SUSPENZNÍ KULTURA TABÁKU JAKO MODELOVÝ SYSTÉM PRO STUDIUM STRESOVÉ REAKCE ROSTLIN

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE A BIOCHEMIE

SUSPENZNÍ KULTURA TABÁKU JAKO MODELOVÝ SYSTÉM PRO STUDIUM STRESOVÉ REAKCE ROSTLIN Bakalářská práce

BRNO 2006

Vedoucí bakalářské práce:

Vypracovala:

doc. Ing. Josef Zehnálek, CSc.

Dagmar Buchtová

3

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Suspenzní kultura tabáku jako modelový systém pro studium stresové reakce rostlin“ vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Brně, dne...................

Podpis……………………

4

Poděkování

Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucímu bakalářské práce doc. Ing. Josefu Zehnálkovi, CSc. za cenné rady a užitečné připomínky, školiteli Ing. René Kizkovi, Ph.D. za odborné vedení, školiteli–specialistovi Mgr. Janu Vítečkovi za odborné konzultace a pomoc při mé experimentální i teoretické práci, konzultantovi prof. RNDr. Ladislavu Havlovi, CSc. za přínosné podněty.

5

ANNOTATION Numbers of stress factors of both abiotic and biotic origin can affect markedly organisms. These different kinds of stresses could lead to decrease of life-sustaining functions, to damage of organs, to marked changes in metabolism and, moreover, to death of plants. Heavy metals belong to crucial and topically abiotic factors. Due to anthropogenic activities they tend to accumulate in soil, where are up-taken by plant roots. Therefore, heavy metals could influence whole food chain and influence higher organisms. Allelopathy, which belongs to biotic stresses, is based on mutual influencing of plants through synthesis of secondary metabolites such as naphthoquinones. These compounds could affect inhibitive and toxic other plants. We investigated influence of different concentrations of cadmium, lead, zinc and 1,4naphthoquinone on suspension of BY-2 tobacco cell through determination of viability, esterase and oxido-reductase activity and electrochemical detection of changes of thiols content. We observed decrease of viability and enzymes activity at all heavy metals of interest in comparison with control plants. Lead caused the highest decrease in viability and zinc ions the lowest. In addition, oxido-reductase activity was mostly decreased by lead, following zinc and cadmium. Lead also caused the highest decrease in esterase activity. Effect of zinc and cadmium on esterase activity was similar. Viability decreased more than 70 % and esterase and oxido-reductase activity was four times lower in comparison with control, when we treated BY-2 tobacco cells by lead (500 µM). The same concentration of cadmium caused decrease in viability about 65 %, activity of esterases decreased four times and activity of oxido-reductase three times in comparison with control. The viability and oxido-reductase activity of BY-2 tobacco cells treated by zinc (500 µM) decreased more than 60 % after 96 h long treatment, esterase activity decreased four times in comparison with control samples. LC50 was estimated for the heavy metals of interest, particularly, LC50 for lead was 52.6 µM, for cadmium 52.5 µM and for zinc 65 µM. The highest changes in content of thiols were caused by cadmium followed by lead and zinc. 1,4-Naphthoquinone did not cause decrease viability of BY-2 tobacco cells except the highest tested concentration (6 µM). This concentration decreased oxido-reductase activity from 7 % in the beginning experiment to 45 % in the end.

6

OBSAH 1. ÚVOD..............................................................................................................................11 2. LITERÁRNÍ PŘEHLED .................................................................................................12 2.1. Stresové faktory, stres, stresová reakce ....................................................................12 2.2. Společné mechanismy stresových reakcí..................................................................14 2.2.1. Tvorba stresových proteinů ...............................................................................15 2.2.2. Tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku ................................................16 2.2.3. Tvorba stresových fytohormonů ........................................................................17 2.3. Stresové faktory rostlin a možnosti jejich studia ......................................................17 2.4. Těžké kovy................................................................................................................20 2.4.1. Zinek ..................................................................................................................22 2.4.2. Kadmium ...........................................................................................................22 2.4.3. Olovo .................................................................................................................23 2.4.4. Příjem a transport těžkých kovů v rostlině ........................................................24 2.4.5. Vliv těžkých kovů na rostliny............................................................................27 2.4.6. Obranné mechanismy rostlin proti působení těžkých kovů...............................28 2.5. Biotické faktory ........................................................................................................30 2.5.1. Alelopatie...........................................................................................................30 2.5.2. Naftochinony .....................................................................................................31 3. CÍLE PRÁCE...................................................................................................................32 4. MATERIÁL A METODY...............................................................................................33 4.1. Rostlinný materiál.....................................................................................................33 4.1.1. Příprava vzorků pro stanovení účinků těžkých kovů.........................................33 4.1.2. Příprava vzorků pro stanovení účinků 1,4-naftochinonu...................................34 4.2. Chemikálie a přístroje...............................................................................................35 4.3. Analytické metody....................................................................................................36 4.3.1. Stanovení viability buněk a toxické koncentrace těžkých kovů ........................36 4.3.2. Stanovení oxidoreduktázové aktivity.................................................................37 4.3.3. Stanovení aktivity intracelulárních esteráz ........................................................37 4.3.4. Elektrochemické stanovení změn obsahu thiolových sloučenin........................39 4.3.4.1. Příprava vzorků...........................................................................................39 4.3.4.2. Stanovení thiolů ..........................................................................................40 5. VÝSLEDKY A DISKUZE..............................................................................................41 5.1. Studium vlivu těžkých kovů na suspenzní kulturu tabáku .......................................41 5.1.1. Stanovení vlivu těžkých kovů na viabilitu buněk ..............................................41 5.1.2. Určení toxicity těžkých kovů dle výpočtu LC50 ................................................42 5.1.2. Stanovení oxidoreduktázové aktivity.................................................................45 5.1.3. Stanovení aktivity intracelulárních esteráz ........................................................49 5.1.4. Vliv těžkých kovů na změny obsahu thiolových látek v suspenzní kultuře ......52 tabáku...........................................................................................................................52 5.2. Sledování účinku 1,4-naftochinonu na suspenzní kulturu tabáku ............................56 5.2.1. Stanovení viability buněk ..................................................................................56 5.2.2. Stanovení oxidoreduktázové aktivity.................................................................57 6. ZÁVĚR ............................................................................................................................59 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .............................................................................60

7

SEZNAM OBRÁZKU A TABULEK

Obr. 1.

Schéma průběhu stresové reakce..................................................................... 13

Obr. 2.

Růstová křivka buněčné suspenze................................................................... 19

Obr. 3.

Mechanizmus příjmu, transportu, distribuce a detoxikace kovů u vyšších rostlin................................................................................................ 26

Obr. 4.

Erlenmeyerova baňka s buněčnou suspenzí tabáku linie BY-2....................... 33

Obr. 5.

Buňky suspenze obarvené fluoresceindiacetátem (zelené) a propidium jodidem (červené)........................................................................ 36

Obr. 6.

Schéma hydrolýzy fluoresceindiacetátu katalyzované esterázami.................. 38

Obr. 7.

Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku............................................................................... 41

Obr. 8.

Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku .............................................................................. 42

Obr. 9.

Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku ............................................................................. 42

Obr. 10.

Vliv koncentrace těžkých kovů na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace.................................................. 43

Obr. 11.

Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace kadmia v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace.................................................................................. 44

Obr. 12.

Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace olova v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace.................................................................................. 44

Obr. 13.

Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace zinku v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace.................................................................................. 45

Obr. 14.

Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku........................... 46

Obr. 15.

Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku........................... 46

Obr. 16.

Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku........................... 47

8

Obr. 17.

Vliv 100 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku........................... 47

Obr. 18.

Vliv 500 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku........................... 48

Obr. 19.

Vliv koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku po 96 h kultivace........... 48

Obr. 20.

Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku......................... 49

Obr. 21.

Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku......................... 50

Obr. 22.

Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku......................... 50

Obr. 23.

Vliv 500 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku............. 51

Obr. 24.

Vliv koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu intracelulárních esteráz po 96 h kultivace........................................................ 51

Obr. 25.

Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 53

Obr. 26.

Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 54

Obr. 27.

Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 55

Obr. 28.

Vliv 1,4-naftochinonu na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku............. 57

Obr. 29.

Vliv 1,4-naftochinonu na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku................................................................ 58

Tab. 1.

Přehled nejdůležitějších stresových faktorů..................................................... 12

Tab. 2.

Příklady esenciálních kovů a jejich funkcí....................................................... 21

Tab. 3.

Varianty pokusů s těžkými kovy a jejich koncentrace..................................... 34

Tab. 4.

Varianty pokusu s 1,4-naftochinonem a jeho koncentrace.............................. 34

Tab. 5.

Příprava reakčních směsí pro stanovení esterázové aktivity........................... 39

Tab. 6.

Vliv koncentrace těžkých kovů na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace.................................................. 43

9

Tab. 7.

Inverzní hodnoty viability buněk vztažené k daným inverzním hodnotám koncentrace těžkých kovů po 96 h kultivace.................................. 44

Tab. 8.

Hodnoty LC50 u sledovaných těžkých kovů.................................................... 45

Tab. 9.

Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 52

Tab. 10.

Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 53

Tab. 11.

Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku.................................................... 54

Tab. 12.

Vliv 1,4-naftochinonu na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku............. 56

Tab. 13.

Vliv 1,4-naftochinonu na aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku................................................................................. 57

10

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

BY-2

suspenzní kultura tabáku (Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow)

DNA

deoxyribonukleová kyselina

DPV

diferenční pulzní voltametrie

DTT

dithiotreitol

EDTA

kyselina ethylendiaminotetraoctová

FDA

fluoresceindiacetát

GSH

redukovaný glutathion

MS-medium

Murashige Skoog medium

MTT

methylthiazolyltetrazolium-bromid

PC

fytochelatiny

PC-syntetáza

fytochelatin syntetáza

PI

propidium jodid

RNA

ribonukleová kyselina

ROS

aktivní formy kyslíku (z angl. reactive oxygen species)

11

1. ÚVOD

V přírodě jsou rostliny vystavovány mnoha nepříznivým vlivům abiotické i biotické povahy. Abiotické faktory zahrnující klimatické a chemické vlivy vytvářejí odlišné podmínky pro živé systémy. Faktory biotické povahy vyplývají z přítomnosti dalších organismů v daném prostředí a jejich vzájemného střetávání. Působením stresu se zpomalují životní funkce, odumírají jednotlivé orgány a v krajním případě i celá rostlina. Mezi abiotickými stresovými faktory mají důležité postavení těžké kovy s výrazně inhibičními až toxickými účinky. Jejich rostoucí obsah v prostředí je spojen hlavně s antropogenní činností. Biotický stres může představovat alelopatie, při níž jedna rostlina produkuje sekundární metabolity inhibující růst jiné. Problematika stresu u rostlin je v současnosti aktuálním tématem. Pro objasnění mechanizmu působení stresových faktorů na rostliny se často používají zjednodušené modelové systémy – buněčné suspenze, které vhodně doplňují studium stresu u celistvých rostlin.

12

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED

2.1. Stresové faktory, stres, stresová reakce

Rostliny jsou v průběhu svého života vystaveny velmi proměnlivým podmínkám vnějšího prostředí, které mohou zpomalovat jejich životní funkce, ale také poškozovat jednotlivé orgány a v krajním případě vést i k jejich uhynutí. Nepříznivé vlivy vnějšího prostředí závažně ohrožující rostlinu jsou označovány jako stresové faktory (stresory) (Tab. 1.). Termín stres je používán pro označení stavu, kdy vznikají odchylky faktorů prostředí od normy a zatěžují organizmus (Vodrážka, 2002). Jde o dynamický komplex mnoha reakcí (Procházka et al., 2003).

Tab. 1. Přehled nejdůležitějších stresových faktorů (upraveno podle (Procházka et al., 2003). Abiotické faktory Fyzikální mechanické účinky větru nadměrné záření (UV, viditelné) extrémní teploty (horko, chlad, mráz) Chemické nedostatek vody (vodní stres) nedostatek kyslíku (hypoxie, anoxie) nedostatek živin v půdě nadbytek iontů solí a vodíku v půdě toxické látky v prostředí Biotické faktory

herbivorní živočichové patogenní mikroorganismy (viry, mikrobi, houby) vzájemné ovlivňování (alelopatie, parazitismus)

Výzkum vztahů mezi vnějším prostředím a stresem v rostlinách obvykle začíná studiem přenosu podnětů vyvolávajících stres na rozhraní orgánů rostliny s vnějším prostředím a dále pak přenosem signálů uvnitř rostliny. Stresové faktory mohou v důsledku různě vyvinutých ochranných struktur pronikat do vnitřního prostředí rostlin různých druhů nestejně snadno. Tento způsob ochrany má převážně pasivní a dlouhodobý charakter (např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody

13

a snadno rozložitelných organických látek tlumící jejich nedostatek). Jde v podstatě o schopnost vyhnout se stresu (stress avoidance), k níž přispívají také vhodně načasované životní cykly (Procházka et al., 2003). Z fyziologického hlediska jsou však mnohem zajímavější mechanizmy aktivní odolnosti (stress tolerance), omezující negativní dopad stresorů až po jejich proniknutí k plazmatické membráně buněk a do symplastu. V takovém případě dochází ke spuštění řetězce změn, který bývá označován jako stresová reakce. Její schéma je uvedeno na obrázku 1. Bezprostředně po začátku působení stresového faktoru jsou narušeny buněčné struktury a funkce (poplachová fáze). Pokud intenzita působení stresoru nepřekračuje letální úroveň, dochází k mobilizaci kompenzačních mechanizmů (restituční fáze), které směřují ke zvýšení odolnosti rostliny vůči působícím faktorům (fáze rezistence). Ne vždy však toto zvýšení má trvalý charakter. Při dlouhodobém a intenzivním působení stresového faktoru může být vystřídáno dalším poklesem (fáze vyčerpání) (Procházka et al., 2003).

