taxonomy of higher plants of Hungarian flora. Tankönyvkiadó, Budapest, pp. 1-892 Skriver K. Mundy J. (1990) Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress. Plant Cell. 2: 503-512. Skowyra D., Georgopoulos C., Zylicz M. (1990) The E. coli dnaK product, the hps homolog, can reactive heat inactivated RNA polymerase in ATP hydrolysis manner. Cell. 62: 939-944. Steponkus P.L. (1984) Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant. Physiol. 35: 543-548. Steponkus P.L., Lamphear F.O. (1967) Refinement of triphenil tetrazolim chloride method for determining cold injury. Plant Physiol. 42:1423-1426. Steponkus P.L. Lynch D.V. (1989) Freeze/thaw induced destabilisation of the plasma membrane and the effect of cold acclimation. J. Bioenerg. Biomembr. 21: 2141. Strizhov N., Ábrahám E., Ökrész L., Blickling S., Zilberstein A., Schell J., Koncz CS., Szabados L. (1997) Differential expression of two P5CS genes controlling proline accumulation during salt stress requires ABA and is regulated by ABA1, ABI1 and AXR2 in Arabidopsis. Plant Journal 12 (3): 557-569. Sváb J. (1973) Biometriai módszerek a kutatásban. Mezőgazdsági kiadó, Budapest, pp. 186-208 Sun L.H., Jian L.C. (1989) The cryopreservation of maize (Zea mays L.) calli. Chin. Bull. Bot. 6: 28-30. Sutton F., Ding X., Kenefick D.G. (1992) Group 3 LEA gene HVAi regulation by cold acclimation and deacclimation in two barley cultivars with varying freeze resistance. Plant Physiol. 99: 338-340.

94

IRODALOM

Suzuki T., Kaneko M., Harada T. (1997) Increase in freezing resistance of excised shoot tips of Asparagus officinalis L. by preculture on sugar-rich media. Cryobiology. 34: 264-275. Tanford C. (1973) The hydrofobic effect: Formation of micells and biologcal membranes. John Wiley and Sons, New York. pp. 10-14. Tao D., Li P.H. (1986) Classification of plant cell cryoprotectants. J. Theor. Biol. 123: 305-312. Thomashow M.F. (1990) Molecular genetics of cold acclimation in higher plants. Adv. Genet. 28: 99-131. Touchel D.H., Dixon K.W., Tan B. (1992) Cryopreservation of shoot tips Grevillea scapigera (Proteacea): a rare and endangered plant from western Australia. Aust J. Bot. 40: 305-310. Tshukahara M. Hirosawa T. (1992) Simple dehydration treatment promotes plantlet regeneration of rice (Oryza sativa L.) callus. Plant Cell Rep. 11: 550-553. Tunthala P., Jana M.K., Mohanan K. (1993) Cryopreservation of groundnut (Arachis hypogaea L.) embryonic axes for germplasm conservation. Cryo. Lett. 14: 335-338. Uragami A. (1991) Cryopreservation of asparagus ( Asparagus officinalis L.) cultured in vitro . Res. Bull. Hokkaido. Natl. Agric. Exp. Stn. 156: 1-37. Urrutia M.E., Duman J.G., Knight C.A. (1992) Plant thermal hysteresis proteins. Biochim. Biophys. Acta 1121: 199-206. van Berkel J., Salamini F., Gebhardt C. (1994) Transcripts accumulation during cold storage of potato (Solanum tuberosum L.) tubers are sequence related to stress-responsive genes. Plant Physiol. 104: 445-452. Vandenbussche B., De Proft M.P. (1996) Cryopreservation of in vitro sugar beet shoot-tips using the encapsulation-dehydration technique: development of a basic protocol. Cryo. Lett. 17: 137-140. Vasques J.S., Raynal M., Meza-Basso L., Delseny M. (1993) Two related, lowtemperature -induced genes from Brassica napus are homologous to the human tumour bbc1 (breast basic conserved ) gene. Plant Mol. Biol. 23:1211-1221. Wallis J.G., Wang H. and Guerra D.J. (1997) Expression of synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mol. Biol. 35: 323-330.

