České vysoké učení technické v Praze Fakulta biomedicínského inženýrství Katedra biomedicínské techniky
Studium elektrofyziologických vlastností mozkové tkáně při umělé plicní ventilaci Teze disertační práce Doktorský studijní program: Biomedicínská a klinická technika
Listopad 2011
Disertační práce byla vytvořena během postgraduálního studia na Katedře biomedicínské techniky Fakulty biomedicínského inženýrství Českého vysokého učení technického v Praze.
Doktorand:
Ing. Richard Grünes Katedra biomedicínské techniky Fakulta biomedicínského inženýrství, ČVUT v Praze Nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno, Česká republika
Vedoucí:
doc. Ing. Karel Roubík, Ph.D. Katedra biomedicínské techniky Fakulta biomedicínského inženýrství, ČVUT v Praze Nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno, Česká republika
Oponenti:
prof. MUDr. Pavel Kučera, Ph.D. Institut de Physiologie de la Faculte de Medecine Universite de Lausanne Ch-1011 Lausanne, Switzerland doc. Ing. Vladimír Eck, CSc. Katedra kybernetiky Fakulta elektrotechnická, ČVUT v Praze Karlovo náměstí 13, 121 35 Praha 2, Česká republika Ing. Marek Penhaker, Ph.D. Katedra kybernetiky a biomedicínského inženýrství Fakulta elektrotechniky a informatiky, VŠB-TU Ostrava 17. listopadu 15, 708 33 Ostrava, Česká republika
Termín obhajoby disertační práce: Obhajoba práce proběhne 25. ledna 2012 v 15.30 před komisí sestavenou oborovou radou pro doktorský studijní program Biomedicínská a klinická technika v místnosti 615, v 6. patře Fakulty biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze, Nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno.
Prof. Ing. Peter Kneppo, DrSc. Předseda oborové rady Fakulta biomedicínského inženýrství ČVUT v Praze Nám. Sítná 3105, 27201 Kladno
Bližší informace o obhajobě disertační práce jsou k dispozici na sekretariátu děkana FBMI, ČVUT v Praze, Nám. Sítná 3105, 272 01 Kladno.
Obsah 1 Úvod do problematiky, současný stav ............................................................................. 6 2 Cíle disertační práce ....................................................................................................... 13 3 Metodika animálních experimentů ................................................................................ 15 3.1 Příprava laboratorních zvířat.................................................................... 15 3.2 Ventilační podpora laboratorních zvířat .................................................. 16 3.3 Záznam elektrické aktivity mozku ........................................................... 17 4 Metody zpracování naměřených dat .............................................................................. 19 4.1 Předzpracování záznamu ......................................................................... 19 4.2 Metody analýzy získaných parametrů ..................................................... 21 5 Výsledky ........................................................................................................................ 22 5.1 Celková charakteristika souboru naměřených dat ................................... 22 5.2 Časový vývoj výskytu EAP v průběhu experimentu ............................... 22 5.3 Klasifikace typů EAP ............................................................................... 24 5.4 Statistické vyhodnocení parametrů EAP v průběhu experimentu .......... 26 6 Závěr .............................................................................................................................. 27 7 Literatura ........................................................................................................................ 29 8 Publikace ........................................................................................................................ 33
1
Úvod do problematiky, současný stav Disertační práce se zabývá studiem vlivu hladiny kyslíku a oxidu uhličitého na