Schéma průběhu stresové reakce (LARCHER restituční fáze poplachová fáze otužování

maximální odolnost (rezistence)

fáze vyčerpání

+ odolnost normální stav

počátek stresu čas Obr. 1. Schéma průběhu stresové reakce (upraveno podle (Procházka et al., 2003).

Průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi, souhrnně označovaných jako adaptační schopnosti (Procházka et al., 2003).

14

Adaptace je realizována na třech úrovních: -

přizpůsobení podmíněná evolucí (vznik mutací, výměna genetického materiálu),

-

modifikační přizpůsobení (dlouhodobější aklimatizace na změny faktorů prostředí),

-

modulační přizpůsobení (adaptace na poměrně rychle se měnící podmínky na buněčné úrovni) (Vodrážka, 2002).

Zvýšení odolnosti a opětovné ustavení homeostáze bývá obvykle dosahováno jen za cenu jistých dodatečných energetických nákladů provázených snížením rychlosti tvorby biomasy. Změny struktur a funkcí rostliny vedoucí k nízké efektivitě získávání zdrojů mohou přetrvávat ještě hodně dlouho po návratu vnějších podmínek k optimu, někdy i po celý zbytek vegetačního období. Studium stresu u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách je mimo jiné komplikováno současným působením několika stresových faktorů (např. silné záření, vysoká teplota a nedostatek vody). Interakce mezi nimi mohou podstatně měnit charakter stresové reakce ve srovnání s působením každého faktoru odděleně. Působení stresorů bývá také často omezeno pouze na část rostliny, kde dochází k lokální stresové reakci, ale ta může druhotně způsobovat stres i v ostatních orgánech (Procházka et al., 2003).

2.2. Společné mechanismy stresových reakcí I přes mnoho výhrad k představě jediné obecné stresové reakce u rostlin existují jisté dílčí komplexy společných reakcí, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresům současně. K nejčastějším takovým společným změnám patří: - tvorba stresových proteinů, - tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku (Foyer a Noctor, 2000), - tvorba „stresových“ fytohormonů, - tvorba osmoregulačních sloučenin (cukrů, polyalkoholů a jednoduchých dusíkatých látek).

15

2.2.1. Tvorba stresových proteinů

Pod vlivem kteréhokoliv ze stresových faktorů (Tab. 1.) dochází často již během několika desítek minut k velmi dramatickým změnám v kvantitativním i kvalitativním zastoupení proteinů v buňkách. Tvorba některých prudce stoupá, u jiných se naopak zastavuje. V hojné míře se syntetizují proteiny, které se za normálních okolností vůbec nedají v buňkách zjistit. Z několika desítek proteinů, jejichž syntéza se působením určitého stresoru prudce zvyšuje (stresové proteiny), se jen jistá část pravidelně vyskytuje i u jiných typů stresů. Indukce zbývající části stresových proteinů je specificky vázána na určitý stresový faktor (Procházka et al., 2003). Tyto stresové proteiny mají velmi rozmanitou velikost i funkci. Je možné je rozdělit podle molekulové hmotnosti, která bývá nejčastěji v rozmezí od 8 000 do 260 000. Mnohem obtížnější je určit

jejich funkci. Většina z těch proteinů, jejichž tvorba je

indukována nespecificky, tedy různými typy stresorů, patří do některé z těchto funkčních skupin: - molekulární chaperony, - proteázy, - ubikvitin. Jedná se převážně o konstitutivní proteiny, které patří k pravidelné výbavě buněk všech genotypů a za stresu se jejich množství mnohonásobně zvyšuje. Jejich intenzivní tvorba souvisí se vzrůstem počtu poškozených proteinů v různých buněčných strukturách. Chaperony slouží nejen k řízení změn konformace proteinů při transportech přes membrány, ale jsou schopny upravit jejich konformaci i při mírném poškození. Pokud ovšem dojde k velkým, nenapravitelným změnám, je takový protein „označen“ malou molekulou ubikvitinu a rozložen pomocí proteáz na aminokyseliny. Ty jsou pak využity k syntéze nových proteinů (Procházka et al., 2003). Příklady skupin stresových proteinů se specificky indukovanou syntézou: - proteiny indukované zvýšenou teplotou, heat-shock proteins HSP (Vierling, 1991; Wang et al., 2003), - proteiny indukované chladem, cold-induced proteins (Thomashow, 1998), - proteiny indukované dehydratací, dehydration-induced proteins, - proteiny indukované sníženou koncentrací kyslíku, anaerobic stress proteins, ASP, - proteiny indukované patogeny, pathogenesis-related proteins, PRP.

16

2.2.2. Tvorba a odstraňování aktivních forem kyslíku Jako aktivní formy kyslíku (reactive oxygen species, ROS) označujeme všechny částečně redukované nebo aktivované deriváty kyslíku (Buchanan et al., 2002). - singletový kyslík, - superoxidový anion, - hydroxylový radikál, - perhydroxylový radikál, - peroxid vodíku. Za normálních růstových podmínek je produkce aktivních forem kyslíku v buňce nízká, ovšem působí-li na rostlinu stresové faktory, dochází k výraznému zvýšení jejich koncentrace (Mittler, 2002). Aktivní formy kyslíku hrají v biologických systémech dvojí roli: - slouží jako signální molekuly pro expresi genů - jako toxické meziprodukty aerobního metabolismu způsobují poškození či zánik buňky (Procházka et al., 2003). Reakcí ROS s nenasycenými mastnými kyselinami dochází k peroxidaci esenciálních membránových lipidů v plazmalemě nebo v intracelulárních organelách. Peroxidační poškození plazmalemy vede k úniku buněčného obsahu a k buněčné smrti (Delledonne et al., 2002). Intracelulární poškození membrány ovlivňuje respirační aktivitu mitochondrie, a způsobuje také ztrátu schopnosti chloroplastu fixovat oxid uhličitý (Scandalios, 1990). ROS mohou dále inaktivovat enzymy, oxidovat proteiny a poškozovat DNA a RNA.. V důsledku toho může nastat buněčná smrt (Delledonne et al., 2002). Zvýšená koncentrace ROS je charakteristická pro hypersenzitivní reakci rostlin (Delledonne et al., 2002). Rostliny jsou schopné se do jisté míry bránit působení ROS. Mechanizmy ochrany před oxidačním poškozením lze rozdělit do několika skupin. Přímou deaktivaci ROS umožňují karotenoidy, které velmi rychle odstraňují singletový kyslík z protein-pigmentových komplexů chloroplastů.V membránách se také vyskytuje lipofilní α-tokoferol (vitamín E), který chrání membránové lipidy před peroxidací (Procházka et al., 2003). Nejuniverzálnější ochranu před poškozením ROS ve všech částech buňky poskytují některé specializované enzymy. Patří k nim především superoxiddismutáza, která katalyzuje přeměnu superoxidu na peroxid vodíku, jež je dále rozkládán buď katalázou nebo askorbátperoxidázou (Bowler et al., 1992).

17

2.2.3. Tvorba stresových fytohormonů

Je výhodné, aby stresové reakce v jednotlivých buňkách probíhaly koordinovaně, a to i v okolí napadeného místa, což je zvláště důležité při mechanickém poranění rostliny či při pronikání patogenní houby. K šíření signálů na delší vzdálenosti využívají rostliny hlavně fytohormony. Kyselina abscisová a etylen patří ke „klasickým“ fytohormonům, jejichž zvýšená tvorba pravidelně provází působení většiny stresorů. Kromě stimulačních účinků (např. na tvorbu stresových proteinů a některých hydroláz) mají stresové fytohormony i výrazné inhibiční účinky na tvorbu některých enzymů (např. Rubisco, α-amyláza), což vede ke zpomalení růstu a ke zrychlení stárnutí. Jasmonáty (kyselina jasmonová, metyljasmonát aj.), polyaminy (zejména spermin, spermidin a putrescin) a kyselina salicylová patří také k látkám fytohormonálního typu, jejichž koncentrace za stresů roste a mají výrazný ochranný účinek (Procházka et al., 2003).

2.3. Stresové faktory rostlin a možnosti jejich studia

Rostlina bývá vystavena celé řadě stresových faktorů. Obvykle se klasifikují na stresové faktory abiotické a biotické povahy (Procházka et al., 2003). Abiotické faktory (neživotné, abiogenní) zahrnují různé klimatické, chemické a další vlivy, vytvářející v prostoru a čase značně odlišné podmínky pro živé organismy. Faktory biotické povahy (životné, biogenní) vyplývají z existence dalších organismů v daném prostředí (Vodrážka, 2002). Základní přehled stresových faktorů uvádí tabulka 1 (kap. 2.1).

Vliv stresových faktorů na rostliny lze studovat buď na intaktních rostlinách, za normálních podmínek - in vivo nebo lze využít izolované části rostlin kultivované v umělých podmínkách - explantátové kultury (Procházka et al., 2003). Kultivace in vitro probíhá ve sterilním prostředí a za definovaných podmínek (kultivační média, teplota, vlhkost, osvětlení). Explantátové kultury mají široké využití (Kováč, 1995).

18

Regenerace či morfogeneze probíhá v podmínkách in vitro buď přímo na izolovaném pletivu nebo nepřímo přes kalusové stádium či suspenzní kulturu. V obou případech existují v zásadě dva procesy: organogeneze (vznikají orgány) či embryogeneze (v závislosti na explantátu zygotická, gametofytická nebo somatická). V konečné fázi lze ve všech případech získat plnohodnotnou celistvou rostlinu (Procházka et al., 2003). Mezi hlavní požadavky kladené na kvalitní buněčnou suspenzi patří především její vysoká rozpadavost, co nejvyšší dělivá schopnost, vyrovnanost buněčného fenotypu a hlavně stabilita během dlouhodobější kultivace (Kováč, 1995). Založení buněčných kultur není experimentálně náročné a využívá se mnoho buněčných linií z různých pletiv a druhů vyšších rostlin; např. tabák XD (Filner, 1965) a Acer pseudoplatanus (Simpkins et al., 1970). Nicméně buněčná linie tabáku Nicotina tabacum, L. cv. BY-2 (Bright Yellow 2) vykazuje jedinečné vlastnosti, díky nimž je v současnosti jedním z nejpoužívanějších experimentálních materiálů (Nagata et al., 1992).

Používají se různé kultivační systémy. Kultivační nádoby lze umístit na roller (v šikmé rovině se otáčející plocha) nebo na třepačku (pohyb v horizontální rovině). Pro kontinuální kultivaci se využívají různé typy bioreaktorů, kdy je pohyb média zajišťován buď míchadlem nebo probubláváním sterilního vzduchu (lze též regulovat pH, hustotu suspenze atd.) (Kováč, 1995). Růst buněčné suspenze v uzavřeném systému, kdy se mění podmínky kultivace (složení média, hustota suspenze atd.) lze charakterizovat tzv. růstovou křivkou . Ta je znázorněna na obrázku 2.

19

Obr.2. Růstová křivka buněčné suspenze (upraveno podle (Kováč, 1995).

Průběh křivky je charakteristický pomalým růstem buněčné suspenze těsně po naočkování (lag fáze), velmi intenzivním nárůstem v exponenciální fázi a poklesem ve stacionární fázi (nedostatek živin). Délka doby mezi založením buněčné kultury a stacionární fází záleží na několika faktorech: na počáteční hustotě suspenze, době trvání lag fáze a růstové rychlosti buněčné linie. Při rychlém růstu suspenze dochází k rychlému odčerpání živin z kultivačního média a k zajištění stálého růstu je proto nutné buněčné suspenze poměrně často pasážovat na čerstvé médium. Pasážování se provádí na konci exponenciální fáze růstu – v době aktivního dělení, kdy není růst buněk limitován exogenními faktory. Růst buněk suspenze lze měřit pomocí čerstvé hmotnosti, hmotnosti sušiny, počtu buněk, mitotického indexu, objemu sedimentované kultury vzhledem k celkovému množství suspenze v % (packed cell volume, PCV), vodivosti média a celkového obsahu bílkovin či DNA. Nejpřesnější metodou měření růstu buněčné suspenze je stanovení počtu buněk pomocí cytometru, kdy se stanoví počet buněk v 1 ml (Kováč, 1995).

20

Při posouzení růstu buněčné suspenze je někdy výhodné stanovit také vitalitu buněk. Kromě mikroskopického pozorování např. proudění cytoplazmy a přítomnosti intaktního jádra je možné použít vitální barvení (Fojtová a Kovařík, 2000).

