Szent István Egyetem

Szent István Egyetem AZ IVARÉRÉS IDEJÉT MEGHATÁROZÓ QTL­EK GENETIKAI TÉRKÉPEZÉSE TYÚKBAN Doktori értekezés tézisei

Szabó Gyula

MBK Gödöllő 2004

A doktori iskola Neve: Állattenyésztés­tudományi Doktori Iskola Tudományága: Vezetője:

Mezőgazdaságtudomány

Dr. Horváth László

tanszékvezető egyetemi tanár az MTA doktora Szent István Egyetem, Mezőgazdaság­ és Környezettudományi kar, Halgazdálkodási Tanszék Témavezető:

Dr. Varga László

tudományos főmunkatárs, Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Géntérképezés állatokon csoport

..........................................

.........................................

A programvezető aláírása

A témavezető aláírása

1. A munka előzményei, a kitűzött célok A genetika és molekuláris genetika fejlődésével számos olyan módszer és   technika   alakult   ki,   melyek   segítségével   megismerhetjük   a tulajdonságok  kialakításáért felelős géneket, megtudhatjuk mi az a DNS által   hordozott   információban   létrejött   változás,   ami   hat   a   tulajdonság kialakulására. A   korszerű   genetikai   markerek   megjelenésével   a   genetikai térképezésben   is   kialakultak   olyan   technikák,   melyek   igen   hatékony eszközt jelentenek a tulajdonságok hátterének felderítésében. Amennyiben  már feltérképeztük   egy  gén  helyét, a hozzá  két oldalról legközelebb   levő   markergének   felhasználhatók   a  MAS­ban   (Marker Assisted   Selection   =  markerek  segítségével   végzett   szelekció).   Ezzel   a technikával a markergéneken kimutatott genotípusokkal ellenőrízhetjük, mely   utódok   örökölték   a   legkedvezőbb  allélkombinációt.  Ezáltal célzottabban   van   lehetőségünk   egyes   tulajdonságok   öröklődésének ellenőrzésére és ennek alapján ezeket az állatokat akár még a fenotípus kifejlődése előtt is előszelektálni tudjuk. Ezeket   a   hatékony   technikákat   akarták   alkalmazni   a   klasszikus tenyésztési   munka   sikeres   folytatása   mellett   a   Bábolna  TETRA­SL tojóhibrid  tenyésztői   is.   A   tenyésztési   és   a   genetikai   paramétereket figyelembe véve az „ivarérés ideje” az a tulajdonság, melyen keresztül a leghatékonyabban emelhető a Bábolna TETRA­SL tojástermelőképessége molekuláris genetikai módszerek segítségével. Ennek   a   célnak   az   eléréséhez   ki   kellett,   hogy   alakítsak   egy   olyan módszert,   amely   alkalmazkodik   a   kétvonalas   tojóhibrid   tenyésztés gyakorlati   adottságaihoz,   alkalmassá   teszi   a   reciprok   rekurrens szelekcióban   kialakított   tesztkeresztezések   állományait   a   genetikai térképezésre. Először   az   alkalmazandó   módszer   elemeit   egy   kész   kísérleti elrendezésben   kellett   megvalósítanom.   Csoportunk   egy   fontos   kutatási témájában, az egéren végzett genetikai térképezésben nyílt lehetőség arra, hogy a módszer elemeit kipróbálhassam. Ebben a munkában egy célzottan kialakított   F2   térképezési   populáció   egyedein   sikerült   megvalósítani   a genetikai   térképezés   hatékonyságát   növelő   technikákat,   és   tesztelni   a 1

módszerek alkalmazhatóságát. Második   lépésben   a   módszereket   a   gyakorlatból   származó,   daughter design elrendezésű TETRA­SL keresztezési állomány igényeihez kellett igazítsam. Az alkalmazandó technikákkal olyan mértékben lehet növelni a termelésből   származó   állományokon   végzett   genetikai   térképezés hatásfokát,   hogy   nincs   szükség   speciális   keresztezési   álomány előállítására ahhoz, hogy a QTL­ek pozícióját felderítsem. Az   alapvető   célkitűzésem   eléréséhez   a   következő   feladatokat   kell elvégezni. 











Térképezési populáció meghatározása a TETRA­SL állománynál: A reciprok­rekurrens nemesítés tesztpopulációjából ki kell választanom azokat   a   családokat,   melyeken   a   genetikai   térképezési   munka   a leghatékonyabban elvégezhető. DNS izolálás: Gyors,   olcsó   és   a   lehető   legkevesebb   káros   anyagot   igénylő   DNS preparálási módszert kell ki dolgoznom, melyel megfelelő mennyiségű és minőségű DNS izolálható. Hatékonyság   növelése   szelektív   genotípus   meghatározással,   DNS poollal az F2 kísérleti elrendezésben A   térképezési   állomány   méretéhez   képest   meg   kell   határozni   a vizsgálandó egyedek számát. Ezeknek a csoportoknak a mintáiból kell kialakítanom   azokat   a   kevert   DNS   mintákat,   más   néven   poolokat, melyeken a vizsgálatokat el tudom végezni. Szelektív   DNS   pool   technika   részleteinek   kidolgozása   a   TETRA­SL állományra A   vizsgálatokra   alkalmas   családok   egyedei   közül   kell   kiválasztanom azokat,   melyek   a   genetikai   térképezés   szempontjából   a   legtöbb információt   hordozzák.   Ezeknek   az   egyedeknek   a   DNS­eiből   hozom létre a kevert mintákat. Genetikai térkép szerkesztése: A tyúkról ismert legtöbb információt összesítő, átfadés mentes genetikai térképet kell szerkesztenem. Markerháló kialakítása: Ahhoz, hogy a QTL­ek pozícióját biztonságosan meg tudjam határozni, 2

kell   választanom   egy   olyan   markergén   szettet,   mely   megfelelően   kis térközökkel, egyenletesen fedi le az alkalmazott genetikai térképet. 















A kimutatás optimalizálása: A   kiválasztott   markerek   kimutatását   úgy   kell   optimalizálnom,   hogy könnyen, hatékonyan, nagy számban vizsgálhatók legyenek. Heterozigóta kakasok kiválasztása a TETRA­SL állomány esetében: A családok kakas őseinek genotípusa alapján kell kiválasztanom azokat a családokat a térképezési populációból, melyeknél a heterozigóta kakas ős alléleinek öröklődését megfelelően viszgálni tudom az utódokban. A pool minták vizsgálata: A kevert   DNS  mintákban   kell  megbecsülnöm  az   apai   marker  allélek gyakoriságát a kimutatást befolyásoló tényezők korrigálása után. Meg kell határozzam a kakasallélek gyakoráságának egyedcsoportok között megfigyelhető különbségét. Az empírikus hiba meghatározása: Meg   kell   határoznom   azt   a   varianciát,   melyet   az   allélgyakorisági különbségek   akkor   is   mutatnának,   ha   nem   befolyásolná   őket   egy genetikailag   kapcsoltan   öröklődő   QTL,   az   értéküket   csak   a   véletlen alakítaná. Hipotézisvizsgálatok: A   vizsgálatok   különböző   szintjein   meg   kell   fogalmaznom   azokat   az alapfeltételezéseket melyek teljesülését statisztikai próbákkal igazolom. Meg kell határoznom a statisztikailag igazolható eredmények csoportját. A valós eredmények becslése: Meg kell becsülnöm azoknak a valós eredményeknek a számát, melyek egy feltételzett QTL­el való genetikai kapcsoltságra utalnak.  FDR számítás: Meg   kell   határozzam   azt   a   téves   elfogadási   arányt,   melyet   még elviselhetőnek   tartok.   Meg   kell   határoznom   a   téves   eredmények mértékét az elfogadhatónak itélt adatok között. A kimutatás erejének meghatározása: A becsült valós eredmények számát össze kell vetnem az adott FDR szintig   elfogadott   eredmények   között   becsült   valós   eredmények számával. Ez az arány a kísérlet ereje, mely megmutatja, hogy mennyi 3

valós eredményt tudok kimutatni a becsült lehetőségekhez képest.

