Syntéza inhibitorů CHK1 kinázy na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

Syntéza inhibitorů CHK1 kinázy na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu Bakalářská práce

Ondřej Hylse

Vedoucí práce: Mgr. Kamil Paruch, PhD.

Brno 2011

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svou bakalářskou práci vypracoval samostatně a výhradně s pouţitím citovaných pramenů

Brno 11. 5. 2011 Ondřej Hylse 1

Poděkování Chtěl bych poděkovat svému vedoucímu Mgr. Kamilu Paruchovi, PhD., za cenné rady a připomínky, odborné vedení a zasvěcení do velmi zajímavé oblasti organické chemie, dále skupině MUDr. Martina Trbuška, Dr., za testy připraveného inhibitoru a Ing. Blance Vrbkové za měření hmotnostních spekter. Děkuji kolegyním a kolegům z naší skupiny: Silvii, Lukášovi, Míše, Romanovi a Štěpánovi za pomoc při práci v laboratoři a za vytvoření příjemné a přátelské atmosféry, v níţ mi byla má práce radostí. Děkuji všem, kteří mi byli nápomocni při zpracování této práce. Také bych chtěl poděkovat svojí rodině za psychickou i materiální podporu během celého mého studia.

2

OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 4 2. LITERÁRNÍ ČÁST .............................................................................................................. 6 2.1. Základní funkce a rozdělení proteinových kináz ............................................................ 6 2.2. Buněčný cyklus ............................................................................................................... 7 2.2.1 Kontrola a regulace buněčného cyklu ...................................................................... 8 2.3. CHK1 kináza................................................................................................................... 9 2.3.1. Rakovina a CHK1 kináza ...................................................................................... 10 2.4. CHK1 inhibitory ........................................................................................................... 11 2.4.1. Struktura proteinových kináz ................................................................................ 11 2.4.2. Interakce kináza-ATP/inhibitor............................................................................. 12 2.4.3. CHK1 inhibitory na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu ........................................... 13 3. VÝSLEDKY A DISKUSE ................................................................................................. 18 3.1. Identifikace látek........................................................................................................... 18 3.2. Příprava látek a jejich analýza ...................................................................................... 18 3.2.1. Příprava CHK1 inhibitoru 3 (racemický SCH 900776) ........................................ 18 3.2.2. Dělení enantiomerů látek získaných při syntéze inhibitoru 3 za pouţití HPLC s chirální stacionární fází ................................................................................................ 21 3.2.3. Příprava CHK1 inhibitoru 6c ................................................................................ 24 3.2.4. Dělení enantiomerů produktu 6c za pouţití HPLC s chirální stacionární fází ...... 25 3.2.5. Kombinatoriální Suzukiho reakce ......................................................................... 25 3.3. Biologické testy CHK1 inhibitoru 3 ............................................................................. 31 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................. 34 4.1. Pouţité přístroje a chemikálie ....................................................................................... 34 4.2. Příprava sloučenin......................................................................................................... 35 5. ZÁVĚR ................................................................................................................................ 54 6. LITERATURA ................................................................................................................... 55 7. SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................................ 58 8. PŘÍLOHA ........................................................................................................................... 61

3

1. ÚVOD Nádorová onemocnění jsou v dnešní době významným společenským i vědeckým problémem, jehoţ řešením se zabývala a zabývá řada výzkumných týmů a institucí. Metody léčení jsou četné a mechanismus účinku je různý. Myšlenka vyuţití inhibitorů proteinových kináz je relativně nová a její počátek je spojen s vývojem inhibitoru imatinibu (GleevecTM), jenţ se stal milníkem nejen v léčbě chronické myeloidní leukémie, ale i v pouţívání kinázových inhibitorů jako prostředků k cílené léčbě nádorových onemocnění vůbec.1, 2

CHK1 kináza se významně podílí na kontrole buněčného cyklu. Pokud je buněčná DNA poškozena, CHK1 přispívá k opravě buňky tím, ţe se (společně s dalšími faktory) zasadí o zastavení buněčného cyklu. Činnost CHK1 kinázy se však můţe stát neţádoucí v okamţiku, kdy začne tímto způsobem napomáhat rakovinotvorným buňkám a sniţuje efektivitu léčiv, která fungují na genotoxické bázi. Z tohoto důvodu je patrné, ţe selektivní inhibitor CHK1 kinázy by společně s takovým léčivem působil synergicky a mohl by účinnost léčby zvýšit.3 Mým cílem v této práci bylo připravit CHK1 inhibitor 3 (jehoţ S-enantiomer nese označení SCH 900776)4 na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu (Obrázek 1), popř. jeho analogy, dle procedury uvedené v literatuře (Schéma 1).5–7

Obrázek 1: Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin s číslováním pozic

4

Schéma 1: Syntéza CHK1 inhibitoru Dalším úkolem bylo připravit inhibitor 3 alternativní metodou, v níţ jsem se snaţil vyzkoušet moţnosti selektivní Suzukiho reakce. Cílem bylo provést Suzukiho reakci na dihalogenovaném pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu, přičemţ volbou vhodných chránicích skupin a reakčních podmínek jsem se pokoušel dosáhnout toho, aby reakce probíhala pouze v poloze 3 (Schéma 2). Tato metodika by byla cenná nejen díky přípravě kýţeného produktu jinou cestou, ale také proto, ţe pokud by se podařily najít optimální podmínky pro selektivitu Suzukiho reakce, dala by se následnou reakcí v poloze 6 připravit řada zajímavých příbuzných sloučenin 6 v jediném kroku.

6: R  Br, H

Schéma 2: Snaha o selektivní Suzukiho reakci (PG = chránicí skupina, z angl. „protecting group“)

5

2. LITERÁRNÍ ČÁST 2.1. Základní funkce a rozdělení proteinových kináz Proteinové kinázy (dále jen „kinázy“) jsou enzymy, které katalyzují přenos γ-fosfátové skupiny adenosintrifosfátu (ATP) na aminokyseliny různých proteinů. Obrázek 2 ilustruje příklad fosforylace proteinu na postranním zbytku aminokyseliny serinu. Tento proces fosforylace má tyto hlavní funkce: (i) podmiňuje aktivitu (nebo naopak pasivitu) proteinu při nějakém procesu, proto kinázy hrají roli molekulárních spínačů, (ii) fosfátový zbytek také můţe zprostředkovat vazbu mezi dvěma proteiny. Významnou funkci mají kinázy při přenosu informací v buňce, protoţe kaskáda na sebe navazujících fosforylací můţe vytvářet účinnou signální soustavu.2

Obrázek 2: ATP a schéma fosforylace rezidua serinu8 V současné době je známo 518 lidských kináz, které tvoří téměř 2 % genetické informace. V roce 2002 byl pro tyto sekvence našeho genomu poprvé pouţit název „kinom“ (Obrázek 3). Tato poměrně velká skupina enzymů se dělí podle několika hledisek: Podle kódující sekvence DNA na 9 skupin: TK, TKL, STE, CK1, AGC, CAMK, CMGC, RGC a Ostatní. Tyto skupiny čítají celkem 478 kináz a mnohé se dělí na tzv. rodiny a další menší jednotky. Zbývajících 40 enzymů tvoří tzv. atypickou skupinu kináz, jejichţ sekvence je značně odlišná od všech ostatních.9

6

Dle specifity vazby na cílové aminokyseliny se rozlišují serin/threonin specifické kinázy (které katalyzují fosforylaci OH skupiny serinu nebo threoninu), tyrosin specifické kinázy (katalyzující fosforylaci OH skupiny tyrosinu), a nespecifické kinázy (jejich katalytické účinky vedou k fosforylaci OH skupin všech tří výše zmíněných aminokyselin).2

Obrázek 3: Lidský kinom9

2.2. Buněčný cyklus Dělení je jedna z fundamentálních charakteristik buněk všech ţivých organismů, kdy mateřská buňka dá vzniknout dvěma dceřiným. Opakovanými cykly růstu a dělení se pak

7

můţe z jediného oplodněného vajíčka vyvinout organismus tak sloţitý, jako je lidské tělo tvořené mnoţstvím buněk, které přesahuje řádově 1013.10 Období od jednoho dělení buňky k druhému se nazývá buněčný cyklus. U eukaryotických buněk se skládá ze dvou základních částí: mitóza a interfáze. Interfáze, během níţ buňka roste, představuje převáţnou část buněčného cyklu a je tvořena třemi fázemi: Při G1 fázi je buňka metabolicky aktivní a připravuje se na zdvojení DNA syntézou potřebných enzymů, nukleotidů a dalších sloučenin. Replikace DNA probíhá při následující S fázi buněčného cyklu. Po něm buňka vstupuje do G2 fáze, která předchází mitóze. Mitóza je samotný proces dělení jádra zakončený cytokinezí, coţ je fyzické rozdělení na dvě dceřiné buňky.10, 11 2.2.1 Kontrola a regulace buněčného cyklu Průběh buněčného cyklu je velmi pečlivě kontrolován. Pokud dojde k poruše, má buňka mechanismy, jak zastavit svůj cyklus do doby, neţ budou chyby napraveny. Většina buněk projde ve svém buněčném cyklu třemi tzv. kontrolními body, které jsou výstupem sofistikovaného signálního systému. Jestliţe se buňka stane z nějakého důvodu nezpůsobilou k pokračování v cyklu, vyšle se signál k příslušnému kontrolnímu bodu. V momentě, kdy buněčný cyklus dospěje do tohoto bodu, je celý cyklus zastaven, a to aţ do chvíle, neţ je porucha odstraněna. Typickým příkladem takové závady je nepřesně replikovaná DNA. Poté, co je nedostatek rozpoznán, je informován kontrolní bod, který předchází mitóze. Cyklus je pak v tomto bodě zastaven a buňka nezapočne dělicí proceduru, dokud není zajištěno, ţe obě dceřiné buňky získají kompletní a přesnou genetickou výbavu. 8, 10, 12 Kontrolní bod G1 zastaví cyklus, jestliţe dostane informaci, ţe prostředí není vhodné pro replikaci DNA nebo je DNA poškozena. Nezřídka se stane, ţe buňka zde sice nedostane pokyn k zastavení buněčného cyklu, ale přejde do klidové fáze označované G0, ve které vyčkává na pokyn pro zahájení replikace. Přijde-li takový signál, vrací se buňka do kontrolního bodu G1 a následně vstupuje do S fáze.10 Kdyţ buňka absolvuje S fázi, pak ji na konci interfáze čeká kontrolní bod G2. Zde se ověřuje, jestli replikace DNA proběhla bezchybně a zcela a zda nedošlo k jejímu poškození. Kontrolní bod M před samotným dělením buňky zastaví buněčný cyklus v případě, ţe chromozomy nejsou správně navázány na dělící vřeténko (Obrázek 4).13

8

Obrázek 4: Buněčný cyklus s kontrolními body10

2.3. CHK1 kináza Významnou úlohu v signálním systému kontrolních bodů mají proteinové kinázy, mezi něţ patří i CHK1 (z angl. „checkpoint kinase 1“). Při poškození DNA se přímo podílí na zastavení buněčného cyklu. Bylo však zjištěno, ţe CHK1 je patrně nedílnou součástí buněčného cyklu i v případě, ţe je DNA zcela v pořádku,14 čemuţ by mohl nasvědčovat i fakt, ţe například myši postrádající CHK1 umírají jiţ brzy během zárodečného vývoje. 15 Signální soustava kontrolních bodů je poměrně sloţitá a rozsáhlá. Obrázek 5 ukazuje tu část, která zahrnuje působení CHK1 kinázy. Dojde-li k poškození DNA, je toto rozpoznáno kinázou ATM (z angl. „ataxia telangiectasia-mutated“; Ataxia telangiectasia je komplexní syndrom způsobený mutací genu kódujícího ATM kinázu16) nebo ATR (z angl. „ataxia telangiectasia and Rad3-related protein“), které fosforylují CHK1 buď přímo (v případě ATR), anebo nepřímo (v případě ATM). Takto aktivovaná kináza CHK1 postoupí signál fosforylací fosfatázy CDC25C (z angl. „Cell division cycle 25“), čímţ ji degraduje (fosfatáza je enzym katalyzující defosforylaci13). CDC25C poté nemůţe aktivovat komplex kinázy CDK1 (z angl. „cyclin-dependent kinase 1“) s proteinem cyklinem B. Tento komplex je nezbytný pro postup buněčného cyklu ve fázi G2. Kvůli jeho deaktivaci není cyklus schopen pokračovat ve svém průběhu a je zastaven v kontrolním bodě G2 před vstupem do mitózy. Tento mechanismus se ukázal být pouze jedním z několika, jak CHK1 napomáhá zastavení buněčného cyklu.8, 17, 18

