SZENT ISTVÁN EGYETEM RIZOSZFÉRA-BAKTÉRIUMOK ÉS MAGASABB REND NÖVÉNYEK INTERAKCIÓINAK ÖKOLÓGIAI ÉRTÉKELÉSE. Doktori értekezés. Oldal Bálint

SZENT ISTVÁN EGYETEM

RIZOSZFÉRA-BAKTÉRIUMOK ÉS MAGASABB RENDĥ NÖVÉNYEK INTERAKCIÓINAK ÖKOLÓGIAI ÉRTÉKELÉSE

Doktori értekezés

Oldal Bálint

GödöllĘ

2006.

A doktori iskola

megnevezése:

Környezettudományi Doktori Iskola

vezetĘje:

Prof. Dr. Menyhért Zoltán az MTA doktora (biol.), egyetemi tanár Szent István Egyetem, Környezet- és Tájgazdálkodási Intézet

A doktori program

megnevezése:

vezetĘje:

MezĘgazdasági-, környezeti mikrobiológia és talaj-biotechnológia

Prof. Dr. Kecskés Mihály az MTA doktora (biol.), egyetemi tanár MTA Környezetvédelmi Mikrobiológiai tanszéki Kutatócsoport

Tudományága:

környezettudomány, környezeti mikrobiológia

TémavezetĘ:

Prof. Dr. Kecskés Mihály az MTA doktora (biol.), egyetemi tanár MTA Környezetvédelmi Mikrobiológiai tanszéki Kutatócsoport

..……………………….……

………..…………………

az iskolavezetĘ jóváhagyása

a témavezetĘ jóváhagyása

Tartalomjegyzék

TARTALOMJEGYZÉK Az értekezésben elĘforduló rövidítések és jelölések, valamint fogalmak jegyzéke................7 1. Bevezetés.........................................................................................................................11 1.1. A téma aktualitása, jelentĘsége..................................................................................11 1.2. CélkitĦzések...............................................................................................................13 2. Irodalmi áttekintés.........................................................................................................15 2.1. Fenntartható mezĘgazdasági termelés .......................................................................15 2.2. A homoki vetésforgó növényei..................................................................................16 2.2.1. Gabonafélék: rozs ................................................................................................16 2.2.2. Pillangós takarmánynövények: bükköny és csillagfürt .......................................16 2.3. A rizoszféra baktériumainak hatása a növény növekedésére ....................................18 2.3.1. Növekedést serkentĘ mikrobiális anyagcseretermékek .......................................21 Antibiotikumok..........................................................................................................21 A Bacillus subtilis különbözĘ törzsei által termelt antibiotikumok...........................21 Pseudomonas sp. baktériumok antimikrobiális anyagai............................................22 Sziderofor vegyületek................................................................................................23 Vaskompetíció szideroforok segítségével .................................................................24 2.3.2. Növekedést szabályozó anyagcseretermékek ......................................................26 Auxin .........................................................................................................................27 Gibberellin .................................................................................................................27 2.3.3. NitrogénkötĘ baktériumok...................................................................................27 Szimbionta nitrogénkötĘ baktériumok ......................................................................28 Szimbionta nitrogénkötĘ baktériumok vizsgálata az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetében ......................................................................................................30 A szabadon élĘ nitrogénkötĘ baktériumok jelentĘsége .............................................31 Baktériumok és növényi gyökerek kölcsönhatása.....................................................32 Diazotróf baktériumok rizoszférából történĘ izolálása..............................................33 Az izolátumok azonosításának lehetĘségei ...............................................................34 2.4. Toxikus szennyezĘk hatása a rizoszféra mikroorganizmusaira.................................36 2.4.1. Nehézfém-vegyületek ..........................................................................................36 2.4.2. Nehézfémek oligodinámiás hatása ......................................................................37 2.4.3. Cianidok...............................................................................................................38 A mikrobák tĦrĘképessége a cianiddal szemben .......................................................38 Cianidvegyületek biológiai úton történĘ képzĘdése a talajban .................................38 A képzĘdött cianid sorsa a természetben...................................................................39 2.5. A hasznos mikroorganizmusok talaj-biotechnológiai célú irányított alkalmazásai ..40 2.5.1. Bacillus sp. baktériumok .....................................................................................40 A Bacillus subtilis élĘ tenyészeteinek felhasználása .................................................40 2.5.2. Pseudomonas sp. baktériumok ............................................................................42 Pseudomonas-törzsek növényi növekedés-serkentĘ hatása.......................................43 Indukált rezisztencia ..................................................................................................44

Rizoszféra baktériumok…

Mikroorganizmusok és magasabb rendĦ növények kölcsönhatásai értékelésének lehetĘségei..................................................................................................................44 3. Anyag és módszer...........................................................................................................47 3.1. Mintaterületek ............................................................................................................47 3.1.1. Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet mintaterületének jellemzése ..................47 3.1.2. A FelsĘ-Tisza vize és árterének talajföldrajzi és vegetációs jellemzése..............50 3.2. Baktériumok izolálása, azonosítása, tulajdonságai és törzsszelekció ........................51 3.2.1. Táptalajok.............................................................................................................51 3.2.2. Izolálás rizoszférából, talajból és vízbĘl ..............................................................53 Rizoszférából történĘ izolálás....................................................................................53 Izolálás talajból és vízbĘl...........................................................................................53 3.2.3. Az izolált baktériumtörzsek csoportosítása és meghatározása ............................54 Baktériumok morfológiai jellemzése .........................................................................54 Baktériumtörzsek csoportosítása diszkontinuus natív PAGE módszerrel .................54 Baktériumtörzsek BIOLOGTM módszerrel történĘ azonosítása.................................56 Baktériumtörzsek API 20 NETM módszerrel történĘ azonosítása..............................58 Baktériumok azonosítása a DNS bázissorrendje alapján – 16S rDNS módszer........58 3.2.4. A törzsek közvetlen növényi növekedés-serkentĘ hatásának kimutatása............59 Bioteszt fehér mustár csíranövénnyel ........................................................................59 3.2.5. Nitrogénkötés meghatározása ..............................................................................60 Nitrogénkötés kimutatása laboratóriumi bioteszttel ..................................................60 Nitrogénkötés meghatározása az acetilén-redukciós aktivitás mérésével..................60 3.2.6. Növényi hormonok termelésének kimutatása biotesztben...................................61 3.2.7. A baktériumok növényi növekedés-serkentĘ tulajdonságának vizsgálata...........62 Sziderofor-termelés meghatározása ...........................................................................62 Növénypatogén gombákkal szembeni antagonizmus ................................................62 3.2.8. Néhány környezeti tényezĘ reprezentatív baktériumtörzsekre gyakorolt hatásának felmérése ...................................................................................................63 A FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek cianid- és nehézfémtĦrésének meghatározása............................................................................................................63 A FelsĘ-Tisza területérĘl és a Westsik-vetésforgóból származó, szelektált baktériumtörzsek nehézfémtĦrésének maghatározása ...............................................64 Nehézfémek oligodinámiás hatásának vizsgálata ......................................................64 3.2.9. A szelektált baktériumtörzsek és gazdanövények in vivo kölcsönhatásának vizsgálata....................................................................................................................65 3.3. A vizsgálatok során alkalmazott statisztikai módszerek............................................65 4. Eredmények....................................................................................................................67 4.1. Az izolált baktériumok azonosítása, jellemzĘ tulajdonságai és a törzsszelekció eredményei ....................................................................................................................67 4.1.1. A Westsik- féle vetésforgóból izolált baktériumok morfológiai jellemzése........67 4.1.2. Baktériumok meghatározása fiziológiai és molekuláris módszerekkel ...............67 Törzsek diszkontinuus natív PAGE módszerrel történĘ csoportosításának eredményei .................................................................................................................67 Baktériumtörzsek BIOLOGTM módszerrel történĘ meghatározásának eredménye...68

Tartalomjegyzék

Pseudomonas sp. baktériumtörzsek API 20 NETM módszerrel történĘ meghatározásának eredménye ...................................................................................71 Baktériumtörzsek 16S rDNS módszerrel történĘ azonosításának eredménye ..........72 4.2. Baktériumtörzsek közvetlen növényi növekedés-serkentĘ hatásának kimutatása – fehér mustár csíranövénnyel végzett bioteszt eredménye ............................................75 4.3. A nitrogénkötés meghatározásának eredményei .......................................................76 4.3.1. A szilárd táptalajban végrehajtott fiziológiai bioteszt eredménye.......................76 4.3.2. Az acetilénredukciós aktivitás mérésének eredménye ........................................82 4.4. A baktériumok növekedés-szabályzó tulajdonságának kimutatása bioteszttel .........83 4.5. Pseudomonas sp. baktériumtörzsek antagonista hatása két növénypatogén gombatörzzsel szemben ................................................................................................85 4.5.1. A sziderofor-termelés bioteszttel történĘ meghatározásának eredménye ...........85 4.5.2. A növénypatogén gombákkal szembeni antagonizmus vizsgálatának eredménye.. .............................................................................................................................86 A kórokozók érzékenysége a Pseudomonas sp. törzsekkel szemben........................86 A Pseudomonas sp. törzsek antagonista képessége...................................................88 Az laboratóriumi bioteszt-módszerek összehasonlítása a Pseudomonas sp. törzsek antagonista képessége szempontjából........................................................................90 4.6. Környezeti tényezĘk baktériumokra gyakorolt hatása vizsgálatának eredményei ....94 4.6.1. A FelsĘ-Tisza területérĘl származó izolátumok cianid- és nehézfém-tĦrése ......94 4.6.2. A FelsĘ-Tisza területérĘl és a Westsik-vetésforgóból származó, szelektált baktériumtörzsek nehézfémtĦrése .............................................................................96 4.6.3. Nehézfémek oligodinámiás hatásának megállapítása..........................................98 4.6.4. Fémekkel szembeni tolerancia: szennyezés hatására kialakuló adaptáció, vagy kiválasztódás............................................................................................................102 A mikrobák sokfélesége ..........................................................................................102 4.6.5. A szelektált baktériumtörzsek növekedés-serkentĘ hatása a gazdanövényekre axénikus kultúrában .................................................................................................103 4.7. Új tudományos eredmények ....................................................................................106 4.7.1. Rizoszférából, talajból és folyóvízbĘl származó baktériumtörzsek ..................106 4.7.2. Rizoszférából izolált, szabadon élĘ baktériumtörzsek nitrogénkötĘ képessége ...... ...........................................................................................................................106 4.7.3. Néhány környezeti tényezĘ hatása a reprezentatív baktériumtörzsekre ............106 A FelsĘ-Tisza területérĘl származó törzsek cianid- és nehézfém-tĦrése.................106 A FelsĘ-Tiszáról és a Westsik-vetésforgóból származó baktériumtörzsek nehézfémtoleranciája...............................................................................................................107 4.7.4. A baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó és serkentĘ tulajdonságai..... ...........................................................................................................................107 4.7.5. A szelektált baktériumtörzsek és gazdanövények in vivo kölcsönhatásai .........108 5. Következtetések és javaslatok.....................................................................................111 A továbblépés lehetĘségei .......................................................................................114 6. Összefoglalás ................................................................................................................115 7. Summary ......................................................................................................................117 M1. Irodalomjegyzék..............................................................................................................i M2. Az adatfeldolgozás eredményei..................................................................................xix


M3. Ábrajegyzék ............................................................................................................ xxxiii Köszönetnyilvánítás .........................................................................................................xxxv

Fogalmak és jelölések

7

AZ ÉRTEKEZÉSBEN ELėFORDULÓ RÖVIDÍTÉSEK ÉS JELÖLÉSEK, VALAMINT FOGALMAK JEGYZÉKE Į

Az Į valószínĦséget a statisztikai próba szignifikancia-szintjének nevezzük (MANCZEL 1983, KEMÉNY és DEÁK 2000). Az elfogadási tartományba a próbastatisztika értékei 1 – Į valószínĦséggel esnek, ha a nullhipotézis igaz. Másképpen, elfogadási tartomány az, melyben a próbastatisztika értékei a véletlenszerĦ ingadozás következtében 1 – Į valószínĦséggel lehetnek.

ANOVA

Variancia-analízis, vagy szóráselemzés (angol: analysis of variance). A nullhipotézis szerint a vizsgált sokaságok (csoportok) várható értékei között nincs különbség. A nullhipotézist akkor utasíthatjuk el, ha a csoportok szórásnégyzeteinek aránya az F-próba kritikus értékénél nagyobb. Az F-próbát az egyes vizsgálatok során adott Į szignifikanciaszintre (általában Į = 0,05), azaz 1 – Į valószínĦségĦ elfogadási tartományra számítottam ki.

ARA

acetilén-redukciós aktivitás

ARDRA

a bakteriológiában gyakran alkalmazott RFLP (restrikciós fragmenthossz polimorfizmusa; restriction fragment lenght polymorphism), melyet PCRrel felszaporított riboszomális DNS-szakaszon végeznek (angol: amplified ribosomal DNA restriction analysis)

ATTC

USA-beli nemzeti és egyben nemzetközi hírĦ mikrobatörzs- és sejtvonalgyĦjtemény (angol: American Type Culture Collection)

bp DNS

bázispár dezoxiribonukleinsav

DSMZ

német nemzeti és egyben nemzetközi hírĦ mikrobatörzs- és sejtvonalgyĦjtemény Braunschweigben (német: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)

EDTA

etilén-diamin-tetraecetsav, kelátképzĘ anyag (angol: ethylene-diaminetetraacetic acid)

ELTE

Eötvös Loránd Tudományegyetem

ENSZ

Egyesült Nemzetek Szervezete (angol: UN; United Nations)

et al.

és mások (latin: et alteri)

FAO

az ENSZ (UN) élelmezésügyi és mezĘgazdasági szervezete (angol: Food and Agriculture Organization of the United Nations)

GC

gázkromatográf (angol: gas chromatograph)

GC-MS

gázkromatográf-tömegspektrométer (angol: gas chromatograph - mass spectrometer)

HPLC

Nagyfelbontású folyadék-kromatográfia (angol: high performance liquid chromatography)

in situ

helyben (latin)

M

egy mól anyagmennyiség, azaz 6 × 1024 db atom, vagy molekula

Mr

relatív molekulatömeg, egy mól anyag tömege (g)

8


m/v%

Tömegszázalék. Szilárd halmazállapotú reagenst folyadékban oldva a reagens tömegaránya az oldatban.

N

normálos oldat (1 M dm-3, adott elemre vonatkoztatva)

MS

tömegspektrométer (angol: mass spectrometer)

MTC

környezeti ágensek – pl. nehézfémek – baktériumtörzsek által tolerált legnagyobb koncentrációja (angol: maximal tolerated concentration)

n.d.

nem detektálható (a használt módszerekkel)

P

Probabilitás (angol: probability), valószínĦség. E dolgozatban P = 1 – Į, vagyis a hipotézisvizsgálat elfogadási tartományának valószínĦsége, más néven az Į szignifikancia-szinthez tartozó megbízhatósági szint. Ha Į = 0,05; akkor P = (1 – 0,05) = 0,95. P értékét %-ban fejeztem ki és adott P megbízhatósági szintre számított szignifikáns differenciát [SzDP%]-kal jelöltem, pl. SzDP95%.

PCA

fĘkomponens-analízis (angol: principal component analysis)

PCR

polimeráz láncreakció (angol: polymerase chain reaction)

PGPR

növényi növekedést serkentĘ rizobaktériumok (angol: plant growth promoting rhizobacteria)

PGR

növényi növekedést szabályozó (hatás, vagy mikroba; angol: plant growth regulator)

r

riboszomális

RNS

ribonukleinsav

rpm

fordulatszám egy perc alatt (angol: round per minute)

SDS

nátrium-lauril-szulfát (angol: sodium dodecylsulfate)

SDS-PAGE

Összfehérje-mintázat meghatározása nátrium-lauril-szulfátos denaturáló poliakrilamid-gélelektroforézissel (angol: sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis). A natív PAGE denaturáló ágenst (SDS-t) nem tartalmaz, így felbontóképessége kisebb, a fehérjék homogenitásának vizsgálatára nem, de pl. adott baktériumtörzs fehérjeprofiljának láthatóvá tételére alkalmas.

sp., spp.

faj, fajok (latin: species)

TEMED

N,N,N’,N’-tetrametil-etiléndiamin, a PAGE gél elkészítése során az akrilamid monomer oldatához bifunkciós N,N’-metilén-bisz-akrilamidot adunk, majd a polimerizációt ammóniumperszulfát és TEMED elegyével indítjuk. A perszulfátból szabad gyök (S2O82-) keletkezik, mely a tetrametil-etiléndiamint aktiválja, s ez indítja be az akrilamid és biszakrilamid térhálós polimerré történĘ alakulását. Az akrilamidbiszakrilamid arányának változtatásával eltérĘ pórusméretĦ polimerek hozhatók létre.

TörzsgyĦjtemény

Saját törzsgyĦjtemény, mely nem azonos és nem áll kapcsolatban bármely nemzeti, vagy nemzetközi, jogi személyként elismert törzsgyĦjteménnyel. E törzsgyĦjtemény saját izolálásból származó, laboratóriumi módszerekkel szelektált, növényoltásra alkalmas baktériumtörzsekbĘl áll, melyek liofilizált állapotban megĘrzésre kerültek.

Fogalmak és jelölések

9

TRIS puffer

Trisz-(hidroximetil)-amino-metán, szinoním néven: 2-Amino-2-hidroximetil1,3-propándiol, Trometamol. Relatív molekulatömege 121,14 g M-1.

UPGMA

csoportátlag módszer: hierarchikus osztályozó algoritmus, melyben két osztály távolságát az objektumaik közötti összes távolságérték aritmetikai átlaga fejezi ki (angol: unweighted pair-group method using arithmetic averages)

UV

ultraibolya (angol: ultraviolet) fénysugárzás

VBNC

élĘ, de nem tenyészthetĘ mikroorganizmus (angol: viable but nonculturable)

v/v%

Térfogatszázalék. Folyékony (vagy gáz-) halmazállapotú reagenst folyadékban oldva a reagens térfogataránya az oldatban.

WRB

a FAO genetikus talajosztályozási rendszere (angol: World Reference Base for Soil Resources)

Bevezetés

11

1. BEVEZETÉS 1.1.

A téma aktualitása, jelentĘsége A talajtermékenység legfontosabb összetevĘi a talaj tápanyagszolgáltató-képessége és fizikai tulajdonságainak stabilitása, melyek elengedhetetlenek a növénytermesztés optimalizálásához, és meghatározó jelentĘségĦek a mezĘgazdasági rendszerek eredményességét illetĘen. Számos, a talajban lejátszódó, annak termékenységét befolyásoló folyamat mikroorganizmusok – gombák, baktériumok, sugárgombák és algák – közremĦködésével megy végbe. A talaj mikroorganizmusainak jelenléte és aktivitásuk ezért alapvetĘ fontosságú a mezĘgazdasági talajok termékenysége szempontjából. Az ember társadalmi fejlĘdésének különbözĘ fokain eltérĘ volt a felhasznált külsĘ, ipari eredetĦ inputok mennyisége, az összlakosságon belül a mezĘgazdasággal foglalkozók részaránya. Az alacsony nemzeti jövedelemmel és fejletlen iparral rendelkezĘ országokban még jelenleg is a népesség több, mint 90 %-a foglalkozik mezĘgazdasággal, hogy megtermelje a létfenntartáshoz szükséges élelmiszereket. A fejlett ipari országokban a fejlĘdés eredményeként a társadalom átrétegzĘdött, kialakult a jóléti társadalom, ahol a munkamegosztáson belül a harmadik szektor és a fogyasztási javak termelése egyre növekvĘ rétegnek biztosítja a megélhetést. A technika fejlĘdésén túl a tápanyag-gazdálkodás az, ami közvetlenül lehetĘvé teszi a hozamok növelését, a termĘföld népességeltartó-képességének emelését. A demográfiai robbanás következtében elĘálló élelemhiány ugyanakkor felhívta a figyelmet a humán és az állati fehérje-ellátásban egyaránt fontos szerepet játszó, a talajok tápanyag-visszapótlását a légköri nitrogén megkötése révén elĘsegítĘ pillangós virágú növények termesztésének fontosságára (KECSKÉS 1976). A pillangós virágú növények termesztésével már a régmúltban is egyre több nitrogén került a talajba, részben a gyökér- és szármaradványok révén, részben közvetett úton, az istállótrágyázáson keresztül. A pillangós takarmánynövények termesztése következtében a talajok nitrogén-ellátottsága átmenetileg javult, ezért is jelentett mérföldkövet LIEBIG (1876) felfedezése a növények ásványi táplálkozását illetĘen, a hamualkotó elemek, elsĘsorban a foszfor és a kálium fontosságának vonatkozásában. A felfedezés nyomán új iparág, a mĦtrágya-gyártás alakult ki, mely a növénytermesztés tápanyagigényét volt hivatott kielégíteni a csontliszt és guanó, majd a foszfáttelepek felfedezése után a nyersfoszfátok felhasználásával. Napjainkban a mezĘgazdaság fejlĘdésére a gépesítés és a kemikáliák alkalmazása bír a legnagyobb hatással. Mindkét beavatkozás jelentĘsen növeli az élĘmunka termelékenységét. A gépesítés és a herbicidek közvetlen élĘmunka-megtakarítást tesznek lehetĘvé, míg a fungicidek, egyéb peszticidek és a mĦtrágyák a hozamokon keresztül növelik az élĘmunka hatékonyságát. A tudomány fejlĘdésével a szakemberek már a múlt század elején felismerték, hogy a mezĘgazdasági termelés a növénytermesztés függvénye, így a talajok termékenységének növelése az egész mezĘgazdaság jövĘje szempontjából meghatározó jelentĘségĦ. A mezĘgazdasági termelés alapja az asszimiláció, központi kérdése azonban a termesztett növények tápanyagellátása, amely egyet jelent a kivont tápanyagok folyamatos utánpótlásával. Az intenzív mezĘgazdaság térhódításával az ember ugyanakkor monokultúrába vonta az egykor nagy biológiai diverzitással rendelkezĘ földterületeket. A monokultúrás mĦvelés és a nemesített növények alkalmazása egyre labilisabbá teszi az ökológiai egyensúlyt. Ebben a környezetben olyan élĘlények túlzott elszaporodása is nagy károkat okozhat, melyeket korábban teljesen ártalmatlannak tartottunk. A közvélemény és a kutatók közössége ezért megkérdĘjelezi a kemikáliák széleskörĦ alkalmazásának indokoltságát, ezért az utóbbi idĘben növekszik az érdeklĘdés a hagyományos eljárásokon alapuló fenntartható mezĘgazdasági termelés iránt. A kutatók egyre kiterjedtebben

12


vizsgálják a fenntarthatóság mezĘgazdasági, környezetvédelmi és társadalmi (közgazdasági) vonatkozásait (LAZÁNYI 1994). Emellett egyre több ismeretekkel rendelkezünk a talajnövény rendszerben elĘforduló mikroorganizmusok életmĦködésével kapcsolatban, ami elengedhetetlen feltétele az eredményes kutatásnak és e mikroorganizmusok gyakorlati alkalmazásának. A homoktalajokon való növénytermesztés egyik kritikus pontja a növények nitrogénnel való ellátottsága, mert a szerves kötésĦ, nitrogént tartalmazó anyagok gyorsan ásványosodnak, az ásványi nitrogén viszont gyorsan kimosódik e talajokból, súlyosan szennyezve ezzel a talajvizet, ami jelentĘsen veszélyeztetheti a lakosság egészségét. A hazai homoktalajos tájak talajvizének szennyezettsége igen sürgĘs beavatkozást igényel. A legnagyobb veszélyt jelentĘ nitrogénmĦtrágyázás viszont nélkülözhetetlen e talajokon az eredményes mezĘ-gazdasági tevékenységhez. A megoldást a mĦtrágyák felhasználását a lehetĘ legkisebb szinten tartó gazdálkodási rendszer jelentheti, amelyre igen jó példát mutat a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet, melyet 1929-ben indított Westsik Vilmos; és hazánk legrégebben folytatott tartamkísérlete (LAZÁNYI 1994). A hosszú ideje változatlanul végzett talajmĦvelés során a hatások összegzĘdnek, és nagyobb mértékben megfigyelhetĘk, mint a hazai, átalakulóban levĘ mezĘgazdaság szántóföldjein, ahol igen nehéz olyan területet találni, amelynek kellĘképpen ismert az „elĘélete”. Ezzel szemben a Westsik-féle vetésforgórendszerrĘl részletes adatok állnak rendelkezésre, illetve elĘre ismert és így tervezhetĘ az egyes földmĦvelési eljárások idĘpontja és technikája. Hosszabb távon, a környezet károsítása nélkül fenntartható mezĘgazdaság egyszerre keres megoldást a környezetvédelmi, gazdaságföldrajzi és mezĘgazdasági problémákra. Olyan termesztéstechnológiai eljárások kidolgozása a cél, ahol a természeti értékek védelme biztosított, a külsĘ erĘforrások felhasználása optimalizált, miközben a termelés jövedelmezĘsége nem csökken (P. SZABÓ 1994). A nagy szakmai tapasztalaton és nemzetközi tudományos alapon nyugvó homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet a fenti kérdés megválaszolásához nyújt hasznos útmutatást. Alkotója korát messze megelĘzve energia-, víz- és tápanyag-körforgalomra, a megújuló természeti erĘforrások ésszerĦ, gazdaságod felhasználására alapozta kísérletét. A XIX. század utolsó évtizedeiben jelentek meg az elsĘ rizoszférával foglalkozó közlemények, védekezési célokra azonban csak a XX. század második felétĘl kezdtük alkalmazni a talajlakó mikroorganizmusokat. Napjainkban egyre több mikroorganizmus kerül a tanulmányozás középpontjába, de még mindig viszonylag keveset tudunk, pl. a talajban élĘ, mesterséges körülmények között nem tenyészthetĘ mikrobákról, melyek nagy részét tehetik ki a rizoszféra mikroorganizmusainak. A növényi tápanyagellátás kiegyensúlyozásában viszont fontos szerep juthat a rizoszférában elĘforduló baktériumok célzott felhasználásának, amennyiben sikerül megismerni ökológiájukat, illetve a hatékonyságukat befolyásoló tényezĘket. E mikrobák azonban nemcsak a tápanyagellátás javítása révén segíthetik elĘ a növények fejlĘdését, hanem növekedés-serkentĘ hatással is rendelkeznek. E két mechanizmus részletei nem ismertek kellĘképpen ahhoz, hogy ökonómiailag is megfelelĘ alkalmazási módokat dolgozhassunk ki. A tápanyagellátásban való szerepüket mélyebben tanulmányozták, de a megbízható szántóföldi felhasználáshoz igen hasznos ismerni a növekedés-serkentĘ hatást is. A növények gyökerét kolonizáló, növekedés-serkentĘ baktériumok némelyikénél már kimutatták, hogy anyagcseretermékeik révén rövidebb-hosszabb ideig tartó rezisztenciát is képesek kiváltani a gazdanövény földfeletti részében (pl. LIU et al. 1995). Fontos szempont ezen kívül a kemikáliákkal és más növényi mikrobiális oltóanyagokkal való kompatibilitás kérdése is (KECSKÉS 1977, KECSKÉS és VINCENT 1973, KECSKÉS et al. 1972, BAYOUMI et al. 1996).

Bevezetés

13

1.2.

CélkitĦzések A homoktalajokon történĘ növénytermesztés kiegyensúlyozásában a rizoszféra baktériumai fontos szerepet töltenek be. Jelen munka fĘ célkitĦzése a homoktalajokon termeszthetĘ néhány fontos gazdasági növény rizoszféra baktériumainak tanulmányozása és a késĘbbi biotechnológiai célú alkalmazást (pl. mag-, növény-, vagy talajoltást) megalapozó ökofiziológiai jellemzése, laboratóriumi és klímakamrás vizsgálatok révén. A fenti kérdés megválaszolásához hasznos segítséget nyújt a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet, amely egyedülálló módon modellezi a parlagoltatás, szalma-, istálló- és zöldtrágyázás, valamint a mĦtrágyázás talajéletre, talajtermékenységre gyakorolt hatását. *** 2000. január 30-án a romániai Nagybánya térségében mĦködĘ Aurul ausztrál-román vegyesvállalat cianidtartalmú víztározója gátjának szakadása következtében közel 100 ezer m³, magas cianid-koncentrációjú szennyezett víz folyt el és jutott a Szamos folyó vízgyĦjtĘ területéhez tartozó Zazar és Lápos vízfolyásokba, majd a Tiszába. A szennyezés alapvetĘen cianid-tartalmú fémkomplexekbĘl tevĘdött össze. 2000. március 10-én a Tisza vízgyĦjtĘterületéhez tartozó Visó folyó völgyében mĦködtetett Borsa bánya meddĘhányóján kialakított zagytározó az esĘzések miatt meglazult és húszezer tonna nehézfémtartalmú iszap került a folyóba, végül a Tiszába. Mivel a cianid, és a cianid tartalmú fémkomplexek közvetlen akut toxicitást okoznak a velük érintkezésbe kerülĘ élĘ szervezetekben, fontos az egyes élĘlénycsoportokra, illetve közösségekre gyakorolt toxikus hatás ismerete, ezért az MTA Környezeti Mikrobiológiai Tanszéki Kutatócsoport korábbi munkája keretében a Tiszából és vízgyĦjtĘjébĘl származó baktériumok és mikroszkopikus gombák tĦrĘképességét is vizsgáltam. A munka során 314 baktérium és 82 mikroszkopikus gomba izolátumot nyertünk a FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából, melybĘl 25 baktérium és 44 gomba törzset választottunk ki további elemzésre (OLDAL et al. 2001, VARGHA et al. 2001, OLDAL et al. 2004). Ez a vizsgálatsorozat jelen dolgozat témáját is befolyásolta, mivel felvetĘdött a kérdés, vajon a Nyírségben a Tisza öntéstalaján elterülĘ mezĘgazdasági táblákon milyen hatása lehet annak, ha ilyen típusú szennyezések többször is elĘfordulnak? ElképzelhetĘ ugyanis – különösképpen az említett területen 2004-ben indult nagyarányú bányafejlesztés okán –, hogy egy tiszai áradás alkalmával a szennyezĘanyagok a folyó medrétĘl akár km-es távolságra is kiáramlanak. Amennyiben pozitív összefüggést lehet kimutatni a Westsik-féle homokjavító vetésforgótartamkísérlet, valamint más, homok-, illetve öntéstalajos területekrĘl származó („vad” típusú), rizoszférában domináns baktériumtörzsek növényi fiziológiai hatását illetĘen, akkor indokolt ezt a szempontot is figyelembe venni a növényoltáshoz használható törzsek szelekciójánál. Az elmondottak alapján célul tĦztem ki a Westsik-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájában, illetve rizoplánjában, valamint a FelsĘ-Tisza vizében és árterületének talajában néhány jellemzĘ mintaterületen elĘforduló, tenyészthetĘ baktérium növényi növekedést közvetlenül (PGR) és közvetve (PGPR) serkentĘ hatásának vizsgálatát. A hosszabb ideje mĦvelés alatt álló (vetésforgó) és a természetes állapotú (ártér, part) talajból nyert baktériumtörzsek ökofiziológiai összehasonlításával mód nyílik az élĘhely, illetve a növénytakaró e tulajdonságokra (szinergizmus, antagonizmus) gyakorolt befolyásának jellemzésére. E célok röviden az alábbiak szerint foglalhatók össze:

14


1.) Rizoszférából, talajból és vízbĘl származó baktériumok elĘfordulásának felmérése kultúr-, valamint természetes – ártéri – területeken x Baktériumok izolálása a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és a rozs gazdanövényeinek rizoszférájából és rizoplánjából, valamint a FelsĘ-Tisza vizébĘl, árterének és partjának talajából, néhány jellemzĘ mintaterületen. x Az eltérĘ eredet (a vetésforgó kezelései, valamint szennyezett, illetve nem szennyezett területek) hatása a természetes abundanciára: az izolálás helye és a baktériumtörzsek ökofiziológiai tulajdonságai közötti összefüggések megállapítása. x Talaj-biotechnológiai célra felhasználható saját törzsgyĦjtemény létrehozása, ismert tulajdonságú törzsekbĘl.

2.) Az izolált baktériumok ökofiziológiai tulajdonságainak megállapítása különbözĘ módszerekkel x A növényi növekedés-serkentés felmérése axénikus kultúrában bükköny, csillagfürt és rozs tesztnövényekkel; a hatékony törzsek szelekciója. x A növekedést jelentĘsen serkentĘ törzsek által termelt hormonhatású anyagok kimutatása. x A szelektált baktériumtörzsek cianiddal és különbözĘ nehézfém-vegyületekkel szembeni toleranciájának meghatározása, valamint x néhány jellemzĘen elĘforduló növénypatogén mikroszkopikus gombával szembeni antagonizmusának megállapítása.

3.) Növényoltásra potenciálisan felhasználható baktériumtörzsek kiválasztása

Irodalmi áttekintés

15

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1.

Fenntartható mezĘgazdasági termelés A mezĘgazdasági és élelmiszeripari termelés problémája egyidĘs az emberiséggel. A probléma gyökerei a talajdegradációs folyamatokban (pl. erózió), a talajtermékenység csökkenésében keresendĘk. Napjainkban az energiafelhasználás növekedésével a környezetszennyezés is egyre növekvĘ problémát jelent és elĘtérbe helyezi a termelés fenntarthatóságának kérdését (SZABÓ 1997). A Föld lakossága, valamint az egy fĘre jutó fogyasztás növekedése miatt nĘ a kereslet a mezĘgazdasági termékek iránt. WOLF (1987) becslése szerint a fogyasztás jelenlegi szinten történĘ tartásához a fontosabb mezĘgazdasági és élelmiszeripari termékek elĘállítását 2020-ig 56 %-kal kell növelni. FARRELL et al. (1984) ugyanerre az idĘszakra még nagyobb, 90–140 %-os termelésnövekedést helyezett kilátásba a növekvĘ élelmiszeripari igények kielégítéséhez. Történelmi példák és környezetvédelmi tanulmányok igazolják, hogy a mezĘgazdasági termelés jelenlegi technológiai szintjén ilyen mértékĦ növekedés a környezet károsodása nélkül nem képzelhetĘ el (EHRLICH 1985, MAGLEBY et al. 1985, FRANCIS és HILDEBRAND 1989, KEENEY 1989). A mezĘgazdasági termelés fenntarthatósága 1969-ben az I. Föld Konferencián került elĘtérbe és a probléma lényegét különbözĘ szerzĘk igen eltérĘ módon közelítették meg (LARSON et al. 1984, LOCKERETZ 1988, RUTTAN 1988, CARTER 1989, HAMILTON 1989, YORK 1989, LAZÁNYI 1993). LOCKERETZ (1986) szerint a fenntartható gazdálkodási forma kerüli, de legalább is a minimálisra csökkenti a nem megújuló erĘforrások felhasználását. LOWRANCE et al. (1984) a fenntartható mezĘgazdaság lényegét olyan technológiai eljárások alkalmazásában látja, amely a környezetre semmilyen káros befolyással nincs. DOUGLASS (1984) a mezĘgazdasági termelés tekintetében háromszintĦ álláspontot határozott meg. Az elsĘ nézĘpont szerint a fenntartható mezĘgazdaság legfontosabb feladata az élelmiszeripari termelés maximalizálása a jövedelmezĘség keretei között. Az elképzelések másik csoportja a fenntarthatóságot a környezeti ártalmak csökkenésében látja, míg a harmadik szerint a legfontosabb feladat a vidéki szokások és erkölcsi normák megĘrzése. Az extenzív talajhasználat azonban nem minden esetben jelent környezetkímélĘ gazdálkodást. Jó példa erre a marginális területek mĦvelésbe vonása az élelmiszer-termelés színvonalának biztosítása érdekében azokon a területeken, ahol a talaj és a környezet degradációjának jelei rövid idĘ alatt széles körben jelentkeznek. A termelés fenntarthatóságának biztosítását ezért a tájkörzet népességeltartó-képességének figyelembevételével lehet megtervezni (SENANAYAKE 1991, ODUM 1983 és 1989). A mezĘgazdaság üzemi szintĦ problémái sokoldalúan befolyásolják a magasabb szintek fenntarthatóságát, amelyek a természeti környezet minĘségének romlásában jelentkeznek. Egy-egy tájkörzet ökológiai állapota ugyanakkor nagymértékben meghatározza az ott folytatható mezĘgazdasági munkát (LAZÁNYI 1994). A homokjavító vetésforgó-kísérleteket 1929-ben állította be Westsik Vilmos a Nyírségben, és 1931-ben értékelte elĘször. A kísérlet 14 háromszakaszos és 1 négyszakaszos vetésforgót foglal magába, egyedülállóan modellezi a parlagoltatás, szalma-, istálló- és zöldtrágyázás, valamint a mĦtrágyázás talajtermékenységre gyakorolt hatását (P. SZABÓ 1994). A kísérlet tudományos értékét növeli, hogy a kiterített vetésforgóban minden évben minden növényt elvetnek, így több mint 60 éves adatsor áll a kutatók rendelkezésére, hogy a homoki gazdálkodás szempontjából legfontosabb növények termésbefolyásoló tényezĘit vizsgálhassák. A különbözĘ szerves- és mĦtrágyakezelések hatására a talajban végbemenĘ folyamatok tanulmányozására is kedvezĘbbek a feltételek, ha a trendeket több évtizeden

16


keresztül nyomon lehet követni és az egyensúlyi folyamatok kialakulásához hosszú idĘ áll rendelkezésre. Westsik Vilmos idejében a gazdák még vetésforgó-rendszerben gazdálkodtak, ezért a kísérleti parcellákat is célszerĦ volt úgy alakítani, hogy az eredmények a gyakorlatba is könnyen átültethetĘk legyenek. E gondolkodásmód helyességét a sikeres bemutatók már a kezdeti idĘszakban igazolták. A megfelelĘ agrotechnika, valamint a maga korában hatékony tápanyag-visszapótlási rendszernek köszönhetĘen a kultúrák jól fejlĘdtek és gyommentesek voltak. A környezĘ gazdákhoz viszonyítva az elért hozamok is nagyobbak voltak, így a kísérletet a szakoktatásban részesülteken túl évente akár 1500 gazda is felkereste, hogy a homoki gazdálkodás újabb módszerével megismerkedjen. MezĘgazdaságunkban a legfontosabb környezetvédelmi feladat a talajtermékenység megóvása, az energiahordozók biztosítása volt az elmúlt néhány évtizedben (LÁNG 1992). Mára azonban a hangsúly a nemzetközi – benne az Európai Unióbeli – trend szerint a talajminĘségre és az élelmiszerbiztonságra helyezĘdött át a hangsúly (BROOKES 1995, GILLER et al. 1997, GIL-SOTRES et al. 2005). Hazánkban a mezĘgazdasági termelés fenntarthatóságának tanulmányozása és új, alternatív növénytermesztési és állattartási technológiák kidolgozása a környezetvédelmi megfontolásokon túl az exportált élelmiszeripari termékek minĘségével szemben támasztott egyre szigorúbb követelmények miatt is egyre fontosabb és ugyancsak sürgetĘ feladat (SZABÓ 1997). 2.2.

A homoki vetésforgó növényei A homoki vetésforgóban elĘforduló növények száma kevés, mert kevés azoknak a növényeknek a száma, amelyek a Nyírség kedvezĘtlen talaj- és ökológiai adottságú területein termeszthetĘk. A vezérnövény mindegyik (Westsik-féle) vetésforgóban a burgonya és a rozs. 2.2.1. Gabonafélék: rozs A gazdálkodás szintjének emelését szolgálja a csillagfürt zöldtrágya-, és a pillangós szálastakarmány-növények vetésforgóba iktatása, hiszen a rozs elĘvetemény-hatása ezekhez képest csak közepes. Bojtos gyökérzete miatt a talajt jól átszövi, de árnyékoló hatása csak a szárbaindulásig áll fenn, késĘbb a talaj kiszárad, akadályozva a mikrobiális tevékenységet. Trágyahatás szempontjából visszamaradó szervesanyag C/N aránya sem kedvezĘ. A kalászosok kedvezĘtlen elĘvetemény-hatása csökkenthetĘ pillangós virágú növényekkel, amelyre a Westsik vetésforgó-kísérlet is szolgáltat példát. Az Ęszi takarmánykeverékben szereplĘ bükköny a gyökérmaradvány kedvezĘtlen C/N arányát ellensúlyozza, de jó árnyékoló képességénél fogva a tenyészidĘszak folyamán hosszú ideig biztosítja a mikrobiális tevékenységet, segítve a talaj beéredését. A rozs termesztését az indokolja, hogy az alacsony humusztartalmú homoktalajokon legbiztonságosabban termeszthetĘ gabonaféle, ugyanakkor jó árunövény. További elĘnye, hogy Ęsszel vethetĘ, így a talajt hosszú ideig és jól borítja, megakadályozza a deflációt. A gabonafélék közül a tavaszi gabonák kevésbé igényesek az elĘvetemény-hatásra, mert az Ęszi csapadék csökkenti a talaj nedvességhiányát, illetve az Ęszi és kora tavaszi idĘszakban a hĘmérséklet is megfelelĘ a mikrobiális tevékenységhez, így a kalászos növények kedvezĘtlen elĘvetemény-hatását képes ellensúlyozni (LAZÁNYI 1994). 2.2.2. Pillangós takarmánynövények: bükköny és csillagfürt A hüvelyes növények közül savanyú homoktalajokon a csillagfürt és a bükkönyfélék termeszthetĘk a legjobb eredménnyel. A csillagfürt jelentĘségét emeli, hogy kis pH-jú talajokon is jól növekedik, mélyre hatoló karós gyökere miatt a talaj mélyebb rétegeibĘl is


17

képes táplálkozni, ugyanakkor kedvezĘ C/N aránya miatt gyökértrágyának is kiváló. A gyökerét kolonizáló Azotobacter fajok miatt képes növelni a talaj nitrogéntartalmát, emellett segíti a foszfor feltáródását. GILLER és DAY (1985) szerint a pillangós növények kedvezĘ elĘvetemény-hatása üzemi méretekben akkor mutatható ki, ha a gazdaság területének 15–25 %-án hosszabb ideig termesztenek pillangós növényt, mert termesztésükkel serkenthetĘ a gazdaság szénforgalma, javítható a talajok humusszal való ellátottsága és minĘsége. A csillagfürt, de általában a hüvelyes növények kedvezĘ elĘvetemény-hatása csak egy évig érvényesül, mert gyökér- és szármaradványuk kedvezĘ összetételének következtében lebontásuk gyors és tökéletes. A csillagfürt az elĘvetemény iránt nem igényes. Önmaga után vetve azonban gyakran találkozunk a talajuntság tünetével, ami a Fusarium gombák felszaporodásának és az általuk elĘidézett gyökérhervadásnak köszönhetĘ. Trágyázása során lényeges szempont viszont a növény kiváló foszformĦtrágya-hasznosítása. Foszfor mĦtrágyázással a növény fejlĘdése intenzívebb, így a megkötött nitrogén mennyisége is nagyobb. A Westsik vetésforgó kísérleteiben a fĘvetésĦ csillagfürt-zöldtrágya hatására a rozs termése 161 %-kal, a burgonya termése 115 %-kal nĘtt a parlagoltatáshoz képest, ami 1,53 t/ha, illetve 4,65 t/ha termésemelkedést jelent. A csillagfürt gyökértrágyázás hatására a rozstermés 130 %-kal (1,23 t/ha), a burgonyatermés 95 %-kal (3,8 t/ha) nĘtt. Még kedvezĘbb hatásokat lehetett kimutatni 1993-ban az F8 jelĦ vetésforgóban, ahol a csillagfürt négy év alatt kétszer fordult elĘ (LAZÁNYI 1994). A csillagfürtfélék kitĦnnek nagy tápanyagfeltáró-képességükkel, melyre gyökérzetük nagy foszfor- és káliumtartalma is utal. Ez magyarázható mélyre hatoló karós gyökérzetük nitrogéngyĦjtésével, amely maga után vonja az egész növény fokozottabb aktivitását. A csillagfürt tápanyagfeltáró-képessége nemcsak az utónövény szempontjából fontos, de hatása az egész gazdaságban értékelhetĘ az altalaj tápanyagtĘkéjének mobilizálása és feltalajban történĘ felhalmozódása miatt (ADAMS és LAUGHLIN 1981). A csillagfürt termesztésének azonban problémái vannak, melyek következtében nem juthat olyan szerephez, mint amit kedvezĘ elĘvetemény- és szervestrágya-hatása miatt megérdemelne. Ezek közül külön ki kell emelni termésingadozását. Termése és termesztése is nagymértékben függ a kitavaszodás, valamint a tenyészidĘben lehullott csapadék mennyiségétĘl. A Westsik-vetésforgók gyökértrágyás kezeléseiben elĘbb a sárgavirágú keserĦ, késĘbb a fehérvirágú édes csillagfürtöt termesztették. VetĘmagellátási problémák miatt 1972 óta egységesen a fehérvirágú édes változat szerepel, amelynek mind a gyökér-, mind a zöldtrágya-hatása elmarad a robosztusabb sárgavirágú keserĦ csillagfürtétĘl. A vetésforgó-rendszerben a bükköny kettĘs termesztésben, zabbal és rozzsal fordul elĘ. A zabosbükköny elĘvetemény-hatása igen jó és a természeteshez legközelebbi állapotot modellezi (LAZÁNYI 1994). A természetben egy vegetáció több társulás formájában alakul ki, ahol az egyes tagok kiegészítik egymást, így optimalizálják a rendelkezésre álló víz és tápanyag felhasználását, ami a szervesanyag-produkció maximalizálásához vezet. A mélyen és sekélyen gyökerezĘ növények, valamint a kalászosok és pillangósok társítása jelentĘs gazdasági eredménnyel is jár. A társítva vetett növények gyökere a talaj aprómorzsás szerkezetének kialakulását is segíti. A rozsosbükköny vetésforgó ezen túl azért is kedvezĘ, mert mindkét növény viszonylag nagy gyökérzetet fejleszt, a talaj borítottságát így a legkritikusabb téli és tavaszi idĘszakban biztosítják.

18


2.3.

A rizoszféra baktériumainak hatása a növény növekedésére A rizoszféra a talaj azon része, amely a magasabb rendĦ növények gyökereivel közvetlen kölcsönhatásban áll; a talaj legintenzívebb ökológiai élĘhelye, melyben a mikroorganizmusok közvetlenül érintkeznek a növények gyökereivel. A magasabb rendĦ növények gyökérrendszere az aktív anyagcserét folytató talajmikrobióta jól megkülönböztethetĘ, változatos közösségével mĦködik együtt, mellyel biokémiai reakciókat bonyolít le. A rizoszféra mikroorganizmusai speciális kölcsönhatásokat (szimbiózis, antagonizmus, illetve ezek kombinációi) alakíthatnak ki a növényekkel, melyek révén egyszersmind a növényi növekedést is befolyásolják. ARSHAD és FRANKENBERGER (1998) összegzése szerint a lehetséges növény-mikroba kölcsönhatások közül a biológiailag aktív anyagcseretermékek, különösen a rizoszféra mikrobiótája által termelt növényi növekedés-szabályozók játsszák a legfontosabb szerepet, melyek a növénybe kerülve közvetlenül, vagy a rizoszféra-környezet módosítása révén közvetetten befolyásolják annak növekedését (1. ábra). A közvetlen hatást ARSHAD és FRANKENBERGER (1998) megfogalmazásában olyan természetesen elĘforduló, növekedés-szabályozó (Plant Growth Regulator; PGR) szerves vegyületek okozzák, melyek a növények fiziológiai folyamatait a tápanyagok, vagy vitaminok által igényeltnél jóval kisebb koncentrációban is befolyásolják. Az elnevezés a természetes (endogén) és az iparilag elĘállított (szintetikus) növényi hormonokra éppúgy vonatkozhat, mint rizoszféra mikrobiótája által (exogén) termeltekre. A közvetett hatás a PGR anyagokon kívül olyan, a rizoszférában elĘforduló baktériumoknak (Plant Growth Promoting Rhizobacteria; PGPR) tulajdonítható, melyek antagonizmus, vagy antibiózis révén módosítják a gyökér mikrokörnyezetét. A növények rizoszférájában élĘ mikroorganizmusok alapvetĘen meghatározzák a növény fejlĘdésének ütemét: elĘnyösen és hátrányosan is befolyásolhatják azt (SZABÓ 1992). A növények növekedésének serkentése már régi vágya a mezĘgazdászoknak, ennek megfelelĘen régóta folytatnak e téren vizsgálatokat a növény-mikroba kölcsönhatással foglalkozó mikrobiológusok. E munka eredményeképpen több lehetséges mechanizmus szerepét feltételezik, illetve bizonyították napjainkig. A jelentĘsebb mechanizmusok SCHIPPERS et al. (1985) szerint a következĘk: 1. a tápanyag-ellátottság javítása (nitrogénkötés, tápanyagfeltárás vagy a tápanyagtranszport elĘsegítése révén), 2. védelem a növényi kórokozók és a növekedést gátló mikroorganizmusok ellen (tér- és tápanyag-kompetíció, antibiózis, parazitizmus, a gátló anyagok lebontása, valamint indukált szisztemikus rezisztencia révén), 3. közvetlen növekedés-serkentés útján (növényi hormon hatású anyagok termelésével). A rizoszférában domináns baktériumok közül a diazotróf baktériumok elsĘsorban a levegĘ nitrogénjének megkötése útján képesek elĘsegíteni a nagyobb és gyorsabb növényi biomassza-produkciót, illetve helyettesíteni a környezetet szennyezĘ, így hosszú távon az emberek életminĘségét is veszélyeztetĘ mĦtrágyázást. E baktériumok azonban a növényi növekedést közvetlenül serkentĘ anyagokat is képesek termelni (PGR-hatás): gibberellin és indolecetsav termelését mutatták ki Rhizobium és Azospirillum nemzetségbe tartozó fajoknál. Az elĘbbi génusz fajai közül a R. leguminosarum bv. phaseoli kultúrájából GA1, GA4, GA9 és GA20, az A. lipoferum és A. brasiliense törzseibĘl pedig GA1 és GA3 gibberellineket azonosítottak (RADEMACHER 1994). FULCHIERI et al. (1993) szerint az Azospirillumok által termelt gibberellinek szignifikánsan fokozták a kukorica növekedését axénikus kultúrában, de RADEMACHER (1994) különbözĘ megfontolások alapján kétségbe vonja ennek helytállóságát, mindazonáltal további vizsgálatokat igénylĘ területként jelöli meg e témát.


19

1. ábra A rizoszféra mikroorganizmusai bonyolult rendszerben befolyásolják a növény növekedését (ARSHAD és FRANKENBERGER 1998)

A természetben a lebontó tevékenységet folytató penészgombák részt vesznek a humuszképzésben, és közülük a talajban sokan élnek magasabb rendĦ növények gyökereivel szorosabb vagy lazább kapcsolatban. E folyamatokban leginkább a szaprofita fajok vesznek részt. A penész- és más gombák ezeken túl az emberi termelés egyes ágazataiban is pozitív jelentĘségĦek. A környezet azonban parazitákat vagy kórokozókat is tartalmaz, amelyek kitartóspórák formájában vagy életciklusuk szaprofita fázisában tartják fenn magukat. Ezek a fajok élĘ növényi vagy állati szervezeteket fertĘznek meg, és így bizonyos populációk szabályozó tényezĘi a biocönózisban. Ha ezek a gombák kultúrnövényeket támadnak meg, csökkentik a termelés kihozatalát és minĘségét, tehát hátrányos tényezĘvé válnak az emberi gazdálkodásban. Vannak azonban szaprofita fajok is, amelyek ártalmasan befolyásolják a mezĘgazdasági terményeket, illetve termékeket, vagy az ezekbĘl elĘállított élelmiszereket és így világszerte jelentĘs károkat okoznak. A gombák okozta gazdasági kártételben a legnagyobb szerepük a fakultatív parazita életmódot folytató penészgombáknak van, mivel egyrészt a növényi kultúrák fertĘzése útján elsĘdleges veszteségeket okoznak, másrészt szaprofita életciklusuk során a már megtermelt növényi termékeket károsítva csökkentik azok értékét. Az intenzív mezĘgazdasági termelés következtében a növénybetegségek elleni védekezés az egyik legfontosabb eredményességet befolyásoló tényezĘvé vált, s ennek eszközeként a kémiai védekezés egyre szélesebb körĦvé és intenzívebbé vált az utóbbi

20


évtizedek alatt. Eközben nyilvánvalóvá vált, hogy a fungicideknek az agrobiocönózisra gyakorolt nemkívánatos hatását is vizsgálni kell. Bebizonyosodott, hogy a fungicidek alkalmazásakor a talaj és az epifita mikroorganizmus-közösségek faji összetétele megváltozik - az antagonista mikroorganizmusok száma csökken ill. a káros fajok felszaporodhatnak -, a növénypatogén gombák jelentĘs részénél fungicid-rezisztencia alakul ki, s úgy tĦnik, e kedvezĘtlen jelenség hosszútávon kísérĘje lesz a fungicidek felhasználásának. E problémák mellett az emberi környezet védelmének ügye egyre inkább elĘtérbe kerül úgy a társadalmi, mint a tudományos életben is. Ennek következménye az egyre több országban napirendre kerülĘ integrált növényvédelem (IPM: Integrated Pest Management) kutatása és alkalmazása. Baicu a betegségek elleni integrális védekezést úgy jellemzi, mint rendszert, amely az adott agroökoszisztéma ökológiai törvényszerĦségeire alapozott és egyesíti a védekezés valamennyi elemét: a kémiai, biológiai, agrotechnikai védekezést, valamint az ellenálló növényfajták termesztését (VAJNA 1987). Az integrált növényvédelem rendszerének egyik dinamikusan fejlĘdĘ része a biológiai védekezés. A biológiai védekezés lényegeként a legtöbben a következĘ rövid megfogalmazást javasolták: a biológiai védekezés egy kórokozó inokulum-mennyiségének vagy betegségokozó-képességének a csökkentése, amely egy vagy több élĘ szervezet – kivéve az embert – hatása révén megy végbe (VAJNA 1987). Betegségokozó-képességen a kórokozó növekedését, infekciós képességét, agresszivitását, virulenciáját és egyéb minĘségi jellemzĘit értjük, valamint azon folyamatokat, amelyek meghatározzák az infekciót, a tünetek kifejlĘdését és a reprodukciót a gazdaszervezetben. Az élĘ szervezeten értendĘk a patogén fajon belüli avirulens vagy hipovirulens egyedek vagy populációk, a nagyobb ellenállóságú gazdanövény és a patogén antagonistái (VAJNA 1987). A szerzĘk a természetben spontán lezajlódó folyamatokat és az emberi beavatkozással végbemenĘ tényleges védekezést egyaránt bennfoglaltnak tekintik és ezt az angol biological control kifejezéssel jelölik. A biológiai védekezés kutatásának és alkalmazásának a növények rovar kártevĘinek vonatkozásában jelentĘs múltja van. Már-már úgy tĦnt, hogy a növényvédelemben, ha a biológiai védekezésrĘl esett szó, az azonos a kártevĘk elleni biológiai védekezéssel. Az elmúlt három évtizedben azonban a növénypatogén gombák elleni biológiai védekezés is egyre nagyobb figyelmet kapott a világ számos országában. Az élénkülĘ érdeklĘdésnek és egyre jelentĘsebb kutatási erĘfeszítéseknek köszönhetĘen egyes kórokozók ellen ma már a gyakorlatban is eredményesen védekeznek antagonista mikroorganizmusokkal. A növényi kórokozók elleni biológiai védekezés esetén antagonizmusról akkor beszélhetünk, amikor egy mikroorganizmus faj egy másik, vele együtt növekvĘ, szaporodó faj életfolyamataira káros hatással van. Az antagonizmus formáit tekintve megkülönböztetünk kompetíciót, antibiózist és parazitizmust. Növénypatogén gombák antagonista szervezetei lehetnek mikovírusok, baktériumok, sugárgombák, gombák és amĘbák. Sok szerzĘ szerint az antagonista szervezetek között a baktériumoknak és a sugárgombáknak van a legnagyobb jelentĘségük, viszont a gombákkal kapcsolatos ismeretek szélesebb körĦek (VAJNA 1987). A baktériumok elĘfordulása a talajban és a növények föld feletti részein általános. Ismeretes, hogy számukat (sejtszám) és a térfogategységre vonatkoztatott összes tömegüket tekintve minden más mikroorganizmust felülmúlhatnak a talajban. A biológiai védekezésben játszott szerepük összefügg rendkívül gyors szaporodási képességükkel, valamint azzal, hogy a legkülönbözĘbb tápanyagforrásokat képesek


21

hasznosítani; a hĘmérséklet, valamint az oxigén mennyiségének tekintetében igen tág határok között aktívak. A biológiai védekezés szempontjából különösen egyes Pseudomonas és Bacillus fajok (pl. Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis) szerepe és alkalmazási lehetĘségei ismertek. A baktériumok hatása egyrészt a tápanyagokért folytatott kompetícióban nyilvánul meg, másrészt antibiotikumokat termelnek, amelyek között fungisztatikus és fungicid hatású, növénypatogén gombákra is hatásos vegyületek is ismeretesek (VAJNA 1987). A baktériumok biológiai védekezési célú vizsgálata során eleinte az izolátummal való közvetlen kezelést alkalmazták, de a hatást befolyásoló környezeti és egyéb tényezĘk nehéz, sokszor megvalósíthatatlan szabályozása, optimalizálása miatt e szervezetek által termelt antimikrobiális fermentum-anyagok hatásvizsgálata került elĘtérbe. 2.3.1. Növekedést serkentĘ mikrobiális anyagcseretermékek Hatásuk szerint a növényi növekedést serkentĘ mikroorganizmusok, illetve anyagcseretermékeik alapvetĘen két csoportra oszthatók: PGR (plant growth regulator), azaz a növekedést közvetlenül befolyásoló, illetve PGPR (plant growth promoting rhizobacteria), azaz a növekedést közvetetten elĘsegítĘ baktériumok és anyagcseretermékeik. Ebben a részben a PGPR hatásról esik szó. Antibiotikumok Természetes antibiotikumok – antimikrobiális hatású anyagcseretermékek – termelését a baktériumok között leggyakrabban különbözĘ Bacillus és Pseudomonas fajok esetében figyeltek meg. Az aerob spóraképzĘ baktériumok (fĘleg Bacillus nemzetség) által termelt ismert antibiotikumok száma ma megközelíti a hétszázat. E nemzetség különféle speciesei közül a B. subtilis a legtermelékenyebb. Több mint hetvenféle antibiotikumot írtak le, melyeket ez a species termel. Sok antibiotikumot termel a B. brevis, a B. licheniformis, a B. pumilus, a B. polymyxa, a B. circulans, a B. cereus, a B. laterosporus és más fajok (SZMIRNOV et al. 1986). A Bacillus fajok által termelt antibiotikumokat már széles körben alkalmazzák az orvostudományban, a mezĘgazdaságban, az élelmiszeriparban. Ezek a polimixin, kolisztin, bacitracin, tirotricinkomplexum (lineáris gramicidin és tirocidin), gramicidin-C, szubtilin, edein, butirozin (SZMIRNOV et al. 1986). A Bacillus nemzetség baktériumai által termelt antibiotikumok többsége polipeptid, fĘként Gram-pozitív baktériumokkal szemben hatékony, ugyanakkor néhány kizárólag Gram-negatív baktériumokra hat. A bacillomicin, a mikobacillin és a fungisztatin élesztĘ- és mikroszkopikus gombákkal szemben hatékony. A Bacillus fajok által termelt peptidantibiotikumok általános tulajdonságainak részletes áttekintését szintén SZMIRNOV et al. (1986) adta közre. A Bacillus subtilis különbözĘ törzsei által termelt antibiotikumok A Bacillus fajok antibiotikum termelésével kapcsolatban már az 1940-es években is behatóan foglalkoztak. Azóta mindig több és több új antifungális anyagcseretermék jelenik meg a kutatási közleményekben. A B. subtilis is a régóta vizsgált fajok közé tartozik, ezért legjellemzĘbb antibiotikumai már jól ismertek és a gyakorlatban is alkalmazottak. A következĘ áttekintésben elĘször az ismertebb B. subtilis törzsek által termelt antifungális hatású anyagokat jellemzem, majd táblázatos formában a kevésbé ismert e faj törzsei által termelt növénybetegségeket okozó gombák ellen kipróbált hatóanyagokat mutatom be.