2. Anyag és módszer Először a Compact egér genetikai térképezésére kialakított állományán használtam   a   szelektív   genotípus   meghatározás   és   a   kevert   DNS módszereit [VARGA és mtsai, 1997], [SZABO és mtsai, 1998]. Ezen az állományon   teszteltem   a   módszer   alkalmazhatóságát,   hatékonyságát. Ebben   a   rendszerben   a   pool   mintákon   kapott   eredmények   csak   egy előszűrést jelentettek a markerlókuszok között. A poolba tartozó egyedek egyedi   genotípus   meghatározása   igazolta   és   támasztotta   alá   a   pool eredményeket   és   ezekből   kaptuk   magát   a   végeredményt   is.   Az   egyedi adatok tették lehetővé a fenotípusra hatással levő feltételezett Cmpt gén genetikai pozíciójának meghatározását. A   TETRA­SL   állományon   végzett   genetikai   térképezésben hasznosítottam   az   előző   állományon   kapott   tapasztalatokat.   Ebben   az esetben maguk a pool eredmények azok, melyekből végkövetkeztetéseket vonunk   le,   ezért   ezeket   az   adatokat   jóval   összetettebb   számítási módszerekkel jellemeztük, igazoltuk. 2.1. A keresztezés egyedei, vérminták, egyedi és kevert DNS minták Az   egér   keresztezés   ~8200   egyedet   számláló   F2   nemzedékén határoztam meg a vizsgálatra alkalmas csoportokat. A vizsgált fenotípust leginkább és legkevésbé mutató 100­100 egyed mintájából alakítottam ki a kevert DNS mintákat. A   TETRA­SL   állomány   esetében   a   genetikai   térképezést   az   apai vonalból  származó  egyes kakasok  F1 lányain  végeztem,  melyek  együtt ~32.000   vérmintát   jelentenek.   A   vizsgálatokra   azokat   a   családokat választottam ki, melyek utódai között a legnagyobb szórást tapasztaltam a fenotípusos értékek tekintetében. Ezekből a családokból kiválasztottam a 20  leghosszabb  (high  pool), és 20 legrövidebb (low  pool) ivarérési időt mutató   egyedek   és   ezek     mintáiból   preparálás   és   hígítás   után   egyenlő térfogatok hozzáadásával készítettem el a kevert DNS mintákat. A TETRA­SL állomány esetében a vérmintákból az általam kidolgozott 4

módszerrel DNS­t preparáltam.  Kidolgoztam egy olyan vérből kiinduló genomiális  DNS   preparálási   technikát,   amely   az   irodalomban   leírt   két módszert   ötvöz,   felhasználva   mindkettő   előnyös   elemeit  [MILLER   és mtsai, 1988] [LAHIRI és NURNBERGER, 1991]. 5 l jó minőségű, nem alvadt vér sejtes elemeinek lizálása (10 mM TrisHCl, 10 mM EDTA pH: 7,5; 10 perc; RT) után a sejtmagokat centrifugálással (~10000g, 3 perc) elkülönítettem   a   keletkezett   sejttörmeléktől,   majd   a  sejtmagokat  is feltártam és Proteinase­K kezeléssel emésztettem a DNS mellett jelenlevő fehérjéket (125,0 mM Tris pH:7,5; 62,25 mM KCl; 62,25 mM MgCl2; 6,225 mM NaCl; 2,5 mM EDTA; 0,6% SDS; 15 g/ml ProtK; 1 óra; 55 ° C).   A   feltárt   DNS­t   1/20   térfogatnyi   7,5   M   ammónium   acetát   és   1/2 térfogatnyi   túltelített   konyhasó   (5­6   M  NaCl)   oldattal   és   1   térfogatnyi izopropanollal  precipitáltam.  A   kicsapódott   DNS­t   centrifugálással (~10000g,   3   perc)   ülepítettem,   majd   1   térfogatnyi   70%­ot   etanollal végzett öblítés után beszárítottam és a pelletet 100 l térfogatba oldottam vissza.   A   DNS   tisztaságát   és   mennyiségét   fotometriás   eljárással állapítottam meg 280 és 260 nm hullámhosszon. A mintákat egységesen 0,05   g/l   koncentrációra   hígítottam   és   a   kevert   DNS   minták kialakításához illetve a PCR reakciókba közvetlenül ezeket használtam. 2.2. A vizsgálatokhoz felhasznált genetikai térképek, mikroszatellitek Az   egérnek   a   munkánk   kezdetekor   is   egységes   és   fejlett   genetikai térképe   volt,   mely   nagyszámú   már   feltérképezett   mikroszatellit   lókusz információit   tartalmazta.   Nem   okozott   tehát   nagy   gondot   annak   az   56 mikroszatellitnek   a   kiválasztása,   melyek   a   keresztezési   állományon informatívak voltak és a termékeik megfeleltek az alkalmazott elválsztási és kimutatási technika adottságaihoz. Nem   volt   ennyire   egyszerű   a   helyzet   a   tyúk   esetében.   Munkánk megkezdésekor   a   világ   három   nagy   baromfi­géntérképező   csoportja (Wageningen, Hollandia  [CROOIJMANS és mtsai, 1996],  [GROBET és mtsai, 1998]; East Lansing (ELMAP)  [CRITTENDEN és mtsai, 1993], USA; Compton, Nagy­Britannia [BUMSTEAD és PALYGA, 1992]) által készített   géntérképek   számos   helyen   különböztek   egymástól   a feltérképezett lókuszok és a kimutatott kapcsoltsági csoportok számában, 5

helyzetében. Kellet   tehát   készítenem   egy,   az   információkat   összesítő   genetikai térképet. A vizsgálandó régiók kiválasztásakor az ELMAP­ból indultam ki, mivel ez tartalmazta a legtöbb információt. Az összes olyan területen választottam mikroszatellit markert, melyeken legalább az egyik térkép információt   közölt   úgy,   hogy   a   markerek   közötti   távolság  kb.  30  cM legyen.   Vizsgálataimhoz  a  National   Animal  Genetic  Research  Program (NAGRP, USA) által  terjesztett mikroszatelliteket  használtam  [CHENG és CRITTENDEN, 1994], [CROOIJMANS és mtsai, 1997] 2.3. A PCR termékek elválasztása, a kimutatás körülményei A   felhasznált   mikroszatelliteknél   a   primerek   és   a   termék szekvenciájából   kiindulva   számításokkal   meghatároztam   az   optimális feltapadási   hőmérsékletet.   Ilyen   módon   egyrészt  lehetőségem  van  arra, hogy a PCR reakció optimális hőmérsékletét kiszámoljam, másrészt előre jelezhetem azt, hogy a számításba vett reakció komponensek arányának megváltoztatásával mennyiben változik az optimális érték. A   komponensek   változtatásával   így   egységesítem   több   marker, eredetileg   különböző   optimális   körülményét,   ami   megkönnyítette   a munkámat. A   PCR   reakció   elegyében  felhasznált  anyagok   végkoncentrációja   a következőképpen alakult: •