9

Obrázek 5: Část signálního systému zahrnující činnost CHK1 kinázy 2.3.1. Rakovina a CHK1 kináza Jako rakovina se označuje skupina onemocnění, která jsou mimo jiné charakteristická nekontrolovatelným mnoţením buněk, které se nazývají rakovinotvorné, a tvorbou nádoru, popřípadě metastází. Léčba takové choroby spočívá v odstranění nádoru a všech rakovinotvorných buněk. K tomuto účelu se pouţívá řada metod, od chirurgického zákroku, přes radioterapii aţ k chemoterapii a dalším.2 Jednou z moţností je vyuţití genotoxických látek, tj. látek, které naruší DNA rakovinné buňky natolik, ţe ta posléze umírá. Jak bylo řečeno výše, buňka má poměrně sofistikovaný kontrolní systém, jenţ jí pomáhá při nápravě poškození DNA, coţ je v tomto případě neţádoucí jev. Efektivita léčby je poté značně limitována, jelikoţ se buňka dokáţe (částečně) bránit. Jít cestou zvyšování dávky genotoxického léčiva nelze, protoţe nesmíme zapomenout, ţe běţně pouţívaná cytostatika nejsou zcela selektivní a příliš bychom ohrozili

10

zdravé buňky. Je moţné, ţe pokud bychom dokázali tento kontrolní systém vyřadit z činnosti, mohla by účinnost léčby vzrůst.19, 20 K tomu se ukázala být vhodná CHK1 kináza. Její inhibice způsobí, ţe při pouţití DNA-poškozujícího agens nedojde k zastavení cyklu v kontrolním bodě G2 a buňka kvůli způsobenému genetickému poškození umírá. Tento synergický efekt byl pozorován například na buňkách nazofaryngeálního karcinomu (karcinom nosohltanu), kdy po aplikaci CHK1 inhibitoru s označením Gö6976 došlo ke zvýšení citlivosti nádorových buněk vůči cisplatině i radioterapii in vitro i in vivo a buňky následně odumřely.21 Z povahy působení CHK1 kinázy vyplývá, ţe při léčbě by její inhibitor většinou potencoval účinky genotoxických látek a podílel se na zvýšení její efektivity. Je však znám i případ, kdy CHK1 inhibitor samotný dával při testech nadějné výsledky.22 Pochopitelně se nabízí otázka, co udělá inhibice CHK1 kinázy se zdravými buňkami? Jak bylo zmíněno výše, činnost CHK1 je pravděpodobně esenciální i při normálně probíhajícím buněčném cyklu.14 Nedávné studie ale ukazují, ţe vhodně načasovaná inhibice CHK1 kinázy je více toxická pro nádorové buňky neţ pro ty zdravé, které při poškození DNA mohou vyuţít zastavení cyklu nejen v kontrolním bodě G2, ale i G1. Na zablokování cyklu v kontrolním bodě G1 se však podílí protein p53, jenţ je vyřazen z činnosti u většiny druhů nádorových buněk. Ty se tím pádem mohou spolehnout pouze na kontrolní bod G2, jehoţ aktivitu inhibicí CHK1 vyřadíme téţ.23,

24

To vše dělá z inhibitorů CHK1 kinázy zajímavý

předmět pro další výzkum.

2.4. CHK1 inhibitory 2.4.1. Struktura proteinových kináz Proteinové kinázy jsou tvořeny dvěma subdoménami nebo také laloky. N-koncový lalok obsahuje převáţně β-skládané listy a alespoň jeden α-helix. C-koncový lalok je větší, variabilní v sekvenci i topologii a většinou α-helikální. Obě subdomény spojuje krátký polypeptidový řetězec, nazývaný hinge region (výstiţný český ekvivalent pojmu „hinge“ není znám), který tvoří kavitu mezi oběma subdoménami a je klíčový pro katalytické působení kinázy, jelikoţ je významnou částí aktivního místa, kam se váţe ATP nebo inhibitor (Obrázek 6).8, 25

11

Obrázek 6: Typická struktura kinázy (PDB kód: 1IR3) s vyznačeným N-koncovým lalokem (modrý), C-koncovým lalokem (zelený), hinge regionem (červený) a molekulou ATP (ţlutá); kináza je zobrazená v reţimu „cartoon“ (vlevo) a „surface“ (vpravo) 2.4.2. Interakce kináza-ATP/inhibitor Ve většině případů jsou klíčovou interakcí mezi ATP a kinázou vodíkové vazby mezi adeninem a polárními zbytky hinge regionu (Obrázek 7) doplněné o interakce dalších částí molekuly

ATP

s aminokyselinovými

zbytky

kinázy.8

Při

návrhu

struktury

ATP-kompetitivního inhibitoru je proto potřeba uváţit, jaké interakce můţe s aktivním místem kinázy vytvářet. Obecně platí, ţe čím je vazba inhibitoru na kinázu silnější, tím lépe.

Obrázek 7: Dvě vodíkové interakce adeninového zbytku molekuly ATP s hinge regionem kinázy (PDB kód: 1IR3) 12

Obrázek 8: ATP-kompetitivní inhibitor 7 v aktivním místě CHK1 kinázy (PDB kód: 3PA3) Pokud jde o CHK1 inhibitory, z literatury je známo několik strukturních motivů. Jedná se například o inhibitory na bázi thienopyridazinu (7)26 (Obrázek 8), triazolonu (8)27, imidazo[1,2-a]pyrazinu (9)28, 2-ureidothiofenu (10)29, pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu5,

6

a další.

Obrázek 9 ukazuje jiţ testované inhibitory s hodnotami IC50 pro kinázu CHK1. IC50 je koncentrace inhibitoru, při níţ je inhibováno 50 % enzymu. 2.4.3. CHK1 inhibitory na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu Motivací pro přípravu CHK1 inhibitorů na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu byl fakt, ţe dříve připravené inhibitory CDK2 s pyrazolo[1,5-a]pyrimidinovým jádrem vykazovaly poměrně dobrou aktivitu i vůči CHK1 kináze. To dávalo důvod domnívat se, ţe vhodně zvolené substituenty kolem jádra by mohly zvýšit aktivitu i selektivitu směrem k CHK1. Selektivita je zde obzvláště důleţitá, jelikoţ inhibice CDK2 kinázy by byla kontraproduktivní. CDK2 totiţ podobně jako CDK1 (viz Obrázek 5) působí jako aktivátor buněčného cyklu. Její inhibice by proto cyklus zastavila, coţ je přesný opak toho, co čekáme od inhibice CHK1 kinázy.5

13

Obrázek 9: Inhibitory 7-10 se svými hodnotami IC5026-29 Startovním bodem ve snaze o převrácení selektivity inhibitoru z kinázy CDK2 na CHK1 byla sloučenina 11 (Obrázek 10). Jako první byla zkoumána moţnost záměny substituentu v poloze 3. Jak se ukázalo, krátký lineární uhlovodíkový zbytek nevedl k poţadovanému cíli. Oproti tomu heteroaryly v této poloze vykazovaly povětšinou jak dobrou aktivitu, tak selektivitu k CHK1 oproti CDK2. Příklad sloučeniny 12d však ukazuje, ţe vhodná pozice heteroatomu je nezbytná pro zachování dobré aktivity inhibitoru (Tabulka 1).5

Obrázek 10: Inhibitor na bázi pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu s hodnotami IC50

14

Poté se pozornost přenesla k aminoskupině v pozici 7. Tabulka 2 ukazuje, ţe náhrada vodíkového atomu substituentem na bázi jednoduchého alkylu, větveného alkylu nebo cykloalkylu sice zvýšila selektivitu, ale pokud jde o aktivitu vůči CHK1, nepřinesla poţadovaný efekt. Dobrou aktivitu i selektivitu většinou vykazuje aryl a heteroaryl jakoţ i původní nesubstituovaný amin 12f (Tabulka 1 a 2). Sloučenina 13f opět naznačuje, ţe udrţení aktivity souvisí s pozicí a počtem heteroatomů.5

Tabulka 1:

Tabulka 2:

CHK1 a CDK2 aktivita inhibitorů

CHK1 a CDK2 aktivita inhibitorů

CHK1

CDK2

CHK1

CDK2

IC50

IC50

IC50

IC50

(μM)

(μM)

(μM)

(μM)

36

7,8

12f

0,060

6,1

12b

9,4

0,27

13a

0,48

neaktivní

12c

18

0,08

13b

5,0

neaktivní

12d

>50

10

13c

1,5

neaktivní

12e

0,070

0,79

13d

0,087

neaktivní

12f

0,060

6,1

13e

0,009

40

12g

0,28

5,4

13f

2,2

neaktivní

Slouč.

12a

R

H

Slouč.

15

R

H

Zbývalo prověřit moţnosti poloh 5 a 6. Zatímco pro polohu 6 se ukázal být vhodný halogen nebo malý uhlovodíkový substituent, v poloze 5 vykazoval nejlepší aktivitu piperidinový cyklus s vhodnou pozicí NH skupiny či jiné strukturně podobné motivy (Tabulka 3 a 4).6

Tabulka 3:

Tabulka 4:

CHK1 a CDK2 aktivita inhibitorů

CHK1 a CDK2 aktivita inhibitorů

CHK1

CDK2

IC50

IC50

(μM)

(μM)

0,060

6,1

6a

0,017

6b

6c

Slouč.

12f

R

H

CHK1

CDK2

IC50

IC50

(μM)

(μM)

3

0,003

0,16

0,17

14a

2,9

28,7

0,031

0,33

14b

0,035

0,49

0,10

22

14c

0,007

2,4

Slouč.

R

6d

Ph

0,56

8,3

14d

4,0

1,3

3

Br

0,003

0,16

14e

0,005

0,44

16

Touto metodikou průzkumu závislosti biologické aktivity na struktuře (SAR) byla úspěšně převrácena selektivita inhibitoru z CDK2 na CHK1. Jako vhodný inhibitor se ukázala sloučenina 3 (racemický SCH 900776) jejíţ CHK1 IC50 = 0,003 μM. Zajímavý je téţ inhibitor 6c, který sice nevykazuje takovou aktivitu (CHK1 IC50 = 0,10 μM), avšak je více selektivní (CDK2 IC50 = 22 μM).5, 6 Syntézou těchto sloučenin jsem se zabýval ve své práci.

17

3. VÝSLEDKY A DISKUSE 3.1. Identifikace látek Pro identifikaci produktů byla ve všech případech pouţita protonová NMR spektroskopie (někdy doplněná i o jiné techniky; většina připravených látek jiţ byla známá). Při interpretaci spekter byla analyticky významná především oblast aromatických protonů či CH protonů poblíţ heteroatomu, jejichţ signály byly povětšinou dobře rozlišené, rozpoznatelné a integrovatelné. Oproti tomu signály v alifatické oblasti obvykle neposkytly příliš relevantní informace, protony piperidinového cyklu interagují s okolními protony s různými interakčními konstantami a všechny jsou zároveň diastereotopické, jejich signály se proto při daném rozlišení často jeví jako sloţité a těţko integrovatelné multiplety. Problém činí také voda v deuterovaných rozpouštědlech, jejíţ signál (v CDCl3 kolem 1,5 ppm; v DMSO kolem 3,3 ppm) často překrývá signály produktu. Z časových důvodů byla spektra některých produktů měřena ještě před jejich dokonalým vysušením, a obsahují proto signály rozpouštědel. Tyto jsou však dobře rozpoznatelné díky známým hodnotám jejich chemických posunů, a pokud významně nepřekrývají píky produktu, nepředstavují při interpretaci větší problém.

3.2. Příprava látek a jejich analýza 3.2.1. Příprava CHK1 inhibitoru 3 (racemický SCH 900776)

Syntéza vycházela z komerčně dostupné kyseliny 1, která byla pomocí SOCl2 nejprve převedena na příslušný chlorid, jenţ byl podroben reakci s Meldrumovou kyselinou a po zpracování v kyselém prostředí a následném refluxu v methanolu poskytl ketoester 15 (Schéma 3)30. Protonové NMR spektrum tohoto produktu bylo značně sloţité, jelikoţ se jedná

18

o směs keto a enol formy. Spektrum je proto pouze přiloţeno bez další podrobné interpretace (Spektrum 1).

Schéma 3: Syntéza ketoesteru 15

Pyrazolo[1,5-a]pyrimidinový

skelet

byl

získán

cyklizací

β-ketoesteru

15

s 3-aminopyrazolem a vzniklý derivát 16 byl převeden na chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin 17 pomocí

POCl3

v

přítomnosti

N,N-dimethylanilinu.

