SZENT ISTVÁN EGYETEM
A biotechnológiai módszereken alapuló növénynemesítés két új eszköze:a sáska proteináz inhibitor és a pPROGMO transzformációs vektor
Doktori értekezés Kondrák Mihály
Gödöllő 2005
A doktori iskola megnevezése:
Növénytudományi Doktori Iskola
tudományága:
Növénytermesztési és kertészeti tudományok
vezetője:
Dr. Virányi Ferenc egyetemi tanár, az MTA doktora SZIE, Mezőgazdasági és Környezettudományi Kar, Növényvédelmi Tanszék
témavezető:
Dr. Bánfalvi Zsófia tudományos tanácsadó, az MTA doktora Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont
........................................................... Az iskolavezető jóváhagyása
........................................................... A témavezető jóváhagyása
2
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE............................................................. 7 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS.................................................. 9 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................ 13 2.1. A transzgénikus növénytermesztés helyzete........................ 13
2.1.1. Transzgénikus burgonya fajták.................................................... 14 2.2. Rovarrezisztens transzgénikus növények............................ 16 2.2.1. Mikroorganizmus eredetű rezisztencia gének............................. 16 2.2.2. Növény eredetű rovar rezisztencia gének.................................... 18 2.2.2.1. Proteináz inhibitorok ............................................................... 19 2.2.2.2. α-amiláz gátlók......................................................................... 23 2.2.2.3. Lektinek és más növény eredetű rezisztencia gének................ 24 2.2.3. Állati eredetű rezisztencia gének............................................... 26 2.2.3.1. Az SGTI és SGCI....................................................................... 27 2.3. Markergén-mentes GM növények előállítása...................... 29 2.3.1. A ko-transzformáció és a markergének szegregációja............... 29 2.3.1.1. Ko-transzformáció két törzs két plazmid módszerrel............... 30 2.3.1.2. Ko-transzformáció egy törzs két plazmid módszerrel.............. 32 2.3.1.3. Ko-transzformáció több T-DNS egy plazmid módszerrel........ 32 2.3.2. Transzpozon-közvetítette génáthelyezés..................................... 33 2.3.2.1. A hasznos gén áthelyezése transzpozíció segítségével............. 34 2.3.2.2. A szelekciós markergén transzpozició általi eliminálása........ 35 2.3.3. Intrakromoszómális homológ rekombináció alkalmazása..........36 2.3.4.Helyspecifikus rekombináz-közvetítette markergén eliminilás......................................................................................... 37 2.3.4.1. Cre-lox rendszer....................................................................... 38 2.3.4.2. FLP-FRT rendszer................................................................... 39 2.3.4.3. Az R-Rs rendszer...................................................................... 40 2.3.5. A vektorgének beépülése............................................................ 42
3. ANYAG ÉS MÓDSZER.......................................................................... 45 3.1. Vegyszerek............................................................................................ 45 3.2. Plazmidok.............................................................................................. 45 3.3. Táptalajok............................................................................................. 45 3.4. Baktérium törzsek................................................................................. 46 3.5. A növények nevelése és fenntartása.................................................... 47 3.6. Burgonya transzformáció.................................................................... 48 3.7. Molekuláris biológiai módszerek.........................................................48 3.7.1. Plazmid DNS tisztítása.......................................................................... 48 3.7.2. Növényi DNS tisztítása.................................................................... 49
3
3.7.3. Növényi RNS tisztítása..................................................................... 49 3.7.4. Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel.................................... 50 3.7.5. Polimeráz láncreakció (PCR – Polymerase Chain Reaction)........ 50 3.7.6. DNS fragmentumok elválasztása és izolálása..................................... 50 3.7.7. DNS klónozás........................................................................................ 52 3.7.8. Plazmid DNS bejuttatása baktérium sejtekbe..................................... 52 3.7.9. Hibridizációs technikák...................................................................... 53 3.7.9.1 DNS blottolás a Southern hibridizációhoz..................................... 53 3.7.9.2. RNS blottolás northern hibridizációhoz......................................53 3.7.9.3. DNS jelölése radioaktív izotóppal.............................................. 53 3.7.9.4. Hibridizációs körülmények......................................................... 54 3.8 LIP gyors teszt ....................................................................................... 54 3.9. Burgonyabogár lárva fejlődésének vizsgálata.................................... 55 3.10. GUS aktivitás meghatározása............................................................ 55
4. EREDMÉNYEK.................................................................................... 57 4.1. Sivatagi sáska eredetű „kétfejű” proteináz inhibitort expresszáló burgonya vonalak előállítása és hatásuk a burgonyabogár (Leptinotarsa decemlineata) lárvákra.............................................................................................. 57 4.1.1. A "kétfejű" sáska proteináz inhibitor (LIP) klónozása bináris vektorba.......................................................................................... 57 4.1.2. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pCP60::LIP transzformációs vektorral............................................................. 57 4.1.3. LIP-et expresszáló transzgénikus burgonya vonalak izolálása.. 58 4.1.4. A LIP7, 9 és 13 transzgénikus vonalak hatása a burgonyabogár lárvákra etetési kísérletekben.......................... 60
4.2. A marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak előállítására alkalmas pPROGMO vektor létrehozása és tesztelése 63 burgonyában................................................................ 4.2.1. A pPROGMO36 konstrukció előállítása..................................... 4.2.2. A rekombináz működésének bizonyítása burgonyában........... 4.2.2.1. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pPROGMO36 vektorral........................................................... 4.2.2.2. Az nptII transzgén jelenléte és kópiaszáma a GUS pozitív transzgénikus vonalakban....................................................... 4.2.2.3. A rekombináz gén expressziójának vizsgálata...................... 4.2.2.4. Növényregenerálás 5-FC szelekcióval.................................. 4.2.2.5. A kanamicin szenzitív vonalak PCR analízise...................... 4.2.2.6. Az 5. számú transzgénikus vonal marker- és vektorgénmentes utódainak Southern hibridizációja............................
4
65 69 69 69 70 71 73
74
4.2.3. Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya vonalak előállítása tranziens szelekcióval.................................. 4.2.3.1. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pPROGMO36 vektorral és regenerálása.............................. 4.2.3.2. A GUS aktivitást mutató vonalak PCR analízise................. 4.2.3.3. A transzgén kópiaszámának meghatározása........................ 4.3. Új tudományos eredmények...................................................
77 77 80 84
5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK.........................
87
5.1. Sivatagi sáska eredetű tripszin és kimotripszin inhibitort expresszáló burgonya vonalak burgonyabogár lárvákra gyakorolt hatásából levonható következtetések........................... 5.2. Rekombinázon alapuló marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya előállításából levonható következtetések.................................................................................
77
87 89
6. ÖSSZEFOGLALÁS........................................................................
95 98
7. MELLÉKLETEK............................................................................
M1.. IRODALOMJEGYZÉK............................................................... M2. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK.............................................................
101 101 115
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..........................................................
119
SUMMARY..........................................................................................
5
6
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
α1-AT
α1-antitripszin, hasnyálmirigy tripszin inhibitor
α-AI
α-amiláz inhibitor
5-FC
5-fluorocitozin
bar
foszfinotricin-acetil transzferáz gén
Bt
Bacillus thuringiensis
CaMV35S
karfiol mozaik vírus promotere
CIM
kallusz indukáló táptalaj
codA
citozin-deamináz gén
CpTI
tehénborsó tripszin inhibitor gén
DEX
dexametazon
GFP
zöld fluorescens protein génje
GM
genetikai módosítás
GNA
hóvirág lektin
GST
glutation-S-transzferáz
GUS
β-glükuronidáz gén
HaSV
gyapottok-bagolylepke törpülési vírus
hpt
higromicin-foszfo-transzferáz gén
IHF
integrációs gazda faktor
int
integráz
ipt
izopentenil-transzferáz gén
Ki
gátlási állandó
LIP
sivatagi sáska kettőshatású PI, "locust inhibitory peptide”
LOX
lipoxigenáz
MAT
"multi-auto-transformation" vektor
MS
Murashige és Skoog táptalaj
MTI-2
mustár tripszin inhibitor 7
nptII
neomicin-foszfo-transzferáz gén
OCI
orizacisztatin-I
PCI
karboxipeptidáz inhibitor
PI
proteináz inhibitor
PLRV
burgonya levélsodró vírus
PPO
polifenol-peroxidáz
PsTI-2
borsó tripszin-kimotripszin inhibitor
PVY
burgonya Y vírus
RM
Murashige és Skoog táptalaj vitaminok nélkül
SbBBI
szója Bowman-Birk családba tartozó inhibitor
SbCPI
szója cisztein proteáz inhibitor
SbTI
szója tripszin inhibitor
SGCI
sivatagi sáska Schistocerca gregaria kimotripszin inhibitor
SGTI
sivatagi sáska Schistocerca gregaria tripszin inhibitor
SI
lép protináz inhibitor
SIM
hajtásindukáló táptalaj
SKTI
szója Kunitz tripszin inhibitor gén
szerpin
szerin proteáz inhibitor
TDC
triptofán-dekarboxiláz
TI
tripszin inhibitor
Ti
tumor indukáló
tms2
indolecetsav-hidroláz gén
8
1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A növénynemesítésben a biotechnológiai módszereken alapuló génbevitel, a genetikai módosítás (GM), egyre nagyobb mértékben alkalmazott eljárás. Ennek köszönhetően nagyobb terméshozamú, kártevő és kórokozó rezisztenciájú, fokozott abiotikus stressztűrő képességgel rendelkező, azaz a szélsőséges időjárási körülményeknek (fagy, aszály) jobban ellenálló, nagyobb tápanyag értékű fajták hozhatók létre. De a transzgénikus növényekkel szántóföldön nagy mennyiségben lehet gyógyászati és ipari molekulákat, alapanyagokat is előállítani, ami szélesíti a megújítható energiaforrások választékát. (HERREREESTRELLA, 2005). A termesztett GM növényeknek környezetvédelmi, ökonómiai és szociológiai hatása is van, segítséget nyújthatnak a fejlődő országok
agronómiai
és
gazdasági
problémáinak
megoldásában.
A
biotechnológia hozzájárulhat az élelmiszerbiztonság fokozásához, a gazdaságok bevételeinek növekedéséhez, valamint csökkentheti a termelési költségeket. A GM növények által termelt új produktumok a jövőben új lehetőséget és piacot teremthetnek. A zöld biotechnológia így nemcsak kikerülhetetlen gazdasági tényezővé válik, hanem alapja lehet a környezetbarát mezőgazdaságnak, és fontos szerepet játszhat a fenntartható fejlődés feltételeinek megteremtésében is (DUDITS, 2005). Az említett előnyöket, pozitívumokat azonban beárnyékolja az a tudományos bizonytalanság, ami a génmódosítás és annak humán- és állategészségügyi, valamint környezeti vonatkozásait illeti. Ennek ellenére az első GM, azaz transzgénikus fajta, kereskedelmi forgalomba kerülése óta eltelt tíz évben a GM növények termőterülete, valamint a köztermesztésbe vitt transzgénikus fajok és fajták száma folyamatosan gyarapszik. A burgonya (Solanum tuberosum L.), a búza, a rizs és a kukorica után, a negyedik legnagyobb mennyiségben termesztett élelmiszernövényünk.
9
A burgonyabogár (Leptinotarsa decemlineata), a burgonya legártalmasabb rovar kártevője. Az imágók és minden fejlődési stádiumban levő lárva, elsősorban a burgonya lombozatát, és alkalmanként, szárát fogyasztja. Ezáltal a fotoszintetizáló felület csökken, a növény tápanyag-előállítása és felhalmozása redukálódik. Mindez a gumók méretét és számát közvetlenül is befolyásolja, ezért a termés mennyisége csökken. Pedig a termés megvédhető lenne - a növényvédelmi
eljárásokon
kívül
-
rovarrezisztens
burgonya
vonalak
előállításával is. A burgonyabogárral szemben rezisztens GM burgonyának további károkozó elleni védelemre nincs szüksége. Ez a termelő, a fogyasztó és a környezet számára egyaránt hasznos. A rovarkárok biotechnológiai úton történő csökkentésének egyik lehetséges módja különböző proteináz inhibitorok növényi genomba vitele és megnyilvánítása. A növények által termelt proteináz inhibitorok gátolják a károkozók emésztő enzimeit, ezáltal csökkentik a károkat. Kísérleteink egyik célja az volt, hogy MALIK et al. (1999) által a sivatagi sáskából izolált tripszin (SGTI) és kimotripszin (SGCI) inhibitort „kétfejű” fehérje formában expresszáló transzgénikus burgonya vonalakat állítsunk elő és vizsgáljuk hatásukat a burgonyabogár lárváinak fejlődésére. A növény-transzformációt követően az idegen DNS csak kevés sejtbe tud integrálódni, a sejtek nagy része transzformálatlan marad. A kevés transzformált sejt kiválasztásához és fejlődésük támogatásához, a „hasznos” gén mellett, a transzformációs vektor szelekciós markergént is tartalmaz, ami legtöbbször egy antibiotikum vagy herbicid rezisztenciáért felelős gén. Az általánosságban használt szelekciós módszerek azonban több szempontból is hátrányosak. A szelekció során a nem transzformált sejtek elhalnak és gátolják a tápanyagok áramlását a transzformált sejtek felé, sőt még toxikus anyagokat is kibocsáthatnak. Ezek a negatív hatások csökkentik a transzgénikus sejtek osztódó és regeneráló képességét. Az antibiotikum rezisztencia gének szelekciós markerként való használata társadalmi ellenérzést is kivált, mivel ezek a gének a transzformációt és szelekciót követően a transzgénikus növényekben maradnak
10
és félő, hogy a termesztés során rokon fajokba is átkerülnek, esetleg patogén organizmusokba integrálódnak. Technológiai szempontból, a gyakorlatban, limitált az alkalmazott markergének száma, s ez korlátja lehet újabb gének transzformációval
történő
bevitelének,
és
a
transzgénikus
növények
keresztezésének. Ehhez jön még az a tény is, hogy a transzformáció során a genomba gyakran a transzformációs vektor egy része is integrálódik, ami átrendeződések forrása lehet. Ezért a génmódosítás során célszerű olyan eljárások, módszerek kifejlesztése és alkalmazása, amellyel marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növények állíthatók elő. Így a termesztésbe kerülő növények új elemként csak a hasznos gént fogják tartalmazni és ezáltal a GM növények termesztése nemcsak a kutatók és a termelők, hanem a társadalom és a környezet számára is elfogadhatóvá válik. Mindebből kiindulva munkánk másik célja az volt, hogy olyan új, a burgonyára, mint vegetatív módon szaporított növényre is alkalmazható transzformációs vektort hozzunk létre, amellyel egyszerre lehet marker- és vektorgén-mentes GM növényeket előállítani.
11
12
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1. A transzgénikus növénytermesztés helyzete Napjaink kemikáliákon alapuló növényvédelmi módszereit a jövőben kisebb energia és vegyszer igényű, környezetbarát mezőgazdaságnak kell felváltania. A cél megvalósítása érdekében hagyományos nemesítési és biotechnológiai eljárásokkal számos kár- és kórokozó rezisztens növényt hoztak és hoznak létre (AZZOUZ et al., 2005). Az első rovarrezisztens kukorica és gyapotfajta (MaimizerTM,
Novartis;
BollgardTM,
Monsanto)
1995-ben
került
köztermesztésbe. Azóta, a transzgénikus növénytermesztés előnyös agronómiai és ökonómiai tulajdonságai következtében, termőterületük, valamint a köztermesztésbe vitt transzgénikus fajok és fajták száma folyamatosan gyarapszik. 2004-ben a jóváhagyott, biotechnológiai eljárással nemesített növények becsült termőterülete globálisan 81 millió hektár volt. Tizenhét országban hozzávetőlegesen 8,25 millió gazdálkodó (90%-uk a fejlődő országokban él) termesztett transzgénikus növényeket (JAMES, 2005). Európában a GM növények kereskedelmi termesztésének akadályai elvileg megszűntek, az EU előírása alapján csak a termékeken kell feltüntetni a produktum GM voltát. Mégis az egyes államok további rendeletekkel küzdenek a GM növények szántóföldi termesztése ellen. Számottevő mennyiségben, Európában, csak Spanyolország termeszt GM növényeket, nevezetesen herbicid rezisztens kukoricát. Európát, a 17 „biotech” ország között, Spanyolországon kívül, Németország és Románia képviseli (www.nature.com). Jelenleg a világon köztermesztésben, ill. kereskedelmi forgalomban 20 növény faj 91 bejelentett transzgénikus fajtája van. Ezek túlnyomó többsége a kukorica, a szója, a repce és a gyapot GM változatai. Termőterülete alapján 2004-ben a GM szója volt a domináns, a biotechológiai eljárással nemesített 13
növények teljes területének 60%-át foglalta el (48,4 millió ha). Ez a szója összes termőterületének 56%-a. A GM kukorica termőterülete is gyorsan növekedett, elérte a 19,3 millió ha-t, ami a világon 143 millió ha-on termesztett tengeri termőterületének 14%-a. A harmadik helyen a 9 millió ha-on (a GM fajták termőterületének 28%-án) termesztett „biotech” gyapot volt, míg a GM repcét 4,3 millió ha-on, majdnem a repce termőterületének 1/5-én (19%) termesztették. A bevitt tulajdonságok alapján a herbicid toleráns növények a GM termőterület 72%-át, a rovarrezisztens növények a 19%-át, a mindkét tulajdonságot egyszerre hordozó gyapot és kukorica termőterülete pedig a maradék 9%-ot foglalta el (www.isaac.org/kc). 2.1.1. Transzgénikus burgonya fajták A burgonyát kb. 18 millió ha-on, több mint 150 országban termesztik, az össztermés: 311 millió tonna. Köztermesztésben a GM burgonyának négy fajtája van. Mindegyik rendelkezik burgonyabogár rezisztenciával, egyikük ezen kívül levélsodró vírus, másikuk pedig burgonya Y vírus rezisztenciát biztosító transzgéneket is hordoz (Monsanto Company). A burgonyatermesztésben az inszekticidek 34%-át a burgonyabogár kordában tartására használják. Inszekticidek nélkül ma már lehetetlen kereskedelmi mennyiségben burgonyát előállítani. A burgonyabogárral szemben több hatóanyag is alkalmazható, de a kártevő a védőszerek ellen képes rezisztenciát kifejleszteni. A burgonyabogár ellenállóságának javítására burgonyában az Atlantic, a Shepody, a Superior és a Russet Burbank fajtákba - a rovarrezisztens kukorica előállításához hasonlóan - integrálták a Bacillus thuringiensis (Bt) cry3A génjét (lásd 2.2.1. fejezet). A Russet Burbank Plus burgonya fajtát, a burgonyabogár rezisztencia mellett, a levélsodró vírussal szemben is rezisztenssé tették. A burgonya levélsodró vírus (PLRV) a luteovírusok csoportjába tartozó gömb vírus, melyet a zöld őszibarack levéltetű (Myzus persicae) terjeszt. Tünetei: a 14
csúcslevelek kanalasodása, törékennyé válása, klorotikus elszíneződése, az internódiumok
rövidülése,
valamint
az
amerikai
burgonya
fajtákban,
gumónekrózis (HORVÁTH, 1995). A GM növények rezisztenciáját a PLRV helikáz és replikáz doméneket kódoló régióinak burgonya genomba integrálása biztosítja. Az így módosított növényekben sem fertőző vírus molekulák, sem pedig patológiai tünetek nem alakulnak ki (www.agbios.com). A burgonya Y vírussal (PVY) szemben is genetikai módosítással állítottak elő rezisztens fajtákat. A PVY a potyvírusok közé tartozó, levéltetvekkel és fertőzött szövetekkel terjedő pálcika vírus. A PVY fertőzés a termést 10-80%kal is csökkentheti, mértéke a PVY törzstől, a gazdanövény toleranciájától, a fertőzés idejétől és a környezeti tényezőktől függ. A fertőzés jellemző tünetei a mozaikfoltosodás és, a levelek fonáki részén, az apró nekrotikus léziók megjelenése
(HORVÁTH,
1995).
A
PVY
köpeny
fehérje
génjével
transzformálva a burgonyabogár rezisztens GM Shepody és Russet Burbank fajtákat, rovar és PVY rezisztens vonalakat állítottak elő. A GM burgonya a vírus RNS genomját 95%-ban burkoló köpenyfehérjét termeli. A vírus rezisztenciát a homológia függő poszttranszkripciós géncsendesítés folyamata biztosítja, melynek során a citoplazmában mind a transzgén, mind pedig a virális köpenyfehérje RNS-e degradálódik (WATERHOUSE et al., 2001). Az előállított GM burgonya vonalak, rezisztenciájuk kivételével, az eredeti fajta külső és belső tulajdonságait hordozzák. Beltartalmi értékeik változatlanok, fogyasztásuk
allergiás
rovarrezisztencia
a
tüneteket
ragadozó
és
sem más
okoz.
A
Bt
toxin
nem-célfajokra
biztosította
nem,
csak
a
burgonyabogárra, és kisebb mértékben, a levéltetvekre mérgező hatású (www.agbios.com/dbase.php).
15
2.2. Rovarrezisztens transzgénikus növények A transzgénikus növények rovarrezisztenciáját legtöbbször a különböző eredetű entomotoxikus fehérjék expresszáltatása biztosítja. Az ellenállás fokozására a növényekbe
egyszerre
több
gént
is
integrálhatunk.