10 ng/l Templát DNS

•

1x reakció puffer

•

200 nM mindkét primer

•

1­4 mM MgCl2 a kiszámolt optimális mennyiségtől függően

•

0,8 mM dNTP

•

0,05 u/l Taq polimeráz

Az egéren végzett poolminták vizsgálatakor a nuklotidok mellé radioaktív foszforral   jelölt   dCTP   kevertem   a   PCR   reakcióba,   és   a   termékeket akrilamid gélen választottam el és röntgen film segítségével jelenítettem meg [VARGA és mtsai, 1997]. A   tyúkon   kimutatott   mikroszatellitek   esetében   a   primerek   egyike 6

floreszcens festékkel van jelölve. A PCR reakció után a termékeket ABI Prism   310   Genetic   Analiser   kapilláris   elektroforézis   berendezéssel választottam el, amely a floureszcens festék által emittált sugárzás alapján detektálja a fragmenteket. 2.4. Az allél gyakoriságok meghatározása Az   egéren   végzett   vizsgálatok   esetében   az   elválasztás   után   képzett radiogramm   alapján   értékeltem   az   allélgyakorisági   különbségeket   a vizsgált csoportok között. A denzitometriás mérések alapján kerestem azt a mikroszatelitet, melynél  a legnagyobb volt az adott régióban az allél gyakoriságokban tapasztalt különbség,  ezek azok  a lókuszok, melyek a legközelebb helyezkednek el a feltételezett QTL­hez  [VARGA és mtsai, 1997]. A TETRA­SL állományon végzett vizsgálatok esetében a kakas allélek gyakoriságának   számítási   folyamata   szintén   a   PCR   reakcióban amplifikálódott   mikroszatellit   fragmentek   mennyiségéből   indul   ki.   Az elvélasztás   után   a   megfelelő   fragmenthossznál   detektált   fluoreszcens festék intenzitás alapján becsülöm meg az allél mennyiségét. A kimutatást befolyásoló   hatások   korrigálása   után   határozom   meg   a   kakasnak megfelelő   allélek   DNS   poolokban   becsülhető   gyakoriságát.   A következőkben   bemutatott   számításkat   csak   a   tyúk   állományon   kapott adatok elemzésekor alkalmaztam. A   PCR   során   keletkező   áltermékek   főtermékhez   viszonyított   relatív intenzitása,   a   főtermékben   meglevő   repetitív   régió   ismétlődésszámával van korrelációban [LIPKIN és mtsai, 1998], [MURRAY és mtsai, 1993]. Az   egyes   áltermék   típusok   relatív   intenzitását   a   bennük   meglevő ismétlődés   számmal   összefüggésben   miroszatellitenként   külön­külön vizsgáltam.   Az   adatpárokra   illeszthető   regresziós   egyenes   egyenletét felhasználva   kiszámítható   minden   főtermékhez   a   hozzá   tartozó áltermékek   relatív   intenzitása   még   akkor   is,   ha   esetleg   nincs   az   adott mérethez tartozó konkrét kísérleti eredmény. Ezekkel az értékekkel kell korrigálni azoknak a főtermékeknek az intenzitását melyekkel megegyező hosszúságú áltermék is képződött a PCR reakcióban. Másrészt   ennek   a   képletnek   a   segítségével   kiszámíthatom   az   összes áltermék   mennyiségét   és   ezzel   megnövelve   a   főtermék   mennyiségét 7

megkapom az ahhoz tartozó összes termék mennyiségét.

RI n ,−i =m⋅nb RIn, ­i: n: i: m: b:

az n ismétlődést tartalmazó főtermék "i"­edik áltermékének relatív intenzitása. a főtermékben megfigyelhető ismétlődések száma. a főtermék és álterméke közötti ismétlődésszám különbség (lehet: ­1; ­2; ­3). az adatpontokra illesztett egyenes meredeksége. az egyenes y tengely metszéspontja.

1. Képlet: Az áltermékek adataira illesztett regressziós egyenes egyenlete [LIPKIN és mtsai, 1998]. Az allélok korrigált intenzitásainak  ismeretében  meg  kell határozni a poolon   belüli   relatív   arányukat   (Fn).   Ezt   úgy   számíthatom   ki,   hogy   az adott allél korrigált össz intenzitását viszonyítom a reakcióban képződött összes termék korrigált intenzitásához. k

F n=CT n / ∑ CT n i=1

Fn: CTn: k:

az allél frekvenciája a poolon belül. a korrigált intenzitáshoz tartozó összes termék. a poolban megfigyelt allélok száma.

2. Képlet: A kakas allél poolon belüli gyakorisága [LIPKIN és mtsai, 1998]. Az   előbbi   számításokkal   meghatároztam,   hogy   a   vizsgálatokban tapasztalt intenzitás mekkora része (F) rendelhető a  kakas alléloknak (L: long,hosszú;   S:short,rövid)   )   megfelelő   fragmentekhez   az   egyes poolokban (H:high; L:low). Ezután kiszámítom a két utódcsoport között tapasztalható gyakoriságok különbségeit.

8

D L =F L H −F L L

D S =F S  H −F S  L = D DL: DS: D:

 D L−D S  2

Allél frekvencia különbség a hosszabb kakas allél esetében a két pool között Allél frekvencia különbség a rövidebb kakas allél esetében a két pool között A frekvencia különbségek átlaga.

3. Képlet: A kakas allél gyakoriságok különbsége [LIPKIN és mtsai, 1998]. 2.5. Az allél gyakoriság külö nbségek standard hibájának meghatározása A   stansard   hiba   számítása   három   elemből   épül   fel.   Meghatározom   a hosszabb (SE2DL) illetve a rövidebb  alléloknál  (SE2DS) a két pool között megfigyelhető   különbségek   standard   hibáját   és   ezekből   kivonom   a   két különbség között megfigyelhető kovariancia értékét (CovDLDS). 2

2

SE  D L SE  D S −2 ×Cov  D L D S   = SE  D 4 2

SE2(D): SE2(DL): SE2(DS): CovDLDS:

Az allél különbségek átlagának standard hibája A hosszabb allél közötti különbségek standard hibája A rövidebb allél közötti különbségek standard hibája A hosszabb illetve a rövidebb alél különbségek között megfigyelhető kovariancia

4. Képlet: Az empirikus standard hiba képlete [LIPKIN és mtsai, 1998]. A két allél különbség között megfigyelhető kovarianciát azokon a vizsgálati eredményeken határozom meg, melyek nem mutatnak statisztikailag igazolható kapcsoltságot. A rövidebb allélok között tapasztalt allél differenciák standard hibáját a következő számítással határozom meg.

9

SE 2  D S =SE 2  F S(H) SE 2  F S(L)  SE2(DS): A rövidebb allél közötti különbségek standard hibája 2 SE (FS(H)): A rövidebb allél high poolban megfigyelt frekvenciájának standard hibája 2 SE (FS(L)): A rövidebb allél low poolban megfigyelt frekvenciájának standard hibája

5. Képlet: A kakasnak megfelelő allél gyakoriság két pool közötti különbségének hibája [LIPKIN és mtsai, 1998]. A   megfelelő   adatok   behelyettesítésével   a   hosszabb   allélok   közötti különbségekre is kiszámolható ez a hiba (SE2(DL)). A   poolban   megfigyelt  allél   frekvenciák  hibáját   a   következőképpen határozom meg.