Buněčná linie tabáku BY-2 poskytuje cenné poznatky zejména při studiu buněčného cyklu, cytoskeletárních struktur, intracelulárního transportu proteinů, fytohormonálních regulací a sekundárního metabolismu. Ovšem možnosti genomiky a proteomiky jsou vzhledem ke značné velikosti a složitosti amfidiploidního genomu u buněčné kultury BY-2 poněkud omezeny. Ve srovnání s buněčnými kulturami dosud získanými z modelové rostliny Arabidopsis thaliana však představuje buněčná linie tabáku BY-2 jednoznačně stabilnější experimentální systém (Geelen a Inzé, 2001). BY-2 buněčná linie byla založena z kalusu indukovaného na semenáčku Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2 (Nagata et al., 1992) a rozmnožována na LS mediu (1965), doplněném o sacharózu a 2,4-dichlorfenoxyoctovou kyselinu. Mezi zkoušenými materiály (40 druhů tabáku a 3 druhy topolu) vykazovala linie BY-2 jednoznačně největší proliferaci buněk. V 70.letech s ní byly prováděny pokusy, zkoumající využití BY-2 jako suroviny pro výrobu cigaret a produkci koenzymu Q10 (Nagata et al., 1992). Vysoká růstová rychlost BY-2 je závislá na obsahu fosfátu v médiu. Optimální množství bylo stanoveno na 510 mg.l-1, což je trojnásobek jeho obsahu v základním MS médiu. Na této buněčné linii byly např. objasněny replikační mechanismy plastidové DNA u vyšších rostlin, jejíž syntéza probíhá přednostně před syntézou chromozomální DNA (Nagata et al., 1992).

2.4. Těžké kovy

Těžké kovy bývají definovány jako kovy s hustotou větší než 5 g.cm–3 (Zenk, 1996); toto kritérium ovšem neplatí pro kovy jako selen a hliník. Těžké kovy vstupující do potravních řetězců všech živých organismů lze rozdělit na dvě skupiny: esenciální a toxické (recetox, 2006).

21

Jako esenciální těžké kovy jsou označovány kovy, které jsou v nízkých hladinách nezbytné pro život a musí být součástí výživy. Prvky zahrnuté v této skupině těžkých kovů jsou důležité pro řadu enzymatických a metabolických procesů; většinou se pak jedná o součásti nebo aktivátory enzymů a složky některých proteinů (Zenk, 1996). Mezi esenciální těžké kovy se zpravidla řadí kobalt, měď, železo, mangan, molybden, nikl, selen, vanad a zinek (recetox, 2006). Tabulka 2 uvádí přehled některých jejich biologických funkcí.

Tab. 2. Příklady esenciálních kovů a jejich funkcí (upraveno podle (Procházka et al., 2003). Kov Kobalt

Biologická funkce součást vitamínu B12 nezbytný pro rostliny fixující vzdušný dusík

Měď

složka oxidáz, fenoláz a laktáz

Železo

prostetická skupina hemových enzymů (cytochromoxidáza, hemoglobin)

Mangan

kofaktor či aktivátor dehydrogenáz, hydroxyláz, dekarboxyláz

Molybden součást nitrátreduktázy Nikl

kofaktor ureázy

Selen

kofaktor glutathionperoxidázy

Vanad

kofaktor nitrátreduktázy

Zinek

kofaktor RNA-polymerázy, karbonátdehydratázy a alkoholdehydrogenázy

V případě esenciálních kovů je velmi důležitá jejich koncentrace. Škodlivé účinky může způsobovat nejen jejich vysoká koncentrace – nadbytek, ale i nízká koncentrace – nedostatek (recetox, 2006).

Toxické těžké kovy představují jednu z nejvýznamnějších skupin toxických látek a jsou charakteristické svou vysokou toxicitou pro organismy. Jako toxicita je označována míra škodlivosti

(jedovatosti)

látky

na

živý

organismus,

která

je

dána

jejími

fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Míra toxicity je závislá na formě výskytu kovu (speciaci), jiná je pro ion, sloučeninu nebo komlexy, a dále na biodostupnosti (množství kovu absorbovaného organismem). Biodostupnost je ovlivňována polárními nebo

22

iontovými vlastnostmi kovu a jeho příjem je řízen jejich chemickou formou a vlastnostmi okolního prostředí (Prokeš, 2005). Toxicita je dále závislá na množství látky - dávce, velikosti organismu, na způsobu vstupu do organismu, délce expozice, metabolismu aj. Aby bylo možno toxicitu měřit a srovnávat, byla zavedena speciální stupnice označovaná zkratkou LD (z angl. Lethal dose smrtelná dávka). Nejčastěji je možno setkat se s variantou LD50 - to je označení dávky, po které uhynulo 50 ze 100 pokusných krys, kterým byla látka podána všemi možnými způsoby (především orálně). Jinou užívanou stupnicí je smrtelná koncentrace , ve zkratce LC (z angl. Lethal concentration) (Prokeš, 2005). Těžké kovy se v prostředí mohou vyskytovat přirozeně nebo mohou být antropogenního původu tj., že jsou produkovány působením člověka. V takovém případě pochází z těžby, metalurgie, textilních barviv, výtoků ze skládek a splachů z městských aglomerací a zemědělsky kultivovaných ploch (recetox, 2006). Existují různé stupnice nebezpečnosti kovů, ovšem většinou se jako nejnebezpečnější environmentílní kontaminant uvádí rtuť. Mezi další významné toxické těžké kovy patří především kadmium a olovo (recetox, 2006).

2.4.1. Zinek

Zinek je relativně měkký kov o hustotě 7,140 g.cm-3 vyskytující se ve sloučeninách pouze v mocenství Zn+2. V zemské kůře je zastoupen poměrně bohatě, jeho průměrný obsah činí 100 mg.kg-1 (např. minerál sfalerit) (Greenwood a Earnshaw, 1993). Má významný vliv na správný vývoj všech živých organizmů rostlinných i živočišných (Greenwood a Earnshaw, 1993), neboť je aktivátorem či kofaktorem mnoha enzymů (Tab. 2.) a také součástí proteinů nazvaných zinkové prsty, které umožňují vazbu proteinů na DNA. Denní potřeba zinku pro člověka činí asi 25 mg. Jeho nedostatek se projevuje zpomalením růstu a kožními poruchami, Ionty zinečnaté mají adstringentní a dezinfekční účinek. Zinečnaté soli jsou ovšem i toxické. Smrtelná dávka pro dospělého člověka je asi 10g ZnSO4, zvláště toxické jsou i páry zinku (Prokeš, 2005). 2.4.2. Kadmium

23

Kadmium (Cd) je stříbřitý chalkofilní kov o hustotě 8,650 g.cm-3 (Greenwood a Earnshaw, 1993) vyskytující se v anorganických i organických sloučeninách v oxidačním stupni II. Vytváří komplexy s organickými látkami včetně látek biologicky aktivních (např. proteiny, fosfolipidy, nukleové kyseliny, enzymy) (Bencko et al., 1995). V přírodě se kadmium vyskytuje v malém množství, především z vyluhovaných hornin, fosfátových hnojiv a ze spalování fosilních paliv. Poměrné množství kadmia v zemské kůře je asi 0,15 - 0,20 mg.kg-1 (recetox, 2006). Vzhledem k nízkému bodu varu kadmia se tento prvek poměrně snadno dostává do atmosféry (Greenwood a Earnshaw, 1993) a odtud poté mokrou či suchou depozicí do půdy a na rostliny, kde se hromadí a následně vstupuje do potravního řetězce (Bencko et al., 1995). Do lidského organismu se dostává dvěma způsoby - inhalačně (ze vzduchu), kdy způsobuje dráždění dýchacích cest, a zažívacím traktem. Při chronické otravě působí na kosti, je známý karcinogen a způsobuje neplodnost. Nejvíce kadmia se kumuluje v ledvinách, ovšem jeho největší podíl je v játrech., kde je při syntéze methalothioneinu vázáno 80 - 90 % kadmia, které již nemůže negativně působit v organismu. Metalothioneiny (MT) jsou na cystein bohaté, malé proteiny, které mají v organismu velmi důležitou roli při regulaci esenciálních kovů (Cu, Zn) a pro detoxikaci esenciálních a některých toxických kovů (Cd, Hg). Poločas rozpadu Cd v orgánech savců je 7 - 40 let. Tolerovaná denní dávka kadmia pro dospělého člověka činí 67 – 83 mg, zatímco LD50 je 88 mg/kg při orálním podání CdCl2 pro krysu) (Prokeš, 2005). Kadmium má podobnou elektronegativitu a podobné chemické vlastnosti jako esenciální těžký kov zinek, což způsobuje, že se toxicita kadmia projevuje výhradně tehdy, když nahrazuje zinek v životně důležitých proteinech (zinkové prsty). Iontový poloměr Zn (0.074 nm) je však nižší než iontový poloměr Cd (0.097 nm), a to při společném vstupu kovů ulehčuje Zn, aby přednostně obsadil cílová místa v proteinech, a tím celkově redukoval toxicitu kadmia (Abdel-Sabour et al., 1988). Kadmium je kumulativní jed, jehož obsah se stoupajícím věkem živého organismu zvyšuje (Prokeš, 2005).

2.4.3. Olovo

24

Olovo (Pb) je modrobílý měkký kov o hustotě 11,34 g.cm-3 (recetox, 2006) vyskytující se ve většině anorganických sloučenin ve dvojmocné formě. Mezi nejvýznamější organické sloučeniny patří tetramethyl- a tetraethyl olovo - antidetonační aditiva do benzínu (Bencko et al., 1995). Ve stopovém množství je Pb přirozenou složkou všech biologických materiálů (půdy, vody, rostlin a živočichů). Podobně jako kadmium se v prostředí vyskytuje přirozeně nebo je antropogenního původu (recetox, 2006). Přirozeným zdrojem olova je jeho obsah v půdě a některých minerálech (galenit PbS, anglesit PbSO4, cerusit PbCO3 a křemičitany) (Bencko et al., 1995). Olovo je nejrozšířenějším těžkým kovem. Tato skutečnost je zapříčiněna tím, že izotopy olova jsou konečným produktem rozpadových řad některých radioaktivních prvků. Jedná se především o tři ze čtyř izotopů olova (206, 207, 208Pb) (Cibulka, 1991). Běžný obsah olova v půdě je 12 – 16 mg.kg-1 (Bencko et al., 1995). Z přírodních zdrojů se olovo do atmosféry dostává ve formě silikátového prachu, kouře z lesních požárů a aerosolu z mořské vody. Většina olova, které se vyskytuje ve vzduchu, vodě a půdě, má svůj původ v aktivitách člověka (těžba a zpracování rud, výroba baterií atd.) (recetox, 2006). Nejvýznamnější antropogenní zdroj olova představují výfukové plyny automobilů. Olovo se z nich usazuje v podobě oxidu, chloridu a bromidu na vegetaci a půdě v okolí silnic (Bencko et al., 1995). V organizmu se anorganické sloučeniny olova přenášejí v krvi, a to především vázány na povrchu erytrocytů. Ukládají se v játrech, ledvinách a v kostech. Jejich poločas je u lidí udáván v krvi 20 dnů, v kostech pak 600-3000 dnů, ale také až 30 let. Olovo je významným kumulativním jedem, velkou zdravotní komplikací je jeho příjem vyšší než 0,5 mg.den-1. Při chronické otravě dochází k degeneraci nervových i svalových buněk, známá je i kardiotoxicita olova (Prokeš, 2005).

2.4.4. Příjem a transport těžkých kovů v rostlině

Rostliny jsou převážně imobilní organismy a v kontaminovaném prostředí je místem primárního kontaktu s ionty kovů většinou kořen (Zenk, 1996). Do rostliny se mohou dostat sorpcí buněčnou stěnou, častější je však přenos kovů pomocí transportních iontových kanálů přes plazmatickou membránu. Tyto kationtové transportéry většinou

25

slouží k příjmu živin nutných pro rostlinu, ovšem z důvodu jejich nedostatečné selektivity dochází k příjmu nebezpečných iontů do rhizodermálních buněk (Hall a Williams, 2003). Příjem kovů rostlinou je značně závislý na jejich rozpustnosti v půdním roztoku, což souvisí i s vlastní pohyblivostí kovů (podle kyselosti okolního prostředí) (recetox, 2006). Po vstupu těžkých kovů do rostliny přes rhizodermis dochází k jejich postupné difúzi apoplastem. Naopak do vodivých elementů rostliny vstupují ionty kovů především symplastem pomocí iontových membránových přenašečů. Spolu s xylémem se pak dostávají do nadzemních částí rostlin. Mohou však přecházet také do floému a spolu s asimiláty být transportovány do dalších částí rostlin (Clemens et al., 2002). Celý mechanismus od vstupu těžkých kovů do rostliny až po jejich detoxikaci je znázorněn na obrázku 3.