Eredetük
szerint
megkülönböztethetünk mikroorganizmusokból, növényekből és állatokból származó rovarrezisztencia géneket (JOUANIN et al., 1998; SCHULER et al., 1998). A növényevő rovarok bélcsatornájának középső szakasza az emésztéshez szükséges speciális mikrokörnyezettel rendelkezik. Fajtól függően a középbél környezete lehet savas (pH:3), mint néhány bogárfajban, vagy esetleg extrémen lúgos (pH:12), mint sok hernyóban (WOLFSON et al., 1990). Egyes fajok ilyen körülmények között is működőképes endo- és exo-pepdidázokkal rendelkeznek. A rovar proteázok nélkülözhetetlen emésztő enzimek, katalizálják az elfogyasztott
fehérjék
aminosavakká
történő
lebontását,
ami
a
lárvanövekedéshez és fejlődéshez szükséges. A rovarrezisztens növények új hatóanyagai főleg a célrovar emésztőrendszerére - köztük az említett peptidázokra - gyakorolnak kisebb-nagyobb hatást. 2.2.1. Mikroorganizmus eredetű rovarrezisztencia gének A B. thuringiensis Gram+ baktérium. Sporuláció közben rovarokat károsító kristályos δ-endotoxint (Bt toxin) szintetizál. A δ-endotoxinokat a rovar bélcsatornájának középső szakaszában levő bélproteázok kisebb polipeptidekre hasítják, így aktiválva válnak toxinná. A toxinok a középbél epithel sejtjeinek receptoraihoz kapcsolódnak és a membránba épülve megváltoztatják a K+ ion pumpát és a pH grádienst, aminek következtében az epithel sejtek elhalnak, a rovar elpusztul. A különböző B. thuringiensis törzsek eltérő δ-endotoxinokat termelnek. A több mint 130 protoxint kódoló cry gént, homológia és gazda 16
szervezetek alapján, cryI-III osztályba sorolják (HÖFTE et al., 1989, DUDITS és HESZKY, 2000). A CryI toxinok a Lepidopterák, a CryIII toxinok a Coleopterák ellen hatnak. Ez a bioinszekticid emberre és más nem-célfajokra ártalmatlan. A Bt toxint kódoló gén expresszálásával a teljes transzgénikus növény védetté válik. Az első kísérleteket dohánnyal és paradicsommal végezték (VAECK et al., 1987; FISCHOFF et al., 1987). Azóta a cry gén részlegesen vagy teljesen szintetizált változatait integrálták kukoricába, rizsbe, gyapotba, burgonyába, szójába, lucernába és több Brassica fajba is (JOUANIN et al., 1998). A Bt toxin megfelelő szintű expresszáltatása szántóföldi körülmények között is a károkozók magas mortalitását okozza. A transzgénikus növények előállításához a cry3 gén nukleotid szekvenciáját, az aminosav sorrend változtatása nélkül, módosították. Így a bakteriális gének gazdag AT tartalma miatti nagyon alacsony expressziót sikerült megemelni úgy, hogy az oldható fehérje tartalom elérte a 0,2-1%-ot (MAZIER et al., 1997). Kloroplasztba integrálva viszont az eredeti cry1Ac gén is nagyon jól expresszált és toxintermelése elérte az oldható fehérje 3-5%-át (McBRIDE et al., 1995). A legtöbb esetben a Bt toxin gént konstitutív promoterről (karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S vagy Agrobacterium tumefaciens eredetű mannopin szintáz) nyilvánították meg, de sikeresen alkalmaztak már szövetspecifikus (pl. csak a zöld szövetben működő vagy pollen specifikus), sebzés indukált promotert is (VAECK et al., 1987; KOZIEL et al., 1993; WILLIAMS et al., 1993). Ennek ellenére kereskedelmi forgalomba eddig csak konstitutív promoterrel irányított Bt toxin termelő fajták kerültek. A vegetatív fejlődés alatt néhány B. thuringiensis egy Vip3A nevű fehérjét is előállít, amit a Lepidopterák ellen találtak hatásos inszekticidnek (ESTRUCH et al., 1996). Másik mikroorganizmus eredetű rezisztencia gén, az A. tumefaciens citokinin bioszintézisben résztvevő enzim, az izopenteniltranszferáz génje (ipt). A burgonya proteináz inhibitor II génjének (PI-II) sebzés-indukálta promoterével meghajtott ipt dohányban és paradicsomban
17
csökkentette az amerikai dohányszender (Manduca sexta) és a zöld őszibaracklevéltetű kártételét. A növényfejlődésre és a klorofill tartalomra viszont negatív hatással volt (SMIGOCKI et al., 1993). A Streptomyces koleszterol oxidáza dohányban megnyilvánítva a rovarok középbél epithelium membránját károsította. A gyapottok-ormányos (Anthonomus grandis) lárvákra toxikus hatással volt, a dohányrügy bagolylepkéknél (Heliothis virescens) retardált növekedést okozott (PURCELL et al., 1993). HANZLIK et al. (1997) egy rovar RNS1 vírust és a gyapottok-bagolylepke (Helicoverpa armigera) törpülési vírus (HaSV) köpeny fehérjéjét dohányban, ill. gyapotban expresszáltatták. Az így előállított transzgénikus növényeket fogyasztó gyapottok bagolylepke lárvák és más gyapot károkozók csenevészek maradtak. A cry gén konstitutív expresszója azonban rezisztencia kialakulását indukálhatja a rovar populációban. Bt rezisztens rovarok megjelenéséről számoltak be ESTRUCH et al. már 1997-ben. A rezisztens egyedek szelekciójának késleltetéséhez a termesztés technológiában egy menedék szigetre, vagy más, különböző mechanizmusokra épülő rezisztens növények váltakozó használatára van szükség (JOUANIN et al., 1998; ABDEEN et al., 2005). 2.2.2. Növény eredetű rovar rezisztencia gének Rovartámadásra adott válaszuk során a növények rovarokra ártalmas másodrendű metabolitokat és fehérjéket, köztük proteáz inhibitorokat (PI), akkumulálnak. A védő mechanizmusok a növényeknek egy bizonyos fokú természetes rezisztenciát adnak, aminek következtében az egyes növényi fajokat csak korlátozott számú növényevő faj képes fogyasztani. Különböző növényekből izolált PI-ok a lárvák növekedését és fejlődését gátolják, egyes esetekben akár a rovar pusztulását is okozhatják. A Bt toxint termelő növényekhez képest ezek a gének a rovarokra kisebb hatást fejtenek ki, és a rovarok mortalitási százaléka is alacsonyabb. A géntermékek enyhébb toxicitása
18
révén a rovarokra kisebb a szelekciós nyomás. Ezért a PI gének konstitutív vagy indukálható promoter általi expressziója alternatívája lehet a Bt toxinoknak és a hagyományos, ökológiailag veszélyes inszekticideknek (JONGSMA et al., 1995; ABDEEN at al., 2005). 2.2.2.1. Proteáz inhibitorok A mechanikai sérülésre vagy rovartámadásra adott válaszként a növény, a rovarok szerin-, cisztein- aszparát- és metallo proteinázaira specifikus, összetett, gátló fehérjéket akkumulál (RYAN et al., 1990; GRUDEN et al., 2003). Ezek a fehérjék, melyek együtt majdnem minden proteáz osztállyal szemben hatásosak, inszekticid hatásuk révén természetes védelmet biztosítanak (JOUANIN et al., 1998; CARLINI és GROSSI-DE-SA, 2002; LAWRENCE és KOUNDAL, 2002; RANJEKAR et al., 2003). Néhány inhibitor a raktározó szervekben és csírákban állandóan magas szinten expresszálódik, míg mások a levélben sebzéskor indukálódnak (JONGSMA et al., 1994). A sérülés vagy rovartámadás következtében az inhibitor gének szisztemikusan expresszálódnak. A védekezés biokémiai folyamatában a szisztemikus választ kiváltó szignál molekulának, a jázmonsavat találták (RYAN et al., 1990; TURNER et al., 2002). Az inhibitor szerepe nemcsak a középbélben található közvetlen proteáz gátlás. Fontos tényező az is, hogy a PI-ok jelenlétében az emésztőenzimek hiperszekréciója az esszenciális aminosavak kiürülését okozhatja, ami a rovarok fejlődését akadályozza (BROADWAY és DUFFAY, 1986). A PI-ok nem mindig hatnak a lárvafejlődésre és az imágókra. Bár az inhibitorok a középbél proteázaihoz kötődnek, a rovarok azonban azzal, hogy a PI-okra érzéketlen proteázok szekrécióját 2-3-szorosára növelik, kiküszöbölhetik emésztő kapacitásuk drasztikus csökkenését. Úgy tűnik, hogy a rovarok rendelkeznek egy feedback rendszerrel, ami a PI-inszenzitív proteázok túlexpresszálásával fenn tudja tartani a proteáz aktivitás megfelelő szintjét (BOLTER és JONGSMA, 1995; BROADWAY et al., 1996). A rovarban a PI-inszenzitív proteázok szekréciója a
19
gazdanövény magas PI szintjéből következő szelekciós nyomás eredménye. JONGSMA et al. (1995) kimutatták, pl., hogy a zöldség és szántóföldi növények széles körét károsító bagolylepke (Spodoptera exigua) lárvák növekedésére a PI-II transzgénikus dohánylevelek fogyasztása nem volt hatással, a lárvák az elvesztett tripszin aktivitást egy új, a PI-II gátlásra nem fogékony proteázzal kompenzálták. Ezt követően a lárvák a kontroll lárvákhoz képest több levelet fogyasztottak, fejlődésük is felgyorsult (JONGSMA et al., 1995; GIRARD et al., 1998; CLOUTIER et al., 1999). A rovar proteázok változatainak teljes spektrumát meghatározva, a bélextraktum biokémiai analízise megmutatta, hogy a rovar 3-6 nagyobb, és 10-20 kisebb proteáz aktivitással rendelkezik (JONGSMA et al., 1996). De kiderült az is, hogy bár a rovarok a PI-érzéketlen proteázok alapszint aktivitásának 2-3 szorosára történő emelésével képesek a szenzitív proteázokat gátlását kompenzálni, de az eredeti proteáz aktivitás szintjét már nem tudják visszaállítani. Ez a fiziológiai alkalmazkodás azt jelenti, hogy a rovarok a természetes gazdanövény PI-ainak hatásától is szenvednek (JONGSMA et al., 1995). Ezért a relatíve kevés PI-inszenzitív rovar proteázokkal szembeni további PI-ok bevitele a növénybe annak túlélési esélyét növelheti (BURGESS et al., 1994). A proteázok aktivitásának teljes gátlásához 10-30 mM minimális PI koncentráció szükséges, ami 0,5-1,5% oldható fehérje tartalomnak felel meg (JONGSMA és BOLTER, 1997). Rovaronként eltérően ugyan, de létezik egy minimális PI expressziós küszöbszint, amellyel a lárvafejlődésben a károsodás előidézhető. DeLEO et al. (2001) kísérleteikben kimutatták, hogy mustár tripszin inhibitort (MTI-2) magas szinten expresszáló repce és dohány növényeket fogyasztó lárvák mortalitása megnő, fejlődésük és levél károsító hatásuk csökken. Ezzel ellentétben az alacsony expressziós szint a kártétellel együtt a lárvafejlődést is fokozza. A gazdanövény nem rokon fajai között találhatók olyan PI családok is, amelyek a gazdanövényben nem léteznek. Ezek a PI-ok hatásos gátlói lehetnek a rovar proteázoknak és fokozhatják a növény rovar rezisztenciáját, mivel
20
inszenzitív proteázok a nem-gazdanövények PI-aival szemben nem tudtak kiszelektálódni (JONGSMA et al., 1996). Az első növénybe integrált PI gén, ami fokozta a rovarrezisztenciát, a tehénborsó tripszin inhibitora (CpTI) volt. A CpTI termeltetésével a transzgénikus dohány a dohányrügy bagolylepke lárvával szemben vált rezisztenssé (HILDER et al., 1987). A későbbiekben a genomba integrált CpTIvel az alma, a saláta, a repce, a burgonya, a rizs, a földieper, a napraforgó és a paradicsom rezisztenciáját is fokozni tudták (SCHULER et al., 1998). A CpTI számos szántóföldi és raktározási kártevő ellen hatásos antimetabolitnak bizonyult. Transzgénikus gyapot CpTI termeléssel a gyapottok bagolylepke (LI et al., 1998), míg a CpTI rizs a sarkantyúskabóca (Nilaparvata lugens) (LEE et al., 1999) ellen mutatott magas rezisztenciát. Szerin típusú proteázokkal főleg a Lepidopterák és Dipterák rendelkeznek, így a szerin PI-kat expresszáló transzgénikus növények velük szemben váltak rezisztensebbekké. Számos PI különböző fajú károkozóval szembeni sikeres alkalmazásáról számoltak be, pl.: a burgonya PI-II és a szója Kunitz tripszin inhibitor (SKTI) expressziójával a rizs a gabonanövényekben károkozó bagolylepkével, a Sesamia inferens-szel, és egy fényiloncafajjal, a Chilo suppressulis-szal szemben vált ellenállóvá DélKelet Ázsiában és Ausztráliában (DUAN et al., 1996; XU et al., 1996). Az árpa tripszin inhibitorát expresszáló rizs vonalak a rizszsizsikkel (Sitophilus oryzea) szemben bizonyultak rezisztensnek (ALFONSO-RUBI et al., 2003). A paradicsom TI-II-vel, burgonya PI-II-vel, csicsóka spTI-I-gyel és szója szerin PI-ral dohányban, rizsben, repcében és burgonyában tudták gátolni a Lepidoptera lárvák növekedését és fejlődését (GATEHOUSE et al., 1992; JOHNSON et al., 1989; McMANUS et al., 1994; YEH et al., 1997). A Bowman-Birk családba tartozó szója és borsó tripszin-kimotripszin inhibitor (SbBBI, PsTI-2) és a mustár Chy8 inhibitora a borsólevéltetű (Acyrthosiphon pisum) növekedését gátolta és pusztulását indukálta (RAHBÉ et al., 2003a; CECI et al., 2003). Az SbBBI-nek a burgonya levéltetű imágókra (Macrosiphum euphorbiae) volt káros hatása (AZOUZ et al., 2005).
21
A Coleoptera fajok belének fő proteáz típusa, a cisztein proteáz (MURDOCK et al., 1987). A rizs cisztein PI génjével különböző növényeket transzformáltak (dohányt, nyárfát, burgonyát, gyapotot). A transzgénikus nyárfa a nyárlevélbogárral (Chrysomel tremulae) szemben mutatott nagy toxicitást (ORR et al., 1994; LEPLÉ et al., 1995). Az orizacisztatin-I (OCI) redukálta a zöld őszibarack-levéltetű imágó súlyát és termékenységét, valamint a nyárlevélbogár nőivarú egyedeinek életidejét, és ezzel akadályozta azok szaporodását (AZZOUZ et al., 2005; RAHBÉ et al., 2003b). A PI-ok működésükhöz a proteázokkal szoros és stabil komplex kialakítását igénylik. Az OCI molekuláris szerkezetét megváltoztatva, a proteázhoz erősebben kötődő cisztein PI-t hoztak létre. Az egyik proteáz kötő domén
egyik
aszpartátjának
deléciójával
az
inhibitor
a
nematoda
(Caenorhabditis elegans) klónozott cisztein proteázával szemben továbbra is aktív maradt, azonban a módosított OCI, in vivo, mind a Caenorhabditis elegans-ra, mind az agronómiailag fontos fehér burgonya-fonálféregre (Globodera pallida) toxikusabb lett. A transzgénikus paradicsom gyökerein levő ciszták az OCI hatására gyakorlatilag petementessé váltak (URWIN et al., 1995). A mesterséges OCI gén expresszáltatásával szántóföldi kísérletekben a transzgénikus burgonya is erős nematoda rezisztenciát mutatott (URWIN et al., 2001). Transzgénikus burgonya OCI extraktuma a burgonyabogár középbél extraktumával szemben, in vitro, nagyon aktív volt (BENCHEKROUN et al., 1995). Ezzel szemben viszont az OCI-t vagy paradicsom katepszin D inhibitor gént expresszáló burgonya vonalak a burgonyabogár lárvákra csak gyenge hatást fejtettek ki. A transzgénikus vonalakkal táplálkozó lárvák az inhibitor inszenzitív proteázokat túltermelték és hipertrófikus tüneteket mutattak (CLOUTIER et al., 2000; BRUNELLE et al., 2004). LECARDONNEL et al. (1999) az OCI–t nagy mennyiségben termelő burgonya vonalakon 50%-nál nagyobb pusztulást figyeltek meg, mint a kontrollokon, de a túlélők és az alacsony OCI expressziójú növényeket fogyasztók a kontrollhoz képest jobban fejlődtek.
22
Az equisztatin, tengeri bíborrózsa (Actinia equina) eredetű, három tiroglobulin I típusú doménből álló cisztein és aszpartil proteáz inhibitor (STRUKELJ et al., 2000). A fehérje a burgonyabogár bélproteázaival szemben nagyon aktív. Elfogyasztása a lárvák növekedését teljesen gátolja, majd pusztulásukat okozza (GRUDEN et al., 1998). A maximális expresszióhoz mutagenezissel
módosított
equisztatin
génnel
a
burgonyában
0,5-7%
mennyiségben jelen lévő, részlegesen működő equisztatint sikerült akkumulálni. A fehérje növénybeli degradációja miatt azonban teljes gátlást nem tudtak elérni (OUTCHKOUROV et al., 2003). A rovar bélről szerzett fiziológiai ismeretek alapján a növényi rezisztencia fokozásának hatásosabb módszere lehet, ha különböző proteázok ellen működő PI-okat kombináltan alkalmazunk. Nyolc független doménből álló, a totál fehérje 0,5%-ban jelen lévő PI koktélt expresszáló transzgénikus növényekkel lehetséges volt a bél proteázok teljes inaktiválása, és ezáltal a rovarok elpusztítása (JONGSMA et al. 1996). Heterológ inhibitorokat expresszáló transzgénikus dohányokon több rovar faj lárvája is csökkent növekedést és fejlődést mutatott (HILDER et al., 1987; JOHNSON et al., 1989). A burgonya tripszin / kimotripszin típusú szerin PI-t és karboxipeptidáz inhibitort (PCI) paradicsomba transzformálva a homozigóta utódokban a kukoricamollyal (Heliothis
obsoleta)
és
a
gerberaaknázóléggyel
szembeni
rezisztencia
fokozódott, míg a hemizigóta vonalakban a hatás az ellenkező volt (ABDEEN et al., 2005). 2.2.2.2. α-amiláz gátlók A közönséges bab egyik magfehérjéje az α-amiláz inhibitor (α-AI). Az α-AI egy hőstabil glikoprotein, a növény rovarok elleni védekezésében bizonyos rovar amilázokkal komplexet képezve gátolja azok működését. A transzgénikus borsó és Azuki bab α-AI-t expresszálva tehénborsózsizsik (Callosobruchus maculatus), déli tehénborsó-zsizsik (C. chinensis) és Graham-babzsizsik (C. 23
analis) raktározási, valamint borsózsizsik szántóföldi kártevőkkel szemben rezisztensnek bizonyultak (SHADE et al., 1994; SHROEDER et al., 1995; ISHIMOTO et al., 1996). Egyes szántóföldi rokon fajok azonban rendelkeznek egy olyan szerin proteázzal, ami néhány α-AI típust hasítani tud, ezért megkérdőjelezhető, hogy mennyire általánosan használhatók ezek a gének rovarrezisztens növények létrehozására (ISHIMOTO et al., 1996). 2.2.2.3. Lektin és más növény eredetű rezisztencia gének A lektinek több növényi szövetben, de főleg a magokban és a raktározó szervekben jelenlevő, szénhidrátkapcsolt fehérjék. A rovar középbél epithel sejtekhez specifikusan kapcsolódva fejtik ki hatásukat. A hóvirágból és fokhagymából izolált lektinek az emlősökre nem, de a rovarokra toxikusak. MELANDER et al. (2003) a transzgénikus repce által termelt lektin repcefénybogár (Meligethes aeneus) lárvára kifejtett hatása alapján állapították meg, hogy a lektin tartalom koncentrációja negatívan korrelál a lárvafejődéssel. A levéltetvekre és a sarkantyúskabócára kifejtett hatása miatt az érdeklődés főleg a hóvirág lektinre (GNA) koncentrálódott (POWEL et al., 1995). A GNA egy mannóz specifikus 12 kDa alegységekből álló tetramer fehérje. A GNA-t több növényben is expresszáltatták, köztük burgonyában, repcében és paradicsomban is. A GM módosított burgonya GNA-ja nem növelte a gyűszűvirág levéltetű (Aulacorthum
solani)
pusztulását
vagy
fejlődési
idejét,
de
redukálta
termékenységét (DOWN et al., 1996). A cukorrépát károsító bagolylepkére viszont (Lacanobia oleracea) toxikus hatással volt (GATEHOUSE et al., 1997). A GNA dohányban és burgonyában védelmet nyújtott a zöld őszibaracklevéltetűvel (HILDER et al., 1995; DOWN et al., 1996), a transzgénikus rizsben pedig a zöld levélbolhával (Nephotettix virescens), a kis barna (Hardya melanopsis) és a feketehátú növénybolhával (Sogatelle furcifera) szemben is (WU et al., 2002; NAGADHARA et al., 2003; 2004).
24
A növények rovarok elleni védekezésre más toxikus és antinutritív anyagokat is előállítanak. A peroxidáz azzal, hogy megköti a tápanyagokat, gátolja az emésztő enzimeket. A peroxidáz által termelt hidrogén-peroxid erős, nagyon toxikus reagens. A dohányban és paradicsomban túltermelt dohány peroxidáz több Lepidoptera és Coleoptera fajjal és a zöld őszibarack levéltetűvel szemben is rezisztenciát nyújt (DOWD és LAGRIMINI, 1997). A tomatinról, a polifenol peroxidázról (PPO) és a lipoxigenázról (LOX) is kimutatták, hogy szintén toxikusak a rovarokra nézve (DUFFEY et al., 1996). A növény eredetű kitinázok viszont a cukkorrépát károsító bagolylepke hernyóival szemben nem, míg a levéltetvek ellen is csak gyenge védő hatást mutattak. A bab kitinázt expresszáló burgonya ugyan nem volt hatással a Lepidopterákra, de redukálta a levéltetvek termékenységét (GATEHOUSE et al., 1997). Az alkaloidok gyakran sok
rovar
számára
táplálkozás-csökkentő
hatásúak.
A
rózsameténg
(Catharanthus roseus) triptofán dekarboxiláz (TDC) génje transzgénikus dohányban triptamint, valamint triptamin alapú alkaloidokat szintetizál, amik gátolják a dohány liszteske (Bemisia tabaci) bebábozodását (THOMAS et al., 1995). Az eddigi eredmények alapján, a Bt endotoxint expresszáló növények kivételével, más transzgénikus növények nem okozzák a célrovarok teljes pusztulását (KUMAR és KUMAR, 2004; STOGER et al., 1999). Szubletális hatásuk ellenére azonban a PI-ok más rezisztencia génekkel együtt vagy több PI gén ko-expresszálásával jelentősen redukálhatják a kártevők számát (ABDEEN et al., 2005; AZZOUZ et al., 2005). Különböző típusú rezisztencia gének együttes expresszáltatása révén keletkező inszekticid fehérjékkel a károkozók ellen nagyobb és szélesebb spektrumú hatás érhető el. A szója cisztein proteáz inhibitor (SbCPI) és egy nyugat-afrikai gyógynövény, a Griffonia simplificolia, rGSII lektinjének rekombináns
fúziójáról
kimutatták,
hogy
együttműködésük
fokozza
a
rovarellenes hatást (ZHU-SALZMANN et al., 2003). LI et al. (2005) bizonyították, hogy a GNA-t és szója tripszin inhibitort (SbTI) expresszáló
25
transzgénikus rizs rezisztens a sarkantyúskabóca és a rizst károsító Cnaphlocrocis medinalis-szal szemben. 2.2.3. Állati eredetű rezisztencia gének Az állati eredetű rezisztencia gének elsősorban az emlős és rovar szerin PI-okat, valamint a kitináz géneket foglalják magukba. A rovarokban a kitin a peritrofikus membránban is megtalálható, ezért az aktív kitináz az emésztést gátolni tudja. Transzgénikus dohányból tisztított rekombináns amerikai dohányszender kitináz 2%-os koncentrációban toxikus hatással volt a napraforgót károsító fogasnyakú földimogyoróbogárra (Oryzaephilus mercator) (WANG et al., 1996). A rovar kitinázok más növény eredetű kitinázoknál erősebb hatású rovar rezisztenciát képesek kialakítani (JOUANIN et al., 1998). A rovar kitinázok mellett rovar PI-kal is indukáltak rezisztenciát. A rovar PI a nem-rokon rovarfajok bélproteázainak különösen hatékony inhibitora, és így az emésztő rendszerbe kerülve nagyon toxikus lehet. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a PI-ok mind a bélnek, mind a bélszövet proteázoknak fiziológiai komponensei. A Lepidoptera lárvák középbél extraktumainak in vitro proteolízis gátlása alapján a szarvasmarha hasnyálmirigy tripszin inhibitorát, az α1-antitripszint
(α1-AT),
és
a
lép
inhibitorát
(SI)
találták
ígéretes
rovarrezisztencia fehérjének, és vitték be génjét számos növénybe. A várakozással
ellentétben
azonban
burgonyában
a
burgonyagumó-moly
(Phthorimaea opercullela) lárvákkal szembeni ellenálló képességet az SI nem fokozta, sőt egyes esetekben a transzgénikus leveleket fogyasztó rovarok súlya még nagyobb is volt, mint a kontroll növényeken táplálkozóké (SCHULER et al., 1998). Ezzel ellentétben, az amerikai dohányszender lárva hemolimfa szerpint expresszáló lucerna, gyapot és dohány fehér legyekkel és tripszekkel szembeni rezisztenciája megnövekedett (THOMAS et al. 1995). A módosított és stabilabb SI-t expresszáló transzgénikus dohányleveleket fogyasztó gyapottokbagolylepke lárvák növekedése és életben maradási esélye csökkent, a túlélő 26
lárvákban a bél tripszin aktivitása csökkent, míg a kimotripsziné nőtt (CHRISTELLER et al., 2002). 2.2.3.1 Az SGTI és SGCI MALIK et al. (1999) izolálták és jellemezték a sivatagi sáska (Schisocerca gregaria) két kis szerin PI peptidjét, a Schistocerca gregaria kimotripszin inhibitort, az SGCI-t, és a Schistocerca gregaria tripszin inhibitort, az SGTI-t. Mindkettő felépítése hasonló, 35-36 aminosavból áll, amelyek három homológ diszulfid híddal összekötött három antiparallel ß–redőt képeznek, struktúra stabilitásuk viszont eltérő. A fehérje kötőhelyek is kissé eltérnek, amelyek a specifitásukban játszhatnak szerepet (GÁSPÁRI et al., 2002). Az SGCI a szarvasmarha kimotripszinnek nagyon jó inhibitora, míg az SGTI a szarvasmarha tripszin közepes gátlószere. Az SGTI két ízeltlábú tripszint is az emlős tripszinnél öt nagyságrenddel erősebben gátolta (PATTHY et al., 2002). Ez az eredmény azt a reményt keltette bennünk, hogy az SGTI inszekticidként is alkalmazható volna. A burgonyabogár esetében a bél proteolitikus aktivitásában főleg az aszpartikus proteázok játszanak szerepet, de detektáltak már a bélben kisebb aktivitású szerin és metallo jellegű proteázokat is (NOVILLO et al. 1997). Az endogén
cisztein
PI-t
magas
szinten
termelő
burgonyákat
fogyasztó
burgonyabogár lárvák az inhibitorokra érzéketlen cisztein proteázokat szekretálnak (BOLTER és JONGSMA, 1995). A különböző szubsztrát specifitású és PI gátló profilú cisztein proteázok vagy rezisztensek a PI-okra vagy N-terminális végének hasításával inaktiválják azokat (GRUDEN et al., 2003). Ez lehet az oka annak, hogy az eddigi tapasztalatok alapján a cisztein PIoknak a burgonyabogárra nincs kimutatható hatása. Az SGCI és SGTI azonban a szerin PI-ok családjához tartoznak. Így nem tűnt reménytelennek, hogy az SGCI-t és SGTI-t burgonyában két reaktív hellyel rendelkező, un. „kétfejű” peptidet,
SGTI-Lys-Arg-SGCI
formában
27
(1.
ábra)
expresszáltatva
burgonyabogár rezisztens növényeket kaphatunk. Ez a kettőshatású sáska inhibitor peptid, melyet angol nevéből "locust inhibitory peptide"-nek, rövidítve LIP-nek neveztünk el, ebben a kettős formában szintetizálódik a sáskában is (KROMER et al., 1994).
1.ábra A „kétfejű” sáska inhibitor peptid aminosav szekvenciája. Az aktív centrum félkövér betűkkel jelölt, az összekapcsoló dipeptidil rész aminosavai aláhúzottak. A két peptidet, a S. gregaria kimotripszin inhibitort, az SGCI, és a S. gregaria tripszin inhibitort, az SGTI jelöli.
Sivatagi sáska lárva zsírtestjéből SZENTHE et al. (2004) mRNS-t izoláltak. Az mRNS cDNS-sé iratásával megkapták mindkét SG peptidet kódoló gén, azaz az SGTI és SGCI cDNS-ét. A cDNS-t PCR-rel amplifikálták és pET17b expressziós vektorba építették. A konstrukciót szekvenálással ellenőrizték. A plazmidot E. coli BL21 sejtekbe transzformálták. IPTG-vel indukálva a transzformált sejteket tisztításhoz elegendő mennyiségű oldható fehérjét tudtak előállítani. A tisztítást követően a „kétfejű” fehérje Ki (gátlási állandó) értékeit ellenőrizték. A kapott értékek megegyeztek az egyes peptidek (SGTI és SGCI) korábban kapott Ki értékeivel (MALIK et al. 1999). Ez azt bizonyította, hogy az 28
E. coli az SGTI és SGCI peptideket megfelelő szerkezetben expresszálja: a két gátló hely nem csökkenti egymás hatását. A LIP burgonyabogár lárvák fejlődésére gyakorolt hatásának vizsgálatára LIP-et expresszáló burgonya vonalakat állítottunk elő és etetési kísérleteket végeztünk, melyek eredményét a 4.1. fejezetben mutatjuk be.