SE 2  F S(H) =V BS(H)V T VBS(H): VT:

A rövidebb allél binomiális mintavételezésből származó hibája a high poolban A technikai hiba

6. Képlet: A kakasnak megfelelő allél poolon belüli gyakoriságának hibája [LIPKIN és mtsai, 1998]. A megfelelő adatok behelyettesítésével a hosszabb allélok frekvenciájára is kiszámolható ez a hiba (SE2(FL(H))). Az   egyes  allél   gyakoriságok  standard   hibája   lényegében   két komponensből   áll   össze   a   binomiális   mintavételi   hibából,   illetve   a technikai hibából. 2.5.1. A binomiális variancia A binomiális eloszlás szabálya segítségével kívánom meghatározni azt a varianciát, mely akkor is megfigyelhető, ha nincs  genetikailag  kapcsolt QTL a marker mellett, az allél eltérés csak a véletlenből adódik. [0,25 / N (H) M S 1−M S ] V BS(H)= 4 N(H): MS:

Az egyedek száma a high poolban A rövidebb allél becsült gyakorisága a tyúkok között

7. Képlet: A binomiális mintavételezésből származó hiba [LIPKIN és mtsai, 1998]. 10

Ennek a hibaelemnek az értéke egyrészt függ a poolba sorolt egyedek számától, másrészt a tyúkoktól örökölt, kakasszerű allélek arányától. Az előbbi   adott,   míg   az   utóbbit   számítani   kell.   Amennyiben   a   poolban megfigyelhető   két   kakasra   jellemző   allél   gyakoriságának   összege meghaladja az összes allél gyakoriság 50%­át, akkor a többlet a tyúkoktól kell,   hogy   származzon.   Ez   alapján   becsülöm   a   poolban   megfigyelhető, tyúkoktól származó, kakasra jellemző allélok gyakorisága (ML; MS). M L =F L(H)F L(L)−0,5  ; M S =F S(H)F S(L)−0,5 8. Képlet: A kakasra jellemző allélok becsült gyakorisága a tyúkokon belül [LIPKIN és mtsai, 1998] 2.5.2. A technikai hiba Ha nem megfelelően készítjük el a pool mintákat,  a bennük szereplő egyedek genotípusai nem egyenlő arányban  képviseltetik magukat, ami befolyásolja az allélek poolon belül megfigyelt gyakoriságát. Az   egér   vizsgálatok   esetében   a   pool   vizsgálatok   után   a   kevert   DNS minták   kialakításakor   kiválsztot   csoportot   egyedileg   is   megvizsgáltuk adott   mikroszatellitekre.   A   feltételezett   QTL   egyedi   genotípusokból következtetett   pozíciója   igazolta,   pontosította   a   poolminták eredményeiből   következtetet   kromoszóma   szakaszt.   A   pool   minták megefleleően   reprezentálták   a   csoportokba   tartozó   100   100   egyed genotípusát [SZABO és mtsai, 1998]. A TETRA­SL vizsgálatok esetében jóval kisebb, 20­20 egyedből álló csoprtokból   képeztünk   poolokat.   Mivel   így   ez   egyedek   részaránya nagyobb,   ezekben   az   esetekben   jóval   nagyobb   lehet   a   rossz összekeverésből származó torzító hatás. Több esetben meghatároztam a poolhoz   tartozó   egyedek   markerlókuszon   megfigyelt   genotípusát egyedileg és az ebből kiszámolt allél gyakoriságokat összevetettem azzal, amit   a   pool   vizsgálatban   kaptam.   A   két   érték   között   megfigyelt különbségből származó variancia lesz a technikai hiba egyik komponense. 280   adatpárt   tudtam   összevetni   az   egyedi   genotípus   és   a   kevert   DNS módszer között. Az adatok között tapasztalt variancia 0,0043­nak adódott. A másik technikai hiba elem, melyet a TETRA­SL vizsgálatok esetében határoztam   meg  az  allél   gyakoriságot  kimutató   lépések   egységessége, 11

ismételhetősége.   Ezt   a   technikai   hibaelemet   az   egyedi   vizsgálatok eredményéből becsülöm. Azt feltételeztem, hogy az egyedileg kimutatott kakas allélok arányában megfigyelhető variancia megmutatja a kimutatás hibáját,   ez   a   hiba   megjelenhet   a   pool   mintákban   megfigyelt  allél intenzitások  vizsgálatakor is. Összesen ~3000 egyedi genotípus adatból képzett   131   csoportban   vizsgáltam   a   kimutatás   ismételhetőségét.   A csoportokban megfigyelhető varianciák átlaga 0,0012. A   két   elemet   összeadva   a   kísérletben   a   technikai   hibából   származó variancia 0,0055­nek adódott. 2.6. A kísérleti eredményekkel végzett hipotézisvizsgálatok Az   egéren   végzett   vizsgálatok   esetében   a   markergéneken   kapott eredményeket az egyedi genotípusok felhasználásával végzett haplotípus elemzéssel igazoltam, pontosítottam. Ezért a pool eredmények szatisztikai vizsgálatára nem volt szükség. A   TETRA­SL   vizsgálatok   esetében   azonban   a   poolmintákon   kapott adatokból   közvetlenül   következtetek   a   feltételzett   QTL   helyzetére. Ezekben az esetekben ezért igazolnom kell a kapott eredményeket. 2.6.1. A kakas­marker eredmények statisztikai vizsgálata Statisztikai   döntésemben   alaphipotézisem,   hogy   a   high   és   low   pool között nincs különbség a kakastól örökölt markerallélok megoszlásában (D=0),   az   adott   markergén   nincs   kapcsoltságban   a   tulajdonságot meghatározó QTL­el. Alaphipotézisemet elvetem akkor, ha ZD a kísérleti hibával standardizált különbség nagyobb, mint a standard normál eloszlás statisztikai biztonsági szintnél vett értéke.  D Z D = Z 1−/ 2  SE  D SE(D): Z1­α /2:

α:

D standard hibája A standard normál eloszlás ordinátájának az a pontja, ahol az eloszlás ­∞ és Z1­α /2 közötti területe egyenlő 1­α/2­vel. tévedési valószínűség

9. Képlet: A kakas­marker teszteken alkalmazott z­próba [LIPKIN és mtsai, 1998]. 12

2.6.2. A markereken összesített eredmények statisztikai vizsgálata Egy   adott   mikroszatelliten   kapott   ZD  értékek   négyzetösszegeit,   a  χ 2 eloszlás α­nál vett értékével hasonlítom össze. Alaphipotézisem ebben az esetben   is   az,   hogy   az   adott   mikroszatelliten   m   kakas   összesített eredménye  nem mutat kapcsoltságban QTL­el és ezt a feltételezésemet elvetem, ha m

∑ Z i2D 2 , d.f.=m i=1

ZD: χ2α: α: m:

a próbastatisztika értéke a Chi eloszlás értéke α­nál tévedési valószínűség a próba szabadságfoka.

10. Képlet: A markereken alkalmazott illeszkedésvizsgálat [LIPKIN és mtsai, 1998]. 2.7. A hipotézis vizsgálatokban kapott eredmények értékelése 2.7.1. A valós eredmények számának értékelése Közvetett   módon   is   meg   tudom   becsülni   a   kísérletemben   meglevő ténylegesen valós eredmények számát. Mivel a valós eredmények QTL hatást mutatnak, ezért a hipotézis vizsgálatok során kiszámolt P értékek nem   véletlenszerűen   oszlanak   el   0   és   1   között,   hanem   az   alacsony   P értékek között lesznek. Ezek számának egyszerű kiszámítási módja, ha a 0,5   feletti   P   értékek   számának   kétszeresét   levonom   az   összes   kísérlet számából,   ekkor   megkapom   az   alacsony   P   tartományban   meglevő többletet. 2.7.2. Az FDR számítása Sok   vizsgálatot   végezve   jelentős   lehet   a   tévesen   elvégzett hipotézisvizsgálatok száma. A téves felderítési arány (false discovery rate FDR [WELLER és mtsai, 1998]) segítségével meg tudom becsülni, hogy eredményem hányad része lehet tévesen elvetett hipotézis. Amennyiben   eldöntöm,   hogy   vizsgálatainkban   q   szinten   kívánom meghatározni   az   eredményeink   között   a   tévesen   elvetett   hipotézisek számát   ­   ekkora   FDR  értéket   kívánok   megengedni   ­,   akkor   keresem   a 13