Chlorace

byla

dosti

špatně

reprodukovatelná, výtěţky se pohybovaly v rozmezí 28–70 %. Následně byl chlor substituován za aminoskupinu při reakci s amoniakem v propan-2-olu a vodě v uzavřené tlakové nádobě při 70 °C. Tato reakce proběhla s vysokým výtěţkem nad 90 % (Schéma 4).

Schéma

4:

Cyklizace

s

3-aminopyrazolem

pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu

19

následovaná

chlorací

a

aminací

Před jodací a následnou Suzukiho reakcí byla aminoskupina ochráněna. Důvodem byl fakt, ţe seskupení dusíkových atomů v polohách 1 a 8 a aminoskupiny v poloze 7 má dobré chelatační schopnosti a mohlo by vázat palladiový katalyzátor, jehoţ katalytické působení je při Suzukiho reakci nezbytné. V literatuře pouţívaný SEMCl byl v našem případě nahrazen levnějším chlormethyl(ethyl)etherem, který má podobné vlastnosti. (Schéma 5)

Schéma 5: Ochrana aminoskupiny v poloze 7 Ochráněný aminoderivát 19 byl jodován v poloze 3 pomocí NIS. Pro zavedení 1-methyl-1H-pyrazol-4-ylu byla pouţita Suzukiho reakce. Následovalo odstranění všech chránicích skupin pomocí 3M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové, které poskytlo produkt 12f (Schéma 6).

Schéma 6: Jodace následovaná Suzukiho reakcí a globální deprotekcí

20

K zisku finálního produktu uţ zbývalo pouze zavést brom do polohy 6, coţ bylo provedeno pomocí Br2 za přítomnosti terc-butylaminu. Ještě předtím však bylo nutné znovu ochránit piperidinový dusík, který by mohl být potenciálně bromován. Navíc Boc-skupina sniţuje polaritu a dává tak větší volnost (z pohledu rozpustnosti) při výběru rozpouštědla. Poté, co byla provedena protekce a bromace, stačilo jiţ jen odstranit chránicí skupinu, k čemuţ byla pouţita kyselina trifluoroctová, a

syntéza finálního produktu 3 tak byla

dokončena (Schéma 7).

Schéma 7: Poslední tři kroky syntézy CHK1 inhibitoru 3 3.2.2. Dělení enantiomerů látek získaných při syntéze inhibitoru 3 za použití HPLC s chirální stacionární fází Jelikoţ S-enantiomer finálního produktu 3 (SCH 900776) vykazuje při inhibici CHK1 kinázy vyšší aktivitu a selektivitu4, pokoušeli jsme se zjistit, jak se bude při chirálním HPLC dělit racemická směs finálního produktu 3, případně některých prekurzorů či jejich příbuzných látek. K dispozici jsme měli dvě analytické kolony s chirální stacionární fází: Chiralpak® ADTM (dále jen „AD“) a Chiralcel® OJTM (dále jen „OJ“). Jako první byl zkoumán amin 12a, který byl připraven deprotekcí aminoderivátu 18 (Schéma 8). Tato látka se však nedělila při ţádném ze zvolených sloţení mobilní fáze, a to na ani jedné z kolon.

21

Schéma 8: Příprava aminu 12a z aminoderivátu 18 Dále byla testována látka 12f (Chromatogram 1), která vykázala poměrně dobrou separaci na koloně AD (hexan + 0,5 % DEA / i-PrOH + 0,5 % DEA – 40:60).

Chromatogram 1: Záznam UV signálu získaného na AD koloně Jako třetí byl testován vzorek finálního produktu 3. Pro ten se ukázala být optimální kolona OJ, kde docházelo k téměř úplné separaci při sloţení mobilní fáze: hexan + 0,5 % DEA / i-PrOH + 0,5 % DEA – 60:40. Separace byla patrná i na koloně AD (hexan + 0,5 % DEA / i-PrOH + 0,5 % DEA – 60:40), avšak nebyla tak účinná. Ţe se jedná o enantiomery potvrzuje záznam z detektoru cirkulárního dichroismu (Chromatogram 2 a 3). Toto byl první případ, kdy byly tímto způsobem odděleny enantiomery racemického inhibitoru SCH 900776.

22

Chromatogram 2: Záznam UV a CD signálu Chromatogram 3: Záznam UV a CD signálu získaného na AD koloně

získaného na OJ koloně

Pro účel separace enantiomerů byl pomocí reduktivní aminace připraven i benzylderivát 29 (Schéma 9) – benzyl by poté mohl být jednoduše hydrogenolyticky odstraněn. Jelikoţ však finální produkt 3 poskytl uspokojivé výsledky dělení, nebyl jiţ tento derivát dále testován.

Schéma 9: Syntéza benzylderivátu 29

23

3.2.3. Příprava CHK1 inhibitoru 6c

Syntéza inhibitoru 6c vycházela z dříve připraveného aminoderivátu 18, který byl postupně bromován dvěma ekvivalenty NBS v polohách 3 a 6. Aminoskupina získaného dibromderivátu 23 byla vzápětí ochráněna chlormethyl(ethyl)etherem a následnou Suzukiho reakcí byl do poloh 3 a 6 zaveden 1-methyl-1H-pyrazol-4-ylový zbytek (Schéma 10).

Schéma 10: Dvojnásobná bromace, ochrana aminoskupiny a následná Suzukiho reakce Kýţený produkt 6c byl poté získán úplnou deprotekcí v kyselém prostředí (Schéma 11).

24

Schéma 11: Odstranění chránicích skupin za vzniku finálního produktu 6c 3.2.4. Dělení enantiomerů produktu 6c za použití HPLC s chirální stacionární fází Vzorek CHK1 inhibitoru 6c byl podroben separaci na obou výše zmíněných kolonách, avšak k rozdělení jeho enantiomerů nedošlo na ani jedné z nich nezávisle na sloţení pouţité mobilní fáze. 3.2.5. Kombinatoriální Suzukiho reakce

Suzukiho reakce je palladiem katalyzovaná reakce mezi organickými sloučeninami boru a organickými halogenidy nebo pseudohalogenidy (např. trifláty) v přítomnosti báze, při níţ se formuje vazba C – C.31, 32 Naším cílem v této syntetické sekvenci bylo ověřit, zda lze výběrem podmínek a vhodnou volbou chránicích skupin na dihalogenovaném substrátu dosáhnout takové selektivity, kdy by reakce v první fázi probíhala pouze v poloze 3, zatímco poloha 6 by 25

zůstala zcela, nebo alespoň z velké části, nedotčena. V druhé fázi by poté reakce probíhala do pozice 6. Touto kombinatoriální metodikou bychom mohli v jednom kroku připravit celou řadu sloučenin (např 6d). První příspěvek k ţádané selektivitě představuje obecně vyšší reaktivita jodderivátů oproti bromderivátům při této palladiově katalyzované reakci. Dalším faktorem jsou sterické a elektronické poměry v okolí polohy 6, které by měly být ovlivnitelné volbou vhodných chránicích skupin PG1 a PG2. My jsme se zatím zabývali pouze první fází reakce a snaţili se optimalizovat ji tak, aby běţela s potřebnou selektivitou. Při prvním experimentu jsme vycházeli z intermediátu 19, který byl v jednom kroku jodován pomocí NIS a následně bromován NBS (Schéma 11). Prvotní konverze v jodderivát 2 byla úplná. Poté byl přidán NBS a reakce ponechána přes noc. I po této době však v reakční směsi zůstávala látka 2, reakce byla proto ukončena a byl izolován produkt 4a a jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin 2, který byl znovu nasazen k bromaci. Celkový výtěţek sloučeniny 4a i po dodatečné bromaci byl 60 %.

Schéma 11: Jodace a bromace v jednom kroku Dihalogenderivát 4a byl podroben Suzukiho reakci, která byla nejprve prováděna v bezvodém DMF, čímţ se mělo zabránit Pd-katalyzované záměně bromu za vodík, nevýhodou však bylo, ţe K3PO4 pouţitý jako báze zůstával převáţně nerozpuštěný (Schéma 12). Teplota byla na začátek nastavena na 60 °C. Jelikoţ ale ve směsi zůstával 26

výchozí derivát 4a, byla teplota zvýšena na 90 °C a reakce běţela dalších 24 hodin. Ani poté ke změně nedošlo, byla proto přidána ještě další 2 molární procenta katalyzátoru a navíc také voda. Ani další 3 dny reakčního času změnu nepřinesly, reakce byla proto ukončena. Směs byla zahuštěna a TLC z koncentrovaného roztoku napovědělo, ţe je přítomna výchozí látka a celá řada dalších produktů. Protonové NMR z této surové směsi poskytlo velice komplikované spektrum, které nepodalo ţádnou informaci. V dalším pokusu byly zvoleny podmínky, jeţ jsme pouţívali u dřívě provedených Suzukiho reakcí – namísto DMF byl opět pouţit 1,2-dimethoxyethan a voda byla v reakční směsi jiţ od samého začátku (Schéma 12). Po 20 hodinách se průběh reakce ustálil. Protoţe na TLC se objevovaly 4 dominantní skvrny, rozhodli jsme se vzít alikvotní podíl, provést preparativní TLC a získané frakce identifikovat pomocí 1H NMR. Obrázek 11 ukazuje podobu TLC desky s hmotnostmi získaných frakcí. Vyhodnocení pomocí NMR odhalilo, ţe 1. frakce patří výchozí látce. Spektrum druhé frakce bylo značně znečištěné a nepodařilo se ho interpretovat, zřejmě šlo o směs více látek. Třetí frakce pravděpodobně patřila kýţenému produktu, tj. takovému, kde reakce proběhla pouze v poloze 3. A konečně čtvrtá frakce obsahovala dle NMR produkt reakce s 1-methyl-1H-pyrazolo-4ylovým skeletem v poloze 3 i 6.

Obrázek 11: Ilustrace rozmístění skvrn na preparativní TLC desce Po přepočtu na látkové mnoţství vypadá zastoupení identifikovaných produktů následovně: výchozí látka : produkt : neţádoucí produkt – 2,7 : 4 : 1 . Tento odhad je pochopitelně zatíţen chybou, jelikoţ je odvozen z jediného experimentu, navíc hmotnost získaných látek je malá, nicméně dával naději, ţe patřičnou optimalizací bychom mohli dosáhnout ţádané selektivity Suzukiho reakce.

27

Schéma 12: Dvě varianty experimentu s cílem provést selektivní Suzukiho reakci V další syntetické sekvenci jsme se pokusili podpořit selektivitu obměnou jedné ethoxymethyl chránící skupiny za Boc skupinu, jejíţ sterické i elektronické působení je značně

odlišné.

Vycházeli

jsme z aminoderivátu

18,

jenţ

byl

podroben

reakci

s 1,1 ekvivalentem Boc2O v přítomnosti DMAP. Následná jodace se obešla bez problémů, avšak zavedení bromu do polohy 6 pomocí NBS nebyla úspěšná. Izolovaný produkt byl totiţ velmi znečištěn dle 1H NMR (Spektrum 22). Lépe dopadla alternativní bromace provedená bromem s terc-butylaminem (Schéma 13). Spektrum tohoto produktu však téţ nemělo zcela očekávanou podobu (Spektrum 23).

28

Signál v oblasti kolem 8 ppm, kde bychom očekávali singlet protonu z pozice 2, měl totiţ podobu pseudo-dubletu aţ multipletu, coţ ale mohlo být způsobeno přítomností několika singletů s podobným chemickým posunem. Vysvětlení se nabízí několik. Signál zmíněného protonu můţe být překryt nečistotou. V úvahu téţ připadá, ţe produkt je tvořen směsí enamino a imino tautomeru – rozdílné elektronické poměry kaţdého tautomeru na pyrazolo[1,5-a]pyrimidinovém jádře pak mohou způsobit, ţe proton v poloze 2 dává dva blízké (ale různé) signály. Třetí variantou je skutečnost, ţe před bromací mohlo dojít k částečné dejodaci uhlíku 3 a následně byla nabromována i tato pozice. Směs produktu a dibromované látky se nemusela díky podobné struktuře rozdělit na chromatografické koloně a při měření NMR mohl být druhý signál poskytován vodíkem z polohy 2, v jehoţ sousedství je namísto jodu brom. Tato záměna halogenů má pochopitelně vliv na chemický posun sousedních jader. Podobný tvar píku byl pozorován jak při měření v CDCl3, tak i v DMSO-d6, kde byl signál posunutý downfield o 0,3 ppm (Spektrum 24).