2.3. Markergén-mentes GM növények előállítása A növény transzformáció során az idegen DNS csak kevés sejtbe tud integrálódni, a sejtek nagy része transzformálatlan marad. Az alacsony hatékonyság miatt a transzgénikus sejtvonalak és hajtások kiválasztásához, valamint fejlődésük elősegítéséhez szükséges a „hasznos” génnel együtt markergének bevitele is (EBINUMA et al., 2001). A szántóföldi termesztésben azonban a rezisztencia markergének jelenléte – bizonyos esetektől eltekintve (herbicid rezisztencia) – szükségtelen, és több szempontból is elfogadhatatlan (HOHN et al., 2001; HARE és CHUA, 2002). Ahhoz, hogy a GM növények előállítása és termesztése ne csak a kutatók és a termelők, hanem a társadalom és a környezet számára is elfogadható legyen, olyan eljárások, módszerek kifejlesztése és alkalmazása szükséges, amelyekben a végső növényi fajtához nem szükséges génszekvenciák a genomból eliminálódnak. A markergén-mentes növények előállításához alkalmazott technikákat a 2.3.1. - 2.3.4. fejezetekben ismertetem. 2.3.1. A ko-transzformáció és a markergének szegregációja Az A. tumefaciens-közvetítette transzformáció során a növényi sejtekbe vagy egy tumor indukáló (Ti) vagy egy bináris plazmid, ún. transzfer vagy T-DNS-e
29
kerül, és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-ébe (DUDITS és HESZKY, 2000; HUANG et al., 2004). A ko-transzformáció egyszerre több T-DNS növényi sejtbe történő átvitelét és integrálását foglalja magába. A ko-transzformáció során, ha a különböző T-DNS-ről a szelekciós markergén és a hasznos gén nem kapcsolt lókuszba épül, akkor a keresztezést követően az utód növényekben, a markergén független hasadásával, marker-mentes transzgénikus növények jönnek létre. A módszer egyedülálló előnye, hogy szekvenciától függetlenül lehetővé teszi nagy számú gén egyidejű beépülését. CHEN et al. (1998) és WU et al. (2002) nagy ko-transzformációs gyakoriság mellett (85%), rizs transzformációt követően, 2-13 transzgén szimultán integrálódását detektálták. HADI
et
al.
(1996)
szójában
közölt
hasonló
eredményeket.
Ko-
transzformációval azonban a hasonló számú, de marker-mentes transzgénikus növény előállításához négyszer több transzgénikus vonalat kell izolálni, a markergén szegregálásához pedig keresztezés szükséges (DALEY et al. 1998). Ezért ez a rendszer a vegetatív szaporítású és hosszú életciklusú fajokban nem, vagy csak nehézkesen alkalmazható (MIKI et al., 2004). Az Agrobacterium-közvetítette szelektív markergének és hasznos gének ko-transzformációját mind kétszikű, mind pedig egyszikű, elsősorban gabona fajokban már gyakran és számos módon alkalmazták. A marker-mentes transzgénikus növény előállításához három módszert használnak. Ezeket az alábbiakban ismertetem. 2.3.1.1. Ko-transzformáció két törzs két plazmid módszerrel A két törzs két plazmid módszerben, külön bináris plazmidban, egy szelekciós markergént és egy hasznos gént visznek két Agrobacterium törzsbe, majd a két baktériummal egyszerre transzformálják a növényt. A fertőzés során egy növényi sejthez legalább két különböző baktérium kapcsolódása és azok TDNS-einek bejuttatása szükséges. A ko-transzformációs gyakoriságot az Agrobacterium opin típusa, a baktérium és a növényi sejt interakciója, a T-DNS
30
átvitele és akceptálása befolyásolja (EBINUMA et al., 2001). Az együtt tenyésztés során a baktérium növényi sejtszámhoz viszonyított túlsúlya növeli az esélyét annak, hogy egy növényi sejthez két különböző baktérium is kapcsolódjon. DEPICKER et al. (1985) a dohány protoplasztokat vad típusú TDNS-sel és neomicin-foszfotranszferáz (nptII), azaz kanamicin rezisztenciát meghatározó
gént
tartalmazó
T-DNS-sel
ko-transzformálták.
A
ko-
transzformációs gyakoriság 15% volt, ami majdnem megegyezett a két független transzformáció alapján várt eredménnyel (13%). DEPICKER et al. (1985) eredményeik alapján tehát úgy vélték, hogy a különböző baktériumok génátvitele egymástól független transzformációs folyamat. DeBLOCK és DEBROUWER
(1991)
azonban
repcét
több
rezisztencia
génnel
ko-
transzformálva a vártnál sokkal nagyobb ko-transzformációs gyakoriságot kaptak (39-85%). Ez DEPICKER et al. (1985) következtetéseivel ellentétben arra utalt, hogy a ko-transzformáció nem egymástól független esemény. Megállapították, hogy a növény állapota és a fertőzés során használt tenyésztési körülmények erősen befolyásolják mind a növényi sejt, mind a baktérium transzformációs képességét és kapcsolódásuk számát. A marker-mentes növény előállításához szükséges, hogy a T-DNS-ek a genom nem kapcsolt lókuszába integrálódjanak, mivel keresztezéssel az utódokban a szelekciós markergén a hasznos géntől nagy eséllyel csak így szegregálódhat. A T-DNS kapcsoltság az Agrobacterium típusától is függ. Nopalin
törzs
alkalmazásával
ko-transzformált
dohány
növények
öntermékenyítésből származó utódainak 22%-ában, míg oktopin törzzsel történt ko-transzformáció után annak több mint 50%-ában szegregált a GUS és nptII transzgén (DeBLOCK és DEBROUWER, 1991; KOMARI et al., 1996). DeNEVE et al. (1997) viszont úgy találták, hogy dohány és Arabidopsis kotranszformált növények 72%-ában a két különböző T-DNS legalább egy kópiában kapcsolt volt. A ko-transzformált T-DNS-ek gyakran még az integráció előtt ligálódtak és így ugyanabba a lókuszba már kapcsoltan épültek be. McKNIGHT et al. (1987) és KOMARI et al. (1996) eredményei azt
31
bizonyítják, - ami a marker-mentes növény előállítás szempontjából a leglényegesebb - hogy különböző baktérium törzsek egy T-DNS kópiája legalább egy lókuszba nem kapcsoltan integrálódik, ami azt jelenti, hogy az utód nemzedékben biztosan kihasadnak marker-mentes transzgénikus növények. 2.3.1.2. Ko-transzformáció egy törzs két plazmid módszerrel Az egy törzs két plazmid módszerben egy szelekciós markergént és egy hasznos gént külön bináris plazmidon visznek be egy Agrobacterium törzsbe. Azért, hogy az inkompatibilitás következtében elkerüljék az egyik plazmid eliminálását a vektorok különböző replikációs origót tartalmaznak (DALEY et al., 1998). Egyetlen baktérium több T-DNS-t képes a növényi sejtbe átvinni és integrálni. A
T-DNS-ek
nem-kapcsolt
lókuszba
történő
beépülését
bizonyította
DeFRAMOND et al. (1986) és DALEY et al. (1998). Az első esetben dohány növényeket oktopin Ti plazmid vad T-DNS-ével és egy bináris plazmid nopalin szintáz (nos) génjével ko-transzformáltak. A tumorból regenerált növények utódaiban az opin markerek függetlenül szegregálódtak. DALEY et al. (1998) kísérletében két bináris vektorral - bennük a GUS és nptII génnel - dohányt és repcét ko-transzformáltak, aminek gyakorisága 52, ill. 62% volt. A kotranszformánsok keresztezését követően a dohány és repce utódokban a szegregáció gyakorisága 40, ill. 58%-ot mutatott. 2.3.1.3. Ko-transzformáció több T-DNS egy plazmid módszerrel A ko-transzformáció ez esetben egy Agrobacterium-ban, egyetlen bináris plazmidba, külön T-DNS-be klónozott szelekciós markergénnel és hasznos génnel történik. A két T-DNS egyformán sokszorozódik és transzferálódik a növényi sejtbe. KOMARI et al. (1996) kísérletében ez a módszer az előző két módszernél nagyobb ko-transzformációs gyakoriságot eredményezett. GUS és higromicin-foszfo-transzferáz (hpt) génnel ko-transzformált dohányban és
32
rizsben a hpt szelekciós markertől a nem kapcsolt GUS gén kb. 50%-os gyakorisággal hasadt ki, bizonyítva, hogy a GUS gén T-DNS-e a kotranszformált növények több mint felében legalább egy nem-kapcsolt lókuszba integrálódik. DEPICKER et al. (1985) szerint a magasabb gyakoriság annak köszönhető, hogy a növényi sejt gyakrabban fogad több T-DNS-t egy baktériumtól, mint egyet-egyet többtől. McCORMAC et al. (2001) szerint a kotranszformáns T-DNS relatív mérete a meghatározó tényező, mivel dohány kísérletükben a hasznos T-DNS és a kétszer nagyobb kiszelektálandó T-DNS ko-transzformációjában a gyakoriság 100% volt. Ez az eredmény a módszer gyakorlati alkalmazhatóságát predesztinálta. MILLER et al. (2002) kukoricában két T-DNS-t, foszfinotricin-acetil transzferáz (bar), ill. GUS gént tartalmazó bináris vektor ko-transzformációjával az R0 generációban 93%-os gyakoriságot, míg két Agrobacterium törzzsel végzett ko-transzformáció esetében csupán 11.7%-ot értek el. Az R1 bar-mentes szegregált utódok 64%-ában expresszálódott a GUS gén. Árpában 66%-os ko-transzformációs gyakoriság mellett csak 24%-ban hasadt ki a markergén (MATTHEWS et al., 2001). 2.3.2. Transzpozon-közvetítette génáthelyezés A transzpozon-közvetítette génáthelyezés a kukorica Ac/Ds transzpozon rendszerén alapul. Az Ac transzpozáz expressziójának következtében a Ds inverz elemek között levő szekvenciák kivágódnak, és a genomon belül egy másik lókuszra helyeződnek át (FEDOROFF, 1989). A kukorica Ac/Ds transzpozon elemei a T-DNS-be építve a növényi integráció után elválasztják az ugyanazon T-DNS-ben bevitt, kapcsolt géneket. A transzpozon alapú transzformációs rendszerben az integrációt követően vagy a hasznos gén vagy a szelekciós markergén kerül új lókuszba. A rendszer a növények széles körében működik, csak az Ac transzpozáz aktivitását igényli, aminek expressziója növényi promoter segítségével még fokozható is (HONMA et al., 1993). A transzpozícióhoz a gén köré kb. 200 bp terminális repeat target szekvenciák
33
szükségesek (GOLDSBROUGH et al., 1993). Ha az új lókusz az eredeti helytől elég messze van, a keresztezés során a két gén szeparálódni tud egymástól, az utódokban marker-mentes transzgénikus növények hasadnak ki (YODER and GOLDSBROUGH, 1994). Az Agrobacterium-közvetítette transzformáció során azonban a bevitt gének a még nem integrálódott T-DNS-ről is expresszálhatnak (JANSSEN et al., 1989). Ennek elkerülésére, Ds elemet tartalmazó transzformáns protoplasztokba utólag jutatták be az in vitro előállított transzpozáz mRNS-ét. Az mRNS képes volt az integrált Ds elemet aktiválni (LEBEL et al., 1995). A transzpozonokkal a gének egy-egy stabil kromoszóma helyre kerülhetnek át, ahol erősebben expresszálhatnak és nem eliminálódnak a későbbi generációk genomjából (HOHN et al., 2001). 2.3.2.1. A hasznos gén áthelyezése transzpozíció segítségével A vektor növényi genomba integrálódása után a T-DNS-en belüli Ac transzpozáz expresszálódik és indukálja a T-DNS-en belül elhelyezkedő hasznos gén
egy
másik
kromoszóma
helyre
történő
transzpozícióját.
Ennek
eredményeként a hasznos gén eltávolodik a T-DNS-től és a szelekciós markergéntől. Bár a cél a marker-mentes transzgénikus növények előállítása, de a genomon belüli hasznos gén áthelyezés egy előnyös pozícióhatást is eredményezhet,
aminek
következtében
további
transzformációk
nélkül
fokozódhat a hasznos gén expressziója. GOLDSBROUGH et al. (1993) paradicsomban bizonyították a rendszer működését. Egy, ill. két T-DNS inszerció után a GUS gén áthelyeződött, majd öntermékenyítést követően, 2,3%ban, ill. 6,6%-ban, nptII-mentes növényeket eredményezett. Rizsben hasonló módszerrel cry1B gén által kódolt Bt endotoxint expresszáló, hpt-mentes növényeket állítottak elő (COTSAFTIS et al., 2002). A cry1B gént, a „green fluorescens protein” (GFP) markergén szekvenciájába építették. A cry1B áthelyezésével a GFP aktiválódott, aminek következtében a 37% gyakorisággal előforduló kivágódás detektálhatóvá vált. Transzpozíció 25%-os gyakorisággal
34
fordult elő. Az előállított marker-mentes növények a vetésfehérítő bogárral szemben nagy fokú rezisztenciát mutattak. Mivel a marker-mentes növény létrehozásához ez a módszer is keresztezést igényel, a vegetatív szaporítású és hosszú életciklusú növényekben nem, vagy csak igen nehezen használható. Az egymást követő transzformációk esetén problémát okozhat az is, hogy az ismételt transzpozáz bevitellel a markergén
eltávolításakor
az
első
transzgén
új
kromoszóma
régióra
transzlokálódhat. 2.3.2.2. A szelekciós markergén transzpozició általi eliminálása Az Ac/Ds rendszer másik stratégiája, ha a T-DNS-ből a szelekciós markergén és a transzpozáz helyeződik át, csak a hasznos gént hagyva a T-DNS-ben. Ezen a módszeren alapul az ipt gént, mint szelekciós markergént alkalmazó ipt-típusú MAT (multi-auto-transformation) vektor rendszer. Az ipt a citokinin bioszintézist katalizálja, a transzgénikus sejtek osztódását és a hajtásképződést serkenti. Az ipt gén pozitív szelekciós hatása következtében a transzformált szövet osztódik, de a citokinin túltermelésnek köszönhetően abnormális morfológiát mutat és regenerálni nem képes. Az ipt, az Ac transzpozon elem segítségével, a transzformációt követően transzlokálódik. EBINUMA et al. (1997b) a MAT rendszerrel, kis gyakorisággal ugyan, de marker-mentes transzgénikus dohányt és hibrid GM nyár fajtákat tudtak előállítani. EBINUMA et al. (1997a) kísérletében a negatív szelekciós lépésben, néhány hét vagy hónap tenyésztést követően, az ipt és a transzpozáz gén eliminálásának következtében normális hajtások jelentek meg, és kb. 5%-os gyakorisággal transzformált, marker-mentes növénnyé regenerálódtak. Ez az eredmény azt mutatta, hogy az Ac elem által kivágott Ds elemek közötti gének nem reintegrálódtak, így a szelekciós markergén keresztezés nélkül tudott a genomból eliminálódni. Ezért ez a rendszer szexuális szaporodási lépést nem igényel, a vegetatív szaporítású és hosszú életciklusú növényekben is
35
alkalmazható. Ez a vektor rendszer az ismétlődő növény transzformációra, a gének egymást követő bevitelére is alkalmas (EBINUMA et al., 1997a,b). 2.3.3. Intrakomoszómális homológ rekombináció alkalmazása Az intrakromószómális homológ rekombinációban a markergén eliminálására a λ-bakteriofág integrációs és kivágódási rendszerét alkalmazzák. Az E. coli genomon belül a fág integrációját és kivágódását az integrációs gazda faktor (IHF) irányítja. Ehhez a genomban szükséges egy 352 bp kapcsolódási P (attP) régió és a fág által kódolt integráz (int) (GARDNER et al., 1986). Az attP régiók közé klónozott markergéneket az integráz eliminálja, aminek következtében marker-mentes növények regeneráltathatók. ZUBCO et al. (2000) bizonyították, hogy intrakromoszómális rekombinációval és két lépésben történő szelekcióval marker-mentes növényt lehet előállítani. Kísérletükben az OCI hasznos génnel és az attP repeatekkel határolt nptII, gfp és indolecetsav-hidroláz (tms2) markergénekkel transzformáltak dohányt. A képződött kanamicin rezisztens kalluszokat egy ideig kanamicin-mentes táptalajon tenyésztették, majd a hajtás regeneráció ismét kanamicin tartalmú szelekciós táptalajon történt. A regenerált 53 fehér hajtásból naftalén acetamid (NAM) tartalmú táptalajon 23 (44%) fejlesztett gyökeret. Az A. tumefaciens tms2 gén terméke a naftalén acetamidot (NAM) auxinná (NAA) alakítja, ami a gyökérfejlődést akadályozza, ugyanakkor a kallusz képződést indukálja. Ilyen körülmények között a gyökér regeneráció mutatja az intrakromoszomális rekombináció általi markergén eliminációt. A 44%-os markergén rekombináció a PUCHTA et al. (1996) által leírtnál egy nagyságrenddel magasabb volt. Ennek ellenére csak 3 (5,6%) „hasznos” gént hordozó növényt kaptak. A két-lépéses regeneráció gyorsabb ugyan, mint a keresztezés vagy az újbóli transzformáció, azonban a kanamicin szenzitivitásra való szelekció kanamicin jelenlétében csökkenti a regeneráció hatékonyságát. Arról is beszámoltak, hogy dohányban az attP repeatek közötti DNS szekvencia az attP 36
régiót szabályozó fehérjék nélkül is kivágódott (ZUBCO et al., 2000). A sok deléció az illegitim rekombináció következménye, ami ZUBCO et al. (2000) szerint a transzformációs vektor fejlesztésével csökkenthető. 2.3.4. Helyspecifikus rekombináz-közvetítette markergén eliminilás Jelenleg szelekciós markergén eliminálására a legígéretesebb kutatási terület az indukálható promoterrel irányított helyspecifikus rekombinázokon alapuló transzformációs eljárás (OW, 2001). Több bakteriális és gomba eredetű rekombináz rendszert adaptáltak már növényre. A rendszerek közös vonása, hogy a rekombináz enzim (Cre, FLP, R) saját cél-szekvenciájához kapcsolódva (lox, FRT, RS) vágja ki a markergént a növényi genomból (OW, 2002; OW és MEDBERRY, 1995). Minden rekombinációs célhelyet rövid oligonukleotidok vesznek körül, az orientációjukat, pedig rövid inverted repeatek határozzák meg. A rekombináz-irányította DNS átrendeződés a helyspecifikus kivágódást, az integrációt, az inverziót és az interkromoszómális rekombinációt foglalja magába. Az egy transzgénikus egységként a növényi sejtbe vitt hasznos- és markergént az aktív rekombináz a rekombinációs helyekbe „zárt” markergén kivágásával választja el. A rekombinázon alapuló technológiák gyors fejlődését az okozza, hogy kiderült, ezzel a rendszerrel a növények széles körében lehet marker-mentes transzgénikus növényeket előállítani. Hátránya azonban, hogy az erős rekombináz expresszió a növényi genom bizonyos helyein átrendeződést okozhat. A Cre-lox rendszer alkalmazásával Arabidopsis-ban, dohányban és paradicsomban figyeltek meg kromoszóma deléciót és inverziót (MEDBERRY et al., 1995; OSBONE et al., 1995; STUURMAN et al., 1996). A rekombináz konstitutív túlexpresszáltatása fenotipikus elváltozást is okozhat (COPPOLSE et al., 2003). Ezek a problémák a rekombináz expresszióját és aktivitását szabályozó indukálható promoterrel (HARE és CHUA, 2002) vagy a rekombináz
expresszióját
korlátozó
37
tranziens
expressziós
stratégiával
(VERGUNST et al., 2000) megoldhatók, ill. a pleiotropikus hatás is kivédhető (MIKI et al., 2004). A módszernek, az inszerciós helyeken változtatható kópia szám további előnyöket biztosít. SRIVASTAVA et al. (1999) génbelövéssel végzett búza transzformációval a többszörös beépülési mintázatot mutató vonalban a kópiaszámot Cre rekombinációval egy kópiássá redukálták. 2.3.4.1. Cre-lox rendszer A P1 bakteriofág Cre-lox rendszere volt az első rekombináz rendszer, amivel marker-mentes növényt állítottak elő. A Cre rekombináz kivágja a közvetlenül a loxP helyek között levő DNS szekvenciákat (ODELL et al., 1990). A T-DNSben közvetlenül a loxP helyek közé klónozzák a szelekciós markergént és hozzá kapcsolják a hasznos gént, majd transzgénikus növényt állítanak elő. A Cre rekombináz gént új transzformációval vagy keresztezéssel viszik be. Az aktív Cre a loxP helyek közé épített markergént a genomból eliminálja. A hasznos gén és a Cre gén keresztezéssel szeparálódik, az utód nemzedékben a marker-mentes növény kihasad (QIN et al., 1994). DALE és OW (1991) a loxP helyre a hpt gént klónozták és a konstrukcióval dohányt transzformáltak. Második transzformációs lépésben a Cre rekombinázzal újra transzformálva 90-95%-os gyakoriságú kivágódást értek el. RUSSEL et al. (1992) dohányt és Arabidopsis-t transzformáltak GUS és loxP helyek között levő acetolaktát-szintáz (ALS) génnel, majd a növényeket a Cre és hpt génnel újra transzformálták. A transzgénikus növényekben molekuláris analízissel kimutatták a kivágott TDNS-t, bizonyítva, hogy a reakció a levelekből regeneráló transzgénikus hajtások korai fejlődési szakaszában és hatékonyan megy végbe. A szelekciós markergént a Cre-lox rendszer alkalmazásával a plasztidból is sikeresen távolították el (CORNEILLE et al., 2001). Azért, hogy elkerüljék a Cre génnel kapcsolt markergén megnyilvánulását, GLEAVE et al. (1999) a Cre-t tranziensen
expresszáltatták,
majd
38
codA
negatív
szelekció
mellett
regeneráltatták. A codA az E. coli citozin-deamináz génje, egy letális domináns gén, az enzim a nem-toxikus 5-fluorocitozint (5-FC) citotoxikus 5-fluorouracillá alakítja át (STOUGAARD, 1993). A kísérlet eredményeként GLEAVE et al. (1999) kis számú (0,25%), de szelekciós marker- és Cre gén-mentes vonalat tudott előállítani. A β-ösztradiollal indukálható promoter, és a hozzátartozó mesterséges transzkripciós faktor, az XVE alkalmazásával a módszer finomítható volt. A hasznos gén és promotere közé építették a lox helyeket, bennük az XVE transzkripciós faktort a promoterével, az nptII szelekciós markerrel és az β-ösztradiol indukálható promoter szabályozása alatt levő Cre rekombinázt kódoló génnel. Kanamicin rezisztens transzformáns Arabidopsis növényekben az indukálás eredményeként a teljes indukciós rendszer, a Cre rekombináz a szelekciós markergénnel együtt kivágódott, és a hasznos gén, jelen
esetben
a
GFP,
expresszálódott.