növekvő   P   szerint   rendezett   sorból   azt   a   legmagasabb   i=t   sorszámmal rendelkező P(t) értéket, melynél még igaz, hogy qn⋅P t  /t 11. Képlet: FDR (false discovery rate). A téves döntések száma az első i vizsgálat között a növekvő sorba rendezett P listából [BENJAMINI és mtsai, 2001] Ez az a pont ahol az első i elvetett hipotézis között még kevesebb mint q téves eredmény van. Mosig  és  munkatársai  szerint   abban   az   esetben,   ha   a hipotézisvizsgálatok  között  az   elfogadott  hipotézisek  száma   nagy,   ez   a számítás nem teljesen kielégítő, mivel a téves döntések aránya az összes hipotézis száma alapján van megítélve (nP(t)) [MOSIG és mtsai, 2001]. A kísérletben lesznek olyan eredmények, melyek QTL hatását mutatják, valós eredmények (n1) és lesznek olyanok, melyek nem mutatnak QTL hatást,   nem   valósak   (n2).   Mivel   a   tévesen   elfogadott   hipotéziseket valójában nem mutatnak QTL hatást, nem valósak ezért pontosabb, ha a téves felderítési arányt a következőképpen határozzuk meg: qn 2⋅P t  /t 12. Képlet: AdjFDR (adjusted false discovery rate). A téves döntések pontosított száma az első i vizsgálat között a növekvő sorba rendezett P listából [MOSIG és mtsai, 2001]. 2.8. A kimutatás ereje Ha öszevetem a közvetett módszerrel becsült valós eredmények számát azoknak   az   eredményeknek   a   számával,   melyeket   az   elemzések   során igazolhatónak   és   valósnak   tartok,   akkor   képet   kaphatok   arról,  hogy   az elméletileg   feltételezetthez   képest   mennyi   eredményt   tudok   kimutatni, vagyis mekkora a kimutatásom ereje.

14

Q=nm / n1 n m=t−n2 ⋅P t  Q: nm: n1: n2: P(t):

A kimutatás ereje Az adott FDR szintig elvetett hipotézisek közül a valós eredmények száma Az elvetett hipotézisek becsült száma Az elfogadott hipotézisek becsült száma A hipotézis vizsgálatokban kapott azon P érték, ahol még igaz a 11. illetve 12. képlet

13. Képlet: A kimutatás erejének meghatározása

3. Eredmények Mivel   az   egér   géntérképezési   munka   mintegy   előkísérlete   volt   a tyúkállományon   tervezett   kísérleteknek,   ezért   az   egéren   végzett vizsgálatok   eredményei   nem   mutatom   be   részletesen   csak   azokat, melyeket hasznosítani tudtam a tyúkon végzett munkában. 3.1. Térképezési populáció kialakítása, szelektív DNS poolozás Az   egér   vizsgálatok   esetében   alkalmazott   szelektív   genotípus meghatározás   módszerével   ~8200   ­ról   200­ra   csökkentettem   a vizsgálandó   minták   számát.   Ezt   a   mennyiséget   is   drasztikusan   tovább csökkentettem a kevert DNS eljárással, így csak két minta vizsgálatával kellett elvégezni a nagy léptékű genetikai térképezést [VARGA és mtsai, 1997]. A   TETRA­SL   vizsgálatok   esetében   is   alkalmaztam   a   szelektív   DNS pool módszerét azzal a különbséggel, hogy itt a térképezési állomány több független   családból   áll   össze,   ezért   több  DNS  poolt   is  kellett   képezni. Meghatároztam   annak   a   24   kakasnak   és   a   hozzájuk   tartozó   kb.   2400 utódnak   a   szubpopulációját,   melyen   a   legnagyobb   hatékonysággal végezhető a tulajdonság hátterének felderítése. A szelektív genotípus meghatározás elméletének megfelelően az egyes családokon belül a 20 legrövidebb és a 20 leghosszabb ivarérést mutató egyedet   választottam   ki.   Ezzel   méginkább   megnöveltem   annak   a valószínűségét, hogy a csoportok között az egyedek QTL genotípusa eltér. Sikerült tehát a genetikai térképezés szempontjából legnagyobb gentikai 15

információt   hordozó   utódcsoportokat   elkülöníteni   és   a   vizsgálandó egyedek számát 40% ra csökkentenem. Elkészítettem   mindkét   egyedcsoport   DNS   pool   mintáját,   így családonként nem 40 egyedet kell genotipizálnom, hanem csak két mintát kell vizsgálnom és ezeken belül becsülni az apai allélek gyakoriságát. Összességében tehát a szelektív DNS pool módszer alkalmazásáva 100­ ról 2­re csökkentettem a családonként vizsgálandó minták számát. Ez a teljes   kísérletre   vetítve   azt   jelenti,   hogy   az   elvégzett   671 családvizsgálatnál   a   több   mint   67.000   genotipizálás   helyett   csak   1342 pool eredménnyel végeztem el a kapcsoltsági vizsgálatokat. 3.2. DNS izolálás Kidolgoztam   egy   olyan   vérből   kiinduló  genomiális  DNS   preparálási technikát, mellyel sikerült a vizsgálatokhoz szükséges nagy mennyiségű vérmintából   gyorsan,   alacsony   költség   mellett,   jó   minőségű genomiális DNS­t   izolálni.   Az   5   l   vérből   preparált,   100   l   végtérfogatú   minták átlagos   koncentrációja   0,71   g/l­nek,   tisztasága   pedig   1,74­nek (OD260/280) adódott. 3.3. A genetikai térkép, markerek Sikerült   összeállítanom   egy   olyan   „konszenzus”   térképet,   amely   44 kapcsoltsági csoportot tartalmazott, és ezek összesen 3824 cM genetikai hosszúságú   örökítő   anyagot   mutattak.   Ezeken   meghatározható  kb.  400 rendelkezésemre álló mikroszatellit marker pozíciója. Az idő közben megjelent Consensus2000 térkép adatai alapján frissített genetikai   térkép   26   kromoszómát   és   27   kapcsoltsági   csoportot   foglal magában, összesen 4200 cM genetikai hosszúságot mutat. Kétszáznál is több mikroszatellit  markert választottam ki a  kísérletek során a genetikai térképen elfoglalt pozíció alapján, amelyekből több mint 160­at vizsgáltam meg a kísérleti populáció kakas egyedein.  Összességében   105   mikroszatellit   marker   lókusszal   a   legfrissebb Consensus2000 genetikai térkép által mutatott 4200 cM távolságból 3442 cM­t  tudtam  kapcsoltsági vizsgálatokat végezni, mely a teljes genetikai információnak több mint 82 %­át lefedi. Ezek között az átlagos genetikai 16