22


Az aspergillus faktor antibiotikum, amelyet Michener választott ki a B. subtilis 6633 törzsbĘl 1949-ben, vízben, etanolban, butanolban oldódó, cellofánon át nem diffundáló vegyület. Alacsony koncentrációban gátolja a Rhizopus nigricans, a Penicillium digitatum, az Aspergillus niger, a Botrytis cinerea növekedését (SZMIRNOV et al. 1986). A rhizoktonia faktort a B. subtilis 6633 törzs tenyészetének vizes oldatából választották ki Michener és munkatársai. Vízben és 70 %-os etanolban oldódik, cellofánon át dializálható. Szelektív antibiotikus, illetve fungicid hatású. Gátolja a Rhizopus nigricans, a Rhizoctonia solani, a Penicillium digitatum, a Sclerotinia fructicola, a Botrytis cinerea növekedését (SZMIRNOV et al. 1986). A bacillomicin antibiotikum-komplexum, melyet Landy és munkatársai választottak ki B. subtilis tenyészetébĘl 1949-ben, majd Tint és Reiss írták le 1951-ben. E polipeptidnek A-, B- és C-frakcióit kapták. A bacillomicin vízben, acetonban oldódik, más szerves oldószerben nem. Cellofánon keresztül nem dializálható, pepszin és tripszin nem inaktiválja. Magas szelektív hatékonyság jellemzi a patogén élesztĘgombákkal és gombákkal szemben. Már 0,025 μg/ml koncentrációban gátolja a Mycrosporum gypseum a Trichophyton rubrum, az Epidermophyton floccosum növekedését (SZMIRNOV et al. 1986). A mikoszubtilint a B. subtilis szubtilin termelĘ törzsei szintetizálják. Walton és Woodruff választotta ki 1949-ben. Polipeptid, amely 70 %-os etanolban és piridinben oldódik, ninhidrin pozitív. Hatékony élesztĘgombák és gombákkal szemben, gátolja a Trichophyton fajok, az Ustilago zeae, a Sclerotinia fructicola növekedését (SZMIRNOV et al. 1986). A mikobacillint a B. subtilis tenyészetébĘl Majumdar és Bose választotta ki és írta le (1958, 1960). 7 pH érték mellett oldódik vízben, acetonban. Széles spektrumú antibiotikum, gátolja az Aspergillus niger és a Candida albicans, valamint növénybetegségeket okozó gombák növekedését is (SZMIRNOV et al. 1986). A fungisztatin antibiotikumot Lewis írta le, amely amfoter polipeptid, metanolban és etanolban oldódik. Antibiotikus hatású néhány humán, állati és fitopatogén gombával szemben. Gátolja a Trichophyton gypseum, az Epidermophyton floccosum és a Monilia albicans növekedését. A fungisztatin toxikus (SZMIRNOV et al. 1986). Az 1. táblázatban a Bacillus subtilis növénypatogén gombák elleni integrált növényvédelemben felhasználható antibiotikumait mutatom be. Pseudomonas sp. baktériumok antimikrobiális anyagai A fluoreszcens Pseudomonas baktériumok képesek különbözĘ, antagonista tulajdonságokkal rendelkezĘ másodlagos anyagcseretermékek bioszintézisére, melyek többnyire nitrogén tartalmú heterociklusos vegyületek. Ezek között vannak fenazin származékok (piocianin és pirrolnitrin típusú vegyületek) és indol származékok (BUDZIKIEWICZ 1993). A többi, antagonista jellegĦ másodlagos anyagcseretermékek általában aminosavak és peptidek, beleértve a vaskelát-képzĘket is, melyek némelyike sziderofor tulajdonságú. Bizonyos Pseudomonas-ok szekunder metabolitjai azonban fitotoxikusak lehetnek (LELLIOTT et al. 1966). A szideroforok és az antagonista anyagcseretermékek kutatása napjainkban nagy jelentĘséggel bír, mivel ezek igen fontos szerepet kaphatnak a növényvédelemben. A sziderofor-termelĘ Pseudomonas-ok közé többek között az alábbi fajok tartoznak: Pseudomonas fluorescens, P. putida, P. aeruginosa, P. chlororaphus, P. aureofaciens, P. syringae, P. fulva, P. corrugata, stb. A P. fluorescens CHA0 törzs legtöbb patogénnel szembeni elsĘdleges antagonista hatása a 2,4-diacetilfloroglucinol, a pioluteorin és a hidrogén-cianid antimikrobiális hatású vegyületeknek tulajdonítható. A CHA0 törzs ezen kívül számos nagy affinitású fémkötĘ sziderofort termel (pioverdin, piochelin és szalicilsav), melyek segítségével a patogénekkel


23

kompetícióban áll és szisztemikusan szerzett gazda rezisztenciával rendelkezik (DUFFY és DÉFAGO 1996). 1. táblázat A Bacillus subtilis mikroszkopikus gombákat gátló antibiotikumai Antibiotikum

Gátolt gombafaj

Antibiotikum 49-4

Penicillium chrysogenum Trichophyton tonsurans Rhizoctonia solani Saccharomyces cerevisiae Ceratocystis fagacearum Cryphonectria parasitica Ophiostoma ulmi Verticillium dahliae

SZMIRNOV et al. (1986)

Bacillopeptin

Fusarium oxysporum (fokhagyma gyökerén)

KAJIMURA et al. (1995)

Fengicin

Aspergillus fumigatus A. terreus Candida albicans Fusarium spp. Trichophyton mentagrophytes T. rubrum

VANITTANAKOM et al. (1986)

Fengimicin Iturin D és E

Rhizoctonia solani Botrytis cinerea Candida albicans Fusarium oxysporum Stemphylium radicinum

LOEFFLER et al. (1986) BESSON és MICHEL (1987)

Oxafun Pilpasztatin A1, B1

Phoma betae Alternaria mali Botrytis cinerea Pyricularia oryzae

BALICKA et al. (1983) YAMADA et al. (1990)

Rhizokticin A

Rhizoctonia solani

KUGLER et al. (1990)

Bacilizin Bacillomicin L Bacillomicin Lc

SzerzĘk

LOEFFLER et al. (1986) BESSON et al. (1984) ESHITA et al. (1995)

Sziderofor vegyületek A sziderofor irodalma századunk elsĘ feléig nyúlik vissza, amikor ARNOW (1937) kolorimetriás módszerrel próbálta meghatározni a 3,4-dihidroxifenilalanin-tirozin keverék összetételét. Számos növény, mely meszes vagy lúgos talajon él erĘs vashiányban szenved. Több publikáció is megjelent, melyek szerint egyes mezĘgazdasági növények gyenge gümĘzöttsége a talaj vashiányával áll összefüggésben, mint azt HEMMANTARANJAN és GARG (1986) francia babbal, O’HARA et al. (1988a,b) spenóttal végzett kísérletei igazolták. MielĘtt megtörténne a hatékony gümĘképzés a gyökérgümĘ-baktériumoknak át kell vészelniük a talajban ezt az átmeneti idĘszakot, megĘrizve a szaporodási- és fertĘzĘképességüket.

24


Többen foglalkoztak pl. a gyökérgümĘ baktériumainak sziderofor-termelésével Krómazurol S (CAS) reagenst (SCHWYN és NEILANDS 1987) használva csak az esetleges negatív, vagy pozitív reakcióra utalva. (GUERINOT 1991) REIGH és O’CONNEL (1993), megvizsgálva 26 Sinorhizobium meliloti törzset, három Rhizobium leguminosarum bv. viciae törzset, 209 másik izolátumot – melyek magas pH-jú talajon termesztett lóherérĘl származtak –, valamint négy Rhizobium loti törzset megállapította, hogy közülük 102, azaz (50%) CAS-pozitív volt. Ez azt jelenti, hogy a törzsek közül 5 S. meliloti, 2 R. leguminosarum bv. viciae, valamint a 209 izolátum közül 95 CAS +-nak bizonyult. FABIANO et al. (1994) Uruguay-i talajokból származó Rhizobium- és Bradyrhizobium-törzseket vizsgálva beszámol arról, hogy 78%-uk CAS+. CARSON et al. (1992) szerint, nem csak a sziderofor-termelés meglétére vagy hiányára kell figyelnünk, mivel a gyökérgümĘ-baktériumok számos törzse rendelkezik e képességgel, hanem azt is szükséges tudnunk, hogy vajon az egyes fajok katekol-, vagy hidroxamát-típusú szideroforokat termelnek. BERRAHO et al. (1997) 35 vizsgált Rhizobium cicer törzs esetében csak kettĘnél tudtak kimutatni sziderofor-termelést, mely nem hidroxamáttípusúnak bizonyult. Vaskompetíció szideroforok segítségével A vas központi szerepet játszik az obligát és fakultatív aerob mikroszervezetek anyagcseréjében. Ennek ellenére nagyon kis mennyiségben van jelen a környezetben. Kis hozzáférhetĘsége a talajban fĘként a ferri-oxi-hidroxi polimerek alacsony oldhatóságának következménye. A jól oxidált talajokban a vas oldhatósága a Fe(OH)3 ellenĘrzése alatt áll (LINDSAY és SCHWAB 1982). E vegyületek oldhatósági együtthatója nagyon alacsony (Kold=10-38), eredményeképpen pH 7-nél a Fe3+ koncentráció 10-17 M, holott a minimális koncentráció, mely még lehetĘvé teszi a normális növekedést 10-6 M (NEILANDS et al. 1987). Ez okból kifolyólag a vas az egyik döntĘ faktor, mely meghatározza az adott élĘhely mikrobaközösségét. Az ilyen közegekben leginkább azok a fajok tudnak létezni, ill. „érvényesülni”, melyeknek jól kiépített és nagy hatásfokkal mĦködĘ vas-szerzési mechanizmusuk van. A mikroorganizmusoknak három alapvetĘ módszere van az oldhatatlan Fe(III) oxidok oldatba vitelére: protonáció, redukció és kelátképzés. A protonáció az egyensúlyi állandó eltolásával a Fe(OH)3 komplexek disszociációjának növekedését eredményezi (a pH egy egységnyi csökkentése a vas(III) ionok oldhatóságát az 1000-szeresére növeli). A vas(III) vas(II)-vé alakítása egy adott pH-n a kétértékĦ vas lényegesen nagyobb oldhatóságát eredményezi. A kelátképzésen valójában a szideroforok termelését értjük, melyeket fĘleg mikroorganizmusok végeznek, és az egyik legáltalánosabb stratégia a tápanyagokért folytatott versenyben. Amennyiben a vas hozzáférhetĘsége a mikroorganizmusok számára a környezetben kis mértékĦ, sokan közülük, a Fe3+-hoz nagy affinitással rendelkezĘ, kis molekulatömegĦ metabolitokat, szideroforokat és részben külsĘ membránproteineket (szerepük van a Fesziderofor komplex felismerésében és a vas felvételében) termelnek (WEGER et al. 1986), melyek kioldják a vasat az ásványokból és a szerves vegyületekbĘl (pl. transzferrin, laktoferrin). Ezek olyan kétértékĦ ligandum molekulák, melyek fĘként az oxigénatomon keresztül kapcsolatot teremtenek a vas(III) ion hat oktaéderes irányú kötésével és kelátok formájában elvonják a Fe3+ ionokat a környezetbĘl a mikrobiális sejtbe juttatva azt (LEONG 1986, NEILANDS 1981a,b). A vas transzportját a baktérium citoszoljába egy specifikus membránreceptor, valamint egy szállítórendszer közvetíti, mely felismeri a vas-sziderofor komplexeket (2. ábra). Ilyenformán a mikroorganizmusok sziderofor-termelése gyengén savas, semleges vagy lúgos kémhatású talajokban fontos és általános jelenség. A mikrobiális sziderofor-termelés jelenlétét különbözĘ talajok esetében valóban ki is mutatták (AKERS 1981, POWELL et al. 1980).


25

2. ábra Baktériumok vasfelvétele: a vas-sziderofor komplexek szállítása a baktériumsejt membránján keresztül – sematikus rajz (http://www.rndsystems.com nyomán)

A szideroforoknak két leggyakoribb kétértékĦ ligandumos rendszere a hidroxamát és katekol rendszerek (NEILANDS 1981a,b és 1984, WEGER et al. 1986). A Fe3+-hoz való affinitásukat a kötési (stabilitási) állandóval fejezhetjük ki (lg 10 KFe, pH 7) (LINDSAY 1979). Ennek az értéke nagy eltéréseket mutat a különbözĘ szideroforok között, ezért a vasért való küzdelemben fontos tényezĘ. A fluoreszcens Pseudomonasok két rokon sziderofort termelnek: pszeudobaktint és pioverdint, melyek ultraibolya fényben fluoreszkálnak. Néhány fluoreszkáló Pseudomonas törzs piochelint és szalicilsavat is termel, melyek szintén szideroforként viselkednek. Sok Pseudomonas sp. törzs szideroforját megtisztították és kémiailag jellemezték: pl. a Pseudomonas putida B10 törzs által termelt pszeudobaktin – lineáris hexapeptid, ami egy N-hidroxi-ornitinbĘl, egy hidroxi-aszpartátsav hidroxi-sav származékából és fluoreszcens odihidroxi aromás csoportból épül fel (TEINTZE et al. 1981) –, pioverdin – P. aeruginosa (WENDENBAUM et al. 1983) –, pszeudobaktin 7SR1 (YANG és LEONG 1984) és A214 (BUYER et al. 1986), melyeket kórokozó Pseudomonas törzsek termelnek, illetĘleg a pszeudobaktin 358, melyet a P. putida WCS358-as törzse termel. E különbözĘ szideroforok kémiai szerkezete hasonló, fluoreszcens kromofort tartalmaznak, mely egy kinolin származék és rövid peptid lánchoz kötĘdik. Ezekben a molekulákban a hidroxamát és aminohidroxi sav csoportok a dihidroxi aromás csoporttal együtt kinolin származékból erednek, és három Fe3+ kelát csoportot képeznek (3. ábra). A pszeudobaktinok szerkezete közötti különbségek a peptid láncok eltérĘ felépítésébĘl és hosszúságából erednek. A pioverdinnek és a pszeudobaktinnak 400 nm körül egy nagy és a hosszabb hullámhosszokon két szélesebb abszorpciós tartománya van, ami nem változik pH 3–10 között (PHILSON és LLINAS 1982a,b), tehát hasonló a két vegyület – mindkettĘ tartalmaz két hidroxamát és egy katekol típusú ligandumot, de a KFe-értékük eltérĘ. Sok fluoreszcens Pseudomonas törzs képes gátolni más mikroorganizmusok növekedését kis vastartalmú táptalajon (BUYER és LEONG 1986, GEELS és SCHIPPERS

26


1983a, KLOEPPER et al. 1980b) sziderofor közvetítette ferri-vas kompetíció által. E törzsek tisztított szideroforjai hasonló antagonista hatást váltanak ki ugyanezen a táptalajon (BUYER és LEONG 1986, KLOEPPER et al. 1980b).

3. ábra Mikroorganizmusok által termelt reprezentatív szideroforok – köztük a pszeudobaktin – szerkezete (http://www.nd.edu/~mmiller1/page2.html nyomán). A Pseudomonas sp. fajokra jellemzĘ ferrikrom és a pszeudobaktin (pyoverdinek) egyaránt hidroxamát típusú.

A fluoreszcens Pseudomonas-ok sziderofor termelésének jelentĘségét a növény növekedésének a serkentésében elsĘként KLOEPPER et al. (1980b) hangsúlyozták. Míg azonban a vad típusú Pseudomonas-ok serkentik a növény növekedését, az UV vagy kemikáliák által indukált mutánsok elvesztették e gátló képességüket kis vastartalmú táptalajon, és nem mutattak ilyen hatást. Megállapították, hogy a patogén rizoszféramikroorganizmusok és antagonista Pseudomonasok közötti, a sziderofor közvetítette kompetíció felelĘs a vizsgált növények növekedés-serkentéséért. A késĘbbiekben mások is igazolták a fluoreszcens Pseudomonas-ok sziderofor-termelésének a rizoszféra különbözĘ mikroorganizmusai gátlásában betöltött fontos szerepét (KLOEPPER et al. 1980a, GEELS és SCHIPPERS 1983a,b, WELLER és COOK 1983, SNEH et al. 1984, WONG és BAKER 1984, ELAD és BAKER 1985a,b, SCHIPPERS 1985, BAKER et al. 1986, BAKKER et al. 1986 és 1987, SCHER 1986, SCHIPPERS et al. 1987, BECKER és COOK 1988, LOPER1988). 2.3.2.

Növekedést szabályozó anyagcseretermékek A növekedésszabályozók termelésének a növényi növekedés serkentésében betöltött szerepe – illetve annak jelentĘsége – hosszú ideig vitatott kérdés volt. LOPER és SCHROTH (1986) például megállapította, hogy a Pseudomonas-ok által termelt indolecetsav gátolja cukorrépa csíranövények gyökérkezdeményeinek meghosszabbodását. A növekedésszabályozó vegyületek gátló és serkentĘ hatását LYNCH (1976) mutatta be


27

széleskörĦ összehasonlításban. E dolgozatban csak a legáltalánosabb, közvetlenül a gyökér (illetve hipokotil) és a szár (epikotil) fejlĘdésére ható auxint, valamint gibberellint említem. Az utóbbi években növekvĘ figyelemre tart számot a növények növekedésének a rizoszférában élĘ mikrobák által termelt hormonhatású vegyületekkel történĘ irányított serkentése. A növényi hormonok egy sor létfontosságú reakciót szabályoznak; a baktériumsejt gyökérfelszínhez történĘ adhéziójával kezdve a növény növekedésére gyakorolt komplex hatásuk kifejezĘdésig. Auxin A baktériumok fitohormon (részben auxin) szintézisével és kiválasztásával sok tanulmány foglalkozik. EbbĘl a szempontból leginkább vizsgált törzsek a Rhizobium, Azotobacter és Azospirillum reprezentánsai. Mindazonáltal viszonylag kevés tanulmány szentel figyelmet a Pseudomonas génuszba tartozó rizobaktériumok eme tulajdonságai vizsgálatának. Az irodalmat tanulmányozva megállapíthatjuk, hogy a növényi hormonok termelése faj- és törzsspecifikus tulajdonság, mely nagymértékben változik a környezet és a tápoldat feltételeitĘl függĘen (OLYUNINA és SHABAEV 1996). A biológiai védekezésben felhasznált fluoreszkáló Pseudomonas-ok számos törzse képes indolecetsavat (auxin) termelni. Az auxin nem vesz részt közvetlenül az antagonista hatások megnyilvánulásában, de a gyökerek hosszanti növekedésének és a gyökérszĘrök növekedésének fokozásával segíti a növények fejlĘdését (LOPER és SCHROTH 1986). RASKIN (1992) a szalicilsavat – ami a piochelin prekurzora – szintén a növényi hormonokhoz sorolja. Antagonista hatásán kívül a növények szerzett rezisztencia rendszerének egyik kulcsvegyületeként is nagy szerepe lehet (GAFFNEY et al. 1993, ARNDT et al. 1998). Gibberellin A gibberellinek (gibberellinsav, GS) tetraciklusos diterpénsavak, melyeknek egy enthelyzetĦ gibberellán gyĦrĦrendszerük van. A legismertebb a GS3, amely egy gomba – a Gibberella fujikuroi – terméke. A növényekben elĘforduló legaktívabb gibberellin a GS1, amely a hajtás, illetve tönk megnyúlásának egyik elsĘdleges felelĘse (ARSHAD és FRANKENBERGER 1998). Sok gibberellin viszont a hajszálgyökerek fejlĘdését is stimulálja. Napjainkig több mint 89 gibberellin ismert, melyek GS1-tĘl GS89-ig számozottak, felfedezésük sorrendjében. A növényekben a gibberellin bioszintézisének a mevalonsav (MVS) a prekurzora. A legtöbb gibberellin ismereteink szerint fiziológiailag inaktív, mindazonáltal az aktív gibberellinek prekurzoraként így is fontos szerepük van.

2.3.3. NitrogénkötĘ baktériumok A növények gyökereivel együttmĦködĘ nitrogénkötĘ (diazotróf) baktériumokat két nagy csoportra oszthatjuk: szimbionta, illetve szabadon élĘ baktériumok. Az elsĘ csoportba a fajok tartoznak, melyek fĘként a pillangós virágú növények gyökerén gümĘt képeznek. A gümĘ egy különleges és nagymértékben szervezett rendszer, mely a mikroszimbionta (pl. Rhizobium) és a növény (pl. pillangós) kölcsönhatásának eredményeként fejlĘdik ki. A kialakuló szimbiózis nélkülözhetetlen növény N-ellátása szempontjából: a baktérium által megkötött légköri N mennyisége a növény N-igényének 90%-át is kiteheti (DREVON 1983).

28


Szimbionta nitrogénkötĘ baktériumok A szimbionta diazotróf baktériumok a Rhizobiaceae család tagjai, jellemzĘ képviselĘjük a Rhizobium génusz (domén: Bacteria, BXII. törzs: Proteobacteria, I. osztály: Alphaproteobacteria, VI. rend: Rhizobiales, I. család: Rhizobiaceae; GARRITY et al. 2004). A Rhizobium-ok taxonómiájának irodalma a XIX. század 80-as éveibe nyúlik vissza, amikor is elĘször figyelték meg a Rhizobium–pillangós együttélést. ElsĘként Beijerinck állította elĘ e baktériumok tiszta kultúráját és Bacillus radicicola-nak nevezte el Ęket hosszú pálcikaformájuk alapján (FEDOROV 1952). KésĘbb Bacterium radiciola-nak nevezték el, és 1889-ben ezt az elnevezést Rhizobium leguminosarum-ra változtatták (HORVÁTH 1970). Az 1984-es Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology genetikai vizsgálati módszerre támaszkodva, a DNS G+C (guanin + citozin) -tartalma alapján a Rhizobiaceae családot 4 génuszra osztja föl: Rhizobium Bradyrhizobium Agrobacterium, Phyllobacterium. ELKAN és BUNN (1994) rendszere a Rhizobiaceae családot négy génuszra osztja: Bradyrhizobium Rhizobium Azorhizobium Sinorhizobium. A Rhizobiaceae család filogenezisének tisztázásához a riboszomális RNS génszekvenciáinak analízise révén jutottak (MARTÌNEZ 1994). Eszerint a Rhizobium és Bradyrhizobium génuszok inkább mutatnak rokonságot más szimbionta baktériumokkal – pl. Agrobacterium –, mint egymással. A Rhizobium és Agrobacterium fajok viszont kevertek, szimbionta vagy patogén viselkedésük a plazmid-összetételben található különbségekkel magyarázható. Már több mint 50 éves az elsĘ fölvetés, hogy a Rhizobium fajok PGR anyagokat (pl. auxin) termelnek, melyek a N-kötĘ gümĘk kifejlĘdését szabályozzák. KésĘbbi munkák során már sikerült e fajok PGR szintézisét in vitro jellemezni, de a mikrobiális eredetĦ PGR anyagok gümĘképzésben játszott szerepe egyelĘre vitatott. HIRSCH és FANG (1994) kritikai áttekintésükben a PGR anyagok gümĘbeli jelenléte és a hormontranszportot gátló vegyületek szerepe alapján egy új, a PGR anyagok gümĘképzésben betöltött szerepét összegzĘ szabályozó-sémát javasolnak (4. ábra). A biológiai nitrogénkötés (biological nitrogen fixation; BNF) kutatása és felhasználása a 2000-ben elhunyt brazil-német Johanna Döbereiner és kutatócsoportja vezetésével igazi mezĘgazdasági forradalmat jelentett a trópusokon. A kifejlesztett oltóanyagok és szójababfajták használatával Brazília és Argentína évi 150 millió t N-nel egyenértékĦ mĦtrágyát, ezzel együtt 3,2 milliárd US$-t takarít meg, a bab esetében ez 375 millió US$. BNF-re alapozottan termelt cukornádból nagyrészt etanolt gyártanak, ennek eredményeképpen Brazíliában négymillió gépkocsi közlekedik 80%-os etanollal, az országban eladott Diesel-olaj átlagosan 20%-nyi etanolt tartalmaz (DÖBEREINER 1997). Mára a BNF kihasználására a legkülönfélébb megoldások léteznek, például nitrogénkötĘ baktériumokat alkalmasnak találtak bioremediációs felhasználásra, a limitáló N-forrás növelésén keresztül (SUOMINEN et al. 2000). A BNF meglétének bizonyításakor problémát okoz, hogy nehéz kötött nitrogénformák jelenlétét, illetve felvételét kizárni. A BNF vizsgálatának kezdeti bizonytalanságai (Kjehldal-féle össz-nitrogéntartalom követése), a körülményes izotópos N-mérlegszámítás (nem radioaktív 15N beépülésének tömegspektrometriás analízise) mellett a ’60-as években megjelent az acetilén-redukciós aktivitás (ARA) mérése.1

1

DILWORTH (1966) illetve SCHÖLLHORN és BURRIS (1966) egymástól függetlenül felfedezték, hogy az acetilén gátolja a nitrogénkötést. Dilworth leírta, hogy a kompetitív gátlás terméke az etilén, amely kimutatásával egyben az elsĘ ARA mérést is elvégezte.


29

4. ábra A növényi növekedést szabályozó anyagok lehetséges szerepe a gümĘképzésben. A citokinin a gyökrek csúcsi részében képzĘdik. Az auxin a szár csúcsi részében képzĘdik és bazipetális transzporttal jut lefelé a szárban. A Rhizobium-ok nod faktrot termelnek, mely a hajszálgyökerek deformációját és sejtosztódást okoz, így kialakul a gümĘkezdemény. Bár auxint, citokinint és gibberellint is termelnek, nem tisztázott, hogy a Rhizobium-ok e termékei szükségesek-e a gümĘkezdemény kialakulásához. Az exogén citokinin megindíthatja a gümĘképzést, a gümĘk pedig nagy mennyiségĦ citokinint és auxint tartalmaznak. Bár az auxin valamilyen módon közrejátszik a gümĘképzésben, szerepe még nem tisztázott. Az etilén és a szár eredetĦ önszabályozó anyagok viszont gátolják a gümĘ kifejlĘdését. A szár eredetĦ faktor stimulánsa a gyökérben termelĘdik és onnan a szárba jut. A termés (hüvely) növekedése közben a gümĘképzés fokozatosan leáll.

Ez a kvantitatív, olcsó és gyors teszt alkalmas talajok és növények terepen, illetve laboratóriumban történĘ vizsgálatára, valamint mikroorganizmusoknak nitrogenázaktivitásának megfelelĘ táptalajokon történĘ indirekt kimutatására. Hátránya, hogy nem következtethetünk ARA alapján a valós BNF mértékére, mivel az 15N-beépülés mérésével összevetve számolható faktor idĘben nem állandó. Ennek oka, hogy az acetilén leszorítja az enzimrĘl a nitrogént, és a mérés közben nitrogén-hiány alakul ki, amire a sejt a nitrogenáz szintézisének növekedésével válaszol, a természetestĘl eltérĘ nitrogenáz-aktivitást eredményezve. Az ARA másik hátránya, hogy a N beépülésérĘl, a baktériumtól a növénybe irányuló mozgásáról nem közöl információt, de ez utóbbi a nitrogénkötĘ képesség önmagában történĘ kimutatása során nem követelmény. Ilyen információhoz az 15N-alapú nitrogénmérlegek számításával juthatunk, melynek alapján megállapították, hogy brazil cukornád-fajták nitrogénigényük 60%-át fedezhetik BNF segítségével, ami évi 150 kg/ha Nt jelent (BODDEY et al. 1995).

30


Azt még így sem lehet eldönteni, hogy a növény-baktérium kapcsolt asszociatív vagy szimbiotikus jellegĦ. A szimbiotikus kapcsolat kritériuma ugyanis az, hogy a kötött nitrogénnek a baktérium felĘl a növénybe irányuló, biológiailag mindkét fél által szabályozott, közvetlen átadását kell bizonyítani. Ennek hiányában, asszociatív kapcsolat esetében a növény elhalt baktériumsejtek felszabaduló N-vegyületeit veszi fel. A pillangósokkal szemben fĦfélék (cukornád, rizs, stb.) esetében eddig nem sikerült kétséget kizáróan bizonyítani szimbiotikus nitrogénkötés jelenségét, jóllehet a rizs gyökerén kimutattak BNF-t mutató speciális képleteket, gümĘket is. Amíg nem bizonyított a direkt nitrogén-transzfer jelenléte, addig a füvek endofita baktériumaira úgy kell tekintenünk, mint amelyek a talaj–rhizoszféra mikrobiótának a gyökérsejtek közötti terek védett ökológiai fülkéinek (niche) kihasználására evolválódott, a növényi szövetekbe befurakodott tagjai (JAMES 2000). Szimbionta nitrogénkötĘ baktériumok vizsgálata az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetében A különbözĘ pillangós növények – csillagfürt, bükköny, borsó, lóbab, lóhere, lucerna, szója – szimbiontáinak kutatása a múlt század hetvenes és nyolcvanas éveiben teljesedett ki az intézetben. Külön témavezetĘk vizsgálták pl. hazánk jellemzĘ talajtípusaiból izolált Rhizobium törzsek genetikáját, növényoltás során kifejtett hatékonyságát, környezeti tényezĘkkel szembeni ellenálló-képességét, és munkálkodtak a Rhizobium-oltás gyakorlati elterjesztésén (MANNINGER és KėVÁRI 1983, KÖVES-PÉCHY és SZENDE 1984, KÖVES-PÉCHY et al. 1987). Emellett oltóanyag-termeléssel foglalkozó részleg is mĦködött. Korábban KECSKÉS (1976) értékelte különbözĘ Rhizbium reprezentánsok xenogén anyagokkal és antibiotikumokkal szembeni ellenálló-képességét; megállapítva, hogy a tolerancia, illetve az adaptációs képesség fontos szempont lehet az oltótörzsek laboratóriumi szelekciója során. GULYÁS és ABDALLA (1987) arról számolt be, hogy a 40 mg kg-1 dózist meghaladó NPK-trágyázás csökkentette a talaj (meszes homoktalaj, ėrbottyán és mészlepedékes csernozjom, Nagyhörcsök) nitrogéntartalmát Rhizobium meliloti törzsekkel oltott (R-MIX) és nem oltott lucerna kultúrában, kisparcellás szántóföldi kísérletben. E negatív hatás okaként a N2-kötés elmaradását jelölték meg, minthogy nagyobb mĦtrágyaadagok mellett a talajok természetes szaprofitái gátolták Rhizobium törzsek szaporodását. KülönbözĘ talajokban jelenlévĘ természetes, és oltással bevitt R.. meliloti klónok közötti versengésrĘl tudósított SZENDE (1987 és 1990) is, megállapítva, hogy az inokulum mennyisége és hatása gyorsan csökkent tenyészedényes kísérletben. Az oltás hatékonysága tehát az oltással talajba juttatott baktériumok mennyiségén kívül azok (genetikailag meghatározott) kompetíciós képességétĘl is függött, melyet a talaj- és növényoltás során célszerĦ figyelembe venni. Az intézetben kifejlesztett BAKTOLEG inokulum borsó, lóbab és szója terméseredményeire gyakorolt hatásáról SZEGI et al. (1990) írt összefoglalót. Eszerint a magoltás szignifikánsan növelte a növények terméshozamát, melynek révén a termelési költségek jelentĘsen csökkenthetĘk. KÖVES-PÉCHY et al. (1990) Magyarország tizenhat tájegységén, különbözĘ talajtípusokban honos, valamint R. leguminosarum és R. meliloti, valamint Bradyrhizobium japonicum törzsek (BAKTOLEG) terméseredményre gyakorolt hatását összegezte. Az oltótörzsek alkalmazása mind mĦtrágyázott, mind anélküli talajban szignifikánsan növelte a terméseredményeket, a legnagyobb hozamot viszont mĦtrágya-kiegészítéssel kombinált magoltással érték el, meszes réti talajban.


31

A szabadon élĘ nitrogénkötĘ baktériumok jelentĘsége Biológiai nitrogénkötésre kizárólag prokarióták képesek. A nitrogénkötĘ baktériumok elsĘ leírásai Martinus Willem Beijerinck („Bacillus radicicola” gyökérgümĘbĘl 1887, szabadon élĘ „Azotobacter chroococcum” 1901) és Sergei Winogradsky (anaerob „Clostridium pastorianum” 1895) nevéhez fĦzĘdnek (BEIJERINCK 1901, VAN ITERSON et al. 1983, DÖBEREINER 1997). Az oligotróf, illetve szezonálisan oligotróf körülmények, a megfelelĘ vízellátás, valamint az elárasztás hatására keletkezett mikromiliĘ-változatosság kedveznek a biológiai nitrogénkötésnek, illetve a diazotróf és oligonitrofil szervezetek elĘfordulásának (WATANABE és FURUSAKA 1981). Eddig a biológiai nitrogénkötés intenzív vizsgálata a pangóvizes területek közül a rizsföldekre összpontosított. Itt mind szabadon élĘ, mind a rizs és kísérĘ növényei gyökerén élĘ baktériumokat is kimutattak. A Fülöp-szigeteken mĦködĘ International Rice Research Institute egyik fĘ kutatási területe a rizs olcsóbb nitrogénellátásának megoldása. Az intézet (ROGER és LADHA 1992) vizsgálatai szerint a rizs rizoszférájának baktériumai évi 1-7 kg N/ha, a rizsföldre kihordott szalmán megtelepedĘ baktériumok 2-4 kg N/t szalma, a cianobaktériumok 0-80kg N/ha, az Azolla vízipáfrány szimbiontái 20-150 kg N/ha, míg a zöldtrágyaként kihordott pillangósok zöldtömege 20-260 kg N/ha mennyiséggel járulhatnak hozzá a rizs nitrogénellátásához. A rizs rizoszférájából kimutatott diazotróf fajok a következĘk: Azorhizobium caulinodans (GOPALASWAMY et al. 2000), Enterobacter cloacae (MEHNAZ et al. 2001), Enterobacter cloacae és Klebsiella planticola (LADHA et al. 1983), Beggiatoa (PITTS et al. 1972), Xanthobacter (REDING et al. 1991), Klebsiella pneumoniae (WATANABE és BARRAQUIO 1979), Azospirillum irakense (KHAMMAS et al. 1989). VASYUK et al. (1990) rizs, búza és fenyércirok rizoplánjából és hisztoszférájából izoláltak szabadon élĘ diazotróf baktériumokat, melyek az Azospirillum, Aquaspirillum, Rhodospirillum, Arthrobacter, Flavobacterium, Bacillus és Mycobacterium génuszok képviselĘi voltak, N2-kötĘ aktivitásukat ARA vizsgálattal határozták meg. Üvegházi kísérletben ellenĘrizték a törzsreprezentánsok rekolonizációs, illetve diazotróf képességét (15N nyomon követésével). A vetést követĘ hetekben a légkörbĘl megkötött N2 jelentĘs mennyiségben halmozódott fel a növények által átszĘtt talajban, ahol az idĘ haladtával az egyes oltótörzsek egyre jobban elszaporodtak a gyökéren. Szabadföldi tartamkísérletek is igazolták az asszociatív diazotrófok kedvezĘ hatását (fenyércirok, árpa, búza, zab és burgonya növényekkel), valamint rámutattak az egyes fajreprezentánsok gazdanövényspecifikusságára. Részben a növényi zöldtömeg hasznosítása, részben a rizzsel párosítható esetleges oltóanyag-elĘállítás miatt vontak vizsgálatba néhány, nagy produkciójú sós mocsarakban állományalkotó pázsitfĦféle (Poaceae) növényt, mint a Leptochloa fusca (L.) Kunt – „kallar grass”, REINHOLD et al. (1987) –, Spartina alternifolia, Juncus roemerianus (BAGWELL és LOVELL 2000). ElĘbbi növényt ajánlják sós mocsaraknak rizsfölddé alakításának elĘkészítésére. A gyökerérĘl kimutatott nitrogénkötĘk között megtalálható a Zoogloea ramigera (BILAL és MALIK 1987), egy Klebsiella pneumoniae-hoz hasonló faj (QURESHI et al. 1988), valamint néhány korábban ismeretlen faj: az Azospirillum halopraeferens és az Azoarcus communis és indigens (REINHOLD et al. 1987). STOLTZFUS et al. (1997) rizsgyökérbĘl izolált in planta (a növényben aktív) nitrogénfixálónak feltételezett baktériumokat (jelentĘs részük nifD és ARA pozitív volt). Az izolált baktériumokat steril rizscsírákra oltották, a kapott gnotobiotikus palánták gyökerébĘl pedig sikerült a törzsek egy részét újraizolálni. A legnagyobb csíraszámmal újraizolálható törzseket erĘs kolonizációs készségĦ törzseknek tekintették. Szabadon élĘ diazotróf baktériumokat bioremediáció céljára is fel lehet használni. VÖRÖS és SZEGI (1990) a visontai külszíni fejtésĦ lignitbánya meddĘhányóinak rekultivációja során sikerrel alkalmazott Azotobacter chroococcum törzset repce

32


zöldtömegének fokozására homok-, agyag- és andezittufa talajban, tartamkísérletben. A legjobb eredményt PK-mĦtrágya hozzáadásával érték el, s a talajokba vitt oltótörzs is megfelelĘen elszaporodott a kísérlet 13 éve során. Baktériumok és növényi gyökerek kölcsönhatása A növényi baktériumokkal létrejövĘ kapcsolatának kutatása százéves múltra tekinthet vissza (HILTNER 1904a,b). A tágabb értelemben használt rizoszféra minden gyökérhez kapcsolódó mikrobiális élĘhely megjelölésére szolgál. A kifejezés értelmét szĦkítve és új terminusokat bevezetve LYNCH (1990) a baktériumok három gyökérhez kapcsolt habitattípusát különbözteti meg: 1) Rizoszféra (külsĘ rizoszféra) a gyökérfelület körüli talajréteg, ahol a gyökér hatásai még észrevehetĘ mértékben jelentkeznek. 2) Rizoplán (külsĘ rizoplán): a gyökér közvetlen felülete, a gyökérsejtek és az itt élĘ baktériumok által kiválasztott mucigél rétege, a (külsĘ) rizoszféra és a hisztoszféra kapcsolódási zónája. 3) Hisztoszféra (belsĘ rizoplán, endorizoszféra): a gyökér belsĘ, szöveti tere (5. ábra). E három habitat-típus baktériumai (a rizobaktériumok) különbözĘ elĘnyöket élveznek a gyökereken. Amellett, hogy maga a felülethez való kötĘdés védelmet nyújt az élĘhelyrĘl való elsodródás ellen, a mikrobák a gyökértĘl szén- és energiaforrást (esetleg nitrogént és vitaminokat) nyerhetnek. A gyökér felszínét kb. 1-10mm vastag extracelluláris nyálkaréteg, ún. mucigél borítja, melyrĘl – bár kémiai összetétele variábilis és kevéssé ismert – elmondható, hogy fĘleg vegyes, savas karakterĦ oligo- és poliszacharidok, fenolvegyületek, glikoproteinek alkotják. A növény a nettó fotoszintetikusan megkötött szén 10-40%-át juttathatja a gyökérkörnyezetbe a mucigél képzésére: a jelenség rizodepozíció néven is ismert. A mucigélen keresztül megy végbe a talaj és a gyökerek közti tápanyag-diffúzió, védi a gyökereket a kiszáradástól és feltehetĘen a mikrobákkal szemben is védelmet nyújt. A felsorolt vegyületek tápanyagforrást jelentenek sok mikroorganizmus számára, melyek ezért a mucigélt kolonizálják, de megkezdhetik az élĘ vagy már elhalt gyökérsejtek lebontását is. Anoxiás közegben a már említett aerenchymatikus oxigén-transzport elektronakceptort szolgáltatva tulajdonképpen szintén energiaforrással látja el a mikrobákat. Mindezen hatások miatt a gyökér környékén a csíraszám szinte mindig magasabb, mint a környezĘ talajban vagy egyéb közegben – ezt nevezzük (pozitív) rizoszféra-hatásnak. Egyes mikrobák (pl. az anaerobok) számára a gyökér kémiai környezetként gátló hatású, ezek csíraszáma az aktív gyökér felülete felé csökken (negatív rizoszféra-hatás). Az említett kapcsolatok a növény szempontjából nemcsak közömbösek (kommenzalizmus, amenzalizmus) és károsak (parazitizmus) lehetnek, hanem hasznosak is (mutualizmus). Így a közismert pillangós-gyökérgümĘk nitrogénkötĘi mellett e régiók más baktériumainak is egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak, egyre nagyobb hányadukról mutatják ki (LALANDE et al. 1989, O'NEILL et al. 1992, SHISHIDO et al. 1995) hogy PGPR, azaz "növényi növekedést serkentĘ hatású" (KLOEPPER et al. 1980a). Újabb és újabb törzsek nitrogénkötĘ képességére derül fény az acetilén-redukciós teszt segítségével (MAVINGUI et al. 1992), és a már részletesen tárgyalt detoxifikáción túl még hosszan folytathatnánk a kedvezĘ bakteriális hatások sorát. A gyökérnél koncentrálódó mikrobák egymással is kölcsönhatásban állnak. Kialakult rétegük (biofilm) folyadékáramlási gátat képez, megakadályozva az extracelluláris enzimek és tápanyagok távozását. Metabolizmusuk összekapcsolódásával pedig a közösségi anyagcsere összetett hálózatait hozhatják létre, melybe a gyökértĘl "távoli" baktériumok mĦködései is integrálódhatnak.


33

5. ábra A baktériumok behatolása a rizs aerenchymatikus gyökereibe (REINHOLD-HUREK és HUREK [1998] nyomán)

A szabadon élĘ és asszociatív diazotróf baktériumok a gazdanövény, illetve a mikorrhiza fejlĘdésére kifejtett jótékony hatása nem merül ki pl. a csekély tápanyagtartalmú talajok nitrogénellátásának fokozásában. B-vitaminokat, aminosavakat, növényi növekedésszabályozó hormonokat és más biológiailag aktív anyagokat is termelnek (KAMPERT és STRZELCZYK 1984, GARBAYE 1994, STRZELCZYK et al. 1994). Ennek ellenére, talajban, valamint rizoszférában történĘ elĘfordulásuk, közösségeik taxonómiai összetétele az utóbbi idĘkig jórészt felderítetlen maradt (BORMANN et al. 1993, BARKMANN és SCHWINTZER 1998). NitrogénkötĘ Bacillus sp. törzsekrĘl számolt be PACHLEWSKI et al. (1991) és LI et al. (1992), melyeket erdeifenyĘ, illetve Douglas-fenyĘ ektomikorrhizaállományába ágyazottan találtak. Diazotróf baktériumok rizoszférából történĘ izolálása Diazotróf törzsek rizoszférából történĘ izolálásához DÖBEREINER (1988) ad útmutatót. Ez minden esetben dúsító tenyészeteken alapul. A növény megfelelĘ szerveit, szöveteit – felületi sterilizálással, vagy anélkül – steril, nitrogénmentes vagy -hiányos dúsító táptalajba helyezik. A nitrogénkötés – kevés kivételtĘl, mint például az Azotobacter fajok eltekintve – mikroaerofil körülmények között zajlik. Az alacsony oxigén-koncentráció biztosításának legegyszerĦbb módja a félszilárd táptalajok alkalmazása. Ebben a baktériumok könnyen vándorolnak, de az oxigén csak diffúzióval mozoghat, így a felszín alatt mikroaerofil viszonyok alakulnak ki. Növekedés esetén – esetleg további dúsítások után – a feltételezett nitrogénkötĘket izolálják, majd a dúsító táptalajba visszaoltják (DÖBEREINER 1988). Ha tiszta tenyészetben is növekedést mutat, a diazotrófia bizonyítása (és az olignitrofil, nem diazotróf szervezetek kiszĦrése) az ARA alapján, illetve

34


a nitrogenáz enzim valamelyik, leggyakrabban a nifD, nifH génjének PCR-alapú kimutatása révén (gélelektroforézissel; ACHOUAK et al. 1999, STOLTZFUS et al. 1997) lehetséges. Az eddigi eredmények tükrében rizs esetében (általánosíthatunk a növények tágabb körére) diazotrófok izolálásának korlátai a következĘk: a nitrogénhiányos vagy -mentes közegben dúsítással izolált törzsek 90%-a oligonitrofil, nem diazotróf; a tenyésztésbe vont diazotrófok nagy részének karakterizálására, meghatározására nem került sor; sok izolátumot nem tudtak megfelelĘen tenyésztésbe vonni vagy tartani (JAMES 2000). Diazotrófokat jó eséllyel csak nagy számú izolátum körébĘl lehet találni. Emiatt szükség van olyan gyors, olcsó jellemzésre, amellyel az azonos izolátumokat, melyek legtöbbször egymás klónjai, ki tudjuk szĦrni, ezáltal a meghatározás munkaigényét és költségeit csökkenteni lehet. Erre a leggyakrabban alkalmazott ujjlenyomat-vizsgálat a Nalauril-szulfát fehérje poliakrilamid-gélelektroforézis (sodium-dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE), a bakteriális zsírsavak gázkromatográfiás analízise, illetve valamelyik molekuláris ujjlenyomat-vizsgálat. E teszteknél fontos követelmény az univerzalitás (azaz minden potenciális baktériumra alkalmazható legyen); lehetĘleg robusztus, információgazdag, gyors, olcsó, és megfelelĘ feloldású (azaz elkülönítse a faji szint alatti jelentĘsebb különbségeket) legyen Az erre alkalmas molekuláris biológiai módszerek a következĘk: PFGE, RFLP, rep-PCR, RAPD, CFLP, AFLP és a DNSszekvenálás. Az egyes törzseket meghatározásánál mára a 16S rDNS szekvenálás (STACKEBRANDT és RAINEY 1995) alapkövetelmény. A fent leírt izolálási folyamat alapfeltevése, hogy a keresett baktérium képes a használt táptalajban, vagy táptalajok valamelyikében szaporodni, azaz növekedést mutatni. Az izolált törzsek növényre való visszaoltásának követése a baktériumok jelölésével, elĘzĘleg sterilizált növények esetében törzs-specifikus monoklonális antitestekkel történĘ jelöléssel, majd – mindkét esetben – a baktériumok mikroszkópos kimutatásával lehetséges (SCHLOTER és HARTMANN 1998). Az izolátumok azonosításának lehetĘségei Hagyományos, fenotipikus tesztek – E módszerrel a baktérium izolátumokat alaktani (alak, méret, flagellum, tok, endospóra), szaporodási (telepmorfológia szilárd táptalajon, mozgás, szaporodás üteme), biokémiai (sejtfalösszetevĘk, pigmentanyagok, kataláz, oxidáz és ureáz termelése, zselatin hidrolízis, H2S-termelés, glükonát-oxidáció, ȕ-galaktozidáz és szelenit termelése, citrát és malonát felhasználása, kazeinemésztés, extracelluláris dezoxiribonukleáz termelése), ökofiziológiai (hĘmérsékleti és pH-optimum, oxigénigény, ozmotikus tĦrĘképesség, KCN-tolerancia) és táplálkozási (energiaforrás, C-, N- és S-forrás, jellemzĘ anyagcseretermékek) tulajdonságaik, valamint festĘdés (Gram-festĘdés és savállósági teszt) szerint csoportosíthatjuk (HOLT et al. 1994). További specifikus tesztek alkalmazhatók a nem fermentatív mikroorganizmusok besorolásának céljából, melyek eredményeit határozókulcsokkal összevetve juthatunk az adott izolátum faji, de legalább génusz-szintĦ meghatározásához (HORVÁTH 1980, HOLT et al. 1994). Ez utóbbi tesztek leggyakrabban a következĘ tulajdonságokat vizsgálják: pigment-termelés, növekedés gátló (pl. cetrimid) agaron, glükóz oxidációja vagy fermentációja, nitrát- és nitritredukció, dekarboxiláz enzim termelése, szénhidrát-anyagcsere (indikátorral), arginin-hidrolízis, Tween 20 és Tween 80 lipolízise, tirozin-hidrolízis és pigment-termelés, növekedés poli-hidroxibutiráton, eszkulin-hidrolízis, 3-ketolaktóz termelése, lecitináz-termelés, keményítĘ hidrolízise. Kereskedelmi azonosító módszerek – A kereskedelmi forgalomban kapható egyszerĦsített azonosító kiteket ugyancsak a fent említett klasszikus fenotipikus tesztek szerinti határozókulcsos besorolás alapján fejlesztették ki, de a hosszadalmas laboratóriumi elĘkészítést igénylĘ egyenkénti vizsgálat helyett az adott mikroorganizmus-csoportra


35

jellemzĘ összes reakciót egyetlen platformra (microplate) integrálják, s az inkubációs idĘ leteltével az elszínezĘdést értékelve rendszerint egy számsort kapunk, mely a gyakori (ubikvista) mikroorganizmusok esetében faji szintĦ határozókulcshoz vezet el. Környezeti minták meghatározása céljából az API 20 E és API 20 NETM (Analytical Profile Index, BioMérieux), a CRYSTALTM (BBL) és a BIOLOGTM rendszerek terjedtek el az utóbbi idĘben. Az API 20 ETM huszonegy tesztet tartalmaz, kiegészítve nitrát- és nitritredukciós, mozgási, növekedési, valamint glükóz-oxidációs és-fermentációs tesztekkel. Az eredményeket 24 h inkubációt követĘen hét számjegyben határozzák meg. A 48 h-s (szükség esetén) eredmények kilencjegyĦek. A gyártó ajánlása szerint e módszerrel 146 Pseudomonas törzsbĘl 48 h-s inkubáció mellett 68,5% pontosan, 15,1% helytelenül, 16,4% viszont egyáltalán nem lett meghatározva. Az API 20 NETM ezért jobb eredménnyel alkalmazható a nem bélrendszeri (azaz környezeti mintából származó) baktériumok azonosítására. E módszer is huszonegy tesztet tartalmaz, de segítségével a 146 referencia-törzsbĘl már 90,4% határozható meg pontosan, míg 4,1% helytelenül, 5,5% pedig egyáltalán nem. A BIOLOGTM módszer (BOCHNER 1989a,b) 95 különbözĘ szubsztrátum oxidálásán alapszik, melyek egy 96 lyukú platón vannak elhelyezve. Minden lyuk tartalmaz tetrazólium ibolyát is, mely lehetĘvé teszi, hogy a szénforrás oxidálásának mértékét kolorimetriásan meg lehessen határozni. A reakciókat 4 és 24 h inkubációt követĘen kell leolvasni. Az adatbázis a teszt idején 434 taxont tartalmazott. A jellemzĘk nagy száma alkalmassá teszi ezt a módszert kutatólaboratóriumokban való alkalmazásra, megjegyzendĘ azonban, hogy a módszer eredményessége nagyban függ a minta-elĘkészítési utasítások pontos betartásától, valamint a választott kiinduló adatbázistól (Gram-pozitív, -negatív, bélrendszeri, stb.). Egydimenziós poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) – A modern biokémiai vizsgálatok egyik leggyakrabban alkalmazott módszere a töltéssel rendelkezĘ makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak) vizsgálatában. Az 1960-as évek közepén terjedt el érzékenysége, nagy felbontóképessége, valamint viszonylag egyszerĦ kivitelezhetĘsége révén (KÖVES-PÉCHY és SZENDE 1984). A PAGE a szabad (folyékony közegben történĘ) elektroforézissel szemben közegként a térhálós szerkezetĦ poliakrilamidot használja, mely lehetĘvé teszi a molekulák nem csupán töltés, hanem molekulatömeg alapján történĘ elválasztását is, illetve e két módszer elĘnyeit egyesíti. Homogén pufferrendszerek esetén a gélben és az elektroforézis-kádakban is ugyanaz a puffer van. Ennek elĘnye az egyszerĦbb kivitelezés, de fehérjekeverékek elválasztására kevésbé alkalmas. A diszkontinuus gélelektroforézis esetében viszont két különbözĘ koncentrációjú gélt és két különbözĘ puffert használunk: az elválasztó gél fölé egy sokkal hígabb koncentráló gélt polimerizálunk, melyben az egyik fajta puffer (TRIS-HCl) van, a másik puffer az elektroforézis-tankban foglal helyet (TRIS-Glicin). A gélrendszerek megválasztása mellett mód van az elválasztó makromolekulák elĘkezelése szerint is különbözĘ típusú gélelektroforézist végezni. Ennek alapján a fentiek a natív gélelektroforézist jellemzik, a denaturáló körülmények között végzett elektroforézis viszont különbözik ettĘl (LAEMMLI 1970, MATTARELLI et al. 1993 és 1998): a) A fehérjemintát elektroforézis elĘtt denaturálni és redukálni kell, mely célból a mintát Na-lauril-szulfát (SDS) és ȕ-merkaptoetanol jelenlétében rövid ideig forraljuk. b) A ȕ-merkaptoetanol hatására a fehérjékben a diszulfidhidak redukálódnak, az ilyen hidakkal összetartott alegységek szétesnek. c) A fehérjék tömegegységre (g) vonatkoztatva azonos mennyiségĦ SDS-t kötnek meg, így specifikus töltésük (töltés g-1 fehérje) azonos lesz. Ha tehát ilyen kezelést követĘen hajtjuk végre az elektroforézist, akkor a fehérjék vándorlási sebessége

36


kizárólag a molekulatömegüktĘl függ, vagyis a gél szĦrĘtulajdonsága maximálisan érvényesül. Zsírsav alapú jellemzés – Sok mikroorganizmus taxon gyors és pontos azonosítását teszi lehetĘvé e módszer. Gram-negatív baktériumok esetében a hidroxisavak elemzésének van jelentĘsége, melyet – a gázkromatográfiás csúcsok referencia-könyvtárral történĘ összevetést – mind manuálisan, mind komputerrel végre lehet hajtani. Az abundancia-viszonyokra következtethetünk pl. a mikrobióta univerzális vagy valamilyen csoportjára specifikus biomolekuláinak közvetlen analízise alapján. Szerves oldószeres extrakció során a zsírsavak több családját egy talajmintából, egymástól elkülönítve vonhatjuk ki (HALBRITTER és UZINGER 2005). A DNS, RNS alapján történĘ kimutatás mellett a lipidanalízissel kapott spektrum is használható az adott mikroba „ujjlenyomataként”; speciális lipidek talajból, vizekbĘl, stb. való kimutatásával egyes mikrobák jelenlétére következtethetünk. Az ilyen lipideket WHITE (1995) signature lipid biomarker-nek (SLB), az erre alapozott megközelítést SLB-analízisnek nevezi. A foszfolipidek (PLFA) a baktériumok és eukarióták körében univerzálisak (a metanogének és más archaebaktériumok membránjában éterlipidek szerepelnek helyettük), a taxonspecifikusak viszont minor komponensek: általában csak kis részét alkotják az össz-PLFAmennyiségnek, és arányuk változékony. Az egyes PLFA-k tehát – bár utalhatnak egyes taxonok jelenlétére, részarányának tér- és idĘbeli dinamikájára – adott taxon biomasszabecslésére kevésbé alkalmasak. A talajból kivont foszfolipidek lehetĘséget adnak a talajmikrobióta baktérium és mikroeukarióta biomasszájának jellemzésére, foszfolipidzsírsavspektrum alapján pedig egyes tágabb taxoncsoportok jelenlétének, tér-és idĘbeli dinamikájának megállapítására; ezáltal az életközösség szintjén történĘ érzékeny bioindikációra (HALBRITTER és UZINGER 2005), de kevésbé alkalmasak egyes törzsek azonosítására. rRNS-en alapuló azonosítási technika – E módszer segítségével általában annak az rDNS-szakasznak a bázissorrendjét állapítjuk meg, amelyrĘl az adott rRNS íródik át, ezért gyakran – és a továbbiakban – rDNS módszernek is nevezik. Az rDNS alapú genotipikus technikát az utóbbi tizenhat évben fejlesztették ki és alkalmazzák egyre szélesebb körben. Az rDNS-ek (riboszomális DNS) minden élĘ szervezetben elĘfordul, funkciójuk rendkívül állandó, bázissorrendjük (szekvenciáik) végtelenül lassan változnak; messze sokkal lassabban, mint a legtöbb proteiné, s mindemellett még könnyen is izolálhatók. Az rRNS-t in vivo meg lehet jelölni 3H, vagy 14C jelzett prekurzor hozzáadásával, a táptalajra történĘ oltás során (RAINEY et al. 1996). 2.4.

Toxikus szennyezĘk hatása a rizoszféra mikroorganizmusaira

2.4.1. Nehézfém-vegyületek A talaj termékenységének fenntartása az abban jelen lévĘ mikrobiális biomassza aktivitásától függ (DE HAAN et al. 1989). Ez a biomassza a talaj szervesanyag-készletének viszonylag kicsiny hányada (1-3%), amely viszont alapvetĘen fontos szerepet játszik a növények által igényelt összes fĘ tápanyag biológiai ciklusában. A talaj biomasszája gyakorlatilag az összes tápanyagforgalmi, szervesanyag-raktározási körfolyamat, valamint a mikroaggregátumok képzésének – mely a talajban történĘ vízmozgás és a talajlevegĘzöttség szempontjából nélkülözhetetlen folyamat – szabályozója. A talajmĦvelési módok és eljárások, valamint a talaj mikrobiális biomasszája közötti összefüggések vizsgálatával foglalkozó tanulmányok jobbára a populációsĦrĦségben és annak következtében a talaj termékenységében beálló változásokról tudósítanak, míg a biomassza talajszennyezettséget jelzĘ indikátorként történĘ felhasználására mindeddig kevesebb figyelmet fordítottak. A nehézfémek, különbözĘ szervetlen és szerves anyagok által elĘidézett abiotikus stresszhatások a talaj-mikroorganizmusok funkcionális zavarát,


37

fehérjéik denaturálódását, illetve a sejtmembránok szétesését okozhatják, miáltal a mikrobák szaporodására, morfológiájára és anyagcseréjére káros hatással vannak. Ennek következtében a talajok nehézfémekkel történĘ elszennyezĘdése jelentĘsen csökkentheti az ott elĘforduló mikrobiális biomassza méretét és aktivitását (BROOKES és MCGRATH 1984). E mikrobiális paraméterek – légzés, C és N mineralizációja, biológiai nitrogénkötés, valamint néhány talajban jelen lévĘ enzim aktivitása – BROOKES (1995) és GIL-SOTRES (2005) szerint csak akkor adhatnak igazán érzékeny jelzést a talaj nehézfémek általi szennyezettségének tekintetében, ha a populációra vonatkozó mérésekkel (pl. biomasszaspecifikus légzés) társítjuk Ęket. Ennek révén viszont költség- és idĘigényes szabadföldi vizsgálatok nélkül is meghatározható, hogy adott természetes ökoszisztéma megváltozik-e a szennyezĘanyagok hatására. A talajban szabadon élĘ, heterotróf mikrobák N2-kötĘ aktivitása kevéssé használható a talajszennyezettség indikátoraként, mert éves diazotróf potenciáljuk – MCGRATH 1994 szerint – csak 1-2 kg N ha-1 / év, szemben az autotróf N2kötés (cianobaktériumok) 5-30 és a szimbionták 100-200 közötti értékeivel. LORENZ et al. (1992) tanulmányukban ez utóbbi közösségeket fel is használták a talaj nehézfémszennyezettségének jelzésére, minthogy a mikroorganizmusok növekvĘ Zn-, Cu-, Ni- és Cdkoncentráció hatására elvesztették nitrogénkötĘ képességüket. BROOKES (1995) egyébként a Cu, Ni, Cd, Zn, Cr és Pb fémeket minĘsítette a legjelentĘsebb talajszennyezĘknek. A nehézfémek növényekre kifejtett káros hatásai kialakulásában a fiziológiai tulajdonságok (CSATHÓ 1994, KERESZTÚRI et al. 2003) mellett a szennyezés típusa (NÉMETH et al. 1993), a talajok fizikai–kémiai állapota – pl. pH-ja és/vagy szervesanyagtartalma – (LEHOCZKY et al. 1997, ANTON et al 2004), illetve a kihelyezési dózisok játszanak elsĘsorban szerepet. A talaj- és rizobiológiai tulajdonságok kedvezĘtlen megváltozása ugyancsak ismert (BIRÓ 2004); mindezek a fitoremediációs növényoltásos technikák gyors elterjedését eredményezték az utóbbi idĘben (MÁTHÉ et al. 2004, MÁTHÉ-GÁSPÁR és ANTON 2004, VIVAS 2004). A mezĘgazdasági talajok nehézfém-szennyezettségének egyik fĘ oka a kommunális szennyvíziszap talaj–növény rendszerben történĘ hasznosítása, melyet széles körben az elhelyezés egy lehetséges módszereként tartanak számon (ANTON és ANTAL 1987, az Európa Tanács határozata [COUNCIL DIRECTIVE] 1999a,b). A szennyvíziszapok esszenciális növényi tápanyagokat, a talaj termĘképességét növelĘ szerves anyagokat, valamint a növények szempontjából hasznos mikroorganizmusokat is tartalmaznak. Ez szükségessé teszi a növény–talaj rendszerekre kifejlesztett hatások pontosabb, körültekintĘbb vizsgálatát, tekintetbe véve pl. a rendszeres kihelyezés talajmikrobák mĦködĘképességére kifejtett negatív hatását, mely a talajban feldúsuló nehézfémek miatt (BIRÓ 1999, BIRÓ et al. 2004, SASTRE et al. 1996) léphet fel. Az emberi egészség védelme érdekében (DUMONTET et al. 1999) a kijuttatás során a növénytermesztés szempontjából hasznos mikrobákkal való felülkezelési lehetĘségekkel (KÖDÖBÖCZ et al. 2003), vagy a nehézfémek táplálékláncban történĘ akkumulációjával is számolni kell (ANTON et al. 1994, KÁDÁR 1995). 2.4.2. Nehézfémek oligodinámiás hatása A nehézfémek egy csoportja (ezüst, réz, cink, higany, molibdén) még igen nagy hígításban is toxikus hatást fejt ki a mikroorganizmusokra. A hatásmechanizmust azzal magyarázzák, hogy az oldatba menĘ igen kis mennyiségĦ fémion a létfontosságú fehérjék denaturálódását katalizálja. A szabad fémion a proteinekkel fémproteináttá kapcsolódik, majd újra felszabadul, és egy másik molekulával újabb kapcsolatba lép. Ezek a fémek és vegyületeik a koncentrációtól függĘen a magasabb rendĦ élölényeknél is súlyos mérgezést okozhatnak. Legsúlyosabb ezek közül az ezüstmérgezés, amelynek nincs ellenszere. Nägeli a fémezüst baktericid hatását oligodinámiás hatásnak nevezte el (HORVÁTH 1980). Ma valamennyi színfém, illetve ötvözetének baktericid hatását is e kifejezéssel jelöljük. A

38


kémiailag tiszta, oxidrétegétĘl megfosztott, vagy mechanikusan tisztított fémdarab a hatást nem mutatja, mert oldékonysága így erĘsen lecsökken. Az oligodinámiás hatás gyakorlati alkalmazását már a perzsák is felfedezték, midĘn utazásaik során a nagykirályok ezüstedényekben szállítatták személyes használatukra a vizet. Jelenleg is speciális sterilizálási eljárások részeként találkozhatunk az oligodinámiás hatás gyakorlati alkalmazásával, pl. ivóvizek ezüstbĘl készült víztisztító berendezésekben történĘ sterilizálása során. Az ezüst evĘeszközök használata is ezért higiénikus, mint ahogy sokkal higiénikusabbak voltak a régebbi rézkilincsek a ma használatos könnyĦfém kilincseknél. Egyes országokban elĘírás, hogy a vendéglátóipari létesítmények mosogatóit és edényöblítĘit ezüstbĘl (illetve ötvözetébĘl) kell készíteni. A réz és a cink különbözĘ vegyületei a mezĘgazdasági termelés során használatos növényvédĘ és talajfertĘtlenítĘ szerek, inszekticidek, valamint termésnövelĘ anyagok hatóanyagaként szerepelhetnek, a higany, molibdén és vegyületeik viszont gyakran a ipari eredetĦ, nehézfémtartalmú szennyvíziszapokban (ANTON és ANTAL 1987, NOWAK 1987), illetve magcsávázószerekben vannak jelen (KECSKÉS 1983). Emiatt indokolt lehet e fémek szelektált, növényoltásra alkalmas baktériumtörzsekre kifejtett oligodinámiás hatásának külön vizsgálata is. 2.4.3.