Arabidopsis-ban
egyetlen
transzformációval minden transzformáns növényben magas hatékonysággal működött a rendszer (29-66%) (ZUO et al., 2001). Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a Cre-lox rendszerrel keresztezés nélkül, közvetlenül, markermentes transzgénikus növény állítható elő. 2.3.4.2. FLP-FRT rendszer A markergén eltávolításához alkalmazott másik rekombináz rendszer a Saccharomyces cerevisie 2μ plazmid eredetű FLP-FRT rendszer. KILBY et al. (1995) dohány és Arabidopsis növényeket transzformáltak FLP rekombinázzal, majd azokat keresztezték olyan transzformált növényekkel, amelyek T-DNSében a GUS gén és a konstitutív expressziót biztosító karfiol mozaik vírus (CaMV) 35S promoter az FRT helyekhez kapcsolt hpt génnel volt elválasztva. A keresztezés eredményeként a hpt gén minden esetben kivágódott és a GUS gén aktiválódott. LYZNIK et al. (1996) transzformációs rendszerében a GUS gént az ubiqutin promotertől az FRP helyek közé klónozott nptII gén választja el. Az első
kukorica
protoplaszt
transzformáció 39
során
keletkező
egy
stabil
transzformáns vonal kalluszából származó protoplasztokat re-transzformálták FLP higromicin konstrukcióval. A kapott kalluszok 30%-ában expresszálódott a GUS, ami azt jelentette, hogy ezekben a vonalakban a marker gén eliminálódott. Ha csak FLP-t (hpt markergén nélkül) hordozó expressziós vektorral retranszformálták a stabil transzformáns protoplasztokat, akkor 2-3%-os gyakorisággal kaptak GUS+ vonalakat. Southern hibridizációval viszont azt az eredményt kapták, hogy az FLP nem inszertálódott, hanem tranziensen expresszálódott. 2.3.4.3. Az R-Rs rendszer ARAKI et al. (1985) számoltak be a Zygosaccharomyces rouxiii pSR1 plazmidjának R/Rs helyspecifikus rekombináz rendszeréről. A rendszerben az R rekombináz génje irányítja a két specifikus Rs hely reciprok rekombinációját, ezáltal az Rs helyek közötti DNS szegmens delécióját vagy inverzióját. Növényre adaptálva és az Rs helyek közé helyezve a markergéneket, a rendszer alkalmas marker-mentes transzgénikus növények előállítására. ONOUCHI et al. (1991, 1995) bizonyították, hogy a R/Rs rendszer növényben is működik. Konstrukciójukban a GUS gén és promotere közé építették az Rs és markergén szekvenciákat. Dohány sejtszuszpenzióban és Arabidopsis-ban a transzformációt követően, az R gén által szabályzott deléciónak köszönhetően, a GUS riporter gén megnyilvánult. SUGITA et al. (1999) az R/Rs rendszert az Ac transzpozáz helyett alkalmazták a MAT vektorban. A dohány transzformációhoz használt TDNS vektor a GUS gén mellett, az Rs helyek között, az ipt szelekciós markergént és a R rekombinázt kódoló gént tartalmazta (EBINUMA és KOMAMINE, 2001). Az ipt gén morfológiai abnormalitással biztosította a kezdeti szelekciót. Az ipt helyett a hajszál gyökeresedési fenotípust okozó A. rhizogenes rol géneket is kipróbálták már (EBINUMA et al., 1997b; CUI et al., 2001). A CaMV35S promoterrel meghajtott R rekombináz a kallusz és hajtás fejlődés nagyon korai fázisában eliminálta az ipt és R géneket. Ennek
40
eredményeként a transzgénikus vonalak között nagy gyakorisággal (39-70%) normálisan fejlődő marker-mentes hajtások jelentek meg. Az esetek 67%-ában három vagy több T-DNS beépülés is történt (SUGITA et al., 1999). Ez feltételezhetően a CaMV35S promoter általi erős konstitutív R gén expressziónak köszönhető, ami az alacsony kópia számú kalluszokban az ipt gént még hajtásképződés előtt kivágta, így ezekből a hajtásokból nem fejlődhetett ipt fenotípusú növény. SUGITA et al. (2000) a korai eliminálódás kiküszöbölésére az R gént egy kukorica eredetű kémiailag indukálható glutation-S-transzferáz (GST-II-27) promoter mögé építették. A GST-II-27 promoterrel meghajtott R-gén által a marker-mentes növények gyakorisága a transzgénikus vonalak 88%-ára emelkedett. Egyszeres T-DNS beépülés 86%-ban történt. Az ipt-indukálta hajtások hormon-mentes táptalajra tételét követően a GST-II-27 promotert szövet tenyészetben SafenerR29148 herbicid ellenszerrel 2 hétig indukálták. Mivel ez a módszer a marker-mentes növények előállításához nem igényel keresztezést, a módszert hibrid nyáron, mint vegetatív szaporítású modell növényen, tesztelték és a transzgénikus vonalak 21%-ában kaptak is markermentes transzgénikus hibrid vonalakat (MATSUNAGA et al., 2002). A transzformációs
hatékonysággal
összevetve
a
marker-mentes
növények
gyakorisága 8% volt. Ezzel a rendszerrel organogenezisen keresztül 25% hatékonysággal, közbülső ipt-hajtás indukálás nélkül, R-génnel egyetlen lépésben állítottak elő marker-mentes transzgénikus rizs növényeket (ENDO et al., 2002). A szövettenyésztésben nehézséget okozó ipt gén kiváltható bifunkcionális markergén használatával. SCHAART et al. (2004) R-Rs rekombináz rendszere a növény-adaptált R recombinázon és egy codA-nptII bifunkcionális szelekciós markergénen alapul. Az nptII gént a transzgénikus szövet szelekciójára alkalmazták, míg a codA gént azoknak a sejteknek a szelekciójára, melyekben a rekombináció nem ment végbe. A pozitív szelekcióból regeneráló kanamicin rezisztens transzgénikus földieper növényekből a második hajtás regeneráció
41
során dexametazonnal (DEX) indukálták a rekombinázt. A negatív codA szelekcióval
minden
vonalban
kaptak
marker-mentes
regeneránsokat
(SCHAART et al., 2004). Az említett rendszerekben a marker-mentes növények előállításához két regeneráció szükséges, az első lépésben pozitív szelekcióval kiszelektálódnak a transzgénikus vonalak, a második regeneráció során pedig negatív szelekcióval azok, amelyekben a rekombináció során a markergén eliminálódott. Az említett marker-mentes transzgénikus növény előállítási stratégiák elég hatékonyan működnek, ugyanakkor nem küszöbölik ki a transzformációs vektor határszekvenciákon kívüli részeinek beépülését. 2.3.5. A vektorgének beépülése Az Agrobacterium-közvetítette burgonya transzformáció során a bináris vektorról történő DNS integrálódás nem mindig fejeződik be a T-DNS baloldali határ szekvenciájánál (KONONOV et al., 1997), ezért annak ellenére, hogy a markergén eliminálódik a genomból, a vektor többi része ott marad, és ez szintén nem kívánatos. A transzformációs vektortól függően a vektor határszekvenciákon kívüli részeinek integrálódása akár 80%-os gyakorisággal is előfordulhat (SÓS-HEGEDŰS et al., 2005). DE VETTEN et al. (2003) szelekciós markergén nélküli hipervirulens AGL0 A. tumefaciens törzs segítségével magas transzformációs hatékonyságot értek el (4,5%). A vektor gének azonban 99 transzgénikus vonalból 60-ban jelen voltak, és csak 10 olyan növényt találtak, amelyben egyszeres T-DNS beépülés történt. A burgonya, akár csak a földieper, vegetatívan szaporított növény, ezért a markergén keresztezéssel történő eliminálása a burgonya esetében is bonyolult. ROMMENS et al. (2004) a marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya vonalakat az ipt és a codA gének segítségével szelektálták. Kettős bináris plazmid rendszerükben a T-DNS-hez hasonló növény eredetű P-DNSben vitték be az ipt-t és a hasznos gént. Az abnormális fenotípusú szövetekből regenerált normális fenotípusú növények az ipt kivágódásával marker-
42
mentesekké váltak. A bináris plazmid P-DNS mögötti részére nptII-vel együtt beépített codA gén megakadályozta azoknak a növényeknek a regenerálását, amelyekbe a vektorgének is integrálódtak. Ezzel a módszerrel több, mint száz marker-
és
vektorgén-mentes,
gumó-specifikus
polifenoloxidáz-gátolt
transzgénikus burgonya vonalat állították elő. Kísérleteink
során
új
transzformációs
rendszerükben
alkalmazott
transzformációs vektor létrehozását és működését, valamint a marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya növények előállítását a 4.2. fejezetben mutatjuk be.
43
44
3. ANYAG ÉS MÓDSZER
3.1. Vegyszerek Kísérleteinkhez a Reanal, Sigma, Serva, Duchefa és Fluka cégek által gyártott vegyszereket és az MBI Fermentas, Appligene Oncor, New England Biolabs és Promega által gyártott enzimeket használtuk. 3.2. Plazmidok A munkánk során használt kiindulási klónozó vektorokat és plazmidokat az 1. táblázatban foglaltuk össze. Az ezek alapján elkészített, és kísérleteinkhez felhasznált plazmid klónokat a 2. táblázatban foglaltuk össze. 3.3. Táptalajok Az Escherichia coli bakteriális munkákhoz LB, Agrobacterium tumefaciens munkákhoz LB, YT (SAMBROOK et al., 1989) és YEB táptalajokat (VERVLIET
et
al.,
1975)
használtunk,
antibiotikumokkal egészítettünk ki.
45
amelyeket
a
megfelelő
1. táblázat Vektorok és plazmidok A plazmid neve
forrása
jellemzője
pET-17b
Novagen, Madison, USA
E. coli expressziós vektor
pBluescript II KS
Stratagene, La Jolla, USA
E. coli klónozó vektor
pUCM2
ROUWENDAL G.
E. coli klónozó vektor
pPG6
ROUWENDAL G.
ST-LS1 intron
pIVSAMV-SYNREC
ROUWENDAL G.
pUCM-35SCNng
ROUWENDAL G.
pGUSN358 - S
Clontech, Palo Malo, USA
pCASeco2
ROUWENDAL G.
pCP60
RATET, P (CNRS Institut des Sciences Vegetales, Gif-sur-Yvette, Franciaország), nem közölt vektor ROUWENDAL G.
rekombinázt tartalmazó plazmid 35S:nosT fúziós konstrukció, vektorban GUS gént tartalmazó plazmid MCS és pBIN19 háttérgéneket tartalmazó pUC19 alapú vektor bináris növénytranszformációs vektor
pPROGMO-02
rekombináz nélküli PROGMO vektor
3.4. Baktériumtörzsek A klónozási munkákhoz az E. coli DH5α (HANAHAN, 1983), JM109 (YANISCH-PERRON et al., 1985), BL21 (STUDIER és MOFFATT, 1986) és a Stratagene által forgalmazott XL1-BlueMRF törzseket használtuk. Növény-transzformációhoz pGV2260-t (DEBLAERE et al., 1985) hordozó A. tumefaciens C58C1 és pTiBo542 supervirulens régiót tartalmazó AGL0 (LAZO et al., 1991) törzseket alkalmaztuk.
46
2. táblázat A munkánk során létrehozott plazmid klónok A plazmid klón neve vektor
inzert
pSGTCI
pET-17
SGTCI, PCR fragmentumként
pSGCP60
pCP60
SGTCI, EcoRI-XbaI
pUCREC1
pUCM2
SYNREC, BglII-BamHI
pUCRECIN
pUCREC1
ST-LS1 intron, Bsp119I-Mva1269I
pUCRECINN
pUCRECIN
nosT, BamHI
pPROGMO30
pUCRECINN 35S promoter, BglII
pPROGMO31
pPROGMO02 p35S:SYNREC:ST-LS1:nosT, Eco31I
pPROGMO32
pPROGMO31 p35S:CodA:nptII:nosT, AscI-BamHI
pCASGUS
pCASeco2
GUS:nosT, SphI-EcoRI
pCASRuGUS
pCASGUS
Rubisco promoter, BglII-NcoI
pPROGMO36
pPROGMO32 pRUB:GUS:nosT, AscI-PacI
3.5. A növények nevelése és fenntartása A genetikai transzformációt Solanum tuberosum cv. Désirée növények levelein végeztük. Az in vitro növényanyagokat 9-10 hetes donor növények három leveles hajtáscsúcsairól
és
egy
nóduszos
szárszegmenseiről
vegetatív
módon
szaporítottuk, majd RM és MS táptalajon (MURASHIGE et al., 1962), 16/8 h fény/sötét fotoperiódus és 24°C hőmérséklet mellett papírdugóval lezárt üvegkémcsőben neveltük. Az in vivo kísérletekhez a két hónapos in vitro növényeket 14 cm átmérőjű cserepekben Florasca B típusú virágföldben, üvegházban neveltük tovább.
47
3.6. Burgonya transzformáció A transzgénikus burgonyanövényeket Agrobacterium tumefaciens közvetítette levéltranszformációval állítottuk elő DIETZE et al. (1995) szerint. A baktériumot antibiotikummal, 20 μM acetosziringonnal kiegészített YEB (pH:7,2) tápoldatban OD600=0.8-1,3-ig növesztettük, majd 1,5 ml-t Eppendorfcsőbe pipettáztunk és 1 perc 7000 rpm centrifugálást követően a leüelepedett baktériumot 1ml MS2 tápoldatban szuszpendáltuk. A transzformációhoz 6 hetes in vitro növények 4-7. levélszintjének leveleit használtuk. A leveleket steril zsilett pengével a főérre merőlegesen a fonákán, a levél méretétől függően 3-4 helyen megvágtuk, a bazális részét pedig eltávolítottuk. 13-15 megsebzett levelet fonákkal felfelé 9 cm átmérőjű, 25-30 ml MS2 tápoldatot tartalmazó üveg Petri-csészébe tettük majd 50 μl baktérium szuszpenziót csöpögtettünk rá, és sötétben 24°C-on két napig együtt tenyésztettük. Ezt követően a leveleket az Agrobacterium-ok elölésére cefotaximot (250 mg/l) is tartalmazó MS2 folyadékkal mostuk. A transzformált leveleket először kallusz (CIM), majd egy hét után és a későbbiekben a hajtásizolálásig hetenként friss hajtásindukáló (SIM) táptalajra tettük. A gyökérregenerálás RM táptalajon történt. A táptalajok az Agrobacterium eliminálására 250 mg/l cefotaximot és pozitív szelekcióra 50 mg/l kanamicint tartalmaztak. A markermentes transzgénikus növények előállításakor a negatív szelekcióra 150 mg/l 5’-fluororcitozint alkalmaztunk. 3.7. Molekuláris biológiai módszerek 3.7.1. Plazmid DNS tisztítása Bakteriális plazmid DNS-t az ún. alkalikus lízis módszerrel tisztítottunk (SAMBROOK et al., 1989). Az RNS-t 30 μg RN-áz A enzimmel lebontottuk (37°C, 30 perc), majd a DNS-t vagy 20%-os PEG 6000, 10 mM MgCl2 oldattal vagy 1/20-ad 4 M Na-acetáttal és 3 térfogat absz. etanollal (-70°C, 1h) 48
kicsaptuk, 75%-os etanolban kétszer mostuk, szárítottuk és 20-50 μl desztillált vízben oldottuk vissza. A rekombinázon alapuló transzformációs vektor előállítása során a plazmid DNS izoláláshoz és tisztításához QIAprep Spin Miniprep Kit-et (QIAGEN) használtunk. 3.7.2. Növényi DNS tisztítása Növénymintáinkból DNS-t SHURE et al. (1983) módszerének nyomán vontunk ki. Körülbelül 0,2 g mintát dörzsmozsárban, folyékony nitrogénben elporítottunk, kivonó puffer (0,6 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, 40 mM EDTA, 4% Sarcosyl, 1% SDS) : 10 M urea : 2 M Na2S2O5 1:1:0,02 arányú keverékével, majd kétszer 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel 5 perc 5000 rpm 4ºC centrifugálással extraháltuk és 0,7 térfogat izopropanollal kicsaptuk (végkoncentráció: 41,2%). A csapadékot visszaoldottuk 300 μl TE, azaz 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 pufferben, majd 20 μg RN-áz A-val kezeltük (37°C, 1 h). Ezt követően a DNS-t 1/20-ad 4 M Na-acetáttal és 3 térfogat absz. etanollal (-70°C, 1h) kicsaptuk, 25 perc 10000 rpm 4ºC centrifugálást követően a csapadékot 75% etanollal kétszer mostuk, beszárítás után 50-100 μl steril desztillált vízben oldottuk és felhasználásig -20°C-on tároltuk. 3.7.3. Növényi RNS tisztítása Növénymintáinkból össz-RNS-t STIEKEMA et al. (1988) módszerének nyomán vontunk ki. Körülbelül 0,2 g mintát dörzsmozsárban, folyékony nitrogénben elporítottunk, kivonó puffer (0,2 M Na-acetát pH 5,2, 1% SDS, 10 mM EDTA) : fenol 1:1 arányú keverékével, majd kétszer 1:1 arányú fenol-kloroform eleggyel extraháltuk, és LiCl-dal (végkoncentráció: 2,5 M) kicsaptuk. A csapadékot 1 ml 2,5 M LiCl-ban, majd 75%-os etanolban kétszer mostuk, 25-30 μl steril desztillált vízben visszaoldottuk és felhasználásig -20°C-on tároltuk.
49
3.7.4. Emésztés restrikciós endonukleáz enzimekkel Plazmid DNS-eket 20-50 μl reakció-térfogatban, a gyártó által javasolt pufferben és hőmérsékleten 60-90 percig emésztettük. A növényi DNS mintákat szintén a megadott optimális pufferben és hőmérsékleten, 200 μl reakciótérfogatban, 100-150 U enzimmel egy éjszakán át inkubáltuk. 3.7.5. Polimeráz láncreakció (PCR – Polymerase Chain Reaction) PCR reakciókat 50 μl végtérfogatban kb. 100 ng DNS templátot, kolónia PCR esetén egy baktérium telepet, 1,5 mM MgCl2-ot, 30-50 pmol primert (3. táblázat), 0,2 mM dNTP keveréket (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1x PCR Taq puffert és 1 U Taq polimeráz enzimet tartalmazó eleggyel végeztünk. A reakcióelegyet első lépésben denaturáltuk (5 perc, 94°C), majd 35-40 cikluson át 94°C-on 30 s-ig, a megfelelő anellálási hőmérsékleten 30 s-ig és 72°C-on 40 s1,5 percig inkubáltuk, végül a keletkezett terméket egyszer 10 percig 72°C-on elongáltuk PTC-200 készülékben. 3.7.6. DNS fragmentumok elválasztása és izolálása A restrikciós emésztés és a PCR során keletkező DNS fragmentumokat 1 vagy 2%-os agaróz gélben választottuk el 1 mg/l etídium-bromidot tartalmazó 1xTBE (90 mM Tris-HCl, 90 mM bórsav, 20 mM EDTA) pufferben és UV fényben tettük láthatóvá. A kívánt DNS fragmentumokat az agaróz gélből szikével kivágtuk és a gyártó utasításait követve, QIAEX II Gel Extraction Kittel vagy MinElute Gel Extraction Kittel (QIAGEN) izoláltuk.
50
3. táblázat PCR primerek Primerek
Szekvencia/eredet
nptII3A
5’-GGAGAGGCTGCTATTCGGCTATG-3
nptII3B
5’-CATGATATTCGGCAAGCAGG-3
nptIII1
5’-TCCACCTTATCGGCAATGAA-3’
nptIII2
5’-CGGCAGTGAGAGCAGAGATA-3’
R352
rekombináz specifikus szensz ROUWENDAL G. -tól
R754C
5’-GCAAGGGAAGAAGTAGACGA-3’
R740
5’-CGTCTACTTCTTCCCTTGCA-3’
R1144C
rekombináz spec. komplementer ROUWENDAL G. -tól
GUSF
5’-cgtgaaatcaaa aaactcgacg-3’
GUSR
5’-GCACACTGATACTCTTCACTCC-3’
recivsup
5’-TTCGAAGTGATCCCCGACAAGGTAAGTTTCTGCT TCTACCTTTG-3’
recivsdown
5’-GCATTCTGCCGAGGTGCTAAACATCACCATGTTT TGGTC-3’
bglnos2
nosT specifikus szensz primer ROUWENDAL G.-tól
M13
5’-TCACACAGGAA-3ACAGCTATGAC-3’
35Score
5’-ATGACGCACAATCCCACTATCC-3’
R396C
5’-GCTTCTCGTGCACACCCACA-3’
MCSBP
5-GTGACGGATCCTTAATTAAGATGCTATTCGGAAGAAC-3
51
3.7.7. DNS klónozás Izolált fragmentumokat a megfelelő restrikciós endonukleázzal emésztett plazmid vektorokba építettük. Amennyiben egy enzimmel hasított helyre klónoztunk, akkor a plazmidot 1 μl 1U/μl CIAP-pal 37°C-on 30 percig kezeltük. A ligálási reakcióba 20 μl végtérfogatban kb. 100 ng fragmentumot, tízszeres moláris többletben vektort, 2,5 U T4 ligáz enzimet, 1xOPA- (Amersham), 1mM ATP-vel kiegészítve és 1x T4 ligáz puffert vittünk. Az előbbi esetben 3 órán át szobahőmérsékleten, az utóbbiban egy éjszakán keresztül 16°C-on inkubáltuk. 3.7.8. Plazmid DNS bejuttatása baktérium sejtekbe Az E. coli sejtek transzformálását INOUE et al. (1990) módszere szerint végeztük. A kompetens sejt szuszpenziót 200 μl-enként folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és –70°C-on tároltuk a felhasználásig. Transzformáció után a sejteket antibiotikum-mentes folyékony tápoldatban 30 percig 37°C-on rázattuk, majd a szelekciós markernek megfelelő antibiotikummal kiegészített szilárd táptalajra szélesztettük. Amennyiben a vektor konstrukció a kék-fehér szelekciót lehetővé tette, a szilárd táptalajra ezt megelőzően 10 μl 1 M izopropil-tio-β-Dgalaktozidot (IPTG) és 40 μl 20 mg/ml 5-brormo-4-kloro-3-indolil--β-Dgalaktozidot (X-gal) szélesztettünk. A pSGCP60 növény-transzformációs vektort E. coli sejtekből A. tumefaciens sejtekbe pRK2013 „helper” plazmid (FIGURSKI et al., 1979) segítségével háromszülős keresztezéssel juttatunk át DITTA et al. (1980) módszere szerint. A „donor”, „recipiens” és „helper” törzseket szilárd táptalajról antibiotikum-mentes szilárd táptalajra oltottuk úgy, hogy a három törzsből egyegy oltókacsnyit 100 μl YEB tápoldatban szuszpendáltunk, majd belőlük 25-25 μl-t egymásra cseppentettünk, majd 28°C-on kb. egy napig inkubáltuk. Miután a
52
kolóniák kinőttek, átoltottuk a megfelelő két antibiotikummal kiegészített szilárd táptalajra, és szelektáltuk a vektort hordozó A. tumefaciens sejteket. A
pPROGMO36
rekombinázon
alapuló
vektor
plazmidot
direkt
transzformációval (HÖFGEN és WILLMITZER, 1988) juttattuk be A. tumefaciens-be. 3.7.9. Hibridizációs technikák 3.7.9.1 DNS blottolás a Southern hibridizációhoz A növényi DNS mintákból 20-20 μg-ot emésztettünk, majd 0,8%-os agaróz gélben, alacsony feszültség mellett, egy éjszakán keresztül elválasztottuk, utána 0,25 M HCl-ban rázattuk 10 percig, majd kétszer 15 percig 0,4 M NaOH-ban rázatva neutralizáltuk. A DNS-t 0,4 M NaOH oldattal Hybond N+ (Amersham) membránra blottoltuk (SAMBROOK et al., 1989) és egyben fixáltuk is. 3.7.9.2. RNS blottolás a northern hibridizációhoz A növényi RNS mintákból LOGEMANN et al. (1987) módszerével 20-20 μg-ot denaturáltunk és formaldehid tartalmú 1%-os agaróz gélben elválasztottunk. A gélt 20 percig 20xSSC-ben (3M NaCl, 3,3 mM tri-Na-citrát, pH 7,0) mostuk, majd 20xSSC-vel blottoltuk Hybond N vagy N+ membránra (Amersham), ezt követően 1 órán át 80°C-on inkubáltuk, végül UV cross-linker készülékkel fixáltuk. 3.7.9.3. DNS jelölése radioaktív izotóppal A Southern és northern hibridizációkhoz [α-32P]-dCTP-vel jelölt, tisztított DNS fragmentumokat
használtunk.
A
jelölést
„random
priming”
módszerrel
(FEINBERG et al., 1983) vagy polimeráz láncreakcióval 2 pmol primer és 100 ng templát DNS jelenlétében [α-32P]-dCTP (0,8MBq) izotóp beépítésével Taq polimeráz felhasználásával végeztük.
53
A DNS fragmentumokat a be nem épült izotóptól Sephadex G-25 oszlopon kromatográfiával választottuk el, majd denaturálás után a hibridizációs pufferhez adtuk. 3.7.9.4. Hibridizációs körülmények A különböző blottolási technikákkal készült membránokat azonos módon hibridizáltuk. A jelölt próbát a CHURCH et al. (1984) által leírt pufferben (0,5 M Na2HPO4, 7% SDS, 1mM EDTA, 1% BSA, pH 7,2), forgó hibridizációs tégelyben, 65°C-on, 20 órán át inkubáltuk a membránnal. Utána a nem specifikusan megtapadt próbát 0,1% SDS, 2xSSC oldatban, 65°C-on, kétszer 20 percig, 0,1% SDS, 0,2x SSC oldattal 15 percig tartó mosással távolítottuk el. Végül a membránt röntgen filmre exponáltuk, majd a kapott képet „scannerrel” digitalizáltuk. Az ábrákat Adobe Photoshop programmal szerkesztettük (Adobe Systems). 3.8 LIP gyors teszt A vizsgált in vitro burgonya növények leveleinek tömegét megmértük, majd ezeket folyékony nitrogénben elporítottuk és megközelítőleg tízszeres mennyiségű reakció pufferben (pH 8.5, 50 mM TRIS, 10 mM CaCl2, 0,3 mM KCl) eldörzsöltük és felszuszpendáltuk. Centrifugálást követően 50 μl felülúszót adtunk 2,9 ml 10-8 M kimotripszint tartalmazó reakció pufferhez. A reakciót 25 μl Suc-AAPF-pNA törzsoldat hozzáadásával indítottuk (végkoncentráció: 10-5 M). Az elsőrendű sebességi állandót a 410 nm-es abszorpcióváltozásból határoztuk meg. A gátlóhatást az extraktum nélkül mért (gátolatlan) elsőrendű sebességi állandó százalékában fejeztük ki.
54
3.9. Burgonyabogár lárva fejlődésének vizsgálata A LIP-et expresszáló transzgénikus növények hatását a burgonyabogár növekedésére SÁRINGER (1967) módosított módszerével végeztük. A szántóföldről származó Leptinotarsa decemlineata imágókat és lárvákat Nagykovácsiban gyűjtöttük, petecsomóikkal együtt klimatikus kamrában 21°Con 20/4 órás fény/sötét periódusban tenyésztettük. Kísérletünkhöz petezsákból kikelt fiatal 3. stádiumú lárvákat használtunk. A kísérlet kezdetén 10-10 lárvát kontroll, ill. LIP-et expresszáló levelekkel etettünk. A leveleket kettévágtuk, friss súlyukat analitikai mérlegen megmértük. Szárazanyag meghatározás céljából az egyik felét 24 óráig 105°C szárító szekrénybe tettük, a másik részével pedig vizes higrosztátumon a lárvákat etettük. Egy napi fogyasztást követően a megmaradt leveleket szintén szárítószekrénybe tettük, majd tömegüket meghatároztuk. A leveleket mindennap cseréltük. A lárvák súlyát a bebábozódásukig, ill. pusztulásukig is naponta mértük. Íly módon pontosan meg tudtuk határozni lárvánként az elfogyasztott szárazanyag pontos mennyiségét. Az adatokat T-próbával analizáltuk (SPSS9, Windows). 3.10. GUS aktivitás meghatározása Hisztokémia
festés
céljából
a
mintákat
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-
glükuronsav (X-Gluc) szubsztrát oldatba mártottuk JEFFERSON (1987) szerint, és 37°C–on inkubáltuk. A reakció után a keletkezett kék termék (5,5’-dibróm4,4’-diklór-indigó) észlelését gátló klorofillt többszöri, 70%-os etanolos mosással távolítottuk el.
55
Fluorimetriás mérésekhez JEFFERSON (1987) módszerével a vizsgálandó szövetből nyers fehérjekivonatot készítettünk, amihez 4-metilumbelliferil-ß-Dglükuronid (MUG) szubsztrátot adtunk. A GUS enzim aktivitásának következtében keletkező 4-metilumbelliferon (MU) termék mennyiségét ismert koncentrációjú standard mellett határoztuk meg 365 nm-es gerjesztési és 455 nm-es emissziós hullámhosszokon. Az össz-fehérje mennyiségét BRADFORD (1976) szerint mértük és a fluorimetriás aktivitásokat erre, ill. időegységre kivetítve fejeztük ki.
56
4. EREDMÉNYEK 4.1. Sivatagi sáska eredetű „kétfejű” proteináz inhibitort expresszáló
burgonya
vonalak
előállítása
és
hatásuk
a
burgonyabogár (Leptinotarsa decemlineata) lárvákra 4.1.1. A "kétfejű" sáska proteináz inhibitor (LIP) klónozása bináris vektorba A LIP burgonyában történő expresszáltatásához a LIP cDNS-t a pCP60 bináris vektorba klónoztuk. A pET-17b::LIP konstrukciót EcoRI-XbaI restrikciós enzimekkel emésztettük és a LIP-et kódoló cDNS-t a pCP60 EcoRI-XbaI restrikciós helyére ligáltuk, ami így a CaMV35S promoter és a nos terminátor régió közé a megfelelő, 5'-3' orientációban épült be. Így az előállított pCP60::LIP konstrukció a jobb és balodali határszekvenciái között szabályozó elemeikkel együtt tartalmazza az nptII kanamicin szelekcióra alkalmas markergént, valamint a LIP cDNS-t. A rekombináns bináris vektort háromszülős keresztezéssel vittük át A. tumefaciens-be. A konjugáció sikerességét Southern hibridizációval bizonyítottuk. Radioaktiv jelet az LIP-nek megfelelő 265 bp méretű tartományban, mind az E. coli-ból, mind pedig az A. tumefaciensből izolált pCP60::LIP minták esetében kaptunk.