Schéma 13: Zavedení Boc skupiny a následné halogenace I přes toto pozorování byla látka 28 nasazena k alkylaci chlormethyl(ethyl)etherem (Schéma 14). Inkriminovaná oblast

1

H NMR spektra získaného (a chromatograficky

přečištěného) produktu 4b však vypadala zcela obdobně (Spektrum 25). Tento fakt vyvrací vysvětlení opírající se o přítomnost enamino a imino tautomerů, přítomnost nečistoty se pak stává více nepravděpodobnou.

29

Schéma 14: Ochrana NH skupiny ethoxymethyl skupinou S vědomím, ţe produkt 4b můţe být znečištěn dibromovaným derivátem (který zřejmě nelze uspokojivě separovat na chromatografické koloně) a ţe informace o selektivitě můţe být přítomností této látky zkreslena, bylo přistoupeno k Suzukiho reakci (Schéma 15). Po 22 hodinách se podoba reakce ustálila, a přestoţe byla stále přítomna výchozí látka, reakce byla ukončena. Po kolonové chromatografii bylo získáno 24 mg produktu, coţ představuje 50% výtěţek. K tomu bylo získáno 9 mg výchozí látky a 4 mg neidentifikovaných vedlejších produktů. Pokud bychom opět pouţili přepočet na látková mnoţství a vyjádřili poměrné zastoupení identifikovaných produktů reakce, dostali bychom se na tato čísla: výchozí látka : produkt – 1 : 3, coţ ukazuje na značný posun ke kýţené selektivitě. Nutno podotknout, ţe látka 5b nebyla příliš čistá (dle 1H NMR), avšak následná celková deprotekce (Schéma 15) a purifikace na preparativním TLC poskytla alternativně připravený finální produkt 3 v dobré čistotě (Spektrum 27 a 28).

Schéma 15: Suzukiho reakce a deprotekce v kyselém prostředí poskytují finální produkt 3

30

Zavedení Boc-skupiny mělo za následek zvýšení poţadované selektivity. Vysvětlení je moţné hledat ve větším sterickém stínění pozice 6. Vliv můţe mít i rozdílné elektronické působení karbamátu na sousední polohu. Toto společně s niţší reaktivitou oproti pozici substituované jodem patrně vyústilo ve významnou preferenci pozice 3 při Suzukiho reakci. Pokud vezmeme v úvahu, ţe látka 4b byla navíc moţná znečištěna dibromovaným derivátem, vyplyne nám, ţe při reakci čisté látky by selektivita byla ještě o něco vyšší. Toto tvrzení je však nutné brát se značnou rezervou, jelikoţ hypotéza o dibromované nečistotě nebyla nijak potvrzena, tím spíše nelze ani zdaleka odhadovat míru případného znečištění. Nicméně získané poznatky dávají nadějné vyhlídky a další optimalizace této metodiky můţe přinést zajímavé výsledky.

3.3. Biologické testy CHK1 inhibitoru 3 CHK1 inhibitor 3 jiţ prošel řadou biologických testů.4 Inhibitor připravený v rámci této práce byl testován na buněčné linii MEC-1 (transformované buňky chronické lymfocytární leukémie - CLL) Uvedená data mají pouze ilustrovat popsaný synergický mechanismus působení CHK1 inhibitoru s doprovodným cytostatikem (viz literární část). Podrobnější analýza biologických testů přeshuje rámec této práce, proto se omezím pouze na stručné shrnutí. Inhbitor 3 byl aplikován společně s třemi cytostatiky – cytarabinem, fludarabinem a gemcitabinem v různých koncentracích. Fludarabin se pouţívá jako standardní medikament při léčbě CLL. Grafy 1 a 2 ukazují, ţe přítomnost inhibitoru někdy aţ velice významně sniţuje viabilitu nádorových buněk. U gemcitabinu (Graf 3) není efekt tak výrazný, jelikoţ toto cytostatikum mělo velmi silný efekt samo o sobě.

k1 Cytarabin + Inhibitor Cytarabin Koncentrace

k2 10,4 30,1

25 μg/ml

k3 9,7 28,4

6.25 μg/ml

k4 12,3 42,5

1.6 μg/ml

18,4 76,8

0 92,5 100,0

0.4 μg/ml

Tabulka 5: Hodnoty koncetrací a procentuální zastoupení buněk (modrá pole), které přeţily aplikaci cytostatika popř. cytostatika společně s inhibitorem

31

procentuální zastoupení přeživších buněk

120,0 100,0 80,0 Cytarabin + Inhibitor

60,0

Cytarabin

40,0 20,0 0,0 k1

k2

k3

k4

0

koncentrace

Graf 1: Závislost procentuálního zastoupení přeţivších buněk na koncentraci cytostatika popř. cytostatika společně inhibitorem

k1 Fludarabin + Inhibitor Fludarabin

k2 11,7 30,5

k3 12,2 55,1

6.25 25 μg/ml μg/ml

Koncentrace

k4 48,8 103,7

1.6 μg/ml

83,2 110,1

0 77,1 100,0

0.4 μg/ml

Tabulka 6: Hodnoty koncetrací a procentuální zastoupení buněk (modrá pole), které přeţily aplikaci cytostatika popř. cytostatika společně s inhibitorem

procentuální zastoupení přeživších buněk

120,0 100,0 80,0 Fludarabin + Inhibitor

60,0

Fludarabin

40,0 20,0 0,0 k1

k2

k3

k4

0

koncentrace

Graf 2: Závislost procentuálního zastoupení přeţivších buněk na koncentraci cytostatika popř. cytostatika společně inhibitorem

32

k1 Gemcitabin + Inhibitor Gemcitabin

k2

k3

6,5 8,4

6.25 25 μg/ml μg/ml

Koncentrace

k4

7,7 10,0

7,8 15,4 1.6 μg/ml

7,3 14,3

0 88,1 100,0

0.4 μg/ml

Tabulka 7: Hodnoty koncetrací a procentuální zastoupení buněk (modrá pole), které přeţily aplikaci cytostatika popř. cytostatika společně s inhibitorem

procentuální zastoupení přeživších buněk

120,0 100,0 80,0 Gemcitabin + Inhibitor

60,0

Gemcitabin

40,0 20,0 0,0 k1

k2

k3

k4

0

koncentrace

Graf 3: Závislost procentuálního zastoupení přeţivších buněk na koncentraci cytostatika popř. cytostatika společně inhibitorem Testy provedla skupina dr. Martina Trbuška z Interní hematoonkologické kliniky Fakultní nemocnice Brno.

33

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Použité přístroje a chemikálie Všechny experimenty byly prováděny s pouţitím komerčně dostupných chemikálií od specializovaných výrobců (Acros, Sigma-Aldrich, Lach-ner, AK Scientific, Fluka a Penta) a v dodané čistotě. Acetonitril (Acros) byl zakoupen extra suchý nad molekulovými síty (4 Å) a nebyl dále upravován. 1,2-dichlorethan (Sigma-Aldrich) byl sušen nad molekulovými síty (4 Å). Dichlormethan (Penta) byl sušen nad molekulovými síty (4 Å). 1,2-dimethoxyethan (Acros) byl zakoupen jako extra suchý a nebyl dále upravován. DMF (Sigma-Aldrich) byl sušen nad molekulovými síty (4 Å). Pyridin byl sušen nad pevným hydroxidem sodným a následně destilován z hydridu vápenatého a skladován nad hydroxidem draselným. Toluen (Penta) byl sušen nad molekulovými síty (4 Å).33 Spektra nukleární magnetické rezonance byla měřena na přístroji Bruker AVANCE 300 za pouţití pracovní frekvence 300 MHz (1H NMR) a 75 MHz (13C NMR) za teploty 303 K. Hodnoty chemických posunů (δ v jednotkách ppm) byly kalibrovány s vyuţitím reziduálního píku deuterovaných rozpouštědel CDCl3 (1H NMR: δ = 7,24 ppm; 13C NMR: δ = 77,23 ppm) a DMSO-d6 (1H NMR: δ = 2,50 ppm; 13C NMR: δ = 39,51 ppm). Hmotnostní spektra byla měřena na přístroji Agilent 6224 TOF LC/MS (Agilent Technologies, USA) s duálním módem ionizace (ESI/APCI; Agilent Technologies, USA). Spektra infračervené spektroskopie byla měřena na přístroji FTIR ATI Matson Genesis series. Vzorek byl lisován do tablety společně s KBr. Teploty tání byly měřeny na Koflerově bodotávku Künstner Nacht, KG HMK 66/1565, získané hodnoty nebyly korigovány.

34

Silikagel pro kolonovou chromatografii byl zakoupen u firmy Acros s částicemi o velikosti 40–60 μm. Látka byla na kolonu nanášena v roztoku mobilní fáze nebo adsorbovaná na silikagel. Tenkovrstevná chromatografie byla prováděna na silikagelem potaţených hliníkových nebo skleněných destičkách 60 F254 od firmy Merck s UV detekcí při 254 nm nebo ponořením destičky do 10% ethanolického roztoku fosfomolybdenové kyseliny a následným zahřátím. Chirální vysokoúčinná kapalinová chromatografie byla provedena na přístroji Shimadzu LC10ADVP s UV/CD detektorem JASCO CD-1595 a analytickými kolonami s chirální stacionární fází Chiralcel® OJTM (tris(4-methylbenzoát)celulóza vázaná na silikagel) a Chiralpak® ADTM (tris(3,5-dimethylfenylkarbamát)amylóza vázaná na silikagel). Mobilní fázi tvořil hexan s přídavkem 0,5 % diethylaminu a propan-2-ol s přídavkem 0,5 % diethylaminu v různých poměrech. Vzorek pro nástřik byl vytvořen rozpuštěním látky v propan-2-olu (koncentrace činila přibliţně 1 mg/ml). Reakce za bezvodých podmínek byly prováděny v suché aparatuře pod inertním plynem (N2)

4.2. Příprava sloučenin Všechny produkty byly sušeny pod vakuem. Není-li uvedeno jinak, reakce běţely do úplné konverze výchozích látek v produkty.  terc-butyl-3-(3-methoxy-3-oxopropanoyl)piperidin-1-karboxylát (15)7 Do 100ml baňky byla naváţena kyselina 1 (5,01 g; 21,9 mmol) a byla rozpuštěna v suchém dichlormethanu (30 ml) a suchém pyridinu (4,5 ml; 55,8 mmol). K míchanému roztoku byl přes septum pomalu přikapán SOCl2 (1,9 ml; 26,2 mmol). Oranţový roztok byl pod atmosférou N2 míchán za laboratorní teploty po dobu 30 minut. Po uplynutí této doby byl k reakční směsi přidán DMAP (6,90 g; 56,4 mmol) a Meldrumova kyselina (3,55 g; 24,6 mmol). Vzniklá tmavě červená směs byla dále míchána za laboratorní teploty pod N2 1 hodinu. Poté byla směs nalita na diethylether (200 ml) a v dělicí nálevce promyta

35

1M roztokem HCl (3x 50 ml) a nasyceným roztokem NaCl (50 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Neodpařený olejovitý zbytek byl rozpuštěn v methanolu (58 ml) a směs byla refluxována pod zpětným chladičem přes noc. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 10:1). Poté byl methanol odpařen na RVO a pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 10:1). Produkt 15 byl získán jako oranţový olej (3,51 g; 56 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): viz příloha a diskuse  terc-butyl-3-(7-hydroxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (16)7 V 25ml baňce byl smíchán β-ketoester 15 (3,51 g; 12,3 mmol) a 3-aminopyrazol (0,951 g; 11,4 mmol). Tato směs byla refluxována pod atmosférou N2 pod zpětným chladičem v suchém toluenu (10,5 ml) po dobu 24 hodin. Roztok měl oranţovou barvu a po několika hodinách se začala vylučovat sraţenina. Průběh reakce byl

sledován pomocí TLC (CH2Cl2/MeOH 20:1). Po skončení reakce byl toluen odpařen na RVO a pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/MeOH 20:1 aţ 12:1). Produkt 16 byl získán jako naţloutlá krystalická látka (3,11 g; 85 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,42 (s, 10H); 1,56–1,67 (m, 1H);1,77–1,98 (m, 1H);

2,05-2,26 (m, 1H); 2,81–3,15 (m, 2H); 3,19–3,43 (m, 1H); 3,67–3,91 (m, 1H); 3,98–4,15 (m, 1H) 5,73 (s, 1H); 6,12 (d, 1H); 7,81 (d, 1H); 11,83 (brs, 1H, OH) ppm  terc-butyl-3-(7-chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (17) 7