Cianidok

A mikrobák tĦrĘképessége a cianiddal szemben A fĘleg ipari hulladékokból származó cianid- és nitrilvegyületek ismert környezetszennyezĘ anyagok (pl. talajban, ill. talaj- és felszíni vízben). Ugyanakkor számos vizsgálat bizonyítja – pl. OLDAL et al. 2004 –, hogy az alacsonyabb rendĦ élĘlények – baktériumok, sugárgombák, mikroszkopikus gombák – egyes képviselĘi (pl. Bacillus, Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Stenotrophomonas és Trichoderma fajok) viszonylag nagy cianid-koncentráció mellett is képesek szaporodni. JEPPSSON et al. (1995) megfigyelte, hogy a Pichia stipitis élesztĘgomba légzési lánca – ellentétben másokkal, mint pl. Candida utilis, Pachysolen tannophilus és Saccharomyces cerevisiae – a cianid jelenlétére nem (cyanide-insensitive respiration; CIR), de a szalicil-hidroxámsavra érzékeny. Xilóz egyedüli szénforráson tenyésztve, cianid jelenlétében xilitolt, arabitolt és ribitolt termel. Cianidtartalmú vegyületek – szintézis, vagy sokféle mikroorganizmus, növény és néhány rovar anyagcseréje során – biológiai úton is képzĘdhetnek. Mintegy kettĘezer növényfaj rothadása során szabadul fel HCN, de élĘ növényi szövetben szintúgy termelĘdhet. E képességnek fontos szerepe van a káros, ill. patogén mikroorganizmusok elleni biológiai védekezésben (LEPP et al. 1995). Cianidvegyületek biológiai úton történĘ képzĘdése a talajban Cianidok általában a mikroorganizmusok intenzív szaporodásának utolsó szakaszában, másodlagos anyagcseretermékként képzĘdnek, amikor a sejt egy elsĘdleges vegyületet más – katalizáló – anyagcseretermékek (pl. glicin, vagy metionin) felhasználásával cianiddá alakít át. A termelt cianid mennyiségét a tápközeg vas- (Fe–) és foszfát- (PO42–) -tartalma határozza meg. A cianid további biokémiai reakciók során ßciano-alaninre, vagy széndioxidra és ammóniára bomolhat. E folyamat számos gomba és nem fotoszintetizáló baktérium – pl. Chromobacterium violaceum, egy sor Pseudomonas faj - esetében ismert (HARRIS et al. 1987). VOISARD et al. (1989) kimutatta, hogy a Pseudomonas fluorescens CHA0 törzs hidrogén-cianidot termel, mely természetes körülmények között is szerepet játszik a dohánygyökér feketerothadásának gátlásában.


39

A Chlorella vulgaris alga peroxidáz rendszere révén, oxigén és Mn2– ionok jelenlétében a D-aminosavakat cianidvegyületekké alakítja át, illetve glioxálsav rendszerével glioxálsavból és hidroxilaminból HCN-ot is képes elĘállítani. Sok rizoszférában elĘforduló baktérium is termel HCN-ot, így részt vesz a növénypatogén mikroorganizmusok elleni biológiai harcban is (SCHIPPERS 1988). CASTRO et al (1996) bizonyította, hogy az acetonitril és a klóracetonitril biológiai dehidrogénezése során egy metilotróf szervezet, a Methilosinus trichosporium a köztes termékként képzĘdĘ cianohidrint formaldehiddé alakítja, miközben HCN szabadul fel. Cianidtermelés más xenobiotikumok biológiai transzformációja során is elĘfordul. A legtöbb cianidtermelĘ baktérium a cianidot egyben anyagcseréjéhez is felhasználja, ezért e vegyület biológia lebontásában különösen fontos szerepük van. Cianid a benzonitril (ciánbenzol) és származékai biológiai lebontása során is keletkezhet. Egy pentaklórfenol- (PCP-) -bontó Flavobacterium sp. törzs (ATCC 39723) a bromoxinilt is metabolizálja, eközben bromid és cianid szabadul fel, aromás intermedierek megjelenése nélkül. A termelt cianid viszont gátolja a baktériumtörzs szaporodását és anyagcsere-aktivitását (TOPP et al. 1992). A bromoxinil és a PCP lebontása együttesen megy végbe, a reakciót a szubsztrát jelenléte váltja ki. E Flavobacterium sp. törzs tisztított PCP-hidroxiláz enzime viszont a bromoxinilt sztöchiometrikus cianid-felhalmozódás mellett (NADPH, oxigén és bromoxinil 2:1:1 mólarányban fogy, eközben egy mól lebontott bromoxinilbĘl egy mól cianid képzĘdik), de bróm termelése nélkül bontja. Tengervízben élĘ baktériumok is termelnek cianidtartalmú vegyületeket. Yap (Mikronézia), Palau (Belau) és Okinawa szigetén gyĦjtött 2.594 izolátum közül 37 esetében igazolták a ß-ciano-L-alanin (L-CNAla) termelését anélkül, hogy a tápközegben cianid-ion jelen lett volna. A vegyület az Oscillatoria amphibia NIES-361 és néhány más cianobaktérium törzs szaporodását 0.4–25 μg/ml koncentrációban gátolja. A legtöbb baktériumra, mikroszkopikus gombára és eukarióta algára azonban nincs káros hatással (YOSHIKAWA et al. 2000). A képzĘdött cianid sorsa a természetben Aerob biodegradáció – A cianid szabadon és komplexek formájában a talajból a talaj-, illetve felszíni vizekbe, a HCN viszont (gázhalmazállapot) a levegĘbe is kerülhet. A szabad HCN gázhalmazállapota és az ionos (oldott) forma közötti megoszlást alapvetĘen a közeg pH-ja határozza meg. KIMBER (1994) szerint a két forma 1:1 aránya pH 9 körül fordul elĘ. Kisebb pH-n a gázállapot aránya nagyobb. A cianid-fémkomplexek végül a szabad ciánná bomlanak le, e folyamat fény hiányában azonban igen lassú. A biológiai lebontás során mind a szabad, mind az oldott formák felhasználódhatnak, HCN ezen kívül még fotokémiai úton is lebomolhat. Igen sok mikroorganizmus képes arra, hogy a szabad és oldható komplexekben elĘforduló, biogén, vagy ipari szennyezéssel a talajba került cianidot lebontsa; legtöbbjük a talajok és vizek gyakori lakója. Baktériumok és gombák mind aerob, mind anaerob biodegradációs tevékenységét megfigyelték már (WEIGHTMAN és SLATER 1988); a baktériumok (elsĘsorban Pseudomonas sp.) által végzett lebontással, illetve cianiddal szembeni tĦrĘképességükkel ezért számos közlemény foglalkozik. Sok Pseudomonas képviselĘ (P. putida, P. fluorescens, P. paucimobilis [újabban Sphingomonas paucimobilis; GARRITY et al. 2004]) képes a cianidot még egyedüli Nforrásként is hasznosítani, melynek során CO2 és NH3 szabadul fel, utóbbi részben újra asszimilálódhat (HARRIS et al. 1987, ROLLINSON et al. 1987, CHAPATWALA et al. 1995 és PODOLSKAYA et al. 1995). E folyamatot a cianid-oxigenáz enzim katalizálja. A felépítĘ anyagcsere egy másik útja a légköri nitrogént kötĘ baktériumok nitrogenáz rendszere révén valósul meg, mely a cianidot metánná és ammóniává, mint végtermékekké

40


történĘ redukálását katalizálja. A növénypatogén gombák (pl. Gloecerospora sorghi) cianidhidroláz enzimrendszere alkalmazkodott néhány gazdanövény cianidtermeléséhez, midĘn e cianidot a kevésbé mérgezĘ formiddá alakítja át. Ez az egyszerĦ hidrolitikus lebontási útvonal egyúttal sokféle ipari eredetĦ lúgos kémhatású hulladék és melléktermék ártalmatlanítását teszi lehetĘvé anélkül, hogy azokat elĘzĘleg savanyítani kellene. Ennek következtében a hidrogén-cianid volatilizációját jelentĘsen csökkenti, környezetegészségügyi szempontból ezért nagy érdeklĘdésre tart számot. A Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 törzs sejtmentes kivonata (150.000 × g, felülúszó összegyĦjtve) a HCN CO2-dá és NH3-vá történĘ oxidációját katalizálja. Az átalakítás mind az oxigén, mind a NADPH mennyiségétĘl függ; egy mól HCN lebontásához 1-1 mól oxigén, illetve NADPH kell. Az enzimreakció során egy-egy gázból (oxigénmolekula) és vízmolekulából származó oxigénatom épül be. E tevékenység megerĘsíti azt a korábbi tapasztalatot, hogy a baktérium a HCN-ot oxigén mediátor jelenlétében alakítja át. A cianid anaerob biodegradációja szintén jelentĘs mértéket képvisel. Vízzel telített, rosszul szellĘzött, azaz reduktív talajokban és üledékekben a lebontás szinte csakis ezen az úton megy végbe. Az anaerob baktériumok a HCN-ot NH3, ammónium-formát, H2S, CO2 és CH4 képzĘdése közben bontják le (FALLON et al. 1991, INGVERSON et al. 1991, FALLON 1992 és TOPP et al. 1992). Mikrobiális cianid-asszimiláció – KUNZ et al. (1998) Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 törzzsel végzett kísérletében piroszĘlĘsav és Į-ketoglutarát halmozódott föl a tápközegben, midĘn a baktériumot ammónia, vagy cianid – mint növekedést limitáló egyedüli energiaforrás – jelenlétében tenyésztették. A reakció mediátora a cianid-oxigenáz enzim, a termék pedig a biológiai úton képzĘdött ketosavak cianohidrinjei voltak, melyek a sejt további anyagcseréje során ismét nitrogénforrásként szolgáltak. A képzĘdĘ ketosavak és a felvett cianid mennyisége egyenesen arányos. A piroszĘlĘsav és az Į-ketoglutarát a sejtet a cianidmérgezéstĘl is védi, és termelésük a cianid szubsztrátként történĘ hasznosításához közvetlenül kapcsolódik. A baktérium e képessége a cianidok asszimiláció révén történĘ ártalmatlanításának újabb módját alapozza meg, melyben a ketosavak kulcsszerepet játszanak. 2.5.

A hasznos mikroorganizmusok talaj-biotechnológiai célú irányított alkalmazásai

2.5.1.

Bacillus sp. baktériumok A Bacillus génusz tagjai aerob spórás baktériumok (domén: Bacteria, BXIII. törzs: Firmicutes, III. osztály: Bacilli, I. rend: Bacillales, I. család: Bacillaceae; GARRITY et al. 2004), melyek spórásodási, valamint nagyfokú alkalmazkodási képességük folytán széles körben elterjedtek a természetben, és fontos szerepet játszanak a különbözĘ biológiai folyamatokban. Tipikus kozmopolita baktériumok, a legkülönbözĘbb körülmények között képesek létezni: porban, folyami iszapban, állati és növényi maradványokban, tavak, tengerek és folyók vizében, a különbözĘ típusú talajokban, élelmiszerekben, rovarokban, emberi és állati szervezetekben (SZMIRNOV 1986). A Bacillus subtilis élĘ tenyészeteinek felhasználása A Bacillus subtilis élĘ tenyészeteinek használhatóságát a növényi gombabetegségek, valamint raktári károsító gombák ellen számos szerzĘ vizsgálta. Az alábbiakban a teljesség igénye nélkül mutatom be az utóbbi tizenöt év ezirányú törekvéseit a 2. táblázatban. A Bacillus nemzetség különbözĘ fajainak, illetve azok törzseinek további kutatása – az eddig talált nagyszámú hatóanyag ellenére – fontos részét képezi az integrált


41

növényvédelem, s ezen belül a biológiai védekezés fejlesztésének, hogy közelebb jussunk a kockázatmentesen felhasználható környezetkímélĘ növényvédĘ szereknek a mezĘgazdasági gyakorlatban való térhódításához. 2. táblázat A Bacillus subtilis élĘ tenyészeteinek alkalmazása az integrált növényvédelemben Törzs

Gátolt gombafaj

Gazdanövény

SzerzĘk

AP-3 AP-12 AP-51 AP-114

Aspergillus sp. Bipolaris sorokiniana Penicillium sp. Pyricularia oryzae Rhizoctonia solani Sclerotinia sclerotiorum Helminthosporium sativum

Bab (Phaseolus vulgaris) Búza (Triticum aestivum)

LAZZARETTI et al. (1994)

--

Botrytis cinerea Glomerella cingulata (Colletotrichum gloeosporioides) Monilinia fructicola Macrophomina phaseolina Claviceps fusiformis

Csonthéjasok

VOZNYAKOVSZKAJA et al. (1988) PUSEY (1989)

B. subtilis B-3

B. subtilis B. subtilis B. subtilis

B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis B. subtilis No. 72 B. subtilisizolátumok B246

2. tábl. folytatás

Xanthomonas campestris pv. cyanopsidis Heterodera cajani Fusarium udum Pseudocercospora purpurea Fusarium moniliforme

Lóbab (Vicia faba) Pennisetum americanum Bab (Phaseolus vulgaris) Takarmánybükköny (Vicia sativa)

SIDDIQUI és MAHMOOD (1995a) MAHADEVAMURTHY et al. (1988) HOODA et al. (1995)

SIDDIQUI és MAHMOOD (1995b)

Avokádó (Persea americana) BanksfenyĘ (Pinus banksiana) Uromyces appendiculatus Bab (Phaseolus vulgaris) Hagyma Phytium ultimum Rhizoctonia solani (Allium cepa)

KORSTEN et al. (1994)

Kukorica (Zea mays) Avokádó (Persea americana)

RAGAB (1994) KORSTEN et al. (1995)

Gátolt gombafaj

Gazdanövény

Ustilago maydis Colletotrichum gloeosporioides Fusarium solani Pestalotiopsis versicolor Phomopsis perseae Thyronectria pseudotrichia Törzs

HWANG et al. (1995) MIZUBUTI et al. (1995) PLEBAN et al. (1995)

42


B3

Rhizoctonia cerealis

Bacillus sp.

Trichoderma sp. T. viridae Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

Bacillus sp.

Bacillus sp.

Sclerotium rolfsii Sacc.

Bacillus sp.

Fusarium sp. Phytium sp. Rhizoctonia solani Pyricularia oryzae Cav. Botrytis cinerea Fusarium oxysporum Phytophtora infestans Pythium ultimum Rhizoctonia solani

Bacillus subtilis C18

GBO3 PRS5

RPP64 RPP674 T99

Búza (Triticum aestivum) Bükk (Fagus sylvatica) Paradicsom (Lycopersicon esculentum) Paradicsom (L. esculentum) --

Rizs (Oryza sativa) Paradicsom (L. esculentum)

MERCER és KIRK (1984) KAPOOR és KAR (1988) CHAMSWARNG et SANGKAHA. (1988) CIAMPI és TEWARI (1990) BETTIOL (1988) SADLERS (1996)

Gyapot BRANNEN (1995) (Gossypium hirsutum) YANG (1990) Kínai fenyĘ (Cunninghamia lanceolata)

Alternaria alternata Colletotrichum gloeosporioides Lophodermium conigeum Penicillium digitatum P. italicum Phytophtora capsicii Rhizoctonia solani Csonthéjasok Monilinia fructicola Fusarium oxysporum f. sp. dianthi

ZHANG et al. (1995)

SzegfĦ (Dianthus caryophyllus)

McKEEN et al. (1986) BOCHOW et al. (1988)

2.5.2. Pseudomonas sp. baktériumok A Pseudomonas génusz tagjai a baktériumok Pseudomonadaceae családjába tartozó (domén: Bacteria, BXII. törzs: Proteobacteria, III. osztály: Gammaproteobacteria, IX. rend: Pseudomonadales, I. család: Pseudomonadaceae; GARRITY et al. 2004), egyenes vagy görbült Gr-, de nem helikális pálcák, 0,5-1,0 μm átmérĘjĦek és 1,5-5,0 μm hosszúak. Sok fajuk akkumulál poli-ß-hidroxibutirátot mint széntartalékot, nem képeznek prosztékát és nincsenek körülvéve hüvellyel. Egyetlen vagy néhány poláros flagellum segítségével mozognak, ritkán nem mozognak. Néhány faj rövidebb laterális flagellumokat is képez. Az anyagcseréjük általában szigorúan oxigénhez, mint terminális elektronakceptorhoz kötött, néhány esetben nitrát is felhasználódik anaerob körülmények között. Xanthomonadinokat nem termelnek. 4,5-nél kisebb pH-értéken nem növekednek. A legtöbb törzs nem igényel szerves növekedési faktorokat, oxidáz-pozitívak vagy -negatívak, kataláz-pozitívak, kemoorganotrófok, néhány fajuk fakultatív kemolitotróf, képesek hidrogént vagy szénmonoxidot, mint energiaforrást hasznosítani. A természetben széleskörĦen elterjedtek.


43

Pseudomonas-törzsek növényi növekedés-serkentĘ hatása Rengeteg tanulmány foglalkozik a Pseudomonas-ok növényekre gyakorolt jótékony hatásának tanulmányozásával a világon. Ez többek között rugalmas anyagcseréjüknek, rövid generációs idejüknek, mobilitásuknak – a fiatal gyökérrészek elsĘdleges kolonizálóinak tekinthetĘk – köszönhetĘ, valamint az antagonizmusért felelĘs másodlagos anyagcseretermékek széles skáláját képesek elĘállítani. A rizoszférában nagy mennyiségben elĘforduló szaprofita mikroba közösségeket hosszú ideig károsnak gondolták a növények számára, mivel versengenek az ott jelen lévĘ tápanyagforrásokért a növénnyel (ROVIRA és DAVEY 1974, ROVIRA et al. 1979). Napjainkban azonban egyre fontosabb szerepet tulajdonítanak számukra a növények tápanyagellátásában: mineralizálják a talajba jutó szerves törmelékeket (a növény számára felvehetĘ formákká); egyes, a növény számára nem felvehetĘ szervetlen vegyületeket (pl. foszfor) oldott állapotba viszik át; növényi hormonokat és antibiotikumokat termelnek; visszaszorítják a növénypatogén formákat. Mivel a növényi növekedés-serkentés mechanizmusának több összetevĘje van, az ilyen tulajdonsággal rendelkezĘ Pseudomonas baktériumok izolálására is sok módszert találunk az irodalomban. E baktériumok igénytelenségének következtében igazi szelektív tápközeget nehéz feladat összeállítani. A különbözĘ szintetikus táptalajokon nagyon sokféle baktériummal együtt növekednek. Ennek ellenére a gyakorlott szem számára, már pusztán küllemük alapján is felismerhetĘek. Ezt elĘsegíthetjük, ha kitenyésztésükhöz olyan izolációs közegeket alkalmazunk, amelyeken a rájuk jellemzĘ morfológiai jellemvonásaik még inkább kidomborodnak. Pl.: Brolacin-agar (a Pseudomonas kolóniák kékes-zöldek és mattak), XLD-agar (számos Pseudomonas kolónia áttetszĘ vörös színĦ), GSP-agar (a telepeik e közegen viszonylag nagyok, 2-3 mm átmérĘjĦek és kékes-ibolya színĦek, mely az agarba diffundálva, vöröses-ibolyába vált át) (SZABÓ 1998). Az említett tápközegeken kívül egyik legelterjedtebb a King’s B táptalajról való izolálási mód, melyen kolóniáik szabad szemmel áttetszĘ kékes-zöld fényĦek és UV megvilágítás alatt fluoreszkálnak (GEELS és SCHIPPERS 1983c). Amennyiben a SCHWYN és NEILANDS (1987) által kidolgozott módszert választjuk, úgy az antagonizmusért fĘként felelĘs szideroforok termelését detektálhatjuk, mely a kék színĦ táptalajon a kolóniák körül megjelenĘ narancssárga gyĦrĦk formájában nyilvánul meg (amennyiben errĘl a táptalajról izolálunk sziderofor-termelĘ törzseket, természetesen utólag meg kell gyĘzĘdnünk róla, hogy Pseudomonas-ok, mert sok más mikroorganizmus is képes termelni ezeket a vegyületeket). Sok esetben a fluoreszcens Pseudomonas-ok növekedés-serkentést mutatnak patogén mikrobák távollétében is, míg elĘfordul, hogy a patogén mikrobák jelenléte elĘfeltétel (KLOEPPER et al. 1988, SCHIPPERS et al. 1987). Patogénmentes környezetben a növekedés-serkentés talán az ásványi anyagok hozzáférhetĘsége növelésének, vagy növekedés szabályozók termelésének köszönhetĘ (GASKINS et al. 1985, KLOEPPER et al. 1988). Mikor a patogének jelenléte szükséges a növekedés-serkentés szempontjából, bizonyos PGPR mikrobák nem fejtenek ki hatást – mint ezt KLOEPPER és SCHROTH (1981) gnotobiotikus rendszerben ellenĘrizte. A növekedés-serkentés ez esetben valószínĦleg a patogén ágens (-ek) aktivitása csökkentésének köszönhetĘ. A folyamatban résztvevĘ lehetséges mechanizmusok a következĘk: kompetíció a szubsztrátumért vagy vasért sziderofor termelés által, antibiotikum termelés és indukált rezisztencia. A fluoreszcens Pseudomonas-ok a növény növekedésére gyakorolt jótékony hatásának számos példája van, pl. elĘsegítik a mag csírázását, növelik a csíranövény élet- és ellenálló képességét, elĘsegítik a gyökérrendszer fejlĘdését és emelik a terméshozamot (PANDEY et al. 1999). Ezen hasznos tulajdonságaik viszont nem különíthetĘek el teljesen a talajban betöltött biológiai „ellenĘrzĘ” tevékenységüktĘl (gátolják más baktériumok és gombák, beleértve fitopatogének, szaporodását). A fluoreszcens Pseudomonas-ok e

44


tulajdonsága az antibiotikum-, sziderofor-, HCN-termelésüknek és gyors kolonizációs képességüknek köszönhetĘ (MAZZOLA és COOK 1991, BIN et al. 1991, O’SULLIVAN és O’GARA 1992, COOK 1993, LOPER és HENKELS 1999). Tulajdonképpen e tulajdonságok összességének köszönhetĘ a Pseudomonas-ok nagy kompetíciós képessége, mely elĘrevetíti biotechnológiai felhasználásuk lehetĘségét (KLOEPPER et al. 1986 és 1988, LAMBERT és JOOS 1989, BAKKER et al. 1990, CAMPBELL és GREAVES 1990, HÖFLICH et al. 1995). LIFSHITZ et al. (1987) a retek csíranövények növekedés-serkentését tanulmányozta P. putida GR12-2R3 törzse által gnotobiotikus rendszerben, növénypatogének hiányában. Kimutatták, hogy a törzs növeli a 32P jelzett foszfát felvételét, a jelenségért felelĘs DNS szakaszt pedig késĘbb sikerült azonosítani, és klónozni is (LIFSHITZ et al. 1988). Indukált rezisztencia Mindössze néhány olyan talajeredetĦ betegség van, melyekkel szemben úgy gondolják, hogy a Pseudomonas-ok rezisztenciát indukálnak. Burgonya gumó darabok avirulens vagy inkompatibilis P. solanacearum ill. fluorescens-el történĘ kezelése utáni betegséggátlást a hervadással (kórokozója a P. solanacearum) szembeni indukált rezisztenciának tulajdonítják (KEMPE és SEQUEIRA 1983). Azonban a késĘbbiekben McLAUGHLIN és SEQUEIRA (1988) tanulmányukban bizonyították, hogy a burgonya hervadás bakteriális gátlása avirulens P. solanacearum törzzsel inkább a kompetitív kizárásnak köszönhetĘ. A dohány feketerothadásos betegsége gátolva lett a P. fluorescens CHA0 törzse által. E betegség gátlása, melyet a Thielaviopsis basicola okoz, úgy gondolják, részben az indukált rezisztenciának köszönhetĘ (SCHIPPERS 1988). ANDERSON és GUERRA (1985) szerint a bab (Phaseolus vulgaris L.) védelme a Fusarium solani f. sp. phaseoli-val szemben P. putida törzzsel, többek között annak köszönhetĘ, hogy az utóbbi módosította a növény védelmi potenciálját azáltal, hogy a gyökérszövetben nagyobb lignin szintézist indukált. A rizoszféra mikroorganizmusok növényi rezisztencia kialakulásában betöltött másik szerepérĘl számoltak be DAVIS et al. (1985) és AZAD et al. (1987). A burgonya azon genotípusainak rizoszférájában, melyek rezisztensek voltak a verticillium-os rothadással szemben, sokkal nagyobb populációit találták a kórokozóval szemben antagonista mikroorganizmusoknak összehasonlítva a fogékony genotípusú növény gyökérzónájában levĘkkel. Mikroorganizmusok és magasabb rendĦ növények kölcsönhatásai értékelésének lehetĘségei A hasznos, növény-, illetve magoltásra felhasználható baktériumok és más (pl. növénypatogén) mikroorganizmusok, illetve a gazdanövények közötti kölcsönhatásokat, valamint mikroorganizmusok és közösségeik környezeti tényezĘkkel szembeni ellenállóképességét laboratóriumi, szabadföldi, valamint hosszabb távú monitoring módszerekkel követhetjük nyomon (GILLER et al. 1997). Mindegyikre számos példát találhatunk a szakmai közleményekben. Laboratóriumi – pl. ökotoxikológiai – tesztek esetében meghatározott környezeti ágensek (pl. nehézfémek) kitüntetett mikroba-populációra (pl. Bacillus, Pseudomonas, vagy Rhizobium oltótörzsek) gyakorolt hatását vizsgálják, egyfajta modellrendszerben (KECSKÉS 1976). E megközelítés leegyszerĦsíti a természetes ökoszisztémát és csak közelítĘ információt ad a valós környezetben végbemenĘ folyamatokról, de különbözĘ tulajdonságok szerinti kiválogatásra alkalmas. A szabadföldi körülmények között végrehajtott vizsgálatok már adott – pl. szennyezett és/vagy növényekkel bevetett – területen és környezeti feltételek között zajlanak, vagy ilyen területrĘl vett mintákkal (pl. talaj) dolgoznak. Rendszerint azonban a hosszú távú megfigyelések céljára nem alkalmasak, mert e kísérletek általában egy, legfeljebb néhány


45

vegetációs idĘszakot ívelnek át (MANNINGER és KėVÁRI 1983, KÖVES-PÉCHY és SZENDE 1984, KÖVES-PÉCHY et al. 1987, GULYÁS és ABDALLA 1987, SZENDE 1987; 1990, KÖVES-PÉCHY et al. 1990, SZEGI et al. 1990). Egyes ökoszisztémák alakulását (pl. szukcesszió) tartamkísérletek, valamint adott talajkörnyezet (pl. meddĘhányók, intenzív mĦvelésbe vont talajok) rendszeres mintázása révén lehet legmegbízhatóbb módon követni a talaj-mikroba-növény rendszerben (VÖRÖS és SZEGI 1990). Komplex vizsgálatban, illetve a természetes ökoszisztémában az egyes szereplĘk közötti kölcsönhatásokat sok változó (dimenzió) mérésével jellemezzük (PODANI 1997, KEMÉNY és DEÁK 2000). Az összehasonlítandó jellemzĘket objektumoknak nevezzük. A tulajdonságok, melyek alapján az összehasonlítás történik az objektumok attribútumai, vagy változók. Az elemzésben – legtöbb esetben – azonban felcserélhetĘ az, hogy mit tekintünk változónak vagy objektumnak. Ez az attribútum-dualitás alapelve. Az attribútumokat (változókat) téglalap alakú táblázatba rendezzük, ez az alapadat mátrix. Az objektumokat elképzelhetjük pontokként egy olyan sokdimenziós térben, melynek tengelyeit a változók adják, ez az ún. n-dimenziós attribútum tér. Szükség lehet az adatok átalakítására is. Ennek oka, hogy az egyes paraméterek más-más mértékegységgel szerepelnek, önmagukban nem mérhetĘk össze. LehetĘség van standardizálásra, vagy transzformációra. A különbség az, hogy az elsĘ esetben az átalakítás az adatokból számított valamilyen statisztika alapján történik, az eljárások adatfüggĘk. A transzformáció típusú módszerek nem az adatokból számított statisztika alapján mĦködnek, nem adatfüggĘk. Az eloszlás normálishoz való közelítésére használhatóak. A vizsgálandó jellemzĘkre átalakítás után valamilyen hasonlóságot, vagy távolságot értelmezünk. A távolság legegyszerĦbb fogalma az euklidészi távolság mely egyenlĘ két pont között meghúzható egyenes szakasz hosszával. Ez az értelmezés kiterjeszthetĘ akármennyi dimenzióra. A mátrix térbeli jelentése ennek átlátásában segít, ha azt n-dimenziós térként képzeljük el, melyben az objektumokat pontok képviselik. Az euklidészi távolságfogalom része a távolságfüggvények csoportjának, amelyeket ha megfelelnek bizonyos matematikai feltételeknek, metrikának nevezünk. A távolságfüggvények közös jellemzĘje, hogy értéke d = 0 két azonos, minden attribútum értékében kölcsönösen megegyezĘ objektum esetén, és annál nagyobb, minél jobban különböznek egymástól. Minél kisebb a távolság két objektum között valamely távolságfüggvénnyel mérve, annál nagyobb a hasonlóság az ekvivalens hasonlóságfüggvény szerint. Az objektumok szimilaritási struktúrájának feltárása után, azokat három alapvetĘ módon osztályozhatjuk. Ezek a következĘk: nem-hierarchikus, hierarchikus és ordinációs osztályozás. A nem hierarchikus osztályozás során elĘre meghatározott számú osztályba próbáljuk besorolni objektumainkat. Egy objektum csak egy osztályba tartozhat. Ez a megközelítés nem vezet célra környezeti adatok elemzéseknél, ezért nem alkalmaztam. A hierarchikus osztályozás az objektumok halmazát úgy osztja részhalmazokra, hogy azok hierarchikusan összefüggĘ rendszert alkotnak, valamint megmutatja az egyes részhalmazok (osztályok) között fennálló kapcsolatokat is. Inkluzív hierarchiában minden részhalmaz részhalmaza nem csak az objektumok teljes halmazának, hanem egy magasabb rendĦ részhalmaznak is. Az osztályozás folyamata alapvetĘen kétféle lehet: agglomeratív, vagy divizív. Az agglomeratív algoritmusok kiindulásképpen minden objektumot külön osztálynak tekintenek, s az egyes lépésekben ezeket az osztályokat páronként vonják össze növekvĘ tagszámú csoportokba a közöttük lévĘ távolság figyelembevételével. Utolsó lépésben minden objektum egy osztályba kerül. A divizív algoritmusok fordítva járnak el: kezdetben az összes objektum egy osztályt alkot, melyet alkalmas módon két osztályra bontunk, ezeket további divízióval még kisebb csoportokra osztjuk fel, ezt addig folytatjuk, míg az egyelemĦ osztályokhoz el nem jutunk. A klasszifikáció számítógépes végrehajtása agglomeratív módszerekkel egyszerĦbb, ezért emellett döntöttem. Ha a klasszifikáció egyes lépései egy kitüntetett tulajdonság szerint hoznak létre csoportokat, akkor az osztályozás

46


monotetikus. Politetikus klasszifikáció esetén több változó együttes hatása alakítja ki a csoportokat. Vizsgálataimban is az utóbbi megközelítés a szerencsés, mivel így lehetĘség nyílt valamennyi paraméter együttes hatásának vizsgálatára. Ebbe a csoportba tartoznak a klaszter analízis típusú eljárások. Ezeknek rengeteg változata létezik, pl.: távolság optimalizáló kombinatorikus, homogenitás optimalizáló kombinatorikus stb. módszerek (PODANI 1997). Irodalmi adatok alapján a csoportátlag módszert (UPGMA, SOKAL és MICHENER 1958; ROHLF 1963) választottam. Ennek elve, hogy két osztály távolságát az összes osztályközi, páronkénti távolság aritmetikai átlagával definiáljuk. Az osztályozás során a távolságok átszámításakor figyelembe kell venni az osztályokban elĘzĘleg egyesített objektumok számát. Az olyan eljárásokat, melyek elsĘdleges feladata a sok dimenzió behelyettesítése kevés számú, de az eredeti adatstruktúrát jól tükrözĘ dimenzióval, GOODALL (1954) nyomán ordináció néven foglalhatjuk össze. A dimenzionálás csökkentése mesterséges változók bevezetésével történik. A többváltozós ordinációs módszerek közé tartozó fĘkomponens-analízis (principal component analysis; PCA) központi szerepet tölt be többváltozós adatstruktúra feltárásban. Kifejlesztése PEARSON (1901) és HOTELLING (1933) munkásságának köszönhetĘ. A fĘkomponens-analízis rendkívüli elĘnye, hogy a pontok közötti távolságviszonyok elemzésén túlmenĘen a változók kapcsolatrendszerének alaposabb értékelésére is alkalmas. Képzeljünk el egy kétdimenziós koordináta rendszerben levĘ pontfelhĘt. Ezekre a pontokra új tengelyt fektetünk úgy, hogy az egybeessen a pontfelhĘ fĘ irányával. Ez már az összvarianciának a jelentĘs hányadát megmagyarázza, míg az erre merĘleges második új tengelyre csak az összvariancia töredék jut. Ezeket az új tengelyeket nevezzük komponenseknek. Másképpen fogalmazva: a pontok helyzetét változatlanul hagyva az eredeti koordinátarendszert egy új koordinátarendszerrel helyettesítjük úgy, hogy az elsĘ új tengely, illetve komponens maximális varianciát sĦrítsen magába, s a lehetĘ legkevesebbet hagyja a második komponensre. Több kiinduló változó esetén is így járunk el. ElĘször a legnagyobb variancia-hányadot lefedĘ komponenst keressük ki, ezt követĘen a megmaradó varianciát legjobban magyarázó másodikat, és így tovább. A komponensek száma tehát nem lesz feltétlenül kevesebb, mint az eredeti változóké volt, a variancia hányadok átrendezése nem jelenti automatikusan a dimenziók számának csökkentését. Az új dimenziók egy része azonban, a rájuk esĘ jelentéktelen variancia-hányad miatt, számunkra érdektelen lesz. Ez a gondolat átvezet az eredmények ábrázolási lehetĘségeihez. Felmerül a kérdés, hogy a valós dimenzionalitáson belül, hány valóban értelmes dimenziónk van, és mennyi az elhanyagolható, csupán sztochasztikus ingadozást magyarázó dimenziók száma? Az ordináció eredményét „biplot” diagramon (kettĘs szórásdiagram) jeleníthetjük meg, mely mind az objektumokat, mind a változókat feltünteti. Ez a koordináták átalakítása után lehetséges. Ennek módja az, hogy a változók koordinátáit beszorozzuk egy alkalmasan megválasztott számmal, hogy a két ordináció felrajzolható legyen. Az átalakítás azért szükséges, mert a változók koordinátáit rendszerint más skálán vesszük fel, mint az objektumokét. Hozzátartozik még az ábrához, hogy a változókhoz az origóból nyilak futnak, megkönnyítve a diagram értelmezését.

Anyag és módszer

47

3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1.

Mintaterületek

3.1.1. Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet mintaterületének jellemzése A Westsik Vilmos-féle talajjavító homoki vetésforgó-tartamkísérlet (6. ábra) parcelláinak rozs (Secale cereale L.), szöszös bükköny (Vicia villosa ROTH) és fehérvirágú édes csillagfürt (Lupinus albus L.) növényeirĘl (7. ábra) – a rizoszférából, illetve rizoplánból – izoláltam nem szimbionta baktériumokat.

6. ábra A Westsik-féle vetésforgó tartamkísérlet (mĦvelt terület Nyíregyháza határában, balra) és a FelsĘ-Tisza vizsgálatba bevont – javarészt bolygatatlan – árterének (jobbra) hozzávetĘleges elhelyezkedése. Forrás: http://www.terkepcentrum.hu (Nyíregyháza), illetve Dr. Zentai László (Kárpát-medence, 1996; ELTE, Informatikai Kar, Térképtudományi és Geoinformatikai Tanszék), utóbbi engedéllyel felhasználva.

a)

b)

c)

7. ábra Rizoszférából izolált baktériumok gazdanövényei: a) Vicia villosa ROTH – JÁVORKA és CSAPODY (1991) nyomán, b) Lupinus albus L., c) Secale cereale L. – saját felvételek

A kísérleti gazdaság talaja kevés kalciumot tartalmazó homokból valamint ezzel keveredĘ karbonátos löszbĘl épül fel. A leiszapolható agyag részaránya 4-6%. A területen a talajképzĘdés fázisában összefüggĘ erdĘ volt, ezért a talajok gyengén humuszosak (LAZÁNYI 1994). A felhalmozódási szintben 2-3 cm vastag, egymástól 30-40 cm távolságban elhelyezkedĘ kovárványos csíkok vannak, így víz- és tápanyag-gazdálkodása a futóhomoknál jobb, mert a kovárványcsíkok kolloidtartalmuknál fogva több nedvességet és tápanyagot tudnak raktározni.

48


A parcellák két Észak-Dél irányban húzódó homokdombon terülnek el, az Érpatakhoz közel, mely a buckaközi mélyedések vizébĘl táplálkozik. A vetésforgó beosztását a 3. táblázat, míg – a mintavétel idĘpontjában érvényes – áttekintĘ térképét a 8. ábra szemlélteti. A talajvizsgálati adatokat az 1997. évre vonatkozóan a 4. táblázatban mutatom be.

3. táblázat A Westsik-féle tartamhatás-kísérlet kezelései a pillangósvirágúak kiemelésével Westsik-féle jelölés

Kezelés, mĦtrágyázás

A vetésforgó sorrendje

I. II. III. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X. XI. XII. XIII. XIV. XV.

Parlag, gyomnövények alászántása, –– FĘvetésĦ csillagfürt zöldtrágyázás, PK Csillagfürt gyökértrágyázás, PK Homokjavítás szalmával, NPK Erjesztett szalmatrágya, NPK Vízzel erjesztett szalmatrágya, NPK Szalmatrágyázás, –– Csillagfürt gyökér- és zöldtrágyázás, PK Pillangós szálastakarmány-termesztés, PK KettĘs takarmánytermesztés, –– Istállótrágyázás, PK ėszi takarmánykeverék-termesztés, PK MásodvetésĦ csillagfürt zöldtrágya, NPK MásodvetésĦ csillagfürt zöldtrágya, NPK MásodvetésĦ csillagfürt zöldtrágya, ––

B, R, P Cs, R, B Cs, R, B B, R, R R, B, R B, R, R R, B, R B, R, Cs B, R, Cs B, Z, R Z, B, R R, B, R B, R, R B, R, R B, R, R

B: burgonya; R: rozs; Cs: csillagfürt; Z: zabos bükköny. Az V. kezelésben mészammonsalétrommal erjesztett szalmatrágyát adnak ki.

4. táblázat A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet talajvizsgálati eredményei (1997). A csillag <mg [100 g talaj]-1 > dimenziót jelöl. Kezelés F-1 F-2 F-5 F-6 F-7 F-9 F-10 F-15

pH H2O 6,2 6,4 6,1 6,5 6,0 6,1 5,8 6,6

pH KCl 6,1 6,2 6,1 6,3 5,7 5,8 5,8 6,4

Víz (%) 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6 9,6

NH4+-N (*) 0,44 2,07 0,60 0,57 0,54 0,51 0,72 0,48

N2O5 (*) 0,025 0,033 0,031 0,031 0,010 0,017 0,005 0,028

NO3--N (*) 0,90 1,61 1,99 1,57 2,33 2,33 2,50 1,64

P2O5 (*) 7,96 8,45 9,17 8,96 8,97 8,01 6,00 7,82

K2O (‰) 182 280 260 269 233 277 247 277

H (%) 1,37 1,42 1,41 1,49 1,44 1,47 1,42 1,45

Anyag és módszer

49

8. ábra A Westsik-féle talajjavító homoki vetésforgó-tartamkísérlet vázlatos alaprajza (Debreceni Egyetem, Agrártudományi Centrum Nyíregyházi Kutató Központja közlése nyomán)

50


3.1.2. A FelsĘ-Tisza vize és árterének talajföldrajzi és vegetációs jellemzése A 2000. évi cianid- és nehézfémszennyezést szállító Szamos folyó Vásárosnamény felett, Jándnál torkollik a Tiszába, ahol a folyó még felsĘszakasz jellegĦ, de lassabb (átlagos vízsebessége 4-6 km h-1). A nehézfémek az élĘ szervezetekben elsĘsorban a bioakkumulációs folyamatok eredményeként fejthetnek ki mérgezĘ hatást. A baktériumok azonban az eukarióta szervezeteknél sokkalta toleránsabbak a cianiddal szemben, illetve sok faj maga is termeli azt, mely tulajdonságot a növénypatogén mikroorganizmusok elleni biológiai védekezésben is felhasználnak. Sok baktérium, pl. egyes Pseudomonas sp. fajok a cianidot C- és N-forrásként képesek hasznosítani (KUNZ et al. 1998). A cianidtartalmú vegyületek megengedett koncentrációi világszinten szabályozottak (5. táblázat). 5. táblázat Cianidtartalmú vegyületek földhasználati kategóriák szerinti, illetve vízben megengedett értékei (Castro et al. 1996)

Cianidformák Szabad CN Összes CN

Háttér 0,25 2,5

Határérték koncentráció (mg kg–1) MezĘgazdaság Lakóövezet 0,5 10,0 5,0 50,0

Ipari terület 100,0 500,0

Víz 100,0 100,0

A talaj- és vízmintákat a FelsĘ-Tisza-vidéki Környezetvédelmi FelügyelĘség által javasolt mintavételi pontokon vettem, ahol – elsĘsorban a reprezentatív vízminták biztosítása érdekében – a sodorvonal gyaloghídon, vagy komppal megközelíthetĘ volt; ezek: Tivadar (705,8 fkm), Aranyosapáti (668,6 fkm, a Szamos torkolata, illetve Vásárosnamény alatt, ahhoz közel), Záhony (613,1 fkm) és Balsa (544,1 fkm). A mintavételi pontok hozzávetĘleges elhelyezkedését a 9. ábra mutatja.

Záhony 613 km Balsa 544 km Tivadar 706 km

Aranyosapáti 669 km 9. ábra Mintavételi helyek a FelsĘ-Tisza mentén. Az eredeti térképet Dr. Zentai László (ELTE, Informatikai Kar, Térképtudományi és Geoinformatikai Tanszék, 1996) készítette; felhasználását engedélyezte.

A talajtípus mindenhol homokos öntéstalaj (Mollic Fluvisol, FAO 1998) volt. Növényvilágát tekintve az ártéri erdĘk és -legelĘk, puhafa ligetek, nádassal borított parti zónák, valamint a mocsarak, láprétek, nedves rétek, ligetek teszik változatossá a terület élĘvilágát. Az ehhez kapcsolódó flóra és fauna igen nagy diverzitást mutat. A FelsĘ-Tiszavidék és a Nyírség agrártájait a félkultúr kaszálók és legelĘk színesítik. A tájat átszelĘ folyók és patakok két oldalán a növénytakaró övezetes-sávos elrendezĘdését figyelhetjük

Anyag és módszer

51

meg. A terület veszélyeztetĘ tényezĘi az erdĘgazdálkodásból és a környezĘ mezĘgazdasági területek kemikáliájából adódnak. JellemzĘ növényfajok a következĘk voltak: Althea officinalis – orvosi ziliz, Bidens tripartitus – subás farkasfog, Cichorium intybus – mezei katáng, Equisetum arvense – mezei zsurló, Galium verum – tejoltó galaj, Lotus corniculatus – szarvaskerep, Lathyrus tuberosus – mogyoróslednek, Poa pratensis – réti perje, Potentilla argentea – ezüst pimpó, Ranunculus acris – réti boglárka, Rumex acetosa – mezei sóska, Salvia nemorosa – ligeti zsálya, Solanum dulcamara – ebszĘlĘ csucsor, Sonchus arvensis – mezei csorbóka, Symphytum officinale – fekete nadálytĘ, Taraxacum officinale – pongyola pitypang és Vicia cracca – kaszanyĦg bükköny. 3.2.

Baktériumok izolálása, azonosítása, tulajdonságai és törzsszelekció

3.2.1. Táptalajok A vizsgálatok során használt táptalajok összetételét az alábbiakban foglaltam össze. A sterilizálás 120 °C-on 20 percig történt. A folyadékkultúrák esetében a tápoldathoz nem tettem agart. A felhasznált segédanyagok (Reanal termékek, pl. agar, élesztĘkivonat, stb.) bakteriológiai tisztaságúak, a többi vegyszer (fĘleg Sigma-Aldrich termék) analitikai tisztaságú volt. Az izoláláshoz és fenntartáshoz használt táptalajokat HORVÁTH (1980) útmutatása alapján készítettem el. A Pseudomonas sp. törzsek sziderofor-termelését a SCHWYN és NEILANDS (1987) által kidolgozott, a Pseudomonas-ok teszteléséhez módosított, krómazurol-tartalmú King’s B szilárd tápközegben történĘ tenyésztéssel vizsgáltuk. A táptalaj összetevĘi 1 liter oldathoz: PIPES [Piperazin-N,N-bisz (2-etánszulfonsav)] 6,0 g NaOH 0,6 g pepton 20,0 g MgSO4×7H2O 1,5 g 1,5 g K2HPO4 10,0 g glicerin 15,0 g agar desztillált vízzel 900,0 ml-re feltöltve festékoldat-1 CAS (Krómazurol S) 60,5 mg 50,0 ml desztillált víz festékoldat-2 FeCl3×6H2O 10,0 mg HDTMA (Hexadeciltrimetil-ammónium-bromid) 72,9 mg desztillált víz 50,0 ml A normál King’s B táptalaj PIPES-t, NaOH-ot és festékoldatokat nem tartalmaz. Ashby-féle nitrogénmentes agar: glükóz 15,0 g MgSO4×7H2O 0,2 g K2HPO4 0,2 g NaCl 0,1 g CaCO3 5,0 g desztillált víz 1000,0 ml agar 15,0 g Oldjuk fel a foszfátot 500 ml vízben. Semlegesítsük (ha szükséges) 1 N NaOH-dal. Adjuk hozzá egyenként feloldva a többi komponenst. Lemezöntés elĘtt oldjuk fel forralással az agart, szĦrés nélkül, idĘnként felrázva, hogy a CaCO3 ne ülepedjen le.

52


Nutrient agar: húskivonat 3,0 g pepton 10,0 g agar 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml; pH: 7,2 Az anyagokat forralással oldjuk fel, majd ha szükséges, vattán szĦrjük meg. Endo-agar: pepton 10,0 g K2HPO4 3,5 g agar 20,0 g desztillált víz 1000,0 ml Oldódás után 100 ml-es üvegekbe fejtük a táptalajt és sterilizáljuk. Használat elĘtt újra felolvasztjuk és a következĘ anyagokat tartalmazó oldatot adjuk hozzá minden 100 ml alaptáptalajra: laktóz, steril 20%-os oldat 5,0 ml NaSO4, steril 5%-os oldat 5,0 ml fukszin, bázikus, 5%-os 1,0 ml (szĦrt etanolos oldat) Keverjük össze alaposan a két oldatot, majd sterilizáljuk 5 percig áramló gĘzben. A táptalaj fényérzékeny, csak sötétben, hĦvös helyen áll el. Tioglikollát tápoldat a natív sejtfehérjék kivonása során alkalmazott minta-elĘkészítéshez HORVÁTH (1980) nyomán, a mucigéltermelés gátlása céljából módosítva: pepton 15,0 g élesztĘkivonat 5,0 g NaCl 5,0 g glükóz 5,0 g 0,15 g Na-tioglikollát L-cisztin 0,75 g desztillált víz 1000,0 ml; pH: 7,4 Sterilizálás elĘtt a tápoldatot vattán szĦrjük meg. Négyszeresére hígított Hoagland-féle növényi tápoldat axénikus kultúrában történĘ növényneveléshez (LÁNG 1994), összetételét a 6. táblázat mutatja: 6. táblázat A négyszeresére hígított Hoagland-oldat összetétele (LÁNG 1994) Vegyület KNO3 Ca(NO3)2 MgSO4 KH2PO4 Fe-EDTA H3BO3 MnCl2 × 4 H2O ZnSO4 × 7 H2O Na2MoO4 × 2 H2O CuSO4 × 5 H2O

Relatív molekulatömeg (Mr) 101,10 236,15 246,46 136,00 346,75 61,83 197,91 287,54 241,95 249,68

Szükséges mennyiség (M dm-3) 1,25 × 10-3 1,25 × 10-3 0,50 × 10-3 0,25 × 10-3 4,00 × 10-6 1,156 × 10-5 4,60 × 10-6 1,90 × 10-7 1,20 × 10-7 8,00 × 10-8

Anyag és módszer

53

A tápoldat összeállításánál ügyelni kell arra, hogy a foszfát oldhatatlan csapadékot adhat a Ca2+ és a Mg2+ ionokkal, ezért ha só formájában adjuk a desztillált vízhez a tápanyagot, akkor meg kell várni, míg minden egyes anyag feloldódik, majd a tápoldat összerázását követĘen mérhetjük be a következĘ tápsót. A mikroelemekbĘl – mivel koncentrációjuk nagyon kicsi – törzsoldatot kell készíteni, s ebbĘl kipipettázni a szükséges mennyiséget.

3.2.2.

Izolálás rizoszférából, talajból és vízbĘl

Rizoszférából történĘ izolálás A Westsik-féle vetésforgó különbözĘ parcelláiban termesztett bükköny, csillagfürt és rozs növények gyökérfelületérĘl (rizoszférájából és rizoplánjából) TEPPER (1945) módszerével izoláltam a baktériumtörzseket. Ásóval kiemelt és folyóvízzel óvatosan lemosott 1 g gyökérmennyiséget 100 ml steril vizet tartalmazó Erlenmeyer-lombikba tettem. A baktériumok lemosása érdekében a lombikot 100 rpm-en 5 percig rázattam. Ezt a folyamatot hatszor egymás után, a gyökérdarabok további hat lombikba való átvitelével megismételtem. A két utolsó lombikba 5-5 g steril kvarchomokot is tettem. A hetedik lemosás után a gyökereket steril dörzsmozsárba tettem, majd homogenizáltam. A kapott szuszpenzióból, valamint a 6. és 7. lemosáshoz használt vízbĘl megfelelĘ hígításokat végeztem. A szuszpenziókból különbözĘ baktériumok számára kedvezĘ, Petri-csészékben elĘkészített Ashby, King’s B, Nutrient, és Endo szilárd táplemezekre steril üvegkaccsal 0,1 ml-t egyenletesen eloszlattam. Az inkubálás 26-28°C-on 24 óráig történt (SIMON et al. 1973). A különbözĘ morfológiájú telepeket szélesztéssel tisztítottam. Az izolált baktériumtörzseket – a törzsek számának csökkentését célzó csoportosítást követĘen – BIOLOGTM módszerrel határoztam meg, mely 95 különbözĘ szubsztrátum oxidálásán alapul (56. oldal). Az elĘbbi módszerrel izolált baktériumtörzseken kívül még negyvennyolc Pseudomonas sp. törzset izoláltam a tartamkísérlet I., IV., VIII. és IX. kezeléseibĘl. Ennek során a King’s B szilárd táptalajon UV-fényben fluoreszkáló pigmentet termelĘ telepeket izoláltam és tisztítottam meg. Az így nyert törzsek közül kiválasztottam a sziderofort termelĘket (26 törzs) és növénypatogén gombákkal szembeni antagonista képességüket vizsgáltam (3.2.7. fejezet). Izolálás talajból és vízbĘl A FelsĘ-Tisza vizébĘl, valamint árterének talajából négy település – Tivadar, Aranyosapáti, Záhony és Balsa – határában vettem mintákat; három ismétlésben, melyekbĘl alapos összekeverést követĘen elegymintákat képeztem. A vízmintákat sodorvonalban, a víz felszíne alatt 20-40 cm-rĘl, az ártéri talajmintákat – steril, 1 cm átmérĘjĦ rozsdamentes acélcsövek és alumíniumlapátok segítségével – ismétlésenként egy 10 m átmérĘjĦ körterületen, a koordináták véletlen kiválasztásával (egyszerĦ véletlen mintavétel, HORVÁTH 1980), 20 és 40 cm mélységbĘl („A” szint) nyertem. Az elegymintákat steril, légmentesen záró patent befĘttesüvegekben – vízminták esetében 1 dm3 Ħrtartalmú, csavaros kupakkal légmentesen záródó sötét színĦ üvegpalackokban –, +4 °C-on (jégakkuval telerakott hĦtĘtáskában) haladéktalanul a laboratóriumba szállíttattam, ahol a minták feldolgozása még aznap megtörtént. A vízmintákból 1–10-6 relatív koncentrációban steril csapvízzel hígítási sort készítettem. A talajmintákat a fentebb említett fúrásos módszerrel, a vízmintavételi hely 50 m-es körzetén belül, a hullámtérben vettem; melyekbĘl elegymintánként 5 g-ot 50 ml steril csapvízben szuszpendáltam, húsz percig szobahĘmérsékleten történĘ rázatás révén

54


(GallenkampTM orbitális inkubátor, 100 rpm), majd e szuszpenziókból 1–10-7 relatív koncentrációban hígítási sort készítettem. Mind a víz-, mind a talajminták hígításaiból 100 μl mennyiséget három ismétlésben Ashby, King’s B, Nutrient és Endo szilárd agaros táptalajokra (90 mm átmérĘjĦ Petri-csészékbe) szélesztettem, a tenyészthetĘ mikroorganizmusok minél szélesebb körének kinyerése céljából. A Petri-csészéket 25 qC-n 24 óráig inkubáltam, majd meghatároztam az egyes lemezeken kialakult telepek számát (CFU ml-1), illetve összesen 314 különálló telepet izoláltam. Az izolátumokat tisztítottam, majd makro- és mikromorfológiai tulajdonságaikat leírtam. Így 202 fenntartható törzset nyertem, melyeket fenotípusos tulajdonságaik alapján csoportosítottam, amibĘl 43 jellemzĘ törzset genotípusos alapon, 16S rDNS módszerrel határoztam meg.

3.2.3.

Az izolált baktériumtörzsek csoportosítása és meghatározása

Baktériumok morfológiai jellemzése A Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából nyert 126 tiszta izolátumot elsĘ lépésben telepmorfológia, majd a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (BUCHANAN és GIBBONS 1974) szerint végzett Gram-festés, valamint az ennek során fénymikroszkóp segítségével megállapított sejtalak (morfológiai típus) szerint rendeztem. A törzsek ezt követĘ, natív fehérjemintázat alapján végzett csoportosítása megerĘsítette, hogy a telep- és sejtmorfológia e törzsek további megkülönböztetéséhez nem alkalmas, mert többségük egymáshoz genetikai szempontból közel álló csoportokat alkot, melyeken belül a telepmorfológia alapján már nem lehet különbséget tenni. A FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából különbözĘ táptalajokon kitenyésztett izolátumokat viszont 16S rDNS nukleotid-szekvenciáik alapján, molekuláris módszerrel azonosítottam, melyet Internetes adatbázisokkal (pl. BLAST és GeneBank) többször ellenĘriztem, ezért itt morfológiai jellemzést nem készítettem. Baktériumtörzsek csoportosítása diszkontinuus natív PAGE módszerrel A natív fehérje-gélelektroforézis, melynek során a lizált sejtek összes fehérjéit tartalmazó minták poliakrilamid gélben futnak (mely a proteineket molekulatömegük szerint különíti el), alkalmas a különbözĘ izolátumok összfehérje-profil alapján történĘ fenotípusos összehasonlítására. Az általam végzett csoportosítás során a Westsik-féle vetésforgóból izolált mintegy 240 eredeti törzsbĘl a laboratóriumi körülmények között értelmezett tenyészthetĘség és telepmorfológiai tulajdonságaik alapján 117-et különítettem el annak céljából, hogy sejtfehérjéik gélelektroforézisben mutatott mintázata szerint csoportosítsam Ęket, így a megegyezĘ mintázatú törzseket azonosnak véve a reprezentatív baktériumtörzsek számát csökkentsem. Natív fehérjék kivonása – A baktériumtörzseket 24 órás (Nutrient ferdeagaron és 26 °C-n inkubált) tenyészetbĘl 10 ml tioglikollát tápoldatot (mely a mucigéltermelést gátolja) tartalmazó kémcsövekbe oltottam át, majd ezeket 24-36 órán át 26 °C-n inkubáltam, a 107108 CFU ml-1 sejtsĦrĦség eléréséig, melyet nem patogén Enterococcus faecalis sztenderddel szemben, spektrofotométerrel (560 nm) állapítottam meg. A sejteket ezután centrifugálással (10.000 g, 10 percig) a kémcsĘ aljára gyĦjtöttem, majd a felülúszó eltávolítását követĘen 0,2 ml TRIS-HCl (0,2 M, pH 7,4) pufferben szuszpendáltam és üveggyöngyök között (kb. 20 mg, 75-110 μm átmérĘvel), mechanikus rázógépben összetörtem (180 rpm, 1 h). A sejtfal és egyéb organellumok maradványait centrifugálással (10.000 g, 10 percig, kétszer ismételve) ülepítettem, majd a felülúszót 250 μl-es Eppendorf csĘbe gyĦjtöttem és 20 mg szacharózt adtam hozzá, mely a minta kellĘ fajsúlyát biztosította. Végül e mintához brómfenolkék oldatot adtam (7. táblázat), mely mint színes, kis molekulatömegĦ, negatív töltéssel

Anyag és módszer

55

rendelkezĘ anyag jelzi az anionfront helyzetét az elektroforézis során. Az elektroforézis során mintánként 40 μl-t pipettáztam a gyĦjtĘgél kamráiba. Elektroforézis – Az elválasztáshoz „Protean II” (BioRad) készüléket használtam, melybe LAEMMLI (1970) módszerét követve 20 cm széles, 16 cm magas és 1,5 mm vastagságú gélt öntöttem (7. táblázat). A fehérjemintákat és a markert HamiltonfecskendĘvel a gyĦjtĘgél kamráinak aljára rétegeztem, majd az elekródákat a tápegységhez csatlakoztatva – a továbbiakban a készülék kézikönyve szerint eljárva – 40 mA áramerĘsség és 150 V feszültség mellett megkezdtem az elektroforézist. Amint a minták a választógélbe léptek, az áramerĘsséget 48-50 mA-ra, a feszültséget 200 V-ra emeltem, melyet minden további órában – összesen négy óra hosszáig – 50 V-tal ismét megemeltem. A második óra elteltével az elektroforézis végéig (4 h) az áramerĘsség fokozatosan 26-26 mA értékre csökkent. Amikor az anionfront a gél aljától kb. 1 cm-es távolságba ért, a feszültséget kikapcsoltam és a fehérjéket festéssel tettem láthatóvá. Markerként molekulasztenderd helyett egy Enterococcus fecalis (BXIII. törzs: Firmicutes, III. osztály: Bacilli, II. rend: Lactobacillales, IV. család: Enterococcaceae, I. génusz: Enterococcus) nem patogén típustörzset alkalmaztam, mert ebben a vizsgálatban nem volt szükség az egyes fehérjék molekulatömegének (akárcsak közelítĘ) meghatározására; a mintázatok közötti különbség és a futásidĘ végének jelzésére egy – a rizoszférában honos baktériumoktól várhatóan filogenetikailag távol álló – eltérĘ faj profilja is elegendĘ volt. Festés és a festék eltávolítása – A gélt MATTARELLI et al. (1993 és 1998) módszerét követve, egy napig 50% (v/v) metanol és 9% (m/v) jégecetben oldott 0,1%-os (m/v) Coomassie Brillant Blue R-250 festékoldatban rázógéppel szobahĘmérsékleten rázattam (90 rpm). Másnap a festék feleslegét a fenti oldószerrel, majd 5% (v/v) metanol és 7% (v/v) ecetsav puffer elegyével mostam ki, szobahĘmérsékleten 15 percig történĘ rázatás révén (90 rpm). Festést követĘen a géleket szabad szemmel értékeltem. A Westsik-féle vetésforgóból, bükköny, csillagfürt és rozs növények rizoszférájából származó megegyezĘ mintázatú törzseket azonosnak véve 56 reprezentatív törzzsel végeztem el a BIOLOGTM tesztet. 7. táblázat A natív PAGE-hez használt elĘkészítĘ oldat, gél és futtató puffer összetétele (m/v %). TEMED: N,N,N’,N’-tetrametil-etiléndiamin. ÖSSZETEVėK Minta-elĘkészítĘ oldat 0,2 M-os TRIS-HCl, pH 7,4 (ml) Szacharóz (mg) 0,2%-os brómfenolkék (ml) Poliakrilamid gél 30% akrilamid – 0,8% bisz- (ml) Desztillált víz (ml) 3 M-os TRIS-HCl, pH 8,8 (ml) 0,5 M-os TRIS-HCl pH 6,8 (ml) cc. TEMED (μl) 10%-os ammónium-perszulfát (μl) Tankpuffer (pH 8,3) TRIS (g) Glicin (g)

MENNYISÉGEK

0,20 20,00 0,04 3,6%-os gyĦjtĘgél

12,5%-os választógél

6,00 6,68 –– 1,88 2,50 –– 30,00 13,50 100,00 30,00 FelsĘ (belsĘ) tank Alsó (külsĘ) tank 3,00 3,00 14,40 14,40 A tankpuffereket desztillált vízzel 1 literre kell feltölteni.