4.1.2. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pCP60::LIP transzformációs vektorral A transzformáció során 105 db, 6 hetes in vitro burgonya növény 3-7. levél szintjéről származó leveleket transzformáltunk pCP60::LIP plazmidot hordozó A. tumefaciens-szel. A növényregeneráció során 80 levélből, szelektív
57
körülmények között, 417 db hajtást izoláltunk. Ebből kanamicin rezisztensnek szelektív gyökereztető médiumon 226 vonal bizonyult. A további kísérletekhez 23 növényt választottunk ki véletlenszerűen. Ezeket, in vitro, felszaporítottuk. 4.1.3. LIP-et expresszáló transzgénikus burgonya vonalak izolálása A LIP expresszió vizsgálatát a transzgénikus növényekben northern hibridizációval végeztük. Ezzel párhuzamosan a kimotripszin gátló aktivitást Dr. Asbóth Bence PI gyors teszttel elemezte. A 23 analizált vonalból 15 (65%) adott hibridizációs jelet (2. ábra). Az expressziót mutató vonalakkal a PI gyors tesztet megismételtük, végül a további kísérletekhez a magasabb LIP mRNA expressziót és a transzformálatlan kontroll Désirée növényhez képest mindkét kísérletben szignifikánsan magasabb PI aktivitást mutató 7, 9 és 13 számú vonalakat választottuk ki. Ezeket in vitro tovább szaporítottuk, majd üvegházi cserepekbe ültettük át. A kontroll növényekhez képest a transzgénikus vonalakon fenotípusos elváltozás nem volt látható. A két hónapos üvegházban nevelt transzgénikus burgonyák leveleiből SZENTHE et al. (2002) tisztítottak LIP-et. Fordított fázisú HPLC-n megvizsgálva, mind három vonalból ugyanolyan retenciós időnél mértek csúcsokat, mint a szintetikus LIP esetében. A LIP mennyisége a vízoldható fehérje tartalom 0,04%-a volt. A LIP9-es vonal N-terminális végéről megszekvenált MEQECTPQTK aminosav sorrend megegyezett a várttal (vö. 1. ábra). A növényi LIP extraktum kimotripszin és tripszin gátló hatása is azonos mértékű volt a természetes STI, ill. SCI peptidek egyenkénti inhibíciójával. Ezek az eredmények bizonyították, hogy a kiválasztott transzgénikus burgonya vonalaink által termelt „új” tripszin és kimotripszin inhibitorai megegyeznek a sáska hasonló típusú inhibitoraival.
58
(A)
(B)
(A)
(B)
2. ábra A LIP génnel transzformált S. tuberosum cv. Désirée vonalak northern hibridizációja. K: transzformálatlan kontroll; Az A panelekben 1-23: LIP transzgénikus vonalak. A nyilak azokat a transzgénikus vonalakat jelölik, amiket a további kísérletekhez kiválasztottunk A B panelekben a 28S rRNS-eket mutatjuk be, az egyenletes mintafelvitel és RNS épség szemléltetésére.
59
4.1.4. A LIP7, 9 és 13 transzgénikus vonalak hatása a burgonyabogár lárvákra etetési kísérletekben Transzgénikus növényeink burgonyabogarakra gyakorolt hatását 3. fejlődési stádiumban levő lárvákkal végzett etetési kísérletekben vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy a LIP-et termelő burgonya növényekkel táplálkozó burgonyabogár lárvák fejlődése kissé, de szignifikánsan elmarad a kontroll növényeket fogyasztó lárvákéitól. A kontroll Désirée növénnyel táplálkozó lárvák átlagos napi tömeggyarapodása a bebábozódás első napjáig (a kísérlet 5. napja) 16-25%-kal magasabb volt, mint a LIP-et expresszáló burgonya leveleket fogyasztóké. A kontroll lárvák súlya az 5. napon azért esett vissza, mert a 4. napon fejlődésük elérte az előbáb stádiumot. Ebben a stádiumban a lárvák kevesebb táplálékot fogyasztanak, és a talajba ássák magukat. A kísérleti környezet azonban erre nem adott lehetőséget. Szignifikáns különbség (P=0,05) kontroll, ill. transzgénikus növénnyel táplálkozó lárvák súlyában a 2. és 4. napon volt kimutatható. Meg kell említeni, hogy a kísérlet 3., 4. és 5. napján a LIP-et termelő növényt fogyasztó 10 lárva közül 3 elpusztult. Az etetési kísérletből, példaként, a 3.A ábrán a LIP9 vonal értékei láthatók. A kísérlet ismétlése, valamint a LIP7 és 13 vonal etetése is hasonló eredménnyel zárult. A bioesszé alatt a szárazanyagra vonatkoztatva mértük az elfogyasztott levél mennyiségét is. Ezek az adatok mutatták, hogy a lárvanövekedéssel arányosan fokozódik a táplálék igény. A LIP-et expresszáló növényt fogyasztó lárvák napról-napra 20-29%-kal kevesebb levelet fogyasztottak, mint azok, amelyek a transzformálatlan kontrollal táplálkoztak (3.B ábra). Ezek az eredmények magyarázhatják a lárvanövekedésben mutatott különbségeket, valamint alátámasztják azt is, hogy a LIP-nek fiziológiailag toxikus hatása van.
60
3. ábra A LIP9 transzgénikus burgonya vonal etetési kísérletének grafikonja. A: 10 kontroll Désirée (fehér oszlop) és 10 LIP9 transzformáns vonal (szürke oszlop) leveleivel etetett burgonyabogár lárvák átlagos napi súlygyarapodása. A 0. napi oszlop mutatja a kezdő tömeget. B: A kontroll Désirée és LIP9 leveleken tenyésztett lárvák által naponta elfogyasztott levelek szárazanyag tartalma (bal tengely) és LIP tartalma (jobb tengely). I: a szórás.
61
A kísérlet végén a lárvákat talajra helyeztük, ahol 3 napon belül mindegyik bebázódott. A talajban mindegyik lárva imágóvá alakult. A felszínre jött bogarakat két hétig laboratóriumi körülmények között tovább tenyésztettük. A bogarakon morfológiai elváltozást nem tapasztaltunk.
62
4.2. A marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak előállítására alkalmas pPROGMO36 vektor létrehozása és tesztelése burgonyában A pPROGMO36 vektor működésével kapcsolatban az alábbi elképzelésünk volt: •
A pPROGMO36 vektor fő részei: a jobb oldali határ szekvencia, a multi klónozó hely és benne a GUS riporter gén, a specifikus rekombináz helyek között a Zygosaccharomyces rouxiii növényre adaptált szintetizált rekombináz génje, a vektor működéséhez szükséges gének, valamint a pozitív és negatív szelekciós markergének.
•
Mivel a pPROGMO36 csak a jobb oldali határszekvenciát tartalmazza, a transzformáció során a növényi genomba az egész vektor be tud épülni.
•
Ha a pPROGMO36 vektorunk integrálódik, a rekombináz aktivitásának következtében
a
Rs
helyek
közötti
szekvencia
a
genomból
kirekombinálódhat és a növényben csak a kívánt gén, jelen esetben a GUS marad, a transzgénikus növény így marker- és vektorgén-mentessé válik (4. ábra).
63
4. ábra A pPROGMO36 működése. Rs: rekombináz hely; RB: jobb oldali határszekvencia; S: ST-LS1 intron; 35S: CaMV35S promoter; T: nos terminátor; Rubpr: krizantén Rubisco promotere GUS: a multiklónozó helyre épített β-glükuronidáz gén; codA: a negatív szelekcióhoz alkalmazott ciano-deamináz gén, nptII: a pozitív szelekcióhoz alkalmazott neomicin-foszfotranszferáz II gén; p-nptIII-t: a vektorunkat hordozó baktérium törzsek szelekcióját segítő promoter, neomicin-foszfotranszferáz gén, terminátor konstrukció.
64
4.2.1. A pPROGMO36 konstrukció előállítása Transzformációs rendszerünkben a SCHAART et al. (2004) Zigosaccharomyces rouxii helyspecifikus rekombináz génjének növényre adaptált, újra szintetizált változatát használtuk. Azért, hogy a rekombináz gén működését Agrobacteriumban meggátoljuk a konstrukció előállítása során a génbe a 370. bp-nál egy STLS1 intront építettünk. Első lépésben a PIVSAMV-SYNREC plazmidból, BglIIBamHI emésztés után izoláltuk a rekombináz génnek megfelelő fragmentumot és a pPUCM2 klónozó vektor BglII-BamHI restrikciós helyeire építettük. Erre azért volt szükség, mert az eredeti plazmidot a későbbiekben használt Mva1269I enzim vágta. Az ST-LS1 intront a pPG6 plazmid GUS génjéből PCR termékként "recinsup" és "recinsdown" primerekkel izolátuk, majd Mva1269I és Bsp119I restrikciós enzimekkel emésztve, a pPUCM2-SYNREC konstrukció ugyanezen restrikciós helyeire klónoztuk. A PCR termék, a hasító helyek és a pontos beillesztésre való törekvés miatt, a két végén 14, ill. 20 bp rekombináz gén szekvenciát is tartalmazott. A klónozás helyességét szekvenálással ellenőriztük. A megszekvenált plazmidba a rekombináz gén mögé BamHI helyre építettük a pPUCM-35SCNng plazmidból "bglnos2-M13" PCR primerekkel amplifikált, majd BglII-BamHI enzimekkel hasított, nos terminátort (nosT). A BglII és BamHI tapadós végei kompatibilisek egymással, ezért a nosT fragmentum be tudott épülni a pPUCM2-SYNREC BamHI helyére. A megfelelő orientációjú inszerciót tartalmazó plazmidot BamHI-Bsp119I és BamHI-BglII emésztésekkel választottuk ki. A rekombináz gén elé, BglII restrikciós helyre, a pPUCM2-SYNREC-nosT konstrukcióba szabályzó elemként a CaMV35S promotert építettük, ami a végein BglII-BamHI helyekkel rendelkezett. A megfelelő orientációjú plazmidokat kolónia PCR segítségével, "35Score-R396C" primereket használva választottuk ki (5.A ábra). Az előállított 35Spr-SYNREC-ST-LS1int-nosT konstrukciót BglII-BamHI fragmentumként klónoztuk a pPROGMO02 plazmid BglII-BamHI tapadós végeivel kompatibilis, Eco31I restrikciós helyére. A beépülést és orientációt
65
"bglnos2-MCSBP" primereket használva kolónia PCR-rel bizonyítottuk. Ezt a konstrukciót pPROGMO31-nek neveztük el (5.A ábra). A
következő
lépésben
a
35S-codnptII-nosT
fragmentumot
a
pPROGMO13-ból AscI-BamHI enzimekkel izoláltuk és a pPROGMO31 AscIBamHI szakaszára cseréltük. Ez a konstrukció volt a „pPROGMO32”, ami már tartalmazta a T-DNS jobb oldali határszekvenciáját, azt követően egy multiklónozó helyet (MCS), a két helyspecifikus rekombináz szekvencia között a szabályozó elemeikkel ellátott rekombináz gént, a vektor baktériumban való szaporodásához és szelekciójához szükséges géneket, valamint a negatív és pozitív szelekcióra alkalmas codA és nptII géneket (5.A ábra). A multiklónozó helyre a vektor működésének tesztelésére a GUS riporter gént építettük. A GUS gén mögé a pPUCMGUSN plazmidból a Bsp119I-EcoRI enzimpárral izoláltuk a GUS egy szakaszát és a nosT-t, amit aztán a pGUSN358-S vektorban a GUS gén megegyező részének a helyére klónoztunk. A GUS-nosT konstrukciót ezután áttettük a pCASeco2 klónozó vektor EcoRISphI restrikciós helyére, majd itt a GUS gén elé, a BglII-NcoI hasító helyre, a krizantén eredetű Rubisco promotert építettük be (5.B ábra). A pPROGMO36 konstrukció előállításának utolsó lépéseként, a Rubisco promoter-GUS-nosT fragmentumot a pPROGMO31 multiklónozó részén levő AscI-PacI helyre tettük (5.B ábra).
66
67
5. ábra A pPROGMO36 konstrukció létrehozása. (A): a rekombináz gén és szabályzó elemeinek összeállítása; (B): a GUS gén és szabályzó elemeinek összállítása; Rs: rekombináz hely; RB: jobb oldali határszekvencia; S: ST-LS1 intron; 35S: CaMV35S promoter; T: nos terminátor; Rubpr: krizantén Rubisco promotere; GUS: a multiklónozó helyre épített β-glükuronidáz gén; codA: a negatív szelekcióhoz alkalmazott ciano-deamináz gén, nptII: a pozitív szelekcióhoz alkalmazott neomicin-foszfotranszferáz II gén; p-nptIII-t: a vektorunkat hordozó baktérium törzsek szelekcióját segítő promoter, neomicin-foszfotranszferáz gén, terminátor konstrukció.
68
4.2.2. A rekombináz működésének bizonyítása burgonyában 4.2.2.1. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pPROGMO36 vektorral A pPROGMO36 transzformációs vektort A. tumefaciens AGL0 törzsébe transzformáltuk. Ellenőrzés után kiválasztottunk egy megfelelő törzset, amivel in vitro 6 hetes S. tuberosum cv. Désirée 45 levelét transzformáltuk. Kanamicint tartalmazó, azaz szelektív, kallusz- (1 hét), majd hajtásindukáló (4-6 hét) táptalajon történő növényregenerálás után, 100 hajtást izoláltunk. Ezek közül szelektív körülmények között 91 fejlesztett gyökeret. A legyökeresedett növények GUS aktivitását 2-2 levélen hisztokémiai festéssel vizsgáltuk. Indigó kék színeződést, azaz GUS aktivitást, 68 vonal esetében kaptunk. Ezek közül a további kísérletekhez 11 növényt szaporítottunk fel, in vitro. 4.2.2.2. Az nptII transzgén jelenléte és kópiaszáma a GUS pozitív transzgénikus vonalakban Marker- és vektorgén-mentes növényeket nagyobb valószínűséggel azokból a transzgénikus vonalakból kapunk, amelyekben a rekombináz, ill. nptII gén a genomba egy, vagy alacsony kópiaszámban épült be. Ezért a kiválasztott 11 növényben Southern hibridizációval, próbaként az nptII-t használva, vizsgáltuk a transzgén beépülés kópiaszámát. Megállapítottuk, hogy 11 vonalunkból nyolcban az nptII gén egy kópiában integrálódott a burgonya genomba (6. ábra).
69
6. ábra A szelektív körülmények között regenerált és GUS hisztokémiai festéssel festődött vonalak Southern hibridizációja nptII próbával. (A) EcoRI enzimmel emésztett DNS-ek hibridizációja. (B): HindIII enzimmel hasított DNS-ek hibridizációja. 1-11: transzgénikus vonalak; K, nem transzformált, kontroll DNS, M: 10kb méret marker (GeneRulerTM, Fermentas); (C): a pPROGMO36 tesztelése és a rekombináz működés bizonyításának folyamatábrája.
4.2.2.3. A rekombináz gén expressziójának vizsgálata A nyolc egy kópiás inszerciót hordozó transzgénikus növényünkből RNS-t izoláltunk és northern hibridizációval megvizsgáltuk a rekombináz gén expresszióját. Hibridizációs próbaként a pPROGMO36 plazmidból PCR-rel felszaporított rekombináz gén 740-1144 bp izotóppal jelölt fragmentumát használtuk. A hibridizációs kép alapján megállapítottuk, hogy minden kiválasztott vonalban expresszálódik a rekombináz gén (7. ábra)
70
(A)
(B) . 7. ábra Rekombináz expresszió kimutatása northern hibridizációval (A). A számok a transzgénikus vonalakat jelölik; K: transzformálatlan, kontroll Désirée. Az alsó panelben (B) a megfelelő 28S rRNS-eket mutatjuk be az egyenletes mintafelvitel és RNS épség szemléltetésére.
4.2.2.4. Növényregenerálás 5-FC szelekcióval A rekombináz működésének bizonyítására az egy kópiás növényekből ismét hajtást
regeneráltunk.
A
hajtás
regenerálás
során
negatív
szelekciót
alkalmaztunk, hogy előnyt adjunk azoknak a regeránsoknak, amelyekben a rekombináz működött, és amelyek marker- és vektorgén-mentesek. A 6 hetes in vitro növények 20-20 levelét 2 napig MS2 tápoldaton, majd 1 hétig szelekciómentes kallusz indukáló táptalajon, végül 4-6 hétig a negatív szelekciót biztosító 5-FC-t tartalmazó hajtásregeneráló táptalajon tenyésztettük (8. ábra). Így azok a hajtások, amelyekben a rekombináció nem ment végbe és a codA gén működött, elpusztultak. A nyolc vonal 20-20 levelén szelektív körülmények között összesen 242 5-FC rezisztens hajtást izoláltunk (4. táblázat). A negatív szelekció
71
működését kanamicint tartalmazó hajtás gyökereztető táptalajon teszteltük. Azokban a regenerált hajtásokban, amelyek ilyen körülmények között nem voltak képesek a gyökérképzésre, a negatív szelekció működött és a növények marker-mentessé váltak. Két-három hét gyökereztetést követően 18 kanamicin szenzitív vonalat kaptunk.
8. ábra Regeneráció 5-FC tartalmú táptalajon. 3 és 5, transzgénikus vonalak; K: transzformálatlan, kontroll Désirée; (A): a pPROGMO tesztelése és a rekombináz működés bizonyításának folyamatábrája.
72
4. táblázat Az 5-FC-t tartalmazó táptalajon regenerált hajtások száma és kanamicin érzékenysége
(A)
Tr.vonal FCR hajtás KmS 3 4 5 6 7 8 9 10
Σ
29 91 14 30 12 17 31 18
242
1 7 2 1 0 0 2 6
18
Tr. vonal: a transzgénikus vonalak sorszáma; FCR hajtás: 5-FC rezisztens hajtások száma KmS: kanamicin szenzitív, kanamicin tartalmú táptajon gyökeret nem fejlesztő hajtások száma; (A): a pPROGMO tesztelése és a rekombináz működés bizonyításának folyamatábrája.
4.2.2.5. A kanamicin szenzitív vonalak PCR analízise A 18 kanamicin szenzitív vonalból DNS-t izoláltunk, majd a marker- és vektorgének hiányát, ill. a GUS jelenlétét PCR reakcióval bizonyítottuk. Először a vonalainkat nptII markergénre az "nptII3A" és "nptII3B" primerekkel
73
teszteltük. 14 növényben nem kaptunk amplifikátumot. Ezeket a vonalakat az nptIII és rekombináz gén jelenlétére is megvizsgáltuk. Az "nptIIIA" és "nptIIIB" primerekkel 13 mintában nem kaptunk fragmentumot, míg a "R352", "R754C", ill. "R740", "R1144C" primerekkel végzett reakció szerint 11 transzgénikus vonalból hiányzott a rekombináz génnek megfelelő fragmentum. A konstrukció működése alapján a GUS-nak a genomban kell maradnia. Ezért a növényeinket GUS primerekkel indított PCR-rel és GUS hisztokémiai festéssel is vizsgáltuk. A ß-glükoronidáz génnek megfelelő fragmentumot csak négy utód vonalból sikerült amplifikálni. Hétből nem kaptunk GUS fragmentumot. Valószínűleg belőlük vagy az egész konstrukció eliminálódott vagy a regeneránsaink, a szülői vonal mozaikossága miatt, azok transzformálatlan sejtjeiből keletkeztek. Eredményeinket a hisztokémiai festés is alátámasztotta. A szülők és a várt eredményt adó vonalak PCR analízise a 9. ábrán látható. 4.2.2.6. Az 5. számú transzgénikus vonal marker- és vektorgén-mentes utódainak Southern hibridizációja Southern hibridizációval az 5. transzgénikus vonalban bizonyítottuk a markerés vektorgének eliminálódását (10. ábra). A hibridizációs próba a jelölt GUS fragmentum volt. A kapott eredmény alapján az egy kópiában jelenlevő nptII gén mellett a GUS több másolatban van jelen, ez azt jelentheti, hogy az egyik rekombináció már a genomba történő integrálódás előtt végbement és így ebben az esetben a vektor Rs közti része nem épült be. Az első regenerációs lépésben szükséges kanamicin rezisztenciát a kimutatott egyetlen nptII gén biztosította. A hibridizációs képen látható, hogy az egyik jel a szülői vonalban kapott két jel egyikével azonos magasságban van, míg a másik jel esetében méretbeli különbség van a szülő és utód között. Ezt a méretbeli különbséget a rekombináció hozta létre. Végeredményben tehát a rekombináz működésének köszönhetően a második regeneráció során negatív szelekcióval négy olyan növényt kaptunk, melyben csak a hasznos gén volt kimutatható.
74
T4 M 0 1 2
T5
K
0 1 2
+ (A)
npt II npt III rec GUS
9. ábra A rekombináz működése által marker- és vektorgénmentes GUS transzgénikus burgonya vonalak PCR analízise. 0: a transzformációból származó szülő vonalak; 1, 2: utód vonalak, amelyekben a rekombináció sikeresen végbement; K+, pPROGMO36 transzformációs vektor; K-, transzformálatlan, kontroll Désirée. (A): a pPROGMO tesztelése és a rekombináz működés bizonyításának folyamatábrája. M: 10kb DNS méret marker (GeneRulerTM, Fermentas)
75
10. ábra A GUS gén jelenlétének kimutatása Southern hibridizációval a rekombináz működése által marker- és vektorgén-mentessé vált vonalakban. Az 5. transzgénikus vonal és rekombináns utód vonalainak Southern hibridizációja GUS próbával. 5: a transzformációból származó 5. szülő vonal; 1, 2: utód vonalak, amelyekben a rekombináció sikeresen végbement; K: transzformálatlan, kontroll Désirée; M: 10kb DNS méret marker (GeneRulerTM, Fermentas)
76
4.2.3. Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya vonalak előállítása tranziens szelekcióval 4.2.3.1. Solanum tuberosum cv. Désirée transzformálása pPROGMO36 vektorral és regenerálása ROMMENS et al. (2004) kimutatták, hogy a marker-mentes vonalak gyakorisága növekszik, ha tranziens szelekciót alkalmazunk, és egy aránylag rövid idejű pozitív szelekciót követően negatív szelekcióval megakadályozzuk azoknak a hajtásoknak a növekedését, melyekben nem történt meg a rekombináció. Ebből kiindulva a pPROGMO36 transzformációs gyakoriságát tranziens szelekcióval is teszteltük. Ehhez 50 db, 6 hetes in vitro Désirée leveleket fertőztünk a pPROGMO36-ot hordozó Agrobacterium törzzsel. Két napos együtt-tenyésztést követően a kallusz indukálás 7 napig kanamicin tartalmú táptalajon történt (11. ábra). A 5-FC negatív szelekciót az ezt követő hajtás regenerálás során alkalmaztuk. Három-öt hét múlva, 150 hajtást izoláltunk és gyökeresítettünk nem szelektív körülmények között. Vonalanként két-két levelet GUS hisztokémiai festéssel vizsgálva, indigó kék elszíneződést 9 növény mutatott. A hajtások többsége tehát nem volt transzgénikus. A GUS festődést nem mutató 141 hajtás valószínűleg a pozitív szelekció megszüntetése után regenerálódott. 4.2.3.2. A GUS aktivitást mutató vonalak PCR analízise A GUS aktivitást mutató transzgénikus növényekből DNS-t izoláltunk és a marker, ill. vektor gének rekombinációját PCR reakcióval bizonyítottuk. Vonalainkat markergén jelenlétére az "nptII3A" és "nptII3B" primerekkel teszteltük. Az nptII-nek megfelelő fragmentumot egyikben vonalból sem
77
a
11. ábra Kanamicin tartalmú táptalajon történő kalluszosítást követő hajtásregeneráció 5’-FC szelekcióval. P: pPROGMO36 transzformánsok; K: transzformálatlan kontroll; (A): a pPROGMO transzgénikus vonalak tranziens szelekcióval történő előállításának folyamatábrája. tudtunk felszaporítani. Az nptII elvesztését alátámasztotta a gyökerezési teszt eredménye is, ami azt mutatta, hogy ezek a növények kanamicin tartalmú táptalajon nem tudnak gyökeret fejleszteni. A negatív szelekció tehát jól működött. Az "nptIIIA" és "nptIIIB" primerekkel hét vonalban, míg a rekombináz specifikus "R740" és "R1144C" primerekkel hat transzgénikus vonalban nem kaptunk az nptIII, ill. a rekombináz génnek megfelelő 78
fragmentumot. Elképzelhető, hogy azokban a vonalakban, amelyekben kaptunk nptIII, ill. rekombináz PCR terméket részleges beépülés történt, s így a 2. rekombinációs hely hiánya miatt a rekombináció nem mehetett végbe. A GUS primerekkel indított PCR-ben minden növényből kaptunk GUS fragmentumot (12. ábra).
K TS M1 2 3 4 5 6 7 8 9 + (A)
npt II npt III
rec
GUS
12. ábra A GUS festődést mutató vonalak PCR analízise. TS 1-3, 7-9: Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak; 4-6: részlegesen marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak; K+: pPROGMO36 transzformációs vektor; K-: transzformálatlan, kontroll Désirée. (A): a pPROGMO transzgénikus vonalak tranziens szelekcióval történő előállításának folyamatábrája.
79
4.2.3.3. A transzgén kópiaszámának meghatározása Azért, hogy megtudjuk van-e összefüggés a marker- és vektorgének rekombinálódása és a beépülés kópiaszáma között, a GUS aktivitást mutató vonalakban Southern hibridizációval meghatároztuk a genomba integrálódott transzgének
számát.