Do 25ml

baňky

naplněné

atmosférou

N2

byl

naváţen

hydroxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin 16 (0,688 g; 2,16 mmol) a přes septum byl pomalu přikapán POCl3 (6,9 ml; 74,0 mmol) a N,N-dimethylanilin (0,85 ml, 6,71 mmol). Nahnědlá směs byla míchána pod atmosférou N2 za laboratorní teploty 4 dny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 8:1). Poté byl přebytek POCl3 odpařen a zahuštěný zbytek byl pomalu nalit na nasycený roztok NaHCO3 (50 ml). Produkt byl v dělicí 36

nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 20 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 8:1). Produkt 17 byl získán jako světle ţlutá voskovitá látka (0,512 g; 70 %) 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,45 (s, 12H); 1,69–1,94 (m, 3H); 1,98–2,21 (m, 2H);

2,69-2,95 (m, 3H); 2,99–3,23 (m, 1H); 3,92–4,16 (m, 1H); 4,16–4,39 (m,1H); 6,69 (d, 1H); 6,89 (s, 1H); 8,17 (d, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-aminopyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (18) 7 Ţlutá

směs

chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidinu

17

(0,512

g;

1,52 mmol), 2M roztoku NH3 v propan-2-olu (3,2 ml) a 25-29% vodného roztoku amoniaku (0,3 ml) byla míchána v uzavřené tlakové nádobě při 70 °C po dobu 30 hodin. Průběh reakce byl sledován rozpouštědla

odpařena

na

RVO

pomocí a

TLC

pevný

(CH2Cl2/MeOH

zbytek

byl

20:1).

podroben

Poté

byla

chromatografii

(CH2Cl2/MeOH 10:1). Produkt 18 byl získán jako bílá pevná látka (438 mg; 91 %) 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,44 (s, 12H); 1,62–1,91 (m, 2H); 1,91–2,20 (m, 1H);

2,60-2,90 (m, 3H); 2,90–3,11 (m, 1H); 3,94–4,32 (m, 2H); 5,55 (brs, 2H, NH2); 5,98 (s, 1H); 6,43 (d, 1H); 7,99 (d, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin1-karboxylát (19) 7 Do 25ml baňky byl naváţen aminopyrazolo[1,5-a]pyrimidin 18 (0,623 g; 1,96 mmol) a baňka s výchozí látkou byla propláchnuta

dusíkem.

Přes

septum

byl

přidán

suchý

1,2-dichlorethan (6,5 ml), DIPEA (2,3 ml; 14,0 mmol) a chlormethyl(ethyl)ether (0,65 ml; 7,01 mmol). Červená směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 2 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 5:1). Poté byla směs nalita na nasycený roztok NaHCO3 (30 ml) a produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu 37

(3x 15 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 2:1). Produkt 19 byl získán jako světle ţlutá pevná látka (0,787 g; 93 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,15 (t, 6H); 1,42 (s, 10H); 1,46–1,61 (m, 1H); 1,63–1,90

(m, 2H); 1,91–2,10 (m, 1H); 2,63–2,85 (m, 2H); 2,89–3,10 (m, 1H); 3,55 (q, 4H); 3,95–4,17 (m, 1H); 4,18–4,35 (m, 1H); 5,21 (s, 4H); 6,37 (s, 1H); 6,47 (d, 1H); 7,97 (d, 1H) ppm 13

C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 14,33; 15,24; 25,27; 28,62; 30,55; 44,59; 60,48; 64,16; 79,64;

80,02; 94,45; 95,35; 143,89; 148,42; 151,16; 154,99; 163,46 ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-3-jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5yl)piperidin-1-karboxylát (2) 7 V 25ml baňce byla sloučenina 19 (0,787 g; 1,82 mmol) rozpuštěna v suchém acetonitrilu (4,5 ml) a baňka byla propláchnuta dusíkem. Přes septum byl přidán roztok NIS (384 mg; 1,71 mmol) v suchém acetonitrilu (4,5 ml). Baňka se světle oranţovou reakční směsí byla obalena alobalem a směs byla míchána pod N2 za laboratorní teploty po dobu 90 minut. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 20:1). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 15:1). Produkt 2 byl získán jako naţloutlá voskovitá látka (0,876 g; 93 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,17 (t, 6H); 1,45 (s, 10H); 1,68–1,91 (m, 2H); 1,98–2,15

(m, 2H); 2,72–2,92 (m, 2H); 2,96–3,17 (m, 1H); 3,56 (q, 4H); 4,23–4,41 (m, 1H); 5,21 (s, 4H); 6,43 (s, 1H); 7,99 (s, 1H) ppm

38

 terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (20) 7 Do

suché,

dusíkem

naplněné

50ml

baňky

byl

k jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidinu 2 (0,718 g; 1,28 mmol) naváţen 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2yl)-1H-pyrazol

(0,538

g;

2,59

mmol),

katalyzátor

[PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (110 mg; 0,135 mmol) a K3PO4 (1,08 g; 5,09 mmol). Baňka byla řádně propláchnuta dusíkem a přes septum byl přidán 1,2-dimethoxyethan (18 ml) a voda (3,6 ml). Tmavě hnědá směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 4 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 5:1). Poté byla na RVO odpařena rozpouštědla a zahuštěný zbytek byl nalit na vodu. Produkt byl v dělicí nálevce extrahován do ethyl-acetátu (3x 25 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 3:1). Produkt 20 byl získán jako tmavě ţlutá pevná látka (401 mg; 61 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,18 (t, 6H); 1,46 (s, 11H); 1,53–1,69 (m, 2H); 1,69–1,93

(m, 2H); 2,03–2,21 (m, 1H); 2,66–2,95 (m, 2H); 3,01–3,17 (m, 1H); 3,58 (q, 4H); 3,97 (s, 3H); 4,05–4,25 (m, 1H); 4,25–4,44 (m, 1H); 5,25 (s, 4H); 6,40 (s, 1H); 7,94 (s, 1H); 7,96 (s, 1H); 8,14 (s, 1H) ppm  3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-(piperidin-3-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amin (12f) 7 Do 50ml baňky byl k sloučenině 20 (499 mg; 0,972 mmol) přidán ethanol (10 ml) a 3M roztok HCl (10 ml). Naţloutlá směs byla míchána pod zpětným chladičem při 60 °C po dobu 2 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 6:1).

Ethanol byl poté odpařen na RVO a

zbývající kyselý roztok byl zalkalizován pevným NaOH aţ do vyloučení pevné fáze. Rozpouštědla byla odpařena a surový produkt byl vysušen. Dále bylo přidáno malé mnoţství MeOH a heterogenní směs byla podrobena chromatografii

39

(CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 6:1). Produkt 12f byl získán jako bílá pevná látka (247 mg; 86 %). 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,14–1,37 (m, 1H); 1,38–1,58 (m, 1H); 1,61–1,77 (m, 1H);

1,94–2,02 (m, 1H); 2,61–2,81 (m, 2H); 2,88–3,02 (m, 1H); 3,08–3,16 (m, 1H); 3,88 (s, 3H); 5,98 (s, 1H); 7,52 (brs, 2H, NH2); 7,91 (s, 1H); 8,06 (s, 1H); 8,27 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-amino-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5yl)piperidin-1-karboxylát (21) 7

Pyrazolo[1,5-a]pyrimidin 12f (207 mg; 0,696 mmol) byl v 25ml baňce pod atmosférou N2 rozpuštěn v suchém dichlormethanu (5 ml). Přes septum byl přidán TEA (0,85 ml; 6,10 mmol). Poté byl do baňky přidán Boc2O (183 mg; 0,838 mmol) a lehce naţloutlá směs byla míchána pod N2 za laboratorní teploty 18 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/MeOH 20:1). Poté byla směs nalita na nasycený roztok NaHCO3 (30 ml) a produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 10ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/MeOH 20:1). Produkt 21 byl získán jako světle ţlutá pevná látka (190 mg; 69 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0,79–0,88 (m, 2H); 1,04–1,12 (m, 1H); 1,46 (s, 13H);

1,73-1,88 (m, 1H); 2,72–2,82 (m, 1H); 2,99–3,17 (m, 1H); 3,29–3,58 (m, 1H); 3,96 (s, 3H); 4,04–4,18 (m, 1H); 4,24–4,41 (m, 1H); 5,49 (brs, 2H, NH2); 5,99 (s, 1H); 7,92 (s, 1H); 7,96 (s, 1H); 8,13 (s, 1H) ppm

40

 terc-butyl-3-(7-amino-6-brom-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (22) 7 V 25ml baňce byla vytvořena směs látky 21 (190 mg; 0,478 mmol), terc-butylaminu (4 ml; 38,3 mmol) a suchého dichlormethanu (2 ml). Roztok byl míchán pod atmosférou N2 a přes septum k němu byl pomalu přikapán roztok Br2 (22 μl; 0,428 mmol) v suchém dichlormethanu (1,6 ml). Naţloutlý roztok byl míchán za laboratorní teploty 21 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 1:1). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a neodpařený zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 1:1). Produkt 22 byl získán jako bílá pevná látka (181 mg; 88 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,46 (s, 13H); 1,71–1,95 (m, 2H); 2,68–2,93 (m, 2H);

3,04-3,29 (m, 3H); 3,36–3,57 (m, 1H); 3,97 (s, 3H); 4,09–4,44 (m, 3H); 5,99 (brs, 2H, NH2); 7,90 (s, 1H); 7,93 (s, 1H); 8,10 (s, 1H) ppm  6-brom-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-(piperidin-3-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin7-amin (3) Metoda A: 7

Brompyrazolo[1,5-a]pyrimidin 22 (181 mg; 0,380 mmol) byl v 10ml baňce rozpuštěn v suchém dichlormethanu (2 ml). Baňka byla naplněna atmosférou N2 a přes septum do ní byla přikapána TFA (2 ml). Naţloutlá směs byla míchána za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 1:1). Rozpouštědlo bylo odpařeno, zbytek TFA byl odpařen společně s toluenem. Suchý produkt byl rozpuštěn v MeOH a byl neutralizován pomocí pevného Na2CO3. Tato surová heterogenní směs byla čištěna na chromatografické (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 13:1). Produkt 3 byl získán jako bílá pevná látka (135 mg; 94 %). IČ (KBr): 3429; 3274; 2937; 1640; 1586; 1541; 1341; 1250, 1212 cm-1 41

Teplota tání: 212,5–215,7 °C HRMS (APCI): spočteno pro C15H18N7Br [M+H]+: 376,0880/378,0861; nalezeno 376,0875/378,0856 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,56–1,71 (m, 2H); 1,75–1,94 (m, 2H); 2,02–2,15 (m, 1H);

2,69–2,80 (m, 1H); 2,98–3,13 (m, 2H); 3,18–3,33 (m, 2H); 3,97 (s, 3H); 5,97 (brs, 2H, NH2); 7,93 (s, 2H); 8,10 (s, 1H) ppm 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,44–1,61 (m, 1H); 1,65–1,86 (m, 2H); 1,91–2,03 (m, 1H);

2,47–2,61 (m, 2H); 2,70–2,83 (m, 1H); 2,90–3,02 (m, 1H); 3,05–3,20 (m, 2H); 3,89 (s, 3H); 7,94 (s, 1H); 8,06 (s, 1H); 8,32 (s, 1H) ppm 13

C NMR (75 MHz, DMSO): δ 26,14; 29,54; 38,53; 43,47; 46,01; 50,66; 83,22; 101,11;

112,94; 126,41; 135,71; 140,83; 142,27; 154,17; 160,16 ppm Metoda B: 7 Výchozí látka 5b (24 mg; 38,8 μmol) byla v 10ml baňce rozpuštěna v ethanolu. Poté byl k míchané směsi přidá 3M roztok HCl. Ţlutá směs byla míchána pod zpětným chladičem při 60 °C po dobu 2 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 15:1). Směs byla poté zneutralizována přídavkem pevného Na2CO3. Rozpouštědla byla odpařena a surový produkt byl vysušen. Dále bylo přidáno malé mnoţství MeOH a heterogenní směs byla podrobena chromatografii (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 20:1). Jelikoţ produkt nebyl získán v dostatečné čistotě, byla směs získaných látek rozpuštěna v methanolu (1 ml) a nanesena na preparativní TLC (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 15:1). Produkt 3 byl získán jako bílá pevná látka (6 mg; 42 %). 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,15–1,32 (m, 1H); 1,36–1,59 (m, 1H); 1,62–1,86 (m, 2H);

1,90–2,09 (m, 2H); 2,67–2,83 (m, 1H); 2,91–3,00 (m, 1H); 3,05–3,19 (m, 2H); 3,90 (s, 3H); 7,94 (s, 1H); 8,07 (s, 1H); 8,33 (s, 1H) ppm 13

C NMR (75 MHz, DMSO): δ 26,27; 29,60; 38,55; 43,60; 46,10; 50,79; 83,25; 101,10;

112,96; 126,42; 135,70; 140,82; 142,28; 145,17; 160,24 ppm

42

 terc-butyl-3-(7-amino-3,6-dibrompyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1karboxylát (23) 7 Do 10ml baňky byl naváţen aminopyrazolo[1,5-a]pyrimidin 18 (100 mg; 0,315 mmol) a byl přidán suchý acetonitril (1 ml). Směs byla míchána pod atmosférou N2. Přes septum byl přikapán roztok NBS (56 mg; 0,315 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Naţloutlá směs byla dále míchána za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 7:1). Po uplynutí této doby byl přes septum opět přidán roztok NBS (56 mg; 0,316 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Po chvíli vzniklá béţová heterogenní směs byla míchána za laboratorní teploty přes noc. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 7:1) Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 7:1). Produkt 23 byl získán jako bílá pevná látka (144 mg; 96 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): 1,45 (s, 13H); 1,71–1,95 (m, 3H); 1,99–2,16 (m, 2H);

2,68-2,86 (m, 1H); 3,03–3,28 (m, 3H); 4,02–4,34 (m, 3H); 6,03 (brs, 2H; NH2); 7,94 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-3,6-dibrompyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5yl)piperidin-1-karboxylát (24) 7 Do 10ml baňky

byl naváţen dibrompyrazolo[1,5-a]pyrimidin

23 (141 mg; 0,297 mmol) a baňka byla propláchnuta dusíkem. Přes septum byl poté přidán suchý 1,2-dichlorethan (2,5 ml), DIPEA (0,35 ml; 2,11 mmol) a chlormethyl(ethyl)ether (0,10 ml; 1,08 mmol). Načervenalá směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 po dobu 20 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 20:1). Poté byla směs nalita na nasycený roztok NaHCO3 (50 ml). Produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 15 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno

na

RVO.