26

F)

Distribuce kovů v pletivech Vysvětlivky: membránový transportér

ukládání kovů v trichomu

cytoplazmatickámembrána buněčná stěna směr transportu kovu chelatační agens

vazba kovů v buněčné stěně

D)

kov

Transport iontů vodivými pletivy

E)

Detoxikace kovů ve vakuole popřípadě v dalších buněčných kompartmentech

floém xylém

vakuola

symplast mitochondrie

apoplast

B)

Zabránění

A) vstupu

buněčné jádro

Zvýšení mobility kořen půda

kořen půda

H+-ATPáza

vyloučení

okyselení zablokování vazba buněčnou stěnou

C)

Zvýšený příjem pomocí symbiotických bakterií kořen

půda

chelátační činidla (EDTA) fytosiderofóry

rhizosférní baktérie

Obr. 3. Mechanizmus příjmu, transportu, distribuce a detoxikace kovů u vyšších rostlin (upraveno podle (Clemens et al., 2002).

Kadmium se do rostlin dostává převážně kořeny (Haghiri, 1973), ale existuje i mimokořenový příjem přímo z atmosféry prostřednictvím znečištěného povrchu listů (Hovmand et al., 1983). Příjem kadmia kořeny je lineárně závislý na koncentraci volného iontu Cd2+ v živném prostředí (Domažlická a Opatrný, 1989). Pohyb ke kořenům je uskutečňován difúzí a hromadným půdním tokem a v blízkosti kořenů pak dochází k chelataci kovu organickými kyselinami vylučovanými rostlinami, zvýšení difúzního gradientu a zrychlení příjmu prvku (Mullins a Sommers, 1986).

27

Stejně jako kadmium i olovo je přijímáno kořeny ze živných roztoků v lineární závislosti na jeho koncentraci (Van Assche et al., 1988). Ve venkovních podmínkách se na celkovém obsahu olova v rostlině značnou měrou podílí kromě kořenového i mimokořenový (foliární) příjem (Zurera-Cosano et al., 1989). Někteří autoři uvádějí, že tento foliární příjem činí 40 až 80 % celkového olova obsaženého v rostlině (Cibulka, 1991). Za normální obsah olova v rostlinách se považují hodnoty 2 – 8 mg.kg-1, vyjímečně až 10 mg.kg-1 v sušině (Cibulka, 1991). Jeho obsah v blízkosti komunikací je podstatně větší. Prachové částečky s vysokým obsahem olova jsou z ovzduší zachytávány ve voskové vrstvičce na povrchu listů, kudy pak olovo proniká do jejich vnitřní struktury (Cibulka, 1991). Nejvíce kadmia je zpravidla obsaženo v kořenech, dále v listech, stoncích, plodech a zásobních orgánech a nejméně v semenech (Sawert et al., 1987). Z celkového množství Cd v listech rostlin se asi 48 % ukládá v buněčné stěně, 39 % v cytoplasmě a vakuolách a 13 % je v chloroplastech a mitochondriích (Bencko et al., 1995). Nejvíce olova přijatého rostlinou se kumuluje v kořenech, kde je jeho obsah asi pětkrát vyšší než v nadzemních částech (Bencko et al., 1995).

2.4.5. Vliv těžkých kovů na rostliny

Jedním z prvních příznaků toxického působení kovu je zpomalení růstu primárního kořene, k němuž dochází po vstupu těžkých kovů do rostliny v důsledku inaktivace některých enzymů a redoxních systémů. Těžké kovy nejvíce ovlivňují fyziologické procesy v listech, především fotosyntézu (Procházka et al., 2003).

Kadmium je kvůli své vysoké toxicitě a dobré rozpustnosti ve vodě jedním z nejnebezpečnějších těžkých kovů. Mezi nejčastější symptomy pozorované u rostlin při působení kadmia patří zakrslost a chloróza listů (Das et al., 1997), hnědnutí kořenových vlásků a špiček kořenů (Hagemeyer et al., 1986), červenohnědé zbarvení listové žilnatiny a výskyt fialovohnědých skvrn na listech (Barceló et al., 1986), případně usychání a opad listů (Hagemeyer et al., 1986). Byla zaznamenána také vakuolizace a degenerace mitochondrií (Das et al., 1997).

28

Pro rostliny jsou obzvlášť toxické rozpustné soli olova (Bencko et al., 1995). Přítomnost olova v rostlině vyvolává řadu respiračních poruch a snížení fotosyntézy a růstu, vyvolané inhibicí enzymů (Uhlířová et al., 1995). Dochází k bobtnání organel, vakuolizaci cytoplazmy a strukturálním změnám chloroplastů (Cibulka, 1991). Mezi symptomy fytotoxicity způsobené olovem patří chlorózy listů (Burzynski, 1985) a poškození kořenů (Cibulka, 1991).

2.4.6. Obranné mechanismy rostlin proti působení těžkých kovů

K vnitrobuněčným detoxikačním mechanismům rostlin patří hlavně tvorba stresových proteinů. Velmi účinnou reakcí je však také tvorba specifických thiolových sloučenin glutathionu (GSH) a fytochelatinů (PC) (Procházka et al., 2003).

Glutathion (GSH) je tripeptid s primární sekvencí γ-Glu-Cys-Gly (γ-glutamylcysteinyl glycin), který je přítomen v buňkách bakterií, kvasinek, živočichů i rostlin. Byly u něj potvrzeny významné antioxidační a detoxikační vlastnosti související s ochranou buněk před oxidačním stresem a abiotickými vlivy (UV-záření, anoxie, atd.). Podstatou biologické účinnosti GSH je přítomnost redukované sirné skupiny (sulfhydrylová skupina, SH), kterou nese v molekule GSH cysteinový zbytek (Giles et al., 2003). Pokud je buňka vystavena oxidačním činidlům, GSH je oxidován za vzniku glutathiondisulfidu (GSSG) (Meister a Anderson, 1983). Glutathion také napomáhá udržování homeostáze v buňce a účastní se reakce organismu na patogeny (Locigno a Castronovo, 2001). Biosyntéza GSH probíhá ve dvou krocích za účasti dvou enzymů. Nejprve je enzymem γ-glutamylcysteinsyntetázou (GCS) za přítomnosti ATP katalyzována syntéza dipeptidu γ-glutamylcysteinu z kyseliny glutamové a cysteinu. V další fázi dochází pomocí enzymu glutathionsyntetázy (GS) a za účasti ATP k reakci γ-glutamylcysteinu s glycinem (Vacek et al., 2003) . Regulace celé biosyntézy je řízena zpětnovazebným mechanismem, kde inhibitorem enzymu GCS je samotný glutathion, jež se váže na vazebné místo pro glutamovou kyselinu (Richman a Meisner, 1975).

Pokud jsou rostliny vystaveny přítomnosti těžkých kovů, zahájí rostlinné buňky syntézu fytochelatinů (PC) (Kondo et al., 1984), což jsou peptidy, které mají schopnost vázat těžké

29

kovy a zajišťují tak rostlině transport toxických iontů do vakuoly, kde již bezprostředně svou toxicitou rostlinný organismus neohrožují. Fytochelatiny mají základní strukturu (γ-Glu-Cys)n-Gly, kde se dipeptidická repetice glutamové kyseliny a cysteinu (γ-Glu-Cys) může opakovat 2 – 11krát (nejčastěji 2 – 5krát) (Cobbett, 2000). Tyto peptidy jsou také označovány jako rostlinné metallothioneiny a řadí se do III. třídy metallothioneinů (Kojima, 1991). Fytochelatiny obsahují velké množství cysteinu (s obsahem -SH skupin odpovídajících za vazbu iontů kovů) a jsou syntetizovány posttranslačně redukcí glutathionu (GSH), tzv. transpeptidizační

reakcí.

Syntéza

fytochelatinů

z GSH

je

katalyzována

γ-Glu-Cys-dipeptidyl transpeptidázou (triviálně fytochelatin syntetáza, PC-syntetáza). PC-syntetáza je schopna zahájit syntézu fytochelatinů po aktivaci ionty kovů, které jsou lokalizovány v cytoplazmě. PC-syntetáza je základní enzymem a regulačním prvkem pro syntézu fytochelatinů (Grill et al., 1989). Ze syntetizovaných PC vzniká za přítomnosti iontů kovů M-PC komplex (M: Cd, Hg, Ag, atd.), který je označován jako LMW M-PC komplex (nízkomolekulární komplex), kde jsou cysteinovými zbytky vyvázány těžké kovy. Takto vzniklý komplex přejde přes membránu tonoplastu do vakuoly. Ve vakuole je LMW M-PC komplex přeměněn na HMW M-PC komplex (vysokomolekulární komplex) pomocí inkorporace S2–. Na mutantu kvasinky byl studován transport Cd-PC komplexů přes vakuolární membránu a bylo prokázáno, že transport PC a LMW Cd-PC přes membránu tonoplastu je nezávislý na protonovém gradientu. Zajišťuje ho ABC-typ kazetového transportéru (Ortiz et al., 1995). Naopak transport samotných iontů kadmia přes membránu tonoplastu, který je zajišťován Cd2+/H+ antiportním systémem, je na protonovém gradientu závislý (Salt a Wagner, 1993), (Ortiz et al., 1995). Mechanismus detoxikace prostřednictvím PC byl doposud prokázán u kadmia (Grill et al., 1985), stříbra, mědi (Maitani et al., 1996) a arsenu (Schmöger et al., 2000). Pro studium PC má velký význam také objasnění principů transportu PC komplexů a samotných iontů přes buněčnou stěnu, cytoplazmatickou membránu a membránu vakuoly. V případě fytochelatinů doposud nebyla prokázána funkce nosičů iontů esenciálních prvků k apoenzymům, jako je tomu např. u živočišných MT (Cobbett, 2000). Za hlavní funkci PC je považována detoxikace těžkých kovů. Důkazy o tom přinesly experimenty realizované na mutantech husečníku a kvasinek. Srovnání různých těžkých kovů u husečníku a kvasinky studoval (Ha et al., 1999). Byla prokázána role PC

30

v detoxikaci kadmia a arsenu, dále byly pozorovány menší diference mezi odpovědí husečníku a kvasinky na expozici Hg, Cu a Pb. Z těchto výsledků vyplývá, že pojem indukce PC-syntetázy, která odpovídá za syntézu PC, nemusí mít vždy souvislost se samotnou detoxikací kovu, který enzym PC-syntetázu indukoval (Vacek et al., 2003).

2.5. Biotické faktory

2.5.1. Alelopatie

Každá rostlina obsahuje velké množství sekundárních metabolitů, z nichž některé mohou působit inhibičně až toxicky na jiné rostliny vyskytující se v jejich těsné blízkosti (Procházka et al., 2003). Tento jev je nazýván alelopatie. Uvolňovanými fytotoxickými látkami mohou být např. fenoly, deriváty aminokyselin a acetylenu a k přenosu na jinou rostlinu dochází jejich vymýváním, vylučováním či odpařováním z kořenů (Vodrážka, 2002). Při ovlivňování rostlinných společenstev hrají důležitou úlohu fytopatogenní mikroorganismy schopné překonávat rezistenci napadených rostlin řadou svých biochemických mechanismů (např. biosyntéza fytopatogenních toxinů a extracelulárních enzymů či nadprodukce růstových fytohormonů). Rostliny brzdí růst těchto patogenů produkcí fytoalexinů, látek lipofilní povahy, které porušují buněčné membrány mikrobů (Vodrážka, 2002). Účinné látky musí být z jedné (zdrojové) rostliny vyloučeny a přeneseny na jinou (cílovou) rostlinu v dostatečné koncentraci. Toto alelopatické působení je teoreticky možné i u nadzemních orgánů přenosem těkavých látek (především terpenů) či smýváním netěkavých metabolitů vyloučených na povrch listů. Hlavní význam je však v kořenové zóně. V současné době je velká pozornost věnována druhům, které sice mají špatné kompetitivní předpoklady (zejména pomalý růst), ale přesto v přírodě vytvářejí souvislé porosty, ve kterých se jiným druhům nedaří. Bývají mezi ně zařazovány např. metlička křivolaká (Avenella flexuosa), česnek medvědí (Allium ursinum) či bažanka lesní (Mercurialis perennis). Alelopatické působení bylo prokázáno ve zjednodušených podmínkách vodních kultur u trav a jetelovin, kde dochází k vzájemnému ovlivňování

31

především prostřednictvím fenolických sloučenin jako jsou skopolin a eskulin (Procházka et al., 2003). K nejčastěji pozorovaných účinkům látek s potenciálním alelopatickým působením patří inhibice membránových funkcí, včetně příjmu iontů minerálních živin, inhibice dělivého i dlouživého růstu buněk a inhibice klíčení. Kromě tohoto utlumení může však docházet také ke stimulaci růstu a vývoje (Vodrážka, 2002). Citlivost různých druhů rostlin vůči těmto sloučeninám je značně rozdílná a předpokládá se existence rozdílně účinných detoxikačních schopností (Procházka et al., 2003).