56


Baktériumtörzsek BIOLOGTM módszerrel történĘ azonosítása A rizoszférából izolált baktériumok meghatározására a klasszikus biokémiai tesztek helyett – kivéve az oxidáztesztet (SZEGI 1979 és HORVÁTH 1980), melyben minden törzs pozitív reakciót adott – a BIOLOGTM azonosítási eljárást alkalmaztam (BOCHNER 1989a,b). A módszer 95 különbözĘ szubsztrátum oxidálásán alapszik, melyek egy 96 zsebet magába foglaló platón vannak elhelyezve (8. és 9. táblázat). Minden zseb tartalmaz tetrazólium ibolyát is, mely lehetĘvé teszi, hogy a szénforrás oxidálásának mértékét kolorimetriásan meg lehessen határozni. A reakciókat 4, 16 és 24 órás, 30 °C-n történt inkubáció után olvastam le. A teszt eredményeit vizuálisan is, vagy automata leolvasó segítségével lehet értékelni (javasolt a gyártó által e célra tervezett készülék használata). Számítógépes program határozza meg az egyes törzsek rendszertani besorolását oly módon, hogy a memóriában tárolt, típustörzsekre jellemzĘ, valamint a színreakció eredményeként a platón kialakult mintázatokat korrelációszámítással összehasonlítja, majd az identifikáció eredményét a korrelációs koefficiensek feltüntetésével táblázatosan közli. Általában R 0,950 esetén elfogadhatjuk a számítógép által javasolt faji – de legalább génusz – szintĦ besorolást. A beoltás során a módszer kézikönyve szerint, 108 CFU ml-1 sĦrĦségĦ sejtszuszpenzióból (10 ml, kémcsĘben) minden egyes zsebbe 150 μl-t pipettáztam. A szuszpenzió sĦrĦségét a gyártó által mellékelt transzportoldathoz (T) képest, spektrofotométer segítségével állítottam be (28% T ± 3% a Gram-pozitív, és 52% T ± 3% a Gram-negatív baktériumokhoz, 560 nm), 24 órás tenyészetbĘl kiindulva. A szuszpendáló folyadék gyártó által ajánlott összetétele: 4 g NaCl, 0,3 g Pluronic F-68 (Sigma #P7061) és 0,1 g zselatin (PhytagelTM, Sigma #P8169) 1000 ml desztillált vízben feloldva. E transzportoldathoz a nyálkaburok-képzés megakadályozása végett kémcsövenként 3 csepp – 50 μl – koncentrált Na-tioglikollátot (Biolog #73011) adtam (FRANCO-BUFF et al. 1998).

Anyag és módszer

57

8. táblázat A BIOLOG GN2 MicroPlateTM lemezek szénforrásai A1

A2

A3

A4

A5

A6

víz

dextrin

glikogén

B1

Į-ciklodextrin B2

B3

B4

Tween 40 B5

i-eritritol

D-fruktóz L-fukóz

C1

C2 ȕ-metilDglükozid D2 ciszakonitsav E2

C3

D-galaktóz C4

gentiobióz C5

Dpszikóz D3

Draffinóz D4

citromsav E3

itakonsav F2

Į-ketovajsav F3

Lramnóz D5 D-galakhangya- tonsavlakton sav E4 E5 Į-ketovaleriánĮ-ketoglutársav sav F4 F5

szukcinaminsav G2

glükuronamid G3

alaninamid G4

Dmelibióz D1 ecetsav E1 p-hidroxifenilecetsav F1 brómszukcinsav G1 Lhisztidin H1

hidroxi-L- L-leucin prolin H2 H3

L-ornitin

urokánsav

inozin

timidin

uridin

H4

Tween 80 B6

A7 N-acetilD-galaktózamin B7

A8 N-acetilD-glükózamin B8

Į-Dglükóz C6

minozitol C7

Į-Dlaktóz C8

Dszorbitol D6

szukróz

turanóz

xylitol

D9

D 10

D-galakturonsav E6

D-glükonsav E7

D-trehalóz D8 Dglükózaminsav E8

D-glükuronsav E9

D,Ltejsav F6

malonsav F7

propionsav F8

quinsav

Į-hidroxivajsav E 10 Dszacharinsav F 10

D-alanin

L-alanin

G5

G6

L-fenilalanin H5

L-prolin H6

L-alanilglicin G7 L-piroglutaminsav H7

feniletilamin

putreszcin

2-aminoetanol

2,3glicerol butándiol

D7

A9

A 10

A 11

A 12

adonitol

Larabinóz B 10

Darabitol B 11

cellobióz B 12

maltóz

Dmannitol C 11

D-mannóz C 12 monometilszukcinát D 12

B9 Į-Dlaktózlaktulóz C9

C 10

L-aszparagin G8

F9 Laszpartátsav G9

L-glutaminsav G 10

D-szerin

L-szerin

L-treonin

H8

H9

H 10 D,L-Įglicerolfoszfát

metilpiruvát D 11

ȕ-hidroxi- Ȗ-hidroxivajsav vajsav E 12 E 11 sebaksav F 11 glicil-Laszpartátsav G 11

szukcinsav F 12 glicil-Lglutaminsav G 12

D,Lkarnitin H 11

Ȗ-aminovajsav H 12

glükóz-1- glükóz-6foszfát foszfát

9. táblázat A BIOLOG GP2 MicroPlateTM lemezek szénforrásai A1

A2

A3

A4

A5

A6

víz

Į-ciklodextrin B2

ȕ-ciklodextrin B3

dextrin

glikogén

mannán

B4

B5

B6

Darabitol C2 Į-Dlaktózlaktulóz D2 Į-metilD-mannozid E2

arbutin

cellobióz

D-fruktóz L-fukóz

C3

C4

C5

maltóz

maltobióz D4

DDmannitol mannóz D5 D6

E3

Dpszikóz E4

Draffinóz E5

Lramnóz E6

Dtrehalóz F2 D-tejsavmetilészter G2

turanóz

xylitol

D-xilóz

ecetsav

F3

F4

F5

F6

L-tejsav

Dalmasav G4

Lalmasav G5

metilpiruvát G6

D-alanin

L-alanin

H2

H3

L-alanilglicin H4

L-aszparagin H5

timidin

uridin

L-glutaminsav H6 adenozin-5’mono-P

B1 Larabinóz C1 Į-Dlaktóz D1 ȕ-metilDglükozid E1 Dtagatóz F1 laktamid G1 alaninamid H1

D3 palatinóz

G3

adenozin 2’-deoxi- inozin adenozin

C6

A7 N-acetilD-galaktózamin B7

A8

A9

Tween 40 B8

Tween 80 B9

Dgalaktóz C7 Dmelezitóz D7

D-galakturonsav C8

gentiobióz C9 Į-metilD-galaktozid D9 szedoheptulozán E9

Dmelibióz D8

Į-D-ribóz szalicin

A 10 N-acetilD-glükózamin B 10

A 11 N-acetilD-mannózamin B 11

A 12

D-glükonsav C 10 ȕ-metilD-galaktozid D 10

Į-Dglükóz C 11 3-metilglükóz D 11

minozitol C 12 Į-metilDglükozid D 12

sztahióz

szukróz

Dszorbitol E7 E8 E 10 p-hidroxiĮ-hidroxi- ȕ-hidroxi- Ȗ-hidroxifenilecetsav vajsav vajsav vajsav F7 F8 F9 F 10 monometilpropion- piroszukciszukcinát sav szĘlĘsav námsav G7 G8 G9 G 10 glicil-LL-piroglutamin- glutamin- L-szerin putreszsav sav cin H7 H8 H9 H 10 timidinuridin-5’5’-mono- monofruktózglükóz-1foszfát foszfát 6-foszfát foszfát

amigdalin B 12

E 11

E 12 Į-ketovaleriánĮ-ketoglutársav sav F 11 F 12 N-acetilszukcin- L-glutaminsav sav G 11 G 12 2,3glicerol butándiol H 11 H 12 D,L-Įglükóz-6- glicerolfoszfát foszfát

58


Baktériumtörzsek API 20 NETM módszerrel történĘ azonosítása A Westsik-féle vetésforgó I., IV., VIII. és IX. parcelláiból izolált, King’s B táptalajon UV-fényben fluoreszkáló pigmentet termelĘ baktériumokat az API 20 NETM teszttel próbáltam meg azonosítani Az API 20 NETM módszer (BioMérieux) 21 biokémiaifiziológiai tesztet tartalmaz: nitrátredukció, triptofán deamináció, savképzés glükózból, arginin-dihidroláz- és ureáz-termelés, eszkulin- és zselatin-hidrolízis, glükóz-, arabinóz-, mannóz-, mannitol-, N-acetil-glükózamin-, maltóz-, glükonát-, kaprát-, adipát-, malát-, citrát- és fenilacetát-asszimiláció, valamint oxidáz-termelés. Környezeti mintákból izolált, Gram-negatív, nem bélrendszeri baktériumok azonosítására alkalmas; az eredményeket 24 h inkubációt (26 °C) követĘen hét számjegyben határozzák meg, de gyakran 48 h-s kiértékelésre is szükség van, ez utóbbi kilencjegyĦ. Leolvasása vizuálisan, a kódok megfejtése a gyártó által mellékelt rendszerben történik. A beoltás a BIOLOGTM teszttel azonos módon és mennyiségekkel történt, de itt a speciális transzportoldat helyett a tenyészeteket fiziológiás sóoldatban szuszpendáltam. Baktériumok azonosítása a DNS bázissorrendje alapján – 16S rDNS módszer A FelsĘ-Tisza mentén vízbĘl és talajból izolált, jellemzĘ baktériumtörzseket 16S rDNS módszerrel határoztam meg. DNS kivonása: A tiszta tenyészetek teljes genomi DNS-ét a RAINEY et al. (1996) által leírt módszer szerint vontam ki. A baktériumsejteket NaCl-EDTA pufferben szuszpendáltam, majd egymást követĘ lizozim-, K-proteináz- és SDS-kezeléssel tártam fel. A sejttörmeléket, fehérjét és a poliszacharidokat azonos térfogatrész fenollal és klorformextrakcióval távolítottam el. A DNS-t vizes fázisból, Prep-A-Gene (Bio-RadTM) kit használatával tisztítottam meg. A 16S rDNS régió szelektív amplifikálása PCR-rel: Az adott fajra jellemzĘ 16S riboszomális DNS kb. 1500 bázispár hosszúságú szakaszát amplifikáltam (SAMBROOK et al. 1989). A reakcióelegy 5 μl 10-szeres töménységĦ, MgCl2-os PCR puffert (GeronTM), 10 μl dNTP keveréket (GeronTM), 0.5-0.5 μl primert (27f, 1525r) és 2 μl DNS-t tartalmazott. A végtérfogatot 49.6 μl-re állítottam be HPLC tisztaságú vízzel. 96 °C-on három percig történĘ denaturálást követĘen öt egység (0.4 μl) Taq-polimerázt adtam hozzá. Az amplifikálás GeneAmp 2400PCR típusú (Perkin Elmer, Applied BiosystemTM) hĦtĘfĦtĘkészülékkel történt, a következĘ hĘmérsékleti program alkalmazásával: primer-anelláció 52 °C-on 30 s, enzimes lánchosszabbítás 72 °C-on 60 s, denaturálás 94 °C-on 30 s, mindezt 28 ciklusban, majd 7 percig tartó végsĘ lánchosszabbítás (72 °C). A PCR-terméket minĘségi- és mennyiségi szempontból 1%-os, etidium-bromid-tartalmú agaróz gélben ellenĘriztem, majd Prep-A-Gen kit segítségével megtisztítottam. A 16S rDNS parciális szekvenálása: A szekvenálás Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Perkin ElmerTM) használatával történt. A reakcióelegy 4 μl, AmpliTaqTM polimerázt tartalmazó szekvenáló folyadékot, 2 μl hígító puffert (Perkin ElmerTM), 5 μl PCR-terméket és 7.5 μl HPLC tisztaságú vizet tartalmazott. A reakciót itt is GeneAmp 2400PCR típusú (Perkin Elmer, Applied BiosystemTM) hĦtĘ-fĦtĘkészüléken futtattam, a következĘ hĘmérsékleti profil mellett: 28 ciklus denaturálás (96 °C-on 10 s), primeranelláció 50 °C-on 5 s, lánchosszabbítás 60 °C-on 4 percig. A keletkezett terméket megtisztítottam, majd a nukleotid-szekvenciákat ABI PRISM 310 szekvenáló készülékkel (Perkin Elmer, Applied BiosystemTM) határoztam meg. Az egyes törzseket 16S rDNS szekvenciáik GeneBank adatbázisban (National Center for Biotechnology Information [NCBI], National Library of Medicine [NLM], USA) létezĘ szekvenciákhoz történĘ hasonlítása révén, a BLAST keresĘszoftver 2. verziója segítségével (ALTSCHUL et al. 1997) határoztam meg Az eredményeket legalább 98% szekvencia-hasonlóság esetén fogadtam el faji szintĦ azonosításnak.

Anyag és módszer

59

A jellemzĘ baktériumtörzsek filogenetikai összehasonlítása Az ARB szoftver segítségével a GeneBank adatbázis alapján kapott szekvenciákat a legközelebbi ismert rokonhoz illesztettem, majd az így számított konszenzusszekvenciákból Kimura 2 paraméteres távolságmodellel (KIMURA 1980) távolságmátrixot alkottam. EbbĘl kiindulva a baktériumtörzsek rokonsági viszonyait ábrázoló filogenetikus fát a legközelebbi szomszéd módszerével (SAITOU és NEI 1987) szerkesztettem meg. Az ARB használatával a legtöbb törzs esetében 99- vagy 100%-os biztonságú azonosítást étem el. A meghatározott törzsek sorszámukkal és a megfelelĘ mintavételi hely nevével vannak feltüntetve. A BIOLOGTM teszt esetében a különbözĘ baktériumtörzsek hierarchikus osztályozását a távolság-optimalizáló kombinatorikus módszerekhez (PODANI 1997) tartozó csoportátlag eljárással (UPGMA, SOKAL és MICHENER 1958, valamint ROHLF 1963). végeztem el. E számításmenetben két osztály távolsága az összes osztályközi, páronkénti euklideszi távolság aritmetikai átlagával definiálható.

3.2.4.

A törzsek közvetlen növényi növekedés-serkentĘ hatásának kimutatása

Bioteszt fehér mustár csíranövénnyel A fehérmustár-csíranövényteszt esetében a csíranövények elsĘ leveleinek (1 pár) átmérĘibĘl következtettem a baktérium-törzsek növényi növekedésre gyakorolt hatására (LETHAM 1968). A módszer a hivatkozott irodalom szerint is inkább egyes törzsek – durvább szelekció céljából történĘ – screening-jellegĦ, elĘzetes osztályozására, alkalmas a csírakorban különösen nitrogén- és tápanyagigényes fehér mustár növekedésére gyakorolt hatás révén, ami a vizsgálat értékelése során bizonyítást nyert. E bioteszt egyféle baktérium és egy csíranövény axénikus, kvázi folyadékkultúrában kialakuló kölcsönhatásán alapul. A vizsgálatba 24, a Westsik-féle vetésforgó növényeirĘl izolált reprezentatív baktériumtörzset vontam be. A fertĘtlenített fehérmustár-magokat (3%-os Na-hipoklorit-, majd 70%-os etilalkohololdatban [mind m/v%] történĘ lemosás, 3-szor ismételve) elĘször vizesagaron (HORVÁTH 1980) 36 óra hosszat elĘcsíráztattam, az agarban ez alatt megjelentek az esetlegesen még szennyezett magvakból eredĘ mikroorganizmusok, az ilyen magvakat nem használtam föl a továbbiakban. 90 mm átmérĘjĦ Petri-csészékbe 3 rétegĦ szĦrĘpapírt tettem, melyet a steril, elĘcsíráztatott magok ráhelyezése után elĘször 5 ml, majd naponta 3 ml 108 CFU ml-1 sejtszámú baktérium-szuszpenzióval, amikor az elfogyott, steril csapvízzel öntöztem be a 4 napos inkubációs idĘ végéig (FRENYÓ 1985). A vizsgálatot 8 ismétlésben, azaz Petricsészénként 8 csíranövénnyel végeztem (egy csészét egy törzs szuszpenziójával oltottam), melyek közül az esetleg elpusztult, vagy ki nem hajtott növényeket nem használtam fel. A csíranövények kondícióját a mérést megelĘzĘen szemrevételezéssel értékeltem, melynek során a ki nem hajtott magvakat és a feltĦnĘen gyengén fejlett (a többséghez képest csak feleakkora, turgorát vesztett, klorózisos, vagy nekrotizált) csíranövényeket kiválogattam (és a továbbiakban nem vettem figyelembe); így végül kezelésenként (Petri-csészénként) 5-5 fehérmustár csíranövény levélátmérĘjét mértem meg 0,5 mm pontossággal. A relatív növekedési arányt (N%) a levélkék legnagyobb oldalsó kiterjedésének mérésével a következĘk szerint fejeztem ki: N% = {(x – x0) / x0) ×100}, ahol N% a relatív növekedési arány, x az aktuális levélátmérĘ átlagos értéke a kezelt csíranövények esetében, x0 pedig a kontroll-növények levélátmérĘjének átlagos értéke.

60

3.2.5.


Nitrogénkötés meghatározása

Nitrogénkötés kimutatása laboratóriumi bioteszttel A nitrogénkötĘ aktivitás meglétének egyszerĦ – screening-jellegĦ – kimutatása érdekében a fenti 24, reprezentatív baktériumtörzset oltottam agarba-merült tenyészetként N-mentes (valójában N-szegény) Ashby-féle táptalajra 3 ismétlésben (HORVÁTH 1980). A ferdeagaron fenntartott törzseket 5 ml steril fiziológiás sóoldatban szuszpendáltam, majd e szuszpenzió 10-7 léptékĦ hígításából 100 μl-t cseppentettem a Petri-csészébe, erre 40 °C-s táptalajjal lemezöntést végeztem, miközben a szuszpenziót a táptalajban (a csésze körkörös mozgatása révén) alaposan elkevertem. Hét napos inkubációs idĘ alatt (26 °C-n) az agarba merült telepek körül megfigyeltem a nem opálos zónák (körgyĦrĦk) kialakulását. Ahol a táptalaj kitisztul, ott növekedés, anyagcsere van (a termelt savak „elfogyasztják” a táptalajban levĘ CaCO3-ot), tehát – mivel a táptalaj elvileg N-mentes – N-kötés is valószínĦ. EllenĘrzés a hét nap alatt naponta, kiértékelés a hetedik nap után szemmel, igen-vagy-nem válasszal történt. A tiszta zónák átmérĘje alapján a törzsek között nem lehetett szignifikáns különbséget kimutatni. A módszer jellege, hogy a lemezöntés, majd az inkubáció során a táptalajba ammónia – mely még a laboratórium levegĘjében is jelen van – diffundálhat, ezért a rendszer elsĘsorban oligonitrofil mikrobák teszteléséhez, illetve kimutatásához alkalmas. Tipikusan anaerob nitrogénkötĘ baktériumok izolálása céljából ajánlják, anaerob gázfejlesztĘ rendszerben, mely azonban nem állt rendelkezésemre. Marino-lemezes technikát alkalmazva – midĘn a lemezöntést a törzs-szuszpenzióval a Petri-csésze felfordított fedelében hajtjuk végre, majd a megszilárduló agarba belenyomjuk a csésze lefelé fordított alsó részét (HORVÁTH 1980, ELTE Mikrobiológiai Tanszék, szóbeli közlés) – viszont az agarba merült tenyészetek a levegĘ oxigénje elĘl anaerob edény használata nélkül is többékevésbé el vannak zárva; a módszer így a fakultatív anaerob Pseudomonas sp. törzsek esetében is viszonylag megbízható eredményt ad. Nem Pseudomonas baktériumtörzsek esetében (RUPPEL 1987) az eljárást úgy módosítottam, hogy normál lemezöntést követĘen a tenyészeteket bonctĦvel szúrtam a megszilárduló táptalajba, majd a Petri-csészék szélét kívülrĘl parafilmmel zártam le. A vizsgált törzsek ily módon oxigénszegény, de nem -mentes környezetbe kerültek, melyet a legtöbb izolátum (Gammaproteobacteria és Firmicutes) jól tolerált. Minden esetben – a Marino-lemezes módszernél is – fontos volt azonban, hogy a légtérbĘl az ammónia táptalajba történĘ diffúzióját megakadályozzam, ezért a Petri-csészéket közvetlenül egy P2O5-ot és külön üvegtálban tömény kénsavat (mely az ammóniával ammónium-szulfáttá egyesül) tartalmazó szárítóedénybe (exszikkátor) helyeztem, majd a lezárt szárítóedényt állítottam a termosztátba. E vizsgálat során, referált elĘzmények híján – talán OLÁH (1983) kivételével, aki széles körĦ mérésekkel vizsgálta élĘvizeink N2-kötését – csak feltételeztem, hogy adott körülmények között a rizoszférában asszociált, illetve szabadon élĘ, nem Azospirillum, vagy Azotobacter sp. baktériumok is köthetnek légköri nitrogént, késĘbb azonban ezt a jelenséget több kutatócsoport – pl. EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH (2003), valamint ÇAKMAKÇI et al. (2005) – is leírta. Nitrogénkötés meghatározása az acetilén-redukciós aktivitás mérésével A N2-kötés intenzitását gázkromatográfiásan, az ún. acetilén-redukciós (ARA) teszttel (DILWORTH 1966, KARDOS 1983) igen pontosan lehet mérni (a módszer 103 – 104-szer érzékenyebb a 15N-eljárásnál). A teszt lényege, hogy az acetilén gátolja a nitrogenázenzimrendszer N2-kötését, ugyanakkor a nitrogenáz képes az acetilént etilénné redukálni. A képzĘdött etilén gázkromatográfiásan meghatározható. A módszer felhasználási területe a nitrogenáz biokémiai vizsgálatától a N2-kötĘ organizmusok élettanának tanulmányozásán, a

Anyag és módszer

61

talajban, élĘvizekben, rizoszférában, filloszférában, sĘt az emlĘsök emésztĘrendszerében végzett laboratóriumi elemzéseken át a szabadföldi mérésekig terjed. A fent említett huszonnégy reprezentatív, Westsik-féle vetésforgóból származó baktériumtörzs acetilén-redukciós aktivitását a HARDY és KNIGHT (1967) által leírt GCFID módszert követve, annak RÓĩYCKI et al. (1999) szerinti módosításával határoztam meg. 14 mm × 100 mm méretĦ, Ashby-féle ferdeagart (8 ml) tartalmazó üvegedényekben 24 órás tenyészetek fölé – steril szérumpalack-dugóval történt lezárás után – 10 v/v% acetilént adtam a mintához, majd 30 °C-n újabb 24 óráig inkubáltam. Ezt követĘen a minták fölötti gáztérbĘl 1 cm3-t injektáltam a gázkromatográfba, mellyel a képzĘdött etilén mennyiségét mértem. A készülék Hewlett-Packard 5890 A típus volt, 2 m × 1,8 mm méretĦ Porapak R oszloppal szerelve, 70 °C fĦtĘtér-hĘmérséklettel. Az injektor és a láng-ionozációs detektor (FID) hĘmérsékletét 100 °C-ra állítottam be, a N2 vivĘgáz sebessége 40 cm3 min-1 volt. A törzsek nitrogenáz-aktivitását a kultúránként és óránként képzĘdött etilén mennyiségével (nM) fejeztem ki, melyet módosított MÃRTENNSON (1993) egyenlet alapján számítottam: A = [%C2H4 × (PV/RT) × 10-7] / 24, (1) ahol A: nitrogenáz-aktivitás [nM C2H4 / tenyészet / h], %C2H4: az etilén-csúcsterület százalékban, P: légköri nyomás (§ 1,0 MPa), V: a tenyészethez injektált acetilén térfogata (cm3), R: egyetemes gázállandó, T: hĘmérséklet °K-ban (= 273 + °C).

3.2.6. Növényi hormonok termelésének kimutatása biotesztben Negyvenhét, Gram-negatív és Gram-pozitív, zömmel pálcika alakú, a Westsik-féle homoki vetésforgó-tartamkísérletben (Nyíregyháza) termesztett bükköny és csillagfürt növények 1/ rizoszférájából, illetve rizoplánjából (18 törzs: Staphylococcus sp. W.6, W.13, S. cohnii ssp. cohnii W.9, Bacillus sp. W.7, W.10, W.14, W21, Bacillus megaterium W.15, W.18, Bacillus subtilis W.32, Corynebacterium sp. W28, Pseudomonas vesicularis [újabban Brevundimonas vesicularis, GARRITY et al. 2004] W20, Pasteurella sp. W.30, W.31, Pseudomonas sp. W.1, W.36, Pseudomonas corrugata W.34, W.35), valamint a 2a/ FelsĘTisza ártéri talajából (8 törzs: Pseudomonas syringae I.110, Pseudomonas sp. I.401, II.109, II.407, VI.87, VI.404, VI.405, VII.101), 2b/ parti talajából (9 törzs: P. azotoformans III.118, P. jensenii III.119, Pseudomonas sp. III.103, III.106, III.108, V.104, VIII.97, VIII.102, VIII.120) és 3/ felszíni vizébĘl (12 törzs: Aeromonas media A.66, A.89, A.92, A.93, A.94, Pseudomonas gessardi B.83, Bacillus thüringiensis C.69, C.107, Pseudomonas sp. C.115, C.116, D.94, Pseudomonas veronii D.111), különbözĘ mintavételi helyekrĘl – Tivadar, Aranyosapáti, Záhony, Balsa – származó baktériumtörzset vontam be a vizsgálatba. A PGR hatást LETHAM (1968) módosított félkvalitatív módszerével, búza jelzĘnövénnyel detektáltam sztenderd mennyiségĦ (100 mg l-1) auxinnal és gibberellinnel (GS3) szemben. A vizsgálatot a fehér mustár csíranövénnyel végzett teszttel analóg módon állítottam be, de itt szĦrĘpapírkorongok helyett nitrogénmentes tápsóoldatot (HORVÁTH 1980) alkalmaztam. Ezt egy literre vonatkoztatva 3 g húskivonattal, 10 g peptonnal, valamint 10 g agarral és 100 mg DL-triptofánnal (SARWAR és KREMER 1995), illetve mevalonsavval (melyek sorrendben az auxin, illetve gibberellin prekurzorai) egészítettem ki; a baktériumok szaporodásának és a hormonjellegĦ anyagcseretermékek termelésének elĘsegítése céljából. A kontroll csíranövények táptalajába húskivonat és pepton helyett a sztenderdeket tettem és a triptofánt, illetve mevalonsavat elhagytam. Hét nap szobahĘmérsékleten történĘ inkubáció után a csíranövények gyökérkezdeményeinek mennyiségét és tömegét, valamint a hajtáskezdemények hosszát és tömegét megmértem, majd a baktériumtörzsek hatását (a sztenderdekhez és egymáshoz képest) értékeltem.

62


3.2.7.

A baktériumok növényi növekedés-serkentĘ tulajdonságának vizsgálata

Sziderofor-termelés meghatározása Negyvenhét Pseudomonas sp. törzs sziderofor-termelését a SCHWYN és NEILANDS (1987) által kidolgozott, a Pseudomonas-ok teszteléséhez módosított, krómazurol-tartalmú King’s B szilárd tápközegben történĘ tenyésztéssel vizsgáltuk. A módszer lényege, hogy a szideroforok a vas (III) ionhoz való igen nagy affinitásuk okán szerkezetüktĘl függetlenül kimutathatók. A folyamat a következĘ kémiai egyenlettel írható le: FeFest3–Ȝ + Lk– ĺ FeL3–k + Fest Ȝ–,

(2)

ahol L: erĘs ligandum (pl. sziderofor), Fest: festékanyag. Az élénk színĦ vas-festék komplexhez erĘs ligandumot (pl. sziderofort) adunk. Amikor a vas–ligandum komplex kialakult, akkor a festékanyag felszabadulását színváltozás (mélyebb, vagy világosabb narancssárga szín megjelenése) kíséri. Ha ligandumként EDTA-t használunk, akkor a színváltozás a komplexometriás titrálás átcsapási pontja közelében jelenik meg (SCHWARZENBACH és FLASCHKA 1969). A folyékony King’s B kultúrában nevelt, 24 órásnál nem idĘsebb sziderofor-termelĘ törzseket 5 μl-es foltokban hatosával, egymástól egyenlĘ távolságra oltottam az agarlemezekre. A minél kisebb telepátmérĘk érdekében a frissen elkészített táptalajokra csak három nap elteltével oltottam rá a törzseket. A 48 órás 28 °C-on végzett inkubáció eltelte után az eredetileg kék táptalajon a telepek körül megjelenĘ narancssárga színĦ gyĦrĦ átmérĘjének mérésével végeztem a kiértékelést, melynek során a legnagyobb gyĦrĦt indukáló baktériumtörzs aktivitását 100%-nak vettem, a többi törzset pedig ehhez hasonlítottam és aktivitásukat szintén százalékban fejeztem ki. Mivel sziderofor-termelĘ képességük a növénypatogén gombákkal szemben kifejtett antagonizmus komplex vizsgálata során a fĘkomponens-analízis (PCA) egyik faktorát képezte, a relatív aktivitásértékeket más statisztikai próbával nem rangsoroltam. Növénypatogén gombákkal szembeni antagonizmus A Westsik-féle homoki vetésforgó-tartamkísérlet különbözĘ kezeléseibĘl izolált Pseudomonas sp. baktériumtörzsek eredetét a 10. táblázat tartalmazza. A törzsek az elĘzetes vizsgálatok alapján a P. aeruginosa fajhoz, valamint a P. fluorescens-putida csoportba tartoztak, mely utóbbiak pontos azonosítása az API 20 NETM módszerrel nem volt lehetséges. Két törzs mindenesetre – P65 és P80 – nagy valószínĦséggel a P. putida faj képviselĘje. 10. táblázat A PGPR tulajdonságra vizsgált Pseudomonas sp. törzsek kódja és származási helye Pseudomonas sp. I. nem mĦvelt P. aeruginosa Fluorescens-putida típus

A Westsik-féle tartamkísérlet kezelései* IX. istállótrágya IV. szalma VIII. gyökér(26,1 t / ha / 3 év) (26,1 t / ha / 3 év) és zöldtrágya

A10; AX

A5/2; A35; A20

A6; A9; A34

16; 23/1; 28a; 30/2; 36

F1; F2

F4; F8; F12

F15; F22; F38

F41; F44; F47; P65; P80

*A kezelésekben a következĘ mĦtrágyaadagokat alkalmazták: IV = 50 kg·ha–1 P és 16,2 kg·ha–1 K VIII = 50 kg·ha–1 P és 16,2 kg·ha–1 K IX = 50 kg·ha–1 P és 16,2 kg·ha–1 K

Anyag és módszer

63

A tesztelt növénypatogén, mikroszkopikus gombák a következĘ fajok képviselĘi voltak: Rhizoctonia solani (Kühn) DSM No.843 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany) = ATCC 13289 (American Type Culture Collection) és a Fusarium solani F.00715 (MezĘgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok GyĦjteménye, Szent István Egyetem, Budapest). A baktériumtörzseket egyesével teszteltem a gombák micélium-növekedésére gyakorolt gátló hatás szempontjából. A vizsgálatok szilárd maláta- és élesztĘ-kivonatos tápközegben kerültek beállításra (élesztĘkivonat 3,0 g, malátakivonat 3,0 g, pepton 5,0 g, glükóz 10,0 g, agar 20,0 g; 1 liter ioncserélt vízben feloldva), két különbözĘ technikát alkalmazva: a) Egy baktériumtörzs kétkacsnyi tenyészetét (24 h inkubációt követĘen) 90 mm átmérĘjĦ Petri-csésze átellenes széleire helyeztem egymással szemben (pontoltás). A növénypatogén gomba tenyészetét tartalmazó 1 db, 5 mm átmérĘjĦ agarkorongot pedig a csésze közepén helyeztem el. b) A baktérium-szuszpenziót a tápközeg felületére szélesztettem (szélesztés). A növénypatogén gomba tenyészetét tartalmazó 1 db, 5 mm átmérĘjĦ agarkorongot ismét a csésze közepén helyeztem el. A módszert a tápközeghez vasat – Fe(III): 0,01 g FeCl3×6H2O l-1 – adagolva is megismételtem. Ez utóbbi során a sziderofor-termelés révén fellépĘ tápanyag-kompetíciót ki lehet oltani.

A növénypatogén gombák és az antagonista baktériumok mindegyik kombinációját 3 párhuzamos ismétlésben, 26-28 qC hĘmérsékleten inkubáltam. 8 nap múltán a gombatelepek átmérĘjét lemértem. A baktériumok gátló hatásának megállapításához kiszámítottam a gátlási arányt, melyet [GA %]-kal jelöltem. A pontoltás esetében: GA% = (K – R) / K × 100; ahol K = a tesztelt gomba kontroll-telepének átmérĘje (mm), R = a baktériummal együtt, ellipszoid formában növekedĘ gombatelep rövidebb átmérĘje (mm). Szélesztés esetében: GA% = (K – B) / K × 100; ahol „B” a vizsgált patogén gomba baktériummal együtt növekedĘ telepének (ez közelít a körformához) átmérĘje (mm), „K” a tesztelt gomba kontroll-telepének átmérĘje (mm).

3.2.8.

Néhány környezeti tényezĘ reprezentatív baktériumtörzsekre gyakorolt hatásának felmérése

A FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek cianid- és nehézfémtĦrésének meghatározása A baktériumok csíraszámát (CFU ml-1) szilárd táptalajon történĘ, módosított telepszámlálással állapítottam meg. A módszer lényegében hasonló az MPN meghatározáshoz; a baktérium-szuszpenziót azonban nem szélesztéssel, hanem pontoltással visszük a táptalaj felületére (ANGERER et al. 1998). Az egyes mintavételi helyekrĘl származó izolátumok darabszámát szintén feljegyeztem. A cianiddal-, illetve különbözĘ nehézfémekkel szembeni érzékenységi tesztek a következĘ vegyületekkel és koncentrációkban zajlottak: KCN, Zn(NO3)2, Cu(NO3)2 és Pb(NO3)2: 1, 5, 10, 100, 200, 300 mg l-1; Pb(NO3)2: az elĘbbieken felül 450, 600 mg l-1; a szennyezéskor kialakult koncentrációknak megfelelĘen, illetve azokat meghaladóan. A vegyületek baktériumok szaporodására gyakorolt hatását folyékony Nutrient tápoldatban, 28 °C-n 24 óráig tartó inkubálást (rázatott kultúra, 90 rpm) követĘen, a turbidimetria elvén – kezeletlen (baktériumot nem tartalmazó) kontrollal szemben – spektrofotométerrel (560 nm) határoztam meg. MARTENSSON (1992) szerint a Cu2+ és Zn2+ ionok hatásmódja erĘsen függ az alkalmazott vizsgálati módszertĘl is, így pl. az agart

64


tartalmazó táptalaj erĘsen adszorbeálhatja azokat, ezzel kiegyenlíti, tompítja hatásukat. Megállapítását figyelembe véve és könnyebb kivitelezhetĘsége miatt – a további toleranciavizsgálatok során is – a folyékony táptalajjal végzett, mikrofermentoros módszert alkalmaztam. A FelsĘ-Tisza területérĘl és a Westsik-vetésforgóból származó, szelektált baktériumtörzsek nehézfémtĦrésének maghatározása Negyvenhét Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumtörzset különítettem el a Westsik-féle homoki vetésforgó-tartamkísérletben (Nyíregyháza) termesztett bükköny és csillagfürt növények 1/ rizoszférájából, illetve rizoplánjából (18 törzs), valamint a 2a/ FelsĘTisza ártéri talajából (8 törzs), 2b/ parti talajából (9 törzs) és 3/ felszíni vizébĘl (12 törzs), különbözĘ mintavételi helyekrĘl származó izolátumok közül. A megelĘzĘ eredmények alapján tizenhárom baktériumtörzset választottam ki további vizsgálatok céljára: Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas corrugata W.34, Pasteurella sp. W.30, Pseudomonas sp. W.37, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas sp. C.115, Pseudomonas syringae I.110, Pseudomonas veronii D.111, P. veronii III.119 és P. veronii VI.404, Bacillus sp. W.7, Bacillus thüringiensis C.69, valamint B. thüringiensis III.108. A kiválasztott törzsek érzékenységét – a tápoldatban történĘ szaporodás mérése révén – a következĘ nehézfém-vegyületekkel szemben vizsgáltuk: ZnCl2, Zn(NO3)2, CuCl2, Cu(NO3)2, CuSO4, Pb(NO3)2, (NH4)6Mo7O24, Fe(III)Cl3, Fe(II)SO4, Fe(III)(NO3)3. Alkalmazott koncentráció-dózisok: 50, 100, 200, 400, 800 és 1600 μM voltak – a 2000. évi tiszai szennyezésnek, valamint extrém terhelésként az akkori maximum kétszeresének (800 és 1600 μM) megfelelĘ koncentrációban. A nehézfém-vegyületeket a Környezetvédelmi és Területfejlesztési – ma: Környezetvédelmi és Vízügyi – Minisztérium (http://www.ktm.hu), valamint FLEIT és LAKATOS (nem publikált adatok) beszámolói alapján választottuk ki. A vegyületeknek a baktériumok szaporodására kifejtett hatását rázatott (90 rpm) folyékony Nutrient tápoldatban (28 °C, 24 h), a turbidimetria elvén kezeletlen (baktériumot nem tartalmazó) kontrollal szemben, spektrofotométerrel (560 nm) mértem meg. Nehézfémek oligodinámiás hatásának vizsgálata A nehézfémek egy csoportja (ezüst, réz, cink, higany, molibdén) még igen nagy hígításban is toxikus hatást fejt ki a mikroorganizmusokra. Ezek a fémek és vegyületeik a koncentrációtól függĘen a magasabb rendĦ élĘlényeknél is súlyos mérgezést okozhatnak, ezért e fémek szelektált, növényoltásra alkalmas baktériumtörzsekre kifejtett oligodinámiás hatását külön is megvizsgáltam. A törzsek érzékenységét a fentiekben is vizsgált fémvegyületekkel szemben határoztam meg: ZnCl2, Zn(NO3)2, CuCl2, Cu(NO3)2, CuSO4, Pb(NO3)2, (NH4)6Mo7O24, Fe(III)Cl3, Fe(II)SO4, Fe(III)(NO3)3. E vegyületeket az alábbi koncentráció-tartományokban alkalmaztam: 25, 50, 100, 200, 300, 400 μM (szulfátok) és 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 μM (nitrátok és kloridok). A vizsgálatokat folyékony Nutrient táptalaj (tápleves) felhasználásával, 24 órás, 26-28 ºC-on történĘ inkubálással, három ismétlésben végeztem el. A tenyészeteket tartalmazó tápoldat abszorbanciáját spektrofotométerrel (560 nm) mértem. Megállapítottam a fémvegyületek törzsek által tolerált maximális koncentrációit (MTC, BÅÅTH 1989) is; így a baktérium képviselĘket ellenálló-képességük alapján csoportosítottam. Bár a vizsgálatba bevont, laboratóriumi módszerekkel szelektált törzsek jellemzĘen két eltérĘ rendszertani csoporthoz (Proteobacteria, illetve Firmicutes) tartoznak, az összehasonlítás során nem találtam szignifikáns különbséget az egyes képviselĘk egymáshoz viszonyított toleranciájában, adott fémvegyület és koncentráció esetén. Ezért az értékelés során e

Anyag és módszer

65

baktériumokat a vizsgált vegyületek, illetve koncentrációk szerint csoportosítottam és MTCértékeik eszerint értelmeztem.

3.2.9.

A szelektált baktériumtörzsek és gazdanövények in vivo kölcsönhatásának vizsgálata A baktériumtörzseket Nutrient tápoldatban 108 CFU ml-1 sejtszám eléréséig szaporítottam, amely 24-36 óra inkubációs idĘnek felel meg 26 °C hĘmérsékleten. A felületén fertĘtlenített növényi magvakat úgy oltottam be a baktériumokkal, hogy azokat a tápközeg szuszpenzióba mártottam. E vizsgálathoz a Westsik-féle tartamkísérletbĘl, rizoszférából történt izoláláshoz kiválasztott növényeket – szöszös bükköny, fehérvirágú csillagfürt és rozs – alkalmaztam. A növényeket 2,5 kg-os tenyészedényekben, azaz mĦanyag (polipropilén; PP) virágcserepekben, fénykamrában neveltem. A nevelĘ közeg kvarchomok (d = 0,6 mm) és perlit 4:1 arányú keveréke volt. Minden egyes tenyészedénybe 8 db, felületén fertĘtlenített rozs, bükköny és csillagfürt magot vetettem, majd az edényeket a 40 napig tartó vizsgálat idĘtartama alatt naponta felváltva kétszer, a homoktalaj szántóföldi vízkapacitásának 60 %ára öntöztem Hoagland-oldattal, illetve sterilizált csapvízzel. A fénykamrában a csírázáshoz legmegfelelĘbb, 20.000 lx hosszúnappalos megvilágítást alkalmaztam. Ennek során a megvilágított idĘszak hossza 16 h volt, az elsĘ két órában 22 °C, a harmadik órától a 14. óra végéig 25 °C, majd két óra hosszat ismét 22 °C; mellyel a reggel, nappal és este enyhe hĘmérsékleti változásait igyekeztem szimulálni. A sötét idĘszak hossza 8 h volt, melynek során végig 15 °C hĘmérsékletet biztosítottam a fénykamrában. A nevelési idĘszak leteltét – 40 napot – követĘen a tenyészedényekbĘl a növényeket kivettem, a gyökér és a hajtás felületét a rátapadt közegtĘl megtisztítottam, majd e mintákat szobahĘmérsékleten, szĦrĘpapír között 24 h ideig szárítottam. Ezt követĘen a növények fĘgyökerének (pillangósok), illetve gyökereinek (rozs) és hajtásának hosszát (mm), valamint tömegét (g) külön megmértem, 0,5 mm-es, illetve 0,01 g pontossággal. Ezen kívül a pillangósok esetében feljegyeztem a fĘgyökérbĘl induló elágazások és a hajtáselágazások számát, valamint a rozs esetében a gyökerek és az egy magból kelt hajtások számát. Az oltott növények paramétereit a kezeletlen kontroll százalékában fejeztem ki, ezek az adatok képezték alapját a statisztikai feldolgozásnak. 3.3.

A vizsgálatok során alkalmazott statisztikai módszerek Bioteszt fehér mustár csíranövénnyel – Az egyes baktériumtörzsek csíranövények növekedésére kifejtett (esetenként serkentĘ) hatása közötti különbséget egyszeres osztályozásra épülĘ variancia-analízissel (ANOVA, analysis of variance) mutattam ki (MANCZEL 1983, KEMÉNY és DEÁK 2000). A nullhipotézis az, hogy az egyes baktériumtörzsek hatására kialakult átlagos levélátmérĘk a vizsgált törzsek szerint nem különböznek. A varianciabecslés eredményeként a nullhipotézist P = 95% megbízhatósági szinten F-próbával értékeltem, majd a szignifikáns különbségek közt meghatároztam a statisztikailag igazolható eltérés mértékét (SzDP95%). Nitrogénkötés meghatározása az acetilén-redukciós aktivitás mérésével – A reakció (nitrogenáz enzimrendszer mĦködése) során képzĘdött etilén mennyiségét minden vizsgált baktériumtörzs esetében külön megmértem, majd az egyes törzsek aktivitása közötti különbségeket egytényezĘs variancia-analízissel, a nullhipotézist P = 95% és P = 99% szinten F-próbával értékelve állapítottam meg, majd meghatároztam a szignifikáns differencia értékét is (SzDP95% és SzDP99%).

66


Növényi hormonok termelésének kimutatása bioteszttel – A törzsek növényi növekedést befolyásoló hatását egymáshoz és a kezeletlen kontroll növényekhez képest kétszeres osztályozásra épülĘ variancia-analízissel (MANOVA, multifactor analysis of variance) határoztam meg. A nullhipotézis az volt, hogy az egyes baktériumtörzsek hatására, valamint a 100 ppm auxin-, illetve gibberellin-sztenderd által indukált növekedés (gyökérkezdemény mennyisége és tömege, valamint a hajtáskezdemény hossza és tömege) az összes csíranövény esetében azonos. A varianciabecslés eredményeként a nullhipotézist P = 95% szinten F-próbával értékeltem, majd a szignifikáns különbségek közt – a törzsek és a növényi részek vonatkozásában külön-külön – meghatároztam a statisztikailag igazolható eltérés mértékét (SzDP95%). Növénypatogén gombákkal szembeni antagonizmus – A vizsgált baktériumtörzsek gátló aktivitását (GA%) egytényezĘs variancia-analízissel értékeltem. A nullhipotézis az volt, hogy a baktériumtörzsek által a gombák telepnövekedésére kifejtett gátlás az egyes törzsek szerint nem különbözik. A varianciabecslés eredményeként a nullhipotézist P = 95% szinten F-próbával értékeltem, majd az egyes törzsek mérési adataiból minden oltási módszer esetében kétoldali megbízhatósági intervallumot (konfidencia-intervallumot, KEMÉNY és DEÁK 2000) számítottam P = 95% valószínĦségi szintre, melyet az eredmények értékelése során grafikusan ábrázoltam. A sziderofor-termelĘ Pseudomonas sp. baktériumtörzsek eredete, sziderofor-termelése és antagonista hatása között a többváltozós ordinációs módszerek közé tartozó fĘkomponensanalízis (principal component analysis; PCA) segítségével kerestem összefüggést. A SYNTAX 2000 program (PODANI, 1997) által generált „biplot” diagram értelmezése a következĘ elv alapján történik: a feketével jelölt feliratok az objektumok, a kékek a változók. A változókhoz (paraméterekhez) az origóból piros színĦ szakaszok futnak. Ha egy objektumot reprezentáló pont rajta van egy adott paraméterhez vezetĘ piros szakaszon, akkor azon objektum elválása esetében az illetĘ paraméter a legmeghatározóbb, ez természetesen lehet egyszerre több is. Ha a szakasz az adott objektumhoz tart, de az nincs rajta a szakaszon akkor a szakasz, valamint az adott pont és az origó között húzott képzeletbeli vonal által bezárt szög jelzi, hogy mely paraméter(ek) meghatározó(ak) az objektum elválásában. A kis szög szorosabb kapcsolatot jelez, a nagyobb lazábbat. KülönbözĘ mintaterületekrĘl származó baktériumok cianid- és nehézfémtĦrése – A törzsek érzékenységét a kezeletlen kontroll százalékában fejeztem ki és az egyes törzsek közötti eltéréseket egyszeres variancia-analízissel határoztam meg (P = 95%). A szignifikáns differencia értékét Statgraphics 5.1 szoftver segítségével határoztam meg. Ugyanígy jártam el különbözĘ vegyületekben adagolt nehézfémek oligodinámiás hatásának értékelése során is. A nehézfémekkel szembeni tolerancia értékelése során a baktériumtörzseket csoportátlag módszerrel (SOKAL és MICHENER 1958; ROHLF 1963) hierarchikusan is osztályoztam, és a legellenállóbb, valamint a sorrendben következĘ (nem sokkal kisebb toleranciájú) csoportból választottam ki reprezentatív törzseket további vizsgálat céljára. Szelektált PGPR baktériumtörzsek és növények in vivo kölcsönhatása – Az egyes törzsek növényi növekedésre (a gyökér, illetve a hajtás hosszára, mennyiségére és tömegére) gyakorolt hatását a kezeletlen kontroll százalékában fejeztem ki és növényfajonként egyszeres variancia-analízissel értékeltem. A nullhipotézis szerint az egyes törzsek által axénikus kultúrában elĘidézett növekedési mutatók adott tesztnövény esetében nem különböznek. A varianciabecslés eredményeként a nullhipotézist P = 95% szinten Fpróbával értékeltem, majd a szignifikáns különbségek közt meghatároztam a statisztikailag igazolható eltérés mértékét (SzDP95%).

Eredmények

67

4. EREDMÉNYEK 4.1.

Az izolált baktériumok azonosítása, jellemzĘ tulajdonságai és a törzsszelekció eredményei

4.1.1. A Westsik- féle vetésforgóból izolált baktériumok morfológiai jellemzése A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérletbĘl származó legtöbb izolátum tipikus pálcika vagy kokkusz formát és ezen belül egyenlĘ arányban Gram-negatív, illetve -pozitív festĘdést mutatott, amint azt a 11. táblázat szemlélteti. A táblán csak a késĘbb meghatározott, illetve vizsgált baktériumtörzsek adatai szerepelnek, kezdetben mintegy százhúsz telepet izoláltam. SzámottevĘ volt még a Gram-pozitív spóraképzĘ pálcák mennyisége, az összes törzs mintegy 15,8 %-a. Az egyes baktériumtörzsek morfotípusait, a BIOLOGTM módszerrel történt azonosítás szerinti rendszertani besorolását és néhány jellemzĘ törzs mikroszkópikus képét (melyet a Gram-festés értékelése során készítettem) a 14-15. táblázat mutatja be. A táblázatban a fentiek mellett a törzsek nitrogénmentes Ashbyféle táptalajon történĘ növekedését is feltüntettem. 11. táblázat A Westsik-féle vetésforgóból származó baktériumtörzsek morfológiai típus szerinti megoszlása* Növény Bükköny Csillagfürt Rozs Összesen

GNC 8 0 1 9

GNCB 0 0 1 1

GNR 7 6 2 15

GPC 6 3 6 15

GPR 2 2 3 7

GPR-SB 4 3 2 9

Összesen 27 14 15 56

*Rövidítések magyarázata: GNC = Gram-negatív kokkusz (nem enterikus) GNCB = Gram-negatív „kokkobacillus”; ovális sejtforma (nem enterikus) GNR = Gram-negaív pálca (nem enterikus) GPC = Gram-pozitív kokkusz GPR = Gram-pozitív pálca GPR-SB = Gram-pozitív spóraképzĘ pálca (Bacillus sp.)

4.1.2.

Baktériumok meghatározása fiziológiai és molekuláris módszerekkel

Törzsek diszkontinuus natív PAGE módszerrel történĘ csoportosításának eredményei A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából mintegy százhúsz, különbözĘ baktérium-tenyészetet izoláltam. E tenyészeteket azonosítás elĘtt natív diszkontinuus PAGE (gélelektroforézis) segítségével csoportokba rendeztem. A fehérjemintázat alapján homogén csoportokból egy-egy törzset emeltem ki meghatározás céljából. Így több mint ötven reprezentatív baktériumtörzset különítettem el, melyeket további vizsgálatokra használtam fel. A baktériumtörzsek csoportosítása során regisztrált gélelektroforézis-mintázatokat a 10. ábra szemlélteti. Az izolált és megtisztított baktériumtörzseket telepmorfológiai jegyeik, valamint a Gram-festés során megfigyelt sejtalakjaik alapján rendeztem hasonló csoportokba és e sorozatok tagjait hasonlítottam össze. Az elsĘ sorozatban (1-19.) kettĘ, a másodikban (2038.) ismét kettĘ megegyezĘ csoportot találtam. A 39-56. sorozatban öt azonos csoport, az 57-76-ban csak egy ilyen volt. A 77-95. sorban három, a 96-115. sorozatot tartalmazó gélen pedig kettĘ homogén csoportot regisztráltam. A baktériumok BIOLOGTM módszerrel végrehajtott azonosítása során az összesen ötvenhat különbözĘ törzsbĘl harminchat esetében jutottam faj-, illetve legalább génusz-szintĦ eredményre.

68


1-19

20-38

39-56

57-76

77-95

96-115

10. ábra Diszkontinuus natív PAGE gélképek a Westsik-vetésforgóból izolált baktériumtörzsek csoportosítása során. A megegyezĘ mintázatok homogén csoportot mutatnak, melynek tagjai fenotípusos tulajdonságukban megegyeznek. A markertörzs (Enterococcus fecalis) a 20-as zsebben foglal helyet (nem minden képen látszik).

Baktériumtörzsek BIOLOGTM módszerrel történĘ meghatározásának eredménye Harminchat, a Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzset határoztam meg e módszerrel, melyeket Gram-festĘdés szerint csoportosítva a 11. és 12. ábra dendrogramjai szemléltetnek.

Eredmények

69

A1 Staphylococcus lentus B2 Corynebacterium sp. C3 C4 C5 C6

Staphylococcus cloosii Staphylococcus cohnii ssp. cohnii Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus haemolyticus

D7 Corynebacterium aquaticum B D8 Corynebacterium aquaticum A E9 Corynebacterium aquaticum B E10 Rothia dentocariosa E11 Bacillus licheniformis E12 Bacillus subtilis E13 Corynebacterium sp. F14 F15 F16 F17

Corynebacterium bovis Micrococcus diversus Bacillus brevis Corynebacterium sp.

Relatív távolság 11. ábra A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált Gram-pozitív baktériumok BIOLOGTM módszer alapján csoportosítva és azonosítva. A dendrogramot UPGMA módszerrel szerkesztettem, melyben két osztály távolságát az objektumaik közötti összes távolságérték aritmetikai átlaga fejezi ki.

A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

Flavobacterium indologenes Pseudomonas diminuta Pseudomonas vesicularis Xanthomonas sp. Erwinia sp. Pasteurella caballi Capnocytophaga gingivalis CDC Group EF-4 (P. fluorescens-putida)

B 9 Sphingomonas sp. B 10 Alcaligenes sp. B 11 Comamonas sp. B 12 Pseudomonas viridiflava B 13 Pseudomonas corrugata B 14 Pseudomonas fluorescens type F B 15 Pseudomonas corrugata B 16 Pseudomonas corrugata C 17 Agrobacterium sp. C 18 Sphingomonas sp. C 19 Burkholderia sp. Relatív távolság

12. ábra A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált Gram-negatív baktériumok BIOLOGTM módszer alapján csoportosítva és azonosítva. Az UPGMA módszerrel szerkesztett dendrogramon, két osztály távolságát az objektumaik közötti összes távolságérték aritmetikai átlaga fejezi ki.

70


A Gram-pozitív baktériumok között a legnagyobb mennyiségben az Actinobacteria (BXIV.) törzs Actinobacteridae (V.) alosztályának képviselĘi fordultak elĘ. Ezek nagyobb része (az összes törzs 19%-a) a Corynebacterineae (X.) alrendbe, a Corynebacterium génuszhoz tartozik. Az Actinobacteridae alosztályban a Micrococcaceae család egy-egy tagját – Micrococcus diversus és Rothia dentocariosa – tudtam ezen kívül azonosítani. A Firmicutes (BXIII.) törzs Bacilli (III.) osztályából több Bacillus törzset (B. licheniformis, B. subtilis és B. brevis), valamint jelentĘs számú Staphylococcus sp. képviselĘt (S. lentus, S. cohnii és S. haemoliticus) izoláltam. A Gram-negatív baktériumtörzsek túlnyomó többségét a Proteobacteria (BXII.) rendszertani törzs Gammaproteobacteria (III.) osztályába tartozó Pseudomonas sp. reprezentánsok alkotják, melyek az összes törzs 23%-át teszik ki (P. diminuta, P. vesicularis, P. fluorescens és P. putida, valamint P. viridiflava és P. corrugata). Az Alphaproteobacteria (I.), Betaproteobacteria (II.) osztályokból azonos számú, de különbözĘ rendekbe tartozó törzseket sikerült azonosítani, az összes törzs tizenhat százaléka tartozik ebbe a csoportba (Burkholderia, Sphingomonas, Alcaligenes, Comamonas és Agrobacterium sp.). Ezen kívül a Bacteroidetes (BXX.) törzsben a Flavobacteriaceae család két tagját (Flavobacterium indologenes és Capnocytophaga gingivalis) találtam meg. A Gram-pozitív baktériumcsoport ennek alapján – az alkalmazott módszerekkel gyĦjtve – sokkal egységesebb, azaz kevésbé változatos képet mutatott, mint a Gramnegatívok. ElĘbbi esetben két rendszertani törzs – Firmicutes és Actinobacteria – összesen három rendjének, illetve alrendjének képviselĘit, utóbbiban viszont két törzs négy osztályába és ezek összesen nyolc rendjébe sorolt baktériumtörzseket tudtam izolálni és meghatározni (13. ábra).

6%

8%

G + Firmicutes / Bacilli / Bacillus sp.

8% G + Firmicutes / Bacilli / Staphylococcus sp.

14% G + Actinobacteria / Actinobacteria / Corynebacterium sp. G + Actinobacteria / Actinobacteria / Actinobacteridae alosztály G - Proteobacteria / Alphaproteobacteria / IV., VI. rend

23%

G - Proteobacteria / Betaproteobacteria / Burkholderiales rend

19%

G - Proteobacteria / Gammaproteobacteria / Pseudomonas sp. G - Proteobacteria / Gammaproteobacteria / III., XIII., XIV. rend

8% 8%

6%

G - Bacteroidetes / Flavobacteria / Flavobacteriaceae család

13. ábra A Westsik-vetésforgó szöszös bükköny, fehérvirágú csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumok megoszlása (%). G+: Gram-pozitívok, G-: Gram-negatívok.