Olejovitý

zbytek

byl

čištěn

kolonovou

chromatografií

(CH2Cl2/EtOAc 20:1). Produkt 24 byl získán jako bílá pevná látka (91 mg; 52 %).

43

1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,11 (t, 6H); 1,17–1,28 (m, 3H); 1,46 (s, 12H); 1,53–1,67

(m, 1H); 1,74–1,88 (m, 2H); 1,96–2,16 (m, 2H); 3,03–3,16 (m, 1H); 3,30–3,39 (m, 1H); 3,48 (q, 4H); 4,03–4,41 (m, 3H); 5,03 (s, 4H); 7,98 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-3,6-bis(1-methyl-1H-pyrazol-4yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (25) 7 Do 25ml baňky vyplněné atmosférou N2 byl k sloučenině 24 (91

mg;

0,153

mmol)

naváţen

1-methyl-4-(4,4,5,5-

tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazol

(85,0

mg;

0,409 mmol), katalyzátor [PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (25 mg; 30,8 μmol) a K3PO4 (299 mg; 1,41 mmol). Baňka byla řádně propláchnuta

dusíkem

a

přes

septum

byl

přidán

1,2-dimethoxyethan (4 ml) a voda (1 ml). Tmavě hnědá směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 po dobu 24 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (EtOAc/MeOH 50:1). Poté byla na RVO odpařena rozpouštědla a zahuštěný zbytek byl nalit na vodu. Produkt byl v dělicí nálevce extrahován do ethyl-acetátu (3x 15 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Pevný zbytek byl chromatografován sloupci silikagelu (EtOAc/MeOH 50:1). Produkt 25 byl získán jako bílá pevná látka (32 mg; 35 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,09 (t, 6H); 1,43 (m, 13H); 1,61–2,05 (m, 5H); 2,64–2,85

(m, 1H); 2,88–3,15 (m, 1H); 3,39 (q, 4H); 3,97 (s, 6H); 4,03–4,30 (m, 2H); 4,57–4,73 (m, 4H); 7,63 (s, 2H); 7,90 (s, 1H); 7,98 (s, 1H); 8,16 (s, 1H) ppm

44

 3,6-bis(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)-5-(piperidin-3-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7amin (6c) 7 Do 10ml baňky byl k výchozí látce 25 (32 mg; 53,4 μmol) přidán ethanol (2 ml) a 3M roztok HCl (0,6 ml). Směs byla míchána pod zpětným chladičem při 60 °C po dobu 3 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (EtOAc/MeOH 50:1). Ethanol byl poté odpařen na RVO a zbývající roztok byl zalkalizován pevným NaOH aţ do vyloučení pevné fáze. Rozpouštědla byla odpařena a surový produkt byl vysušen. Dále bylo přidáno malé mnoţství MeOH a heterogenní směs byla čištěna na chromatografií na koloně

se silikagelem

(CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 20:1 aţ 10:1). Produkt 6c byl získán jako lehce nahnědlá pevná látka (17 mg; 85 %). IČ (KBr): 3402; 2934; 2857; 1717; 1638; 1539; 1336; 1248; 1119 cm-1 Teplota tání: 268,3–271,0 °C HRMS (APCI): spočteno pro C19H23N9 [M+H]+: 378,2149; nalezeno: 378,2143 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,18–1,61 (m, 2H); 1,68–1,89 (m, 3H); 2,79–2,94 (m, 1H);

3,00–3,11 (m, 2H); 3,91 (s, 3H); 3,92 (s, 3H); 7,11 (brs, 2H, NH2); 7,48 (s, 1H); 7,81 (s, 1H); 7,99 (s, 1H); 8,11 (s, 1H); 8,34 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-6-brom-3-jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin5-yl)piperidin-1-karboxylát (4a) 7 Sloučenina 19 (134 mg; 0,309 mmol) byla rozpuštěna v 10ml baňce v suchém acetonitrilu (2 ml) a baňka byla propláchnuta dusíkem. Přes septum byl přidán roztok NIS (70 mg; 0,311 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Baňka byla obalena alobalem. Naţloutlá směs byla míchána pod N2 za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 10:1). Po upynutí této doby byl přes septum přidán roztok NBS (55 mg; 0,310 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Směs byla míchána za laboratorní teploty přes noc. Průběh bromace byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 13:1). V reakční směsi vedle bromovaného produktu 45

zůstával i jodovaný substrát 2, a jelikoţ nedocházelo ke změně, byla reakce ukončena. Rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO a olejovitý zbytek byl chromatografován sloupci silikagelu

(CH2Cl2/EtOAc 20:1 aţ 5:1). Produkt byl získán jako nahnědlá pevná látka

(28,9 mg; 15 %). Vedle produktu 4a byla izolována jodovaná výchozí látka 2 (92 mg; 0,164 mmol), která byla znovu podrobena bromaci. Jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin 2 (92 mg; 0,164 mmol) byl rozpuštěn v 10ml baňce v suchém acetonitrilu (2 ml) a baňka byla propláchnuta dusíkem. Přes septum byl přidán roztok NBS (33 mg; 0,185 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Baňka byla obalena alobalem. Naţloutlá směs byla míchána pod N2 za laboratorní teploty po dobu 4 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 15:1). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 13:1). Produkt 4a byl získán jako nahnědlá pevná látka (90 mg; 85 %). Celkově bylo získáno 119 mg produktu (60 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,11 (t, 6H); 1,45 (s, 10H); 1,74–1,91 (m, 2H); 1,97–2,19

(m, 1H); 2,70–2,95 (m, 1H); 2,97–3,18 (m, 1H), 3,48 (q, 4H); 4,04–4,41 (m, 2H); 5,03 (s, 4H); 7,98 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(bis(ethoxymethyl)amino)-6-brom-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (5a)

metoda A: Do

25ml

baňky

vyplněné

atmosférou

N2

byl

k brom-jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidinu 4a (61 mg; 95,9 μmol) naváţen 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2(20

yl)-1H-pyrazol

mg;

96,1

μmol),

katalyzátor

[PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (8 mg; 9,9 μmol) a K3PO4 (82 mg; 0,384 mmol). Baňka byla řádně propláchnuta dusíkem a přes septum byl přidán N,N-dimethylformamid (4 ml). Tmavě hnědá heterogenní směs byla intenzivně míchána při 60 °C pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 přes noc. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 13:1). Protoţe v reakční směsi byla stále přítomna výchozí látka, byla teplota zvýšena na 90 °C a reakce za nezměněných ostatních podmínek ponechána dalších 24 hodin. Jelikoţ ani poté nebyla konverze úplná, byl do reakční 46

směsi přidán znovu katalyzátor [PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (2 mg; 1,8 μmol) a navíc ještě voda (0,4 ml). Po dalších 4 hodinách byla teplota sníţena na 60 °C a směs byla míchána pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 přes víkend. Poté byla reakční směs zahuštěna na olejové vývěvě a z koncentrovaného roztoku bylo provedeno TLC (CH2Cl2/EtOAc 13:1; EtOAc/CH2Cl2 2:1), z něhoţ bylo zjištěno, ţe v reakční směsi je stále přítomna výchozí látka a řada dalších produktů. Reakce byla proto ukončena. metoda B: 7 Do 25ml baňky vyplněné atmosférou N2 byl k brom-jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidinu 4a (58 mg; 90,2 μmol)

naváţen 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazol

(19 mg; 90,3 μmol), katalyzátor [PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (9 mg; 11,1 μmol) a K3PO4 (80 mg; 0,377 mmol). Baňka byla řádně propláchnuta dusíkem a přes septum byl přidán 1,2-dimethoxyethan (4 ml) a voda (0,8 ml). Tmavě hnědá směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 po dobu 20 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 13:1; EtOAc/CH2Cl2 2:1). Protoţe sloţení reakční směsi se ustálilo, byla reakce ukončena, rozpouštědla byla odpařena a zahuštěný zbytek byl nalit na vodu. Produkty byly v dělicí nálevce extrahovány do dichlormethanu (3x 10 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Pevný zbytek byl rozpuštěn v dichlormethanu (3 ml) a alikvot (1 ml) byl nanesen na preparativní TLC (EtOAc/CH2Cl2 2:1), kde byly získány 4 frakce (1. frakce: 3 g; 2. frakce: 2 mg; 3. frakce: 4 mg; 4. frakce 1 mg), jeţ byly poté analyzovány pomocí 1H NMR. 1. frakce (4a) : 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,11 (t, 6H); 1,45 (s, 8H); 1,71–1,96 (m, 2H); 2,00–2,24 (m, 1H); 2,70–2,90 (m, 1H); 3,04–3,21 (m, 1H); 3,28–3,39 (m, 1H); 3,48 (q, 4H); 3,91–4,17 (m, 1H); 4,20–4,37 (m, 1H); 5,02 (s, 4H); 7,98 (s, 1H) ppm 2. frakce (směs): 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,04–1,17 (m, 11H); 1,46 (s, 10H); 1,71-1,91 (m, 3H); 1,92–2,04 (m, 2H); 2,10–2,23 (m, 1H); 2,68–2,92 (m, 2H); 2,98–3,16 (m, 1H); 3,27-3,42 (m, 4H); 3,51 (q, 4H); 3,97 (m, 5H); 4,15–4,41 (m, 2H); 4,50–4,71 (m, 3H); 5,06 (s, 4H); 6,82–6,97 (m, 2H); 7,62 (s, 1H); 7,87 (s, 1H); 7,95 (s, 1H); 8,01 (s, 1H); 8,14 (s, 1H) ppm

47

3. frakce (5a): 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,09 (t, 6H); 1,46 (s, 10H); 1,58–1,75 (m, 2H); 1,76–1,89 (m, 2H); 1,92–2,11 (m, 2H); 2,67–3,19 (m, 4H); 3,28–3,44 (m, 4H); 3,97 (s, 3H); 4,04–4,29 (m, 3H); 4,54–4,68 (m, 4H); 6,80–7,00 (m, 1H); 7,62 (s, 2H); 8,01 (s, 1H) ppm 4. frakce (25): 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,10 (t, 6H); 1,44 (s, 13H); 1,60–1,80 (m, 3H); 1,80–2,04 (m, 4H); 2,10–2,29 (m, 1H); 2,66–3,08 (m, 3H); 3,39 (m, 4H); 3,98 (s, 6H); 4,04-4,25 (m, 3H); 4,56–4,75 (m, 4H); 7,63 (s, 2H); 7,91 (s, 1H); 7,99 (s, 1H); 8,16 (s, 1H) ppm  terc-butyl-3-(7-(terc-butoxykarbonylamino)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5yl)piperidin-1-karboxylát (26)