Az
EcoRI
és
HindIII
emésztett
DNS-ekhez,
gélelektroforézist és blottolást követően, izotóppal jelölt GUS fragmentumot hibridizáltunk (13. ábra). A hibridizációs kép alapján megállapítottuk, hogy kb. 50-50%-ban történt egyszeres, ill. több, de valószínűleg csak kétkópiás beépülés. Az azonban érdekes, hogy a marker és vektorgén-mentes vonalak közül csak az 1. számú esetében van egy kópiás beépülés, míg a többi öt vonalban legalább két kópia található. Azok a növények viszont, amelyekben a rekombináció nem történt meg, a transzgént csak egy kópiában tartalmazták. Ez valószínűleg azért lehet, mert kicsi az esély arra, hogy több kópiában is részleges beépülés történjen. A negatív szelekció miatt azok a vonalak, amelyekben a törés a codA gén után történt, nem tudtak regenerálódni. Bár, a PCR-ek és a Southern hibridizáció alapján nem találtunk rá példát, de előfordulhat olyan több kópiás beépülés is, amelyben a részleges beépülés mellett egy teljes integráció is végbe megy. Ebben az esetben a hibridizációs képen a rekombinációból származó GUS génnek is jelet kellene adni. Mindenesetre a rekombináció a több transzgén beépülésénél is ugyanúgy végbe megy, mint egy kópia esetében.
80
13. ábra A marker- és vektorgén-mentes GUS festődést mutató vonalak Southern hibridizációja. A DNS-eket EcoRI enzimmel emésztettük és GUS próbával hibridizáltuk. 1-3, 7-9: A marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak; 4-6: részlegesen markerés vektorgén-mentes transzgénikus vonalak; K: transzformálatlan, kontroll Désirée; M: 10kb méret marker (GeneRulerTM, Fermentas)
81
Végeredményben tehát 150 növény közül találtunk 6 olyan transzgénikus vonalat, amelyben a rekombináció vagy tranziensen, vagy közvetlenül a beépülés után végbement, így ezek genomjából a marker- és vektorgének eliminálódtak. A növényben csak a multiklónozó helyre tett GUS gén, ill. a jobboldali határszekvencia maradt. A GUS aktivitás mértékét fluorimetriás méréssel határoztuk meg. A hisztokémiai festéssel megfigyelt magas GUS aktivitást (14. ábra) a mért adatok is alátámasztották (15. ábra).
14. ábra Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növények GUS aktivitása hisztokémiai festéssel.
82 82
15. ábra Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növények GUS aktivitása. 1-3, 7-9: Marker- és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak; K: transzformálatlan, kontroll Désirée.
Désirée burgonya leveleket transzformálva a pPROGMO36 vektorral, tranziens szelekcióval, egy növényregenerációs lépésben az izolált 150 hajtásból hatot találtunk GUS+ marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növénynek. Gyakoriság: 4%.
83 83
4.3. Új tudományos eredmények Munkánknak kettős célja volt. Az egyik cél annak vizsgálata volt, hogy SZENTHE et al. (2004) által a sivatagi sáskából izolált tripszin (SGTI) és kimotripszin (SGCI) inhibitor „kétfejű” fehérje formában (LIP) alkalmas lehet-e a burgonya burgonyabogárral szembeni ellenálló képességének javítására. Munkánk másik célja az volt, hogy burgonyára, mint vegetatív módon szaporított növényre is alkalmazható, olyan új transzformációs vektort hozzunk létre, amellyel egyszerre lehet marker- és vektorgén-mentes GM növényeket előállítani. A kapott új tudományos eredményeinket a következőkben foglalhatjuk össze: 1. LIP transzgénikus burgonya vonalak előállítása céljából a LIP cDNS-t a pCP60 bináris vektorba klónoztuk és A. tumefaciens-be juttattuk. Az így létrehozott A. tumefaciens törzzsel S. tuberosum cv. Désirée növényeket transzformáltunk. A LIP expresszióját a transzgénikus burgonya vonalakban northern hibridizációval és PI gyors teszttel vizsgáltuk. Három, erős LIP mRNA expressziót és a transzformálatlan, kontroll Désirée növényekhez képest szignifikánsan magasabb PI aktivitást mutató vonalat választottunk ki a további kísérletekhez. Megállapítottuk, hogy a növény által termelt LIP mind szekvenciájában, mind kimotripszin és tripszin gátló hatásában megegyezik a sivatagi sáska természetes SGTI, ill. SGCI peptidjeivel. 2. Etetési kísérletekkel vizsgáltuk a LIP-et expresszáló transzgénikus vonalak burgonyabogár lárvákra kifejtett hatását. A LIP-et termelő burgonya növényekkel táplálkozó burgonyabogár lárvák fejlődése kissé, de szignifikásan gátlódott, közülük néhány el is pusztult. A kontroll Désirée növénnyel táplálkozó lárvák átlagos napi tömeggyarapodása és
84 84
levél fogyasztása a bebábozódás első napjáig magasabb volt, mint a LIP-et expresszáló burgonya leveleket fogyasztóké. Az etetési kísérlet végén a talajra helyezett lárvák három napon belül bebázódtak. Az imágókon és bogarakon morfológiai elváltozást nem tapasztaltunk. 3. Létrehoztunk egy marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növény előállításra alkalmas transzformációs vektort, ami gyakorlatilag maga egy T-DNS, és működése növényre adaptált R rekombinázon és codA-nptII bifunkcionális szelekciós markergéneken alapul. A vektort pPROGMOnak neveztük el. 4. A pPROGMO-ba beépítettük a GUS riporter gént. Az így kapott p PROGMO36-tal transzgénikus burgonya növényeket állítottunk elő. A transzgén megnyilvánulását GUS hisztokémiai festéssel bizonyítottuk. Southern hibridizációval kiválasztottuk az egy kópiás vonalakat és northern
hibridizációval
kimutattuk
bennük
a
rekombináz
gén
expresszióját. 5. Bizonyítottuk a rekombináz műkődését oly módon, hogy a fent említett vonalak leveleiből negatív szelekcióval hajtást regeneráltunk, majd pozitív szelekcióra szenzitív növényeket izoláltunk. A marker- és vektorgének eliminálódását és a GUS gén növényi genomban maradását, azaz közvetve a rekombináz működését, molekuláris módszerekkel is alátámasztottuk. 6. Ideiglenes pozitív szelekciót követő negatív szelekcióval 4%-os gyakorisággal
kaptunk
hat
marker-
és
vektorgén-mentes
GUS
transzgénikus vonalat. Ezek a vonalak mind magas GUS aktivitás mellett alacsony kópia számú beépülést hordoztak.
85 85
86 86
5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
5.1. Sivatagi sáska eredetű tripszin és kimotripszin inhibitort expresszáló burgonya vonalak burgonyabogár lárvákra gyakorolt hatásából levonható következtetések A burgonya legnagyobb kártevője a burgonyabogár. Az ellene való védekezésre szórják ki a burgonyatermesztésben használt növényvédő inszekticidek 34%-át. A rovarölő kemikáliák használatának csökkentésére létrehozott, biotechnológiai módszerekkel előállított, Bt toxint termelő rovarrezisztens transzgénikus burgonya vonalak már kereskedelmi forgalomban vannak. A proteináz inhibitorok (PI-ok) expresszáltatása is sok növény fajban, sokféle rovar ellen hatásosnak bizonyult. Ennek ellenére eddig PI-okkal hatékony burgonyabogár rezisztenciát nem sikerült kialakítani. Ennek az lehet az oka, hogy a burgonyabogár nemcsak a burgonya védekezési mechanizmusában keletkező PIokat képes inaktiválni, hanem más burgonyába integrált heterológ PI-okat is (GRUDEN et al., 2003; BRUNELLE et al., 2004). A sivatagi sáska hemolimfából izolált tripszin és kimotripszin gátló természetes peptidjeit „kétfejű” formában kódoló LIP cDNS-t klónoztuk, és a megfelelő szabályozó elemekkel ellátva, burgonyába transzformáltuk. Northern hibridizációval és gyors kimotripszin teszttel a további kísérletekhez három transzgénikus vonalat választottunk ki. Mindhárom vonalban a LIP erős expressziót mutatott és a kimotripszin gátlás is a kontroll Désirée növényhez viszonyítva négy-ötszörös volt. Ennek ellenére a levél extraktumokban csak kis mennyiségű (0,04%) LIP peptid volt. A teljes proteináz gátláshoz valószínűleg az oldható fehérje tartalom 0,5-1%-át kitevő PI mennyiségre lenne szükség (JONGSMA és BOLTER, 1997). Az alacsony LIP mennyiség az mRNS gyenge transzlációjával vagy a peptid instabilitásával magyarázható. OUTCHKOUROV et al. (2003) kimutatták, hogy a magas szinten expresszálódó karboxipeptidáz 87 87
gátló equisztatint a transzgénikus növény az akkumulálás során degradálta, ezért az előetetési kisérletekben oly hatékony equisztatinnal ily módon sem tudtak teljes proteáz gátlást elérni. A LIP mennyiségének emelésével a gátlás és a rovarlárvákra kifejtett hatás is fokozódhatna. A LIP koncentrációja emelhető lenne, pl. úgy, hogy azt egy N-terminális szignál segítségével az endoplazmatikus retikulumba vagy kloroplasztba juttatnánk, ahol is az felhalmozódna. A másik lehetőség a LIP degradáció gátlása volna. Ehhez először meghatároznánk a PI-on a növényi proteázok hasítási helyeit, majd úgy változtatnánk meg a szekvenciáját, hogy az ne legyen a lebontó enzimeknek szubsztrátja, miközben biológiai aktivitását megtartja. Mindemellett lehetséges a LIP-pel együtt olyan PI-ok ko-expresszáltatása is, amelyek gátolják a LIP-et degradáló enzimeket. Ily módon tudták, pl. OUTCHKOUROV et al. (2003), in vitro az equisztatint a növényi proteázokkal szemben egy cisztein proteáz inhibitorhoz hasonló kininogén domén III-mal megvédeni. Az alacsony peptid szint ellenére a transzgénikus burgonya leveleket fogyasztó burgonyabogár lárvák növekedése a transzformálatlan növényekkel táplálkozókhoz képest 16-25%-kal csökkent. Ellenkező hatást, mint DeLEO et al. (2001) és LECARDONELL et al. (1999), akik arról számoltak be, hogy az alacsony PI (MTI-2, ill. OCI) expressziójú növényeket fogyasztó rovarok a kontrollhoz képest jobban fejlődtek, mi nem figyeltünk meg. PATTHY et al. (2002) kimutatták, hogy a LIP a szarvasmarha kimotripszint nagyon erősen köti. A lárvák csökkent növekedése is valószínűleg azáltal jön létre, hogy a LIP gátolja a lárvák kimotripszinhez hasonló bélproteázának működését és ezáltal emésztését (NOVILLO et al., 1997). De a LIP gátolhatja a proenzim formában szintetizálódó szerin proteázokat is. Lehetséges továbbá az is, hogy a LIP-nek, mint heterodimer szerin PI-nak fiziológiai szerepe is van, ugyanis ezek a PI-ok részt vesznek az immunrendszer szabályozásában, hatnak a lárvanövekedésre és fejlődésre, valamint az ovárium fejlődésen keresztül, a szaporodásra is (SIMONET et al., 2002).
88 88
Eredményeink tehát bizonyítják, hogy a rovar eredetű multifunkcionális PI-ok fokozhatják a növények rovarrezisztenciáját. A Bt toxin kivételével, más transzgének termékeihez hasonlóan (KUMAR és KUMAR, 2004), a célrovarra a LIP-nek nincs teljesen letális hatása. A transzgénikus növény számára a szerin típusú LIP a főleg szerin típusú proteázokkal rendelkező Lepidopterákkal és Dipterákkal szemben biztosíthat fokozott védelmet. Ezért érdemes lenne a LIPet ezeknek a rovarfajoknak a gazdanövényeiben is megnyilvánítani. Mivel azonban a LIP hatása, legalább is a burgonyabogárral szemben, gyenge, ezért valószínűleg más típusú rezisztencia génekkel, pl. Bt toxin vagy lektin, kombinálva lehet majd gazdaságilag is hasznosan alkalmazni. Így viszont hatékonyabbá, erősebbé és stabilabbá teheti a rovarrezisztenciát. 5.2. Rekombinázon alapuló marker- és vektorgén-mentes transzgénikus burgonya előállításából levonható következtetések Létrehoztunk egy olyan transzformációs rendszert, amellyel marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növényeket állíthatunk elő. Rendszerünk abban különbözik más Agrobacterium-közvetítette transzformációs módszertől, hogy a vektor a T-DNS átvitelére csak a jobb oldali határszekvenciát hordozza. A TDNS-ek határszekvenciái nem pontos direkt ismétlődő szekvenciák. HORSCH és KLEE (1986) bizonyították először, hogy a bal oldali határszekvenciák alkalmanként a T-DNS szintézisének előidézésében úgy működnek, mint a jobb oldaliak. Így a bal határról kezdődő T-szállal a vektorgének is a genomba integrálódhatnak. Másrészt az is előfordulhat, hogy egy jobb oldali határról kezdődő T-szál átvitel a bal oldali határnál, egy egyszerű hiba miatt, nem fejeződik be, ami szintén a vektorgének beépülését eredményezheti. De beszámoltak már genetikai kimérák kialakulásáról is, amikor a baloldali kezdetű T-DNS visszaligálódott a jobb oldalról normálisan integrálódó T-szálba (WOLTERS et al., 1998). Mivel a pPROGMO vektor csak a jobb oldali
89 89
határszekvenciát tartalmazza, gyakorlatilag maga egy T-DNS, így ezek a problémák a pPROGMO vektor használata esetén fel sem merülnek. A transzformáció során mind a hasznos- és markergének, mind pedig a plazmid működéséhez szükséges vektorgének a növényi sejtbe kerülnek és a genomba
integrálódnak.
A
marker-
és
vektorgéneket
ezután
a
Zygosaccharomyces rouxii növényre adaptált R/Rs rekombináz rendszer távolítja el. A pPROGMO vektorunkban a MAT rendszerhez (SUGITA et al., 1999) hasonlóan az R rekombináz, valamint a szelekciós marker gének a két Rs hely között helyezkednek el. A konstrunkciónkban nóvum, hogy a vektor működéséhez szükséges géneket is ide klónoztuk, így az R rekombináz működése során nemcsak önmagát és a markergéneket, hanem a vektorgéneket is kirekombinálja, aminek következtében marker- és vektorgén-mentes növények
jönnek
szelektálására
létre.
A
codA-nptII
markergén-mentes bifunkcionális,
transzgénikus
pozitív/negatív
vonalak szelekciós
markergéneket alkalmaztunk. Ezzel a rendszerrel SCHAART et al. (2004) is sikeresen szelektáltak marker-mentes földieper vonalakat. Kísérleteink bizonyítják, hogy a Zygosaccharomyces rouxii R/Rs rekombináz rendszere burgonyában is működik. A vegetatíven szoporodó növényekre kidolgozott marker-mentes transzgénikus növény előállítási módszerekhez hasonlóan első regenerációs lépésben pozitív szelekcióval stabil transzformánsokat állítottunk elő. Kiválasztottunk nyolc pPROGMO-GUS egy kópiás beépülést hordozó transzgénikus vonalat, mert az alacsony kópiaszámú vonalakban a sikeres rekombináció révén nagyobb valószínűséggel keletkeznek marker-mentes
növények.
A
második
regenerációs
lépésben
negatív
szelekcióval kaptunk 242 db FC rezisztens növényt, melyek közül csak 18 volt kanamicin szenzitív. A sok negatív szelekcióból megszökött hajtás azt mutathatja, hogy az általánosságban használt 150 mg/l FC koncentráció nem volt elégséges, vagy a keletkezett hajtások mozaikosak. Mindenesetre kaptunk négy olyan növényt, amiben az R rekombináz-irányította rekombinációnak köszönhetően, új elemként a burgonya genomban csak a GUS gén maradt. Ez a
90 90
négy növény két vonalból származott. A másik hat vonalból vagy nem kaptunk marker-mentes növényeket vagy az nptII gén ugyan eliminálódott, de az R gén, ill. az R gén az nptIII-mal együtt megmaradt a genomban. Azokban a vonalakban, amelyekből egyáltalán nem kaptunk marker-mentes növényeket (5. táblázat), northern hibridizáció alapján (6. ábra) a rekombináz mRNS-ének mérete nagyobb volt a vártnál, azaz itt az integráció során valamilyen átrendeződés következhetett be, s ez valószínűleg inaktív rekombinázt eredményezett. A többi vonalban, amiből úgy tűnik, hogy csak az nptII gén eliminálódott, lehet, hogy volt egy teljes és egy csonka beépülés, amiből a teljes beépülés a rekombináció következtében kivágodott, de a csonka, a második Rs hely hiánya miatt, megmaradt. Tranziens pozitív szelekciót alkalmazva hat magas GUS aktivitású vonalat izoláltunk. Mind a hat marker- és vektorgén-mentes GUS transzgénikus vonal volt, amelyek mind, magas GUS aktivitás mellett, alacsony kópia számú beépülést hordoztak. Valószínű, hogy maga a transzformációs rendszer szelektál az ilyen típusú transzgénikus vonalakra. A T-DNS által bevitt gének legkorábbi expressziója 18 órával a fertőzést követően detektálható. Az expressziós csúcs a fertőzés után 36 órával mutatható ki, majd az expresszió 4-10 napig fokozatosan csökken, míg végül a sejtekben a tranziensen expresszálódó idegen gének lecsendesednek és a sejtek stabilan transzformánssá válnak (JANSSEN és GARDNER, 1990; NARASHIMULU et al., 1996). A konstitutívan expresszált rekombináz vagy tranziensen, vagy korai kallusz és hajtásfejlődési stádiumban aktiválódhat, aminek következtében a hasznos gén és a markergén már ekkor kirekombinálódhat (SUGITA et al., 1998). Mi azonban a levél explantumot két napig tenyésztettük együtt az Agrobacterium-mal, majd 7 napig szelektáltunk kanamicin tartalmú kalluszosító táptalajon. Ez idő alatt a rekombináz a növényi genomba már integrálódott és aktiválódott. ROMMENS et al. (2004) úgy találták, hogy burgonyában öt nap elegendő az ideiglenes kanamicin szelekcióra. Eredményeink alapján viszont valószínű, hogy a nagy számú nem-transzgénikus hajtás, a kanamicin szelekció befejezése, a hét napos kallusz indukálás után
91 91
regenerálódott. Az 5-FC a codA elvesztésére szelektál, amihez valószínűleg a rekombináz magas aktivitása szükséges, ami csak bizonyos kromoszóma poziciókból érhető el. A rekombinációt követően ugyanazon a kromoszóma helyen marad a GUS. Ez lehet a magyarázata annak, hogy az általunk izolált marker– és vektorgén-mentes transzgénikus vonalak mindegyikében magas volt a GUS aktivitás. A vonalakban detektált inszerciók alacsony kópia száma pedig valószínűleg annak köszönhető, hogy a codA könnyebben eliminálódik az alacsony kópia számú vonalakból, mint a több beépülést tartalmazókéból. Ezt támasztja alá SUGITA et al. (2000) eredménye is. Ipt-n alapuló transzformációs rendszerükben, konstitutív promoterrel hajtott rekombinázzal, a marker-mentes transzgénikus növények 67%-ában több mint három T-DNS integrálódott. Ezekben a vonalakban, az alacsony kópiaszámú vonalakéhoz képest, alacsonyabb volt a sikeres rekombinációk gyakorisága, ami redukálta az általuk létrehozott rendszer hatékonyságát. A pPROGMO rendszer fejlesztésére, a magasabb marker- és vektorgénmentes gyakoriság elérésére, több lehetőséget is látunk: • A
növényregeneráció
során
esetlegesen
a
pozitív
szelekciós
idő
változtatásával, a nem-transzgénikus sejtek fejlődése tovább gátolható, a transzgénikus sejtvonalaink pedig fejlődésükben nagyobb előnyre tehetnek szert,
aminek
következtében
nagyobb
gyakorisággal,
korábban
regenerálódhatnak marker- és vektorgén-mentes hajtások. • A másik lehetőség indukálható promoter alkalmazásával a rekombináz működésének időbeli szabályozása. Az első regeneráció során a rekombinázt nem-átírva, pozitív szelekcióval stabil transzformánsokat választunk ki. A második regenerációs lépésben pedig a rekombináz promoterét indukálva aktiváljuk a rekombinázt, és így a marker- és vektorgének kivágódását. Negatív szelekció mellett csak a marker- és vektorgén-mentes hajtások képesek regenerálódni. Mi azért nem követtük ezt az utat, mert a burgonyában nem ismerünk jól működő indukálható promotert. A mi vektorunkban konstitutívan expresszálódó rekombináz volt. Mivel a 92 92
konstitutívan expresszálódó rekombináz működése következtében már korán, akár a pozitív szelekció során, bekövetkezhet a rekombináció, a pozitív markergén is elveszhet, és ez csökkenti a rendszer hatékonyságát. Indukálható promoterrel szabályozva a rekombinázt, ez az esemény nem következik be. EBINUMA et al. (2001) MAT rendszerében indukálható promoterrel emelkedett a marker-mentes növények aránya. • A pPROGMO konstrukcióban a bifunkcinális markergének rekombináz gén elé klónozásával, a részleges beépülést mutató vonalak regenerációja is kiküszöbölhető lenne. Mivel a pPROGMO36-ban a negatív szelekciós markergén a konstrukció végén helyezkedik el, részleges beépülés esetén nem kerül be a növénybe és így nem képes megakadályozni ezeknek a vonalaknak a regenerációját. Ha a konstrukcióban a „hasznos” gént közvetlenül negatív markergén követné, akkor az még részleges beépülés esetén is működne és gátolná ezeknek a vonalaknak regenerálódását. Bebizonyítottuk tehát, hogy a pPROGMO vektorunkkal és transzformációs rendszerünkkel marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növényeket lehet létrehozni. A pPROGMO használata egyszerű, egy transzformációval akár egy növény regenerációs folyamatban, akár két lépésben regenerálódó transzformáns vonalak nagy gyakoriságban marker- és vektorgén-mentesek. A rendszer hatékonyságát emelhetik mind a szelekcióra, mind a pPROGMO vektor működésének javítására tett javaslatok.
Mind a LIP-et, mind a pPROGMO vektort burgonyán teszteltük ugyan, de eredményeink alapján mindkét biotechnológiai nemesítési eszköz alkalmazása a növények széles körében lehetséges.
93 93
94 94
6. ÖSSZEFOGLALÁS
A növénynemesítésben genetikai módosítással (GM) nagyobb terméshozamú, kár- és kórokozó rezisztenciájú, fokozott abiotikus stressztűrő képességgel rendelkező, azaz a szélsőséges időjárási körülményeknek (fagy, aszály) jobban ellenálló, nagyobb tápanyag értékű fajták hozhatók létre. A GM növények rovarrezisztenciáját legtöbbször a különböző eredetű entomotoxikus fehérjék expresszáltatása biztosítja. Az ellenállás fokozására a növényekbe egyszerre több gént is integrálhatunk, pl. mikroorganizmus eredetű géneket, növény eredetű rezisztencia géneket, vagy állati eredetű géneket. A kereskedelmi forgalomban levő GM fajták burgonyabogár ellenállósága a Bacillus thuringiensis (Bt) toxin termelésen alapul. A toxin konstitutív expresszója azonban a rovar populációban rezisztencia kialakulását indukálhatja. Ennek elkerülésére különböző mechanizmusokra épülő rezisztens növények váltakozó használatára van szükség. A rovarrezisztencia fokozásának egyik lehetséges módja különböző proteináz inhibitorok (PI-ok) bevitele és megnyilvánítása a növényi genomban. A PI-ok, inszekticid hatásuk révén, természetes védelmet biztosítanak. A
burgonyabogár
(Leptinotarsa
decemlineata),
a
burgonya
legártalmasabb rovar kártevője. Inszekticidek nélkül ma már lehetetlen kereskedelmi mennyiségben burgonyát termeszteni. Az előzetes kísérletek eredménye arra utalt, hogy a sivatagi sáska (Schisocerca gregaria) két kis szerin PI peptidje, a kimotripszin inhibitor SGCI és a tripszin inhibitor SGTI, „kétfejű” fehérje formájában (LIP) alkalmas lehet a burgonya burgonyabogárral szembeni ellenálló képességének javítására. LIP transzgénikus burgonya vonalak előállítása céljából a LIP cDNS-t a pCP60 bináris vektorba klónoztuk és A. tumefaciens-be juttattuk, majd transzformációval LIP-et termelő transzgénikus burgonya vonalakat hoztunk létre. Kimutattuk, hogy a növény által termelt LIP mind szekvenciájában, mind kimotripszin és tripszin gátló hatásában 95 95
megegyezik a sivatagi sáska természetes SGTI, ill. SGCI peptidjeivel. Etetési kísérletekben a LIP-et termelő burgonya növényekkel táplálkozó burgonyabogár lárvák fejlődése kissé, de szignifikásan gátlódott, közülük néhány el is pusztult. A kontroll Désirée növénnyel táplálkozó lárvák átlagos napi tömeggyarapodása és levél fogyasztása a bebábozódás első napjáig magasabb volt, mint a LIP-et expresszáló burgonya leveleket fogyasztóké. A lárvákból fejlődő imágókon és bogarakon
morfológiai
elváltozást
nem
tapasztaltunk.