Eredmények

71

Szerves anyagban gazdag (intenzív mĦvelés alatt álló), valamint organikus, vagy minimum-mĦvelést folytató gazdálkodó területekrĘl egyaránt, a közelmúltban is leírtak hasonló rendszertani kategóriákba tartozó baktériumfajokat. ÇAKMAKÇI et al. (2005) újabb N2-kötĘ és foszfátoldó baktériumok növényi növekedés-serkentĘ képességének felmérése során Bacillus megaterium, B. licheniformis, Paenibacillus polymyxa, Rhodobacter capsulatus és Pseudomonas putida törzseket izolált árpa és búza rizoszférájából, trágyázott, mĦtrágyázott, valamint csekély szervesanyag-tartalmú talajokból. PARK et al. (2005), pedig Bacillus fusiformis, Pseudomonas fluorescens és Stenotrophomonas maltophilia, diazotróf aktivitással rendelkezĘ, indolecetsavat termelĘ baktériumtörzseket válogatott ki szezámfĦ, kukorica, szója, jégsaláta, paprika és rizs rizoszférájából Dél-Koreában. E törzsekkel a mindeddig rutinszerĦen, igen nagy mennyiségben alkalmazott nitrogén- és foszformĦtrágyák egy részét próbálják kiváltani. EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH (2004) B. amyloliquifaciens, B. mendocina, B. polymyxa, Pseudomonas alcaligenes és P. denitrificans törzseket izolált meszes csernozjom talajban termesztett borsó és gyapot rizoszférájából Üzbegisztánban. a baktériumokat N2kötĘ aktivitásuk, növénypatogén gombákkal szemben tanúsított antagonista képességük, valamint enzimtermelésük alapján szelektálták, majd sikerrel használták fel a növények fejlĘdésének elĘsegítésére axénikus kultúrában. Mindezek alapján a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérletbĘl, pillangós növények rizoszférájából, valamint talajból izolált baktériumtörzsek közül nagyobbrészt Pseudomonas (P. diminuta, P. vesicularis, P. fluorescens és P. putida, valamint P. viridiflava és P. corrugata), Flavobacterium indologenes, illetve Bacillus (B. licheniformis, B. subtilis és B. brevis) és Micrococcus sp. reprezentánsokat választottam ki további tanulmányozás céljára. E törzsek – a fent említett adatokra építve – a további szelekció kiindulópontját képezhették.

Pseudomonas sp. baktériumtörzsek API 20 NETM módszerrel történĘ meghatározásának eredménye A Westsik-féle vetésforgó I., IV., VIII. és IX. parcelláiból izolált, King’s B táptalajon UV-fényben fluoreszkáló pigmentet termelĘ baktériumokat az API 20 NETM teszttel próbáltam meg azonosítani. Feltevésem az volt, hogy e baktérium törzsek nagy része, esetleg mindegyike a Pseudomonas fluorescens faj képviselĘje lesz. Az említett parcellák a homokjavítás olyan különbözĘ módjait mutatják be, ahol – a parlagoltatás kivételével – a pillangós takarmánynövények (bükköny és csillagfürt) gyökér- vagy zöldtrágyaként, illetve elĘvetemény-hatásuk révén fontos szerepet játszanak a talaj tápanyag-utánpótlásában. Az alkalmazott módszerrel azonban a negyvennyolc reprezentatív törzs fele – huszonhat baktériumtörzs – nem volt azonosítható (ezek az adatok nincsenek feltüntetve). Másik huszonhat törzsbĘl tizenhármat a Pseudomonas aeruginosa fajba tudtam sorolni, míg újabb tizenhárom Pseudomonas fluorescens, illetve P. putida reprezentáns. Ez utóbbiak közül csak két törzs – P65 és P80 – tartozik valószínĦleg a P. putida fajhoz, a többit e módszerrel nem tudtam egyértelmĦen azonosítani. A használt adatbázis szerint ezek „fluorescens-putida típusú” (fluorescens-putida type) baktériumtörzsek, ezért a továbbiakban következetesen így említem Ęket. A kapott eredményeket a 12. táblázat mutatja be.

72


12. táblázat A Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet eltérĘ módon trágyázott parcelláinak talajából izolált huszonhat Pseudomonas sp. baktériumtörzs Kezelések, mĦtrágyakiegészítéssel

I. nem mĦvelt (parlag)

IV. szalma (26,1 t / ha / 3 év) 50 kg ha–1 P és 16,2 kg ha–1 K

VIII. gyökér- és zöldtrágya 50 kg ha–1 P és 16,2 kg ha–1 K

IX. istállótrágya (26,1 t / ha / 3 év) 50 kg ha–1 P és 16,2 kg·ha–1 K

Törzskódok 1AX 1A5/2 1F01 1F02 4A06 4A09 4A10 4F04 4F08 4F12 8A16 8A20 8A23/1 8F15 8F22 8F38 9A28a 9A30/2 9A34 9A25/2 9A36 9F41 9F44 9F47 9P65 9P80

Azonosítás eredménye Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens / P. putida

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas fluorescens / P. putida





Pseudomonas putida

Baktériumtörzsek 16S rDNS módszerrel történĘ azonosításának eredménye A FelsĘ-Tisza egyes szakaszairól származó izolátumokat 16S rDNS módszerrel azonosítottam, melynek során a típustörzsek szekvenciáihoz történĘ illeszkedést több lépésben ellenĘriztem. Így a további vizsgálatokban szereplĘ tiszai baktériumtörzsek faji, esetenként alfaj szintĦ azonosítása lehetĘvé vált. Az eredményeket a 14. ábra mutatja be. A módszer elĘnye a BIOLOGTM-hoz képest többek között az, hogy egy közbensĘ lépésben (ARDRA) tartalmazza a törzsek csoportosítását még abban az esetben is, ha nem közvetlenül környezeti mintából, hanem tiszta izolátumokból indulunk ki. Aeromonas, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Acidovorax, Klebsiella, Shewanella, Rahnella, Acinetobacter, Paracoccus, Rhodococcus, Micrococcus, Bacillus, Streptomyces, Arthrobacter, Cytophaga és kóliform baktériumtörzseket azonosítottam, melyek az Alphaés Gammaproteobacteria, Firmicutes, valamint Actinobacteria rendszertani törzsek tagjai. Legnagyobb egyedszámban a Pseudomonas, Aeromonas, Acinetobacter és Bacillus fajok képviselĘi kerültek elĘ. A mintákból történt sejtszám-meghatározás és az izolátumok száma alapján a FelsĘ-Tisza Aranyosapáti és Záhony környéki szakaszain regisztráltam a legnagyobb baktériumsĦrĦséget és fajdiverzitást (13. táblázat). Az egyes szakaszokról származó izolátumok faji összetétele és a minták sejtszáma általában megfelelt a tél végi, illetve kora tavaszi populációdinamikai jellemzĘknek, mely

Eredmények

73

szerint a Pseudomonas baktériumok a hideg, nem eutróf (kis termĘképességĦ) felszíni vizek tipikus lakói (KOVÁCS 2001). A 2000. évi szennyezés beáramlásához közeli szakaszról (Aranyosapáti), valamint az alsóbb, középszakasz jellegĦ területrĘl (inkább Balsa, mint Záhony) származó mintákban mind a baktériumok sĦrĦsége, mind változatossága határozottan nagyobb volt (13. táblázat). 13. táblázat A baktériumok becsült sĦrĦsége és az egyes mintavételi helyekrĘl izolált törzsek száma Mintavételi helyek a FelsĘ-Tisza mentén, fentrĘl lefelé Tivadar Aranyosapáti Záhony Balsa

Folyóvíz SĦrĦség Izolált törzsek –1 száma (lg CFU ml ) 4 19 5 28 5 17 6 32

Ártér talaja SĦrĦség Izolált törzsek –1 száma (lg CFU g sz.a.) 5 29 6 36 6 13 7 28

A FelsĘ-Tisza mentén Tivadartól Balsáig különbözĘ, nagyrészt az Alphaproteobacteria és Gammaproteobacteria rendszertani törzsbe tartozó (GARRITY et al. 2004) baktériumfajok képviselĘit tudtam izolálni és fenntartani. A Tivadarhoz közeli szakaszáról (mely mintegy szennyezéstĘl mentes kontrollként fogható fel) vett mintában fĘleg Pseudomonas sp. baktériumok fordultak elĘ, az aranyosapáti, záhonyi és balsai szakaszokról származó törzsek viszont a filogenetikus fán elszórtan helyezkednek el (14. ábra). Hasonló eredményre jutott RÓĩYCKI et al. (1999) és ELO et al. (2000) is, midĘn különbözĘ környezeti mintákból izolált és szelektált diazotróf, indolecetsav- és sziderofor-termelĘ, szabadon élĘ baktériumtörzseket. ElĘbbiek a Visztula-völgy futóhomokján képzĘdött, homokos szövetĦ podzolos rozsdabarna erdĘtalajból izoláltak zömmel Pseudomonas sp. (P. glathei és P. putida, 55%), Bacillus sp. (B. azotoformans, B. megaterium, B. mycoides, 24%), Xanthomons (10%), Burkholderia (5%) és Agrobacterium sp. (2%) törzseket, néhány azonosítatlan kokkusz és korineform baktérium jelenlétében, természetvédelmi területen. Utóbbiak Finnország déli részén, csekély szervesanyag-tartalmú podzolos barna erdĘtalajból viszont nagyrészt Gram-pozitív baktériumokat (81%: Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Arthrobacter, Nocardia, Rhodococcus és Streptomyces sp.) gyĦjtöttek. A Gram-negatívok között a Pseudomonas (11%) génusz dominanciáját tapasztalták. A Firmicutes és Actinobacteria törzs tagjai (Bacillus megaterium, B. cereus, B. thüringiensis, valamint Streptomyces és Arthrobacter sp.) viszont csak Aranyosapáti és Balsa környékérĘl kerültek elĘ. Ennek egy magyarázata lehet, hogy a szennyezés torkolatában, illetve az ahhoz közel esĘ részeken olyan fajok, illetve közösségek kerülhettek elĘnybe, melyek biodegradációs kapacitása szélesebb körĦ volt. Az általános nézet (pl. KOVÁCS 2001) szerint e képesség az Acinetobacter, Bacillus és Arthrobacter nemzetségre egyaránt jellemzĘ. Az Aranyosapáti környékén (a Szamos torkolata alatt) talált néhány Pseudomonas és több Aeromonas baktériumtörzs mindazonáltal rendelkezhet olyan másodlagos anyagcseretermékekkel, melyek a fémionokat komplexbe vihetik, csökkentve ezzel a toxikus hatás mértékét. E feltevés helytálló voltát azonban törzs-specifikus laboratóriumi és/vagy in-situ vizsgálatokkal lenne célszerĦ eldönteni. Pseudomonas sp. reprezentánsokat viszont mindegyik mintavételi helyrĘl, nagyrészt talajból, de néhány esetben vízbĘl is tudtam izolálni. Ez az eredmény alátámasztja azokat a felméréseket, melyek szerint a Pseudomonas-ok széles körben elterjedtek a természetben (KLOEPPER et al. 1986 és 1988, LAMBERT és JOOS 1989, BAKKER et al. 1990, CAMPBELL és GREAVES 1990, BIN et al. 1991, MAZZOLA és COOK 1991,

74


O’SULLIVAN és O’GARA 1992, COOK 1993, HÖFLICH et al. 1995, LOPER és HENKELS 1999, DALTON et al. 2004). Az egyes szakaszokról azonosított, leggyakrabban elĘforduló baktériumtörzseket a 14. ábra, illetve 14. táblázat mutatja be.

Pseudomonas sp. 295, Tivadar, hullámtér 109, Tivadar, hullámtér 294, Tivadar, hullámtér 309, Aranyosapáti, víz Pseudomonas extremorientalis 118, Tivadar, hullámtér, Pseudomonas tolaasii 017, Záhony, hullámtér, P. anguilliseptica 119, Balsa, hullámtér Pseudomonas fluorescens 404, Balsa, hullámtér Pseudomonas borealis 302, Aranyosapáti, hullámtér, Pseudomonas sp. Aeromonas media 022, Tivadar, hullámtér Aeromonas sp. 021, Aranyosapáti, hullámtér 285, Záhony, víz Aeromonas salmonicida 313, Aranyosapáti, hullámtér Aeromonas veronii 158, Balsa, víz Shewanella baltica (T) 317, Balsa, hullámtér Klebsiella granulomatis (T) 122, Aranyosapáti, víz Acinetobacter johnsonii (T) 202, Záhony, víz Stenotrophomonas rhizophila 314, Aranyosapáti, hullámtér Acidovorax defluvii (T) Pseudomonas sp. P51 327, Tivadar, hullámtér Paracoccus carotinifaciens (T) 283, Záhony, víz, Cytophaga sp. Nem tenyésztett repce rhizoszféra bakt. 015, Balsa, hullámtér Bacillus sp. 19497 Bacillus megaterium 312 Aranyosapáti, hullámtér, Bacillus benzoevorans Bacillus sp. VAN23 Nem tenyésztett baktérium talajból 303 Aranyosapáti, hullámtér, Streptomyces purpureus Streptomyces sp. 335, Balsa, hullámtér Arthrobacter sp. CAB1

A

B

C

D Deinococcus grandis (T)

0.10

14. ábra A FelsĘ-Tisza különbözĘ szakaszairól izolált huszonnégy jellemzĘ baktériumtörzs filogenetikus fája (a legközelebbi szomszéd módszerével számítva; a bal alsó sarokban lévĘ szakasz nukleotidonkénti 0,10 szubsztitúciót jelöl). A: BXII. törzs: Proteobacteria, III. osztály: Gammaproteobacteria. B: I. osztály: Alphaproteobacteria. C: BXIII. törzs: Firmicutes. D: BXIV. törzs: Actinobacteria. T: típustörzs.

Eredmények

75

JellemzĘ volt még, hogy a vízpart és az ártér talajából csekély eltérésekkel kb. ugyanannyi izolátumot nyertem, mint a Tisza vizébĘl, pedig a talajminták a vízminták tömegének átlagosan csak mintegy felét tették ki. ValószínĦleg ebben közrejátszott a tél végi-tavasz eleji (februári) mintavételi idĘpont is, mert ekkor a hideg víz (2-5 °C) mikrobiális biomasszája erĘsen lecsökken. 14. táblázat JellemzĘ baktériumtörzsek a FelsĘ-Tisza egyes szakaszairól Származási hely és folyamkilométer

4.2.

Tivadar

705,8 km

Aranyosapáti

668,6 km

Záhony

613,1 km

Balsa

544,1 km

Faj Enterobacter agglomerans Pseudomonas gessardii Pseudomonas marginalis Acinetobacter johnsonii Aeromonas hydrophila Rahnella aquatilis Acinetobacter johnsonii Klebsiella sp. Pseudomonas synxantha Aeromonas veronii Pseudomonas veronii Pseudomonas fluorescens Pseudomonas marginalis Bacillus cereus Bacillus thüringiensis Pseudomonas sp.

Törzskód B 12 B 83 B 136 A 14 A 106 A 211 A 212 A 217 A 308 IV 313 D 11 D 65 C 25 C 59 C 69 C 115

Baktériumtörzsek közvetlen növényi növekedés-serkentĘ hatásának kimutatása – fehér mustár csíranövénnyel végzett bioteszt eredménye A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet pillangós növényeinek rizoszférájából izolált reprezentatív törzsek igen eltérĘ mértékben hatottak a vizsgált csíranövények fejlĘdésére, azaz levélkiterjedésük alakulására. A teszt eredménye huszonnégy vizsgált baktériumtörzsbĘl tizenhárom esetében érte el, illetve hat esetben haladta meg a kezeletlen kontroll szintjét (15. ábra). Az ábrán az elsĘ tizenegy baktériumtörzs – W.32-tĘl W.43-ig – a csíranövények növekedését a kontrollhoz képest szignifikáns mértékben gátolta. FRENYÓ (1958 és 1985) Magyarországon precedens értékĦ eredményei szerint sok növényben éhezéskor nitrát mutatható ki abban az esetben is, ha a környezetbĘl egyáltalán nem jutottak nitráthoz. E jelenség vizsgálatában apró magvakból – fehér mustárból is – nevelt csíranövényeket, hogy tartalékaik mihamarabb elfogyjanak, minthogy a növényi sejtekben endogén módon képzĘdĘ nitrát a szerves anyagok és a metabolikus energia fogyásával függ össze. Magyarázata szerint a légkör mint oxidatív környezet a nitrátredukció megfordulását segítheti, ha a redukciós potenciál csökkenĘben van, és ebben dehidrogenáló enzimek közremĦködése valószínĦ – melyeket a baktériumok is termelhetnek. ÉhezĘ csíranövényben, amint a növény tartalékai kimerülnek, a nitrátredukció helyett az egyensúly az oxidáció felé tolódhat, ami viszont a növekedést fékezi. FRENYÓ (1985) az endogén nitrátképzést nem tartotta sem ritka, sem általános jelenségnek: bekövetkezésének feltételei a csíranövények fajtája, életkora, egyedi sajátságai és környezeti tényezĘk szerint változhatnak. Nem zárható ki tehát pl. az, hogy a baktériumok jelenléte a fiatal gyökerek izzadmánytermelését fokozta (miközben a termelt izzadmányokat fogyaszthatták is), ezáltal segítette az éhezĘ állapot kialakulását.

76


Figyelemre méltó, hogy az Ashby-féle táptalajon történt tenyésztés során (15. és 16. táblázat) a W.35 jelĦ törzs – mely e teszt során még a legserkentĘbbnek bizonyult – egyáltalán nem növekedett. Sejtmorfológiájára nézve ez a baktérium Gram-negatív pálca és BIOLOGTM tesztbeli mintázata alapján a Pseudomonas génusz típustörzseivel rokon, de egyikkel sem egyezik meg. ElképzelhetĘ, hogy e csíranövénytesztben vitamin – pl. Bvitaminok (RÓĩYCKI et al. 1999) –, vagy egyéb növekedési faktor (aminosavak, növényi hormon) termelésével tĦnt ki, de diazotróf aktivitása nincs.

14

LevélátmérĘ (mm)

12

SZDP95% = 0.7

Kontroll

10 8 6 4 2

W .3 2 W .5 W 2 .2 7 W /2 .3 4/ 2 W .3 7 W .5 7 W .5 1 W .2 W 9 .3 0/ 2 W .3 9 W .4 3 W .3 3 W .2 W 7 .3 9/ 2 W .4 4 W .3 4 W .4 9 W .1 3 W .5 0 W .4 2 W .1 2 W .6 W 0 .2 9/ 2 W .3 5

0

Törzsek

15. ábra A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából izolált huszonnégy baktériumtörzs növényi növekedésre gyakorolt hatása fehér mustárral végzett biológiai tesztben. A félszakaszok a szignifikáns differencia (SzDP95% = 0,7) mértékét jelzik.

4.3.

A nitrogénkötés meghatározásának eredményei

4.3.1. A szilárd táptalajban végrehajtott fiziológiai bioteszt eredménye A következĘkben az Ashby-féle nitrogénmentes táptalajon történt tenyésztés, azaz a nitrogénkötĘ aktivitás fiziológiai tesztjének eredményét mutatom be. A screening jellegĦ pozitív vagy negatív elbírálás mellett a baktériumtörzsek sejtmorfológiája, valamint – ahol az lehetséges volt – BIOLOG módszerrel végzett azonosítása és a jellemzĘ formák mikroszkópos képe is fel van tüntetve (15. és 16. táblázat). A vizsgálatba a diszkontinuus natív PAGE (gélelektroforézis) módszerrel elkülönített ötvenhat baktériumtörzset vontam be. A Gram-negatív baktériumok közül (25 törzs) tizenkettĘ esetében tapasztaltam látható telepnövekedést, illetve a CaCO3 fogyásából adódó átlátszó körgyĦrĦ megjelenését. A 31 Gram-pozitív törzs közül tíz növekedett aktívan, melyek körül ugyancsak színtelen zóna alakult ki. A bükköny rizoszférájából hat (köztük Pseudomonas sp. W.1, P. corrugata W.34 és Flavobacterium indologenes W.51), csillagfürtrĘl hét (pl. Pseudomonas sp. W.37 és W.39/2, P. corrugata W.39 és mások), rozs rizoszférájából ismét hat (Gram-pozitív

Eredmények

77

kokkuszok és pálcák) aktív baktériumtörzset találtam. Bár a legtöbb törzs a bükköny gyökerérĘl került elĘ, e tesztben ennek csak 22%-a volt aktív, a csillagfürtrĘl, valamint rozsról származó baktériumtörzsek 50-, illetve 40%-ával szemben. A legtöbb tanulmányozott szabadon élĘ diazotróf baktériumtörzs a Pseudomonas génuszhoz tartozik. E csoport dominanciája mind a talajban, mind a növények gyökérzónájában való igen nagy elterjedtségének, csekély tápanyag-igényének és számos szerves szubsztrát hasznosításának képességén, valamint azon alapul, hogy a kis pH-t jól tolerálja (DAWSON 1983). HÖFLICH (1989) szerint a rizoszférában élĘ baktériumok között a Pseudomonas sp. aránya akár a 60%-ot is elérheti. A második leggyakoribb ilyen génusz a Bacillus. Az aerob, illetve fakultatív anaerob spóraképzĘ pálcák is közönséges lakói a talajoknak és a rizoszférának, különösen azok, amelyek a szacharózt bontják és csekély mennyiségĦ nitrogénnel is beérik, pl. Bacillus circulans és B. polymyxa (BUCHANAN és GIBBONS 1974, RÓĩYCKI 1987). E génusz aktív nitrogenáz-emzimrendszerrel rendelkezĘ képviselĘit több esetben izolálták már környezeti mintákból (RÓĩYCKI 1987, PACHLEWSKI et al. 1991, LI et al. 1992).

78


15. táblázat Ötvenhat reprezentatív baktériumtörzs szaporodása Ashby-féle N-mentes szilárd táptalajon; Gram-negatív csoport. A ’+’ jel anyagcsere-aktivitást jelent, míg a ’–’-al jelzett törzsek nem növekedtek. Morfológia: GNC = Gram-negatív kokkusz (nem enterikus) GNCB = Gram-negatív „kokkobacillus”; ovális sejtforma (nem enterikus) GNR = Gram-negatív pálca (nem enterikus) Gazdanövény

Törzs kódja

Mikrofotó (kb. 400×)

Taxon

Szaporodás

W.9

GNC

n.d.

n.d.

–

W.10

GNR

n.d.

n.d.

–

W.1

GNR

Pseudomonas sp.

+

W.12

GNR

n.d.

n.d.

+

W.24

GNC

n.d.

n.d.

–

GNR

Pseudomonas vesicularis (Brevundimonas vesicularis, GARRITY et al. 2004)

–

W.26

GNR

Pseudomonas vesicularis (Brevundimonas vesicularis, GARRITY et al. 2004)

–

W.28

GNR

Capnocytophaga gingivalis

–

W.30

GNC

Pasteurella sp.

–

W.31

GNC

n.d.

–

W.34

GNR

Pseudomonas corrugata

+

W.25

bükköny (Vicia sativa L.)

Morfológia

n.d.

n.d.

Eredmények

79

Törzs kódja

W.49

GNC

W.50

GNC

W.51

GNC

W.52

GNC

W.35

rozs (Secale cereale L.)

csillagfürt (Lupinus albus)

Gazdanövény


15. táblázat, folytatás Morfológia


Taxon

Szaporodás

Alcaligenes faecalis

–

n.d.

+

Flavobacterium indologenes

+

n.d.

n.d.

+

GNR

n.d.

n.d.

–

W.36

GNR

n.d.

CDC csop. EF-4

–

W.37

GNR

n.d.

Pseudomonas sp.

+

W.39

GNR

Pseudomonas corrugata

+

W.39/2

GNR

n.d.

W.57

GNR

W.17

n.d.

n.d.

Pseudomonas F típus n.d.

+

GNR

n.d.

n.d.

–

W.26

GNCB

n.d.

n.d.

–

W.43

GNC

n.d.

n.d.

+

W.60

GNR

n.d

n.d

+

+

80


16. táblázat Az ötvenhat reprezentatív baktériumtörzs Gram-pozitív csoportjának szaporodása Ashby-féle N-mentes szilárd táptalajon. A ’+’ jel anyagcsere-aktivitást jelent, míg a ’–’-al jelzett törzsek nem növekedtek. Morfológia: GPC = Gram-pozitív kokkusz GPR = Gram-pozitív pálca GPR-SB = Gram-pozitív spóraképzĘ pálca (Bacillus sp.)

csillagfürt (Lupinus albus L.)


Gazdanövény

Törzs kódja

Morfológia

W.4


Taxon

Szaporodás

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.6

GPC

n.d.

n.d.

–

W.7

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.8

GPC

n.d.

n.d.

–

W.9

GPC

Staphylococcus cohnii ssp. cohnii

–

W.23

GPR

Corynebacterium aquaticum B

–

W.25

GPC

Staphylococcus sp.

–

W.29

GPC

Staphylococcus sp.

+

W.29/2

GPR–SB

n.d.

n.d.

+

W.30/2

GPR

n.d.

Corynebacterium sp.

+

W.56

GPC

n.d.

n.d.

–

W.63

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.32

GPR

Bacillus subtilis

+

W.33

GPR–SB

n.d.

n.d.

+

Eredmények

81

16. táblázat, folytatás

rozs (Secale cereale L.)

csillagfürt (Lupinus albus L.)

Gazdanövény

Törzs kódja

Morfológia

W.34/2

GPC

W.35/2

GPC

W.38


Taxon

Szaporodás

Staphylococcus closii B

–

n.d.

Staphylococcus sp.

–

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.40

GPR

n.d.

Corynebacterium sp.

–

W.41

GPR–SB

Bacillus licheniformis

–

W.42

GPC

Micrococcus sp.

+

W.13

GPC

n.d.

+

W.14

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.16

GPC

n.d.

n.d.

–

W.21

GPR–SB

n.d.

n.d.

–

W.22

GPC

n.d.

n.d.

–

W.27

GPR

n.d.

n.d.

+

W.27/2

GPC

n.d.

n.d.

+

W.44

GPC

n.d.

n.d.

+

W.61

GPC

n.d.

n.d.

–

W.64

GPR

n.d.

n.d.

–

W.65

GPR

n.d.

Corynebacterium sp.

–

82


4.3.2. Az acetilénredukciós aktivitás mérésének eredménye A Westsik-féle vetésforgóból, rizoszférából származó huszonhárom baktériumtörzs acetilénredukciós aktivitását – mely a teszt eredményei szerint igen eltérĘ volt – a 16. ábra mutatja be. A fehér mustárral végzett csíranövénytesztben még szereplĘ W.35 törzs itt már nincs feltüntetve, mert – ahogy a fiziológiai tesztben – ez esetben sem adott értékelhetĘ reakciót. Az Ashby-féle N-mentes szilárd táptalajon történt tenyésztés és az ARA teszt eredményei a legtöbb esetben egybeestek (az elĘbbi során szaporodó telepek az acetilént is redukálták: R2 = 0,79), ami arra enged következtetni, hogy e táptalaj nemcsak anaerob, hanem aerob (vagy mikroaerofil) diazotróf baktériumok szelektív izolálása céljából is felhasználható. MegfelelĘ eredmények eléréséhez azonban biztosítani kell a felhasznált vegyszerek nagy tisztaságát, valamint kiküszöbölni az ammónia táptalajba történĘ diffúzióját (pl. a tömény kénsavval történĘ reakció révén). A diagramon két nagyobb csoport; egy gyengébb és egy erĘsebb aktivitással rendelkezĘ különböztethetĘ meg, mely utóbbi tagjai között három újabb alcsoportban P = 99%-os szinten is szignifikáns különbségek voltak. A huszonhárom törzsbĘl tizenkettĘ tenyészet termelt 31 nM-nál kevesebb etilént egy óra alatt. A növekvĘ sorrendben következĘ nyolc törzs 38-67 nM-t termelt, mely az elĘzĘ csoportnál szignifikánsan nagyobb volt, s e csoporton belül a Pseudomonas sp. W.39/2 és a W.32 jelĦ spóraképzĘ pálca (feltehetĘen valamely Bacillus sp.-el rokon) tĦnt ki. A harmadik csoport tagjai – három törzs – szignifikáns mértékben kiemelkedĘ N2-kötĘ aktivitást mutattak. A W.60 jelĦ Gramnegatív pálca tenyészete 75 nM, a W.12 jelĦ 88 nM, míg a W.27 jelĦ Gram-pozitív pálca 104 nM etilént – ez szignifikánsan a legnagyobb volt – termelt az inkubáció ideje alatt. 120

SZDP95% = 10.44 *

3. alcsop.

SZDP99% = 13.88 **

100

-1

**

*

2. alcsoport

-1

Etilén (nM tenyészet h )

R2Ashby = 0,79

**

80

* 60 gyenge

*

1. alcsoport

** 40

* 20

W

.2 9 W .5 W 2 .2 7/ 2 W .4 9 W .4 4 W .4 3 W .3 W 2 .3 4/ 2 W .5 W 0 .3 0/ 2 W .5 7 W .3 7 W .3 W 9 .3 9/ 2 W .4 W 2 .2 9/ 2 W .3 3 W .3 4 W .1 3 W .5 1 W .6 0 W .1 2 W .2 7

0

Törzsek

16. ábra A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából izolált huszonhárom baktériumtörzs acetilén-redukciós aktivitása ARA-tesztben, a keletkezett etilén mennyiségének gázkromatográfiás mérése révén. A növekvĘ sorrendben következĘ, P = 95% mellett pozitív szignifikáns különbségeket a megfelelĘ oszlop fölött egy csillag, P = 99% szinten két csillag jelzi. Az erĘsebb aktivitású csoport tagjai között három újabb alcsoportban P = 99%-os szinten is szignifikáns különbségek voltak.

Eredmények

83

Az acetilénredukciós teszt révén megállapítottam, hogy a rizoszférából izolált szabadon élĘ baktériumtörzsek némelyike egyértelmĦ diazotróf tulajdonsággal bír. A három kiemelkedĘ aktivitású törzs közül kettĘ rozs, egy pedig bükköny növény gyökerérĘl származik. Ennek alapján feltételezhetĘ, hogy a rizoszférában élĘ, nitrogenáz enzimrendszerrel rendelkezĘ baktériumok többsége csak annyi N2-t köt meg, amennyire élettevékenységéhez feltétlen szüksége van. Néhány baktériumfaj képviselĘi (pl. Bacillus sp. W.33, vagy Pseudomonas corrugata W.39) ennél statisztikailag igazolhatóan nagyobb aktivitású, míg egy-két törzs különösen aktív lehet. Az itt bemutatott eredményeknél egy nagyságrenddel kisebb nitrogénkötĘ aktivitásról számolt be RÓĩYCKI et al. (1999) csekély tápanyagtartalmú erdĘtalajból, de PARK et al (2005) és ÇAKMAKÇI et al. (2005) intenzív mĦvelés alatt álló talajokból izolált baktériumtörzsek esetében hasonló értékeket regisztráltak. A diazotróf tulajdonság kialakulásában, illetve kifejezĘdésének mértékében nemcsak a tápanyagért folytatott versengés intenzitása, hanem horizontális (fajok közötti) génátvitel is szerepet játszhat (PAL et al 2001).

4.4.

A baktériumok növekedés-szabályzó tulajdonságának kimutatása bioteszttel Az elĘzetesen nehézfém- és cianidtĦrésük alapján szelektált, a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából, valamint a FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából származó – fĘleg Bacillus és Pseudomonas génuszba tartozó – baktériumtörzsek auxin-, illetve gibberellinsztenderdekhez képest serkentették a búza (Triticum aestivum L.) csíranövények növekedését. E hatás mind a hajtás-, mind a gyökérkezdemény vonatkozásában tapasztalható volt a megfelelĘ sztenderddel szemben. Indolecetsavhoz (auxin) hasonlítva a törzsek többsége egyaránt fokozta a gyökértömeg, valamint a hajtáshossz és -tömeg növekedését. Gibberellinsavval (GS3) szemben e hatás csak a hajtás hossza és tömege esetében volt kifejezett. Ennek oka valószínĦleg a két hormon eltérĘ helyezĘdése a növényben, minthogy az auxin a gyökerek hosszanti növekedését és a gyökérszĘrök fejlĘdését fokozza, a gibberellinek viszont a hajtásban serkentik a sejtmegnyúlást és az osztódást, levélkiterjedést, valamint siettethetik a csírázást (LOPER és SCHROTH 1986, ARSHAD és FRANKENBERGER 1995). A leghatékonyabb törzsek mindkét hormonhoz képest hasonló mértékben segítették a hajtás (hossz- és tömeg-) növekedését. Ez arra vezethetĘ vissza, hogy a gibberellinek számos élettani hatást az auxinokkal együttmĦködésben, azok endogén koncentrációjának fokozása révén fejthetnek ki (EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH 2004, PARK et al 2005). Az elĘvizsgálatban tanulmányozott 47 törzs közül 12 nem, 22 pedig a kontrollhoz viszonyítva nem szignifikáns mértékben serkentette a csíranövények növekedését (17. és 18. ábra). A maradék tizenhárom törzs viszont az alábbi csökkenĘ sorrendben szignifikánsan serkentette mind a gyökér-, mind a hajtáskezdemény növekedését: Pseudomonas gessardii B.83 > Pseudomonas sp. W.35 (CDC group EF-4) > Bacillus sp. W.7 > Pasteurella sp. W.30 > Pseudomonas sp. C.115 > Pseudomonas syringae I.110 > Pseudomonas sp. W.1 > Pseudomonas veronii D.111 P. veronii > III.119 > P. veronii VI.404 > Bacillus thüringiensis C.69 > B. thüringiensis III.108 > Pseudomonas sp. W.36.

84

Rizoszféra baktériumok… I.110 W.34

W.35

W.36 400%

W.32 W.31

I.401

II.108

Gyökér menny. II.109

300%

W.30

Hajtás hossza

III.118

250%

W .28

Gyökér tömege

II.407 III.103

350%

200%

W.20

V.104

150%

W.21

Hajtás tömege

III.119

VI.87

100%

W.18

VI.233

50%

W.15

VI.404

0%

W.13

VI.405

W.14

Törzsek SzDP95% = 61,8 Növényi részek SzDP95% = 21,9

VII.101

W.10

VIII.97

W.9

VIII.102

W.7

VIII.120

W.1

A.66

D.111

47 törzs PGR hatása (%) -1 100 mg l auxinhoz képest búza csíranövénnyel

A89 A92

D.106 D.94 C.116

A93 C.115C.107

C.69 B.83

A.94

17. ábra Westsik-vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó hatása 100 mg l-1 auxinhoz képest. ElĘbbiek az ábra bal oldalán foglalnak helyet (W kezdĘbetĦvel). A tiszai törzsek jelzései: I és II – Tivadar, part és hullámtér; III és IV – Aranyosapáti, part és hullámtér; V és VI – Balsa, part és hullámtér; VII és VIII – Záhony, part és hullámtér. A – Aranyosapáti, víz; B – Tivadar, víz; C – Balsa, víz; D – Záhony, víz. A sárga szaggatott vonal a kontroll növények növekedését jelzi (100%). I.110 W.35

W.36 400%

I.401

W.32 W.31

Gyökér menny.

II.108

W.34

II.109

300%

W.30

Hajtás hossza

III.119

200%

W .20

V.104

150%

W.21

VI.87

100%

W.18

VI.233

50%

W.15

VI.404

0%

W.13

Hajtás tömege

III.118

250%

W.28

Gyökér tömege

II.407 III.103

350%

VI.405

W.14

Törzsek SzDP95% = 62,9 Növényi részek SzDP95% = 22,0

VII.101

W.10

VIII.97

W.9

VIII.102

W.7

VIII.120

W.1

A.66

D.111

A89 A92

D.106 A93

D.94 C.116

C.115C.107

C.69 B.83

A.94

48 törzs PGR hatása (%) -1 100 mg l gibberellinhez képest búza csíranövénnyel

18. ábra Westsik-vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó hatása 100 mg l-1 gibberellinhez képest. Jelmagyarázat: mint fent.

Eredmények

85

Amint az ábrán felsorolt baktériumok eredetébĘl is látszik, a különbözĘ biotópokból közel azonos számú növekedést serkentĘ baktériumtörzs volt izolálható. A csíranövényeket stimuláló törzsek többsége a Pseudomonas génuszhoz tartozott, a legnagyobb serkentĘ hatással pedig a rizoszféra eredetĦ törzsek (Pseudomonas sp. W.35, Bacillus sp. W.7 és Pasteurella sp. W.30) rendelkeztek. A legnagyobb mértékben serkentĘ törzseket használtam fel a következĘ vizsgálatok során. 4.5.

Pseudomonas sp. baktériumtörzsek antagonista hatása két növénypatogén gombatörzzsel szemben

4.5.1. A sziderofor-termelés bioteszttel történĘ meghatározásának eredménye Negyvennyolc korábban izolált Pseudomonas sp. törzs mindegyikére elvégeztem a sziderofor-termelĘ képesség kimutatása céljából tervezett biológiai tesztet (SCHWYN és NEILANDS, 1987), melynek eredménye alapján 13 Pseudomonas aeruginosa, valamint 13 egyéb, szintén Pseudomonas sp. (fluorescens-putida csoport) törzset választottam ki további vizsgálatra (12. táblázat, 72. oldal). A következĘ ábrákon az áttekinthetĘség kedvéért a Westsik-féle vetésforgótartamkísérletre, mint származási helyre utaló „W.” elĘtagot a baktériumtörzsek kódjaiból elhagytam, a következĘ ábrákon az „A” elĘtag a Pseudomonas aeruginosa törzseket, az „F” és „P” elĘtag a fluorescens-putida csoportba tartozókat jelöli (17. táblázat). A Westsik-féle tartamkísérlet különbözĘ kezeléseit, azaz a baktériumtörzsek származási helyét az eredeti római számoknak megfelelĘ arab számok jelölik. Az említett sziderofor-tesztet „screening” jelleggel végeztem el, vagyis az egyes törzsek sziderofor-termelése közötti különbségeket mennyiségileg relatíve jellemeztem, csak a sziderofor jellegĦ vegyületeket termelĘ törzseket választottam ki (pozitív teszteredmény). A 26 szelektált törzs mindegyike képes tehát sziderofor(ok) termelésére, mely tulajdonság fontos szerepet játszik antagonista képességükben. A P. aeruginosa törzsek sziderofor-termelése jóval nagyobb mértékĦ és egyöntetĦbb volt, mint a fluorescensputida csoport törzseié, ezért a 17. táblázat csak az utóbbiak egymáshoz viszonyított aktivitását mutatja be. Ezek közül az 1F02, 4F08, 9F44 és a 9P80 törzs emelkedett ki, mivel az átlagoshoz képest mintegy 1,5-2-szer annyi sziderofor-vegyületet termeltek. 17. táblázat A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet különbözĘ parcelláiból származó, fluorescensputida csoportba tartozó Pseudomonas sp. törzsek és relatív sziderofor-termelésük Kezelések, mĦtrágya-kiegészítéssel I. nem mĦvelt (parlag) IV. szalma (26,1 t / ha / 3 év) 50 kg ha–1 P és 16,2 kg ha–1 K VIII. gyökér- és zöldtrágya 50 kg ha–1 P és 16,2 kg ha–1 K

IX. istállótrágya (26,1 t / ha / 3 év) 50 kg ha–1 P és 16,2 kg·ha–1 K

Törzskódok 1F01 1F02 4F04 4F12 4F08 8F22 8F38 8F15 9F41 9F47 9P65 9F44 9P80

A törzsek relatív sziderofortermelése (%) 51,3 88,3 34,7 42,1 71,1 19,6 34,3 49,9 21,2 30,5 31,8 96,7 100,0

86


4.5.2.

A növénypatogén gombákkal szembeni antagonizmus vizsgálatának eredménye

A kórokozók érzékenysége a Pseudomonas sp. törzsekkel szemben A baktériumok gátló hatásának megállapításához kiszámítottam a gátlási arányt, melyet [GA %]-kal jelöltem. Az összes vizsgált baktériumtörzs nagymértékben gátolta mind a Rhizoctonia solani ATCC 13289, mind pedig a Fusarium solani F.00715 gomba növekedését. A Rhizoctonia viszont mindkét vizsgálati módszer esetében érzékenyebb volt. Az eredményeket a 19–22. ábrák segítségével mutatom be. A mérési adatokból minden oltási módszer esetében kétoldali megbízhatósági intervallumot (konfidencia-intervallumot) számítottam P = 95% valószínĦségi szinten, melyet az ábrákon az oszlopokra írt szakaszok (illetve félszakaszok) ábrázolnak. A R. solani érzékenysége 3.5 – 98.6 GA% között adódott, míg a F. solani-é csak 21.2 – 79.3 GA% volt. Ez a tulajdonság azonban aligha általánosítható, mivel jelen munkában csak egy Fusarium és egy Rhizoctonia törzset vizsgáltam.

P. aeruginosa törzsek vs. Rh. solani Szélesztés

100.0

Széleszt.+Fe3+ Pontoltás 80.0

GA %

60.0

40.0

20.0

0.0 A9

A5/2

A6

A35/2

A28a

A34

A16 A10 Törzsek

A23/1

AX

A20

A30/2

A36

19. ábra Pseudomonas aeruginosa törzsek antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben. A szakaszok és félszakaszok a konfidencia-intervallumot jelzik (P95%). GA%: a gátlás mértéke a kontroll százalékában.

Eredmények

87

Pseudomonas sp. (f-p) törzsek vs. Rh. solani Szélesztés

100.0


GA %

60.0

40.0

20.0

0.0 P80

F2

F8

P65

F1

F15

F44

F4

F12

F41

F38

F47

F22

Törzsek

20. ábra Pseudomonas sp. fluorescens-putida típusú törzsek antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben. A szakaszok és félszakaszok a konfidencia-intervallumot jelzik (P95%). GA%: a gátlás mértéke a kontroll százalékában. F: P. fluorescens, P: P. putida.

P. aeruginosa törzsek vs. F. solani Szélesztés

100.0


GA %

60.0

40.0

20.0

0.0 A9

A5/2

A35/2

A10

AX

A28a

A20 A6 Törzsek

A34

A23/1 A30/2

A16

A36

21. ábra Pseudomonas aeruginosa típusú törzsek antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben. A szakaszok és félszakaszok a konfidencia-intervallumot jelzik (P95%). GA%: a gátlás mértéke a kontroll százalékában.

88


Pseudomonas sp. (f-p) törzsek vs. F. solani Szélesztés

100.0


GA %

60.0

40.0

20.0

0.0 F44

P80

F12

F2

F38

F47

F1

F15

F4

F8

F22

F41

P65

Törzsek

22. ábra Pseudomonas sp. fluorescens-putida típusú törzsek antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben. A szakaszok és félszakaszok a konfidencia-intervallumot jelzik (P95%). F: P. fluorescens, P: P. putida.

A Pseudomonas sp. törzsek antagonista képessége Általánosságban, a Pseudomonas aeruginosa törzsek esetében alakultak ki a legnagyobb gátlási zónák. A fluorescens-putida típusú Pseudomonas-ok ennél gyengébb gátló hatást mutattak. Bár a szakirodalomban nincs kifejezetten erre vonatkozó adat, az eredmények mégis arra mutatnak, hogy a két csoport antagonista képessége különbözĘ mechanizmus szerint alakul, amely további vizsgálatok tárgya lehet (23. és 24. ábra). Ezeken az ábrákon a két említett csoportba tartozó baktériumtörzsek GA% értékeinek számtani átlaga szerepel, vagyis az, hogy az egyes fajcsoportok GA%-ban kifejezve átlagosan mekkora antagonista képességet fejtettek ki a Rhizoctonia solani ATCC 13289 és a Fusarium solani F.00715 mikroszkopikus gombatörzsekkel szemben. A Pseudomonas fluorescens fajhoz tartozó baktériumtörzsek általában erĘsebb gátló hatást fejthetnek ki a környezetükben található mikroszkopikus gombákra, mint a P. aeruginosa reprezentánsok (ELO et al. 2000, PAL et al. 2001). Ezzel szemben e vizsgálatban a fluorescens-putida csoport antagonizmusának szórása a P. aeruginosa törzsekhez képest nagy volt. Ez vélhetĘen az elĘbbi csoport bizonytalan faji hovatartozásának következménye lehet, melyet viszont az alkalmazott azonosítási módszerrel nem tudtam kiküszöbölni. ElképzelhetĘ, hogy a vizsgált törzsek egy része valójában nem a P. fluorescens, hanem a P. putida taxon képviselĘje. A Pseudomonas aeruginosa csoportban a A9 és A5/2 jelĦ törzsek antagonista hatása volt a legjelentĘsebb, a másik Pseudomonas sp. fluorescens-putida csoportból pedig a P80 és F44 jelĦ törzsek emelkedtek ki gátló hatásukat illetĘen. E vizsgálatot követĘen a Pseudomonas aeruginosa baktériumtörzseket a következĘ felmérésekbĘl kirekesztettem, illetve a nem tenyésztettem tovább Ęket, mert lehetséges, hogy emberben bĘrallergiát okozó faktort is hordozhatnak, amit nem tudtam kizárni.

Eredmények

89

Pseudom onas sp.

Pseudom onas aeruginosa

45%

55%

23. ábra Huszonhat Pseudomonas sp. törzs antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben, a gátlóképesség (kontroll százaléka) számtani átlagával kifejezve

Pseudom onas sp. Pseudom onas aeruginosa

40% 60%

24. ábra Huszonhat Pseudomonas sp. törzs antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben, a gátlóképesség (kontroll százaléka) számtani átlagával kifejezve

A Pseudomonas aeruginosa baktériumtörzsek növényi kórokozó gombákkal szembeni gátló hatása kevéssé kutatott terület, mivel ez a faj opportunista emberi kórokozó is egyben. Ezzel együtt azonban gyakori, ubikvista tagjai a talaj-ökoszisztémának, így a talajok mikrobaközösségével állandó kölcsönhatásban vannak. Jelen vizsgálat során a tesztgombákkal szemben az egyéb nem patogén Pseudomonas sp. törzsekhez képest szignifikánsan nagyobb mértékĦ gátló hatást mutattak. A fluorescens-putida csoport tagjai ugyanakkor szintén sikerrel alkalmazhatóak a talajban elĘforduló növényi kórokozókkal szemben, pl. az alma talajuntság elleni védekezésben, melyet tenyészedényes vizsgálatok bizonyítanak (BIRÓ et al., 1998; BUYSENS et al., 1999).

90


Az laboratóriumi bioteszt-módszerek összehasonlítása a Pseudomonas sp. törzsek antagonista képessége szempontjából A baktériumtörzsek antagonista hatásában jelentĘs eltérés mutatkozott a két említett módszer között. A legerĘsebb gátlást a szélesztéses technikával beállított tenyésztésnél mértem. A szélesztéses módszer esetében a tápközeghez adagolt vas (Fe3+) a baktériumtörzsek többségénél csökkentette az antagonizmus mértékét, így feltehetĘ, hogy a gátlás kialakításában a vaskötĘ jellegĦ sziderofor(ok) termelésének fontos szerepe van. A Rhizoctonia solani ATCC 13289 gomba elleni gátló hatás kialakulásában viszont elsĘsorban másféle mechanizmus (pl. antibiotikum-termelés) játszhat szerepet. Ez az összefüggés, illetve kétféle viselkedés a törzsek eredete, sziderofor-termelése és antagonista hatása között számított fĘkomponens-analízis (principal component analysis; PCA) euklidészi biplot diagramján (kettĘs szórásdiagram) is megkülönböztethetĘ (25. ábra). A SYNTAX 2000 program (PODANI, 1997) által generált diagramon a feketével jelölt feliratok az objektumok, a kékek a változók. A változókhoz (paraméterekhez) az origóból piros színĦ szakaszok futnak. Ha egy objektumot reprezentáló pont rajta van egy adott paraméterhez vezetĘ piros szakaszon, akkor azon objektum elválása esetében az illetĘ paraméter a legmeghatározóbb, lehet egyszerre több is. Ha a szakasz az adott objektumhoz tart, de az nincs rajta a szakaszon akkor a szakasz, valamint az adott pont és az origó között húzott képzeletbeli vonal által bezárt szög jelzi, hogy mely paraméter(ek) meghatározó(ak) az objektum elválásában. A kis szög szorosabb kapcsolatot jelez, a nagyobb lazábbat.

25. ábra FĘkomponens-analízis: a Rhizoctonia solani és Fusarium solani növényi kórokozó gombák Pseudomonas sp. baktériumokkal (F: P. fluorescens-putida csoport, P: P. putida) szembeni érzékenysége. KettĘs szórásdiagram (euklidészi biplot), kifejtése a szövegben. GA: gátlás mértéke (a kontroll %-a), Fe: vassal dúsított táptalaj, Fus.: Fusarium, Rhi.: Rhizoctonia, Rel.szid.: a baktériumtörzsek relatív sziderofor-termelése.

A koordináta-rendszerben a baktériumtörzsek antagonista hatás alapján számított relatív elhelyezkedése is fel van tüntetve, esetükben azonban a 26. ábra mutatja jobban az

Eredmények

91

egyes törzsek közötti euklidészi távolságokat; itt viszont a gombafajok és kezelések elhelyezkedése torzult kissé. A Westsik-féle tartamkísérlet különbözĘ kezeléseire, mint a baktériumok származási helyére a 17. táblázat (85. oldal) római számainak megfelelĘ arab számok utalnak. Jóllehet a pontoltás esetében kisebb mértékĦ gátlást tapasztaltam, a baktériumok ekkor is megakadályozták a patogének szkleróciumainak kifejlĘdését az inkubáció teljes 8 napja alatt. A kapott adatokból kitĦnik, hogy az oltásnál alkalmazott két technika között statisztikailag igazolható különbség van. E módszerek immanens tulajdonsága ugyanis, hogy szélesztéssel hatékonyabb antagonizmust tapasztalunk (nagyobb méretĦ gátlási zónák alakulnak ki), mint pontoltással, mivel a biológiai kontroll ágens és a patogén mikroorganizmusok közvetlenül érintkezhetnek egymással. A 25. ábrán az egyes kezelések (tenyésztési körülmények) közötti távolság a törzsekhez viszonyítva nagy, ezen kívül a kezelések koordináta-rendszer különbözĘ negyedeiben helyezkednek el. A relatív sziderofor-termelés a jobb felsĘ, a Rhizoctonia solani gombával szemben kifejtett gátlás mértéke a jobb alsó, ugyanezen gombával és a Fusarium solani-val szembeni, de vassal kiegészített táptalajban kifejtett a bal alsó, valamint a F. solani gomba szaporodására gyakorolt gátló hatás a bal felsĘ szegmensben helyezkedik el. Ennek alapján megállapítható, hogy a számítás eredménye szerint a baktériumtörzsek antagonista hatása a) a Fusarium és a Rhizoctonia esetében a nem módosított táptalajban jelentĘsen eltérĘ módon és mértékben; b) a vassal kiegészített táptalajban viszont – a törzsek többsége esetében a relatív sziderofor-termeléstĘl függetlenül – inkább hasonló jelleggel fejezĘdött ki. A mikroszkopikus gombák érzékenysége tekintetében a legnagyobb euklidészi távolság mindegyik táptalajban történĘ tenyésztés esetén a Fusarium és a Rhizoctonia között feszül. Hasonlóan nagy azonban a Rhizoctonia-val szemben a normál és a módosított táptalajban regisztrált gátló hatások közötti távolság, ami arra enged következtetni, hogy könnyen felvehetĘ vas jelenlétében, illetve vashiányos környezetben eltérĘ mechanizmus játszhat szerepet a vizsgált Pseudomonas sp. baktériumok antagonista hatásának kialakulásában. A fĘkomponens-analízis eredménye alátámasztja azt a korábbi állítást, hogy a legtöbb törzs gátló hatása a Rhizoctonia solani gombával szemben a vaskiegészítéssel negatívan korrelál. Pozitív korreláció esetén ugyanis a pontfelhĘknek hasonló irányba kellett volna elmozdulniuk, vagyis a „GA Rhi” és „GA Rhi.Fe” pontokból az origóba futó egyenesek hegyesszöget zárnának be. Ahol tehát a gátlás mértéke normál táptalajban kisebb, ott a vassal kiegészítettben nagyobb lesz, ami e vizsgálatban azt jelenti, hogy a baktériumtörzsek a Rhizoctonia szaporodását nem sziderofor-termelésük, vagyis az ennek során megjelenĘ tápanyag-kompetíció révén, hanem egyéb módon gátolták. Mivel a vas számos bakteriális másodlagos anyagcseretermék elĘállításának mediátora lehet, ez az eredmény arra enged következtetni, hogy adott miliĘben a Rhizoctonia solani gomba térnyerésével szemben a vizsgált törzsek többsége ilyen anyagcseretermék, pl. antibiotikumok termelésével védekezhet. A 26. ábrán az egyes baktériumtörzsek Fusarium- és Rhizoctonia solani növényi kórokozó gombák telepnövekedésére gyakorolt gátló hatásai közötti euklideszi távolságok láthatók a kettĘs szórásdiagramon.

92


26. ábra FĘkomponens-analízis: a Pseudomonas sp. baktériumtörzsek (F: P. fluorescens-putida csoport, P: P. putida) eredete, sziderofor-termelése, valamint Rhizoctonia solani és Fusarium solani növénypatogén gombákkal szembeni antagonista hatása közötti összefüggés. KettĘs szórásdiagram (euklidészi biplot), kifejtése a szövegben. GA: gátlás mértéke (a kontroll %-a), Fe: vassal dúsított táptalaj, Fus.: Fusarium, Rhi.: Rhizoctonia, Rel.szid.: a baktériumtörzsek relatív sziderofor-termelése.

Az F08, P65 és F80 jelĦ törzsek relatív sziderofor-termelése olyan mértékben nagyobb volt a többinél, hogy a számítás során külön kategóriába kerültek, jóllehet csak a P80 törzs fejtett ki igen erĘs gátló hatást mindkét gombával szemben (20. és 22. ábra), azaz mind sziderofor-, mind feltételezett antibiotikum-termelés révén. Az ábrán az is látszik, hogy a Westsik-vetésforgó IV. (4) és VIII. (8) parcelláiból származó baktériumtörzsek egyöntetĦen viselkedtek, melynek egy lehetséges oka, hogy ezekben a szalma-, illetve gyökér- és zöldtrágyázott szakaszokban, ahol a szervesanyag-bevitel az istállótrágyához képest csekélyebb, a parlagoltatáshoz képest viszont kiegyenlítettebb, egy lassabban változó ökoszisztéma jött létre; ezért innét fĘleg a K-strategista törzsek voltak kitenyészthetĘk. Ez azonban az eredmények alapján egyelĘre feltevés, melyet új talajminták közösségi elemzésével (pl. PLFA-profil analízisével) lehetne megerĘsíteni. Az F04, F12, F22, F38, F41 és F47 törzsek Fusarium solani gomba elleni antagonizmusa nagyon hasonlóan alakult mind a normál, mind a vassal kiegészített táptalajon történt együtt-tenyésztés során. Gátló hatásuk a szideroforok kioltásával az F22 és F41 törzs kivételével jelentĘsen, mintegy felére csökkent ugyan (22. ábra), de még így is a többi törzshöz, illetve a normál táptalajon tapasztalt gátláshoz képest a legkisebb mértékben. Ez arra enged következtetni, hogy esetükben az antagonizmus kialakulásáért nemcsak sziderofor vegyületek, hanem egyéb másodlagos anyagcseretermékek termelése is felelĘs. Ennek alapján elképzelhetĘ, hogy természetes körülmények között antagonizmusuk stabilabb, illetve egységesebb a többi törzséhez képest, melyekben a fenti mechanizmusok közül inkább csak az egyik mĦködik. FeltehetĘen nagyobb metabolikus potenciáljuknak köszönhetĘen ezért pl. növényoltás során alkalmazva, egyéb törzsekhez képest elĘnyre

Eredmények

93

tehetnek szert a fiatal hajszálgyökerek kolonizálása közben, mert a niche-be tolakodó mikroorganizmusokkal szemben többféle módon is kifejthetik ellenállásukat. Ez utóbbi feltevést konkrét mérésekkel lenne célszerĦ megvizsgálni, pl. a FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) módszer segítségével, mellyel gyakran adott baktériumfaj, vagy legalább génusz környezeti mintából közvetlenül is kimutatható (LOY et al. 2003). RÓĩYCKI et al. (1999) erdeifenyĘ és tölgy rizoszférájából mutatott ki fĘként Pseudomonas putida és P. glathei (a törzsek 55%-a) és Bacillus (24%) fajokat bolygatatlan rendszerbĘl, az általuk termelt biológiailag aktív anyagok karakterizálását további kutatási témaként jelölte meg. Az F22 és F41 baktériumtörzsek esetében a gátló hatás vassal kiegészített táptalajon szignifikáns mértékben nagyobb volt, mint normál táptalajon. Ezek a törzsek mindkét vizsgált gombával szemben hasonló módon viselkedtek, azaz a sziderofor-termelés kioltásával antagonista hatásuk mértéke nem csökkent, hanem növekedett. Ez arra enged következtetni, hogy vas befogása révén nem tudnak versengeni más mikroorganizmusokkal, védekezésük, illetve térnyerésük másodlagos anyagcseretermékek, pl. antibiotikumok termelése révén valósul meg. Ezt szemlélteti az F41 törzs Rhizoctonia solani gombával történt együtt-tenyésztése (SZEGI, 1979) során készült képsorozat (27. és 28. ábra), ahol a 72 h inkubálást követĘen a gombafonalak már nem voltak fölfedezhetĘk a táptalajban.

24 h

36 h

27. ábra Egészséges és Pseudomonas sp. W.F41 törzs hatására károsodott gombafonál (Rhizoctonia solani ATCC 13289), 24 és 36 órás tenyészet

A Pseudomonas baktériumok növényi kórokozó gombákkal szembeni, antibiotikumok termelése révén kifejtett szaporodásgátló hatását VÁRADY (2001) vizsgálta részletesebben. Munkájában számos, Magyarország fĘ talajtípusaiból gyĦjtött Pseudomonas törzs antibiotikus hatását mutatta ki és rangsorolta. Eredményeim megerĘsítik e baktériumok antibiotikum-termelésének elterjedtségét különbözĘ mikrokörnyezetekben, ugyanakkor a Fusarium solani gomba esetében tapasztaltak aláhúzzák, hogy ettĘl eltérĘ mechanizmus is szerepet játszik egyes törzsek növényoltásra, illetve a biológiai védekezésben történĘ alkalmazhatóságának meghatározásában. Fenti szerzĘ eltérĘ környezetbĘl származó Pseudomonas törzsek sziderofor-termelését és az ennek révén különbözĘ tesztnövényekre kifejtett növekedés-serkentĘ hatását igazolta, de a szideroforok által kiváltott direkt

94


antagonista hatást nem vizsgálta. Ez utóbbi antagonizmus jelen munkában – ha egyetlen kórokozó gomba esetében is – közvetlen bizonyítást nyert. A gombákat gátló (antifungális) hatás azonban valószínĦleg egyéb, a sziderofor termelésétĘl eltérĘ tulajdonságoktól is függ, pl. antibiotikum-termelés, szaporodási sebesség, stb. (BIRÓ et al., 1998; BUYSENS et al., 1999). Valamely baktériumtörzs antagonista képessége nagymértékben függ továbbá magától a patogén ágenstĘl is.

48 h

72 h

28. ábra Egészséges és Pseudomonas sp. W.F41 törzs hatására károsodott gombafonál (Rhizoctonia solani ATCC 13289), 48 és 72 órás tenyészet

4.6.

4.6.1.

Környezeti tényezĘk baktériumokra gyakorolt hatása vizsgálatának eredményei

A FelsĘ-Tisza területérĘl származó izolátumok cianid- és nehézfémtĦrése Mindegyik vizsgált szennyezĘanyag – KCN, Zn(NO3)2, Cu(NO3)2, Pb(NO3)2 – néhány kivétellel gátolta a baktériumtörzsek szaporodását. A 29. ábra a FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából izolált törzsek tĦrĘképességét (MTC, maximum tolerált koncentráció) mutatja a mintavételi helyek sorrendjében. A legmérgezĘbb vegyület a ZnNO3 volt, azután KCN (e kettĘ között nem volt igazolható statisztikai eltérés), majd Cu(NO3)2 és Pb(NO3)2. A baktériumok hat-hétszer nagyobb koncentrációját is jól tolerálták, mint amekkora az a szennyezés idĘpontjában volt. A baktériumok mintavételi helyek szerinti összesített tĦrĘképessége alapján az egyes mintavételi pontokból származó törzsek a következĘ, toleranciájukat növekvĘ szakaszokban kifejezĘ sorrendbe állíthatóak: Tivadar < Balsa < Aranyosapáti = Záhony. Aranyosapáti és Záhony szakaszok között nem tapasztaltam szignifikáns különbséget, vagyis az e mintavételi helyszínekrĘl származó törzsek toleranciája nem tért el egymástól lényegesen.