95

IRODALOM

Ward A.C. W, Benson E.E., Blackhall N.W., Cooper-Bland S., Powell J.B., Davey M.R. (1993) Flow cytometric assessments of ploidy stability in cryopreserved dihaploid Solanum tuberosum and wild species. Cryo. Lett. 14:145-152. Watanabe K., Kawai F. and Kanamuri M. (1995) Factors affecting cryoprotectability of cultured rice (Oryza sativa L.) cells cell-wall and cell-aggregate size. Cryo. Lett. 16: 147-156. Weretilnyk E., Orr W., White T.C.I. B., Singh J. (1993) Characterisation of three related low-temperature-regulated cDNAs from winter Brassica napus. Plant Physiol. 101:171-177. Widholm J.M. (1972) The use of fluorescein diacetate and phanosafranine for determining viability of cultured plant cells. Stain. Technol. 47:189. Wiest S. Steponkus P. (1978) Freeze thaw injury to isolated spinach protoplast and its simulation at above freezing temperatures. Plant Physiol. 62: 699. Williams R.J. (1981) Frost desiccation: an osmotic model., in C.Olien, M. Smith (eds.), Analysis and improvement of hardiness in crops. CRC Press, Boca Raton FL, pp. 53-78. Williams R.J., Hope H.J. (1981) The relationship between cell injury and osmotic volume reduction. III. Freezing injury and frost resitsance in winter wheat. Cryobiology. 18:133. Williamson J.D. Scandalios J.G. (1992) Differential response of maize catalases to abscisic acid: Vp1 transcriptional activator is not required for abscisic acid-regulated Cat1 expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8842-8846. Withers L.A. Street H.E. (1977) Freeze preservation of cultured plant cells. III. The pregrowth phase. Plant Physiol. 39:171-175. Withers L.A. (1984) Freeze preservation of cells., in: L. Vasil.(ed.), Cell culture and somatic cell genetics of plants. Academic Press, New York. p. 612. Withers L.A. (1985) Cryopreservation of cultured plant cells and protoplast., in: K.K. Kartha (ed.), Cryopresevation of plant cells and organs. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 243-267. Withers L.A. (1992) In vitro conservation., in: F.A. Hammerschlag, R.E. Litz (eds.), Biotechnology of perennial fruit crops, Biotechnology in agriculture no. 8, CAB International, Wallingford, UK, pp. 169-200. Withers L.E., King P.J. (1979) Proline: a novel of cryoprotectant for the freeze preservation of cultured cells of Zea mays L. Plant Physiol. 64:675-678.

96

IRODALOM

Withers L.A., King P.J. (1980) A simplified freezing unit and cryopreservation method for plant cell suspension. Cryo-Lett. 1:2 00-213. Wolfraim L.A., Langis R., Tyson H., Dhindsa R.S. (1993) cDNA sequence, expression and transcript stability of a cold acclimation -specific, cas18, of alfalfa (Medicago sativa) cells. Plant Physiol 101:1275-1282. Wurgler-Murphy S.M., Saito H. (1997) Two-component signal transducers and MAPK cascades. Trends Biochem. Sci. 22:172-176. Yamada T., Sakai A., Matsumura T., Higuchi S. (1991) Cryopreservation of apical meristems of white clover (Trifolium repens L.) by vitrification. Plant Sci. 78: 81-87. Yamada T., Sakai A., Matsumura T., Higuchi S. (1993) Plant regenaration of meristematic callus of white clover (Trifolium repens L.) cooled to -196 °C by vitrification. Euphytica. 70:197-203. Yancey P.M., Clark M.E., Hand S.C., Bowlus R.D., Somero G.N. (1982) Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217: 1214-1222. Zeevaart J.A.D., Creelman R.A. (1988) Metabolism and physiology of abscisic acid. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 439-473. Zhang S.B., Jian L.C., Qian Y.Q., Bajaj Y.P.S. (1994) Cryopreservation of maize., in: Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in agriculture and forestry, vol. 25. Maize. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, pp. 619-627. Zhu B., Chen T.H.H., Li P.H. (1993) Expression of an ABA-responsive osmotin-like gene during the induction of freezing tolerance in Solanum commersonii. Plant Mol. Biol: 21: 727-735. Zhu D., Scandalios H.J.G. (1994) Differential accumulation of manganazesuperoxide dismutase transcripts in maize in response to abscisic acid and high osmoticum. Plant Physiol. 106: 173-178.

SZENT ISTVÁN EGYETEM

Recommend Documents