Aminopyrazolo[1,5-a]pyrimidin 18 (125 mg; 0,394 mmol) byl v 25ml

baňce

pod

atmosférou

N2

rozpuštěn

v suchém

1,2-dichlorethanu (5 ml). K roztoku byl přidán DMAP (48 mg; 0,395 mmol) a Boc2O (94 mg; 0,431 mmol) a světle ţlutá směs byla míchána pod N2 za laboratorní teploty 90 minut. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 2:1). Poté byla směs nalita na nasycený roztok NaHCO3 (30 ml) a produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 15ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 4:1). Produkt 26 byl získán jako bílá pevná látka (126 mg; 77 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,44 (s, 11H); 1,55 (s, 12H); 1,65–2,17 (m, 5H); 2,59–3,19

(m, 4H); 3,94–4,47 (m, 2H); 6,52 (d, 1H); 7,33 (s, 1H); 7,98 (d, 1H); 8,57 (brs, 1H, NH) ppm 13

C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 25,33, 28,31; 28,67; 30,92; 45,26; 77,43; 79,73; 83,48; 92,15;

96,41; 140,58; 143,98; 148,74; 150,82; 155,02; 164,68 ppm

48

 terc-butyl-3-(7-(terc-butoxykarbonylamino)-3-jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5yl)piperidin-1-karboxylát (27) 7 V 10ml baňce byla sloučenina 26 (126 mg; 0,302 mmol) rozpuštěna v suchém acetonitrilu

(2,5 ml)

a baňka byla

propláchnuta dusíkem. Přes septum byl přidán roztok NIS (68 mg; 0,302 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Baňka se světle ţlutou reakční směsí byla obalena alobalem a byla míchána pod N2 za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 35:1). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 30:1). Produkt 27 byl získán jako bílá pevná látka (135 mg; 82 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,45 (s, 13H); 1,55 (s, 11H); 1,69–1,87 (m, 3H); 2,70–2,96

(m, 3H); 3,01–3,23 (m, 1H); 4,03–4,40 (m, 3H); 7,38 (s, 1H); 8,00 (s, 1H); 8,48 (brs, 1H, NH) ppm  terc-butyl-3-(6-brom-7-(terc-butoxykarbonylamino)-3-jodpyrazolo[1,5a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (28) Metoda A: 7 Do 10ml baňky byla naváţena výchozí látka 27 (60 mg; 0,111 mmol) a byla rozpuštěn v suchém acetonitrilu (2 ml). Směs byla míchána pod atmosférou N2. Přes septum byl přikapán roztok NBS (20 mg; 0,111 mmol) v suchém acetonitrilu (1 ml). Naţloutlá směs byla dále míchána za laboratorní teploty po dobu 24 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 30:1). V reakční směsi zůstávala výchozí látka, přesto byla reakce ukončena. Rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO a pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 20:1). Produkt 28 však nebyl získán v dostatečné čistotě (dle 1H NMR).

49

Metoda B: 7 V 25ml baňce byla vytvořena směs sloučeniny 27 (74 mg; 0,135 mmol), terc-butylaminu (1 ml; 9,57 mmol) a suchého dichlormethanu (2 ml). Roztok byl míchán pod atmosférou N2 a přes septum k němu byl pomalu přikapán roztok Br2 (6 μl; 0,117 mmol) v suchém dichlormethanu (1 ml). Naţloutlý roztok byl míchán za laboratorní teploty 2 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/EtOAc 30:1). Poté bylo rozpouštědlo odpařeno na RVO a neodpařený pevný zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 20:1). Produkt 28 byl získán jako ţlutá pevná látka (61 mg; 85 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,45 (s, 15H); 1,53 (s, 16H); 1,58–1,68 (m, 1H); 1,71–1,91

(m, 3H); 2,06–2,20 (m, 2H); 2,69–2,89 (m, 1H); 3,07–3,21 (m, 2H); 3,27–3,46 (m, 2H); 4,16-4,37 (m, 2H); (brs, 1H, NH); 7,96–8,04 (m, 1H) ppm 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,38 (s, 11H); 1,43 (s, 11H); 1,50–1,68 (m, 1H); 1,72–1,98

(m, 3H); 2,71–3,08 (m, 2H); 3,75–4,04 (m, 2H); 4,07–4,41 (m, 1H); 8,18–8,45 (m, 1H); 10,35 (brs, 1H, NH) ppm  terc-butyl-3-(6-brom-7-(terc-butoxykarbonyl(ethoxymethyl)amino)-3jodpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (4b) 7 Do 10ml baňky

byla naváţena výchozí látka 28 (připravená

metodou B, 61 mg; 98,7 μmol) a baňka byla propláchnuta dusíkem. Přes septum byl poté přidán suchý 1,2-dichlorethan (3 ml), DIPEA (57 μl; 0,345 mmol) a chlormethyl(ethyl)ether (16 μl; 0,172 mmol). Ţlutá směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 po dobu

17 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC

(CH2Cl2/EtOAc 30:1). Poté byla směs nalita na nasycený roztok NaHCO3 (20 ml). Produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 15 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/EtOAc 30:1 aţ 20:1). Produkt 4b byl získán jako ţlutá pevná látka (58 mg; 87 %).

50

1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,11 (t, 3H); 1,30 (s, 9H); 1,46 (s, 12H); 1,62–1,92 (m, 3H);

2,04–2,26 (m, 1H); 2,67–2,91 (m, 1H); 3,02–3,23 (m, 1H); 3,30–3,43 (m, 1H); 3,82 (q, 2H); 4,16–4,44 (m, 2H); 5,17–5,32 (m, 2H); 7,94-8,09 (m, 1H) ppm  terc-butyl-3-(6-brom-7-(terc-butoxykarbonyl(ethoxymethyl)amino)-3-(1-methyl1H-pyrazol-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-5-yl)piperidin-1-karboxylát (5b)7 Do suché, dusíkem naplněné 25ml baňky byl k sloučenině 4b (53 mg; 77,9 μmol) naváţen 1-methyl-4-(4,4,5,5-tetramethyl1,3,2-dioxaborolan-2-yl)-1H-pyrazol (17 mg; 80,2 μmol), katalyzátor [PdCl2(dppf)]CH2Cl2 (6 mg; 7,9 μmol) a K3PO4 (70 mg; 0,330 mmol). Baňka byla řádně propláchnuta dusíkem a přes septum byl přidán 1,2-dimethoxyethan (4 ml) a voda (0,8 ml). Tmavě oranţová směs byla míchána a refluxována pod zpětným chladičem pod atmosférou N2 22 hodin. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (EtOAc/CH2Cl2 2:1), dle něhoţ bylo zjištěno, ţe v reakci zůstává výchozí látka. Reakce byla přesto ukončena. Rozpouštědla byla odpařena na RVO a zahuštěný zbytek byl nalit na vodu. Produkt byl v dělicí nálevce extrahován do dichlormethanu (3x 10 ml). Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (EtOAc/CH2Cl2 2:1). Produkt 5b byl získán jako ţlutá olejovitá látka (24 mg; 50 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,13 (t, 3H); 1,31 (s, 7H); 1,46 (s, 11H); 1,73–1,90 (m, 2H);

2,10–2,25 (m, 1H); 2,68–2,87 (m, 1H); 3,03–3,18 (m, 1H); 3,26–3,43 (m, 1H); 3,77–3,89 (m, 2H); 3,98 (s, 3H); 4,15-4,48 (m, 2H); 5,16-5,38 (m, 2H); 7,83–7,89 (m, 1H); 7,92–8,01 (m, 1H); 8,11–8,19 (m, 1H) ppm

51

 5-(1-benzylpiperidin-3-yl)-3-(1-methyl-1H-pyrazol-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin7-amin (29) Do 25ml baňky byl naváţen pyrazolo[1,5-a]pyrimidin 12f (60 mg; 0,201 mmol) a byl rozpuštěn v methanolu (5 ml). Baňka byla propláchnuta dusíkem a přes septum byl přidán benzaldehyd (21 μl; 0,207 mmol). Směs byla míchána pod atmosférou N2 za laboratorní teploty 40 minut.

Poté byl

přidán NaBH3CN (13 mg; 0,204 mmol) a směs byla pod N2 míchána další 2 hodiny. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC (CH2Cl2/MeOH 10:1). Poté byla směs nalita na vodu (POZOR! Vznik kyanovodíku) a produkt byl v dělicí nálevce extrahován do ethyl-acetátu. Organická fáze byla oddělena, vysušena nad pevným MgSO4, zfiltrována a rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO. Olejovitý zbytek byl čištěn kolonovou chromatografií (CH2Cl2/MeOH 10:1). Produkt 29 byl získán jak světle hnědá pevná látka (49 mg, 63 %). 1

H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1,11–1,38 (m, 4H); 1,51–1,70 (m, 2H); 1,77–1,93 (m, 3H);

1,94–2,11 (m, 2H); 2,14–2,28 (m, 1H); 2,40–2,63 (m, 1H); 2,96–3,16 (m, 3H); 3,17–3,33 (m, 1H); 3,72 (s, 2H); 3,95 (s, 3H); 5,78 (brs, 2H, NH2); 5,95 (s, 1H); 7,26-7,42 (m, 6H); 7,88 (s, 1H); 7,92 (s, 1H); 8,09 (s, 1H) ppm 13

C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 24,75; 29,92; 39,18; 43,90; 53,60; 58,21; 63,20; 87,29;

101,88; 114,02; 126,85; 128,07; 128,72; 130,02; 136,76; 141,04; 144,99; 146,80; 163,33 ppm  5-(piperidin-3-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-amin (12a) V 10ml baňce byl aminopyrazolo[1,5-a]pyrimidin 18

(96 mg;

0,303 mmol) rozpuštěn v suchém dichlormethanu (1,6 ml). Baňka byla propláchnuta dusíkem a přes septum do ní byla přikapána TFA (1,6 ml). Čirá směs byla míchána za laboratorní teploty po dobu 1 hodiny.

Průběh

reakce

byl

sledován

pomocí

TLC

(CH2Cl2/MeOH 20:1). Rozpouštědlo bylo odpařeno, zbytek TFA byl odpařen společně s toluenem. Suchý produkt byl rozpuštěn v MeOH a byl neutralizován pomocí pevného

52

Na2CO3. Tato surová heterogenní směs byla podrobena chromatografii (CH2Cl2/7M roztok NH3 v MeOH 8:1). Produkt 12a byl získán jako bílá pevná látka (40 mg; 61 %). 1

H NMR (300 MHz, DMSO): δ 1,37–1,56 (m, 1H); 1,57–1,77 (m, 3H); 1,85–2,03 (m, 1H);

2,58–2,74 (m, 2H); 2,83–3,00 (m, 1H); 3,00–3,14 (m, 1H); 3,17–3,36 (m, 6H); 5,97 (s, 1H); 6,27 (d, 1H); 7,50 (brs, 2H, NH2); 8,00 (d, 1H) ppm

53

5. ZÁVĚR Byla zpracována literární rešerše o CHK1 kináze, její funkci a jejích inhibitorech. Důraz byl kladen na inhibitory vycházející ze struktury pyrazolo[1,5-a]pyrimidinu. Dva inhibitory na této bázi byly syntetizovány podle známé procedury. Racemická forma inhibitoru SCH 900776 (3) byla připravena v 11 krocích s celkovým výtěţkem 8 %. Strukturně podobný inhibitor 6c byl syntetizován v 8 krocích s celkovým výtěţkem 5 %. S vyuţitím HPLC s chirální stacionární fází byly odděleny enantiomery finálního produktu 3. Vedle této látky byly testovány moţnosti dělení dalších sloučenin. Byly zkoumány moţnosti kombinatoriální Suzukiho reakce. Volbou vhodné chránicí skupiny pro aminoskupinu v poloze 7 se nám podařilo dosáhnout poměrně dobré selektivity první fáze Suzukiho reakce, která probíhala z velké většiny v poloze 3. Synergické působení inhibitoru 3 společně s doprovodným cytostatikem bylo potvrzeno při biologickém testování. V budoucnu bychom se chtěli zaměřit na další optimalizaci selektivity Suzukiho reakce na dihalogenovaném substrátu a v případě úspěchu aplikovat tuto metodiku i na jiné systémy. Dalším plánem je syntéza analogu inhibitoru 3, kde by volná methylová skupina byla nahrazena CF3 skupinou, čímţ bychom se vyvarovali moţnosti metabolické oxidace methyl skupiny.

54

6. LITERATURA 1.

Gambacorti-Passerini, C. Lancet Oncol. 2008, 9, 600.

2.

Thurston, D. E. Chemistry and Pharmacology of Anticancer Drugs, CRC Press: United States of America, 2007.

3.

Xiao, Z.; Xue, J.; Semizarov, D.; Sowin, T. J.; Rosenberg, S. H.; Zhang, H. Int. J. Cancer 2005, 115, 528.