Eredmények

95

350 Zn

CN

Cu

Pb

300

MTC (mg l-1)

250

Szennyezés (Szamos)

200 150 100 50 0

Tivadar

Aranyosapáti

Záhony

Balsa

Mintavételi helyek a folyó mentén, fentrĘl lefelé

29. ábra A FelsĘ-Tisza mintázott szakaszairól származó huszonöt baktériumtörzs cianid- és nehézfém-toleranciája (SzDP95% = 163,2)

A baktériumok tĦrĘképességének származási hely szerinti eltérésére – a szennyezĘanyagok nyilvánvalóan különbözĘ koncentrációin túl – egy, a törzsek anyagcserestratégiájával, illetve adaptációs képességével összefüggĘ magyarázat is kínálkozik. Tivadar a szennyezés beömlési helye fölött 705,8 fkm-nél helyezkedik el; itt a víz trofitása a tél végi állapotnak megfelelĘen alacsony volt (mintavétel 2000. február 10-én), ami azt jelenti, hogy az elsĘdleges producensek száma (aljzathoz nem kötött baktériumok, algák és protozoák, vagyis a tulajdonképpeni lebegĘ biomassza mennyisége) a melegebb idĘjárású hónapokhoz képest kicsi volt. Ez elvileg elĘállhatna úgy is, hogy sok (döntĘen oligotróf; fototróf vagy kemoorganotróf) faj néhány egyede van jelen, itt azonban az egyed- és a fajszám egyaránt csekély étéket mutatott. Ezen a szakaszon tehát az adott körülményekhez adaptálódott (Kstrategista), illetve a folyó felsĘszakasz-jellege (átlagos vízsebesség 6-8 km h-1) által széttördelt baktériumközösségek jöhettek létre; ennek megfelelĘen az izolátumok homogének voltak, közülük elsĘsorban ubikvista Pseudomonas sp. képviselĘket tudtam azonosítani. A szennyezés Aranyosapáti (668,6 fkm), illetve Vásárosnamény felett ömlött a Tiszába, ahol a folyó még felsĘszakasz jellegĦ, de lassabb (átlagos vízsebessége 4-6 km h-1). Itt helyenként még a téli idĘszakban is fajban gazdagabb mikrobaközösség alakulhat ki, mert a víz lassabb mozgása helyenként már 8-12 órás tartózkodást is lehetĘvé tesz egy meghatározott zugban. A cianid- és a nehézfémvegyületek mintegy szelekciós nyomást gyakoroltak e terület mikrobaközösségére, így itt néhány tágtĦrésĦ, illetĘleg cianidot szubsztrátként felhasználni képes baktériumfaj már nagy (az elĘzĘhöz képest két nagyságrenddel nagyobb) egyedszámban fordult elĘ. Acinetobacter és Aeromonas sp. képviselĘk mellett a Pseudomonas synxantha faj több törzsét izoláltam innét. A továbbiakban Záhony térségében (613,1 fkm) ismét csak a valamelyest felhígult szennyezĘdéshez és a kissé összeszĦkülĘ mederhez alkalmazkodott fajokat (P. veronii és P. fluorescens) találtam, majd Balsánál (544,1 fkm), ahol (Dombrádtól lefelé) a folyó már középszakasz jellegĦ, megjelent néhány Bacillus faj (B. cereus és B. thüringiensis) is. Ez

96


utóbbi azt jelzi, hogy a lebegĘ biomassza összetétele az e szakaszra jellemzĘ természetes állapothoz közelít. Általánosságban nem találtam összefüggést, vagy hasonlóságot a különféle génuszokba, illetve taxonómiai csoportokba tatozó egyes baktériumtörzsek tĦrĘképessége között, az ólom esetében azonban a törzsek kumulatív toleranciája (MTC; legnagyobb tolerált koncentráció) és az izolálás (származás) helye között nagy korreláció mutatkozott. Az egyes törzsek cianid-, Zn- és Cu-toleranciája ugyancsak nem tért el jelentĘs mértékben. A szennyezés beömlése környékérĘl – Aranyosapáti feletti vízterület – származó törzsek sokkal több fajhoz, illetve génuszhoz tartoztak, mint a többiek. Ezek az izolátumok összességében nagyobb tĦrĘképességrĘl tettek bizonyságot, mint a még nem szennyezett szakaszról származó társaik. Ez – a cianid- és nehézfémvegyületek által kifejtett szelekciós hatás mellett – azt is jelenti, hogy a szennyezett szakaszon olyan bakteriális közösség jelent meg, melynek genetikai potenciálja lehetĘvé tette (illetve teszi), hogy a környezeti faktorok okozta változásokhoz történĘ alkalmazkodás érdekében kiterjedt szelekciós alapanyag álljon rendelkezésre. A tivadari mintavételi helyrĘl – mely a Szamos torkolata fölött helyezkedik el – származó baktériumok kisebb diverzitást mutattak, innen fĘleg Pseudomonas fajok kerültek elĘ. A szennyezĘanyagok e törzsek szaporodását gátolták a legnagyobb mértékben, ami valószínĦleg az eladdig zavartalan közösség hiperszenzitív reakciója miatt alakult ki. E gátló hatás a szennyezés hígulásával (a folyó további szakaszain) gyors ütemben csökkent; a záhonyi és balsai vízmintákban ismét nagyobb tĦrĘképességĦ baktériumtörzsek fordultak elĘ. A szennyezett szakaszok vizének baktériumközösségei nagyobb változatosságot mutattak, amint ez az egyes törzsek taxonómiai besorolása és toleranciája igazolta. A tiszai cianid- és nehézfémszennyezés által okozott zavar mértéke azonban aláhúzza, hogy az a teljes ökoszisztéma szintjén – leginkább a magasabb rendĦ növények és állatok pusztulása révén – sokkalta nagyobb romboló hatást fejt ki, ahogy ezt pl. a nagyarányú halpusztulás során is láthattuk (FLEIT és LAKATOS, 2003). Az alternatív anyagcsereutakat beindító „forró foltokból” (mint amilyenek az erĘsen szennyezett folyószakaszok) szelektálódott, illetve kiválasztott baktériumtörzsek ezért a bioremediáció lehetséges eszközeiként fontos szerepet játszhatnak, melyre számos e témával foglalkozó kutató – pl. GIEG et al. (1999) – is felhívja a figyelmet.

4.6.2.

A FelsĘ-Tisza területérĘl és a Westsik-vetésforgóból származó, szelektált baktériumtörzsek nehézfémtĦrése Az elĘzĘ vizsgálat során nagy ellenálló-képességet mutató és a növényi hormonhatású anyagot termelĘ (4.4. fejezet), valamint a Westsik-féle vetésforgóból származó, diazotróf aktivitásuk, hormontermelésük és növénypatogén gombákkal szembeni antagonista képességük szelektált baktériumtörzsek nehézfémtĦrését együttesen vizsgáltam. E munkába összesen harminc törzset vontam be. A törzsek eredete (származási hely, gazdanövény) és nehézfém-vegyületekkel szembeni toleranciájuk között nem tapasztaltam összefüggést, ezért fémtolerancia-értékeik szerint csoportosítottam Ęket. Ennek alapján a vizsgált harminc baktériumtörzs kettĘ nagyobb és egy kisebb csoportot alkotott (30. ábra).

97

50

40

30

20

10

W.1 W.7 W.30 W.36 C.69 A.106 III.119 W.34 B.83 C.115 I.110 W.11 D.111 III.119 VI.404 III.108 W.20 W.32 W.4 B.4 W.41 A.3 W.10 W.37 W.13 W.12 W.35/2 W.6 W.40 D.2

Eredmények

30. ábra Harminc baktériumtörzs hasonlósági dendrogramja tíz nehézfém-vegyülettel szembeni összesített érzékenységük szerint, a szelektált PGPR törzsek kiemelésével. A, B, C, D, I, III, VI: tiszai törzsek. W: A Westsik-vetésforgóból származó törzsek.

98


A számítás UPGMA módszerrel, PODANI (1997) szerint, Syntax 2000 programmal készült. Látható, hogy mindegyik – nagyobb, illetve kisebb toleranciájú – csoportban egyaránt vannak mĦvelt, valamint természetes (vad) területrĘl származó törzsreprezentánsok. A pirossal jelzett csoport ellenálló-képessége volt a legnagyobb, a többi baktérium ennél gyengébb rezisztenciát mutatott és két alcsoportra bomlott. A jól és kevésbé ellenálló csoportok fajösszetétele között szembetĦnĘ különbséget vettem észre: a toleránsabb törzsek egy Bacillus thüringiensis és egy Pasteurella képviselĘ kivételével mind a Pseudomonas génuszba tartoztak: P. veronii (2), P. jensenii (1), P. gessardii (1), P. syringae (1) és P. fluorescens (1), valamint négy Pseudomonas sp. reprezentáns. Az érzékenyebb csoportba viszont nagyrészt Gram-pozitív pálcák és kokkuszok kerültek, két Aeromonas és egy Pseudomonas sp. képviselĘ mellett: Bacillus licheniformis, Staphylococcus sp., Corynebacterium sp. A sejtfal kémiai összetétele és szerkezete egyike a baktériumfajok legfontosabb megkülönböztetĘ jegyeinek (SZABÓ 1992). A baktériumsejt külsĘ merev takarója a murein, mely biztosítja a sejt fajra jellemzĘ alakját. A Gram-negatív sejtek esetében ennek vastagsága feltehetĘen csak egy peptidoglikán-molekulának felel meg, emiatt csak kb. 10%át teszi ki a fal szárazanyagának A Gram-pozitívoknál a murein vastag és homogén szerkezet, sokkal vastagabb, mint a Gram-negatívok sejtfalának valamennyi rétege együttvéve. Utóbbiak fala elkülönült lipoprotein és poliszacharid rétegekbĘl épül fel, míg az elĘbbieknél ilyen megoszlást nem tapasztaltak (SCHLEIFER és KANDLER 1972). A Gram-pozitív baktériumok falának vastag mureinrétegébe glicerin-, vagy ribitfoszfátok vízoldható polimerjei (a teichosavak) kovalens kötéssel épülnek be. Újabban feltételezik, hogy a teichosavak erĘsen befolyásolhatják az ionok (pl. fémionok) áthatolását a sejt külsĘ felületi rétegein, mert a sejtburokban szabályosan elhelyezkedĘ nagy töltéssĦrĦséget biztosítanak. A Gram-negatív sejtfal külsĘ membránja foszfolipid kettĘsréteg, mégis csak viszonylag kicsiny molekulák számára átjárható. Véd az extracelluláris hidrolitikus enzimek aktivitásával szemben és számos anyagnak diffúziós akadályt állít. Vasionok, szénhidrátok és vitaminok felvételi rendszereit tartalmazza, míg a benne lokalizált pórusképzĘ proteinek számos kis molekulatömegĦ anyag felvételében mĦködnek közre. Ezek a pórusok a membránfelszín töltésmegoszlásától függĘen megnyílni és záródni képesek. NIKAIDO és VAARA (1985) többek között a külsĘ membránnak tulajdonítják a sejt védelmét detergensekkel és emésztĘ enzimekkel szemben, az antibiotikumok behatolásának gátlását, a sejtfelszín erĘs hidrofilitását, mely a fagocitózis ellen véd, valamint bizonyos mértékĦ komplement-rezisztenciát. ElképzelhetĘ mindemellett az is, hogy nagy nehézfémtĦrésĦ Pseudomonas sp. baktériumtörzsek többféle komplexképzĘ enzimet termelhetnek, melyek csökkenthetik a fémionok okozta toxicitás mértékét. BARKAY et al. (1985) a Gram-negatív baktériumok számának szignifikáns növekedését tapasztalta olyan talajokban, melyek Cd-, Cu-, Pb- és Zn-szennyezettsége – nagy mennyiségĦ szennyvíziszap hosszú idĘn keresztül történt kijuttatása miatt – igen erĘs volt, ráadásul Gram-pozitív baktériumtörzseket nem is tudott izolálni e talajokból.

4.6.3. Nehézfémek oligodinámiás hatásának megállapítása A fentiekben vizsgált – növényi növekedést serkentĘ – baktériumok közül hét törzset választottam ki nehézfém-vegyületekkel szembeni ellenálló-képességük alapján úgy, hogy a közöttük mindkét mintavételi területre (kultúr- és vad) jellemzĘ képviselĘk legyenek: Bacillus sp. W.7, Pasteurella sp. W.30, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas sp. W.36, Bacillus thüringiensis C.69, valamint III.108, III.119. Ezek átlagos érzékenysége között nem találtam statisztikailag igazolható különbséget (31. ábra).

Eredmények

99

(NH4)6Mo7O24 (SzDP5% = 13,66)

Zn(NO3)2 (SzDP5% = 19,02) 50

140

100

120

200

100

400

80

800

60

1600

40 20

160 Relatív szaporodás (kontroll%)

Relatív szaporodás (kontroll%)

160

50

140

100

120

200

100

400

80

800

60

1600

40 20 0

0 W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

W.1.

III. 119.

W.7.

Baktériumtörzsek

ZnCl2 (SzDP5% = 8,09)

III. 119.

50

50 100

120

200

100

400 800

80

1600 60 40 20



III. 108.

Pb(NO3)2 (SzDP5% = 22,34)

140

W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

140

100

120

200 400

100

800 80

1600

60 40 20 0

III. 119.

W.1.

Baktériumtörzsek

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

III. 119.

Baktériumtörzsek

CuSO4 (SzDP5% = 17,13)

FeSO4 (SzDP5% = 20,56)

160

160

50

140

100

120

200

100

400 800

80

1600

60 40 20



C 69.

160

0

0

50

140

100

120

200

100

400

80

800 1600

60 40 20 0

W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

III. 119.

W.1.

W.7.

Baktériumtörzsek

W.36.

C 69.

III. 108.

III. 119.

Fe(NO3)3 (SzDP5% = 22,46)

Cu(NO3)2 (SzDP5% = 20,31) 140

100

120

200

100

400

80

800 1600

p

40 20


50

60

W.30.

Baktériumtörzsek

160 Relatív szaporodás (kontroll%)

W.36.

Baktériumtörzsek

160

160

50

140

100

120

200

100

400

80

800

60

1600

40 20 0

0 W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

W.1.

III. 119.

W.7.

Baktériumtörzsek

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

III. 119.

Baktériumtörzsek

FeCl3 (SzDP5% = 24,73)

CuCl2 (SzDP5% = 17,28)

160

180

50

140

100

120

200

100

400 800

80

1600

60 40 20 0



W.30.

50

160

100

140

200

120

400

100

800

80

1600

60 40 20 0

W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

Baktériumtörzsek

III. 108.

III. 119.

W.1.

W.7.

W.30.

W.36.

C 69.

III. 108.

III. 119.

Baktériumtörzsek

31. ábra Hét baktériumtörzs relatív szaporodása tíz nehézfém-vegyület különbözĘ koncentrációi (μM) mellett Az oszlopokra írt szakaszok a szignifikáns differencia mértékét jelzik (P = 95%).

100


A szelektált baktériumok nehézfémekkel szembeni toleranciáját e hét reprezentatív törzs tíz nehézfém-vegyülettel végzett vizsgálata eredményeinek példáján mutatom be. Az ábrán a félszakaszok a szignifikáns differencia értékét (SzDP95%) jelölik. A fémvegyületek közül a környezetvédelmi szempontból kiemelten veszélyes ólom vegyületei a réz- és cink-vegyületekhez képest csak kevésbé gátolták törzsek szaporodását; ezért feltételezhetĘ, hogy a baktériumok – a származási hely szennyezettségéhez adaptálódva – ólomvegyületekbĘl nagyobb mennyiséget tolerálnak. A vas-vegyületek esetében a mikroelem-hatás is szerepet játszhat, azaz a vizsgált törzsek a vasat anyagcseréjükhöz felhasználják, a gátló hatás erĘsségét itt inkább az oldatban disszociált anionok határozzák meg. A FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének, valamint a Westsik-féle homokjavító vetésforgó tartamkísérlet különbözĘ parcelláinak talajából, illetve a termesztett növények rizoszférájából izolált baktériumtörzsek nehézfém-vegyületekkel szembeni toleranciájáról összefoglalóan a következĘket állapítottam meg: a) A törzsek reakciói eltérĘek voltak: mind adott nehézfémre, mind törzsenként egy-egy fémvegyületre vonatkoztatva. A legtoxikusabb [(NH4)6Mo7O24] és legkevésbé mérgezĘ [Fe(III)(NO3)3] vegyületekkel szembeni reakcióik ugyanakkor hasonlóaknak mondhatók. Nem volt olyan törzs, melyet a vizsgált vegyületek mindegyike gátolt volna; a 10 fémvegyület a törzsek 64-91 %-át gátolta a vizsgált koncentrációtartományban. b) Nem mutatkozott viszont szignifikáns különbség a Westsik-féle homokjavító vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza árterén vett talajmintákból származó törzsek nehézfém-érzékenységi spektruma között (31. ábra), ami rezisztenciájuk törzsfüggĘ tulajdonságára utal, és valószínĦleg hosszabb távú (és esetleg nagyobb mértékĦ) hatásra van szükség bizonyos fokú adaptáció kialakulásához. c) A nehézfémek szulfát formái általában nagyobb mértékben gátolták a törzsek szaporodását; a nehézfém-vegyületekben szereplĘ nitrát ellensúlyozta az adott fém toxikus hatását, mely kis koncentrációknál a szaporodás serkentésében nyilvánult meg a vizsgált tartományban. d) A nehézfém-vegyületeket gátló hatás szerint csökkenĘ sorrendbe téve, a vizsgált törzsek MTC értékeinek alapján a következĘ toxicitási sorozat alakult ki (32. ábra): (NH4)6Mo7O24, > CuSO4, > ZnCl2, > Cu(NO3)2, > Zn(NO3)2, > CuCl2, Pb(NO3)2, > Fe(II)SO4, > Fe(III)Cl3, > Fe(III)(NO3)3.

Eredmények

101

Összesített MTC (μM)

30000

*

SzDP95% = 1896

25000

*

20000 15000

* *

10000

*

5000

NO 3)3 II)( Fe (I

Fe (III )Cl 3

O4 I)S Fe (I

3)2 Pb (NO

Cu Cl2

Zn (NO 3 )2

Cu (NO 3)2

Zn Cl2

Cu SO 4

(N H 4)6 M

o7O

24

0

32. ábra Tíz nehézfém-vegyület hatása harminc baktériumtörzs szaporodására (összesített MTC; μM). A félszakaszok a pozitív szignifikáns differencia mértékét jelzik. A tolerancia sorrendjében következĘ szignifikánsan nagyobb MTC-értékek csillaggal jelzettek. Az oszlopokra írt félszakaszok a szignifikáns differencia mértékét jelzik P = 95% megbízhatósági szinten.

102


4.6.4.

Fémekkel szembeni tolerancia: szennyezés hatására kialakuló adaptáció, vagy kiválasztódás A baktériumok nehézfémekkel szembeni tĦrĘképességét számos fém esetében megfigyelték már. Egyik legtöbbet tanulmányozott példa az volt, hogy egy Alcaligenes eutrophus törzs, melyet cinkülepítĘ tankból izoláltak, hatékony kationcserélĘ mechanizmussal rendelkezett, mely képessé tette igen nagy cink, kadmium és kobaltkoncentrációk elviselésére laboratóriumi körülmények között (MERGEAY et al. 1985, NIES et al. 1989). A baktériumok és mikroszkopikus gombák toleranciájában szerepet játszó biokémiai folyamatok igen eltérĘek lehetnek: fémionok fehérjék, extracelluláris polimerek segítségével történĘ megkötése, vagy a sejtfalhoz történĘ adszorpciója, továbbá sejten belüli zárványok, vagy oldhatatlan fémszulfidok képzése, csökkentett sebességĦ felvétel, illetve fokozódó transzport, valamint volatilizáció. Ezek között vannak általánosan elterjedt, de törzs-specifikus mechanizmusok is (COOKSEY 1993, ROSS 1993, TOMSETT 1993). A mezĘgazdasági használatú talajokban élĘ baktériumok nehézfémekkel szembeni tĦrĘképességérĘl többen megállapították, hogy nagy mértékĦ szennyezések esetén a toleráns törzsek száma az idĘvel egyre növekedik (ABAYE et al. 2005). Korábban már OLSON és THORNTON (1982) is szoros összefüggést talált a fémekkel szemben toleráns baktériumtörzsek aránya és néhány bányászati terület erĘsen szennyezett talajának Cd- és Zn-koncentrációja között. CAMPBELL et al. (1995) arról számolt be, hogy ipari létesítmények területének talajából izolált Pseudomonas sp. törzsek toleranciája szignifikánsan nagyobb volt, mint a nem szennyezett mezĘgazdasági talajokból származó izolátumoké. GILLER et al. (1998) számos olyan vizsgálatról tudósított, melyek a talajban szabadon, illetve rizoszférához asszociáltan élĘ baktériumok nagyrészt Cd-, Cu- és Zntoleranciájával foglalkoztak. A legtöbb esetben azt tapasztalták, hogy az expozíciós idĘ növekedésével a tesztelt törzsek toleranciája is nagyobb lett. E kísérletek közös vonása, hogy a baktériumok, illetve közösségeik tĦrĘképességét a tenyészetek valamely táptalajban történĘ inkubálása révén mérték, melyek elkerülhetetlenül szelektívek. Minthogy a baktériumsejtek igen különbözĘ élĘhelyeken is nagy tömegben vannak jelen, számos olyan faj lehet közöttük, melyek a hagyományos táptalajokon nem tenyészthetĘk (ún. VBNC; élĘ, de nem tenyészthetĘ fajok). Ezért az ilyen típusú vizsgálatok eredményeit csak nagy körültekintéssel szabad – ha egyáltalán – a természetes közegekre kiterjeszteni (ROSZAK és COLWELL 1987, AMANN et al. 1995). Mégis szükséges ismereteket gyĦjteni a gyakorlatban oltásra felhasználható tĦrĘképességét illetĘen, valamint a toleráns törzseket kiválasztani. GILLER et al. (1989) pl. megemlítették, hogy két hónappal a tĘzeges talajoltás után nem tudtak élĘ Rhizobium leguminosarum bv. trifolii törzset izolálni a talajból, mert az oltóanyag-gyártásra felhasznált baktériumokat elĘzĘleg – laboratóriumi körülmények között – nem szelektálták nehézfémtĦrĘ képesség alapján. Az oltás viszont erĘsen szennyezett ipari területen történt. A mikrobák sokfélesége A talajok mikrobaközösségei az általános nézet szerint különösen változatosak. Becslések szerint egyetlen gramm talaj 13.000 különbözĘ baktériumfajt tartalmazhat (TORSVIK et al. 1994), a talajban élĘ mikroszkopikus gombák és algák diverzitása pedig nagyrészt felderítetlen. Bár a genetikai sokféleség a jelenlegi felfogás szerint nagyobb stabilitást kölcsönöz adott ökológiai rendszer számára, ennek kísérletes bizonyítására csak néhány szerzĘ vállalkozott (pl. WALKER 1989). Egy korábbi feltételezés (ATLAS 1984) szerint a környezetszennyezés adott területen csökkenti a mikrobák változatosságát, értve ez alatt mind a kevésbé ellenálló fajok eltĦnését, mind a stressztĦrĘk helyi elszaporodását. A

Eredmények

103

stabil, „beállt” és tápanyagokat fölöslegben tartalmazó környezet viszont lehetĘvé teszi a különösen versenyképes fajok dominanciáját (AUSTIN és SMITH 1989), míg enyhébb stressz csökkentheti e kompetitív kizárás hatását. A környezeti terhelés és a fajdiverzitás mértéke közötti összefüggés tehát haranggörbével írható le, mely állati és növényi közösségek tekintetében természetesnek tĦnik (ROZENZWEIG és ABRAMSKY 1993). Újabb eredmények szerint e modell a mikroorganizmusok környezeti ágensekkel szembeni viselkedésére is alkalmazható (WARDLE és GILLER 1996, GILLER et al. 1997). A mikrobaközösségek ily módon megnyilvánuló funkcionális stabilitásának elméletét – mely szerint adott faj törzsei átvehetik egy másik, visszaszorult vagy eltĦnt faj szerepét (TOBORKAPLON et al. 2005) – a FelsĘ-Tisza mentén izolált baktériumtörzsek elĘfordulására, valamint cianid- és nehézfém-toleranciájára vonatkozó szerény eredményeim is megerĘsítik.

4.6.5.

A szelektált baktériumtörzsek növekedés-serkentĘ hatása a gazdanövényekre axénikus kultúrában A bükköny, csillagfürt és rozs tesztnövények a baktériumokkal történt kezelésre (magoltás) eltérĘ módon reagáltak. Fehérvirágú csillagfürt esetében gyakorlatilag mindegyik baktériumtörzs a kontrollhoz képest szignifikáns mértékben növelte a gazdanövény valamely föld feletti, vagy -alatti részének hosszát és tömegét (33. ábra). A hajtás-elágazások számát azonban egyik kezelés sem befolyásolta; az minden esetben megegyezett a kontrollal. A növényi részek közül szinte mindegyik törzs esetében a gyökértömeg volt szignifikánsan a legnagyobb. ValószínĦsíthetĘ, hogy a kiválasztott törzsek a magoltást követĘen meg tudtak telepedni a csillagfürt növény hajszálgyökerein. A rekolonizációs képességet azonban itt, és a többi tesztnövény esetében is valamely közvetlen módszerrel lenne még célszerĦ igazolni, pl. LiveDead BackLight KitTM (fluoreszcens festés), vagy FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció) módszer alkalmazásával.

700

SzDP95% = 66,0

Kontroll %

600 500 400 300 200 100

W .3 0

W .1

W .3 7

W .3 4 D. 11 1

W .7

W .1 0

B. 83 A. 10 6

C. 69

W .3 2

0

Törzsek GH

GS

GT

HH

HS

HT

33. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása csillagfürt növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GH: fĘgyökér hossza, GS: oldalgyökerek száma, GT: gyökér tömege, HH: hajtás hossza, HS: hajtáselágazások száma, HT: hajtás tömege.

104


A csillagfürt gyökerének növekedését legjobban serkentĘ baktériumtörzsek a Bacillus subtilis W.32, a Bacillus thüringiensis C.69, a Pseudomonas gessardii B.83 és az Aeromonas hydrophyla A.106 voltak. A Pseudomonas veronii W.10 törzzsel történt kezelés az összes többihez képest szignifikánsan serkentette a gyökerek megnyúlását, a P. corrugata W.34 viszont hasonló mértékben növelte a hajtás tömegét. A kétszikĦ fehérvirágú csillagfürt a legtöbb esetben a gyökér hosszának és tömegének megnövekedésével jelezte a baktérium partnerek tevékenységét, mely az auxin hormonhoz hasonló hatású anyagcseretermék jelenlétével analóg. A szöszös bükköny esetében viszont néhány baktériumtörzs hatására a hajtás tömege gyarapodott igen nagy mértékben (Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas veronii D.111, P. gessardii B.83), ugyanakkor a gyökerek tömege ehhez képest sokkal kisebb volt, bár a kontrollhoz viszonyítva így is kb. tízszeres. E hatás a gibberellinéhez (GS3) hasonlatos. Más törzsek (kivétel a Pseudomonas sp. W.37 és P. veronii W.10) a csillagfürtnél tapasztaltakkal egyezĘen a gyökértömeg jelentĘs növekedését okozták (34. ábra). Ez arra enged következtetni, hogy a különbözĘ baktériumok által termelt anyagok a növény eltérĘ részeibe helyezĘdhettek, de valószínĦ, hogy a gibberellinek számos élettani hatást az auxinokkal együttmĦködésben, azok endogén koncentrációjának fokozása révén fejthetnek ki (EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH 2004, PARK et al 2005). A legaktívabb törzseket kiválasztottam lehetséges oltóanyag-komponensként: Bacillus thüringiensis C.69, B. subtilis W.32, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111, P. corrugata W.34.

6000

SzDP95% = 727,4

Kontroll %

5000 4000 3000 2000 1000

W .1

W .1 0 W .3 2

W .3 4

W .7

W .3 7

W .3 0

B. 83 A. 10 6

C. 69 D. 11 1

0

Törzsek GH

GS

GT

HH

HS

HT

34. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása bükköny növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GH: fĘgyökér hossza, GS: oldalgyökerek száma, GT: gyökér tömege, HH: hajtás hossza, HS: hajtáselágazások száma, HT: hajtás tömege.

A rozs egyszikĦ növény, melynek bojtos gyökérzete miatt a gyökér-elágazások száma nem volt értelmezhetĘ, az egyes gyökerek számában pedig nem találtam szignifikáns különbséget a kontroll, valamint a kezelések között. Nem találtam a véletlen hatásán túlmutató különbséget a kontroll és az oltott növények többi mért változója (hajtások hossza, száma és tömege) esetében sem, a gyökerek tömegének kivételével. Ebben feltehetĘen az játszott szerepet, hogy a Pseudomonas sp. W.37-es törzsével kezelt növények

Eredmények

105

gyökereinek összes tömege mintegy tízszeresen haladta meg a kontroll vonatkozó értékét, míg a többi paraméter tekintetében maximum 4,5-szeres növekedést tapasztaltam. A szignifikáns differenciát ezért itt csak a gyökértömeg-értékek között számítottam ki. Ez az eredmény szintén az auxin-hatású másodlagos anyagcseretermékek által indukált növekedéssel mutat hasonlóságot, de feltehetĘen inkább a növény tápanyagfelvételének intenzitása fokozódott, melynek révén nedves tömege kiugróan megnövekedett. A törzsek többsége a bokrosodást is serkentette. A legaktívabb baktériumtörzseket ez esetben is kiválasztottam lehetséges oltóanyagkomponensként: Pseudomonas sp. W.37, Bacillus subtilis W.32, Pseudomonas veronii D.111, Aeromonas hydrophyla A.106, Bacillus sp. W.7, Bacillus thüringiensis C.69. A kontrollhoz képest jelentĘsebb (4,5×) növekedést tapasztaltam hajtások hossza tekintetében a Pseudomonas sp. W.1 és Pseudomonas gessardii B.83 törzsekkel, a hajtások összes tömegére vonatkozóan pedig a P. veronii W.10 törzzsel végzett oltás során (35. ábra).

1200

GT SzDP95% = 158,8

Kontroll %

1000 800 600 400 200

W .1 0

B. 83 W .3 0 W .3 4

W .1

C. 69

W .7

A. 10 6

W .3 2 D. 11 1

W .3 7

0

Törzsek GS

GT

HH

HS

HT

35. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása rozs növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GS: gyökerek száma, GT: gyökerek összes tömege, HH: hajtások hossza, HS: hajtások száma, HT: hajtások összes tömege.

Az axénikus kultúrában nevelt bükköny és csillagfürt növények gyökerén – megfelelĘ szimbionta partner hiányában – nem tapasztaltam gümĘképzést, ezért e képességet nem is vettem fel a mérendĘ paraméterek közé. A kiválasztott baktériumtörzsek gümĘképzésre gyakorolt hatását újabb, koinokulációval végrehajtott tenyészedényes vizsgálat során lehetne megállapítani. BIRÓ et al. (1998) arra hívták fel a figyelmet, hogy a növényoltás sikere a gazdanövény kompatibilitásától és környezeti tényezĘkkel szembeni tĦrĘképességétĘl is függ. A laboratóriumi módszerekkel elért eredmények szabadföldi viszonyokra történĘ kiterjesztésével óvatosan kell eljárni, mégis reális igény a gyakorlatban oltásra felhasználható, ellenálló, ugyanakkor hatékony törzsek felkutatása is.

106

4.7.


Új tudományos eredmények

4.7.1. Rizoszférából, talajból és folyóvízbĘl származó baktériumtörzsek A növények gyökerét kolonizáló, növekedés-serkentĘ baktériumok némelyikénél már kimutatták, hogy anyagcseretermékeik révén rövidebb-hosszabb ideig tartó rezisztenciát képesek kiváltani a gazdanövény földfeletti részében (pl. LIU et al., 1995). Amennyiben pozitív összefüggést lehet kimutatni a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet, valamint más, homok-, illetve öntéstalajos területekrĘl származó („vad” típusú), rizoszférában domináns baktériumtörzsek növényi fiziológiai hatását illetĘen, akkor indokolt ezt a szempontot is figyelembe venni a növényoltáshoz használható törzsek szelekciójánál. Ennek vizsgálatára negyvenhét Gram-negatív és Gram-pozitív, zömmel pálcika alakú baktériumtörzset azonosítottam, majd ökofiziológiai tulajdonságaik alapján szelektáltam Ęket homoktalajon termesztett pillangós takarmánynövények növekedése, illetve hozama serkentésének céljából. A különbözĘ mintavételi területekrĘl a következĘ mikroorganizmusokat vontam vizsgálat alá: a Westsik-féle homoki vetésforgó-tartamkísérletben (Nyíregyháza) termesztett rozs, bükköny és csillagfürt növények 1/ rizoszférájából, illetve rizoplánjából (18 törzs: Staphylococcus sp. W.6, W.13, S. cohnii ssp. cohnii W.9, Bacillus sp. W.7, W.10, W.14, W21, Bacillus megaterium W.15, W.18, Bacillus subtilis W.32, Corynebacterium sp. W28, Pseudomonas vesicularis [újabban Brevundimonas vesicularis, GARRITY et al. 2004] W20, Pasteurella sp. W.30, W.31, Pseudomonas sp. W.1, W.36, Pseudomonas corrugata W.34, W.35), valamint a 2a/ FelsĘ-Tisza ártéri talajából (8 törzs: Pseudomonas syringae I.110, Pseudomonas sp. I.401, II.109, II.407, VI.87, VI.404, VI.405, VII.101), 2b/ parti talajából (9 törzs: P. azotoformans III.118, P. jensenii III.119, Pseudomonas sp. III.103, III.106, III.108, V.104, VIII.97, VIII.102, VIII.120) és 3/ felszíni vizébĘl (12 törzs: Aeromonas media A66, A.89, A.92, A.93, A.94, Pseudomonas gessardii B.83, Bacillus thüringiensis C.69, C.107, Pseudomonas sp. C.115, C.116, D.94, Pseudomonas veronii D.111). 4.7.2.

Rizoszférából izolált, szabadon élĘ baktériumtörzsek nitrogénkötĘ képessége A Westsik-féle homokjavító vetésforgóból származó baktériumtörzsek egy csoportja esetében sikerült kimutatni a diazotróf aktivitást, melyet fiziológiai bioteszt módszerrel szilárd táptalajon, valamint az acetilénredukciós aktivitás (ARA) révén is fel tudtam mérni. Az aktív törzsek többsége a Pseudomonas nemzetség, két Bacillus faj és egy Flavobacterium indologenes törzs képviselĘje volt. E génuszokhoz tartozó fajképviselĘk diazotróf aktivitását az utóbbi idĘben több szerzĘ is kimutatta. A szabadon élĘ, vad és termesztett növények rizoszférából izolált N2-kötĘ baktériumtörzseket indolecetsav és gibberellinek termelése, valamint növénypatogén gombákkal (Fusarium, Rhizoctonia és Verticillium sp.) szembeni antagonista képességük alapján szelektálták és – egyelĘre axénikus kultúrában – sikerrel alkalmazták a gazdanövények erĘteljes fejlĘdésének támogatására (RÓĩYCKI et al. 1999, ELO et al. 2000, PAL et al 2001, EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH 2004 és ÇAKMAKÇI et al. 2005). 4.7.3.

Néhány környezeti tényezĘ hatása a reprezentatív baktériumtörzsekre

A FelsĘ-Tisza területérĘl származó törzsek cianid- és nehézfém-tĦrése Általánosságban nem találtam összefüggést, vagy hasonlóságot a különféle génuszokba, illetve taxonómiai csoportokba tatozó egyes baktériumtörzsek tĦrĘképessége között, az ólom esetében azonban a törzsek kumulatív toleranciája (MTC; legnagyobb

Eredmények

107

tolerált koncentráció) és az izolálás (származás) helye között nagy korreláció mutatkozott. Az egyes törzsek cianid-, Zn- és Cu-toleranciája ugyancsak nem tért el jelentĘs mértékben. A szennyezés beömlése környékérĘl – Aranyosapáti feletti vízterület – származó törzsek sokkal több fajhoz, illetve génuszhoz tartoztak, mint a többiek. Ezek az izolátumok összességében nagyobb tĦrĘképességrĘl tettek bizonyságot, mint a még nem szennyezett szakaszról származó társaik. Ez – a cianid- és nehézfémvegyületek által kifejtett szelekciós hatás mellett – azt is jelenti, hogy a szennyezett szakaszon olyan bakteriális közösség jelenhetett meg, melynek genetikai potenciálja lehetĘvé tehette, hogy a környezeti faktorok okozta változásokhoz történĘ alkalmazkodás érdekében kiterjedt szelekciós alapanyag álljon rendelkezésre. A FelsĘ-Tiszáról és a Westsik-vetésforgóból származó baktériumtörzsek nehézfémtoleranciája A két eltérĘ mintavételi területrĘl származó, különbözĘ idĘszakokban izolált baktériumtörzsek tíz nehézfémvegyülettel szembeni tĦrĘképességét egyidejĦleg is megvizsgáltam. A legfontosabb megállapítások a következĘk: - Nem mutatkozott lényeges különbség a Westsik-féle homokjavító vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza vizébĘl, valamint ártéri talajából származó baktériumtörzsek nehézfémérzékenységi spektruma között, ami rezisztenciájuk egyedi specifikusságára utal, ezért adaptációjuk valószínĦleg csak hosszabb – a laboratóriumi vizsgálat tartamát mindenképpen meghaladó – idĘ elteltével alakulhat ki. - A jól és kevésbé ellenálló csoportok fajösszetétele között viszont különbséget vettem észre: a toleránsabb törzsek a Bacteria domén BXII. Proteobacteria törzsébe, azon belül túlnyomórészt a III. Gammaproteobacteria osztályba tartoztak. Zömük a Pseudomonas génusz tagja. Az érzékenyebb csoportba ezzel szemben nagyrészt Gram-pozitív pálcák és kokkuszok kerültek, melyek a BXIII. Firmicutes törzs képviselĘi, legtöbben Bacillus fajok. E szétválás oka feltehetĘen a Gram-negatív (Pseudomonas sp.) és Gram-pozitív (Bacillus sp.) sejtfal eltérĘ felépítésében, összetételében, illetve áteresztĘképességében keresendĘ. - A nehézfémek szulfát formái általában nagyobb mértékben gátolták a törzsek szaporodását; a nehézfém-vegyületekben szereplĘ nitrát ellensúlyozta az adott fém toxikus hatását, mely kis koncentrációknál a szaporodás serkentésében nyilvánult meg a vizsgált tartományban. - A fémvegyületek toxicitási sorrendje a vizsgált törzsek MTC értékeinek alapján a következĘképpen alakult: (NH4)6Mo7O24, > CuSO4, > ZnCl2, > Cu(NO3)2, > Zn(NO3)2, > CuCl2, Pb(NO3)2, > Fe(II)SO4, > Fe(III)Cl3, > Fe(III)(NO3)3.

4.7.4.

A baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó és serkentĘ tulajdonságai Két különbözĘ laboratóriumi módszer alkalmazásával vizsgáltam néhány – növényi fitneszt elĘsegítĘ – rizoszféra eredetĦ Pseudomonas sp. baktérium gátló hatását talajban elĘforduló, növénypatogén mikroszkopikus gombával szemben. ElĘzetes vizsgálat keretében, egyszerĦ bioteszttel kimutattam, hogy a baktériumtörzsek sziderofor jellegĦ anyagok termelésére képesek, mely tulajdonság szerepet játszhat az antagonizmus kialakulásában. Az alkalmazott biológiai tesztmódszert ismertettem.

108


A szélesztéses módszerrel beállított együtt-tenyésztés esetében közel 100%-os gátlási arányt tapasztaltam, míg a pontoltásos tenyésztés csupán 50% körüli eredményt adott. Ez alátámasztja az antagonista baktérium és a célzott ágens közötti közvetlen (kontakt-) érintkezés fontosságát a biológiai kölcsönhatás kialakulásában. Mindkét tárgyalt laboratóriumi eljárás felhasználható az antagonista jelleg eldöntésére, azaz a biológiai kontroll céljára alkalmazható baktériumtörzsek egyszerĦ módszerrel történĘ elĘzetes kiválasztására. Az eredmények alapján feltételezhetĘ, hogy az antagonizmus kialakításában a baktériumok (pl. a vizsgált Pseudomonas génusz képviselĘi) sziderofor-termelése is közrejátszik, minthogy az itt bemutatott törzsek mindegyike termel sziderofor jellegĦ másodlagos anyagcseretermékeket, melyek a környezetükben elĘforduló egyéb mikroorganizmusokkal szemben a táplálkozási verseny során elĘnyhöz juttatják Ęket (ELLIOTT et al., 1984; COOK, 1993). A Pseudomonas baktériumok növényi kórokozó gombákkal szembeni, antibiotikumok termelése révén kifejtett szaporodásgátló hatását VÁRADY (2001) vizsgálta részletesebben. Eredményeim megerĘsítik e baktériumok antibiotikum-termelésének elterjedtségét különbözĘ mikrokörnyezetekben, ugyanakkor a Fusarium solani gomba esetében tapasztaltak aláhúzzák, hogy ettĘl eltérĘ mechanizmus – a sziderofor-termelés – is szerepet játszik egyes törzsek növényoltásra, illetve a biológiai védekezésben történĘ alkalmazhatóságának meghatározásában. Fenti szerzĘ eltérĘ környezetbĘl származó Pseudomonas törzsek sziderofor-termelését és az ennek révén különbözĘ tesztnövényekre kifejtett növekedés-serkentĘ hatását igazolta, de a szideroforok által kiváltott direkt antagonista hatást nem vizsgálta. Ez utóbbi antagonizmus jelen munkában – ha egyetlen kórokozó gomba esetében is – közvetlen bizonyítást nyert. A Pseudomonas aeruginosa baktériumtörzsek növényi kórokozó gombákkal szembeni gátló hatása kevéssé kutatott terület, mivel ez a faj opportunista emberi kórokozó is egyben. Ezzel együtt azonban gyakori, ubikvista tagjai a talaj-ökoszisztémának, így a talajok mikrobaközösségével állandó kölcsönhatásban vannak. A laboratóriumi módszerekkel szelektált, hatékony antagonista baktériumtörzsek integrált növényvédelemben történĘ felhasználásának jelentĘségét – amennyiben humán patogenitást nem mutatnak –, ezért kiemelkedĘnek ítélem meg.

4.7.5. A szelektált baktériumtörzsek és gazdanövények in vivo kölcsönhatásai A szöszös bükköny, fehérvirágú csillagfürt és rozs tesztnövények – melyek egyben a Westsik Vilmos-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérletbĘl izolált, rizoszférában élĘ baktériumtörzsek gazdanövényei is – a baktériumokkal történt kezelésre (magoltás) eltérĘ módon reagáltak. A kétszikĦ növényekhez tartozó csillagfürt elsĘsorban a gyökér hosszának és tömegének megnövekedésével jelezte a baktérium partnerek tevékenységét, mely feltehetĘen az auxin hormonhoz hasonló hatású anyagcseretermék jelenlétével analóg. A bükköny néhány kezelésre a hajtás-, de több törzs esetében a gyökértömeg gyarapodásával reagált. ElĘbbi a gibberellin (GS3) hatású másodlagos anyagcseretermékek által gyakorolt effektussal mutat hasonlóságot. FeltehetĘ azonban, hogy a baktériumok terméke nem egymagában helyezĘdött a hajtásba, hanem az auxinokkal együttmĦködésben, azok endogén koncentrációjának fokozása révén fejthette ki hatását. A legaktívabb törzseket kiválasztottam lehetséges oltóanyag-komponensként: Bacillus thüringiensis C.69, B. subtilis W.32, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111, P. corrugata W.34. A rozs egyszikĦ növény, mely néhány kezelés esetében a gyökerek tömegének szignifikáns megnövekedésével válaszolt a baktériumok jelenlétére. E reakció szintén az auxin-hatású másodlagos anyagcseretermékek által indukált növekedéshez hasonlít, de

Eredmények

109

feltehetĘen inkább a növény tápanyagfelvételének intenzitása fokozódott, melynek révén nedves tömege kiugróan megnövekedett. A legaktívabb baktériumtörzseket ez esetben is kiválasztottam lehetséges oltóanyagkomponensként (Pseudomonas sp. W.37, P. veronii D.111, Aeromonas hydrophyla A.106, Bacillus sp. W.7, B. subtilis W.32, B. thüringiensis C.69.). A baktériumtörzsek mindegyik gazdanövényre gyakorolt hatását figyelembe véve a következĘ hét törzset választottam ki lehetséges oltóanyag-komponensként, melyeket saját törzsgyĦjteményben, liofilizált állapotban tartósítva helyeztem el: Bacillus subtilis W.32, Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas corrugata W.34, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111 és P. veronii W.10.

Következtetések és javaslatok

111

5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK Negyvenhét Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumtörzset vizsgáltam a Westsikféle homoki vetésforgó-tartamkísérletben (Nyíregyháza) termesztett rozs, bükköny és csillagfürt növények 1/ rizoszférájából, illetve rizoplánjából (18 törzs); 2a/ FelsĘ-Tisza ártéri talajából (8 törzs), 2b/ parti talajából (9 törzs) és 3/ felszíni vizébĘl (12 törzs), melyeket BIOLOGTM, illetve molekuláris 16S rDNS módszerrel azonosítottam. A vetésforgó fĘbb különbözĘ tápanyag-visszapótlási gyakorlatát bemutató parcellák talajából további huszonhat Pseudomonas sp. baktériumot izoláltam, és API 20 NETM teszttel meghatároztam. E törzsek közül tenyésztési tulajdonságaik, nitrogénkötĘ és növényi hormontermelĘ (PGR-) aktivitásuk, valamint biotikus és abiotikus környezeti tényezĘkkel szemben tanúsított ellenálló-képességük, illetve az ennek révén kifejtett növényi növekedést serkentĘ (PGPR) hatásuk alapján hét, növényoltásra elvileg alkalmas reprezentatív baktériumtörzset választottam ki – Bacillus subtilis W.32, Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas corrugata W.34, Pseudomonas veronii D.111, W.10 – melyeket saját törzsgyĦjteményben, liofilizált állapotban tartósítva helyeztem el. Az eredmények alapján e laboratóriumi módszerekkel szelektált baktériumtörzseket a biológiai növényvédelemben történĘ felhasználás szempontjából ígéretesnek ítélem meg. Munkám során az alábbi következtetések és javaslatok fogalmazódtak meg: 1. A törzsek csoportosítása céljára alkalmazott diszkontinuus natív PAGE módszerrel különbséget találtam a Westsik-féle vetésforgóból származó, morfológiailag hasonló baktérium-izolátumok között, melyet a reprezentatív törzsek kiválasztása során fel tudtam használni. A következĘ lépésben BIOLOGTM kit segítségével az elkülönített baktériumtörzsek többsége – legalább génusz szinten – azonosítható volt. A Gramnegatív baktériumok közül elsĘsorban Pseudomonas, a Gram-pozitívok közül pedig Corynebacterium és Staphylococcus fajok kerültek elĘ. Ez utalhat egyrészt a tenyésztéshez használt táptalajok (Ashby-, King’s B-, Nutrient- és Endo-agar) szelektivitására, amennyiben e gazdag tápanyag-összetételĦ médiumokon nem volt lehetséges többféle mikroorganizmus izolálása, mert az adott miliĘbĘl leginkább a domináns, gyors szaporodású fajok voltak kitenyészthetĘk; amely a vizsgálatok céljának (jellemzĘ baktériumok izolálása) megfelel. Másrészt az újabban a gyártó által is elismert tény, hogy a BIOLOGTM teszt jellegébĘl fakadóan környezeti mintákból inkább anyagcseretípusok, mintsem konkrét fajok meghatározására képes. Sikerrel alkalmazzák azonban más, specifikus mikrokozmoszok (pl. bélrendszer flórája, kórházi mĦszerek, stb.) karakterizálásához. Újabb vizsgálatok alapján 2000ben megjelent a BIOLOG EnviroPlateTM, mely már szélesebb spektrummal, illetve adatbázissal rendelkezik. Több módosítás után környezeti minták vizsgálatában sikerrel alkalmazzák, a változatos, de csekély létszámban elĘforduló ún. „élĘ, de nem tenyészthetĘ” (VBNC) mikroorganizmusok meghatározására azonban talán sosem lesz alkalmas, hiszen a környezetben jelen lévĘ fajok csak kb. 1 %-a tenyészthetĘ ki. A csak Pseudomonas sp. törzsek meghatározása céljából használt API 20 NETM teszt viszont nem váltotta be a hozzá fĦzött reményeket: a negyvennyolc baktériumtörzsbĘl 26 esetben adott közelítĘ információt a törzs faji hovatartozásáról, de ezen belül is csak tizenhárom P. aeruginosa meghatározását vehetjük pontosnak. További tizenhárom, vélhetĘen P. fluorescens és P. putida fajokkal rokon törzset a módszer összefoglalóan „P. fluorescens-putida” csoportba sorolt. 2. A FelsĘ-Tisza vizének és árterének talajából ezzel szemben csaknem mindegyik, a vizsgálatba bevont izolátum azonosítható volt a 16S rDNS molekuláris módszer

112


segítségével. Ebben az esetben a meghatározott taxonok száma is sokkal több volt, noha a vizsgálatot nem közvetlenül környezeti mintából (melybĘl vélhetĘen még több baktériumfajt került volna elĘ), hanem a fentivel azonos táptalajokon kitenyésztett izolátumok felhasználásával végeztem el. Itt a megfelelĘ primer tervezése a legfontosabb, mert (NIKOLAUSZ, 2004; 2005) eredményei szerint az általánosan használt 27f primer – kb. 500-1500 bp hosszú szakaszt vizsgálva – nem minden baktérium esetében szaporítja fel a DNS megfelelĘ régióját. Specifikus csoportok (pl. Archaea) meghatározása ezért kiterjedt molekuláris ökológiai vizsgálatokat igényel, melyek a világban jelenleg is folyamatban vannak. 3. A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált, szabadon élĘ baktériumtörzsek esetében kétféle módszerrel (fiziológiai és ARA-teszt) kimutattam, hogy azok egy csoportja légköri nitrogén megkötésére képes. Az Ashby-féle szilárd táptalajon történt tenyésztés és az ARA teszt eredményei jól korreláltak egymással, ami lehetĘvé teszi e táptalaj nemcsak anaerob, hanem aerob (vagy mikroaerofil) diazotróf baktériumok szelektív izolálása céljából történĘ felhasználását. MegfelelĘ eredmény eléréséhez azonban biztosítani kell a felhasznált vegyszerek nagy tisztaságát, valamint azt, hogy az elĘkészítés és az inkubáció során a levegĘbĘl ne kerülhessen ammónia a táptalajba. Ez megoldható úgy, hogy a Petri-csészéket exszikkátor-edényben inkubáljuk, melybĘl az ammóniát – mely csekély mennyiségben mindig jelen van –elnyeletjük (pl. tömény kénsavval). 4. A fehér mustár felhasználásával végzett, a közvetlen növekedés-serkentés kimutatását célzó csíranövényteszt eredményei viszont csak a legaktívabb baktériumtörzsek esetében vágnak egybe az elĘzĘ tesztekkel. Itt valószínĦleg más növekedési faktorok, pl. a gyökérizzadmányok baktériumok általi felvétele is befolyásolhatták a csíranövények fejlĘdését; ami a vizsgált törzsek többsége esetében a növények fejlĘdését éppen gátolta. E folyamat egyébként elĘidézhette a csíranövények endogén nitrátképzését is, mely kisebb diazotróf aktivitással rendelkezĘ törzsek jótékony hatását vélhetĘen nem engedte kifejezĘdni. 5. Félkvalitatív vizsgálat révén kimutattam, hogy az elĘzetesen nitrogénkötĘ aktivitásuk, illetve nehézfém- és cianidtĦrésük alapján szelektált, egyrészt a Westsikféle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából, másrészt a FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából származó – fĘleg Bacillus és Pseudomonas génuszba tartozó – baktériumtörzsek auxin-, illetve gibberellin-sztenderdekhez képest serkentették a búza csíranövények növekedését. E hatás mind a hajtás-, mind a gyökérkezdemény vonatkozásában észlelhetĘ volt a megfelelĘ sztenderddel szemben. 6. Megállapítottam a Westsik-féle vetésforgó különbözĘ parcelláiból izolált huszonhat Pseudomonas sp. baktériumtörzs sziderofor-termelését, melyek közül tizenhárom, fluorescens-putida csoportba tartozó törzs antagonista hatását Fusarium solani és Rhizoctonia solani növénypatogén gombákkal szemben két különbözĘ biológiai teszttel (pontoltás és szélesztés) mértem fel. A pontoltás esetében kisebb mértékĦ gátlást tapasztaltam, de a baktériumok ekkor is megakadályozták a patogének kifejlĘdését az inkubáció teljes ideje alatt. Az oltásnál alkalmazott két technika között statisztikailag igazolható különbség volt, mert e módszerek immanens tulajdonsága, hogy szélesztéssel hatékonyabb antagonizmust tapasztalható, mivel a biológiai kontroll ágens és a patogén mikroorganizmusok közvetlenül érintkezhetnek egymással. 7. Bemutattam, hogy a fenti baktériumtörzsek antagonista képessége egyfelĘl a sziderofor-termelésük révén kialakult vaskompetíció, másfelĘl antibiotikus hatású másodlagos anyagcseretermékek termelése útján valósulhat meg. Megállapítottam

Következtetések és javaslatok

113

továbbá, hogy elĘbbi stratégia elsĘsorban a Fusarium solani, utóbbi viszont a Rhizoctonia solani mikroszkopikus gombával szemben bizonyult hatékonynak. A Fusarium esetében a szideroforok által kiváltott direkt antagonizmus is közvetlen bizonyítást nyert. 8. A 2000. évben történt tiszai cianid- és nehézfémszennyezés kapcsán reprezentatív baktériumtörzseket izoláltam a FelsĘ-Tisza vizébĘl és hullámterének talajából. Néhány környezeti tényezĘ baktériumokra gyakorolt hatásának felmérése során e törzseket együtt vizsgáltam a Westsik-féle vetésforgó tartamkísérletbĘl származó baktériumtörzsekkel, mert felvetĘdött a kérdés, vajon a Nyírségben a Tisza öntéstalaján elterülĘ mezĘgazdasági táblákon milyen hatása lehet annak, ha ilyen típusú szennyezések máskor is elĘfordulnak? Meghatároztam a törzsek cianiddal és néhány nehézfémmel szembeni toleranciáját, melynek során azt az eredményt kaptam, hogy a fémvegyületek közül a kiemelten veszélyes ólom vegyületei a réz- és cink-vegyületekhez képest csak kevésbé gátolták törzsek szaporodását; ezért feltételezhetĘ, hogy a baktériumok a származási hely szennyezettségéhez adaptálódtak, ezért ólomvegyületekbĘl nagyobb mennyiséget toleráltak. A tiszai cianid- és nehézfémszennyezés által okozott zavar mértéke azonban aláhúzza, hogy az a teljes ökoszisztéma szintjén sokkalta nagyobb romboló hatást fejt ki, ahogy ezt pl. a nagyarányú halpusztulás során is láthattuk. Az alternatív anyagcsere-utakat beindító „forró foltokból” – mint amilyenek az erĘsen szennyezett folyószakaszok – szelektálódott baktériumtörzsek ezért a bioremediáció eszközeiként fontos szerepet játszhatnak. 9. Nehézfémek oligodinámiás hatását a fent említett kétféle mintavételi helyrĘl származó, növényi növekedést szabályozó, illetve serkentĘ hatásuk és antagonista képességük alapján szelektált baktériumtörzsek bevonásával vizsgáltam. Kimutattam, hogy a törzsek egyedi reakciói adott nehézfémre vonatkozóan eltérĘek voltak. Nem mutatkozott viszont szignifikáns különbség a Westsik-féle homokjavító vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza árterén vett talaj-és vízmintákból származó törzsek nehézfém-érzékenységi spektruma között, ami rezisztenciájuk egyedi jellegére enged következtetni. ValószínĦleg hosszabb tartamú hatásra van szükség az adaptáció kialakulásához. A nehézfémek szulfát formái általában nagyobb mértékben gátolták a törzsek szaporodását; a nehézfém-vegyületekben szereplĘ nitrát ellensúlyozta az adott fém toxikus hatását, ennek révén a kisebb fémkoncentrációknál serkentette a törzsek szaporodását. A vas-vegyületek esetében a mikroelem-hatás is szerepet játszhat, azaz a vizsgált törzsek a vasat anyagcseréjükhöz felhasználják, melyet a vasvegyületekkel szembeni nagy tolerancia támasztott alá. 10. A kiválasztott baktériumtörzsek rekolonizációs képességét és gazdanövényekre gyakorolt növekedés-serkentĘ (PGPR) hatását tenyészedényes kísérletben, axénikus kultúrában vizsgáltam. A szöszös bükköny, fehérvirágú csillagfürt és rozs tesztnövények a baktériumokkal történt magoltásra eltérĘ módon reagáltak. A kétszikĦ növényekhez tartozó bükköny és csillagfürt esetében leginkább a gyökér hossza és tömege növekedett meg, mely az auxin hormonhoz hasonló hatású anyagcseretermék jelenlétére utal. Bükköny esetében viszont néhány baktériumtörzs hatására a hajtás tömege gyarapodott igen nagy mértékben Ez utóbbi a gibberellin (pl. GS3) hatású másodlagos anyagcseretermékek jelenlétére enged következtetni. A rozs, mely egyszikĦ növény, néhány kezelés hatására a gyökerek tömegének szignifikáns megnövekedésével válaszolt a baktérium jelenlétére. A leghatékonyabb törzsek mind a hajtás, mind a gyökér növekedését serkentették a gazdanövényekben. Ez arra vezethetĘ vissza, hogy a gibberellinek számos élettani hatást az auxinokkal együttmĦködésben, azok endogén koncentrációjának fokozása révén fejthetnek ki

114


(EGAMBERDIYEVA és HÖFLICH 2004, PARK et al 2005). A legaktívabb baktériumtörzseket mindegyik növény esetében kiválasztottam lehetséges oltóanyagkomponensként, melyeket saját törzsgyĦjteményben, liofilizált állapotban tartósítva helyeztem el. Erre a következĘ hét törzset tartottam érdemesnek: Bacillus subtilis W.32, Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas corrugata W.34, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111 és P. veronii W.10. A laboratóriumi és klímakamrás eredmények további vizsgálatok (pl. koinokuláció, kompatibilitás más rhizoszféra-baktériumokkal) nélkül nem extrapolálhatók a szabadföldi körülményekre, de a korábban idézett, mások által is szerzett tapasztalatok a lehetséges oltótörzsek elĘzetes, laboratóriumi módszerekkel történĘ kiválogatására irányítják a figyelmet. Összegzésképpen arra a következtetésre jutottam, hogy bár a kiválasztott baktériumtörzsek néhány környezeti tényezĘvel szembeni tĦrĘképességének vizsgálata során legtöbbjük szaporodásának jelentĘs visszaesését tapasztaltam, növényi növekedésserkentĘ képességük pedig jelentĘs eltéréseket mutatott, a megfelelĘ szelekciós módszerek alkalmazásával ellenállóbb és hatékony törzsekhez jutottam. A biotikus és abiotikus tényezĘk hatásának felmérése és a kevésbé érzékeny, oltóanyag elĘállítására is alkalmas baktériumtörzsek keresése mind ökológiai, mind gazdaságossági szempontból fontos lehet.

A továbblépés lehetĘségei A laboratóriumi módszerekkel szelektált, növényi növekedést serkentĘ, növényoltásra elvileg felhasználható baktériumtörzsek gyökereken történĘ rekolonizációs képességére a tenyészedényes kísérletben tapasztalt növekedés-serkentĘ hatás alapján következtettem. A rekolonizációt in situ UV- illetve immunofluoreszcens mikroszkópiával lehetséges kimutatni, pl. a LiveDead BackLight kit alkalmazásával, vagy Auroprobe LM (Amersham) festéssel (DALTON et al 2004). MegfelelĘ – s talán kevésbé költséges – megoldásnak tĦnik a fluoreszcens in situ hibridizációs (FISH, LOY et al. 2003) módszer alkalmazása is. A baktériumtörzsek növényi növekedést serkentĘ (PGPR) hatásáért felelĘs anyagcseretermékek meglétére szintén közvetett bizonyíték adódott. Ezek egzakt minĘségi (pl. növényi hormonok, vitaminok, antibiotikumok, stb.) és mennyiségi meghatározása HPLC, vagy GC-MS technikával lehetséges, melyet a saját törzsgyĦjteményben szereplĘ baktériumok esetében célszerĦ lenne elvégezni. Érdemes megvizsgálni azt is, hogy az egyes bakteriális anyagcseretermékek milyen egyéb gazdanövényekre fejtenek ki serkentĘ hatást, valamint, hogy a különbözĘ növények milyen mechanizmus szerint hasznosítják azokat; pl. melyek azok a faktorok, amelyek meghatározzák, hogy adott exkrétum az illetĘ növény gyökér-, vagy föld feletti részébe helyezĘdik át (FRENYÓ 1985). Mindezek érdekében az itt vizsgáltaknál még több, speciális ökológiai feltételek között elĘforduló gazdanövényekkel (pl. más pillangós takarmánynövények, gabonák, vagy futóhomokon termeszthetĘ fajok), valamint rizoszférájukból izolált baktériumokkal, esetleg specifikus csoportokkal (pl. Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium, stb.) további, egy-egy említett részterületre koncentráló kutatómunkát célszerĦ végezni.