elektrickou aktivitu mozku v oblasti kortexu. Míra okysličení tkáně má zásadní vliv na míru poškození mozkové tkáně a na jeho reversibilitu či ireversibilitu. Na rozsah následného poškození mozkové tkáně v důsledku hypoxie proto může mít vliv také aplikovaná umělá plicní ventilace (UPV), určující množství kyslíku, které je organismu dodáváno, spolu s množstvím odváděného oxidu uhličitého a následně další související parametry, jako pH, metabolické procesy apod. Studium lokálních elektrofyziologických parametrů mozkové tkáně je proto prováděno v závislosti na zvoleném režimu UPV. Nalezení korelace mezi lokálními elektrofyziologickými parametry a parametry UPV a následný přechod ke globálním parametrům by mohlo vést nejen k predikci dalšího vývoje poškození mozkové tkáně při UPV, ale i ke komplexní optimalizaci okamžitého ventilačního režimu z hlediska dlouhodobého, tj. zejména vlivu na mortalitu a kvalitu života. V centru zájmu současného výzkumu je ověření vlivu hladiny okysličení mozkové tkáně na její fyziologické procesy na buněčné úrovni. Vliv hypoxie (anoxie) a hyperkapnie na nervové buňky je pozorován na různých úrovních fyziologických procesů buňky. Mezi tyto procesy patří například přenos impulsu pomocí transmiterů na synapsích mezi jednotlivými neurony, ale také procesy transportu iontů přes buněčnou membránu neuronů mezi intracelulárním a extracelulárním prostorem [1][2]. Ovlivnění těchto procesů v důsledku hypoxie, popřípadě anoxie, nebo hyperkapnie vede ke změnám dráždivosti těchto buněk [3][4][5], ke změně vodivosti membrány pro jednotlivé ionty [6][7], ke změně velikosti klidového membránového potenciálu [7][8][9][10][11][12] a v neposlední řadě také ke změně tvaru presynaptického, postsynaptického nebo akčního potenciálu (AP) [13][14][15][16]. Extracelulární záznam elektrické aktivity mozkových buněk s sebou přináší některé komplikace. Je potřeba si uvědomit, že extracelulární prostor představuje nelineární objemový vodič. Tímto objemovým vodičem protékají proudy generované jednotlivými neurony [17]. Práce zabývající se simulacemi závislosti AP (tj. membránového potenciálu) a jednotkové
aktivity
(tj.
extracelulárního
akčního
potenciálu
–
EAP)
dospívají
k následujícímu závěru. Matematické výpočty spolu s následným měřením potvrdily, že potenciál v extracelulárním prostoru souvisí s první a druhou derivací AP neuronu v závislosti na místu snímání [18][19][20]. Jeho průběh oproti průběhu AP má opačnou polaritu a přibližně o tři řády menší amplitudu [21][22][23], což je způsobeno právě první derivací AP. Srovnání tvaru obou průběhů je na Obr. 1. 6
Obr.
1: Porovnání zprůměrovaného tvaru intracelulárního a extracelulárního akčního potenciálu, volně podle [21].
akčního
potenciálu
K výpočtu a simulaci elektrického potenciálu v extracelulárním prostoru neuronu používali Gold a další modelování buněčné membrány neuronu pomocí Laplaceovy rovnice [24][25][17].
Obr. 2: Simulace potenciálu v extracelulárním prostoru [24]. Jak je zobrazeno na Obr. 2, simulace průběhu potenciálu v extracelulárním prostoru začíná malým pozitivním hrotem (1), po kterém následuje rychlá negativní výchylka (3) a ta je zakončena pomalým pozitivním hrotem (4). Negativní výchylka je výsledkem vstupujících sodíkových proudů a představuje depolarizaci membrány neuronu. Velikost této výchylky závisí na velikosti vodivosti sodíkových kanálů. Naproti tomu závěrečná positivní výchylka potenciálu odpovídá vystupujícím proudům pomalých draslíkových kanálů a její velikost závisí hlavně na vodivosti draslíkových kanálů. Extracelulární prostor se díky svým vlastnostem chová jako dolní propust, proto se amplituda EAP se vzdáleností od neuronu rychle zmenšuje. Bodová aproximace extracelulárního potenciálu jako funkce axiálních proudů, namísto membránových proudů, 7
ukazuje, že EAP je úměrná druhé derivaci membránového potenciálu vzhledem k příčné pozici vůči ose neuronu [17][24]. Tvar i velikost amplitudy EAP také značně závisí na podélné poloze elektrody vůči ose neuronu (viz Obr. 3). Na tvar EAP mají vliv všechny potenciály vznikající v těle neuronu. EAP proto může nabývat tvaru postsynaptického potenciálu v blízkosti synapse, akčního potenciálu v blízkosti axonu, nebo presynaptického potenciálu v blízkosti dendritu.