4.

Guzi, T. J.; Paruch, K.; Dwyer, M. P.; Labroli, M.; Shanahan, F.; Davis, N.; Taricani, L.; Wiswell, D.; Seghezzi, W.; Penaflor, E.; Bhagwat, B.; Wang, W.; Gu, D. L.; Hsieh, Y. H.; Lee, S.; Liu, M.; Parry, D. Mol. Cancer Ther. 2011, 10, 591.

5.

Dwyer, M. P.; Paruch, K.; Labroli, M.; Alvarez, C.; Keertikar, K. M.; Poker, C.; Rossman, R.; Fischmann, T. O.; Duca, J. S.; Madison, V.; Parry, D.; Davis, N.; Seghezzi, W.; Wiswell, D.; Guzi, T. J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 467.

6.

Labroli, M.; Paruch, K.; Dwyer, M. P.; Alvarez, C.; Keertikar, K. M.; Poker, C.; Rossman, R.; Duca, J. S.; Fischmann, T. O.; Madison, V.; Parry, D.; Davis, N.; Seghezzi, W.; Wiswell, D.; Guzi, T. J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 471.

7.

Paruch, K.; Guzi, T. J.; Dwyer, M. P.; Alvarez, C. S. WO 2007/041712 A1, 2007.

8.

Matthews, D. J.; Gerritsen, M. E. Targeting Protein Kinases for Cancer Therapy, John Wiley & Sons: United States of America, 2010.

9.

Manning, G.; Whyte, D. B.; Martinez, R.; Hunter, T.; Sudarsanam, S. Science 2002, 298, 1912.

10.

Cooper, G. M. The Cell: A Molecular Approach, ASM Press: United States of America, 1997.

11.

Watson, J. D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M.; Losick, R. Molecular Biology of the Gene, 5th ed., CSHL Press: United States of America, 2004.

12.

Elledge, S. J. Science 1996, 274, 1664.

13.

Alberts, B.; Johnson, A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. Molecular Biology of the Cell, 4th ed., Garland Science: United States of America, 2002.

14.

Schmitt, E.; Boutros, R.; Froment, C.; Monsarrat, B.; Ducommun, B.; Dozier, C. J. Cell Sci. 2006, 119, 4269.

15.

Takai, H.; Tominaga, K.; Motoyama, N.; Minamishima, Y. A.; Nagahama, H.; Tsukiyama, T.; Ikeda, K.; Nakayama, K.; Nakanishi, M.; Nakayama, K. Genes Dev. 2000, 14, 1439.

55

16.

Savitsky, K.; Bar-Shira, A.; Gilad, S.; Rotman, G.; Ziv, Y.; Vanagaite, L.; Tagle, D. A.; Smith, S.; Uziel, T.; Sfez, S.; Ashkenazi, M.; Pecker, I.; Frydman, M.; Harnik, R.; Patanjali, S. R.; Simmons, A.; Clines, G. A.; Sartiel, A.; Gatti, R. A.; Chessa, L.; Sanal, O.; Lavin, M. F.; Jaspers, G. J.; Taylor, A. M. R.; Arlett, C. F.; Miki, T.; Weissman, S. M.; Lovett, M.; Collins, F. S.; Shiloh, Y. Science 1995, 268, 1749.

17.

Karlsson-Rosenthal, C.; Millar, B. A. Trends Cell Biol. 2006, 16, 285.

18.

Sagata, N. Science 2002, 298, 1905.

19.

Al-Ejeh, F.; Kumar, R.; Wiegmans, A.; Lakhani, S. R.; Brown, M. P.; Khanna, K. K. Oncogene 2010, 29, 6085.

20.

Hurley, L. H. Nat. Rev. Cancer 2002, 2, 188.

21.

Feng, Z. Z.; Xu, S. B.; Liu, M. Z.; Zeng, Y. X.; Kang, T. Cancer Lett. 2010, 297, 190.

22.

Cole, K. A.; Huggins, J.; Laquaglia, M.; Hulderman, C. E.; Russell, M. R.; Bosse, K.; Diskin, S. J.; Attiyeh, E. F.; Sennett, R.; Norris, G.; Laudenslager, M.; Wood, A. C.; Mayes, P. A.; Jagannathan, J.; Winter, C.; Mosse, Y. P.; Maris, J. M. P. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 3336.

23.

Cho, S. H.; Toouli, C.D.; Fujii, G. H.; Crain, C.; Parry, D. Cell Cycle 2005, 4, 131.

24.

Zhou, B. B. S.; Bartek, J. Nat. Rev. Cancer 2004, 4, 216.

25.

Knighton, D. R.; Zheng, J. H.; Ten Eyck, L. F.; Ashford, V. A.; Xuong, N. H.; Taylor, S. S.; Sowadski, J. M. Science 1991, 253, 407.

26.

Zhao, L. Y.; Zhang, Y. X.; Dai, C. Y.; Guzi, T.; Wiswell, D.; Seghezzi, W.; Parry, D.; Fischmann, T.; Siddiqui, M. A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 7216.

27.

Oza, V.; Ashwell, S.; Brassil, P.; Breed, J.; Deng, C.; Ezhuthachan, J.; Haye, H.; Horn, C.; Janetka, J.; Lyne, P.; Newcombe, N.; Otterbien, L.; Pass, M.; Read, J.; Roswell, S.; Su, M.; Toader, D.; Yu, D. W.; Yu, Y.; Valentine, A.; Webborn, P.; White, A.; Zabludoff, S.; Zheng, X. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 5133.

28.

Matthews, T. P.; McHardy, T.; Klair, S.; Bodalo, K.; Fischer, M.; Cherry, M.; Allen, C. E.; Addison, G. J.; Ellard, J.; Wynne Aherne, G.; Westwood, I. M.; Van Montfort, R.; Garrett. M. D.; Reader, J. C.; Collins, I. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 4045.

29.

Janetka, J. W.; Almeida, L.; Ashwell, S.; Brassil, P. J.; Daly, K.; Deng, C.; Gero, T.; Glynn, R. E.; Horn, C. L.; Ioannidis, S.; Lyne, P.; Newcombe, N. J.; Oza, V. B.; Pass, M.; Springer, S. K.; Su, M.; Toader, D.; Vasbnder M. M.; Yu, D. W.; Yu, Y.; Zabludoff, S. D. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18, 4242.

30.

Oikawa, Y.; Sugano, K.; Yonemitsu, O. J. Org. Chem. 1978, 43, 2087. 56

31.

Suzuki, A. J. Organomet. Chem. 1999, 576, 147.

32.

Kotha, S.; Lahiri, K.; Kashinath, D. Tetrahedron 2002, 58, 9633.

33.

Williams, D. B. G.; Lawton, M. J. Org. Chem. 2010, 75, 8351.

57

7. SEZNAM ZKRATEK Význam mnohých zkratek vychází z anglických výrazů, které někdy nemají český ekvivalent, nebo se jejich český překlad uţívá jen velmi zřídka. V takových případech je v seznamu zkratek ponecháno anglické slovní spojení.

Ac

acetyl

ADP

adenosindifosfát

APCI

chemická ionizace za atmosferického tlaku (atmosphericpressure chemical ionization)

ATM

ataxia telangiectasia-mutated

ATP

adenosintrifosfát

ATR

ataxia telangiectasia and Rad3-related protein

Boc

terc-butoxykarbonyl

Boc2O

di-terc-butyldikarbonát, Boc-anhydrid

Bu

butyl

CAMK

calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase

CD

cirkulární dichroismus

CDC25C

Cell division cycle 25

CDK

(cyklin dependentní kináza) cyclin-dependent kinase

CK1

casein kinase 1

CLL

chronická lymfocytární leukémie

DEA

diethylamin

DIPEA

N,N-diisopropylethylamin

DMAP

4-dimethylaminopyridin

DME

1,2-dimethoxyethan

DMF

dimethylformamid

DMSO

dimethylsulfoxid

DMSO-d6

deuterovaný dimethylsulfoxid

DNA

deoxyribonukleová kyselina

dppf

1,1'-bis(difenylfosfino)ferrocen

ESI

ionizace elektrosprejem (electrospray ionization)

Et

ethyl

58

FTIR

infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací

HPLC

vysokoúčinná (vysokotlaká) kapalinová chromatografie

HRMS

vysoce rozlišená hmotnostní spektrometrie (high-resolution mass spectrometry)

CHK1

checkpoint kinase 1

IC50

half maximal inhibitory concentration

IČ

infračervená spektroskopie

i-Pr

isopropyl

lab. t.

laboratorní teplota

LC

kapalinová chromatografie

Me

methyl

MS

hmotnostní spektrometrie

N,N-DMA

N,N-dimethylanilin

NBS

N-bromsukcinimid

NIS

N-jodsukcinimid

NMR

nukleární magnetická rezonance

PDB

proteinová databáze (protein data bank)

PG

chránicí skupina (protecting group)

Ph

fenyl

Pr

propyl

RVO

rotační vakuová odparka

SAR

structure-activity relationship

SEMCl

2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl chlorid

TEA

triethylamin

TFA

kyselina trifluoroctová

TK

tyrosine kinase

TKL

tyrosine kinase-like

TLC

tenkovrstevná chromatografie

TM

obchodní značka (trade mark)

TOF

time of flight

UV

ultrafialové záření

59

široký singlet – broad singlet (multiplicita signálu v NMR

brs

spektru) d

dublet (multiplicita signálu v NMR spektru)

m

multiplet (multiplicita signálu v NMR spektru)

q

kvartet (multiplicita signálu v NMR spektru)

s

singlet (multiplicita signálu v NMR spektru)

t

triplet (multiplicita signálu v NMR spektru) V textu uvedené výrazy AGC, CMGC, MEC-1, RGC a STE mají charakter názvu a proto nejsou

v seznamu uvedeny.

60

8. PŘÍLOHA

Spektrum 1: 1H NMR ketoesteru 15 v CDCl3

Spektrum 2: 1H NMR derivátu 16 v CDCl3

61

Spektrum 3: 1H NMR chlorderivátu 17 v CDCl3

Spektrum 4: 1H NMR aminoderivátu 18 v CDCl3

62

Spektrum 5: 1H NMR látky 19 v CDCl3

Spektrum 6: 13C NMR látky 19 v CDCl3

63

Spektrum 7: 1H NMR jodderivátu 2 v CDCl3

Spektrum 8: 1H NMR látky 20 v CDCl3

64

Spektrum 9: 1H NMR sloučeniny 12f v DMSO-d6

Spektrum 10: 1H NMR látky 21 v CDCl3

65

Spektrum 11: 1H NMR látky 22 v CDCl3

Spektrum 12: 1H NMR finálního produktu 3 v CDCl3

66

Spektrum 13: 1H NMR finálního produktu 3 v DMSO-d6

Spektrum 14: 13C NMR finálního produktu 3 v DMSO-d6 s detailem signálu na 38,53 ppm poblíţ signálu rozpouštědla

67

Spektrum 15: 1H NMR dibromderivátu 23 v CDCl3

Spektrum 16: 1H NMR sloučeniny 24 v CDCl3

68

Spektrum 17: 1H NMR látky 25 v CDCl3

Spektrum 18: 1H NMR finálního produktu 6c v DMSO-d6

69

Spektrum 19: 1H NMR sloučeniny 26 v CDCl3

Spektrum 20: 13C NMR sloučeniny 26 v CDCl3

70

Spektrum 21: 1H NMR látky 27 v CDCl3

Spektrum 22: 1H NMR aromatické oblasti znečištěné látky 28 (připravené bromací pomocí NBS) v CDCl3

71

Spektrum 23: 1H NMR sloučeniny 28 (připravené bromací pomocí Br2) v CDCl3 s detailem signálů kolem 8 ppm

Spektrum 24: 1H NMR sloučeniny 28 (připravené bromací pomocí Br2) v DMSO-d6 s detailem signálů kolem 8,3 ppm 72

Spektrum 25: 1H NMR sloučeniny 4b v CDCl3 s detailem signálů kolem 8 ppm

Spektrum 26: 1H NMR látky 5b v CDCl3

73

Spektrum 27: 1H NMR alternativně připraveného finálního produktu 3 v DMSO-d6

Spektrum 28: 13C NMR alternativně připraveného finálního produktu 3 v DMSO-d6 s detailem signálu na 38,55 ppm poblíţ signálu rozpouštědla

74

Spektrum 29: 1H NMR benzylderivátu 29 v CDCl3

Spektrum 30: 13C NMR benzylderivátu 29 v CDCl3

75

Spektrum 31: 1H NMR aminu 12a v DMSO-d6

76