Összefoglalás

115

6. ÖSSZEFOGLALÁS Célul tĦztem ki a Westsik-féle homokjavító vetésforgó-tartamkísérlet bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájában, illetve rizoplánjában, valamint a FelsĘ-Tisza vizében és árterületének talajában néhány jellemzĘ mintaterületen elĘforduló, tenyészthetĘ baktériumok növényi növekedést közvetlenül (PGR) és közvetve (PGPR) serkentĘ hatásának vizsgálatát. A 2000. évi tiszai környezetszennyezés (cianid és nehézfémek) kapcsán indított, baktériumtörzsek tĦrĘképességét felmérĘ újabb vizsgálatsorozat jelen dolgozat témáját is befolyásolta, mivel felvetĘdött a kérdés, vajon a Nyírségben a Tisza öntéstalaján elterülĘ mezĘgazdasági táblákon milyen hatása lehet annak, ha ilyen típusú szennyezések többször is elĘfordulnak. A hosszabb ideje mĦvelés alatt álló (vetésforgó) és a természetes állapotú talajból (ártér, part), illetve vízbĘl nyert baktériumtörzsek ökofiziológiai összehasonlításával jellemezhetĘ az élĘhely tĦrĘképességre, a növényi növekedést serkentĘ jótékony hatásra, valamint patogén mikroorganizmusokkal szembeni antagonizmusra gyakorolt befolyása. A munka során elért fĘbb eredmények A Westsik-féle vetésforgó tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából, rizoplánjából, valamint a FelsĘ-Tisza vizébĘl és árterének talajából tenyésztéses módszerrel több, mint ötszáz baktérium izolátumot nyertem. A Westsik-féle vetésforgóból származó izolátumokból diszkontinuus natív PAGE módszerrel ötvenhat reprezentatív baktériumtörzset állítottam elĘ, melyek közül BIOLOGTM módszerrel harminchatot meghatároztam. A parlagoltatással, gyökér- és zöldtrágyázással, valamint istállótrágyázással végzett homokjavítást bemutató parcellákból további huszonhat Pseudomonas sp. törzset izoláltam, melyeket API 20 NETM teszttel határoztam meg. A FelsĘ-Tisza mintavételi területeirĘl negyvenöt baktériumtörzset azonosítottam 16S rDNS molekuláris módszerrel, melybĘl huszonnégy reprezentáns filogenetikai helyét ábrázoltam. A Westsik-vetésforgóból származó ötvenhat baktériumtörzs nitrogénkötĘ aktivitását fiziológiai teszttel, Ashby-féle nitrogénmentes táptalajon történt tenyésztéssel vizsgáltam. Az anyagcsere-aktivitást mutató törzsek esetében a nitrogénkötést további módszerrel, az acetilénredukciós aktivitás (ARA) vizsgálatával határoztam meg. Huszonnégy törzs közvetlen növényi növekedés-serkentĘ hatását fehérmustár-csíranövényteszttel mértem fel. A fiziológiai teszt és az ARA eredményei korreláltak, de a csíranövényteszt nem volt megfelelĘ a növekedés-serkentĘ hatás gyors és megbízható vizsgálatára. A Westsik-vetésforgóból valamint a FelsĘ-Tisza árterületérĘl származó negyvenhét, azonosított, szelektált baktériumtörzs bevonásával félkvalitatív csíranövénytesztet végeztem annak érdekében, hogy auxin, illetve gibberellin (GS3) növényi hormonok mint másodlagos anyagcseretermékek termelését kimutassam. A csíranövények növekedését szignifikánsan serkentĘ törzseket kiválasztottam további vizsgálat céljára. A Westsik-féle vetésforgó különbözĘ parcelláiból származó Pseudomonas sp. törzsek antagonista hatását egy-egy Fusarium solani és Rhizoctonia solani növényi kórokozó gombával szemben vizsgáltam. Megállapítottam, hogy e baktériumtörzsek antagonista képessége egyfelĘl sziderofor-termelésük révén kialakult vaskompetíció, másfelĘl antibiotikus hatású másodlagos anyagcseretermékek termelése útján valósulhat meg. Bemutattam, hogy a Fusarium solani gombával szemben egyes törzsek sziderofor-termelése közvetlenül antagonista hatást fejtett ki. Az így szelektált, kultúr- és természetes területrĘl származó baktériumtörzsek tíz nehézfémvegyülettel szembeni toleranciáját felmértem. ElĘvizsgálat keretében a FelsĘTisza mentérĘl származó, azonosított baktériumtörzsek cianid- és nehézfém-érzékenységét

116


szintén felmértem, a 2000. évi környezetszennyezés során elĘforduló, valamint annál nagyobb koncentrációk alkalmazásával. Megállapítottam, hogy e környezeti tényezĘkkel szembeni tolerancia leginkább törzsfüggĘ tulajdonság, de nincs összefüggésben azzal, hogy adott baktériumtörzs kultúr-, vagy természetes (vad) környezetbĘl származik. A Tisza még nem szennyezett szakaszáról származó minták faji sokfélesége, illetve az ebbĘl nyert baktériumtörzsek toleranciája viszont rendre kisebb volt. A fent említett környezeti tényezĘknek legjobban ellenálló törzsek közvetett – magoltást követĘen kialakuló – növényi növekedés-serkentĘ hatását a tesztnövények (csillagfürt, bükköny és rozs) axénikus kultúrában történt nevelése révén mértem fel. A hatékony serkentĘ (PGPR) tulajdonságú baktériumtörzseket növényfajonként kiválogattam, majd a kiválasztott törzseket saját törzsgyĦjteményben, liofilizált állapotban tartósítva helyeztem el. Erre a következĘ hét törzset tartottam érdemesnek: Bacillus subtilis W.32, Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas corrugata W.34, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111 és P. veronii W.10. A laboratóriumi és klímakamrás eredmények további vizsgálatok (pl. koinokuláció, kompatibilitás más rizoszféra-baktériumokkal) nélkül nem extrapolálhatóak a szabadföldi körülményekre, de a korábban idézett, mások által is szerzett tapasztalatok a lehetséges oltótörzsek elĘzetes, laboratóriumi módszerekkel történĘ kiválogatására irányítják a figyelmet. Az ily módon szelektált, a tesztnövények növekedését serkentĘ, illetve – két növénypatogén gombával szembeni antagonista képességük alapján – támogató, néhány szennyezĘ ágenssel szemben ellenálló baktériumtörzseket a homoktalajon termesztett csillagfürt, bükköny, valamint rozs takarmánynövények erĘteljes kelésének biztosítása érdekében ígéretesnek tartom.

Summary

117

7. SUMMARY The aim of this work was on one hand to investigate and evaluate the plant growth regulating (PGR) and -promoting (PGPR) effects of culturable bacteria occurring in the rhizosphere (and rhizoplane) of vetch (Vicia hirsuta Roth), lupine (Lupinus albus L.) and rye (Secale cereale L.) plants from the long-term crop rotation field experiment which was established by Vilmos Westsik in 1929 for studying the amelioration of low-nutrientsupplied sandy soils by means of organic manures enriched with inorganic fertilizers in a low-input (organic management) system, in the Nyírség region in North-Eastern Hungary. On the other hand, the cyanide and heavy metal pollution in the Tisza River of the year 2000 induced another investigation project, which provided a secondary base for strain selection from the water, shore and flooded area of the river, because of the emerging question: What effect could have such another pollution event (already happened to various extent in the meantime) on the agricultural fields located in the soils developing on accumulation of colluvial material of Tisza River (Anthropic Regosols), in the Nyírség region? The influence of the habitat on the tolerance, plant growth promoting beneficial effect and antagonistic ability against plant pathogenic microorganisms could be characterized by the eco-physiological comparison of the bacterial strains gained from the anthropogenic (crop rotation system) and natural (rather intact: shore, flooded area). Principal results More than five hundred bacterial isolates were obtained from the rhizosphere and rhizoplane of vetch, lupine and rye plants of Westsik’s crop rotation experiment and from the water and soil of flooded area of Upper-Tisza River by conventional culturing method. The isolates deriving from the Westsik’s crop rotation were grouped by discontinuous native polyacrylamide gel electrophoresis, which resulted to fifty-six representative bacterial strains. Thirty-six of these latter strains were then identified by BIOLOGTM method. Other twenty-six Pseudomonas sp. strains isolated from the plots demonstrating the melioration with root- and green manure, as well as waste ground were identified by API 20 NETM. Strains originated from the sampling sites of Upper-Tisza were identified by 16S rDNA molecular method, from which phylogenetic position of twenty-four representative was displayed by a cluster diagram. Nitrogen-fixing activity of the fifty-six strains originated from the Westsik’s experiment was screened by culturing them on Ashby’s nitrogen-free agar medium. In case of the active (grown with metabolic activity) strains, N2-fixing capacity was measured by further acetylene-reduction activity (ARA) test. In a parallel experiment, direct plant growth stimulating effect of twenty-four bacterial strains was screened by laboratory seedling biotest using white mustard (Sinapis alba L.). Results of the physiological (culturing on Ashby’s medium) and ARA tests showed a good correlation (R2 = 0.79), but the seedling test was not suitable for the rapid and reliable detection of plant growth stimulating effect. Forty-seven identified and selected bacterial strains derived from the Westsik’s crop rotation and sampling sites along the Upper-Tisza River were screened for auxin (indoleacetic acid) and gibberellin (GA3) plant hormone production as secondary metabolites, by a semi-qualitative seedling test using wheat (Triticum aestivum L.) seeds. The significant growth-promoting strains were then selected for further investigations. Antagonistic ability of Pseudomonas sp. strains originated from the different plots of Westsik’s crop rotation experiment against one Fusarium solani and Rhizoctonia solani plant pathogenic micro fungi was investigated by a laboratory study through co-culturing the pathogens with bacteria. It was concluded that the antagonistic ability of these beneficial

118


strains on one hand can be attributed to the iron competition expressed by siderophore production, on the other hand to the production of secondary metabolites having antibiotic effect. It was moreover demonstrated that siderophore production of some strains took direct antagonistic effect on the growth of the fungus Fusarium solani. Bacterial strains selected by the above-mentioned methods were further investigated for their tolerance against ten heavy metal salts (compounds). In a preliminary experiment, cyanide and heavy metal tolerance of identified bacterial strains from the Upper-Tisza area was estimated within no-effect, toxic and over-estimated concentration range of the pollutants registered during the 2000 year’s pollution. It was concluded from the evaluation of maximal tolerated concentrations (MTC) that tolerance ability depended mostly on the specific properties of a single strain rather than its origin: there was no correlation between the origins (anthropogenic, cultivated land vs. natural, ‘wild’ environment) and MTC values of the different strains. It was however noticeable that species diversity, as well as tolerance of bacterial strains taken from the non-polluted section of Tisza River (which was used as a control site) was successively less than those of polluted area. Plant growth promoting effects of bacterial strains resistant to the above-mentioned environmental factors were assessed by inoculation to host plants (vetch, lupine and rye) grown in axenic culture under light chamber conditions. Effective strains showing significant plant growth promoting effect (PGPR strains) were selected by plant species and lyophilised for conservation in a laboratory (non patent nor proprietary) strain collection, including the following representatives: Bacillus subtilis W.32, Bacillus thüringiensis C.69, Pseudomonas sp. W.1, Pseudomonas corrugata W.34, Pseudomonas gessardii B.83, Pseudomonas veronii D.111 and P. veronii W.10. The results obtained by laboratory experiments can be hardly extrapolated to field conditions without further investigations (i.e. co-inoculation and compatibility test with other beneficial microbes). However, previously cited experiences in the thesis have focused the attention to the preliminary selection of potential beneficial rhizobacterial inoculants. These plant growth stimulating and -promoting strains – showing antagonistic ability to some plant pathogens – selected by laboratory methods and resistant to some pollutants are considered to promising candidates for supporting the robust germination and rise of vetch, lupine and rye forage plants grown in sandy soils.

M1. Irodalomjegyzék

i

MELLÉKLETEK M1. IRODALOMJEGYZÉK ABAYE D.A., LAWLOR K., HIRCH P.R., BROOKES P.C. (2005): Changes in the microbial community of an arable soil caused by long-term metal contamination. European Journal of Soil Science, 56 (1): 93-102. p. ACHOUAK W., NORMAND P., HEULIN T. (1999): Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the Bacillaceae. International Journal of Systematic Bacteriology, 49 (3): 961-967. p. ADAMS, T.M., LAUGHLIN, R.J. (1981): The effects of agronomy on the carbon and nitrogen contained in the soil biomass. The Journal of Agricultural Science, 118 (2): 101-107. p. AKERS H.A. (1981): The effect of water logging on the quantity of microbial iron chelators (siderophores) in soil. Soil Science, 132 (2): 150-152. p. ALTSCHUL S.F., MADDEN T.L., SCHÄFFER A.A., ZHANG J., ZHANG Z., MILLER W., LIPMAN D.J. (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Research, 25 (17): 3389-3402. p. AMANN R.I., LUDWIG W., SCHLEIFER K.H. (1995): Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews, 59 (1): 143169. p. ANDERSON A.J., GUERRA D. (1985): Responses of bean to root colonization with Pseudomonas putida in hydroponic system. Phytopathology, 75 (9): 992-995. p. ANGERER P., BIRÓ B., ANTON A., KÖVES-PÉCHY K., KISS E. (1998): Indicator microbes of chlorsulfon addition detected by a simplified plate counting method. Agrokémia és Talajtan, 47 (1-4): 297-305. p. ANTON A., ANTAL M., (1987): Effect of sewage sludge on saccharase activity of different soils. 771-776. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Proceedings of the 9th International Symposium on Soil Biology and Conservation of the Biosphere. Vol. 2. Budapest: Akadémiai Kiadó, 936 p. ANTON A., MÁTHÉ P., FÜLEKY GY., (2004): The effect of phosphorous fertilizer on the phosphomonoesterase activity of Capsicum annuum L. rhizosphere. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 51 (1-2): 196-197. p. ANTON A., MÁTHÉ P., RADIMSZKY L., FÜLEKY GY., BICZÓK GY. (1994): Effects of environmental factors and Mn, Zn, Cu, trace elements on the soil phosphomonoesterase and amidase activity. Application of DISITOBI model. Acta Biologica Hungarica, 45 (1): 39-50. p. ARNDT W., KOLLE C., BUCHENAUER H. (1998): Effectiveness of fluorescent pseudomonads on cucumber and tomato plants under practical conditions and preliminary studies on the mode of action of the antagonists. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz – Journal of Plant Diseases and Protection, 105 (2): 198-215. p. ARNOW L.E. (1937): Colorimetric determination of the components of 3,4-dihydroxyphenylalaninetyrosine mixtures. Journal of Biological Chemistry, 118 (2): 531-537. p. ARSHAD M., FRANKENBERGER W.T. (1998): Plant-growth regulating substances in the rhizosphere: microbial production and functions. 46-151. p. In: Sparks D. L. (Szerk.): Advances in agronomy. Volume 62. San Diego (CA), London: Academic Press, 308 p. ATLAS R.M. (1984): Use of microbial diversity to assess environmental stress. 540-545. p. In: KLUG M.J., REDDY C.A. (Szerk.): Perspectives in microbial ecology. Washington (DC): American Society for Microbiology. AUSTIN M.P., SMITH T.M. (1989): A new model for the continuum concept. Vegetatio, 83 (1): 3547. p. AZAD H.R., DAVIS J.R., SCHNATHORST W.C., KADO C.I. (1987): Influence of Verticillium wilt resistant and susceptible potato genotypes on populations of antagonistic rhizosphere and rhizoplane bacteria and free nitrogen fixers. Applied Microbiology and Biotechnology, 26 (1): 99104. p.

ii


BÅÅTH E. (1989): Effects of heavy metals in soil on microbial processes and populations: a review. Water, Air and Soil Pollution, 47: 335-379. p. BAGWELL C.E., LOVELL C.R. (2000): Microdiversity of culturable diazotrophs from the rhizoplanes of the salt marsh grasses Spartina alterniflora and Juncus roemerianus. Microbial Ecology, 39 (2): 128-136. p. BAKER R., ELAD Y., SNEH B. (1986): Physical, biological and host factors in iron competition in soils. 77-84. p. In: SWINBURNE T.R. (Szerk.): Iron, Siderophores and Plant Diseases. [New York, London: Plenum.] (NATO Asi Series A, Life Sciences, Vol 117.) 313 p. BAKKER P.A.H.M., BAKKER A.W., MARUGG J.D., WEISBEEK P.J., SCHIPPERS B. (1986): The role of siderophores in potato-tuber yield increase by Pseudomonas putida in a short rotation of potato. Netherlands Journal of Plant Pathology, 92 (6): 249-256. p. BAKKER P.A.H.M., BAKKER A.W., MARUGG J.D., WEISBEEK P.J., SCHIPPERS B. (1987): Bioassay for studying the role of siderophores in potato growth-stimulation by Pseudomonas spp. in short potato rotations. Soil Biology and Biochemistry, 19 (4): 443-449. p. BAKKER P., PEER V.R., SCHIPPERS B. (1990): Specifity of siderophores and siderophore receptors and biocontrol by Pseudomonas spp. 131-142. p. In: HORNBY D. (Szerk.): Biological control of soil borne plant pathogens. Oxford: CAB International (Oxford University Press), 505 p. BALICKA N., STANKIEWICZ M., ZUKOWSKA Z. (1983): Effect of oxafun on the antibiosis between Bacillus subtilis and Phoma betae. Acta Microbiologica Polonica, 32 (2): 185-189. p. BARKAY T., TRIPP S.C., OLSON B.H. (1985): Effect of metal-rich sewage sludge application on the bacterial communities of grasslands. Applied and Environmental Microbiology, 49: 333-337. p. BARKMANN J., SCHWINTZER C.R. (1998): Rapid N2-fixation in pines? Results of Maine field study. Ecology, 79: 1453-1457. p. BAYOUMI HAMUDA H.E.A.F., KUCSMA N., VÁRADY GY., KISS Z., KECSKÉS M. (1996): Nehézfémek és kombinációk hatása különbözĘ Rhizobium leguminosarum törzsek szaporodására. Agrokémia és Talajtan, 45 (1-2): 153-168. p. BECKER J.O., COOK R.J. (1988): Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased-growth response of wheat by fluorescent pseudomonads. Phytopathology, 78 (6): 778-782. p. BEIJERINCK M.W. (1901): Über oligonitrophile Mikroben. Zentralblatt für Bakteriologie und Parasitenkunde, 2: 561-582. p. BERRAHO E.L., LESUEUR D., DIEM H.G., SASSON A. (1997): Iron requirement and siderophore production in Rhizobium ciceri during growth on an iron-deficient medium. World Journal of Microbiology and Biotechnology 13 (5): 501-510. BESSON F., PEYPOUX F., QUENTIN M.J., MICHEL G. (1984): Action of antifungal peptidolipids from Bacillus subtilis on the cell-membrane of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Antibiotics, 37 (2): 172-177. p. BESSON F., MICHEL G. (1987): Isolation and characterization of new iturins – iturin-D and iturinE. Journal of Antibiotics, 40 (4): 437-442. p. BETTIOL W. (1988): Selecao de microorganismos antagonicos a Pyricularia oryzae CAV. para o controle da brusone do arros (Oryza sativa L.). Thesis. Universidade de Saõ Paulo, Brazil. 140 p. BILAL R., MALIK K.A. (1987): Isolation and identification of a N2-fixing zoogloea-forming bacterium from kallar grass histoplane. Journal of Applied Microbiology, 62 (4): 289-294. p. BIN L., KNUDSEN G.R., ESCHEN D.J. (1991): Influence of an antagonistic strain of Pseudomonas fluorescens on growth and ability of Trichoderma harzianum to colonize Sclerotinia sclerotiorum in soil. Phytopathology, 81 (9): 994-1000. p. BIRÓ B. (1999): További tudnivalók a kommunális szennyvíziszapok mezĘgazdasági elhelyezésérĘl. Talajbiológiai következmények. Gyakorlati Agrofórum, 10 (9): 4-6. p. BIRÓ B. (2004): A növény–talaj–mikroba kölcsönhatások szerepe az elemfelvétel alakulásában. 112. p. In: SZILÁGYI M., SIMON L. (Szerk.): Mikroelemek a víz–üledék–mikroba–talaj–levegĘ– növény rendszerben. Nyíregyháza: Bessenyei György Középiskola, 248 p.


iii

BIRÓ B., KÖVES-PÉCHY K., VÖRÖS I., KÁDÁR I. (1998): Toxicity of some field applied heavy metal salts to the rhizobial and fungal microsymbionts of alfalfa and red clover. Agrokémia és Talajtan, 47 (1-4): 265-276. p. BIRÓ B., MAGYAR K., VÁRADY GY., KECSKÉS M. (1998): Specific replant disease reduced by PGPR rhizobacteria on apple seedlings. ISHS Acta Horticulturae, 477: 75-82. p. BIRÓ B., MORVAI B., ANTON A. (2004): Limits of sewage sludge depositions of Hungarian soils, functioning of endosymbionts and phytoremediation possibilities. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 51 (1-2): 193-194. p. BOCHNER B.R. (1989a): Sleuthing out bacterial identities. Nature, 339 (6220): 157-158. p. BOCHNER B.R. (1989b): “Breathprints” at the microbial level. ASM News, 55 (10): 536-539. p. BOCHOW H., HENTSCHEL K.D., JACOB M. (1988): Möglichkeiten und Wege zur biologischen Bekämpfung phytopatogener Bodenpilze durch Nutzung mikrobieller Antagonisten. Zentralblatt für Mikrobiologie, 37 (2): 168-176. p. BODDEY R.M., DE OLIVEIRA O.C., URQUIAGA S., REIS V.M., OLIVARES F.L., BALDANI V.L.D., DÖBEREINER J. (1995): Biological nitrogen fixation associated with sugarcane and rice – Contributions and prospects for improvement. Plant and Soil, 174 (1-2): 195-209. p. BORMANN B.T., BORMANN F.H., BOWDEN W.B., PIERCE R.S., HAMBURG S.P., WANG D., SNYDER M.C., LI C.I., INGERSOLL R.C. (1993): Rapid N2-fixation in pines, alder, and locust – evidence from the sandbox ecosystem study. Ecology, 74: 583-598. p. BRANNEN P.M. (1995): Potential modes of action for suppression of root diseases and yield enhancement when using Bacillus subtilis seed inoculants on cotton. [205-208 p.] In: Proceedings 1. Beltwide Cotton Conferences. San Antonio, TX, U.S.A., January 4-7, 1995. BROOKES P.C. (1995): The use of microbial parameters in monitoring soil pollution. Biology and Fertility of Soils, 19 (4): 269-279. p. BROOKES P.C., MCGRATH S.P. (1984) Effects of heavy metals on microbial activity and biomass in field soils treated with sewage sludge. Environmental and Contaminant Chemistry, 4 (4): 574583. p. BUCHANAN R.E., GIBBONS R.F. (1974): Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 8. kiadás. Baltimore: Williams and Wilkins, 1268 p. BUDZIKIEWICZ H. (1993): Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads. FEMS Microbiology Letters, 104 (3-4): 209-228 p. BUYER J.S., LEONG J. (1986): Iron transport-mediated antagonism between plant growthpromoting and plant-deleterious Pseudomonas strains. Journal of Biological Chemistry, 261 (2): 791-794. p. BUYER J.S., WRIGHT J.M., LEONG J. (1986): Structure of pseudobactin A214, a siderophore from a bean-deleterious Pseudomonas. Biochemistry, 25 (19): 5492-5499. p. BUYSENS S., HEUNGENS K., POPPE J., HOFTE M. (1996): Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium-induced damping-off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Applied and Environmental Microbiology, 62 (3): 865-871. p. ÇAKMAKÇI R., DÖNMEZ F., ùAHIN F. (2005): Growth promotion of plants by plant growthpromoting rhizobacteria under greenhouse and two different field soil conditions. Soil Biology and Biochemistry, In Press. CAMPBELL J.I.A., JACOBSON C.S., SØRENSEN J. (1995): Species variation and plasmid incidence among fluorescent Pseudomonas strains isolated from agricultural and industrial soils. FEMS Microbiology Ecology, 18 (1): 51-62. p. CAMPBELL R., GREAVES M.P. (1990): Anatomy and community structure of the rhizosphere. 11-35. p. In: LYNCH J.M. (Szerk.): The Rhizosphere. Chicester, UK: Wiley. CARSON K.C., HOLLIDAY S., GLENN A.R., DILWORTH M.J. (1992): Siderophore and organic acid production in root nodule bacteria. Archives of Microbiology, 157 (1-2): 264–271. p. CARTER H.O. (1989): Agricultural sustainability: An overview and research assessment. Californian Agriculture, 1 (1): 16-17. p. CASTRO C.E., O’SHEA S.K., WANG W., BARTNICKI E.W. (1996): Biodehalogenation: oxidative and hydrolytic pathways in the transformations of acetonitrile, chloroacetonitrile, chloroacetic

iv


acid, and chloroacetamide by Methylosinus trichosporium OB-3b. Environmental Science and Technology, 30 (4): 1180-1184. p. CHAMSWARNG C., SANGKAHA K. (1988): In vitro screening for effective antagonists of Sclerotium rolfsii SACC., a causal agent of tomato stem rot. Kasetsart Journal of Natural Sciences, 22 (5): 7-13. p. CHAPATWALA K.D., BABU G.R.V., ARMSTEAD E.R., WHITE E.M., WOLFRAM J.H. (1995): A kinetic-study on the bioremediation of sodium-cyanide and acetonitrile by free and immobilised cells of Pseudomonas putida. Applied Biochemistry and Biotechnology, 51 (2): 717726. p. CIAMPI L., TEWARI J.P. (1990): Evaluation of soil-microorganisms with inhibitory activity against Rhizoctonia solani causal agent of the damping-off of canola. Archives of Biological and Medical Experiments (Santiago), 23 (2): 101-112. p. COOK R.J. (1993) Making greater use of introduced microorganisms for biological control of plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, 31: 53-80. p. COOK R.J., BAKER K.F. (1983): The nature and practice of biological control of plant pathogens. St. Paul (MN): American Phytopathological Society, 539 p. COOKSEY D.A. (1993): Copper uptake and resistance in bacteria. Molecular Microbiology, 7 (1): 1-5. p. COUNCIL DIRECTIVE 86/278/EEC of 12 June 1986 on the protection of the environment and in particular of the soil, when sewage sludge is being used for agriculture. Official Journal of the European Communities, L 181. 4/7/1999. COUNCIL DIRECTIVE 1999/31/EC of 26 April 1999 on the landfill of waste. Official Journal of the European Communities, L. 182/1. 16/7/1999. CSATHÓ P. (1994): A környezet nehézfém-szennyezettsége és az agrártermelés. Tematikus szakirodalmi szemle. Budapest: MTA Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézete, 176 p. DALTON D.A., KRAMER S., AZIOS N., FUSARO S., CAHILL E., KENNEDY C. (2004): Endophytic nitrogen fixation in dune grasses (Ammophila arenaria and Elymus mollis) from Oregon. FEMS Microbiology Ecology, 49: 469-479. p. DAVIS J.R., PAVEK J.J., CORSINI D.L., SORENSEN L.H. (1985): Stability of Verticillium resistance of potato clones and changes in soilborne populations with potato monoculture. 165166. p. In: PARKER C.A., ROVIRA A.D., MOORE K.J., WONG P.T.W., KOLLMORGEN J.F. (Szerk.): Ecology and Management of Soilborne Plant Pathogens. St. Paul (MN): American Phytopathological Society, 536 p. DAWSON J.O. (1983): Dinitrogen fixation in forest ecosystems. Canadian Journal of Microbiology, 29: 976-992. p. DILWORTH M.J. (1966): Acetylen reduction by nitrogen-fixing preparations from Clostridium pasteurianum. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects, 127 (2): 285-294. p. DOUGLASS G. K. (1984): The meanings of agricultural sustainability. 1-29. p. In: DOUGLASS G. K. (Szerk.): Agricultural sustainability in a changing world order. Boulder (CO): Westview Press, 343 p. DÖBEREINER J. (1988): Isolation and identification of root associated diazotrophs. Plant and Soil, 110 (2): 207-212. p. DÖBEREINER J. (1997): Biological nitrogen fixation in the tropics: Social and economic contributions. Soil Biology and Biochemistry, 29 (5-6): 771-774. p. DREVON J.J. (1983): Various organisms that fix nitrogen. 1-4. p. In: Food and Agricultural Organization of the United Nations (Szerk.): Technical Handbook on Symbiotic Nitrogen Fixation, Legume/Rhizobium, 1 Biology. H.n.: I.k., 247. p. DUFFY B.K., DÉFAGO G. (1996): Influence of minerals, C-source, and pH on antibiotic and salicylate production by Pseudomonas fluorescens biocontrol strain CHA0. (Abstracts of) Phytopathology, 86: S79. DUMONTET S., DINEL H., BALODA S.B. (1999): Pathogen reduction in sewage sludge by composting and other biological treatments: A review. Biological Agriculture and Horticulture, 16 (4): 409-430. p.


v

EGAMBERDIYEVA D., HÖFLICH G. (2004): Effect of plant growth-promoting bacteria on growth and nutrient uptake of cotton and pea in a semi-arid region of Uzbekistan. Journal of arid Environments, 56: 293-301. p. EHRLICH A.H. (1985): The human population. Size and dynamics. American Zoology, 25 (2): 395406. p. ELAD Y., BAKER R. (1985a): Influence of trace amounts of cations and siderophore-producing pseudomonads on chlamydospore germination of Fusarium oxysporum. Phytopathology, 75 (9): 1047-1052. p. ELAD Y., BAKER R. (1985b): The role of competition for iron and carbon in suppression of chlamydospore germination of Fusarium spp. by Pseudomonas spp. Phytopathology, 75 (9): 1053-1059. p. ELKAN G.H., BUNN C.R. (1994): The rhizobia. 2197-2213. p. In: BALOWS A., TRÜPER H.G., DWORKIN M., HARDER W., SCHLEIFER K.H. (Szerk.): The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria. Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications. New York, Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag, 4126 p. ELLIOT L.F., GILMOUR G.M., LYNCH J.M., TITTEMORE D. (1984): Bacterial colonization of plant roots. 1-16. p. In: TODD R. L., GIDDENS J. E. (Szerk.): Microbial Interactions. Madison (WIS): Soil Science Society of America, 248 p. ELO S., MAUNUKSELA L., SALKINOJA-SALONEN M., SMOLANDER A., HAAHTELA K. (2000): Humus bacteria of Norway spruce stands: plant growth promoting properties and birch, red fescue and alder colonizing capacity. FEMS Microbiology Ecology, 31: 143-152. p. ESHITA S.M., ROBERTO N.H., BEALE J.M., MAMIYA B.M., WORKMAN R.F. (1995): Bacillomycin Lc, new antibiotic of the iturin group: isolations structures and antifungal activities of the congeners. Journal of Antibiotics, 48 (11): 1240-1247. p. FABIANO E., GUALTIERI G., PRITSCH C., POLLA G., ARIAS A. (1994): Extent of highaffinity iron transport system in field isolates of rhizobia. Plant and Soil, 164 (2): 177-185. p. FALLON R.D. (1992): Evidence of hydrolytic route for anaerobic cyanide degradation. Applied and Environmental Microbiology, 58 (9): 3163-3164. p. FALLON R.D., COOPER D.A., SPEECE R., HENSON M. (1991): Anaerobic biodegradation of cyanide under methanogenic conditions. Applied and Environmental Microbiology, 57 (6): 16561662. p. FARRELL K.R., SQUANDERSON F.H., VO T.T. (1984): Feeding a hungry world. Report No. 76. Resources for the Future. Washington (DC): I.k., 247 p. FEDOROV M.V. (1952): Biologicseszkaja fikszacija azota atmoszferü. [Második, átdolgozott és bĘvített kiadás.] Moszkva: Goszudarsztvennoje Izdatyelsztvo Szelszkohozjajsztvennoj Lityeraturü, 671. p. HozzáférhetĘ az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetben. FLEIT E., LAKATOS GY. (2003): Accumulative heavy metal patterns in the sediment and biotic compartments in the Tisza watershed. Toxicology Letters, 140 (SI): 323-332. p. Food and Agriculture Organization of the United Nations [1998]: World Reference Base For Soil Resources. http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/docrep/W8594E/W8594E00.htm. FRANCIS C.A., HILDEBRAND P.E. (1989): Foreword. [1-3. p.] In: Proceedings. Farming Systems Research, Extention and the Concept of Sustainability Symposium. University of Arkansas, Fayettwille, USA August 21-25, 1989. FRANCO-BUFF A., DOMENICO P., BOCHNER B.R. (1998): Inhibition of capsule production in bacteria by thioglycolate. ASM Abstracts, 98: 432. p. FRENYÓ V. (1958): Növényrészek oldható N, K, P tartalmának gyors meghatározása. Agrokémia és Talajtan, 7 (3-4): 401-402. p. FRENYÓ V. (1985): Nitrifikálás talajbaktériumok nélkül? Agrokémia és Talajtan, 34 (1-2): 171178. p. FULCHIERI M., LUCANGELI C., BOTTINI R. (1993): Inoculation with Azospirillum lipoferum affects growth and gibberellin status of corn seedling roots. Plant and Cell Physiology, 34 (8): 1305-1309. p.

vi


GAFFNEY T., FRIEDRICH L., VERNOOIJ B., NEGROTTO D., NYE G., UKNES S., WARD E., KESSMANN H., RYALS J. (1993): Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science, 261 (5122): 754-756. p. GARBAYE J. (1994): Helper bacteria: a new dimension to the mycorrhizal symbiosis. New Phytologist, 128 (2): 197-210. p. GARRITY G.M., BELL J.A., LILBURN T.G. [2004]: Taxonomic Outline of the Prokaryotes. Második kiadás, ötödik változat (Release 5.0). [New York (NY): Springer-Verlag.] (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) 399 p. GASKINS M.H., ALBRECHT S.L., HUBBEL D.H. (1985): Rhizosphere bacteria and their use to increase plant productivity: a review. Agriculture Ecosystems and Environment, 12 (2): 99-116. p. GEELS F.P., SCHIPPERS B. (1983a): Selection of antagonistic fluorescent Pseudomonas ssp. and their root colonization and persistence following treatment of seed potatoes. Phytopathologische Zeitschrift – Journal of Phytopathology, 108 (3-4): 193-206. p. GEELS F.P., SCHIPPERS B. (1983b): Reduction of yield depressions in high-frequency potato cropping soil and seed tuber treatments with antagonistic fluorescent Pseudomonas spp. Phytopathologische Zeitschrift – Journal of Phytopathology, 108 (3-4): 207-214. p. GEELS F.P., SCHIPPERS B. (1983c): Reduction of yield depressions in high-frequency potato cropping by fluorescent Pseudomonas spp. Les Colloques de l’INRA, 18: 231-238. p. GEELS F.P., SCHMIDT E.D.L., SCHIPPERS B. (1985): The use of 8-hydroxy quinoline for the isolation and prequalification of plant growth-stimulating rhizosphere pseudomonads. Biology and Fertility of Soils, 1 (4): 167-173. p. GIEG L.M., KOLHATKAR R.V., MCINERNEY M.J., TANNER R.S., HARRIS S.H., SUBLETTE K.L., SUFLITA J.M. (1999): Intrinsic bioremediation of petroleum hydrocarbons in a gas condensate-contaminated aquifer. Environmental Science and Technology, 33: 2550-2560. p. GILLER K.E., BEARE M.H., LAVELLE P., IZAC A-M.N., SWIFT M.J. (1997): Agricultural intensification, soil biodiversity and ecosystem function. Applied Soil Ecology, 6 (1): 3-16. p. GILLER K.E., DAY J.M. (1985): Nitrogen fixation in the rhizosphere: significance in natural and agricultural systems. p. 127-147. In: Ecological Interactions in Soil. Special Publication No. 4. of the British Ecological Society (a Brit Ökológiai Társaság 4. sz. szakmai kiadványa). Oxford: Blackwell Scientific Publications, 343 p. GILLER K.E., MCGRATH S.P., HIRSCH P.R. (1989): Absence of nitrogen fixation in clover grown on soil subject to long term contamination with heavy metals is due to survival of only ineffective Rhizobium. Soil Biology and Biochemistry, 21 (6): 841-848. p. GILLER K.E., WITTER E., MCGRATH S.P. (1997): Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils: a review. Soil Biology and Biochemistry, 30 (1011): 1389-1414. p. GIL-SOTRES F., TRASAR-CEPEDA C., LEIRÓS M.C., SEOANE S. (2005): Different approaches to evaluating soil quality using biochemical properties. Soil Biology and Biochemistry, 37 (5): 877-887. p. GOODALL D.W. (1954): Objective methods for the classification of vegetation III. An essay in the use of factor analysis. Australian Journal of Botany, 2: 304-324. p. GOPALASWAMY G., KANNAIYAN S., O’CALLAGHAN K.J., DAVEY M.R., COCKING E.C. (2000): The xylem of rice (Oryza sativa) is colonised by Azorhizobium caulinodans. Proceedings of Royal Society London B (Biology), 267 (1439): 103-107. p. GUERINOT M.L. (1991): Iron uptake and metabolism in the rhizobia/legume symbioses. Plant and Soil, 130 (1-2): 199-209. p. GULYÁS F., ABDALLA T.E.B. (1987): Assessment of N2-fixation by lucerne affected by NPK application and inoculation. 309-314. p. In: In: SZEGI J. (Szerk.): Proceedings of the 9th International Symposium on Soil Biology and Conservation of the Biosphere. Vol. 1. Budapest: Akadémiai Kiadó, 572 p.


vii

HAAN A.B., BARTELS P.V., DE GRAAUW J. (1989): Extraction of metal ions from waste water. Modelling of the mass transfer in a supported liquid-membrane process. Journal of Membrane Science, 45 (3): 281-297. p. HALBRITTER A., UZINGER N. (2005): A talaj-mikrobióta vizsgálata foszfoipidek alapján. I. Szükségesség és alkalmazási lehetĘségek. Agrokémia és Talajtan, 54 (3-4): 517-534. p. HAMILTON N.D. (1989): Sustainable agriculture: The role of the alterney. PhD értekezés. Iowa: Drake University des Moines, 134 p. HARDY R.W.F., KNIGHT E. JR. (1967): ATP-dependent reduction of azide and HCN by N2-fixing enzymes of Azotobacter vinelandii and Clostridium pasteurianum. Biochimica et Biophysica Acta, 139: 69-90. HARRIS R.E., BUNCH A.W., KNOWLES C.J. (1987): Microbial cyanide and nitrile metabolism. Science Progress, 71 (282): 293-304. p. HEMMANTARANJAN A., GARG O.K. (1986): Introduction of nitrogen fixing nodules through iron and zinc fertilization in the non nodule-forming French bean (Phaseolus vulgaris L.) Journal of Plant Nutrition, 9 (2): 281-288. p. HILTNER L. (1904a): Zur frage der stickstoffernährung in pflanzen. Landvirtschaftliches VersuchStatistik, 51: 83-100. p. HozzáférhetĘ az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetben. HILTNER L. (1904b): Über neuere Erfahrungen und Probleme auf dem Gebiet der Bodenbakteriologie und unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und Brache. Arbeiten der Deutsche Landwirtschafts-Gesellschaft, 98: 59-78. p. HozzáférhetĘ az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetben. HIRSCH A.M., FANG Y.W. (1994): Plant hormones and nodulation – What’s the connection? Plant Molecular Biology, 26 (1): 5-9. p. HOODA I., PARASHAR R.D., SINDHAN G.S., HOODA I. (1995): Assessment of percent Xanthomonas campestris pv. cyamopsidis infection in cluster bean seed raised from crop sprayed and seed treated with antagonists for controlling bacterial blight infection. Plant Diseases Research, 10 (1): 70-73. p. HORVÁTH I. (1970): Mikrobiológia. Budapest: MezĘgazdasági Kiadó. 901 p. HORVÁTH S. (1980): Mikrobiológiai praktikum. Budapest: Tankönyvkiadó. 590 p. HOTELLING H. (1933): Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology, 24: 417-441, 498-520. p. HÖFLICH G. (1989): The use of rhizosphere microorganisms for stimulating N2-fixation and plant growth. 243-252. p. In. VANÈURA V., KUNC F. (Szerk.): Interrelationships between microorganisms and plants in soil. Praha: Academia Publishing House of the Czechoslovak Academy of Sciences, 249 p. HÖFLICH G., WIEHE W., HECHT-BUCHHOLZ C. (1995): Rhizosphere colonization of different crops with growth promoting Pseudomonas and Rhizobium bacteria. Microbiological Research, 150 (2): 139-147. p. HWANG S.F., CHAKRAVARTY P., CHANG K.F. (1995): The effect of two ectomycorrhizal fungi, Paxillus involutus and Suillus tomentosus, and of Bacillus subtilis on Fusarium dampingoff in jack pine seedlings. Phytoprotection, 76 (2): 57-66. p. INGVORSEN K., HØJER-PEDERSEN B., GODTFREDSEN S.E. (1991): Novel cyanidehydrolysing enzyme from Alcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans. Applied and Environmental Microbiology, 57 (6): 1783-1789. p. VAN ITERSON G., DEN DOOREN DE JONG L.E., KLUYVER A.J. (1995): Martinus Willem Beijerinck, his life and work. 3-154. p. In: BOS P., THEUNISSEN B. (Szerk.): Beijerinck and the Delft School of Microbiology. Delft: Delft University Press, 220 p. JAMES E.K. (2000): Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crop Research, 65 (2-3): 197-209. p. JÁVORKA S., CSAPODY V. (1991): Iconographia florae partis austro-orientalis Europae Centralis. Közép-Európa délkeleti részének flórája képekben. A magyar flóra képekben. Harmadik, változatlan kiadás. Budapest: Akadémiai Kiadó, 576 p. + [8] t. XL. t. + 1 db melléklet. DE

viii


JEPPSSON H., ALEXANDER N.J., HAHN-HÄGERDAL B. (1995): Existence of cyanideinsensitive respiration in the yeast Pichia stipitis and its possible influence on product formation during xylose utilization. Applied and Environmental Microbiology, 61 (7): 2596-2600. p. KAJIMURA Y., SUGIJYMA M., KANEDA M. (1995): Bacillopeptins, new cyclic lipopeptide antibiotics from Bacillus subtilis FR-2. Journal of Antibiotics, 48 (10): 1095-1103. p. KAMPERT M., STRZELCZYK E. (1984): Effect of pH on production of cytokinin-like substances by bacteria isolated from soil, rhizosphere and mycorrhizosphere of pine (Pinus sylvestris L.). Acta Microbiologica Polonica, 33: 77-85. p. KAPOOR I.J., KAR B. (1988): Antagonistic effects of soil microbes of Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, causing tomato wilt. International Journal of Tropical Plant Diseases, 6 (2): 257262. p. KARDOS J. (1983): Az acetilénredukciós teszt alkalmazása a biológiai nitrogénkötés tanulmányozásában. Szemlecikk. Agrokémia és Talajtan, 32 (1-2): 239-245. p. KÁDÁR I. (1995): A talaj–növény–állat–ember tápláléklánc szennyezĘdése kémiai elemekkel Magyarországon. Budapest: MTA Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézete, 388 p. KECSKÉS M. (1976): Xenogén anyagok, minkroorganizmusok és magasabb rendĦ növények közötti kölcsönhatások talajbiológiai értékelése. Doktori értekezés. Budapest: MTA Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézet Mikrobiológiai Osztálya, 225 p. KECSKÉS M. (1977): Soil- and rhizobiological survey of TMTD (thiram). Rhizobium Newsletter, 22 (1): 43-44. p. KECSKÉS M., BORBÉLY I., BORBÉLY F., ELEK É. (1972): Selective investigations on herbicides not inhibiting rhizobia-lupin symbiosis. [64-66. p.] In: Papers of Scientific Conference. Pouskharov Soil Science Institute, Sofia, Bulgaria. September 1-3, 1972, 234 p. KECSKÉS M., VINCENT J.M. (1973): Compatibility of fungicide treatment and rhizobium inoculation of vetch seed. Acta Agronomica Hungarica, 22 (2): 249-263. p. KECSKÉS M. (1983): Mikroorganizmusok laboratóriumban mért peszticidérzékenységének összehasonlítása, környezetvédelmi-talajbiológiai értékelése. Agrokémia és Talajtan, 32 (3-4): 604-606. p. KEENEY R.D. (1989): Towards a sustainable agriculture. Need for clarification of concepts and terminology. American Journal of Alternative Agriculture, 4 (1): 101-106. p. KEMÉNY S., DEÁK A. (2000): Kísérletek tervezése és értékelése. Budapest: MĦszaki Könyvkiadó, 492 p. KEMPE J., SEQUEIRA L. (1983): Biological control of bacterial wilt of potatoes: attempts to induce resistance by treating tubers with bacteria. Plant Disease, 67 (5): 499-503. p. KERESZTÚRI P., LAKATOS GY., URI ZS., SIMON L. (2003): Evaluation of possibility of phytostabilisation of heavy metals by plants. University of Baia Mare Scientific Bulletin C, 17 (5): 243-247. p. KHAMMAS K.M., AGERON E., GRIMONT P.A.D., KAISER P. (1989): Azospirillum irakense sp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil. Research in Microbiology, 140 (9): 679-693. p. KIMBER R.W.L. (1994): Aspects of mine site rehabilitation in Australia with special reference to bioremediation. [338-351. p.] In: Transactions of 15th World Congress of Soil Science, Vol. 4a. Commission III: Symposia. ISSS-MSSS, Québec, Canada. August 22-26, 1994, 380 p. KIMURA M. (1980): A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution, 16: 111120. KLOEPPER J.W., LEONG J., TEINTZE M., SCHROTH M.N. (1980a): Enhanced plant growth by siderophores produced by plant growth-promoting rhizobacteria. Nature, 286 (5776): 885-886. p. KLOEPPER J.W., LEONG J., TEINTZE M., SCHROTH M.N. (1980b): Pseudomonas siderophores: a mechanism explaining disease-suppressive soils. Current Microbiology, 4 (5): 317-320. p.


ix

KLOEPPER W., LIFSHITZ R., SCHROTH M.N. (1988): Pseudomonas inoculants to benefit plant production. ISI Atlas of Science – Animal & Plant Sciences, 1 (1): 60-64. p. KLOEPPER J.W., SCHER F.M., LALIBERTE M., TIPPING B. (1986): Emergence-promoting rhizobacteria: description and implications for agriculture. 155-164. p. In: SWINBURNE T.R. (Szerk.): Iron, siderophores and plant disease. New York: Plenum, 248 p. KLOEPPER J.W., SCHROTH M.N. (1981): Relationship of in vitro antibiosis of plant growthpromoting rhizobacteria to plant growth and the displacement of root microflora. Phytopathology, 71 (10): 1020-1024. p. KORSTEN L., DE VILLIERS E.E, DUVENHAGE J.A., KOTZE J.M. (1994): Control of avocado pre-harvest diseases with Bacillus subtilis and fungicide sprays. Yearbook of South-African Avocado Growers' Association, 17: 32-34. p. KORSTEN L., DE JAGER E.S., DE VILLIERS E.E., LOURENS A., KOTZE J.M., WEHNER F.C., (1995): Evaluation of bacterial epiphytes isolated from avocado leaf and fruit surfaces for biocontrol of avocado postharvest diseases. Plant Disease, 79 (11): 1149-1156. p. KOVÁCS G. (2001): Klasszikus és molekuláris biodiverzitási vizsgálatok úszólápon növĘ keskenylevelĦ gyékény (Typha angustifolia L.) rizoplán baktérium-közösségén. KÖDÖBÖCZ L., BIRÓ B., DUSHA I., IZSÁKI Z.-NÉ, SÁRY L., KECSKÉS M. (2003): Rhizobium törzsek túlélĘképessége különbözĘ vivĘanyagokban. Agrokémia és Talajtan, 52 (3-4): 395-408. p. KÖVES-PÉCHY K., BAKONDI-ZÁMORY É., SZEGI J. (1987): The effect of some pesticides on lucerne-Rhizobium symbiosis. 387-394. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Proceedings of the 9th International Symposium on Soil Biology and Conservation of the Biosphere. Vol. 1. Budapest: Akadémiai Kiadó, 572 p. KÖVES-PÉCHY K., BAKONDI-ZÁMORY É., SZILI-KOVÁCS T., SZEGI J. (1990): Investigation of natural Rhizobial populations in Hungarian soils, demonstrated on four leguminous plants. 335-342. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil Biology and the Conservation of the Biosphere. Proceedings of the 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, August 27-31 1989. Agrokémia és Talajtan, 39 (3-4): 606 p. KÖVES-PÉCHY K., SZENDE K. (1984): Phylogenetic relatedness among Rhizobia. 517-520. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil biology and conservation of the biosphere. Proceedings of the 8th Meeting of the Soil Biology Section of the Hungarian Society for Soil Science, GödöllĘ, August 26-28, 1981. Vol. 2. Budapest: Akadémiai Kiadó, 902 p. KUGLER M., LOEFFLER W., RAPP C., KERL A., JUNG G. (1990): Rhizocticin A, an antifungal phosphono-oligopeptide of Bacillus subtilis ATCC 6633: biological properties. Archives of Microbiology, 153 (3): 276-281. p. KUNZ D.A., CHEN J-L., PAN G. (1998): Accumulation of Į-keto acids as essential components in cyanide assimilation by Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764. Applied and Environmental Microbiology, 64 (11): 4452-4459. p. LADHA J.K., BARRAQUIO W.L., WATANABE I. (1983): Isolation and identification of nitrogenfixing Enterobacter cloacae and Klebsiella planticola associated with rice plants. Canadian Journal of Microbiology, 29 (10): 1301-1308. p. LAEMMLI U.K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4. Nature, 227 (5259): 680-685. p. LALANDE R.; BISSONNETTE N.; COUTLÉE D., ANTOUN H. (1989) Identification of rhizobacteria from maize and determination of their plant-growth promoting potential. Plant and Soil, 115 (1): 7-11. LAMBERT B., JOOS H. (1989): Fundamental aspects of rhizobacterial plant-growth promotion research. Trends in Biotechnology, 7 (8): 215-219. p. LÁNG F. (1994): Növényélettani gyakorlatok. Egyetemi gyakorlati jegyzet. Budapest: ELTE Sokszorosítóüzem, 229 p. LÁNG I. (1992): The ecological foundation of sustainable land use. Hungarian agriculture and the way to sustainability. Symposium on soil resilience and sustainable land use. Budapest, Hungary,

x


September 28-October 20, 1992. 27 p. Kéziratként hozzáférhetĘ az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézetben. LARSON W.E., PIERCE F.J., DAVDY R.H. (1984): Our agricultural resources: Management for conservation 40-59. p. In: ENGLISH B. (Szerk.): Future Agricultural Technology and Resource Conservation. ElsĘ kiadás. Ames (IA): Iowa State University Press [Blackwell Publishing Professional], 738 p. LAZÁNYI J. (1993): Challenges and problems of transition to sustainable agriculture in Hungary. MBA szakdolgozat. Wageningen-Debrecen, 112 p. LAZÁNYI J. (1994): A homokjavító vetésforgókkal végzett kísérletek eredményei. Nyíregyháza: Debreceni Agrártudományi Egyetem Kutató Központja, 238 p. LAZZARETTI E., MENTEN J.O.M., BETTIOL W. (1994): Bacillus subtilis antagonistic to the principal pathogens associated with bean and wheat seeds. Fitopatología Venezolana, 7 (2): 4246. p. LEHOCZKY É., MARTH P., SZABADOS I. (1997): Meszezés hatásának tesztelése salátával nehézfém-szennyezett talajon. 196-200. p. In: ELEK GY., VÉCSI B. (Szerk.): XI. Országos Környezetvédelmi Konfencia kiadványa. Siófok: MTESZ Fejér megyei Szervezete, Szeptember 15-17, 1997, 375 p. LELLIOTT R.A., BILLING E., HAYWARD A.C., (1966): A determinative scheme for the fluorescent plant pathogenic pseudomonads. Journal of Applied Bacteriology, 29 (3): 470-489. p. LEONG J. (1986): Siderophores: their biochemistry and possible role in the biocontrol of plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, 24: 187-209. p. LEPP N.W., EDWARDS R., JONES K.C. (1995): Other less abundant elements of potential environment significance. In: ALLOWAY B.J. (Szerk.): Heavy metals in soils. London, Glasgow, stb.: Blackie Academic & Professional, 368 p. LETHAM D.S. (1968): A new cytokinin bioassay. 19-23. p. In: WIGHTMAN-SETTERFIELD M. (Szerk.): Biochemistry and physiology of plant growth substances. Ottawa: Carleton University Press, 249 p. LI C.Y., MASSICOTTE H.B., MOORE L.V.H. (1992): Nitrogen-fixing Bacillus sp. associated with Douglas-fir tuberculate ectomycorrhizae. Plant and Soil, 140 (1): 35-40. p. LIEBIG J. (1876): Die chemie in ihrer Anwendung auf Landwirtschaft und Physiologie. Neunte Auflage. Braunschweig: Vieweg, 3-341. p. In: KÁDÁR I. (Szerk.): Kémia alkalmazása a mezĘgazdságban és a növényélettanban 1840-1876. Magyar kiadás. Budapest: Magyar Tudományos Akadémia Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézete, 1996, 343 p. LIFSHITZ R., GUILMETTE H., KOZLOWSKI M. (1988): Tn5-mediated cloning of a genetic region from Pseudomonas putida involved in the stimulation of plant root elongation. Applied Environmental Microbiology, 54 (12): 3169-3172. p. LIFSHITZ R., KLOEPPER J.W., KOZLOWSKI M., SIMONSON C., CARLSON J., TIPPING E.M., ZALESKA I. (1987): Growth promotion of canola (rapeseed) seedlings by a strain of Pseudomonas putida under gnotobiotic conditions. Canadian Journal of Microbiology, 33 (5): 390-395. p. LINDSAY W.L., SCHWAB A.P. (1982): The chemistry of iron in soils and its availability to plants. Journal of Plant Nutrition, 5 (4-7): 821-840. p. LINDSAY W.L. (1979): Chemical equilibria in soils. New York (NY), Chicester, Toronto: Wiley, 449 p. LIU L., KLOEPPER J.W., TUZUN S. (1995): Induction of systemic resistance in cucumber by plant growth-promoting rhizobacteria: duration of protection and effect of host-resistance on protection and root colonization. Phytopathology, 85 (10): 1064-1068. p. LOCKERETZ W. (1986): Alternative agriculture. 291-311. p. In: DAHLBERG K.A. (Szerk.): New Directions for Agriculture and Agricultural Research: Neglected Dimensions and Emerging Alternatives. Totowa (NJ): Rowman & Littlefield, 448 p. LOCKERETZ W. (1988): Open questions in sustainable agriculture. American Journal of Alternative Agriculture, 3 (2): 174-181. p.


xi

LOEFFLER W., TSCHEN J.S.M., VANITTANAKOM N., KUGLER M., KNORPP E., HSIEH T. F., WU T.G. (1986): Antifungal effects of bacilysin and fegymycin from Bacillus subtilis F-29-3. A comparison with activities of other Bacillus antibiotics. Journal of Phytopathology, 115 (3): 204-213. p. LOPER J.E. (1988): Role of fluorescent siderophore production in biological control of Pythium ultimum by a Pseudomonas fluorescens strain. Phytopathology, 78 (2): 166-172. p. LOPER J.E., HENKELS M.D. (1999): Utilization of heterologous siderophores enhances levels of iron available to Pseudomonas putida in the rhizosphere. Applied and Environmental Microbiology, 65 (12): 5357-5363. p. LOPER J.E., SCHROTH M.N. (1986): Influence of bacterial sources of indole-3-acetic acid on root elongation of sugar beet. Phytopathology, 76 (4): 386-389. p. LORENZ S.E., MCGRATH S.P., GILLER K.E. (1992): Assessment of free-living nitrogen fixation activity as a biological indicator of heavy metal toxicity in soil. Soil Biology and Biochemistry, 24: 601-606. p. LOWRANCE R., TODD R., FAIL J., HENDRICKSON O., LEONARD R., ASMUSSEN L. (1984): Riparian forests as nutrient filters in agricultural watersheds. Bioscience, 34 (6): 374-377. p. LOY A., HORN M., WAGNER M. (2003): probeBase – an online resource for tRNA-targeted oligonucleotide probes. Nucleic Acid Research, 31: 514-516. p. LYNCH J.M. (1976): Products of soil microorganisms in relation to plant growth. CRC Critical Reviews in Microbiology, 5 (1): 67-107. p. LYNCH J.M. (1990): Introduction: some consequences of microbial rhizosphere competence for plant and soil. 1-10. p. In: LYNCH J. M. (Szerk.): The rhizosphere. Chicester, New York, stb.: Wiley, 458 p. MAGLEBY R., COLACICCO D., THIGPEN J. (1985): Trends in conservation tillage use. Journal of Soil Water Conservation, 40 (3): 274-276. p. MAHADEVAMURTHY S., PRAKASH H.S., SHETTY H.S. (1988): Effect of some antagonists on the sclerotial germination of Claviceps fusiformis. Journal of Biological Control, 2 (2): 120-122. p. MANCZEL J. (Szerk.) (1983): Statisztikai módszerek alkalmazása a mezĘgazdaságban. Budapest: MezĘgazdasági Kiadó, 459 p. MANNINGER E., KėVÁRI B. (1983): Rhizobium-törzsek izolálása és hatékonyságuk vizsgálata 1981-ben. Agrokémia és Talajtan, 32 (1-2): 225-238. p. MARTENSSON A.M. (1992): Effects of agrochemicals and heavy metals on fast-growing rhizobia and their symbiosis with small-seeded legumes. Soil Biology nad Biochemistry, 24 (5): 435-445. p. MÃRTENNSON A. (1993): Heterotrophic nitrogen fixation in soil. 85-90. p. In: TORSTENNSON L. (Szerk.): Soil Biological Variables in Environmental Hazard Assessment. Guidelines. Uppsala: Swedish Environmental Protection Agency, GEO Tryckeriet, Uppsala University. MARTÌNEZ E. (1994): Recent developments in Rhizobium taxonomy. Plant and Soil, 161 (1): 1120. p. MATTARELLI P., BIAVATI B., CROCIANI F., SCARDOVI V., PRATI G. (1993): Bifidobacterial cell wall proteins (BIFOP) in Bifidobacterium globosum. Research in Microbiology, 144 (7): 581-590. p. MATTARELLI P., BIAVATI B., PESENTI M., CROCIANI F. (1998): Effect of growth temperature on the biosynthesis of cell wall proteins from Bifidobacterium globosum. Research in Microbiology, 150: 117-127. p. MÁTHÉ P., MÁTHÉ-GÁSPÁR G., ANTON A. (2004): The phosphomonoesterase activity of lignite mine spoils. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 51 (1-2): 203-204. p. MÁTHÉ-GÁSPÁR G., ANTON A., (2004): Toxikuselem-szennyezĘdés káros hatásainak mérséklése fitoremediációval. Agrokémia és Talajtan, 53 (3-4): 413-432. p.

xii


MAVINGUI P., LAGUERRE G., BERGE O., HEULIN T. (1992): Genetic and phenotypic diversity of Bacillus polymyxa in soil and in the wheat rhizosphere. Applied and Environmental Microbiology, 58 (6): 1894-1903. p. MAZZOLA M., COOK R. (1991): Effects of fungal root pathogens on the population dynamics of biocontrol strains of fluorescens pseudomonads in the wheat rhizosphere. Applied and Environmental Microbiology, 57 (8): 2171-2178. p. MCGRATH S.P. (1994): Effects of heavy metals from sewage sludge on soil microbes in agricultural ecosystems. 247-274. p. In: ROSS M. (Szerk.): Toxic metals in the soil-plant system. London, New York (NY): Wiley. MCKEEN C.D., REILLY C.C., PUSEY P.L. (1986): Production and partial characterization of antifungal substances antagonistic to Monilinia fructicola from Bacillus subtilis. Phytopathology, 76 (2): 136-139. p. MCLAUGHLIN R.J., SEQUEIRA L. (1988): Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato. American Potato Journal, 65 (5): 255-268. p. MEHNAZ S., MIRZA M.S., HAURAT J., BALLY R., NORMAND P., BANO A., MALIK K.A. (2001): Isolation and 16S rRNA sequence analysis of the beneficial bacteria from the rhizosphere of rice. Canadian Journal of Microbiology 47 (2): 110-117. p. MERCER P.C., KIRK S.A. (1984): Biological treatments for the control of decay in tree wounds. I. Laboratory tests. Annals of Applied Biology, 104 (2): 211-219. p. MERGEAY M., NIES D., SCHLEGEL H.G., GERTIS J., CHARLES P., VAN GIJSEGEM F. (1985): Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolitotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals. Journal of Bacteriology, 162 (1): 328-334. p. MIZUBUTI E.S.G., MAFFIA L.A., MUCHOVEJ J.J., ROMEIRO R.S., BATISTA U.G. (1995): Epidemiological aspects of Uromyces appendiculatus on dry bean (Phaseolus vulgaris) after treatment with Bacillus subtilis. Journal of Phytopathology, 143 (11-12): 689-691. p. NEILANDS J.B. (1981a): Iron absorption and transport in microorganisms. Annual Review of Nutrition, 1: 27-46. p. NEILANDS J.B. (1981b): Microbial iron compounds. Annual Review of Biochemistry, 50: 715-731. p. NEILANDS J.B., KONOPKA K., SCHWYN B., COY M., FRANCIS R.T., PAW H., BAGG A. (1987): Comparative biochemistry of microbial iron assimilation. 3-33. p. In: WINKELMANN G., HELM V.D.D., NEILANDS J.B. (Szerk.): Iron Transport in Microbes, Plants and Animals. Weinheim: VCH Verlag, 384 p. NÉMETH T., MOLNÁR E., CSILLAG J., BUJTÁS K., LUKÁCS A., PÁRTAY G. (1993): Fate and plant uptake of heavy metals in soil–plant systems studied on soil monoliths. Agrokémia és Talajtan, 42 (1-2): 195-206. p. NIES D.H., NIES A., CHU L., SILVER S. (1989): Expression and nucleotide sequence of a plasmid-determined divalent cation efflux system from Alcaligenes eutrophus. Proceedings of the National Academy of the U.S.A., 86 (19): 7351-7355. NIKAIDO H., VAARA M. (1985): Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiological Reviews, 49 (1): 1-32. p. NIKOLAUSZ M., MÁRIALIGETI K., KOVÁCS G. (2004): Comparison of RNA- and DNA-based species diversity investigations in rhizoplane bacteriology with respect to chloroplast sequence exclusion. Journal of Microbiological Methods, 56 (3): 365-373. p. NIKOLAUSZ M., SIPOS R., RÉVÉSZ S., SZÉKELY A., MÁRIALIGETI K. (2005): Observation of bias associated with re-amplification of DNA isolated from denaturing gradient gels. FEMS Microbiology Letters, 244 (2): 385-390. p. NOWAK A. (1987): Application of the respiration measurements on the estimation of the influence of heavy metals on soil microflora. 805-810. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Proceedings of the 9th International Symposium on Soil Biology and Conservation of the Biosphere. Vol. 2. Budapest: Akadémiai Kiadó, 936 p.