távolság   20   cM   ami   azt   jelenti,   hogy   egy   feltételezett   QTL   lókusz legfeljebb   átlagosan   10   cM   távolságra   lehet   egy   szomszédos markerlókusztól. 3.4. Egyedi genotípus eredmények a vizsgált marker lókuszokon Az   egér   kísérletben   azokon   a   lókuszokon   végeztem   el   az   egyedi genotípizálást,   melyeken   a   pool   vizsgálatok   alapján   kapcsoltságot tételeztem fel. Az egyedi eredmények itt pontosították, alátámasztották a pool adatokat [VARGA és mtsai, 1997], [SZABO és mtsai, 1998]. Mivel tehát ebben a  rendszerben  az  egyedi  genotípus  eremények  egy további lépést jelentettek és nem a poolokkal végzett genetikai térképezés részei, ezért az ezeket nem részletezem. A   TETRA­SL   állományon   megvizsgált   162   mikroszatellit   markeren összesen több mint 3000 kakas genotípus eredményem van és ezek között a heterozigóta kakasokon részaránya mikroszatellitenkénti átlagban 0,45 volt.   Ez   az   érték   az   egyes   kakasok   esetében   0,33   és   0,53   között   volt amiből általánosságban levonható az a következtetés, hogy a kakasokhoz tartozó valamennyi családban hasonló hatékonysággal tudom elvégezni a vizsgálatokat ezeken a markerlókuszokon. 3.5. A markerallélok áltermékei a tyúk vizsgálatok alapján A vizsgálataim során azt tapasztaltam, hogy n­1, n­2, n­3 és nagyon ritkán n­4  hosszúságú   (n:   az   ismétlődések   száma   a   mikroszatellit szekvenciájában) áltermékek képződése mutatható ki. A mikroszatellitek nagyban   különböznek   egymástól   az   áltemékeik   tekintetében. Kiszámoltam,   hogyan   viszonyul   a   n­1,   n­2,   n­3  valamint   n­4  áltermék   a főtermék mennyiségéhez a különböző mikroszatellitek esetében, az eltérő mérettartományokban   (különböző   n   esetében).   Az   így   elkészített regressziós egyenesek egyenletét használtam fel a kísérletekből származó alapadatok korrigálására. 3.6. A pool mintákon végzett vizsgálatok Az egér vizsgálatok esetében 56 mikroszatellit markeren végeztük el a pool vizsgálatokat, melyek mindegyik esetben a populációban szegregáló 17

két   szülői   allél   egyértelműen   meghatározható   és   elkülöníthető   volt [VARGA és mtsai, 1997]. A tyúkon végzett kapcsoltsági vizsgálatokba bevont 109 mikroszatellit markeren   összesen   671   vizsgálatot   végeztem   a   kiválasztott   családok egyedeiből   képzett   high   és   low   pool   mintákon.   Minden   esetben egyértelműen   meghatározható   volt   a   kakasra   jellemző   allél.   Minden esetben jól elkülönültek a mikroszatellit allélra jellemző fragmentméretek a   képződött   áltermékektől,   a   korrekció   minden   esetben   egyértelműen elvégezhető volt. A vizsgálatokban először meghatároztam a pool mintákból kimutatott mikroszatellit   allélok   főtermékeit.   A   főtermékeknek   megfelelő   csúcsok azonosítása után elvégeztem az adott mikroszatellitre jellemző áltermékek miatt   szükséges   korrekciókat.   Megbecsültem   a   kakastól   örökölt markerallélok   gyakoriságát   a   poolmintákon   belül.   Kiszámoltam   a hosszabb és a rövidebb kakas allélnak megfelelő allél gyakoriságok két pool között megfigyelhető különbségét (DL, és DS). Ennek két értéknek az átlaga lesz a további számításokk alapadata (D). 3.7. Az empirikus standard hiba meghatározása Az   ez   után   bemutatott   számításokat   csak   a   tyúkállományon   kapott eredmények esetében végeztem el. Az   empirikusan   meghatározott   standard   hiba   alapvetően   három komponensből   áll:   a   binomiális   mintavételezésekből   származó varianciából,   a   technikai   hibaelemekből   és   a   DL  és   DS  értékek   között megfigyelhető kovariancia értékéből. Utóbbit azokban a vizsgálatokban határoztam   meg,   melyek   nem   mutatnak   statisztikailag   igazolható kapcsoltságot. A   vizsgálatok   egyharmadánál   a   tyúkokban   becsült   “kakasszerű”   két allél gyakorisága 1/3 és 2/3, vagy annál még közelebbi arányt mutatott közelítve az 1/2; 1/2 arányt. Az ebből származó binomiális mintavételi variancia 0,055 és 0,0625 között mozog ezek esetében, ami jelentősnek mondható. Két elem befolyásolja a technikai hiba mértékét a pool vizsgálatokban. Az egyik a poolok összeállításakor fordulhat elő,  a másik a poolokban 18

meglevő allél gyakorisági különbségek kimutatásának ismételhetőségéből adódik. A   poolok   összeállításából   származó   hiba   meghatározásához   negyven kakas­marker   vizsgálatban   összesen   280   adatpárt   tudtam   összevetni   az egyedi   genotípus   és   a   kevert   DNS   módszer   között.   Az   adatok   között tapasztalt variancia 0,0043­nak adódott. Ekkora varianciával járul hozzá tehát becslésem szerint a poolok kialakításakor felmerült hiba az összes technikai hibához. A ~3000 kakas egyedi genotípus eredményből mikroszatellitenként és azon belül genotípusonként képzett összesen 131 csoportban vizsgáltam a kimutatás   ismételhetőségét.   A   csoportokban   megfigyelhető   varianciák átlaga 0,0012­nek adódott. Ezt az értéket használtam fel a technikai hiba második elemeként. A   két   elemet   összeadva   a   kísérletben   technikai   hibából   származó variancia 0,0055­nek adódott. Ezt mint konstans értéket adtam hozzá a kakas­marker   vizsgálatok   során   egyedileg   meghatározott   binomiális variancia elemhez és ezekből az alapadatokból határoztam meg minden kísérletre külön­külön az empirikusan standard hibát. Miután   a   standard   hiba   egyik   komponensét,   a   DL  és   DS  közötti kovarianciát épp azokon az eredményeken kell számolni, melyekre maga a standard hiba vonatkozik, ezért iterációs megközelítést alkalmaztam. Az elfogadott hipotézisek csoportján belül az empirikus hiba átlaga 0,1250. 3.8. A pool vizsgálatokból származó eredményeken végzett hipotézisviszgálatok és azok elemzése A D értékékek vizsgálatára z­próbát alkalmaztam. A pool vizsgálatban kapott allél különbségek átlagát (D) elosztottam a standard hibával SE(D) és   az   így   standardizált   értékkel   végeztem   el   a   statisztikai   próbát.   Az iterációs számítás végeredményeként 45 pool vizsgálat esetében vetettem el nullhipotézisemet 0,05 tévedési szint mellett és 18 esetben 0,01 szint mellett.   Ennyi   eredményt   tartok   statisztikailag   igazolhatónak   az   adott tévedési szintek mellett.  A   671   pool­marker   vizsgálatban   39   eredménnyel   van   több   a   P<0,5 tartományban ahhoz képest, mintha az adatok egyenletes oszlanának meg 19