Eredményeink
bizonyítják, hogy a rovar eredetű multifukcionális PI-ok fokozhatják a növények rovarrezisztenciáját. A PI-ok teljesen más módon működő fehérjékkel együtt, pl. Bt vagy lektin, kombinálva hatékonyabbá, erősebbé és stabilabbá tehetik a rovarrezisztenciát. A LIP expressziójának emelésével vagy növénybeli degradációjának megakadályozásával a LIP koncentrációja növelhető, ami valószínűleg növelné a transzgénikus növények rovarellenálló képességét is. A növény transzformáció során az idegen DNS csak kevés sejtbe tud integrálódni. Az alacsony hatékonyság miatt a transzgénikus sejtvonalak és hajtások kiválasztásához, a „hasznos” génnel együtt szükség van markergének bevitele is. A szántóföldi termesztésben azonban a markergének jelenléte – bizonyos esetektől eltekintve (herbicid rezisztencia) – szükségtelen, és több szempontból is elfogadhatatlan. Ezért olyan eljárások, módszerek kifejlesztése és alkalmazása a cél, amelyekben a végső növényi fajtához nem szükséges génszekvenciák a genomból eliminálódnak. A markergének eliminálására több hatékonyan működő módszert is kidolgoztak. Ezek vagy ko-transzformáción és az azt követő szegregáción, vagy valamilyen transzformációt követő génátrendeződésen alapulnak. Az eddig kidolgozott módszerek hátránya, hogy legtöbbjük vegetatívan szaporított növényekre nem alkalmazható, és/vagy nem küszöböli ki a transzformációra használt vektor génjeinek gyakran előforduló beépülését. A fent említett hiányosságok megszüntetésére kísérleteink során egy olyan marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növény előállításra alkalmas transzformációs vektort hoztunk létre, ami gyakorlatilag maga egy T-DNS, és
96 96
aminek
működése növényre adaptált R rekombinázon
és codA-nptII
bifunkcionális szelekciós markergéneken alapul. Az új transzformációs vektorral, a pPROGMO-val, egy lépésben lehet marker- és vektorgén-mentes transzgénikus növényt előállítani. A pPROGMO tesztelésére a vektorba beépítettük a GUS riporter gént. A konstrukcióval transzgénikus burgonya növényeket állítottunk elő. A rekombináz műkődését az egy kópiás beépülést hordozó transzgénikus vonalak leveleiből negatív szelekció mellett hajtást regeneráló,
majd
pozitív
szelekcióra
szenzitív
növények
izolálásával
bizonyítottuk. A marker- és vektorgének eliminálódását és a GUS gén növényi genomban maradását, azaz közvetve a rekombináz működését, molekuláris módszerekkel is alátámasztottuk. A következő kísérletünkben ideiglenes pozitív szelekciót követő negatív szelekcióval állítottunk elő transzgénikus burgonya vonalakat. Így 4%-os gyakorisággal kaptunk hat marker- és vektorgén-mentes GUS transzgénikus vonalat. Ezek a vonalak mind magas GUS aktivitás mellett alacsony kópia számú beépülést hordoztak. Kísérleteink tehát azt bizonyították, hogy a pPROGMO működőképes. Használatával egy lépésben állíthatunk elő marker- és vektorgén-mentes alacsony kópia számú beépülést hordozó, a hasznos gént erősen expresszáló GM növényeket.
97 97
SUMMARY Genetic modification (GM) can generate crops with higher yield, pest and pathogen resistance, abiotic stress tolerance (e.g.: cold and drought), and increased nutrition values. In most cases, pest resistance of GM crops is based on expression of entomotoxic proteins of various origins. To increase the pest resistance of crops, genes derived from microrganisms, plants or animals can be integrated simultaneously into the plant genome. Commercial GM potato varieties resistant to Colorado potato beetle (CPB, Leptinotarsa decemlineata) all produce the Bacillus thuringiensis (Bt) toxin. However, constitutive expression of the toxin induces resistance in the pest population. To avoid this problem, development of resistant plants with different resistance mechanisms would be desirable. One of the possibilities to develop pest resistant crops is the insertion and expression of protease inhibitor (PI) genes in the plant genome. PIs via their pesticid effect can provide a natural defence system for the plants against herbivores. CPBs are the most destructive pests of potato. Nowadays it is impossible to yield potato to the market without insecticid. The result of preliminary experiments suggested that two small serine protease inhibitor peptides, Schistocerca gregaria chymotrypsin inhibitor, SGCI, and Schistocerca gregaria trypsin inhibitor SGTI, from desert locust (Shistocerca gregaria) in “double headed” protein form (LIP) could be suitable to increase the resistance against CPB. To generate LIP transgenic potato lines cDNA of LIP was cloned into the binary vector pCP60 and was transferred into A. tumefaciens. LIP-producing transgenic potato lines were isolated after transformation. Sequences and inhibitory constants against chymotrypsin and trypsin of LIP proteins purified from transgenic lines were practically identical with that determined with the individual peptides of desert locust. CPB larvae reared on transgenic plants grew slightly but significantly more slowly than those on control plants, and some of them even died. For the first day of pupation the average daily weights of 98 98
control larvae fed with untransformed potato leaves and weight of consumed leaves was higher than the larvae fed with LIP expressing potato leaves. After pupation adult beetles emerged from the soil. Every larvae reached adulthood and no morphological deformation could be observed on them. The results support the notion that expression of multifunctional protease inhibitors of insect origin might be a good strategy to improve insect resistance in plants. However, to enhance the effect of LIP against CPB it would be necessary to increase the level of LIP in transgenic potato plants. This can be achieved by enhancing LIP expression or protecting the protein from degradation in the plant. Combining LIP with other pest resistance proteins, e.g. Bt toxin or lectins, the pest resistance could be more effective and stable. LIP might have higher effect to other target insects and could be applicable in pest resistance for other crops. Transformation of pant cells occurs at a very low frequency. For identifying those cells that have integrated the DNA into their genome it is necessary to transfer a selectable marker gene together with the gene of interest. However, in the field the presence of marker gene in the crop is unnecessary and unacceptable in some respect except of herbicid resistance genes. Accordingly, such strategy and method must be developed and used, which to the final cultivar can eliminate the unnecessary DNA sequence from the genome. There are several strategies that are based on co-transformation of genes of interest with selectable marker genes followed by the segregation of the separate genes through sexual crosses or transformation followed by a recombination. Disadvantage of these methods is that most of them are not suitable for the crops propagated vegetatively and/or don’t prevent the integration of backbone gene(s) of the transformation vector. To solve these problems we developed a transformation vector suitable for generation of marker- and backbone-free transgenic plants. The vector designated pPROGMO utilises a constitutively expressed plant-adapted R recombinase and a codA-nptII bifunctional, positive/negative selectable marker
99 99
gene. It carries only the right border of T-DNA and thereby the whole plasmid is practically a T-DNA when inserted into the plant genome. Efficiency of pPROGMO transformation was tested by introduction of the GUS reporter gene into potato. Marker- and backbone-free GUS transgenic plants were obtained following two different selection/regeneration strategies. First, the activity of R recombinase in potato was tested in transgenic potato plants with a single copy insertion. By regenerating new calli and shoots from these transformed lines under negative selection pressure we selected for cells in which the recombinase gene became active. In the next experiment, marker- and vector-free transgenic plants were generated with temporary positive selection followed by negative selection pressure. Using this method six marker- and backbone-free transgenic plants were isolated with an efficiency as high as 4%. All the six lines had a high transgene expression and low copy number insertion. Our experiments provided evidence that the pPROGMO vector is suitable for transformation to generate marker- and backbone-free transgenic plants. The pPROGMO vector approach is simple and might be widely applicable for the production of marker- and backbone-free transgenic plants of many crop species.
100 100
7. MELLÉKLETEK M1. IRODALOMJEGYZÉK ABDEEN A., VIRGÓS A., OLIVELLA E., VILLANUEVA J., AVILES X., GABARRA R., PRAT S. (2005): Multiple insect resistance in transgenic tomato plats over-expressing two families of plant proteinase inhibitors. Plant Molecular Biology, 57: 189-202. p. ALFONSO-RUBI J., ORTEGO F., CASTANERA P., DIAZ I. (2003): Transgenic expression of trypsin inhibitor Cme from barley in Indica and Japonica rice, confers resistance to the rice weevil Sitophilus oryzae. Transgenic Research, 12: 23-31. p. ARAKI H., JEARNPIPATKUL A., TATSUMI H., SAKURAI T., USHINO K., MUTA T., OSHIMA T. (1987): Molecular and functional organization of yeast plasmid pSR1. Journal of Molecular Biology, 182: 191-203. p. AZZOUZ H., CAMPAN E.D.M., CHERQUI A., SAGUEZ J., COUTY A., JOUANIN L., GIORDANENGO P., KAISER L. (2005): Potential effects of plant protease inhibitors, oryzacystatin I and soybean Bowman-Birk inhibitor, on the aphid parasitoid Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera, Braconidae). Journal of Insect Physiology;51(8): 941-51 BENCHEKROUN A., MICHAUD D., NGUYENQUOE B., OVERNEY S., DESJARDINS Y., YELLE S. (1995): Synthesis of active oryzacystatin-I in transgenic potato plants. Plant Cell Reports, 14: 585-588. p. BOLTER C.J. and JONGSMA M.A. (1995): Colorado potato beetles (Leptinotarsa decemlineata) adapt to proteinase inhibitors induced in potato leaves by methyl jasmonate. Journal of Insect Physiology, 41: 1071-1078. p. BRADFORD M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254. p. BROADWAY R.M. (1996): Dietary proteinase inhibitors after compliment of midgut proteases. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 32: 39-53. p. BROADWAY R.M. and DUFFEY S.S. (1986): Plant proteinase inhibitors: machanism of action and effect on the growth and digestive physiology of larval Heliothis zea and Spodoptera exigua. Journal of Insect Physiology, 32: 827-833. p. BRUNELLE F., CLOUTIER C., MICHAUD D. (2004): Colorado potato beetles compensate for tomato Cathepsin D inhibitor expressed in transgenic potato. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 55: 103-113. p. BURGESS E.P.J., MAIN C.A., STEVENS P.S., CHRISTELLER J.T., GATEHOUSE A.M.R., LAING W.A. (1994): Effects of protease inhibitor concentration and combinations on the survival, growth and gut enzyme activities af the black field cricket, Teleogryllus commodus. Journal of Insect Physiology, 40: 803-811. p. CARLINI C.R., GROSSI-DE-SA M.F. (2002): Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon, 40: 1515-1539. p.
101 101
CECI L.R., VOLPICELLA M., RAHBÉ Y., GALLERANI R., BEEKWILDER J., JONGSMA M.A. (2003): Selection by phage display of a variant mustard trypsin inhibitor toxic against aphids. The Plant Journal, 33: 557-566. p. CHEN L., MARMEY P., TAYLOR N.J., BRIZARD J.-P., ESPINOZA C., D’CRUZ P., HUET H., ZHANG S., DE KOCHKO A., BEACHY R.N., FAUQUET C.M. (1998): Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants. Nature Biotechnology, 16: 1060–1064. p. CHRISTELLER J.T., BURGESS E.P.J., METT V., GATEHOUSE H.S., MARKWICK N.P., MURRAY C., MALONE L.A., WRIGHT M.A., PHILIP B.A., WATT D., GATEHOUSE L.N., LÖVEI G.L., SHANNON A.L., PHUNG M.M., WATSON L.M., LAING W.A. (2002): The expression of a mammalian proteinase inhibitor, bovine spleen trypsin inhibitor in tobacco and its effects on Helicoverpa armigrera larvae. Transgenic Research, 11: 161-173. p. CHURCH G.M., GILBERT W. (1984): Genomic sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81: 1991-1995. p. CLOUTIER C., FOURNIER M., JEAN C., YELLE S., MICHAUD D. (1999): Growth compensation and faster development of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelydae) feeding on potato foliage expressing oryzacistatin I. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 40: 69-79. p. CLOUTIER C., JEAN C., FOURNIER M., YELLE S., MICHAUD D. (2000): Adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata compensate for nutritional stress on Oryzacistatin Itransgenic potato plants by hyperttophic behavior and over-production on insensitive proteases. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 44: 69-81. p. COPPOLSE E.R., VROOMEN M.J., ROELOFS D., SMIT J., VAN GENNIP F., HERSMUS B.J.M., NIJKAMP H.J.J., VAN KAAREN M.J.J. (2003): Cre recombinase expression can result in phenotypic aberrations in plants. Plant Molecular Biology, 51: 263–279. p. CORNEILLE S., LUTZ K., SVAB Z., MALIGA P. (2001): Efficient elimination of selectable marker genes from the plastid genome by the Cre–lox site-specific recombination system. The Plant Journal, 27: 171–178. p. COTSAFTIS O., SALLAUD C., BREITLER J.C., MEYNARD D., GRECO R., PEREIRA A., GUIDERDONI E. (2002): Transposon-mediated generation of T-DNA- and marker-free rice plants expressing a Bt endotoxin gene. Molecular Breeding, 10: 165–180. p. CUI M., TAKYANAGI K., KAMADA H., NISHIMURA S., HANDA T. (2001): Efficient shoot regeneration from hairy roots of Antirrhinum majus L. transformed by rol type MAT vector system. Plant Cell Reports, 20: 60–66. p. DALE E. and OW D. (1991): Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 88: 10558–10562. p. DALEY M., KNAUF V.C., SUMMERFELT K.R, TURNER J.C. (1998): Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker free transgenic plants. Plant Cell Reports, 17: 489-496. p. DE BLOCK M., DEBROUWER D. (1991): Two T-DNA’s co-transformed into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infection are mainly integrated at the same locus. Theoretical and Applied Genetics, 82: 257–263. p.
102 102
DE FRAMOND A.J., BACK E.W., CHILTON W.S., KAYES L., CHILTON M.-D. (1986): Two unlinked T-DNAs can transform the same tobacco plant cell and segregate in the F1 generation. Molecular and Genomics Genetics. 202: 125-131. p. DE LEO F., BONADÉ-BOTTINO M., CECI L.R., GALLERANI R., JOUANIN L. (2001): Effects of a mustard trypsin inhibitor expressed in different plants on three lepidopteran pests. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 31: 593-602. p. DE NEVE M., DE BUCK S., JACOBS A., VAN MONTAGU M., DEPICKER A. (1997): TDNA integration patterns in co-tranformed plant cells suggest that T-DNA repeats originate from co-integration of separate T-DNAs. The Plant Journal, 11: 15-29. DE VETTEN N., WOLTERS A.M., RAEMAKERS K., VAN DER MEER I., TER STEGE R., HEERES E., HEERES P., VISSER R. (2003): A transformation method for obtaining markerfree plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop. Nature Biotechnology, 21: 439-442. p. DEBLAERE R., BYTEBIER B., DE GREVE H., DEBROEK F., SCHELL J., VAN MONTAGU M., LEEMANS J. (1985): Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors of Agrobacterium mediated gene transfer to plants. Nucleic Acids Research, 13: 4777-4788. p. DEPICKER A., HERMAN L., JACOBS A., SCHELL J., VAN MONTAGU M. (1985): Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the Agrobacterium/plant cell interaction. Molecular and Genomics Genetics, 201: 477–484. p. DIETZE J., BLAU A., WILLMITZER L. (1995): Agrobacterium-mediated transformation of potato (Solanum tuberosum). 24-29. p. In: POTRYKUS I., SPANGENBERG G. (Eds.) Gene Transfer to Plants, Berlin: Springer-Verlag, 361 p. DITTA G.S., STANFIELD D., CORBIN D., HELINSKI D.R. (1980): Broad host-range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77: 7347-7351. p. DOWD P.F. and LAGRIMINI L.M. (1997): In CAROZZI N. and KOZIEL M. eds. Advances in Insect Control: The Role of Tramnsgenic Plants, 195-223. p. DOWN R.E., GATEHOUSE A.M.R., HAMILTON W.D.O., GATEHOUSE J.A. (1996): Snowdrop lectin inhibits development and decreases fecundity of the glasshouse potato aphid (Aulacorthum solani) when administered in vitro and via transgenic plants in laboratory and glasshouse trials. Journal of Insect Physiology, 42: 1035–1045. p. DUAN X., LI X., XUE Q., ABO-EL-SAAD M., XU D., WU R. (1996): Transgenic rice plants harboring an introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. Nature Biotechnology, 14: 494–498. p. DUDITS D., 2005 Főszerkesztői ajánló. Zöld Biotechnológia, 1: 2. p. DUDITDS D. és HESZKY L. (2000): Növényi biotechnológia és géntechnológia. Budapest: Agroinform Kiadó. 190. p. DUFFEY S.S., STOUT M.J. (1996): Antinutritive and toxic components of plant defense against insects. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 32: 3–37. p.
103 103
EBINUMA H. and KOMAMINE A. (2001): MAT (multi-auto-transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of markerfree transgenic plants. In Vitro Celullar and Developmental Biology-Plant, 37: 103–113. p. EBINUMA H., SUGITA K., MATSUGANA E., YAMAKADO M. (1997a): Selection of marker-free transgenic plants using the isopentyl transferase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94: 2117–2121. p. EBINUMA H., SUGITA K., MATSUNAGA E., ENDO S., YAMADA K., KOMAMINE A. (2001): Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker. Plant Cell Reports, 20: 383–392. p. EBINUMA H., SUGITA K., MATSUNAGA E., YAMAKADO M., KKOMAMINE A. (1997b): Principle of MAT vector. Plant Biotechnology, 14: 133–139. p. ENDO S., SUGITA K., SAKAI M., TANAKA H., EBINUMA H. (2002): Single-step transformation for generating marker-free transgenic rice using the ipt-type MAT vector system. The Plant Journal, 30: 115–122. p. ESTRUCH J.J., CAROZZI N.B., DESAI N., DUCK N.B., WARREN G.W., KOZIEL M.G. (1997): Transgenic plants: an emerging approach to pest control. Nature Biotechnology, 15(2): 137-141. p. ESTRUCH J.J., WARREN G.W., MULLINS M.A., NYE G.J., CRAING J.A., KOZIEL M.G. (1996): Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 93: 5389–5394. p. FEDOROFF N.V. (1989): Maize transposable elements. In: Mobile DNA (BERG D.E., HOWE M.M., eds). Washington: American Society for Microbiology, 375-411. p. FEINBERG A.P., VOGELSTEIN B. (1983): A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Analytical Biochemistry, 132(1): 6-13. p. FIGURSKI D.H., HELINSKI D.R. (1979): Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 76: 1648-1652. p. FISCHOFF D.A., BOWDISH K.S., PERLAK F.J. (1987): Insect tolerant transgenic tomato plants. Bio/Technology. 5: 807–813. p. GÁSPÁRI Z., PATTHY A., GRÁF L., PERCZEL A. (2002): Compritive structure analysis of proteinase inhibitors from the desert locust, Schistocerca gregaria. European Journal of Biochemistry, 269. 527-537 p. GARDNER J.F., NASH H.A. (1986): Role of Escherichia coli IHF protein in lambda sitespecific recombination. Journal of Molecular Biology, 191: 180-189. p. GATEHOUSE A.M.R., DAVIDSON G.M., NEWELL C.A. (1997): Transgenic potato plants with enhanced resistance to the tomato moth Lacanobia oleracea: growth room trials. Molecular Breeding, 3: 1–15. p.
104 104
GATEHOUSE A.M.R., HILDER V.A., BOULTER D. (1992): Potential of plant-derived genes in the genetic manipulation of crops for insect resistance, Biotechnology in Agriculture No 7: Plant Genetic Manipulation for Crop Protection, CAB International, 155–181. p. GIRARD C., LE MÉTAYER M., ZACCOMER B., BARTKER E., WILLIAMS I., BONADÉBOTTINO M., PHAM-DELEGUE M.H., JOUANIN L. (1998): Growth stimulation of beetle larvae reared on a trangenic oilseed rape expressing a cysteine protease inhibitor. Journal of Insect Physiology, 44: 263-270. p. GLEAVE A.P., MITRA D.S., MUDGE S.R., MORRIS B.A.M. (1999): Selectable marker-free transgenic plants without sexual crossing: transient expression of cre recombinase and use of a conditional lethal dominant gene. Plant Molecular Biology, 40: 223–235. p. GOLDSBROUGH A.P., LASTRELLA C.N., YODER J.I. (1993): Transposition mediated repositioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato. Biotechnology, 11: 1286–1292. p. GRUDEN K., POPOVIC T., CIMERMAN N, KRIZAJ I, STRUKELJ B. (2003): Diverse enzymatic specificities of digestive proteases, „intestains”, enable Colorado potato beetle larvae to counteract the potato defence mechanism. Biological Chemisty, 384: 305-310. p. GRUDEN K., STRUKELJ B., POPOVIC T., LENARCIC B., BEVEC T, BRZIN T., KREGAR I., HERZOG-VELIKONJA J., STIEKEMA W.J., BOSCH D., JONGSMA M.A. (1998): The cysteine protease activity of Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) guts, which is insensitive to potato protease inhibitors, is inhibited by thyroglobulin type-1 domain inhibitors. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 27: 549-560. p. HADI M.Z., McMULLEN M.D., FINER J.J. (1996): Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment. Plant Cell Reports, 15: 500–505. p. HANAHAN D. (1983): Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology, 166(4): 557-580. p. HANZLIK M.W., KENNEDY G.G., SANDERS D.C., MONKS D.W. (1997): Response of European corn borer (Ostrinia nubilalis, Hubner) to two potato hybrids selected for resistance to Colorado potato beetle. Crop Protection, 16: 487 490. p. HARE P.D. and CHUA N.-H. (2002): Excision of selectable marker genes from transgenic plants. Nature Biotechnology, 20. 575–580. p. HERRERE-ESTRELLA L., SIMPSON J., MARTINEZ-TRUJILLO M. (2005): Transgenic plants: an historical perspective. Methods in Molecular Biology, 286: 3-32. p. HILDER V.A., GATEHOUSE A.M.R., SHEERMAN S.E., BARKER R.F., BOULTER D. (1987): A novel mechanism of insect resistance engineered into tobacco. Nature, 330. 160–163. p. HILDER V.A., POWELL K.S., GETAHOUSE A.M.R. (1995): Expression of snowdrop lectin in transgenic tobacco plants results in added protection against aphids. Transgenic Research, 4: 18–25. p. HOHN B., LAVY A.A., PUCHTA H. (2001): Elimination of selection markers from transgenic plants. Current Opinion in Biotechnology, 12: 139-143. p.
105 105
HONMA M.A., BAKER B.J., WADDEL C.S. (1993): High-frequency germinal transposition of DsALS in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 90: 6242–6246. p. HORSCH R.B., KLEE H.J. (1986). Rapid assay of foreign gene expression in leaf discs transformed by Agrobacterium tumefaciens: role of T-DNA borders in the transfer process. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 83: 4428-4432. p. HORVÁTH J. (Szerk.) (1995): A szántóföldi növények betegségei. Budapest, Mezőgazdasági Kiadó, 126-130 p. HÖFGEN R. and WILLMITZER L. (1988): Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic Acids Research, 16: 9877 HÖFTE H., WHITELEY H.R. (1989): Insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological Reviews, 53: 242–255. p. HUANG S., GILBERTSON L.A., ADAMS T.H., MALLOY K.P., REISENBIGLER E.K., BIRR D.H., SNYDER M.W., ZHANG Q., LUETHY M.H. (2004): Generation of marker-free transgenic maize by regular two-border Agrobacterium transformation vectors. Transgenic Research, 13: 451-461. p. INOUE H., NOJIMA H., OKAYAMA H. (1990): High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96(1): 23-28. p. ISHIMOTO M., SATO T., CHRISPEELS M.J., KITAMURA K. (1996): Bruchid resistance of transgenic azuki bean expressing seed -amylase inhibitor of commun bean. Entomologia Experimentalis et Applicata, 79: 309–315. p. JAMES C. (2005): Global Status of Commercialized Transgenic Crops. (Preview), www.isaaa.org/kc/ JANSSEN B.J., GARDNER R.C. (1989): Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 14. 61-72. p. JEFFERSON R.A., KLASS M, WOLF N, HIRSH D (1987): Expression of chimeric genes in Caenorhabditis elegans. Journal of Molecular Biology, 193(1): 41-46. p. JOHNSON R., NARVAEZ J., AN G. and RYAN C.A. (1989): Expression of proteinase inhibitors I and II in transgenic tobacco plants effects on natural defense against Manduca sexta larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 86: 9871-9875. p. JONGSMA M.A. and BOLTER C. (1997): The adaption of insects to plant protease inhibitors. Journal of Insect Physiology, 43: 885-895. p. JONGSMA M.A., BAKKER P.L., PETERS J., BOSCH D, STIEKEMA W.J. (1995): Adatation of Spodoptera exigua larvae to plant proteinase inhibitors by induction of gut proteinase activity insensitive to inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 92: 8041–8045. p. JONGSMA M.A., BAKKER P.L., VISSER B., STIEKEMA W.J. (1994): Trypsin inhibitor activity in mature tobacco and tomato plants is mainly induced locally in response to insect attack wounding and virus infection. Planta, 195. 29–35. p.
106 106
JONGSMA M.A., STIEKEMA W.J., BOSCH D. (1996): Combatting inhibitor-insensitive proteases of insect pests. Trends in Biotechnology, 14: 331–333. p. JOUANIN L., BONADÉ-BOTTINO M., GIRARD C., MORROT G., GIBAND M. (1998): Transgenic plants for insect resistance. Plant Science, 131: 1-11. p. KILBY N.J., DAVIES G.J., SNAITH M.R., MURRAY J.A.H. (1995): FLP recombinase in transgenic plants: constitutive activity in stably transformed tobacco and generation of marked cell clones in Arabidopsis. The Plant Journal, 8: 637–652. p. KOMARI T., HIEI Y., SAITO Y., MURAI N., KUMASHIRO T. (1996): Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation for higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. The Plant Journal, 10: 165–174. p. KONONOV M.E., BASSUNER B., GALVIN S.B. (1997): Integration of T-DNA binary vector „backbone” sequences into the tobacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration. The Plant Journal, 11: 945-957. p. KOZIEL M.G., BELAND G.L., BOWMAN C. (1993): Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Bio/Technology, 11: 194–200. p. KROMER E., NAKAKURA N., LAGAUEX M. (1994): Cloning of a Locusta cDNA encoding precursor peptide for two structurally related proteinase inhibitors. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 28: 549-560. p. KUMAR H. and KUMAR V. (2004): Tomato expressing Cry1A(b) insecticidal protein from Bacillus thuringiensis protected against tomato fruit borer, Helicoverpa armigera (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) damage in the laboratory, greenhouse and field. Crop Protection, 23: 135-139. p. LAWRENCE P.K. and KOUNDAL K.R. (2002): Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects. Electronic Journal of Biotecnology, 5: 93-109. p. LAZO G.R., PASCAL A.S., LUDWIG R.A. (1991) A DNA transformation - competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology, 9: 963-967. p. LEBEL E.G., MASSON J., BOGUCKI A., PASZKOWSKI J. (1995): Transposable elements as plant transformation vectors for long streches of foreign DNA. Theoretical and Applied Genetics, 91: 899-906. p. LECARDONNEL A., CHAUVIN L., JOUANIN L., BEAUJEAN A., PRÉVOST G., SANGWAN-NORREEL B. (1999): Effects of rice cystatin I expression in transgenic potato on Colorado potato beetle larvae. Plant Science, 140: 87-98. p. LEE S.I., LEE S.H. KOO W.C., CHUN H.L., LIM C.O., MUN J.H., SONG Y.H., CHO M.J. (1999): Soybean Kunitz trypsin inhibitor (SKTI) confers resistance to rice brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) in transgenic rice. Molecular Breeding, 5: 1-9. p. LEPLÉ J.C., BONADÉ-BOTTINO M., AUGUSTIN S. (1995): Toxicity to Chrysomela tremulae (Coleoptera: Chrysomelidae) of transgenic poplars expressing a cysteine proteinase inhibitor. Molecular Breeding, 1: 319–328. p.