2.5.2. Naftochinony

Naftochinony

jsou

sekundární

metabolity

odvozené

od

1,2-naftochinonu

a 1,4-naftochinonu. V přírodě se vyskytují u celé řady čeledí rostlin (např. Plumbaginaceae, Juglandaceae, Droseraceae, Nepenthaceae, Malvaceae), ale jsou produkovány také houbami (zejména rod Fusarium) a mikroorganismy rodu Streptomyces (Moore a Hopke, 2001). V buňkách jsou uloženy ve vakuolách, a to většinou ve formě glykosidů. Jejich biosyntéza může probíhat šesti možnými cestami, přičemž základním prekurzorem většiny naftochinonů je kyselina šikimová. Mezi nejvýznamnější zástupce naftochinonů jsou řazeny plumbagin, juglon, lawson, šikonin, eleutherin, alkanin či lapachol. Juglon, derivát 1,4-naftochinonu, byl izolován ze zeleného perikarpu ořešáku královského. Lawson byl získán z listů lawsonie bílé a je účinnou složkou barviva hennach využívaného k barvení vlasů, vousů a nehtů. Naftochinony, zejména pak plumbagin a jeho deriváty, mají výrazný antifungální efekt a mohou tedy sloužit jako aktivní obrana rostlin proti patogenům. Cytotoxicitu a cytopatologické změny, které naftochinony mohou způsobovat lze dobře sledovat na suspenzní buněčné kultuře tabáku BY-2 (Babula et al., 2006).

32

3. CÍLE PRÁCE

1) Seznámit se s literaturou vztahující se k dané problematice.

2) Sledovat vliv vybraných těžkých kovů (kadmium, olovo, zinek) na buněčnou suspenzi tabáku linie BY-2 z hlediska: a) viability buněk, b) enzymatické aktivity oxidoreduktáz, c) enzymatické aktivity intracelulárních esteráz, d) změn obsahu thiolových sloučenin.

3) Sledovat vliv 1,4-naftochinonu na buněčnou suspenzi tabáku linie BY-2 z hlediska: a) viability buněk, b) enzymatické aktivity oxidoreduktáz.

33

4. MATERIÁL A METODY

4.1. Rostlinný materiál

Pro experimenty byla použita suspenzní kultura tabáku viržinského (Nicotiana tabacum L.)

buněčná

linie

Bright

Yellow

2

(BY-2),

udržovaná

v kapalném

Murashige-Skoog (MS) mediu (Murashige a Skoog, 1962), obohaceném o 30 g.l-1 sacharózy, 0,2 g.l-1 KH2PO4, 1 mg.l-1 thiaminu a 0,2 mg.ml-1 2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny (Nagata et al., 1992). Suspenze (20 ml) byla umístěna v 50 ml Erlenmeyerových baňkách na třepačce ve tmě, při teplotě 27 °C a 135 ot.min-1 (Obr. 4). Subkultivace byla prováděna dvakrát týdně a pro experimenty byla použita 3 dny stará kultura.

Obr. 4. Erlenmeyerova baňka s buněčnou suspenzí tabáku linie BY-2.

4.1.1. Příprava vzorků pro stanovení účinků těžkých kovů

Pro studium vlivu vybraných těžkých kovů (kadmium, olovo, zinek) na suspenzní kulturu tabáku byly založeny čtyřdenní experimenty. Tři dny stará suspenze (z 1 ml inokula) byla rozpasážována do 50 ml Erlenmeyerových baněk v poměru 2 ml suspenze ku 18 ml čerstvého media. Zásobní roztoky vybraných těžkých kovů, připravené v modifikaci s EDTA (smícháním 50 mM roztoků dusičnanů (Cd(NO3)2, Pb(NO3)2, Zn(NO3)2) s 50 mM roztokem EDTA (pH = 7) v poměru 1:1), byly sterilizovány membránovou filtrací (Puradisc 25 AS, 0,2 µm, Whatman, Clifton, New Jersey, USA) a přidány do buněčné suspenze do výsledné koncentrace podle tabulky 3.

34

Tab. 3. Varianty pokusů s těžkými kovy a jejich koncentrace. µM) koncentrace těžkého kovu (µ varianty – kadmium varianty – olovo varianty - zinek

0 0 Cd 0 Pb 0 Zn

50 50 Cd 50 Pb 50 Zn

100 100 Cd 100 Pb 100 Zn

250 250 Cd 250 Pb 250 Zn

500 500 Cd 500 Pb 500 Zn

Baňky byly umístěny na třepačce (135 ot.min-1, 27 °C, tma) a v daných časech (24, 48, 72 a 96 h) z nich byly odebírány vzorky pro jednotlivá stanovení. Protože bylo odebíráno větší množství vzorků a mohlo by dojít ke změně kultivačních podmínek, bylo založeno 20 baněk suspenze pro jednu variantu a sklízel se vždy celý jejich objem.

4.1.2. Příprava vzorků pro stanovení účinků 1,4-naftochinonu

Pro studium účinku 1,4-naftochinonu na suspenzní kulturu tabáku linie BY-2 byl založen čtyřdenní experiment. Suspenze stará 3 dny (z 1 ml inokula) byla rozpasážována do 50 ml Erlenmeyerových baněk v poměru 1 ml suspenze ku 19 ml čerstvého media. Zásobní

roztok

1,4-naftochinonu,

připravený

rozpuštěním

50 mg

v 1 ml

dimethylsulfoxidu, byl sterilizován membránovou filtrací (Puradisc 25 AS, 0,2 µm, Whatman, Clifton, New Jersey, USA) a přidán do buněčné suspenze v množstvích odpovídajících jeho výsledné koncentraci u jednotlivých variant (Tab. 4.).

Tab. 4. Varianty pokusu s 1,4-naftochinonem a jeho koncentrace. varianty koncentrace 1,4-naftochinonu (µ µM)

1

2

3

4

5

6

7

8

0

0,01

0,03

0,1

0,3

1

3

6

Baňky byly umístěny na třepačce (135 ot.min-1, 27 °C, tma) a v daných časech (24, 48, 72 a 96 h) z nich byly odebírány vzorky pro jednotlivá stanovení.

35

4.2. Chemikálie a přístroje

Pro přípravu roztoků byla použita demineralizovaná voda (18,2 MΩ, model Demiwa, Watek, Ledeč nad Sázavou, Česká Republika), pouze u citlivých elektrochemických metod byla zvolena A.C.S. voda (Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika), a to na přípravu pufrů i ředění vzorků. MS médium bylo připraveno z chemikálií certifikovaných pro rostlinné buněčné kultury (DUCHEFA Biochemie B.V., Haarlem, Nizozemí). Na přípravu veškerých pufrů byly použity chemikálie firmy Sigma-Aldrich (Praha, Česká republika).

Další použité chemikálie:

dusičnan kademnatý,

dusičnan olovnatý,

dusičnan zinečnatý,

1,4-naftochinon,

fluoresceindiacetát (FDA),

propidium jodid (PI),

dimethylsulfoxid,

dithiotreitol (DTT),

methylthiazolyltetrazoliumbromid (vše Sigma-Aldrich, Praha, Česká republika).

Použité přístroje:

třepačka (typ LT-W, Kühner, Birsfelden, Švýcarsko),

třepačka (UNIMAX 1010, Heidolph, Francie),

fluorescenční mikroskop (Olympus AX 70, Olympus, Praha, Česká republika),

fluorimetr (RF 551, Shimadzu Europe, Duisburg, Německo),

fotometr (Anthelie, Secomam, Francie),

rotační homogenizátor (Ultra-Turrax T8, Ika-Werke, Staufen, Německo),

termoblok (Thermomixer comfort, Eppendorf 5430, USA),

elektrochemický analyzátor (AUTOLAB, EcoChemie, Utrecht, Nizozemí),

nosič elektrod (VA-Stand 663, Metrohm, Herisau, Švýcarsko).

36

4.3. Analytické metody

4.3.1. Stanovení viability buněk a toxické koncentrace těžkých kovů

Pro

stanovení

viability

bylo

využito

metody

dvojitého

barvení

buněk

fluoresceindiacetátem a propidium jodidem (Jones a Senft, 1985). Ze suspenze ovlivněné stresovým faktorem byl odebrán vzorek o objemu 50 µl, který se zředil 50 µl demineralizované vody. Následně bylo přidáno 10 µl PI (20 µg.ml-1) a 3 µl FDA (1 µg.ml-1). Po uplynutí 5 min inkubace při laboratorní teplotě byl vyhodnocen počet živých (zeleně zbarvených) a mrtvých (červeně zbarvených) buněk (Obr. 5.) jejich pozorováním

pod

fluorescenčním

mikroskopem,

vybaveném

pro

širokopásmou

UV excitaci (kostka U-MWU) (Víteček et al., 2006). Viabilita byla stanovena v procentech (poměr počtu živých buněk k celkovému počtu buněk x 100).

Obr. 5. Buňky suspenze obarvené fluoresceindiacetátem (zelené) a propidium jodidem (červené). Při zkoumání účinků těžkých kovů na suspenzní kulturu tabáku byla na základě dat získaných z testu viability stanovena toxická koncentrace těžkého kovu výpočtem hodnoty LC50, tedy koncentrace, při níž dochází po aplikaci těžkého kovu ke smrti 50 % testovaných organismů (Prokeš, 2005), v našem případě buněk suspenze. Hodnota LC50 byla vyhodnocena po skončení experimentu, tedy po 96 h působení těžkého kovu na buněčnou suspenzi. Pro vyhodnocení bylo nutné přepočítat hodnoty viability a koncentrace těžkého kovu v daném čase na inverzní hodnoty, z nichž byl sestaven graf lineární závislosti viability na koncentraci kovu. Do rovnice lineární regrese

37

byla za y dosazena inverzní hodnota koncentrace, při níž se viabilita rovnala přibližně 50 % a vypočtena letální koncentrace LC50.

4.3.2. Stanovení oxidoreduktázové aktivity

Oxidoreduktázová aktivita buněk byla stanovena prostřednictvím MTT – testu (SigmaAldrich, 2005). Do vzorku buněčné suspenze (0,5 ml) byl ihned po jeho odebrání přidán methylthiazolyltetrazoliumbromid (MTT) do výsledné koncentrace 0,5 mg.ml-1. Směs byla inkubována 1 h na třepačce (120 ot.min-1) při teplotě 25 °C. Po centrifugaci (360 g, 25 °C, 5 min) byl odstraněn veškerý supernatant. Formazan vzniklý redukcí MTT byl z peletu vyextrahován 1,5 ml isopropanolu po dobu 0,5 h za neustálého promíchávání směsi (třepačka, 120 ot.min-1). Po skončení extrakce byl centrifugací (10 000 g, 25 °C, 10 min.) získán čirý roztok formazanu. Jeho absorbance byla změřena na fotometru při λ = 570 nm (Víteček et al., 2006). Oxidoreduktázová aktivita byla vyjádřena v relativních hodnotách, kdy 100 % představuje maximální naměřenou hodnotu absorbance.

4.3.3. Stanovení aktivity intracelulárních esteráz

Aktivita intracelulárních esteráz byla stanovena fluorimetrickou metodou (Víteček et al., 2006), při níž se zjišťuje množství fluoresceinu uvolněného působením esteráz (Víteček et al., 2005). Probíhající reakce je znázorněna na obrázku 6.

38

O

Esterázy

O -

O

O

AcO

O

OAc

fluoresceindiacetát

O

O

-

O

disociovaný fluorescein λexcitace = 490 nm; λemise = 514 nm

Obr. 6. Schéma hydrolýzy fluoresceindiacetátu katalyzované esterázami (Upraveno podle Víteček, 2006).

Pro stanovení aktivity intracelulárních esteráz byl odebrán 1 ml vzorku a centrifugován 10 min, při 360 g a 20°C. Po odstranění supernatantu byl pelet promyt 50 mM fosfátovým pufrem (pH = 8,7) a následně centrifugován (360 g, 20 °C, 10 min). Tento krok se třikrát opakoval. Po posledním stočení a odstranění supernatantu byly vzorky uchovávány v hlubokomrazícím boxu (-75 °C). Vlastní stanovení aktivity intracelulárních esteráz probíhalo tak, že k rozmraženým vzorkům byl nejprve přidán extrakční pufr (1 ml 250 mM fosfátového pufru (pH = 8,7) na celkový objem 1 ml a 10 µl DTT ze zásobního 100 mM roztoku). Vzorky musely být při práci neustále uchovávány na ledové lázni, aby nedošlo k degradaci esteráz působením lytických enzymů. Následovala homogenizace 3 min pomocí rotačního homogenizátoru nastaveného na stupeň č. 6 a poté ještě desintegrace 1 min v ultrazvukové lázni. Získané homogenáty byly zcentrifugovány (10 000 g, 15 min, 4 °C) a alikvot supernatantu (extrakt) napipetován do mikrozkumavek s předehřátým pufrem (980 µl 1 M fosfátového pufru, pH = 8,7) podle tabulky 5 (FDA o koncentraci 500 µg.ml-1).

39

Tab. 5. Příprava reakčních směsí pro stanovení esterázové aktivity.

č. zkumavky čas (min) 250 µM extrakční pufr (µ µl) extrakt (µ µl) FDA (µ µl)

1 0

blank 2 2

3 4

10 --10

10 --10

10 --10

4 6

vzorek 5 8

6 10

--10 10

--10 10

--10 10

Reakční směsi byly vždy krátce promíchány na vortexu a po uplynutí 15 min inkubace (v termostatu, při 45 °C) bylo odpipetováno 10 µl této směsi do kyvety s 2 ml 5 mM fosfátového pufru (pH = 8,7) a na fluorimetru byla změřena fluorescence při λex = 490 nm a λem = 514 nm (Víteček et al., 2004). Od naměřených hodnot byl odečten blank, čistá fluorescence byla přepočítána na koncentraci

fluoresceinu

podle

kalibrace:

fluorescence = 48 400 * koncentrace

fluoresceinu (µM) a ta byla převedena na aktivitu esteráz v IU (1 mezinárodní jednotka, v našem případě definována jako 1 µmol fluoresceinu uvolněného enzymem za 1 min) na 1 ml suspenze. Výsledné hodnoty esterázové aktivity byly přepočteny na relativní hodnoty, kdy 100 % představuje nejvyšší naměřenou aktivitu v daném experimentu.