0  és  1  között.   Becslésem   alapján   ennyi   valós  eredmény   van  az   összes vizsgálat között. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a marker mellett egy, a tulajdonságot befolyásoló QTL van, bár nem mindegyik került a szignifikancia szint alá. 3.9. A markereken összesített adatok és hipotézis vizsgálatok eredményei és azok elemzése Négy   mikroszatellit   esetében   csak   egy   vizsgálati   eredménnyel rendelkezem  (ADL0235,   LEI0098,   MCW0014,   MCW0217).   Így   105 marker esetében tudtam összesítve értékelni kettő vagy több eredményt, melyek egységességét χ2 ­próbával ellenőríztem. Tizenkettő mikroszatellit marker esetében vetettem el nullhipotézisemet 0,05 szinten és 7 esetében 0,01 szinten, ezek statisztikailag igazolhatóak, viszont az alacsony (<0,5) P tartományokban, egy egyenletes eloszláshoz képest megfigyelt többlet alapján 13 valós eredményt tudok becsülni. Az FDR számítások adatai azt mutatják, hogy a hipotézisvizsgálatokban elfogadott eredmények száma túlértékelt. Még 0,2 téves felderítési arány mellett is csak 7 vizsgálat mondható elfogadhatónak és ezek közül is csak 6 a valós. Nem csökken jelentősen az elfogadhatok száma az alacsonyabb FDR szinteken sem. A 0,05 és 0,1 FDR szintekhez tartozó eredmények nem  különülnek   el,  mindekettőhoz   ugyanaz   a  kritikus  P érték   tartozik, ugyanúgy   5   eredményt   tarthatok   elfogadhatónak   valamint   valósnak   is mindkét esetben. 3.10. A kimutatás ereje Mivel   a   markeren   összesített   vizsgálatokban   a   0,05   és   0,1   FDR szintekhez tartozó kritikus P érték azonos, ugyanannyi eredményt mutatok ki,   ezért   a   kimutatás   ereje   is   azonos.   Mindkét   esetben   a   feltételezett eredmények közül csak 38%­ot tudok valósnak kimutatni, 13­ól 5­öt. A 0,2   FDR   szintet   alkalmazva   sem   növekedik   meg   jelentősen   a   valós eredmények aránya, 7 eredményből 6­ot tartok valósnak. Így a kimutatási erő 47%­ra való növekedése sem jelentős. Mindösszességében azt lehet mondani,   hogy   bár   alacsony   hatékonysággal   tudom   csak   kimutatni   a feltételezett   valós   eredményeket,   de   az   igazolt   eredmények   döntő többsége valós. 20

3.11. Új tudományos eredmények 1.A     térképezési   populáció   kialakítása   a   szelektív   DNS   pool   módszer  alkalmazása, genomiális DNS preparálás: A TETRA­SL állományon meghatároztam a teljes keresztezési anyak kb. 8%­át kitevő térképezési populációt, melyen a fenotípusos variancia alapján a leghatékonyabban elvégezhető a genetikai térképezés. A   szelektív   DNS  poolozás   módszerével   elértem,   az   egér   vizsgálatok esetében hogy a térképezési állományok öszes egyedéhez képest az egér vizsgálatoknál   kb   1500­szor,   a   tyúk   vizsgálatoknál   pedig   kb. 50­szer kevesebb minta vizsgálatát kell elvégeznem ahhoz, hogy a kapcsoltsági értékeléseket megfelelően el tudjam végezni. A   TETRA­SL   állományon   végzett   vizsgálatokhoz   saját   fejlesztésű módszerrel   megfelelő   mennyiségű   és   minőségű   DNS­t   izoláltam   a lehető legkevesebb veszélyes anyag felhasználása mellett. 2.Genetikai térkép kialakítása, az alkalmazott markerháló:     Meglevő   adatok   felhasználásával   szerkesztettem   egy   tyúk   genetikai térképet, melyet idő közben többször frissítettem. Ha   az   irodalomban   elfogadott   30   cM­ra   becsülöm   azt   a   genetikai távolságot, melyen egy markerlókusszal ellenőrízni tudom a genetikai kapcsoltságot   akkor   elmondhatom,   hogy   a   tyúk   vizsgálatok   esetében alkalmazott   genetikai   térkép   által   mutatott   terület   82%­án   van értékelhető   vizsgálati   eredményem.   105   markeren   több   család eredményét összesítve vizsgálhattam a kapcsoltsági eredményt. 3.Kakas genotípusok, a vizsgálandó családok száma, pool vizsgálatok:     A kakas mintákon a 162 mikroszatelliten végzett több mint 3000 egyedi genotipizálás   eredményeként   elmondható,   hogy   az   egyes   kakasok esetében a markerlókuszokon tapasztalt heterozigozitási értékek 0,33 és 0,53   között   mozognak.   A   kapcsoltsági   vizsgálatokba   bevont   109 markerlókuszon a heterozigozitás 0,51­nek adódott. A TETRA­SL állományban  109 mikroszatellit  lókuszon,  671 high és low pool eredményen kimutattam az öröklődő mikrozsatellit elléleket, melyek   a   kakasra   illetve   a   tyúkokra   jellemzőek.   Meghatároztam   a kakasallélek   között   tapasztalható   gyakorisági   különbséget   és   a különbségek átlagát. 4.Hipotézis     vizsgálatok,   a   kísérletben   meglevő   valós   eredmények  21

számának becslése: A családok poolmintáin végzett allélgyakorisági különbségek átlagára felállított   alaphipotézisem   volt,   hogy   ez   a   különbség   nulla. Alaphipotézisem   helyeségét   egymintás   z­próbával   teszteltem. Számításaim   szerint   a   105   mikroszatellit   esetében,   melyeknél   több eredmény   is  összesíthető   0,05   tévedési   valószínűséget   alkalmazva  12 mikroszatellitnél feltételezem, hogy kapcsoltan öröklődik QTL­el. Becslésem szerint a markeren összesített eredmény számításba bevont 105 mikroszatellit lókusz között 13 olyan eredmény becsülhető a teljes kísérletben, mely kapcsoltságot mutat. Ezzel a módszerrel közvetett módon megbecsültem a valós eredmények számát. 5.FDR kalkulációk, a kimutatás ereje:     A kísérlet egészében megbecsült valós eredmények számát ­ mely 13­ nak   adódott   ­   összevetettem   azzal   a   számmal,   melyet   adott   FDR szinteknek   megfelelően   alfogadott   eredmények   között   becsültem valósnak, ezzel meghatároztam a kimutatás erejét. FDR=0,05   szinten   5   eredményt   tudok   elfogadni,   melyek   közül valószínűleg mind (4,91) valós. Ezt összevetve a korábban becsült 13 eredménnyel azt mondhatom, hogy a kimutatás ereje 0,38. FDR=0,2   szinten   7   eredményt   tudok   elfogadni,   melyek   közül   kb.   6 (6,07)   valós.   Ezt   összevetve   a   korábban   becsült   13   eredménnyel   azt mondhatom, hogy a kimutatás ereje 0,47.

4. Következtetések és javaslatok A   munkámban   bemutatott   módszer   alkalmas   mennyiségi tulajdonságokat   meghatározó   QTL­ek   felderítésére   az   állattenyésztés gyakorlata   során   kialakított   állományon.   A   szelektív   genotípus meghatározás   és   a   kevert   DNS   módszer   együttes   alkalmazásával drasztikusan   le   lehet   csökkenteni   a   vizsgálandó   minták   számát,   tehát nagylétszámú térképezési állományon is igen hatékonyan lehet vizsgálatot végezni. A munka továbbvitele szempontjából egyrészt lehetőség van arra, hogy akár ugyanezen a kísérleti állományon egy másik értékmérő tulajdonságot meghatározó QTL­eket derítsünk fel. Másrészt lehetőség van arra, hogy 22

egy hatékonyabb kísérleti elrendezésel pontosabban lehessen behatárolni a   tulajdonság   kifejeződését   meghatározó   QTL­ek   helyzetét.  Ebben   a rendszerben   már   nem   kell   a   teljes   genomra   kiterjedő   kapcsoltsági vizsgálatokat végezni, a vizsgálandó régiókat be lehet szűkíteni az általam meghatározott pozícióknak megfelelően. Az így kimutatott közeli, szoros kapcsoltságban levő markerlókuszok alkalmasak   lehetnek,   hogy   a   megfelelő   QTL   allélek   öröklődését   a generációk   között   nyomon   követhessék   a   nemesítők,   ezéltal   állomány szinten befolyásolni tudják a tulajdonság megjelenését.