Obr. 3: Detail simulace vlivu polohy snímání EAP na jeho tvar; zleva EAP ovlivněný postsynaptickým, akčním a presynaptickým potenciálem [24]. Tento fakt je velmi významný v případě laterálního rozložení excitace podél dendritu neuronu. Nicméně, provedené simulace a měření EAP dokazují závislost EAP na následujících faktorech [24]: 1. Biologické pozadí – průběh EAP závisí na tvaru buněk, buněčné morfologii a specifické vodivosti buněčné membrány pro jednotlivé ionty. 2. Pozice elektrody – amplituda EAP je silně závislá na pozici elektrody vůči neuronu. Proto by měla být během měření zajištěna stabilní poloha elektrody vůči neuronu. 3. Technické parametry měřicího setu – měřený signál je značně ovlivňován vlastnostmi měřicích mikroelektrod a dále pak zvoleným zesilovačem a použitými filtry. Výsledný signál měřený v extracelulárním prostoru neobsahuje pouze EAP vybraného neuronu, ale také příspěvky aktivit od okolních neuronů a zároveň také celkovou elektrickou aktivitu mozkové tkáně v podobě šumu. Jak je patrné z Obr. 4 vpravo, může aktivita okolních neuronů při nevhodném načasování ovlivnit průběh zaznamenaného signálu, což se může
8
projevit jako zdánlivě odlišný tvar EAP neuronu. Při dostatečném časovém odstupu jednotlivých aktivit zůstává tvar EAP neuronu beze změny Obr. 4 vlevo. Proto je potřeba měřicí elektrodu umístit co nejblíže snímanému neuronu, aby vliv okolních neuronů byl co nejmenší.
Obr. 4: Vliv aktivity okolních neuronů na výsledný zaznamenaný signál. Vlevo dva neurony A a B, šipkou je označeno místo snímání; vpravo EAP neuronu A a B a jejich sumačního signálu. Jak již bylo řečeno, na tvar EAP má značný vliv také typ použité snímací elektrody. Pro snímání extracelulární EAP se nejčastěji používají kovové mikroelektrody. Při styku elektrody s fyziologickým roztokem vzniká tzv. Helmholtzova dvojvrstva, která má kapacitní vlastnosti [26]. Její elektrické vlastnosti lze popsat pomocí odporu Rt a kapacity Cdl. Hodnoty odporu a kapacity této dvojvrstvy závisejí na mnoha parametrech, jakými jsou například teplota roztoku, proudová hustota a specifický povrch elektrody. Náhradní elektrické zapojení přechodu fyziologický roztok–elektroda, je zobrazeno na Obr. 5, odpor Rs – odpor fyziologického roztoku, Rt – odpor rozhraní elektroda–fyziologický roztok, Cdl – kapacita na tomto rozhraní (Helmholtzova dvojvrstva), Rm – odpor kovu elektrody, Csh – svodová kapacita. Dále tento signál obsahuje artefakty, které se na něho superponují z okolního prostředí. Největší příspěvek rušení vyskytujícího se v signálu je tzv. síťový brum, který se indukuje do vodičů vedoucích od elektrod ke snímacímu zařízení. Dále se do signálu promítá vysokofrekvenční rušení způsobené synchronizačními impulsy a logickými signály elektrických obvodů a svalová aktivita. Přestože je většina energie tohoto rušení potlačena 9
Obr. 5: Náhradní elektrické zapojení přechodu elektrolyt–elektroda [26]. pásmovými zádržemi měřicího zesilovače, promítají se do signálu složky vyšších harmonických frekvencí tohoto rušení. Proto je nezbytné před samotným vyhodnocováním signálu provést tzv. předzpracování tohoto signálu. Působení hypoxie na tvar AP, jak uvádí ve své práci Englund [12], se projevuje ve změně hodnoty potenciálu v jednotlivých úsecích AP [15][7], ale zároveň také v délce trvání těchto úseků. Velmi názorně je vliv hypoxie na tvar AP popsán v práci Sebestião [15]. V článku je posuzován vliv presynaptické a postsynaptické blokády přenosu u synapsí v hipokampu během hypoxie na vzorcích mozkové tkáně laboratorních potkanů v podmínkách in vitro. Změna hladiny kyslíku v roztoku, ve kterém byly uloženy vzorky mozkové tkáně, měla okamžitou odezvu na tvar i velikost excitačního postsynaptického potenciálu (EPSP). Při blokádě adenosinových receptorů subtypu A1 klesla velikost EPSP během hypoxie až na hodnotu 8,8 % z původní velikosti EPSP při normoxii. Po reoxygenaci roztoku se hodnota amplitudy EPSP u vzorků mozkové tkáně vrátila v limitu 30 minut na původní hodnotu. Také při presynaptické blokádě a blokádě receptorů N-metyl D-aspartamu (NMDA) dojde k poklesu amplitudy EPSP v důsledku hypoxie. Stejně jako u blokády adenosinových receptorů dochází i v tomto případě po reoxygenaci k návratu hodnoty potenciálu na původní hodnotu. Výjimkou je blokáda postsynaptického přenosu, kdy nedošlo, jak uvádí ve své práci Sebestião [15], k úplnému obnovení potenciálu na původní hodnotu. Hodnota EPSP po reoxygenaci dosahovala pouze 68 % původní hodnoty amplitudy EPSP. Vliv hyperkapnie na aktivitu mozkové tkáně popisují ve svých pracích Dillon [32] a Ryan [33]. Oba autoři se zabývají vlivem hyperkapnie na nervové buňky hypotalamu. Vliv hyperkapnie na nervové buňky se v obou pracích projevil snížením četnosti AP nervových buněk. Na synaptickém rozhraní způsobuje hypoxie uvolňování různých neurotransmiterů, mezi které můžeme zahrnout aminokyseliny, jakým je například glutamát. Nárůst hladiny glutamátu a následná aktivace ionotropních NMDA receptorů jsou primárně odpovědné za 10
poškození nervových buněk v důsledku hypoxie [27][28][29]. Kromě neurotransmiterů je během hypoxie ovlivňováno také množství neuromodulátorů, jako například adenosinu [30][31]. Jak potvrdilo mnoho studií, má hypoxie vliv na navýšení vodivosti draslíkových iontů K
+
u nervových buněk hipokampu již během její počáteční fáze. Nárůst vodivosti
draslíkových iontů má za následek hyperpolarizaci membránového potenciálu. V počáteční fázi anoxie dochází jak k nárůstu vodivosti draslíkových iontů, tak současně také k nárůstu hladiny aminopyridinů, které naopak tuto vodivost snižují [7][8][9]. Po navrácení hladiny kyslíku do normoxie se i hodnota membránového potenciálu vrací na svou původní hodnotu. Hypoxie také dále působí na hladiny extracelulárního sodíku Na+ a kalcia Ca2+, které také ovlivňují membránový potenciál a způsobují jeho depolarizaci [8]. Je nutné zkonstatovat, že všechny dříve zmíněné články se zabývají vlivem hypoxie na nervové buňky pouze v prostředí in vitro. Pro dosažení hypoxie při experimentech uváděných v těchto článcích je používáno takových hodnot frakce kyslíku, které by při experimentech in vivo vedly ke smrti měřených subjektů. Z metod používaných při experimentech vyplývá, že pro navození hypoxie, nebo spíše anoxie, ve vzorku mozkové tkáně je běžně používán roztok nasycený plynem s obsahem 95 % N2 a 5 % CO2. Z toho lze jen těžko vyvozovat, jak bude hypoxie působit na nervové buňky s hladinami krevních plynů, které lze navodit při experimentech v prostředí in vivo. Výzkumem vlivu hypoxie na nervové buňky in vivo, se ve své práci zabývá Pierrefisch [34]. Tato studie je zaměřena na posouzení vlivu hypoxie v podmínkách in vivo na hypoglosální motoneurony laboratorních koček, který je velmi podobný tomu, jaký můžeme pozorovat u medulárních respiračních neuronů. Odezva na hypoxii byla dvoufázová zahrnující počáteční nárůst frekvence a amplitudy impulsů řídicích inspiraci. Následně, pokud hypoxie trvala déle než 4 minuty, nastal pokles dechové aktivity. Maximální hodnota depolarizace membrány v klidovém stavu dosahovala hodnoty 17 mV. Depolarizaci membrány motoneuronů předcházelo zvýšení frekvence AP. Nicméně hodnoty amplitudy AP a pozdní hyperpolarizace se snížily a velmi rychle došlo k inaktivaci AP. Stejně jako při experimentech in vitro [15], dochází při experimentech v podmínkách in vivo k poklesu amplitudy EPSP během hypoxie [34]. Jak uvádí Sebastião [15] a další autoři [12][13], je rychlost odezvy neuronů na hypoxii in vitro v řádu jednotek minut. Oproti tomu z výsledků experimentů Pierrefische [34] in vivo vyplývá, že rychlost odezvy neuronů na hypoxii dosahuje hodnoty desítek sekund. Sebastião ve svém článku dochází k závěru, že by 11
delší odezva neuronů in vitro mohla být způsobena odlišnou teplotou roztoku, ve které jsou uloženy vzorky tkáně, a tím spojenou změnu rychlosti metabolických procesů nervových buněk. Naopak kratší odezva neuronů in vivo by mohla být způsobena lepším zásobováním mozkové tkáně krevními plyny soustavou kapilár oproti difuznímu způsobu šíření plynu při experimentech in vitro [15]. Míru hypoxie ve zkoumaném regionu mozkové tkáně určuje velikost cerebrálního perfuzního tlaku (Cerebral Perfusion Pressure – CPP) [35], ale také hladina krevních plynů protékajících vlásečnicemi této oblasti. Pochopení závislosti CPP na ventilačních parametrech je nezbytnou podmínkou pro správné nastavení hladiny hypoxie zkoumaného regionu. Posouzením účinku parametru umělé plicní ventilace, jakým je i positivní tlak na konci exspiria (Positive End-Expiratory Pressure – PEEP), se zabývá ve své práci Georgiadis. V této studii byla prokázána závislost CPP na PEEP, kdy s nárůstem hodnoty PEEP klesá velikost CPP [36].