4.3.4. Elektrochemické stanovení změn obsahu thiolových sloučenin

Stanovení změn obsahu thiolových sloučenin bylo provedeno elektrochemickou metodou diferenční pulzní voltametrie (DPV) – modifikované Brdičkovy reakce (Olafson a Sim, 1979) (Paleček a Pechan, 1971).

4.3.4.1. Příprava vzorků

Suspenze zbylá v baňce po odběru vzorků na všechna předešlá stanovení byla odsáta na fritě, biomasa několikrát promyta: 1 x směs 0,25 M EDTA (pH = 7) + 50 mM fosfátový pufr (pH = 8,7) v poměru 1:1; 2 x fosfátový pufr (pH = 8,7), kvantitativně převedena do mikrozkumavek a uchovávána v hlubokomrazícím boxu (-75 °C).

40

Po vyjmutí z hlubokomrazícího boxu byl ke vzorkům přidán 1 ml extrakčního pufru (fosfátový pufr, pH = 7) a směs byla 2 min homogenizována pomocí rotačního homogenizátoru (stupeň 6). Během práce byly vzorky uchovávány na ledové lázni. Následovala centrifugace (14 000 g, 15 min, 4 °C) a odsátý supernatant byl opět uložen v hlubokomrazícím boxu (-75 °C).

4.3.4.2. Stanovení thiolů

Rozmražené vzorky byly podle potřeby naředěny a během práce uchovávány na termobloku při teplotě 0 až 4 °C. Byl použit přístroj AUTOLAB zapojený v klasickém tříelektrodovém režimu (pracovní elektroda: rtuťová kapka o ploše 0,4 mm2, referenční elektroda: Ag/AgCl/3 M KCl, pomocná elektroda: grafitová). Pro měření byly nastaveny tyto parametry: potenciálový rozsah od -0,7 V do -1,7 V, potenciálový krok 1,05 mV.s-1, pulzní amplituda 25,05 mV. Jako základní elektrolyt byl použit amonný pufr (pH = 9,6) obsahující 1 M NH4Cl a 1 M NH4OH v poměru 1 : 1, který byl doplněn kobaltitou solí (0,185 M zásobní roztok Co(NH3)6Cl3) na výslednou 1 mM koncentraci. Bylo využito nepřenosové metody DPV, kdy byl vzorek aplikován přímo do roztoku elektrolytu. Teplota elektrolytu byla udržována na 5 °C pomocí termostatované elektrochemické nádobky a v 1 ml bylo provedeno 5 měření (jeden vzorek). Aby nedocházelo ke změnám koncentrace amonného pufru, nebyl elektrolyt deoxygenován. Při měření se na voltamogramu objevovaly 3 charakteristické katalytické píky, z nichž nás zajímal pík č. 3, který se objevoval při potenciálu 1,5 V. Z jeho výšky byly vyhodnocovány změny obsahu thiolů. Výška tohoto píku po odečtení hodnoty blanku (elektrolytu) byla přepočtena na hodnoty vzhledem k 100 mg čerstvé hmotnosti. Výsledky jsou uvedeny v procentech, kdy jako 100 % byla uvažována maximální naměřená výška píku.

41

5. VÝSLEDKY A DISKUZE

5.1. Studium vlivu těžkých kovů na suspenzní kulturu tabáku

Buněčná suspenze tabáku linie BY-2 byla ovlivněna vybranými těžkými kovy v koncentračním rozmezí od 0 do 500 µM (Tab. 3.). Během čtyřdenního experimentu byla sledována viabilita buněk, aktivita oxidoreduktáz a intracelulárních esteráz a změny obsahu thiolových sloučenin (kap. 4.3.).

5.1.1. Stanovení vlivu těžkých kovů na viabilitu buněk

Pro stanovení viability byla použita metoda dvojitého barvení FDA/PI (kap. 4.3.1.). Hodnoty viability buněk u kontrolní varianty se pohybovaly mezi 96 a 91 %. U variant ovlivněných těžkými kovy se životnost buněk snižovala s rostoucí koncentrací těžkého kovu a dobou kultivace (Obr. 7., Obr. 8., Obr. 9.). Během prvních 24 h byl zaznamenán nejrychlejší pokles viability u kadmia (téměř o 40 %) a nejpomalejší u olova. Po 48 h kultivace se u variant ovlivněných zinkem, narozdíl od variant s kadmiem a olovem, odumírání buněk zpomalilo.

100

viabilita (%)

80

0 Cd 50 Cd

60

100 Cd 250 Cd

40

500 Cd 20 0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 7. Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku (v %).

42

100

viabilita (%)

80

0 Pb 50 Pb

60

100 Pb 40

250 Pb

20

500 Pb

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 8. Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku (v %).

100

viabilita (%)

80

0 Zn 50 Zn

60

100 Zn 40

250 Zn 500 Zn

20 0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 9. Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku (v %).

5.1.2. Určení toxicity těžkých kovů dle výpočtu LC50

U sledovaných koncentrací těžkých kovů byly vypočteny hodnoty toxicity LC50 (kap. 4.3.1.) – viz dále.

43

Tab. 6. Vliv koncentrace těžkých kovů na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace (v %). koncentrace těžkého kovu (µM) 0 50 100 250 500 91 51 37 32 28 91 51 38 32 29 91 57 44 38 35

kadmium olovo zinek

Zvyšující se koncentrace těžkých kovů výrazně negativně ovlivňovala životnost buněk v suspenzní kultuře tabáku. Prudké snížení viability nastalo u variant s 50 a 100 µM koncentrací těžkých kovů. Od hodnoty 250 µM koncentrace těžkého kovu se suspenzní kultura stabilizovala (Tab. 6., Obr. 10.).

100

viabilita (%)

80 kadmium

60

olovo 40

zinek

20 0 0

100

200

300

400

500

koncentrace těžkého kovu (µM)

Obr. 10. Vliv koncentrace těžkých kovů na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace (v %).

Hodnoty viability naměřené po 96 h kultivace, a stejně tak i příslušné koncentrace, byly přepočítány na inverzní hodnoty a z nich sestavena tabulka 7.

44

Tab. 7. Inverzní hodnoty viability buněk vztažené k daným inverzním hodnotám koncentrace těžkých kovů po 96 h kultivace (v %). kov kadmium olovo zinek

koncentrace těžkého kovu 0,02 0,01 0,004 0,002 0,0196 0,027 0,0313 0,0357 0,0196 0,0263 0,0313 0,0345 0,0175 0,0227 0,0263 0,0286

Na základě tabulky 7. byly sestrojeny grafy lineárních závislostí inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace těžkých kovů po 96 h kultivace a vypočteny rovnice (Obr. 11., Obr. 12., Obr. 13.).

viabilita (%)

0,040 0,035 0,030

y = -0,8344x + 0,0359 R2 = 0,969

0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

koncentrace (µM)

Obr. 11. Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace kadmia v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace (v %).

0,040 y = -0,794x + 0,0351 R2 = 0,9821

viabilita (%)

0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

koncentrace olova (µM)

Obr. 12. Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace olova v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace (v %).

45

0,030 y = -0,5912x + 0,0291 R2 = 0,9872

viabilita (%)

0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

koncentrace (µM)

Obr. 13. Lineární závislost inverzních hodnot viability na inverzních hodnotách koncentrace zinku v suspenzní kultuře tabáku po 96 h kultivace (v %). Tab. 8. Hodnoty LC50 u sledovaných těžkých kovů (v µM). těžký kov hodnota LC50 (µ µM) kadmium

52,5

olovo

52,6

zinek

65,0

Kadmium a olovo vykazovaly na suspenzní kulturu tabáku po 96 h prakticky stejné toxické účinky (Obr. 10.). Velmi podobné byly u těchto dvou kovů také hodnoty LC50. Nejmenší toxický vliv na buněčnou suspenzi měl zinek s hodnotou LC50 = 65 µM (Tab. 8.).


Funkční metabolizmus buněk byl sledován prostřednictvím stanovení oxidoreduktázové aktivity v buňkách suspenzní kultury tabáku (kap. 4.3.2.).

relativní aktivita (%)

46

100 0 Cd

80

50 Cd 60

100 Cd

40

250 Cd

20

500 Cd

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 14. Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %).

V průběhu celého experimentu docházelo k výraznému poklesu oxidoreduktázové aktivity zejména při 500 µM koncentraci kadmia v suspenzi (Obr. 14.).

Nejnižší aktivita oxidoreduktáz v suspenzi ovlivněné olovem byla zaznamenána u 500 µM koncentrace kovu. U všech variant s výjimkou 50 µM koncentrace docházelo


během posledních 24 h kultivace ke znatelnému poklesu enzymové aktivity (Obr. 15.).

100 0 Pb

80

50 Pb 60

100 Pb

40

250 Pb

20

500 Pb

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 15. Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). Koncentrace zinku 500 µM způsobila výraznou inhibici oxidoreduktázové aktivity v suspenzní kultuře. Naopak varianty s 50 a 100 µM koncentrací kovu se významně přibližovaly hodnotám aktivity oxidoreduktáz u kontroly (Obr. 16.).


47

100 0 Zn

80

50 Zn 60

100 Zn

40

250 Zn

20

500 Zn

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 16. Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %).

Vliv jednotlivých těžkých kovů na oxidoreduktázovou aktivitu pro vybrané varianty je znázorněn na obrázcích 17 a 18.


100 80 kadmium

60

olovo 40

zinek

20 0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 17. Vliv 100 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %).

K největšímu poklesu oxidoreduktázové aktivity buněk v suspenzní kultuře tabáku při 100 µM koncentraci těžkého kovu docházelo u olova a naopak k nejmenšímu poklesu u zinku (Obr. 17.).

48


100 80 kadmium

60

olovo 40

zinek

20 0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 18. Vliv 500 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). Při 500 µM koncentraci těžkého kovu vykazovalo zpočátku nejvýraznější inhibiční účinek na aktivitu oxidoreduktáz kadmium. Nejméně byla enzymová aktivita ovlivňována zinkem (Obr. 18.).

Po 96 h kultivace docházelo k nejrychlejšímu poklesu oxidoreduktázové aktivity u olova. Nejvyšší aktivitu oxidoreduktáz u variant s 50 a 250 µM koncentrací těžkého kovu vykazovalo kadmium, což bylo o 15 % výše než u zinku (Obr. 19.).


100 80 kadmium 60

olovo zinek

40 20 0 0

100

200

300

400

500

koncentrace (µM)

Obr. 19. Vliv koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku po 96 h kultivace (v %).

Oxidoreduktázy, jedna z nejpočetnějších tříd enzymů, katalyzují přenos atomů vodíku (dehydrogenázy) nebo elektronů (transelektronázy) či přenos atomu kyslíku do substrátu

49

(oxygenázy). Tvoří velmi důležité enzymové komplexy v aerobním dýchacím řetězci (Vodrážka, 2002). Lze je detekovat pomocí tetrazoliových solí, které volně difundují do buněk a následně jsou zde redukovány za vzniku nerozpustného barviva formazanu (Víteček et al., 2006), což svědčí o funkčním dýchacím řetězci (Fojtová a Kovařík, 2000).

5.1.3. Stanovení aktivity intracelulárních esteráz


Aktivita intracelulárních esteráz byla stanovena metodou uvedenou v kapitole 4.3.3.

100 0 Cd 80

50 Cd

60

100 Cd

40

250 Cd

20

500 Cd

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 20. Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). Vlivem kadmia docházelo u 50 a 100 µM koncentrace k pozvolnému poklesu viability, maximálně o 30 % u 100 µM koncentrace. Nejvyšší koncentrace kovu snížila po 96 h esterázovou aktivitu na čtvrtinu (Obr. 20.).


50

100 0 Pb 80

50 Pb

60

100 Pb

40

250 Pb

20

500 Pb

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 21. Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). Během prvních 72 h kultivace byly u 50 µM koncentrace olova zaznamenány hodnoty esterázové aktivity blížící se kontrole, po 96 h již aktivita enzymu klesla o 25 %. Velmi podobný průběh byl pozorován u variant se 100 a 250 µM koncentrací kovu. Nejvíce, až o


80 % po 96 h, se snižovala esterázová aktivita u nejvyšší koncentrace olova (Obr. 21.).

100 0 Zn 80

50 Zn

60

100 Zn

40

250 Zn

20

500 Zn

0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 22. Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %).

V důsledku působení zinku docházelo k výraznějšímu snížení esterázové aktivity u variant s 250 a 500 µM koncentrací. Největší pokles aktivity enzymu, o 75 %, byl zaznamenán u 500 µM koncentrace po 96 h (Obr. 22.).