xiii

O’HARA G.W., DILWORTH M.J., BOONKERD N., PARKPIAN P. (1988a): Iron deficiency specifically limits nodule development in peanut inoculated with Bradyrhizobium sp. New Phytologist, 108 (1): 51-57. p. O’HARA G.W., HATZOOK A., BELL R.W., LONERAGAN J.F. (1988b): Response to Bradyrhizobium strain of peanut cultivars grown under iron stress. Journal of Plant Nutrition, 11 (1): 6-11. p. OLÁH J. (1983): Nitrogénkötés sekély tavakban. Budapest: Akadémiai Kiadó. O’NEILL G.A., CHANWAY C.P., AXELROOD P.E., RADLEY R.A., HOLL F.B. (1992): An assessment of spruce growth response specificity after inoculation with coexistent rhizosphere bacteria. Canadian Journal of Botany, 70 (12): 2347-2353. p. O’SULLIVAN D.J., O’GARA F. (1992): Traits of fluorescens Pseudomonas ssp. involved in suppression of plant root pathogens. ASM Microbiology and Molecular Biology Reviews [ASM Microbiological Reviews], 56 (4): 662-676. p. ODUM E.P. (1983): Basic ecology. Philadelphia (PA): Saunders, 384 p. ODUM E.P. (1989): Input management of production systems. Science, 243 (4888): 177-182. p. OLDAL B., JEVCSÁK I., KÖDÖBÖCZ L., ROMÁN F., VARGHA M., BAYOUMI HAMUDA H.E.A.F., BIRÓ B., NAÁR Z., KECSKÉS M. (2001): Cyanide and heavy metal sensitivity of microbial isolates from polluted Tisza river. University of Baia Mare Scientific Bulletin C, 15 (4): 197-202. p. OLDAL B., VARGHA M., JEVCSÁK I., KÖDÖBÖCZ L., KECSKÉS M. (2004): Characteristic bacterial forms of Upper Tisza river under cyanide and heavy metal pollution. [105-110. p.] In: CHROĕÁKOVÁ A., KRIŠTģFEK V., ELHOTTOVÁ D., MALÝ S. (Szerk.): Proceedings of the 9th Methodological workshop. Present methods for investigation of microbial community biodiversity in soils and substrates. Institute of Soil Biology AS CR. ýeské BudČjovice, Czech Republic, March 2-3, 2004. [CD:\Proceedings from 9th Methodological Workshop, ýB.pdf] OLSON B.H., THRONTON I. (1982): The resistance patterns to metals of bacterial populations in contaminated land. Journal of Soil Science, 33 (2): 271-277. p. OLYUNINA L.N., SHABAEV V.P. (1996): Production of indol-3-acetic acid during growth of the rhizosphere bacteria of the genus Pseudomonas. Microbiology, 65 (6): 709-713. p. [Mikrobiologiya, 65: 813-817. p.] PACHLEWSKI R., KERMEN J., CHRUŒCIAK E., TRZCIÑSKA M. (1991): Studies of pine ectendomycorrhizae in nurseries. Acta Mycologica 27: 49-61. p. PAL K.K., TILAK K.V.B.R., SAXENA A.K., DEY R., SINGH C.S. (2001): Suppression of maize root diseases caused by Macrophomina phaseolina, Fusarium moniliforme and Fusarium graminearum by plant growth promoting rhizobacteria. Microbial Research, 156: 209-223. p. PANDEY A., DURGAPAL A., JOSHI M., PALNI L.M.S. (1999): Influence of Pseudomonas corrugata inoculation on root colonization and growth promotion of two important hill crops. Microbiological Research, 154 (3): 259-266. p. PARK M., KIM C., YANG J., LEE H., SHIN W., KIM S., SA T. (2005): Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea. Microbiological Research, 160: 127-133. p. PEARSON K. (1901): On lines and planes of closest fit to systems of points in space. Philosoph. Mag. Ser., 6 (2): 559-572. p. PHILSON S.B., LLINAS M. (1982a): Siderochromes from Pseudomonas fluorescens. I. Isolation and characterization. Journal of Biological Chemistry, 257 (14): 8081-8086. p. PHILSON S.B., LLINAS M. (1982b): Siderochromes from Pseudomonas fluorescens. II. Structural homology as revealed by NMR spectroscopy. Journal of Biological Chemistry, 257 (14): 80868090. p. PITTS G., ALLAM A.I., HOLLIS J.P. (1972): Beggiatoa: occurence in rice rhizosphere. Science, 178 (4499): 179-180. p. PLEBAN S., INGEL F., CHET I. (1995): Control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in the greenhouse using endophytic Bacillus spp. European Journal of Plant Pathology, 101 (6): 665672. p.

xiv


PODANI J. (1997): Bevezetés a többváltozós biológiai adatfeltárás rejtelmeibe. Budapest: Scientia, 412 p. PODOLSKAYA V.I., YAKUBENKO L.N., ULBERG Z.R., KARAMUSKHA V.I., SHPAK V.E., GRISCHENKO R.I. (1995): Colloidal-biochemical regularities of decomposition of cyanide complexes of transition-metals in a dispersion of Pseudomonas fluorescens. Colloid Journal, 57 (4): 507-511. p. POWELL P.E., CLINE G.R., REID C.P.P., SZANISZLÓ P.J. (1980): Occurrence of hydroxamate siderophore iron chelators in soils. Nature, 287 (5785): 833-834. p. P. SZABÓ GY. (1994): ElĘszó. In: LAZÁNYI, J. (1994): A homokjavító vetésforgókkal végzett kísérletek eredményei. Nyíregyháza: Debreceni Agrártudományi Egyetem Kutató Központja, 238 p. PUSEY P.L. (1989): Use of Bacillus subtilis and related organisms as biofungicides. Pesticide Science, 27 (2): 133-140. p. QURESHI J.A.; ZAFAR Y., MALIK K.A. (1988): Klebsiella sp. NIAB-1: A new diazotroph, associated with the roots of kallar grass from saline sodic soils. Plant and Soil, 110 (2): 219-224. p. RADEMACHER W. (1994): Gibberellin formation in microorganisms. Plant Growth Regulation, 15 (3): 303-314. p. RAGAB M.M.M. (1994): Antagonism between epiphytic microorganisms and Ustilago maydis causing common smut of maize. Egyptian Journal of Phytopathology, 22 (1): 17-37. p. RAINEY F.A., WARD-RAINEY N., KROPPENSTEDT R.M., STACKEBRANDT E. (1996): The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and distinct actinomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. International Journal of Systematic Bacteriology, 46 (4): 1088-1092. p. RASKIN I. (1992): Role of salicylic acid in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 43 (1): 439-463. p. REDING H.K., HARTEL P.G., WIEGEL J. (1991): Effect of Xanthobacter, isolated and characterized from rice roots, on growth of wetland rice. Plant and Soil, 138 (2): 221-229. p. REIGH G., O’CONNEL M. (1993): Siderophore-mediated iron transport correlates with the presence of specific iron-regulated proteins in the outer membrane of Rhizobium meliloti. Journal of Bacteriology, 175 (1): 94-102. p. REINHOLD B., HUREK T., FENDRIK I. (1987): Cross-reaction of predominant nitrogen-fixing bacteria with enveloped, round bodies in the root interior of kallar grass. Applied and Environmental Microbiology, 53 (4): 889-891. p. REINHOLD-HUREK B., HUREK T. (1998): Life in grasses: diazotrophic endophytes. Trends in Microbiology, 6 (4): 139-144. p. ROGER P.A., LADHA J.K. (1992): Biological N2 fixation in wetland rice fields: estimations and contribution to nitrogen balance. Plant and Soil, 141 (1-2): 41-55. p. ROHLF F.J. (1963): Classification of Aedes by numerical taxonomic methods (Diptera, Culicidae). Systematic Zoology, 12: 97-117. p. ROLLINSON G., JONES R., MEADOWS M.P., HARRIS R.E., KNOWLES C.J. (1987): The growth of a cyanide utilising strain of Pseudomonas fluorescens in liquid culture on nickel cyanide as a source of nitrogen. FEMS Microbiology Letters, 40 (2-3): 199-205. p. ROSS I.S. (1993): Membrane transport processes and response to heavy metals. 97-125. p. In: JEMMINGS D.H. (Szerk.): Stress Tolerance of Fungi. New York (NY): Marcel Dekker. ROSZAK D.B., COLWELL R.R. (1987): Survival strategies of bacteria in natural environments. Microbiological Reviews, 51 (3): 365-379. p. ROZENZWEIG M.L., ABRAMSKY Z. (1993): How are diversity and productivity related? 52-65. p. In: RICKLEFS R.E., SCHLUTER D. (Szerk.): Species Diversity in Ecological Communities: Historical and Geographical Perspectives. Chicago: University of Chicago Press.


xv

ROVIRA A.D., DAVEY C.B. (1974): Biology of the rhizosphere. 153-204. p. In: CARSON E.W. (Szerk.): The plant root and its environment. Charlottesville (VA): University of Virginia Press, 691 p. ROVIRA A.D., FOSTER R.C., MARTIN J.K. (1979): Note on terminology: origin, nature and nomenclature of the organic material in the rhizosphere. 1-4. p. In: HARLEY J.L. (Szerk.): The soil-root interface. New York (NY): Academic Press, 483 p. RÓĩYCKI H. (1987): Bacteria nad actinomycetes in soil, rhizosphere and mycorrhizophere of pine (Pinus sylvestris L.). Polonian Journal of Soil Science, 20 (1): 53-59. p. RÓĩYCKI H., DAHM H., STRZELCZYK E., LI C.Y. (1999): Diazotrophic bacteria in root-free soil and in the root zone of pine (Pinus sylvestris L.) and oak (Quercus robur L.). Applied Soil Ecology, 12: 239-250. p. RUTTAN V.W. (1988): Sustainability is not enough. American Journal of Alternative Agriculture, 3 (1-2): 128-130. p. SADLERS H.M., (1996): Einsatz von Bakterien zur Bekämpfung von Pilzkrankheiten. Gemüse München, 32 (3): 180-181. p. SAITOU N., NEI M. (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4 (4): 406-425. SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. (1989): Molecular cloning: a laboratory manual. Második kiadás. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 804 p. SASTRE I., VICENTE M.A., LOBO M.C. (1996): Influence of the application of sewage sludges on soil microbial activity. Bioresource Technology, 57 (1): 19-23. p. SARWAR M., KREMER R.J. (1995): Enhanced suppression of plant growth through production of L-tryptophan-derived compounds by deleterious rhizobacteria. Plant and Soil, 172 (3): 261-269. p. SCHER F.M. (1986): Biological control of Fusarium wilts by Pseudomonas putida and its enhancement by EDDHA. 109-117. p. In: SWINBURNE T.R. (Szerk.): Iron, Siderophores and Plant Diseases. [New York (NY), London: Plenum.] (NATO Asi Series A, Life Sciences, Vol 117.) 313 p. SCHIPPERS B. (1988): Biological control of pathogens with rhizobacteria. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 318 (1189): 283-293. p. SCHIPPERS B., BAKKER A.W., BAKKER P.A.H.M. (1987): Interactions of deleterious and beneficial rhizosphere microorganisms and the effect of cropping practices. Annual Review of Phytopathology, 25: 339-358. p. SCHIPPERS B., GEELS F.P., HOEKSTRA O., LAMERS J.G., MAENHOUT C.A., SCHOLTE K. (1985): Yield depressions in narrow rotations caused by unknown microbial factors and their suppression by selected pseudomonads. 127-130. p. In: PARKER C.A., ROVIRA A.D., MOORE K.J., WONG P.T.W. (Szerk.): Ecology and management of soilborne plant pathogens. St Paul (MN): The American Phytological Society, 462 p. SCHLEIFER K.H., KANDLER O. (1972): Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriological Reviews, 36 (4): 407-477. p. SCHLOTER M., HARTMANN A. (1998): Endophytic and surface colonization of wheat roots (Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain-specific monoclonal antibodies. Symbiosis, 25 (1-3): 159-179. p. SCHÖLLHORN R., BURRIS R.H. (1966): Study of intermediates in nitrogen fixation. Proceedings. ElsĘ kiadás. [Cranfield (Bedfordshire, UK): Cranfield Institute of Technology.] (Microbiology in Civil Engineering. FEMS Symposium, 24.) 710. p. SCHWARZENBACH G., FLASCHKA H. (1969): Complexometric Titrations. London: Methuen, 474 p. SCHWYN B., NEILANDS J.B. (1987): Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry, 160 (1): 47-56. p.

xvi


SENANAYAKE R. (1991): Sustainable Agriculture: Definitions and parameters for measurement. Journal of Sustainable Agriculture, 1 (4): 7-28. p. SHISHIDO M., LOEB B.M., CHANWAY C.P. (1995): External and internal root colonization of lodgepole pine seedlings by two growth-promoting Bacillus strains originated from different root microsites. Canadian Journal of Microbiology, 41 (8): 707-713. p. SIDDIQUI Z.A., MAHMOOD I. (1995a): Management of Meloidogyne incognita race 3 and Macrophomina phaseolina by fungus culture filtrates and Bacillus subtilis in chickpea. Fundamental and Applied Nematology, 18 (1): 71-76. p. SIDDIQUI Z.A., MAHMOOD I. (1995b): Biological control of Heterodera cajani and Fusarium udum by Bacillus subtilis, Bradyrhizobium japonicum and Glomus fasciculatum on pigeonpea. Fundamental and Applied Nematology, 18 (6): 559-566. p. SIMON A., ROVIRA A.D., SAUDS D.C. (1973): An improved selective medium for the isolation of fluorescent pseudomonas. Journal of Applied Bacteriology, 36 (1): 141-145. p. SNEH B., DUPLER M., ELAD Y., BAKER R. (1984): Chlamydospore germination of Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum as affected by fluorescent and lytic bacteria from Fusariumsuppressive soil. Phytopathology, 74 (9): 1115-1124. p. SOKAL R.R., MICHENER C.D. (1958): A statistical method for evaluating systematic relationships. University of Kansas Scientific Bulletin, 38: 1409-1438. p. STACKEBRANDT E., RAINEY F.A. (1995): Partial and complete rDNA sequences, their use in generation of 16S rDNA phylogenetic trees and their implications in molecular ecological studies. 47-85. p. In AKKERMANS A.D.L., VAN ELSAS J.D., DE BRUIN F.J. (Szerk.): Molecular Microbial Ecology Manual. Doordrecht: Kluwer Academic Publishers, 414 p. STOLTZFUS J.R., SO R., MALARVITHI P.P., LADHA J.K., DE BRUIJN F.J. (1997): Isolation of endophytic bacteria from rice and assessment of their potential for supplying rice with biologically fixed nitrogen. Plant and Soil, 194 (1-2): 25-36. p. STRZELCZYK E., KAMPERT M., LI C.Y. (1994): Cytokinin-like substances and ethylene production by Azospirillum in media with different carbon sources. Microbiological Research, 149 (1): 55-60. p. SUOMINEN L., JUSSILA M.M., MÄKELÄINEN K., ROMANTSCHUK M., LINDSTRÖM K. (2000): Evaluation of the Galega–Rhizobium galegae system for the bioremediation of oilcontaminated soil. Environmental Pollution, 107 (2): 239-244. p. SZABÓ I.M. (1992): Az általános talajtan biológiai alapjai. Budapest: Magyar MezĘgazdasági Kiadó, 373 p. SZABÓ I.M. (1998): A környezet-mikrobiológia vizsgáló módszerei I. 501-502. p. In: SZABÓ I. M. (Szerk.): A bioszféra mikrobiológiája IV. Budapest: Akadémiai Kiadó, 932 p. SZABÓ G. (1997): Környezetgazdálkodás. Távoktatási programcsomag. Kaposvár: Pannon Agrártudományi Egyetem. SZEGI J. (1979): Talajmikrobiológiai vizsgálati módszerek. 171-177. p. Budapest: MezĘgazdasági Kiadó, 311 p. SZEGI J., GULYÁS F., KÖVES-PÉCHY K., SOÓS T. (1990): Hungarian experiments with the utilization of Rhizobial inoculant in practice. 325-328. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil Biology nad the Conservation of the Biosphere. Proceedings of the 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, August 27-31 1989. Agrokémia és Talajtan, 39 (3-4): 606 p. SZENDE K. (1987): Competition among Rhizobia followed by bacteriophage typing. 363-371. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Proceedings of the 9th International Symposium on Soil Biology and Conservation of the Biosphere. Vol. 1. Budapest: Akadémiai Kiadó, 572 p. SZENDE K. (1990): Variation in indigenous Rhizobium meliloti populations and the effect of inoculation. 347-352. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil Biology nad the Conservation of the Biosphere. Proceedings of the 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, August 27-31 1989. Agrokémia és Talajtan, 39 (3-4): 606 p. SZMIRNOV V.V., REZNYIK SZ.R., VASZILJEVSZKAJA I.A. (1986): Aerob spóraképzĘ baktériumok. Budapest: Medicina, 96 p. TEINTZE M. HOSSAIN B., BARNES C.L., LEONG J., VAN DER HELM D. (1981): Structure of


xvii

ferric pseudobactin, a siderophore from a plant growth promoting Pseudomonas. Biochemistry, 20 (22): 6446-6457. p. TEPPER E.C. (1945): Metodika ucseta tipicsnüh bakterij rizoszferü szelszkohozjajsztvennüh rasztenij. [Második, átdolgozott és bĘvített kiadás.] Moszkva: TSZHA dokladü, 131 p. HozzáférhetĘ a SZIE Környezettudományi Doktori Iskola, MezĘgazdasági-, Környezeti Mikrobiológia és Talajbiotechnológia c. tudományági részterület könyvtárában (1111 Budapest, Budafoki út 59.). TOBOR-KAPLON M.A., BLOEM J., RÖMKENS P.F.A.M., RUITER DE P.C. (2005): Functional stability of microbial communities in contaminated soils. Oikos, 111 (1): 119-129. p. TOMSETT A.B. (1993): Genetics and molecular biology of metal tolerance in fungi. 69-95. p. In: JENNINGS D.H. (Szerk.): Stress Tolerance of Fungi. New York (NY): Marcel Dekker. TOPP E., XUN L.I., ORSER C.S. (1992): Biodegradation of the herbicide bromoxynil (3,5dibromo-4-hydroxybenzonitrile) by purified pentachlorophenol hydroxylase and whole cells of Flavobacterium sp. strain ATCC 39723 is accompanied by cyanogenesis. Applied and Environmental Microbiology, 58 (2): 502-506. p. TORSVIK V., GOKSØYR J., DAAE F.L., SØRHEIM R., MICHALSEN J., SALTE K. (1994): Use of DNA analysis to determine the diversity of microbial communities. 39-48. p. In: RITZ K., DIGHTON J., GILLER K.E. (Szerk.): Beyond the Biomass. Compositional and Functional Analysis of Soil Microbial Communities. Chicester: Wiley. VAJNA L. (1987): Növénypatogén gombák. Budapest: MezĘgazdasági Kiadó, 303 p. VANITTANAKOM N., LOEFFLER W., KOCH U., JUNG G. (1986): Fengycin – a novel antifungal lipopeptide antibiotic produced by Bacillus subtilis F-29-3. Journal of Antibiotics, 39 (7): 888-901. p. VÁRADY GY. (2001): Környezeti stresszekkel szemben toleráns Rhizobium és Pseudomonas törzsek ökofiziológiai szelekciója. Doktori értekezés. GödöllĘ: Szent István Egyetem, 124 p. VARGHA M., OLDAL B., KÖDÖBÖCZ L., JEVCSÁK I., ROMÁN F., KECSKÉS M.L., NAÁR Z., BAYOUMI HAMUDA H.E.A.F., BIRÓ B., KECSKÉS M. (2001): Characteristic bacterial forms of Upper Tisza in river water, soils of banks and flood area. Scientific Bulletin of Uzhgorod National University. Series: Biology. Bookshelf of Carpathian Land, 9 (127): 176-179. p. VASYUK L.F. POPOVA T.A., TCHEBOTAR V.K., KALTCHITSKY A.E., IVANOV N.S. (1990): Associative diazotrophs: ecology, identification and interaction with non-leguminous plants. 385386. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil Biology nad the Conservation of the Biosphere. Proceedings of the 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, August 27-31 1989. Agrokémia és Talajtan, 39 (3-4): 606 p. VIVAS A. (2004): Fitoremediációs lehetĘségek Ni-toleráns mikorrhiza-baktérium növényoltással. 76-87. p. In: SZILÁGYI M., SIMON L. (Szerk.:): Mikroelemek a víz–üledék–mikroba–talaj– levegĘ–növény rendszerben c. konferencia közleményei. Nyíregyháza: Bessenyei György Középiskola, 473 p. VOISARD C., KEEL C., HAAS D., DÉFAGO G. (1989): Cyanide production by Pseudomonas fluorescens helps suppress black root rot of tobacco under gnotobiotic conditions. The EMBO Journal, 8 (2): 351-358. p. VOZNYAKOVSZKAJA J.M., TRUFANOVA A.K. (1988): Interaction between Helminthosporium sativum, patogen of root rot of crops, and saprophytic soil bacteria. Mikologija i Fitopatologija, 22 (2): 151-161. p. VÖRÖS I., SZEGI J. (1990): Investigation of the effects of Azotobacter inoculation during the recultivation of mining spoils. 391-394. p. In: SZEGI J. (Szerk.): Soil Biology nad the Conservation of the Biosphere. Proceedings of the 10th International Symposium on Soil Biology, Keszthely, August 27-31 1989. Agrokémia és Talajtan, 39 (3-4): 606 p. WALKER D. (1989): Diversity and stability. 115-145. p. In: CHERRETT J.M. (Szerk.): Ecological Concepts. Oxford: Blackwell, 252 p. WARDLE D.A., GILLER K.E. (1996): The quest for a contemporary ecological dimension to soil biology. Soil Biology and Biochemistry, 28 (12): 1549-1554. p.

xviii


WATANABE I., BARRAQUIO W.L. (1979): Low levels of fixed nitrogen required for isolation of free-living N2-fixing organisms from rice roots. Nature, 277 (5697): 565-566. p. WATANABE I., FURUSAKA C. (1981): Microbial ecology of flooded rice soils. 125-168. p. In: ALEXANDER M. (Szerk.): Advances in microbial ecology, 4. New York (NY): Plenum, 511 p. DE WEGER L.A., VAN BOXTEL R., VAN DER BURG B., GRUTERS R.A., GEELS F.P., SCHIPPERS B., LUGTENBERG B. (1986): Siderophores and outer membrane proteins of antagonistic, plant-growth-stimulating, root-colonizing Pseudomonas spp. Journal of Bacteriology, 165 (2): 585-594. p. WEIGHTMAN A.J., SLATER J.H. (1988): The problem of xenobiotics and recalcitrance. 322-347. p. In: LYNCH, J.M., HOBBIE, J.E. (Szerk.): Micro-organisms in action: concepts and application in microbial ecology. [Második, átdolgozott kiadás.] Oxford, London, etc.: Blackwell Scientific Publications, 363 p. WELLER D.M., COOK R.J. (1983): Suppression of take-all of wheat by seed treatments with fluorescent pseudomonads. Phytopathology, 73 (5): 463-469. p. WENDENBAUM S., DEMANGE P., DELL A., MEYER J.M., ABDALLAH M.A. (1983): The structure of pyoverdine Pa, the siderophore of Pseudomonas aeruginosa. Tetrahedron Letters, 24 (44): 4877-4880. p. WHITE D. C. (1995): Chemical ecology: possible linkage between macro- and microbial ecology. Oikos, 74: 177-184. p. WOLF E.C. (1987): Hogyan növelhetĘ a mezĘgazdaság termelékenysége? 199-223. p. In: BROWN L.R., CHANDLER W.U., FLAVIN C., JACOBSON J., POLLOCK C., POSTEL S., STARKE L., WOLF E.C. (Szerk.): A világ helyzete 1987/88-ban. Adatok bolygónk jövĘjérĘl. A washingtoni Worldwatch Institute jelentése. [New York (NY): W. W. Norton and Company.] (The State of the World) [Fordította: FOLTÁNYI ZS., LISKA E., PERJÉS E., VÁNCZA ZS.] Budapest: Árkádia, 275 p. WONG P.T.W., BAKER R. (1984): Suppression of wheat take-all and ophiobolus patch by fluorescent pseudomonas from a fusarium-suppressive soil. Soil Biology and Biochemistry, 16 (4): 397-403. p. YAMADA S., TAKAYAMA Y., YOMANAKA M., KO K., YAMAGUCHI I. (1990): Biological activity of antifungal substances produced by Bacillus subtilis. Journal of Pesticide Science, 15 (1): 95-96. p. YANG C.C., LEONG J. (1984): Structure of pseudobactin 7SR1, a siderophore from a plantdeleterious Pseudomonas. Biochemistry, 23 (15): 3534-3540. p. YANG Z.Z. (1990): Screening of Bacillus subtilis strain PRS5 and tests of its antifungal activities to Rhizoctonia solani. Forest Pest and Disease, 2 (1): 15-16. p. YORK E.T.: (1989): Research for a sustainable Agriculture. American Society of Agronomy Special Publications, 46: 61-68. p. YOSHIKAWA K., ADACHI K., NISHIJIMA M., TAKADERA T., TAMAKI S., HARADA K., MOCHIDA K., SANO H. (2000): ß-Cyanoalanine production by marine bacteria on cyanide-free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacteria. Applied and Environmental Microbiology, 66 (2): 718-722. p. ZHANG X.J., LIU H.L., PAN X.M., PENG G.Q., WANG J.S. (1995): Conditions on antagonistic substance production of Bacillus subtilis B3 used for biocontrol of sharp eyespot of wheat. Journal of Nanjing Agricultural University, 18 (1): 26-30. p.

M2. Az adatfeldolgozás eredményei

xix

M2. AZ ADATFELDOLGOZÁS EREDMÉNYEI 18. táblázat A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek fehér mustár csíranövényekre kifejtett közvetlen növekedés-serkentĘ hatása LevélátmérĘ (mm), ismétlések átlaga Kontroll Kezelt 11 7,4 11 7,8 11 7,9 11 7,9 11 8,2 11 8,5 11 8,6 11 8,9 9,3 11 9,7 11 11 9,9 11 10,3 11 10,5 11 10,7 11 10,9 11 11,1 11 11,5 11 11,7 11 11,9 11 12,0 11 12,0 11 12,3 11 12,8 11 13,2

Törzskód W.32 W.52 W.27/2 W.34/2 W.37 W.57 W.51 W.29 W.30/2 W.39 W.43 W.33 W.27 W.39/2 W.44 W.34 W.49 W.13 W.50 W.42 W.12 W.60 W.29/2 W.35

19. táblázat A 18. táblázatban feltüntetett értékek egytényezĘs variancia-analízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok Kontroll LevélátmérĘ (mm) ismétlések átlaga

Darabszám 24 24

Összeg 264

11

Átlag

Variancia 0

245

10,208

3,113

Variancia-analízis TényezĘk Csoportok között Csoporton belül

SS

Összesen

df

MS

7,521

1

7,521

71,598

46

1,556

79,119

47

F 4,832

p-érték

F krit.

SzD

0,033

4,052

0,700

xx


20. táblázat A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek Ashby-féle nitrogénmentes agaron történt tenyésztésének, valamint az acetilénredukciós aktivitás (ARA) vizsgálatának eredménye. 0: nincs látható szaporodás, 1: az átlátszó zóna mérete 1–3 mm, 2: 4–6 mm, 3: 6 mm-nél több. Törzskód W.29 W.52 W.27/2 W.49 W.44 W.43 W.32 W.34/2 W.50 W.30/2 W.57 W.37 W.39 W.39/2 W.42 W.29/2 W.33 W.34 W.13 W.51 W.60 W.12 W.27

Szaporodás értékszáma Ashby-féle táptalajon 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3

Etilén (nM teny.-1 h-1) 10,769 13,884 17,570 19,391 21,764 24,457 25,812 27,295 30,083 30,803 31,469 31,673 38,440 50,068 53,876 55,225 61,377 62,099 64,430 66,681 74,718 87,601 104,116

21. táblázat Regressziós statisztika a fiziológiai teszt (nitrogénmentes táptalajon történĘ tenyésztés) és az ARA vizsgálat eredményei között. P = 95%. R értéke R2 Korrigált R2 Standard hiba Megfigyelések

0,887 0,788 0,777 11,808 23

Variancia-analízis: df 1 21 22

Regresszió Maradék Összesen

SS 10858,525 2928,100 13786,625

MS 10858,525 139,433

F 77,876

F szignifikanciája 1,64963E-08

22. táblázat A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek acetilén-redukciós aktivitásának egytényezĘs variancia-analízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok Kontroll Etilén (nM teny.-1 h-1)

Darabszám 23 23

Összeg 0 1003,601

Átlag 0 43,635

Variancia 0 626,665


xxi

22. táblázat, folytatás. Variancia-analízis TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

21895,995

1

21895,995

13786,624

44

313,332

35682,619

45

F

p-érték

69,881

1,236E-10

F krit.

SzD

4,062

10,440

23. táblázat A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek acetilén-redukciós aktivitásának egytényezĘs variancia-analízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 99%. Összesítés Csoportok Kontroll Etilén (nM teny.-1 h-1)

Darabszám 23

Összeg 0

23

Átlag 0

1003,601

Variancia 0

43,635

626,665

Variancia-analízis TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

21895,995

1

21895,995

13786,624

44

313,332

35682,619

45

F 69,881

p-érték 1,236E-10

F krit.

SzD

7,248

13,880

24. táblázat A FelsĘ-Tisza partjának és árterének talajából, valamint vizébĘl, illetve a Westsik-féle vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek búza csíranövényekre kifejtett növekedésserkentĘ hatása 100 mg l-1 indolecetsavval (auxin) szemben, a kontroll arányában kifejezve [kezelt × kontroll-1]. Eredeti mértékegységek: gyökérmennyiség – [db], tömeg – [g], hossz – [mm].

Törzskód

Gyökér

Hajtás

menny.

tömege

hossza

tömege

I.110

0,56

0,71

2,05

1,72

I.401

0,56

1,27

0,90

1,08

II.108

0,50

1,57

1,10

1,29

II.109

0,94

1,16

1,07

1,04

II.407

0,63

0,94

1,17

0,99

III.103

0,56

1,35

0,89

0,94

III.118

0,38

0,53

1,54

1,11

III.119

1,25

0,82

1,65

1,33

V.104

0,50

1,49

0,77

0,97

VI.87

0,50

1,31

0,95

1,07

VI.233

1,00

0,78

0,85

0,67

VI.404

1,50

1,16

0,73

1,07

VI.405

0,56

1,35

1,00

1,17

VII.101

0,81

1,10

0,57

0,44

VIII.97

0,88

1,41

0,79

0,98

VIII.102

0,63

1,43

0,96

1,00

VIII.120

0,50

1,29

0,66

0,77

A.66

0,69

1,04

0,89

0,61

A89

0,81

1,53

0,94

0,95

A92

0,47

1,12

0,83

0,94

A93

0,56

1,41

0,94

1,03

xxii

Rizoszféra baktériumok… 24. tábl. folyt. Gyök. menny.

Gyök. tömeg

Hajtáshossz

Hajtástömeg

A.94

1,00

1,39

0,70

0,88

B.83

0,50

0,63

3,82

2,22

C.69

1,00

0,98

1,66

1,34

C.107

0,56

1,43

1,09

1,23

Törzskód

C.115

0,56

0,92

1,25

1,60

C.116

0,69

1,65

0,95

1,07

D.94

0,63

1,73

0,99

1,22

D.106

1,00

1,63

1,04

0,92

D.111

1,00

1,37

1,68

1,54

W.1

1,25

1,35

1,47

1,67

W.7

1,63

1,71

2,59

2,35

W.9

0,81

0,86

1,16

0,77

W.10

1,31

1,00

0,27

0,38

W.14

1,19

1,16

0,75

0,74

W.13

0,75

0,67

0,79

0,79

W.15

0,81

1,33

0,19

0,21

W.18

0,38

0,25

0,82

0,61

W.21

0,75

0,90

0,62

0,66

W.20

0,69

0,98

0,62

0,38

W.28

1,25

1,00

0,53

0,93

W.30

1,31

2,80

1,25

2,26

W.31

1,69

2,41

1,21

1,15 0,63

W.32

1,06

1,18

0,59

W.34

1,31

2,22

1,11

1,29

W.35

1,75

2,41

3,33

2,71

W.36

1,31

0,75

2,15

1,30

25. táblázat A 24. táblázatban szereplĘ értékek kéttényezĘs, ismétlések nélküli variancia-analízise. P = 95%. TényezĘk Törzsek Növ. részek Hiba

SS 27,580 3,840 24,192

df 46 3 138

Összesen

55,612

187

MS 0,600 1,280 0,175

F 3,420 7,302

p-érték 1,46971E-08 0,00014

F krit. 1,457 2,670

26. táblázat A 25. táblázatban jelölt tényezĘk – baktériumtörzsek és növényi részek – közötti szignifikáns differencia (SzD) kiszámítása. P = 95%. K%: a kontroll százalékában kifejezve. Növényi részek TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

3,840

3

1,280

51,772

184

0,281

55,612

187

F 4,549

p-érték

F krit.

SzD K%

0,004

2,654

21,88%

Baktériumtörzsek TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

F

p-érték

F krit.

SzD K%

27,580

46

0,600

3,016

3,213E-07

1,455

61,80%

28,032

141

0,199

55,612

187


xxiii

27. táblázat A FelsĘ-Tisza partjának és árterének talajából, valamint vizébĘl, illetve a Westsik-féle vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumtörzsek búza csíranövényekre kifejtett növekedésserkentĘ hatása 100 mg l-1 gibberellinnel (GS3) szemben, a kontroll arányában kifejezve [kezelt × kontroll-1]. Eredeti mértékegységek: gyökérmennyiség – [db], tömeg – [g], hossz – [mm].

Törzskód

Gyökér

Hajtás

menny.

tömege

hossza

I.110

0,60

0,56

2,28

tömege 1,79

I.401

0,60

1,02

1,00

1,13

II.108

0,53

1,25

1,22

1,35

II.109

1,00

0,92

1,19

1,09

II.407

0,67

0,75

1,30

1,03

III.103

0,60

1,08

0,99

0,98

III.118

0,40

0,42

1,71

1,16

III.119

1,33

0,66

1,83

1,39

V.104

0,53

1,19

0,85

1,01

VI.87

0,53

1,05

1,06

1,12

VI.233

1,07

0,63

0,94

0,70 1,12

VI.404

1,60

0,92

0,81

VI.405

0,60

1,08

1,11

1,22

VII.101

0,87

0,88

0,63

0,46

VIII.97

0,93

1,13

0,88

1,02

VIII.102

0,67

1,14

1,07

1,04

VIII.120

0,53

1,03

0,73

0,80

A.66

0,73

0,83

0,99

0,64

A89

0,87

1,22

1,04

0,99

A92

0,50

0,89

0,93

0,98

A93

0,60

1,13

1,04

1,08

A.94

1,07

1,11

0,78

0,91

B.83

0,53

0,50

4,25

2,32

C.69

1,07

0,78

1,84

1,40

C.107

0,60

1,14

1,21

1,28

C.115

0,60

0,73

1,39

1,67

C.116

0,73

1,31

1,06

1,12

D.94

0,67

1,38

1,10

1,27

D.106

1,07

1,30

1,16

0,96

D.111

1,07

1,09

1,87

1,61

W.1

1,33

1,08

1,64

1,74

W.7

1,73

1,36

2,88

2,46

W.9

0,87

0,69

1,29

0,80

W.10

1,40

0,80

0,30

0,39

W.14

1,27

0,92

0,83

0,77

W.13

0,80

0,53

0,88

0,83

W.15

0,87

1,06

0,21

0,22

W.18

0,40

0,20

0,91

0,64

W.21

0,80

0,72

0,69

0,68

W.20

0,73

0,78

0,69

0,39

W.28

1,33

0,80

0,58

0,97

W.30

1,40

2,23

1,39

2,36

W.31

1,80

1,92

1,35

1,20

W.32

1,13

0,94

0,65

0,65

W.34

1,40

1,77

1,24

1,35

W.35

1,87

1,92

3,71

2,83

W.36

1,40

0,59

2,39

1,36

xxiv


28. táblázat A 27. táblázatban szereplĘ értékek kéttényezĘs, ismétlések nélküli variancia-analízise. P = 95%. TényezĘk Törzsek Növ. részek Hiba

SS 29,132 3,310 25,718

46 3 138

Összesen

58,160

187

df

MS 0,633 1,104 0,186

F 3,398 5,922

p-érték 1,75E-08 0,00079

F krit. 1,457 2,670

29. táblázat A 28. táblázatban jelölt tényezĘk – baktériumtörzsek és növényi részek – közötti szignifikáns differencia (SzD) kiszámítása. P = 95%. K%: a kontroll százalékában kifejezve. Növényi részek TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

F 3,702

3,310

3

1,104

54,850

184

0,298

58,160

187

p-érték

F krit.

0,013

SzD K%

2,654

22,07%

Baktériumtörzsek TényezĘk Csoportok között Csoporton belül Összesen

SS

df

MS

F

p-érték

F krit.

SzD K%

29,132

46

0,633

3,076

1,98E-07

1,455

62,88%

29,028

141

0,206

58,160

187

30. táblázat A FelsĘ-Tisza partjának és árterének talajából, valamint vizébĘl különbözĘ mintavételi helyekrĘl izolált reprezentatív baktériumtörzsek cinkkel, cianiddal rézzel és ólommal szembeni tĦrĘképessége a legnagyobb tolerált koncentrációkkal kifejezve (mg l-1). Mintavételi helyek

Tivadar

Balsa

Törzskódok

Aranyosapáti

CN

Cu

Pb

B 12

5

50

50

100

B 83

1

100

100

100

II 407

10

10

200

100

III 24

50

100

200

50

B 136

300

50

5

50

B 305

1

50

300

200

C 157

5

100

100

200

C 69

10

100

100

200

C 59

10

100

300

10

C 25

50

50

300

100

C 115

Záhony

Ágensek Zn

5

100

300

200

VII 300

100

50

100

100

VII 101

5

1

300

100

10

50

300

100

D 80

5

200

200

100

D 285

5

50

100

600

D 11

1

100

200

600

A 211

1

10

100

100

D 65

M2. Az adatfeldolgozás eredményei 30. tábl. folyt.

Aranyosapáti

xxv

Törzskód

Zn

CN

Cu

Pb

A 308

10

50

100

200

IV 313

5

100

300

100

A 106

5

200

300

50

A 217

10

100

300

200

I 302

5

1

100

600

A 14

5

100

50

600

A 212

5

100

200

450

31. táblázat A 30. táblázatban feltüntetett értékekbĘl számított egytényezĘs variancia-analízis és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok Zn CN Cu Pb

Darabszám 25 25 25 25

Összeg 619 1922 4605 5210

Átlag 24,76 76,88 184,20 208,40

Variancia 3773,023 2601,610 10282,667 37680,667


SS

df

MS

F

570387,44

3

190129,147

1304111,20

96

13584,491

1874498,64

99

13,996

p-érték

F krit.

1,215E-07

2,699

SzD 163,182

32. táblázat A Westsik-féle vetésforgóból, valamint a FelsĘ-Tisza partjának és árterének talajából, illetve vizébĘl, különbözĘ mintavételi helyekrĘl izolált, hét szelektált baktériumtörzs szaporodása tíz nehézfém-vegyület eltérĘ koncentrációi mellett, a kontroll százalékában kifejezve. Az egytényezĘs variancia-analízisek eredményei és a szignifikáns differenciák (SzD). P = 95%.

Összesítés – ammónium-molibdenát Csoportok 50 100 200 400 800 1600

Darabszám 7 7 7 7 7 7

Variancia-analízis TényezĘk SS Csoportok 70079,430 között Csoporton 5758,907 belül Összesen

75838,340

Összeg 726,259 716,141 728,114 684,339 195,458 36,179 df

MS

5

14015,890

36

159,970

41

Átlag 103,751 102,306 104,016 97,763 27,923 5,168 F 87,616

Variancia 81,166 78,989 80,244 72,081 615,267 32,071 p-érték 4,0032E-19

F krit. 2,477

SzD 13,660

xxvi


Összesítés – CuSO4 Csoportok 50 100 200 400 800 1600



22351,300

Összeg 708,526 701,674 660,189 690,149 609,517 351,796 df

MS

5

2659,615

36

251,479

Átlag 101,218 100,239 94,313 98,593 87,074 50,257 F 10,576


F krit.

SzD

2,477

17,130

F krit.

SzD

2,477

8,090

F krit.

SzD

2,477

20,310

41

Összesítés – ZnCl2 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 681,194 671,011 667,868 612,238 539,017 141,474

Átlag 97,313 95,859 95,410 87,463 77,002 20,211

Variancia 11,077 17,256 17,121 51,459 105,820 133,889


SS

Összesen

df

MS

30944,110

5

6188,821

2019,731

36

56,104

32963,840

41

F 110,311

p-érték 8,60137E-21

Összesítés – Cu(NO3)2 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 678,923 684,376 669,454 646,734 624,688 453,868

Átlag 96,989 97,768 95,636 92,390 89,241 64,838

Variancia 94,168 161,259 127,359 223,084 253,390 1261,644


SS

df

MS

5451,019

5

1090,204

12725,420

36

353,484

18176,440

41

F 3,084

p-érték 0,020


xxvii

Összesítés – Zn(NO3)2 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Variancia-analízis TényezĘk SS Csoportok között 8880,569 Csoporton 11165,360 belül Összesen

Összeg 756,092 716,423 701,843 699,320 648,510 444,766

Átlag 108,013 102,346 100,263 99,903 92,644 63,538

Variancia 111,482 19,478 30,650 229,096 535,836 934,350

df

MS

F

p-érték

F krit.

SzD

5

1776,114

5,727

0,00055

2,477

19,02

36

310,149

F krit.

SzD

20045,930

41

Összesítés – CuCl2 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 716,187 702,706 702,121 730,928 614,950 339,767

Átlag 102,312 100,387 100,303 104,418 87,850 48,538

Variancia 39,523 14,283 100,257 36,044 254,660 1090,250


SS

df

MS

F 12,558

16063,662

5

3212,732

9210,098

36

255,836

25273,760

41

p-érték 4,32386E-07

2,477

17,28

Összesítés – Pb(NO3)2 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 746,815 752,814 736,400 711,408 687,157 141,474

Átlag 106,688 107,545 105,200 101,630 98,165 20,211

Variancia 113,943 195,123 154,104 269,931 306,602 133,889


SS

df

MS

6595,733

5

1319,147

15397,760

36

427,715

21993,490

41

F 3,084

p-érték

F krit.

SzD

0,020

2,477

22,34

xxviii


Összesítés – FeIISO4 Csoportok 50 100 200 400 800 1600



32185,880

Összeg 850,231 842,009 792,227 828,179 731,421 422,155 df

Átlag 121,462 120,287 113,175 118,311 104,489 60,308

MS

F

5

3829,845

10,576

36

362,129


F krit. 2,477

SzD 20,560

41

Összesítés – FeIIICl3 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 982,920 931,350 912,396 909,115 843,063 578,195

Átlag 140,417 133,050 130,342 129,874 120,438 82,599

Variancia 188,405 32,918 51,799 387,173 905,562 1579,053


SS

df

MS

15008,160

5

3001,632

18869,450

36

524,152

33877,620

41

F 5,727

p-érték

F krit.

SzD

0,00055

2,477

24,730

F krit.

SzD

2,477

22,460

Összesítés – FeIII(NO3)3 Csoportok 50 100 200 400 800 1600


Összeg 931,044 913,518 912,757 950,206 799,436 441,697

Átlag 133,006 130,503 130,394 135,744 114,205 63,100

Variancia 66,794 24,137 169,434 60,914 430,375 1842,523


SS

df

MS

F 12,558

27147,590

5

5429,518

15565,070

36

432,363

42712,660

41

p-érték 4,3239E-07


xxix

33. táblázat A szelektált baktériumtörzsekkel végzett magoltás hatása a fehérvirágú csillagfürt növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GH: fĘgyökér hossza, GS: oldalgyökerek száma, GT: gyökér tömege, HH: hajtás hossza, HS: hajtáselágazások száma, HT: hajtás tömege. Törzskódok

GH

GS

GT

HH

HS

W.32

180

100

650

90

100

HT 137

C.69

149

100

625

139

100

152

B.83

237

100

625

156

100

135

A.106

200

100

433

136

100

119

W.10

326

100

325

88

100

145

W.7

233

100

320

206

100

154

W.34

143

100

313

109

100

338

D.111

176

100

278

150

100

154

W.37

88

100

271

134

100

148

W.1

212

100

250

104

100

157

W.30

90

100

238

116

100

132

34. táblázat A 33. táblázatban feltüntetett értékek egytényezĘs variancia-analízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok GH GS GT HH HS HT

Darabszám 11 11 11 11 11 11

Összeg 2034,095 1100,000 4327,540 1428,453 1100,000 1769,996

Átlag 184,918 100,000 393,413 129,859 100,000 160,909

Variancia 4766,382 0,000 26444,018 1159,593 0,000 3566,169


SS

Összesen

df

MS

F 22,490

673507,078

5

134701,415

359361,613

60

5989,360

1032868,691

65

p-érték 1,247E-12

F krit.

SzD

2,368

65,999

35. táblázat A szelektált baktériumtörzsekkel végzett magoltás hatása a szöszös bükköny növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GH: fĘgyökér hossza, GS: oldalgyökerek száma, GT: gyökér tömege, HH: hajtás hossza, HS: hajtáselágazások száma, HT: hajtás tömege. Törzskódok

GH

GS

GT

HH

HS

HT

W.32

222

C.69

292

100

567

303

500

4900

500

1156

303

500

B.83

4900

262

300

1167

164

300

2200

A.106

285

50

1700

109

250

980

W.10

292

250

1733

117

250

490

W.7

200

50

1067

116

300

240

W.34

262

150

1750

63

150

220

D.111

364

50

3733

102

50

120

W.37

254

50

1300

84

50

120

W.1

256

50

2667

137

100

100

W.30

284

50

1867

109

50

60

xxx


36. táblázat A 35. táblázatban feltüntetett értékek egytényezĘs variancia-analízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok GH GS GT HH HS HT

Darabszám 11 11 11 11 11 11

Összeg 2972,120 1600,000 18705,560 1607,441 2500,000 14330,000

Átlag 270,193 145,455 1700,505 146,131 227,273 1302,727

Variancia 1803,408 21727,270 752669,500 6695,229 27681,820 3554082,000


SS 25949902

Összesen

df

MS

F

5

5189980,000

7,135

43646590

60

727443,200

69596492

65

p-érték 2,7E-05

F krit.

SzD

2,368

727,358

37. táblázat A szelektált baktériumtörzsekkel végzett magoltás hatása a rozs növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. GS: gyökerek száma, GT: gyökerek összes tömege, HH: hajtások hossza, HS: hajtások száma, HT: hajtások összes tömege. GS

GT

HH

HS

W.37

Törzskódok

100

988

97

50

HT 150

W.32

100

350

100

200

167

D.111

100

300

325

200

125

A.106

100

250

69

200

167

W.7

100

217

127

200

200

C.69

100

214

225

200

125

W.1

100

143

450

200

225

B.83

100

143

450

200

225

W.30

100

133

96

200

200

W.34

100

113

73

150

450

W.10

100

88

27

50

200

38. táblázat A 37. táblázatban feltüntetett gyökérszám- (GS) és gyökértömeg- (GT) értékek egytényezĘs varianciaanalízise és a szignifikáns differencia (SzD). P = 95%. Összesítés Csoportok GS GT

Darabszám 11 11

Összeg 1100,000 2937,500

Átlag 100,000 267,046

Variancia 0,000 63747,964


SS 153473,011

df 1

MS 153473,011

637479,643

20

31873,982

Összesen

790952,655

21

F 4,815

p-érték 0,040

F krit. 4,351

SzD 158,800


xxxi

36. ábra FĘkomponens-analízis: a Rhizoctonia solani és Fusarium solani növényi kórokozó gombák Pseudomonas sp. baktériumokkal (A: P. aeruginosa, F: P. fluorescens-putida csoport) szembeni érzékenysége. Az összes variancia megoszlását szemléltetĘ diagram. A variancia 85%-a két komponens között oszlik meg, 61%-át egyetlen új tengely jellemzi, ezért az elemzés megfelelĘ.

37. ábra FĘkomponens-analízis: a Pseudomonas sp. baktériumtörzsek (A: P. aeruginosa, F: P. fluorescensputida csoport) eredete, sziderofor-termelése, valamint Rhizoctonia solani és Fusarium solani növénypatogén gombákkal szembeni antagonista hatása közötti összefüggés. Az összes variancia megoszlását szemléltetĘ diagram. A variancia 84%-a két komponens között oszlik meg, 69%-át egyetlen új tengely jellemzi, ezért az elemzés megfelelĘ.

M3. Ábrajegyzék

xxxiii

M3. ÁBRAJEGYZÉK 1. ábra A rizoszféra mikroorganizmusai bonyolult rendszerben befolyásolják a növény növekedését (ARSHAD és FRANKENBERGER 1998) ..............................................19 2. ábra Baktériumok vasfelvétele: a vas-sziderofor komplexek szállítása a baktériumsejt membránján keresztül – sematikus rajz.........................................................................25 3. ábra Mikroorganizmusok által termelt reprezentatív szideroforok – köztük a pszeudobaktin – szerkezete............................................................................................26 4. ábra A növényi növekedést szabályozó anyagok lehetséges szerepe a gümĘképzésben. 29 5. ábra A baktériumok behatolása a rizs aerenchymatikus gyökereibe ................................33 6. ábra A Westsik-féle vetésforgó tartamkísérlet (mĦvelt terület Nyíregyháza határában, balra) és a FelsĘ-Tisza vizsgálatba bevont – javarészt bolygatatlan – árterének (jobbra) hozzávetĘleges elhelyezkedése......................................................................................47 7. ábra Rizoszférából izolált baktériumok gazdanövényei: a) Vicia villosa ROTH, b) Lupinus albus L., c) Secale cereale L. ........................................................................................47 8. ábra A Westsik-féle talajjavító homoki vetésforgó-tartamkísérlet vázlatos alaprajza .....49 9. ábra Mintavételi helyek a FelsĘ-Tisza mentén .................................................................50 10. ábra Diszkontinuus natív PAGE gélképek a Westsik-vetésforgóból izolált baktériumtörzsek csoportosítása során ..........................................................................68 11. ábra A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált Gram-pozitív baktériumok BIOLOGTM módszer alapján csoportosítva és azonosítva ......................................................................................................................69 12. ábra A Westsik-vetésforgó bükköny, csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált Gram-negatív baktériumok BIOLOGTM módszer alapján csoportosítva és azonosítva ......................................................................................................................69 13. ábra A Westsik-vetésforgó szöszös bükköny, fehérvirágú csillagfürt és rozs növényeinek rizoszférájából izolált baktériumok megoszlása (%) ...............................70 14. ábra A FelsĘ-Tisza különbözĘ szakaszairól izolált huszonnégy jellemzĘ baktériumtörzs filogenetikus fája ...........................................................................................................74 15. ábra A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából izolált huszonnégy baktériumtörzs növényi növekedésre gyakorolt hatása fehér mustárral végzett biológiai tesztben ..........................................................76 16. ábra A Westsik-féle vetésforgó-tartamkísérlet rozs, bükköny és csillagfürt növényeinek rizoszférájából izolált huszonhárom baktériumtörzs acetilén-redukciós aktivitása ARAtesztben, a keletkezett etilén mennyiségének gázkromatográfiás mérése révén ...........82 17. ábra Westsik-vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó hatása 100 mg l-1 auxinhoz képest .............................84 18. ábra Westsik-vetésforgóból és a FelsĘ-Tisza területérĘl származó baktériumtörzsek növényi növekedést szabályozó hatása 100 mg l-1 gibberellinhez képest .....................84 19. ábra Pseudomonas aeruginosa törzsek antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben..............................................................................................86 20. ábra Pseudomonas sp. fluorescens-putida típusú törzsek antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben .......................................................................87 21. ábra Pseudomonas aeruginosa típusú törzsek antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben ..........................................................................................87

xxxiv


22. ábra Pseudomonas sp. fluorescens-putida típusú törzsek antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben................................................................................88 23. ábra Huszonhat Pseudomonas sp. törzs antagonista hatása Rhizoctonia solani ATCC 13289 gombával szemben, a gátlóképesség (kontroll %) számtani átlagával kifejezve89 24. ábra Huszonhat Pseudomonas sp. törzs antagonista hatása Fusarium solani F.00715 gombával szemben, a gátlóképesség (kontroll %) számtani átlagával kifejezve...........89 25. ábra FĘkomponens-analízis: a Rhizoctonia solani és Fusarium solani növényi kórokozó gombák Pseudomonas sp. baktériumokkal szembeni érzékenysége. KettĘs szórásdiagram.................................................................................................................90 26. ábra FĘkomponens-analízis: a Pseudomonas sp. baktériumtörzsek eredete, sziderofortermelése, valamint Rhizoctonia solani és Fusarium solani növénypatogén gombákkal szembeni antagonista hatása közötti összefüggés. KettĘs szórásdiagram.. ...................92 27. ábra Egészséges és Pseudomonas sp. W.F41 törzs hatására károsodott gombafonál (Rhizoctonia solani ATCC 13289), 24 és 36 órás tenyészet..........................................93 28. ábra Egészséges és Pseudomonas sp. W.F41 törzs hatására károsodott gombafonál (Rhizoctonia solani ATCC 13289), 48 és 72 órás tenyészet..........................................94 29. ábra A FelsĘ-Tisza mintázott szakaszairól származó huszonöt baktériumtörzs cianid- és nehézfém-toleranciája ....................................................................................................95 30. ábra Harminc baktériumtörzs hasonlósági dendrogramja tíz nehézfém-vegyülettel szembeni összesített érzékenységük szerint, a szelektált PGPR törzsek kiemelésével .97 31. ábra Hét baktériumtörzs relatív szaporodása tíz nehézfém-vegyület különbözĘ koncentrációi (μM) mellett ............................................................................................99 32. ábra Tíz nehézfém-vegyület hatása harminc baktériumtörzs szaporodására (összesített MTC; μM)....................................................................................................................101 33. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása csillagfürt növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. ............................................................103 34. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása bükköny növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve .............................................................104 35. ábra Tizenegy baktériumtörzs serkentĘ hatása rozs növekedésére axénikus kultúrában, a kontroll százalékában kifejezve. ..................................................................................105 36. ábra FĘkomponens-analízis: a Rhizoctonia solani és Fusarium solani növényi kórokozó gombák Pseudomonas sp. baktériumokkal szembeni érzékenysége. Az összes variancia megoszlását szemléltetĘ diagram............................................................................... xxxi 37. ábra FĘkomponens-analízis: a Pseudomonas sp. baktériumtörzsek eredete, sziderofortermelése, valamint Rhizoctonia solani és Fusarium solani növénypatogén gombákkal szembeni antagonista hatása közötti összefüggés. Az összes variancia megoszlását szemléltetĘ diagram. .................................................................................................. xxxi

Köszönetnyilvánítás

xxxv

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS E doktori értekezés elkészültéhez szükséges vizsgálatok a Szent István Egyetem, Környezettudományi Doktori Iskola, MezĘgazdasági-, Környezeti Mikrobiológia és Talajbiotechnológia c. tudományági részterülete keretében, az Eötvös Loránd Tudományegyetem (ELTE) Mikrobiológiai Tanszéke és az MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézet (TAKI) közremĦködésével valósulhattak meg, melyért hálás köszönetem fejezem ki. Köszönetet mondok ezért témavezetĘmnek, Prof. em. Dr. Dr. h.c. Kecskés Mihálynak (D.Sc., biol.) a téma és a kezdeti, alapvetĘ laboratóriumi háttér biztosításáért; a hazai, valamint nemzetközi szakmai kapcsolatokért; ezen felül tanáraimnak, bírálóimnak és doktorandusz társaimnak, akik támogatásával az értekezés elkészülhetett. Kiemelten is köszönetet mondok munkahelyi vezetĘimnek, Prof. Dr. habil. Németh Tamás, az MTA TAKI igazgatójának és Dr. Anton Attila Ph.D., általános igazgatóhelyettesnek, a Talajbiológiai és -biokémiai Osztály vezetĘjének a publikálás terén nyújtott segítségért és az intézményi támogatásért, mellyel doktori munkám befejezhettem; valamint Prof. Dr. Biavati Bruno és Prof. Dr. Bonaga Giorgio vendéglátóimnak a Bolognai Egyetem MezĘgazdasági és Ipari Mikrobiológiai Intézetben töltött hosszabb tanulmányút alatt a témavezetésért, szakmai és emberi segítségükért, illetve a Soros Alapítványnak, amely e tanulmányutat számomra lehetĘvé tette. Külön köszönetem fejezem ki még az itt felsorolt személyeknek és intézményeknek: Dr. habil. Biró Borbála Ph.D. – aki programunk alapító tagjaként és az intézetben is értékes szakmai tanácsokkal, irodalommal és biztatással látott el; Dr. Hosam E.A.F. Bayoumi Hamuda Ph.D. – sok gyakorlati tapasztalat átadásáért a környezeti mikrobiológia vizsgálómódszereinek területérĘl, valamint megbízható szervezĘ tevékenységéért; Dr. Márialigeti Károly Ph.D. – tanszékvezetĘnek az ELTE Mikrobiológiai Tanszékén végzett molekuláris biológiai munka lehetĘségéért, számos magas színvonalú elĘadásért a környezeti mikrobiológia területérĘl, valamint szakmai tanácsaiért; Dr. Naár Zoltán Ph.D. – jelen dolgozat témájának ajánlatáért és a kísérletek tervezése során adott értékes tanácsaiért; Dr. Szili-Kovács Tibor Ph.D. – baktériumtörzsek ARA meghatározásában nyújtott segítségért és az értekezés munkahelyi vitaanyagának alapos bírálatáért; Dr. Vargha Márta Ph.D. – baktériumtörzsek 16S rDNS módszerrel történĘ meghatározásában nyújtott segítségéért; Dr. Vörös Ibolya Ph.D. – a klímakamrában történĘ növényneveléshez adott szakmai tanácsaiért; Jevcsák István – doktorandusz társamnak a baktériumok környezeti faktorokkal szembeni érzékenysége vizsgálatában végzett közös munkáért és a rengeteg tréfáért; Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatal, Kutatás-hasznosítási Pályázati Iroda (NKTH KPI) – több Mecenatúra pályázat támogatásáért, mellyel a publikálást segítette; Országos Tudományos Kutatási Alapprogram (OTKA) – témavezetĘm több pályázatának anyagi támogatásához, mellyel munkámhoz aktívan hozzájárult. *** Végül köszönöm családom, barátaim, és mindazok ösztönzését, valamint támogatását, akik a doktori cselekmény sikeréhez valamilyen módon hozzájárulnak.

SZENT ISTVÁN EGYETEM RIZOSZFÉRA-BAKTÉRIUMOK ÉS MAGASABB REND NÖVÉNYEK INTERAKCIÓINAK ÖKOLÓGIAI ÉRTÉKELÉSE. Doktori értekezés. Oldal Bálint

Recommend Documents