107 107
LI G., XU X., XING H., ZHU H., FAN Q. (2005): Insect resistance to Nilaparvata lugens and Cnaphalocrocis medinalis in transgenicindica rice and the inheritance of gna+sbti transgenes. Pest Management Science, 61(4): 390-396. p. LI Y.E., ZHU Z., CHEN Z.X., WU X., WANG W., LI S.J. (1998): Obtaining transgenic cotton plants with cowpea trypsin inhibitor. Acta Gossypii Sinica, 10: 237-243. p. LOGEMANN J., SCHELL J., WILLMITZER L. (1987): Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Analytical Biochemistry, 163: 16-20. p. LYZNIK L.A., RAO K.V., HODGES T.K. (1996): FLP-mediated recombination of FRT sites in the maize genome. Nucleic Acids Research, 24: 3784–3789. p. MALIK Z., AMIR S., PÁL G., BUZÁS Z., VÁRALLYAY É., ANTAL J., SZILÁGYI L., VÉKEY K., ASBÓTH B., PATTHY A., GRÁF L. (1999): Proteinase inhibitors from desert locust, Schistocerca gregaria: engineering of both P1 and P1’ residues convents a potent chymotrypsin inhibitor to a potent trypsin inhibitor. Biochimica et Biophysica Acta, 1434: 143150. p. MATSUNAGA E., SUGITA K., EBINUMA H. (2002): Asexual production of selectable marker-free transgenic woody plants, vegetatively propagated species. Molecular Breeding, 10: 95–106. p. MATTHEWS P.R., WATERHOUSE P.M., THORNTON S., FIEG S.J., GUBLER F., JACOBSEN J.V. (2001): Marker gene elimination from transgenic barley, using cotransformation with adjacent ‘twin T-DNAs’ on a standard Agrobacterium transformation vector. Molecular Breeding, 7: 195–202. p. MAZIER M., PANNETIER C., TOURNEUR J., JOUANIN L., GIBAND M. (1997): The expression of Bacillus thuringiensis toxin genes in plant cells. Biotechnology Annual Review, 3: 313–347. p. McBRIDE K.E., SVAB Z., SCHAAF D.J., HOGAN P.S., STALKER D.M., MALIGA P. (1995): Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco. Bio/Technology 15: 362–365. p. McCORMAC A.C., FOWLER M.R., CHEN D.F., ELLIOT M.C. (2001): Efficient cotransformation of Nicotiana tabacum by two independent T-DNAs, the effect of T-DNA size and implications for genetic separation. Transgenic Research, 10: 143–155. p. McKNIGHT T.D., LILLIS M.T., SIMPSON R.B. (1987): Segregation of genes transferred to one plant cell from two different Agrobacterium strains. Plant Molecular Biology, 8: 439–445. p. McMANUS M.T., WHITE D.W.R., McGREGOR P.G. (1994): Accumulation of a chymotrypsin inhibitor in transgenic tobacco can affect the growth of insect pests. Transgenic Research, 3: 50–58. p. MEDBERRY S.L., DALE E., QIN M., OW D.W. (1995): Intra-chromosomal rearrangements generated by Cre-lox site-specific recombination. Nucleic Acids Research, 23: 485-490. p.
108 108
MELANDER M., AHMAN I., KAMNERT I., STROMDAHL AC. (2003): Pea lectin expressed transgenically in oilseed rape reduces growth rate of beetle larvae. Transgenic Research, 12(5): 555-567. p. MIKI B., McHUGH S. (2004): Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety. Journal of Biotechnology, 107: 193-232. p. MILLER M., TAGLIANI L., WANG N., BERKA B., BIDNEY D., ZHAO Z.Y. (2002): High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumifaciens 2 T-DNA binary system. Transgenic Research, 11: 381–396. p. MURASHIGE T., SKOOG F. (1962): A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15: 473-497. p. MURDOCK L.L., BROOKHART G., DUNN P.E. (1987) Cysteine digestive proteinase in Coleoptera. Comparative Biochemistry Physiology, 87: 783–787. p. NAGADHARA D., RAMESH S., PASALU I.C., KONDALA RAO Y., KRISHNAIAH N.V., SARMA N.P., BOWN D.P., GATEHOUSE J.A., REDDY V.D., RAO K.V. (2003): Transgenic indica rice resistant to sap-sucking insects. Plant Biotechnology Journal, 1: 231-240. p. NAGADHARA D., RAMESH S., PASALU I.C., KONDALA RAO Y., SARMA N.P., REDDY V.D., RAO K.V. (2004): Transgenic rice plants expressig the snowdrop lectin gene (gna) exhibit high level resistance to the witebacked planthopper (Sogatella furcifera). Theoretical and Applied Genetics, 109: 1399-1405. p. NARASHIMULU S.B., DENG X.B., SARRIA R., GELVIN S.B. (1996): Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize. Plant Cell, 8: 873-886. p. NOVILLO C., CASTANERA P., ORTEGO F. (1997): Characterisation and distribution of chymotrypsin and other digestive proteases in Colorado potato beetle larvae. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 36: 181-201. p. ODELL J., CAIMI P., RUSSEL S. (1990): Site-directed recombination in the genome of transgenic tobacco. Molecular and Genomics Genetics, 223: 369-378. p. ONOUCHI H., NISHIHAMA R., KUDO M., MACHIDA Y., MACHIDA C. (1995): Visualization of site-specific recombination catalyzed by a recombinase from Zygosaccharomyces rouxii in Arabidopsis thaliana. Molecular and Genomics Genetics, 247: 653-660. p. ONOUCHI H., YOKOI K., MACHIDA C., MATSUZAKI H., OSHIMA Y., MATSUOKA K., NAKAMURA K., MACHIDA Y. (1991): Operation of an efficient site-specific recombination of Zygosaccharomyces rouxii in tobacco cells. Nucleic Acids Research, 19: 6373-6378. p. ORR G.L., STRICKLAND J.A., WALSH T.A. (1994): Inhibition of Diabrotica larval growth by a multicystatin from potato tubers. Journal of Insect Physiology, 40: 893-900. p. OSBONE B.I., WIRTZ U., BAKER B. (1995): A system for insertional mutagenesis and chromosomal rearrangement using Ds transposon and cre-lox. The Plant Journal, 7: 687-701. p.
109 109
OUTCHKOUROV NS., ROGELJ B., STRUKELJ B., JONGSMA M.A. (2003): Expression of sea anemone equistatin in potato. Effects of plant proteases on heterologous protein production. Plant Physiology, 133: 379-387. p. OW D.W. (2001): The right chemistry for marker gene removal? Nature Biotechnology, 19: 115-116. p. OW D.W. (2002): Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era. Plant Molecular Biology, 48: 183–200. p. OW D.W. and MEDBERRY S.L. (1995): Genome manipulation through site-specific recombination. Critical Review in Plant Sciences, 14: 239–261. p. PATTHY A., AMIR S., MALIK Z., BÓDI Á, KARDOS J. ASBÓTH B., GRÁF L. (2002): Remarkable phylum specificity of a Schistocerca gregaria trypsin inhibitor: the possible role of enzyme-inhibitor flexibility. Archives of Biochemistry and Biophysics, 398: 179-187. POWEL K.S., GATEHOUSE A.M.R., HILDER V.A., VAN DAMME E.J.M., PEUMANS W.J., BOONJAWAT I., HORSHAM K., GATEHOUSE J.A. (1995): Different antimetabolic effects of related lectins towards nymphal stages of Nilaparvata lugens. Entomologia Experimentalis et Applicata, 75: 61–65. p. PUCHTA H., HOHN B. (1996): From centiMorgans to base pairs: homologous recombination in plants. Trends in Plant Science, 1: 340-348. p. PURCELL J.P., GREENPLATE J.T., JENNINGS M.G. (1993): Cholesterol oxydase: a potent insecticidal protein active against boll weevil larvae. Biochemical and Biophysical Research Communications, 196: 1406–1413. p. QIN M., BAYLEY C., STOCKTON T., OW D.W. (1994): Cre recombinase-mediated sitespecific recombination between plant chromosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 91: 1706-1710. p. RAHBÉ Y., DERAISON C., BONADÉ-BOTTINO M., GIRARD C., NARDON C., JOUANIN L. (2003b): Effects of the cysteine protease inhibitor oryzacystatin (OC-I) on different aphids and reduced performance of Myzus persicae on OC-I expressing transgenic oilseed rape. Plant Science, 164: 441-450. p. RAHBÉ Y., FERRASSON E., RABESONA H., QUILLIEN L. (2003a): Toxity to the pea aphid Acyrthosiphon pisum of anti-chymotrypsin isoforms and fragments of Bowman-Birk protease inhibitors from pea seeds. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 33: 299-306. p. RANJEKAR P.K, PATANKAR A., GUPTA V. BHATNAGAR R., BANTUR J., KUMAR P.A. (2003): Genetic engineering of crop plants for insect resistance. Current Science, 84: 321-329. p. ROMMENS C.M., HUMARA J.M., YE J., YAN H., RICHAEL C., ZHANG L., PERRY R., SWORDS K. (2004): Crop improvement through modification of the plant’s own genome. Plant Physiology, 135: 421-431. p. RUSSEL S.H., HOOPES J.L., ODELL J.T. (1992): Directed excission of a transgene from the plant genome. Molecular and Genomics Genetics, 234: 49-59. p.
110 110
RYAN C.A. (1990): Proteinase inhibitors in plants: genes for improving defenses against insect and pathogens. Annual Review of Phytopathology, 28: 939–943. p. SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Ed 2. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. SÁRINGER G. (1967): Nutrient consumpton of alfalfa weevil (Hypera (Phytonomus) variabilis HRBST. Coleoptera, Curculionidae). Acta Agronomica Acad. Scient. Hung., 16: 113-120. P. SCHAART J.G., KRENS F.A., PELGROM K.T.B., MENDES O., ROUWENDAL G.J. (2004): Effective production of marker-free transgenic strawberry plants using inducible site-specific recombination and a bifunctional selectable marker gene. Plant Biotechnology Journal, 2: 233240. p. SCHULER T.H., POPPY G.M., KERRY B.R., DENHOLM I. (1998): Insect-resistant transgenic plants. Trends in Biotechnology, 16: 168-175. p. SHADE R.E., SCHROEDER H.E., PUEYO J.J. TABE L.M., MURDOCK L.L., HIGGINS T.J.V., CHRISPEELS M.J. (1994): Transgenic pea seeds expressing the -amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles. Bio/Technology, 12: 793–796. p. SHROEDER H.E., GOLLASH S., MOORE A. (1995): Bean -amylase inhibitor confers resistance to the pea weevil (Bruchus pisorum) in transgenic peas (Pisum sativum L.). Plant Physiology, 107: 1233–1239. p. SHURE M., WESSLER S., FEDOROFF N. (1983): Molecular identification and isolation of the Waxy locus of maize. Cell, 35: 225-233. p. SIMONET G., CLAEYS I., VANDEN BROECK J. (2002): Structural and functional properties of a novel serine protease inhibiting peptide family in arthropods. Comparative Biochemistry and Physiology, 132: 247-255. p. SMIGOCKI A., NEAL J.W., McCANNA I., DOUGLAS L. (1993): Cytokinin-mediated insect resistance in Nicotiana plants transformed with the ipt gene. Plant Molecular Biology, 23: 325– 335. p. SÓS-HEGEDŰS A., LOVAS Á., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BÁNFALVI Z. (2005): Active RNA silencing at low temperature indicates distinct pathways for antisense-mediated genesilencing in potato. Plant Molecular Biology, 59: 595-602 p. SRIVASTAVA V., ANDERSON O.D., OW D.W. (19999): Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 96: 11117–11121. p. STIEKEMA W.J., HEIDEKAMP F., DIRKSE W.G., VAN BECKUM J., DE HAAN P., TEN BOSH C., LOUWERSE, J.D. (1988): Molecular cloning and analysis of four potato tuber mRNAs. Plant Molecular Biology, 11. 255-269. p. STOGER E., WILLIAMS S., CHRISTOU P., DOWN R.E., GATEHOUSE J.A. (1999): Expression of the insecticidal lectin from snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) in transgenic wheat plants: effect on predation by the grain aphid Sitobion avenae. Molecular Breeding, 5: 65-73. p.
111 111
STOUGAARD J. (1993): Substrate-dependent negative selection in plants using a bacterial cytosine deaminase gene. The Plant Journal, 3: 755–761. p. STRUKELJ B., LENARCIC B., GRUDEN K, PUNGERCAR J., ROGELJ B., TURK V., BOSCH D. and JONGSMA M.A. (2000): Equistatin, protease inhibitor from the sea anemone Actinia equina is composed of three structural and functional domains. Biochemical and Biophysical Research Communications, 269: 732-736. p. STUDIER F.W. and MOFFATT B.A. (1986) Use of bacteriofhage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned gene. Journal of Molecular Biology, 189: 113130. p. STUURMAN J., DE VROOMEN M.J., NIJKAMP H.J.J. and VAN HAAREN M.J.J. (1996): Single site-specific manipulation of tomato chromosomes in vitro and in vivo using Cre-lox sitespecific recombination. Pant Molecular Biology, 32: 901-913. p. SUGITA K., MATSUGANA E., EBINUMA H (1998): Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports, 18: 941-947. p. SUGITA K., KASAHARA T., MATSUNAGA E., EBINUMA H. (2000): A transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency. The Plant Journal, 22: 461–469. p. SUGITA K., MATSUNAGA E., EBINUMA H. (1999): Effective selection system for generating marker.-free transgenic plants independent of sexual crossing. Plant Cell Reports, 18: 941–947. p. SZENTHE B., GÁSPÁRI Z., NAGY A., PERCZEL A., GRÁF L. (2004): Same fold with different mobility: backbone dynamics of small protease inhibitors from the desert locust, Shistocerca gregaria, Biochemistry, 43: 3376-3384. p. THOMAS J.C., ADAMS D.G., NESSLER C.L., BROWN J.K., BOHNERT H.J. (1995): Tryptophan decarboxylase, tryptamine, and reproduction of the whitefly. Plant Physiology, 109: 717–720. p. TURNER J.G., ELLIS C., DEVOTO A. (2002): The jasmonate signal pathway. Plant Cell, 14: 153-164. p. URWIN P., ATKINSON H., WALLER D., McPHERSON M. (1995): Engineered oryzacystatin-I expressed in transgenic hairy roots confers resistance to Globodera pallida. The Plant Journal, 8: 121–131. p. URWIN P.E., TROTH K.M., ZUBKO E.I., ATKINSON H.J. (2001): Effective transgenic resistance to Globodera pallida in potato field trials. Molecular Breeding, 7: 8-95. p. VAECK M., REYNAERTS A., HÖFTE H. (1987): Transgenic plants protected from insect attack. Nature, 328: 33–37. p. VERGUNST A.C., SCHRAMMEIJER B., den DULK-RAS A., deVLAAM C.M.T., REGENSBURG-TUINK T.J.G., HOOYKAAS P.J.J. (2000): VirB/D4-dependent protein translocation from Agrobacterium into plant cells. Science, 290: 979–982. p.
112 112
VERVLIET G., HOLSTERS M., TEACHY H., VAN MONTAGU M., SCHELL J. (1975) Characterisation of different plaque-forming and defective temperate phages in Agrobacterium strains. The Journal of General Virology, 26: 33-48. p. WANG X., DING X., GOPLAKRISHNAN B. (1996): Characterization of a 46 kDa insect chitinase from transgenic tobacco. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 26: 1055–1064. p. WATERHOUSE P.M., WANG M.B., LOUGH T. (2001): Gene silencing as an adaptive defence against viruses. Nature, 411: 834-842 WILLIAMS S., FRIEDRICH L., DINCHER S., CAROZZI N., KESSMANN H., WARD E., RYALS J. (1993): Chemical regulation of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin expression in transgenic plants. Bio/Technology, 10: 540-543. p. WOLFSON J.L., MURDOCK L.L. (1990): Diversity in digestive proteinase activity among insects. Journal of Chemical Ecology, 16: 1089-1110. p. WOLTERS A.-M, TRINDADE A., JACOBSEN L.M., VISSER R.G.F. (1998): Fluorescence in situ hybridization on extended DNA fibres as a tool to analyse complex T-DNA loci in potato. The Plant Journal, 13: 837-847. p. WU A., SUN X., PANG Y, TANG K. (2002): Homozygous transgenic rice lines expressin GNA with enhanced resistance to the rice sap-sucking pest Laodelphax striatellus. Plant Breeding, 121: 93-95. p. WU L., NANDI S., CHEN L., RODRIGUEZ R.L., HUANG N. (2002): Expression and inheritance of nine transgenes in rice. Transgenic Research, 11: 533–541. p. XU D., XUE Q., McELROY D., MAWAL Y., HILDER V.A., WU R. (1996): Constitutive expression of a cowpea trypsin inhibitor gene, CpTi, in transgenic rice plants confers resistance to two major insect pests. Molecular Breeding, 2: 167–173. p. YANISCH-PERRON C., VIEIRA J., MESSING J. (1985): Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors. Gene, 33(1): 103-119. p. YEH K.W., LIN M.-L., TUAN S.J., CHEN Y.M., LIN C.Y., KAO S.S. (1997): Sweet potato (Ipomea batatas) trypsin inhibitors expressed in transgenic tobacco plants confer resistance against Spodoptera litura. Plant Cell Reports, 16: 696–699. p. YODER J.I. and GOLDSBROUGH A.P. (1994): Transformation systems for generating markerfree transgenic plants. Biotechnology, 12: 263–267. p. ZHU-SALZMANN K., AHN J.-E., SALZMAN R.A., KOIWA H., SHAD K., BALFE S. (2003): Fusion of a soybean cysteine protease inhibitor and legume lectin enhances anti-insect activity synergistically. Agricultural and Forest Entomology, 5: 317-323. p. ZUBCO E., SCUTT C., MEYER P. (2000): Intrachromosomal recombination between attP regions as a tool to remove selectable marker genes from tobacco transgenes. Nature Biotechnology, 18: 442–445. p.
113 113
ZUO J., NIU Q.-W., MOLLER S.G., CHUA N.-H. (2001): Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nature Biotechnology, 19: 157–161. p.
114 114
M2. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Szakcikkek lektorált folyóiratokban: KONDRÁK M., KUTAS J., SZENTHE B., PATTHY A., BÁNFALVI Z., NÁDASY M., GRÁF L. ASBÓTH B. (2005): Inhibition of Colorado potato beetle larvae by a locust proteinase inhibitor peptide expressed in potato. Biotechnology Letters, 27: 829-834. p. KONDRÁK M., ROUWENDAL G.J.A., VAN DER MEER I., BÁNFALVI Z. Generation of marker- and backbone-free transgenic potatoes by site-specific recombination and a bifunctional marker gene in a non-regular one-border Agrobacterium transformation vector. (Transgenic Research közlésre beküldve) SÓS-HEGEDŰS A., LOVAS Á., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BÁNFALVI Z. (2005): Active RNA silencing at low temperature indicates distinct pathways for antisense-mediated gene-silencing in potato. Plant Molecular Biology, 59: 595-602 p. DÓCZI R., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BECZNER F., BÁNFALVI Z. (2005): Conservation of the drought-inducible DS2 genes and divergences from their ASR paralogues in solanaceous species. Plant Physiology and Biochemistry, 43(3): 269-276. p. KUTAS J., KONDRÁK M., SZENTHE B., PATTHY A., BÁNFALVI Z., NÁDASY M., GRÁF L., ASBÓTH B. (2004): Colorado potato beetle larvae on potato plants expressing a locust proteinase inhibitor. Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences, 69(3): 281-287. p. KISS J., KONDRÁK M., TÖRJÉK O., KISS E., GYULAI G., MÁZIK-TÖKEI K., HESZKY L.E. (2001): Morphological and RAPD analysis of poplar trees of anther culture origin. Euphytica, 118(2): 213-221. p. TÖRJÉK O., KISS E., KISS J., KONDRÁK M., GYULAI G., HESZKY L.E. (2001): Evaluation of genetic diversity of poplar genotypes by RAPD and APPCR analysis. Acta Biologica Hungarica, 52(2-3): 345-354. p. KISS J., KONDRÁK M., GERGÁCZ J., HESZKY L.E. (1997): A protoplasztnövény rendszer kidolgozása hazai nyárfaklónokra. Erdészeti Kutatások, 86-87: 143-153. p.
115 115
Szakcikkek egyéb folyóiratokban: BÁNFALVI ZS., KONDRÁK M. (2005): Hosszan tárolható paradicsom. Zöld Biotechnológia, 2: 2-5. p. KISS J., KONDRÁK M., GERGÁCZ J., HESZKY L.E. (1997): Towards a heterosis hybrid poplar. Hungarian Agricultural Research, 3: 18-21. p. Konferencia kiadványok: KONDRÁK M., BÁNFALVI ZS. (2005): Rekombinázon alapuló marker- és vektor-mentes növényi transzformációs rendszer. VI. Magyar Genetikai Kongresszus, XIII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Eger, április 10-12. Összefoglaló:161. p. (PO51) SÓS-HEGEDŰS A., LOVAS Á., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BÁNFALVI ZS. (2005): A géncsendesítés hőmérséklet-függőségének vizsgálata antiszensz burgonya növényekben. VI. Magyar Genetikai Kongresszus, XIII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok, Eger, április 10-12. Összefoglaló:193. p. (PO86) SÓS-HEGEDŰS A., LOVAS Á., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BÁNFALVI Z. (2005): Antisense-mediated gene-silencing is manifested in different forms in potato. EMBO/HHMI Central European Scientists Meeting, Budapest, Abstract: 79. p. STILLER I., KONDRÁK M., BÁNFALVI Z. (2004): Drought tolerance mediated by trehalose-6-phosphate synthase in transgenic potato plants. 14th FESPB Congress, Cracow, Poland, August 23-27, Abstract published in Acta Physiologiae Plantarum 26 (suppl.) KONDRÁK M., ASBÓTH B, SZENTHE B, GRÁF L, BÁNFALVI ZS (2002): Sáska eredetű proteináz inhibitor peptid transzgénikus burgonyában. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 7. Munkaértekezlete, Keszthely, május 14-17, Összefoglaló: 59. p. DÓCZI R., CSANAKI CS., KONDRÁK M., BÁNFALVI Z. (2001): Expression and promoter activity studies on the dessication-specific DS2 gene in Solanaceous species, 4th International Symposium in the Series Recent Advances in Plant Biotechnology, Trebon, Czech Republic, September 17-21, Book of Abstracts : 111. p.
116 116
KISS J., KONDRÁK M., TÖRJÉK O., KISS E., MÁZIKNÉ TŐKEI K., HESZKY L.E. (2000): Portok-kultúrából regenerált Populus nigra növények morfológiai és molekuláris vizsgálata. VI. Növénynemesítési Tudományos Napok, MTA, Budapest, március 8-9. Összefoglaló: 82.p. KISS J., KONDRÁK M., TÖRJÉK O., KISS E., MÁZIK-TŐKEI K., HESZKY L.E. (2000): Portokkultúrából regenerált Populus nigra növények morfológiai és molekuláris vizsgálata, Az Agrobiodiverzitás megőrzése és hasznosítása, Budapest, május 4-5. Összefoglaló: KONDRÁK M., KISS J., GERGÁCZ J., MÁZIKNÉ TŐKEI K., KISS E., TÖRJÉK O., HESZKY L. (1999): Pollen eredetű nyárfák molekuláris és morfológiai analízise. IV. Magyar Genetikai Kongresszus, Siófok, április. 1114. p.148. Összefoglaló: 180. p. Szabadalmi bejelentések: BÁNFALVI ZS., DÓCZI R., CSANAKI CS., KONDRÁK M., SILHAVY D.: A DS2 gén szárazság-specifikus expressziót biztosító promoter szakasza. P0103697 ügyszámú bejelentés a Magyar Szabadalmi Hivatalhoz (2001. szeptember 13.) BÁNFALVI Z., DÓCZI R., CSANAKI C, SILHAVY D., KONDRÁK M.: Isolation and use of the desiccation-specific promoter from DS2 gene. Internatonal Patent Application No. PCT/HU02/00090. International filling date: 03/09/2002, priority date 13/09/2001 Tudományos Intézetben tartott szakmai előadások: SÓS-HEGEDŰS A., LOVAS A., KONDRÁK M., KOVÁCS G., BÁNFALVI ZS. (2003): A géncsendesítés hőmérsékletfüggőségének vizsgálata antiszensz burgonya növényekben. MBK napok, Gödöllő KONDRÁK M., BÁNFALVI ZS., ROUWENDAL G, VAN DER MEER I. (2003): Rekombinázon alapuló marker- és vektormentes transzformációs rendszer létrehozása és tesztelése burgonyában. MBK napok, Gödöllő KONDRÁK M., BÁNFALVI ZS. (2002): A Kecskeméti 262 paradicsomfajta fertőzés-ellenállóságának és tárolhatóságának javítása poligalakturonáz gátlással. MBK napok, Gödöllő
117 117
118 118
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm
Dr.
Nagy
Ferencnek,
a
Mezőgazdasági
Biotechnológiai
Kutatóközpont főigazgatójának, hogy az intézményben lehetőséget biztosított a munkám elvégzéséhez. Ezúton szeretnék elsősorban és mindenekelőtt köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Bánfalvi Zsófiának, a folyamatos támogatásért és szakmai segítségért, valamint, hogy biztosította a kísérletek hátterét. Köszönettel tartozom Dr. Asbóth Bencének, Kutas Jánosnak és Gerard J. Rouwendalnak a kísérletekben nyújtott segítségükért és tanácsaikért. Köszönettel tartozom Dr. Dóczi Róbertnek, Dr. Lovas Ágnesnek, Dr. SósHegedűs
Anitának,
Kovács
Gabriellának,
a
csoportunk
és
a
SZIE
Növénynemesítési és Genetikai Tanszék munkatársainak szakmai tapasztalaik megosztásáért és tanácsaikért. Kiss Mónikát és Szabadi Tamásnét a technikai asszisztenciáért, Takács Gábort a fotózási munkákért illeti köszönet.
119 119