51


30 25 20

kadmium

15

olovo

10

zinek

5 0 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 23. Vliv 500 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu intracelulárních esteráz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). Působením 500 µM koncentrace jednotlivých těžkých kovů se aktivita esteráz snížila pod 30 %. Nejnižší byla po celou dobu kultivace u olova. U kadmia a zinku byla prvních 48 h až na malé odchylky stejná. Po 72 a 96 h klesla aktivita kadmia o 1 % vůči zinku (Obr. 23.).

S rostoucí koncentrací jednotlivých těžkých kovů aktivita esteráz klesala. Nejvýrazněji se snížila u olova – u 50 µM koncentrace o 25 % a u 100 µM koncentrace o více než 50 %. Hodnoty esterázové aktivity po působení kadmia a zinku byly u všech sledovaných koncentrací velmi podobné (Obr. 24.).

relativní aktivita(%)

100 80 kadmium 60

olovo zinek

40 20 0 0

100

200

300

400

500

koncentrace (µM)

Obr. 24. Vliv koncentrace jednotlivých těžkých kovů na relativní aktivitu intracelulárních esteráz po 96 h kultivace (v %).

52

Snížení esterázové aktivity, jak uvádí literatura, svědčí o poškoženém metabolizmu (Víteček et al., 2006). Esterázy (EC 3.1.1.3.) katalyzují hydrolytické štěpení molekul jednoduchých esterů obsahujících krátké uhlíkaté řetězce (Bornscheuer, 2002). V rostlinných buňkách a pletivech se účastní mnoha biochemických dějů, např. výstavby buněčné stěny (Willats et al., 2001), degradace xenobiotik (Cummins et al., 2001) a signálních procesů (Stuhlfelder et al., 2002). Esterázy jsou enzymy vykazující nízkou substrátovou specifitu (Bornscheuer, 2002). Pro jejich detekci se nejčastěji používají fluorigenní substráty, které pronikají přes intaktní cytoplazmatickou membránu (Amano et al., 2003). Pro fotometrickou detekci bývá využíván nitrofenylacetátový test (Choi a Lee, 2001), pro fluorimetrickou detekci fluoresceindiacetátový test (Amano et al., 2003). Fluorimetrická metoda je velmi citlivá a je vhodná i tehdy, pokud je k dispozici jen malé množství vzorku (Víteček et al., 2004).

5.1.4. Vliv těžkých kovů na změny obsahu thiolových látek v suspenzní kultuře tabáku

Změny obsahu thiolových sloučenin v suspenzní kultuře tabáku byly stanoveny elektrochemicky, jak je uvedeno v kapitole 4.3.4.

Tab. 9. Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %). doba kultivace (h) 24 48 72 96

0 8,7 9,8 8,4 6,7

koncentrace kadmia (µM) 50 100 250 18,3 10,9 31,4 5,6 24,0 27,2 15,7 24,3 27,4 13,9 33,9 37,3

500 51,1 53,1 54,9 100,0

Nejvíce thiolových látek bylo produkováno při 500 µM koncentraci kadmia. U všech variant kromě dvou se obsah thiolů zvyšoval s rostoucí koncentrací kadmia a dobou kultivace (Tab. 9., Obr. 25.).

53

obsah thiolů (%)

100 80

0 Cd 50 Cd

60

100 Cd 40

250 Cd 500 Cd

20 0 24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 25. Vliv koncentrace kadmia a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %).

Tab. 10. Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %). doba kultivace (h) 24 48 72 96

0 11,3 15,7 16,1 13,6

koncentrace olova (µM) 50 100 250 16,9 17,8 24,0 7,6 8,5 17,1 29,0 34,6 33,0 26,0 26,9 27,6

500 41,9 44,7 28,9 50,8

Obsah thiolových sloučenin u suspenze ovlivněné různými koncentracemi olova značně kolísal. Po 24 a 96 h byl pozorován nárůst obsahu thiolů s rostoucí koncentrací kovu. U variant s 50 a 100 µM koncentrace byl po 48 h zaznamenán pokles obsahu thiolů oproti kontrole řádově o 10 % (Tab. 10., Obr. 26.).

54

60 obsah thiolů (%)

50 0 Pb 40

50 Pb

30

100 Pb 250 Pb

20

500 Pb 10 0 24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 26. Vliv koncentrace olova a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %). Tab. 11. Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %). doba kultivace (h) koncentrace zinku (µM) 0 50 100 250 7,8 29,6 25,5 16,0 24 5,6 7,1 15,0 37,6 48 14,5 18,4 20,5 28,4 72 13,6 7,6 16,8 39,3 96

500 9,2 15,7 25,3 44,9

U 50 a 100 µM koncentrace zinku byl pozorován největší obsah thiolů po prvních 24 h kultivace. Po 48 a 72 h byl nejvyšší obsah thiolových látek u 250 µM koncentrace (Tab. 11., Obr. 27.).

55

obsah thiolů (%)

50 40

0 Zn 50 Zn

30

100 Zn 20

250 Zn 500 Zn

10 0 24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 27. Vliv koncentrace zinku a doby jeho působení na změny obsahu thiolových látek v buněčné suspenzi tabáku (v %).

Ze sledovaných těžkých kovů produkovalo nejvíce thiolů kadmium, nejméně zinek. Největší nárůsty oproti kontrolním variantám byly pozorovány u 500 µM koncetrací u kadmia a olova. U zinku nastalo velké zvýšení i u 250 µM koncentrace kovu.

Elektrochemické metody umožňují rychlé a citlivé stanovení anorganických a organických látek ve složité biologické matrici. Jejich podstatou je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci (Klouda, 2003). V tomto experimentu bylo pro stanovení změn obsahu thiolových slouženin využito diferenční pulzní voltametrie (DPV) – modifikované Brdičkovy reakce (Olafson a Sim, 1979; Paleček a Pechan, 1971). U DPV je na elektrodu přiváděn lineárně rostoucí potenciál. Na konci doby časového kroku je přiveden na elektrodu potenciálový pulz s konstantní amplitudou. Proud je měřen před vložením potenciálového pulzu a před koncem tohoto pulzu. Na konci je hodnota kapacitního proudu nízká a metoda se tak stává výrazně citlivější (Dryhurst, 1977). Pomocí výše zmiňované Brdičkovy reakce lze stanovovat hlavně bílkoviny, ale i další látky, obsahující sulfhydrylovou či disulfidickou vazbu. Měří se signál proteinu na rtuťové elektrodě v prostředí kobaltnaté soli v amonném pufru o pH = 9,2 (Raspor et al., 2001). Metoda vyvinutá prof. Brdičkou (Brdička, 1933) byla v osmdesátých letech použita v environmentálních studiích (Raspor, 2001). Výhodou modifikované metody je, že

56

pro měření stačí i nepatrné množství dané látky, obsahující SH skupiny (Raspor et al., 2001).

5.2. Sledování účinku 1,4-naftochinonu na suspenzní kulturu tabáku

Buněčná suspenze tabáku linie BY-2 byla ovlivněna přídavkem 1,4-naftochinonu v koncentračním rozmezí od 0,01 do 6 µM (Tab. 4.) a po dobu čtyř dnů od založení experimentu byl sledován jeho účinek na viabilitu a oxidoreduktázovou aktivitu.

5.2.1. Stanovení viability buněk

Viabilita buněk byla stanovena metodou uvedenou v kapitole 4.3.1.

Tab. 12. Vliv 1,4-naftochinonu na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku (v %). doba kultivace (h) 0 24 48 72 96

koncentrace 1,4-naftochinonu (µ µM) 0 95 96 98 97 96

0,01 95 91 98 98 95

0,03 95 93 97 96 95

0,1 95 97 96 98 95

0,3 95 98 93 98 95

1 95 91 98 95 95

3 95 89 90 94 95

6 95 82 70 73 85

Na začátku experimentu byla hodnota viability 95 %. Během kultivace docházelo u jednotlivých variant pouze k mírnému kolísání počtu živých buněk. Největší pokles viability byl pozorován po 48 h kultivace u varianty s 6 µM koncentrací 1,4-naftochinonu (Tab. 12., Obr. 28.).

57

100

0 µM

viabilita (%)

0,01 µM 90

0,03 µM 0,1 µM

80

0,3 µM 1 µM

70

3 µM 6 µM

60 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 28. Vliv 1,4-naftochinonu na viabilitu buněk v suspenzní kultuře tabáku (v %).


Oxidoreduktázová aktivita byla stanovena metodou uvedenou v kapitole 4.3.2.

Tab. 13. Vliv 1,4-naftochinonu na aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %). koncentrace 1,4-naftochinonu (µ µM) 0 0,01 0,03 0,1 0,3 1 3 6

0 6 6 6 6 6 6 6 6

doba kultivace (h) 24 48 72 11,14 26,65 40,59 11,65 25,82 39,75 13,84 25,68 49,58 12,67 29,31 51,49 11,23 29,12 62,58 6,29 23,95 39,14 9,59 25,30 43,24 3,63 4,01 16,59

96 80,62 74,65 85,23 100,00 86,81 79,31 77,49 35,74

U variant s koncentracemi 1,4-naftochinonu v rozmezí 0,01 až 0,3 µM byla, až na některé výjimky, pozorována zvýšená oxidoreduktázová aktivita oproti kontrole. Ostatní zkoumané koncentrace 1,4-naftochinonu již aktivitu enzymu snižovaly.

58

K největšímu poklesu oxidoreduktázové aktivity, až o 45 %, došlo u 6 µM koncentrace


(Tab. 13., Obr. 29.).

0 µM

100

0,01 µM 80

0,03 µM

60

0,1 µM 0,3 µM

40

1 µM 20

3 µM

0

6 µM 0

24

48

72

96

doba kultivace (h)

Obr. 29. Vliv 1,4-naftochinonu na relativní aktivitu oxidoreduktáz v buňkách suspenzní kultury tabáku (v %).

59

6. ZÁVĚR

V této bakalářské práci je zpracován literární přehled zabývající se problematikou stresu, stresových faktorů a stresové reakce rostlin. Zvláštní pozornost je věnována těžkým kovům a 1,4-naftochinonu. Experimentální část je zaměřena na sledování účinku kadmia, olova, zinku a 1,4-naftochinonu na modelový systém suspenzní kultury tabáku linie BY-2. Bylo provedeno stanovení viability buněk, aktivity oxidoreduktáz a intracelulárních esteráz a stanovení změn obsahu thiolových sloučenin. Nejvyšší toxický účinek vykazovaly olovo a kadmium. Byla pro ně vypočtena hodnota LC50 = 52,6 µM pro olovo a LC50 = 52,5 µM pro kadmium. U zinku byl toxický účinek nejnižší (LC50 = 65 µM). U všech sledovaných těžkých kovů docházelo s rostoucí koncentrací k poklesu viability, oxidoreduktázové i esterázové aktivity. Po 96 h klesla viabilita u kadmia a olova u 50 µM koncentrace na 50 %, u 500 µM koncentrace na třetinu. U zinku se ve stejném čase snížila viabilita u 50 µM koncentrace o polovinu, u 500 µM koncentrace byla 35 %. Aktivitu oxidoreduktáz nejvíce inhibovalo olovo - při 500 µM koncentraci se po 96 h snížila na čtvrtinu. Kadmium vykazovalo ve stejné koncentraci a ve stejném čase pokles aktivity oxidoreduktáz na třetinu a zinek asi na 40 %. Esterázová aktivita kadmia a zinku po 96 h kultivace klesla u 500 µM koncentrace přibližně na třetinu. U olova byla nejnižší. Obsah thiolových sloučenin se nejvíce zvyšoval působením kadmia - s rostoucí koncentrací a dobou kultivace. U olova byl pozorován maximální obsah thiolových sloučenin u 500 µM koncentrace po 96 h kultivace, kdy dosáhl 50 % hodnoty obsahu thiolů u kadmia. Nejméně stoupaly obsahy thiolových sloučenin působením zinku. 1,4-naftochinon ovlivnil snížení viability a oxidoreduktázové aktivity až při koncentraci 6 µM . Viabilita klesla nejvíce po 48 h, a to o čtvrtinu. Aktivita oxidoreduktáz klesla o 45 % po 96 h kultivace.