5. Publikációk ➢

Közlemények a Ph. D. témájában  Közlemény folyóiratban Varga L., Gy. Szabó, A. Darvasi, G. Müller, M.  Sass and M. Soller (1997) Inheritance and mapping of Compact (Cmpt), a new mutation causing hypermuscularity in mice. Genetics 147, 755­764. Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. and Varga L. (1998) A deletion in the myostatin gene causes the Compact (Cmpt) hypermuscular mutation in mice. Mammalian Genome 9, 671­672. 

Előadás

Varga L., Müller G., Major F., Schlote W, Sághy T., Szabó Gy, Fekete S., Soller M. (1993) Az egér kompakt mutációjának öröklésmenete és genetikai térképezésének terve. XI. Állat­biotechnológiai kerekasztal konferencia, Mosonmagyaróvár. Varga L., Müller G., Szabó Gy., Darvasi A. és Soller M. (1994.) Az egér   compact   mutációjának   térképezése.   A   magyar   genetikusok egyesületének III. konferenciája. Debrecen. p11. Varga L., Müller G., Szabó Gy., Darvasi A. és Soller M. (1995) Egy kiváló húsformákat mutató fenotipus genetikai térképezése. XI. Állat­ biotechnológiai Kerekasztal, Gyöngyös Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. és Varga L. (1998) A miosztatin gén deléciója okozza  a compact egér erőteljes izmoltságát. Magyar Biokémiai Egyesület Mol. Biol. Szakosztálya 3, 23

Munkaértekezlet. Sárospatak, május 11­14. Varga L., Szabó Gy., Dallmann G., Patthy L., Soller M. és Müller G. (1999)   A   miosztatin   gén   deléciója   okozza   a   compact     egér hipermuszkuláris   Cmpt   mutációját.   IV.   Magyar   Genetikai Kongresszus. Siófok, április 11­14. Szabó Gy., Korom E., Soller M. és Varga L. (2002) Az ivarérésre ható QTL­ek térképezése tyúkon. Magyar Biokémiai Egyesület Mol. Biol. Szakosztálya 7, Munkaértekezlet. Keszthely, 2002 május 14­17. Varga L, Müller G, Szabó Gy, Pinke O, Korom E, Kovács B, Patthy L és Morris S. (2003) A hiperizmoltság genetikai hátterének felderítése Compact   egéren.V.   Magyar   Genetikai   Kongresszus.   Siófok, 2003.április 13. 

Poszter

Korom E, Nagy T, Kovács B, Komlósi I, Mihók S, Szabó Gy és Varga L   (2003)   Tyúk   mikroszatellitek   felhasználása   pulyka   populáció genetikai   jellemzésére.   V.   Magyar   Genetikai   Kongresszus.   Siófok, 2003.április 13. ➢

Közlemények más témában  Közlemény folyóiratban Varga, L., Müller,  G.,  Szabó,  Gy., Pinke O,  Korom, E., Kovács,  B., Patthy,   L.   and   Soller,   M.   (2003)   Mapping   modifiers   affecting muscularity   of   the   myostatin   mutant   (MstnCmpt­dl1Abc)   Compact mouse Genetics, 165, 257­267. (IF: 4,48) Varga L, Pinke O, Müler G, Kovács B, Korom E, Szabó G és  Soller M. (2004):   Mapping   a   syntenic   modifier   on   mouse   chromosome   1 influencing   the   expressivity   of   the   Compact   phenotype   in   the myostatin   mutant   (MstnCmpt­dl1Abc)   Compact   mouse.   Genetics. 2004 Oct 1 [Epub ahead of print] 

Előadás

Tóth   P.,   Szabó   Gy.   és   Varga   L.   (1994)   Rhesus   majmok   rokonsági kapcsolatainak   meghatározása   etológiai   és   molekuláris   genetikai módszerekkel.   A   magyar   genetikusok   egyesületének   III. konferenciája. Debrecen. p25. 24

Szabó Gy., Takács E., Gera I., Bodó I. és Varga L. (1995) Háziállatok hatékony   származásellenőrzése   mikroszatellitekkel.   XI.   Állat­ biotechnológiai Kerekasztal, Gyöngyös. Tóth P., Szabó Gy. és Varga L. (1996) Determination of kinship and preferential   relationships   in   a   rhesus   group   by   behavioral   and molecular   genetic   methods.   XVIth.   Congress   of   the   International Primatological   Society   and   XIXth   Conference   of   the   American Society of Primatologists. Madison, Wisconsin USA. Varga L., Szabó Gy., Darvasi A., Müller G., Sass Miklós és Soller M. (1997) "Cmpt", ­ egy új, hústermelésre erősen ható gén felfedezése. XIII. Állat­biotechnológiai Kerekasztal, Salgótarján. Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. és Varga L. (1998)   A   Compact   egérben   az   újonnan   felfedezett   miosztatin   gén természetes   mutációja   okozza   a   fokozott   izmoltságot.   XIV.   Állat­ biotechnológiai Kerekasztal, Hódmezõvásárhely, október 15­16. Varga L., Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L. és Soller M (1999)   Miosztatin   mutáció   egérben   és   szarvasmarhában.   MTA Állatorvosi Bizottsága akadémiai beszámoló, Budapest, január 25. Varga L., Müller G. és Szabó Gy. (2002) Miosztatin modifikátor gének térképezése   egéren.   Magyar   Biokémiai   Egyesület   Mol.   Biol. Szakosztálya 7, Munkaértekezlet. Keszthely, 2002 május 14­17. Pinke O, Huszti K, Korom Et, Kovács B, Müller G, Szabó Gy, Varga L (2004) Komplex fenotípusos tulajdonságok feltérképezésre alkalmas populáció kialakítása egéren. Innováció, a tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában ­ Agrárgazdasági modellek a 21.   század   mezőgazdaságában   cimű   nemzetközi   konferencia   2004. április 16. Varga László, Pinke Orsolya, Müller Géza, Kovács Balázs, Korom Edit, Szabó   Gyula   (2004)   Térképezhető­e   a   szintenikus   modifikátor? Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 9. Munkaértekezletére Sopron, 2004 május 10­13 

Poszter

Kovács B, Korom E, Yue G. H., Szabó Gy, Orbán L és Varga L (2003) Mikroszatellit   markerek   izolálása   pulykából.   V.   Magyar   Genetikai 25

Kongresszus. Siófok, 2003.április 13. Korom   Edit,   Nagy   Tibor,   Kovács   Balázs,   Komlósi   István,   Mihók Sándor,   Szabó   Gyula,   Varga   László   (2003):Tyúk   mikroszatellitek alkalmazása   pulyka   populáció   genetikai   jellemzésére.   EU   Konform Mezőgazdaság és Élelmiszerbiztonság. 2003 jun.5. Gödöllő. Pinke   O.,   Huszti   K.,   Korom   E.,   Kovács   B.,   Szabó   Gy.   és   Varga   L. (2003) Komplex fenotípusos tulajdonságok feltérképezésére alkalmas speciális   populáció   lérehozása.   "BIOMODELLEK   2003 ­Laboratóriumi   állatok   biológiája,   tenyésztése   és   felhasználása" tudományos tanácskozás, 2003 november 13. Budapest Pinke   Orsolya,   Huszti   Katalin,   Korom   Edit,   Kovács   Balázs,   Szabó Gyula   Müller   Géza,   Varga   László   (2004)   A   Compact   modifikátor gének   finomfelbontású   térképezése   "Advanced   Intercross   Lines" speciális   populáció   segítségével.   Magyar   Biokémiai   Egyesület Molekuláris   Biológiai   Szakosztályának   9.   Munkaértekezletére Sopron, 2004 május 10­13.

26