60

7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ABDEL-SABOUR, M. F.; MORTVEDT, J. J.; KELSOE, J. J. Cadmium-zinc interactions in plants and extractable cadmium and zinc fractions in soil. Soil. Sci., 1988, roč. 145. č. s. 424-431. AMANO, T.; HIRASAWA, K.; O'DONOHUE, M. J.; PERNOLLE, J.; SCHIOI, Y. A versatile assay for the accurate, time-resolved determination of cellular viability. Anal. Biochem., 2003, roč. 314. č. s. 1–7. BABULA, P.; MIKELOVÁ, R.; ADAM, V.; POTĚšIL, D.; ZEHNÁLEK, J.; KIZEK, R.; HAVEL, L.; SLADKý, Z. Chromatografické stanovení naftochinonů v rostlinách. Chem. Listy, 2006, roč. 100. č. s. 271-276. BARCELÓ, J.; POSCHENRIEDER, C.; ANDREU, I.; GUNSE, B. Cadmium-induced decrease of water stress resistance in bush bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Contender). J. Plant Physiol., 1986, roč. 125. č. s. 17-25. BENCKO, V.; CIKRT, M.; LENER, J. Toxické kovy v životním a pracovním prostředí člověka. Praha: Grada Publishing, 1995. BORNSCHEUER, U. T. Microbial carboxyl esterases: clasification, properties and application in biocatalysis. FEMS Microbiol. Rev., 2002, roč. 26. č. s. 73-81. BOWLER, C.; VAN MONTAGU, M.; INZÉ, D. Superoxide dismutases and stress tolerance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1992, roč. 43. č. s. 83-116. BRDIČKA, R. Collect. Czech. Chem. Commun., 1933, roč. 5. č. 112, s. BUCHANAN, B. B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville: American society of plant biologists, 2002. BURZYNSKI, M. Influence of lead on chlorophyll content and on initial steps of its sythesis in greening cucumber seedlings. Acta. Soc. Bot. Pol., 1985, roč. 54. č. s. 147-154. CIBULKA, J. A. K. Pohyb olova, kadmia a rtuti v biosféře. Praha: Academia, 1991. CLEMENS, S.; PALMGREN, M. G.; KRÄMER, U. A long way ahead: understanding and engineering plant metal accumulation. Trends Plant Sci., 2002, roč. 7. č. 7, s. 309-315. COBBETT, C. S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification. Curr. Opin. Plant Biol., 2000, roč. 3. č. s. 211–216. CUMMINS, I.; BURNET, M.; EDWARDS, R. Biochemical characterisation of esterases active in hydrolysing xenobiotics in wheat and competing weeds. Physiol. Plant., 2001, roč. 113. č. s. 477-485. DAS, P.; SAMANTARAY, S.; ROUT, G. R. Studies on cadmium toxicity in plants: A review. Environmental Pollution, 1997, roč. 98. č. 1, s. 29-36. DELLEDONNE, M.; MURGIA, I.; EDERLE, D.; SBICEGO, P. F.; BIONDANI, A.; POLVERARI, A.; LAMB, C. Reactive oxygen intermediates modulate nitric oxide signaling in the plant hypersensitive disease-resistance response. Plant Physiol. Biochem., 2002, roč. 40. č. 6-8, s. 605-610. DOMAžLICKÁ, E.; OPATRNý, Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and the selection of potencially Cd-resistant cell lines. Biol. Plant., 1989, roč. 31. č. 5, s. 408-412. DRYHURST, G. Elektrochemistry of biological molecules. New York, San Francisco: London: Academic Press, 1977. FILNER, P. Exp. Cell Res., 1965, roč. 39. č. s. 33-39. FOJTOVÁ, M.; KOVAŘÍK, A. Automatizovaná metoda stanovení viability. In (eds.). Metodické dny 2000: 2000, s. lSBN FOYER, C. H.; NOCTOR, G. Oxygen processing in photosynthesis: regulation and signalling. New Phytologist, 2000, roč. 146. č. 3, s. 359-388.

61

GEELEN, D. N. V.; INZÉ, D. A Bright future for the bright yellow-2 cell culture. Plant Physiol., 2001, roč. 127. č. s. 1375-1379. GILES, F. J.; LIST, A. F.; ROBOZ, G. J.; TSIMBERIDOU, A. M.; LAURENT, D.; REITSMA, D.; KOWALSKI, M. O.; KANTARJIAN, H.; FELDMAN, E. J. Phase I/II study of PTK787/ZK 222584 (PTK/ZK), a novel, oral VEGF-receptor inhibitor, in patients with myelofibrosis with myeloid metaplasia. Blood, 2003, roč. 102. č. 11, s. 922A-923A. GREENWOOD, N. N.; EARNSHAW, A. Chemie prvků I., II. Praha: Informatorium, 1993. GRILL, E.; LOFFLER, S.; WINNACKER, E.-L.; ZENK, M. H. Phytochelatins, the heavymetal-binding peptides of plants, are sinthesized from glutathione by a specific γglutamylcysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, roč. 86. č. s. 6838–6842. GRILL, E.; WINNACKER, E.-L.; ZENK, M. H. Phytochelatins: the principal heavy-metal complexing peptides of higher plants. Science, 1985, roč. 320. č. s. 674–676. HA, S.-B.; SMITH, S. P.; HOWDEN, R.; DIETRICH, W. M.; BUGG, S.; O'CONNELL, M. J.; GOLDSBROUGH, P. B.; COBBETT, C. S. Phytochelatin synthase genes from Arabidopsis and the yeast, Schizosaccharomyces pombe. Plant Cell, 1999, roč. 11. č. s. 1153–1164. HAGEMEYER, J.; KAHLE, H.; BRECLE, S. W.; WAISEL, Y. Cd in Fagus sylvatica L. trees and seedlings: leaching, uptake and interconnection with transpiration. Wat. Air Soil Pollut., 1986, roč. 29. č. 4, s. 347-359. HAGHIRI, F. Cd uptake by plants. J. Environ. Qual., 1973, roč. 3. č. 2, s. 180-183. HALL, J. L.; WILLIAMS, L. E. Transition metal transporters in plantsTransition metal transporters in plants. Exp. Bot., 2003, roč. 54. č. 393, s. 2601-2613. HOVMAND, M. F.; TJELL, J. C.; MOSBAEK, H. Plant uptake of airborne cadmium. Environm. Pollut., 1983, roč. 30. č. s. 27-38. CHOI, Y.-J.; LEE, B. H. Culture conditions for the production of esterase from Lactobacillus casei CL96. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2001, roč. 24. č. s. 59– 63. JONES, K. H.; SENFT, J. A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate propidium iodide. J. Histochem. Cytochem., 1985, roč. 33. č. s. 77–79. KLOUDA, P. Moderní analytické metody. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. KOJIMA, Y. Definitions and nomenclature of metallothioneins. Methods Enzymol., 1991, roč. 205. č. s. 8–10. KONDO, N.; IMAI, K.; ISOBE, M.; GOTO, T.; MURASUGI, A.; WADANAKAGAWA, C.; HAYASHI, Y. Cadystin A and B, major subunit peptides comprising cadmium binding peptides induced in fission yeast—separation, revision of structures and synthesis. Tetrahedron Lett., 1984, roč. 25. č. s. 3869–3872. KOVÁČ, J. Explantátové kultury rostlin. Olomouc: UP, 1995. LOCIGNO, R.; CASTRONOVO, V. Reduced glutathione system: Role in cancer development, prevention and treatment (Review). Int. J. Oncol., 2001, roč. 19. č. 2, s. 221236. MAITANI, T.; KUBOTA, H.; SATO, K.; YAMADA, T. The composition of metals bound of class III metallothionein (phytochelatine its desglycil peptide) induced by various metals in root cultures of Rubia tinctorum. Plant Physiol., 1996, roč. 110. č. s. 1145–1150. MEISTER, A.; ANDERSON, M. E. Glutathione. Ann. Rev. Biochem., 1983, roč. 52. č. s. 711–760.

62

MITTLER, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science, 2002, roč. 7. č. 9, s. 405-410. MOORE, S. B.; HOPKE, B. J. Chem.Biochem., 2001, roč. 2. č. 35, s. MULLINS, G. L.; SOMMERS, L. E. Characterization cadmium and zinc in four soils treated with sewage sludge. J. Environm. Qual., 1986, roč. 15. č. 4, s. 382-387. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 1962, roč. 15. č. s. 473-497. NAGATA, T.; NEMOTO, Y.; HASEZAWA, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell line in the cell biology of higher plants. Int Rev Cytol, 1992, roč. 132. č. s. 1-30. OLAFSON, R. W.; SIM, R. G. Anal. Biochem., 1979, roč. 100. č. 343, s. ORTIZ, D. F.; RUSCITTI, T.; MCCUE, K. F.; OW, D. W. Transport of metal-binding peptides by HMT1, a fission yeast ABC-type vacuolar membrane protein. J. Biol. Chem., 1995, roč. 270. č. s. 4721–4728. PALEČEK, E.; PECHAN, Z. Anal. Biochem., 1971, roč. 42. č. 59, s. PROCHÁZKA, S.; MACHÁČKOVÁ, I.; KREKULE, J.; ŠEBÁNEK, J. Fyziologie rostlin. Praha: Academia, 2003. PROKEš, J. Úvod do toxikologie. Praha: Univerzita Karlova, 1.LF, 2005. RASPOR, B. Elucidation of the mechanism of the Brdička reaction. J. Electroanal. Chem., 2001, roč. 503. č. s. 159-162. RASPOR, B.; PAIĆ, M.; ERK, M. Analysis of metallothioneins by modified Brdička procedure. Talanta, 2001, roč. 55. č. s. 109–115. RECETOX. recetox, 2006 (vol 2006). RICHMAN, P. G.; MEISNER, A. Regulation of γ-Glutymyl-Cysteine synthase by nonallosteric feedback inhibition by glutathione. J. Biol. Chem., 1975, roč. 250. č. s. 1422– 1426. SALT, D. E.; WAGNER, G. J. Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots: evidence for a Cd2(+)/H(+) antiport activity. J. Biol. Chem., 1993, roč. 268. č. s. 12297–12302. SAWERT, A.; WEIGEL, H. J.; JÄGER, H. J. Aufnahme und organ spezifische verteilung von cadmium bei Solanaceae. Angew. Bot., 1987, roč. 61. č. s. 439-451. SCHMÖGER, M. E.; OVEN, M.; GRILL, E. Detoxification of arsenic by phytochelatins in plants. Plant Physiol., 2000, roč. 122. č. s. 793–801. SIGMA-ALDRICH. Sigma-Aldrich, 2005 (vol 2005). SIMPKINS, I.; COLLIN, H. A.; STEET, H. E. Physiol. Plant., 1970, roč. 23. č. s. 385-396. STUHLFELDER, C.; LOTTSPEICH, F.; MUELLER, M. J. Purification and partial amino acid sequences of an esterase from tomato. Phytochemistry, 2002, roč. 60. č. s. 233–240. THOMASHOW, M. F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiol, 1998, roč. 118. č. s. 1-7. UHLÍŘOVÁ, H.; MIOVSKÁ, B.; FABIÁNEK, P. Mechy jako bioindikátory zatížení lesních ekosystémů stopovými prvky. Zprávy lesnického výzkumu, 1995, roč. 40. č. 2, s. 27-30. VACEK, J.; KIZEK, R.; KLEJDUS, B.; HAVEL, L. Fytochelatiny a jejich role pro detoxifikaci těžkých kovů: biosyntéza, regulace a transport. Biol. Listy, 2003, roč. 68. č. 2, s. 133-153. VAN ASSCHE, F.; CARDINAELS, C.; CLIJSTERS, H. Induction of enzyme capacity in plants as a result of heavy metal toxicity: dose-response relations in Phaseolus vulgaris L., treated with zinc and cadmium. Environm. Pollut., 1988, roč. 52. č. 2, s. 103-115. VIERLING, E. The roles of heat-shock proteins in plants. Annu Rev Plant Biol, 1991, roč. 42. č. s. 579-620.

63

VÍTEČEK, J.; ADAM, V.; PETŘEK, J.; BABULA, P.; NOVOTNÁ, P.; KIZEK, R.; HAVEL, L. Aplikace spektrofluorimetrického stanovení esteras v rostlinném materiálu. Chem. Listy, 2005, roč. 99. č. s. 496-501. VÍTEČEK, J.; ADAM, V.; PETŘEK, J.; VACEK, J.; KIZEK, R.; HAVEL, L. Esterases as a marker for growth of BY-2 tobacco cells and early somatic embryos of the Norway spruce. Plant Cell Tissue Organ Cult., 2004, roč. 79. č. s. 195–201. VÍTEČEK, J.; WÜNSCHOVÁ, A.; PETŘEK, J.; HAVEL, L.; ADAM, V.; KIZEK, R. Analysis of cell death induced by sodium nitroprusside and hydrogen peroxide in tobacco cell suspension. Biol. Plant., 2006, roč. Odesláno. č. s. VODRÁžKA, Z. Biochemie. Praha: Academia, 2002. WANG, W. X.; VINOCUR, B.; ALTMAN, A. Plant responses to drought, salinity and extreme temperatures: towards genetic engineering for stress tolerance. Planta, 2003, roč. 218. č. 1, s. 1-14. WILLATS, W. G. T.; ORFILA, C.; LIMBERG, G.; BUCHHOLT, H. C.; VAN ALEBEEK, G.-J. W. M.; VORAGEN, A. G. J.; MARCUS, S. E.; CHRISTENSEN, T. M. I. E.; MIKKELSEN, J. D.; MURRAY, B. S.; KNOX, J. P. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. J. Biol. Chem., 2001, roč. 276. č. 22, s. 19404-19413. ZENK, M. H. Heavy metal detoxification in higher plants – a review. Gene, 1996, roč. 179. č. s. 21–30. ZURERA-COSANO, G.; MORENO-ROJAS, R.; SALMERON-EGEA, J.; POZO LORA, R. Heavy metal uptake from greenhouse border soils for edible vegetables. J. Sci. Food Agr., 1989, roč. 49. č. 3, s. 307-314.

SUSPENZNÍ KULTURA TABÁKU JAKO MODELOVÝ SYSTÉM PRO STUDIUM STRESOVÉ REAKCE ROSTLIN

Recommend Documents