12
2
Cíle disertační práce Motivací ke vzniku tématu této disertační práce byly podněty a úvahy neurologů
a neurochirurgů z Fakultní nemocnice Královské Vinohrady (FNKV). Tým těchto specialistů operačně řeší postižení spojená s kraniotraumatem. Během operačních výkonů na pacientech po kraniotraumatu mají tito lékaři přístup k obnažené mozkové tkáni. Zmínění lékaři přišli s myšlenkou, zda by se podle signálů zaznamenaných přímo ve tkáni mozku nedalo určit, v jakém stavu se tato tkáň nachází. Zejména ve vztahu k tomu, že existuje reversibilní a ireversibilní poškození mozkové tkáně, které je zřejmě spojeno se zásobováním kyslíkem, odvodem CO2 a případně i hladinou dalších analytů. Myšlenka lékařů byla taková, zda jednoduchým záznamem elektrické aktivity při operačních výkonech u pacientů s kraniotraumatem lze ze zaznamenaných signálů usoudit, v jakém stavu se nachází mozková tkáň pacienta. Dále také zda zaznamenané mozkové potenciály obsahují dostatek informací k posouzení poškození mozkové tkáně. Záznamu je potřeba dosáhnout pomocí jednoduchého systému při použití vpichových elektrod a bez speciální úpravy okolí. Z této motivace vyplývá cíl mé disertační práce. Cílem disertační práce je najít vliv hypoxie a hyperkapnie na elektrickou aktivitu mozkových buněk při záznamu extracelulárních potenciálů u laboratorních zvířat. Za podmínek simulujících hypoxii nebo hyperkapnii prostudovat vliv parametrů krevních plynů na tvar a případně i na jiné parametry extracelulárních potenciálů snímaných pomocí vpichové elektrody. Z výsledků této analýzy vybrat parametry vhodné pro sledování poškození mozkové tkáně v důsledku hypoxie a podpořit nebo vyvrátit teoretické úvahy neurologů. Pro dosažení cíle disertační práce je nutné realizovat animální experimenty in vivo, během nichž dojde při kontrolované ventilaci zvířat k záznamu extracelulární elektrické aktivity. K zajištění animálních experimentů je třeba vytvořit podmínky pro technické zabezpečení experimentů. Pro toto zabezpečení a dosažení cíle disertační práce jsou nezbytné následující kroky:
•
Je třeba navrhnout a sestavit vhodný měřicí set pro záznam elektrické aktivity mozkových buněk a dalších fyziologických parametrů zvířete. Mezi sledované parametry by měly patřit extracelulární záznam elektrické aktivity mozkových buněk laboratorních zvířat, monitorování hodnot krevních plynů, monitorování
13
arteriálního tlaku krve a tepové frekvence, měření tělesné teploty, popřípadě dalších fyziologických parametrů. •
Dále je potřeba navrhnout vhodnou techniku pro řízení hypoxie a hyperkapnie u laboratorních zvířat a sestavit ventilační aparaturu pro kontrolovanou ventilaci zvířat.
•
Pro realizaci samotných animálních experimentů je nutné navrhnout metodiku experimentů.
•
Zrealizovat animální experimenty ve spolupráci s Ústavem normální, patologické a klinické fyziologie 3. lékařské fakulty Univerzity Karlovy (ÚNPKF).
•
Na množině naměřených dat provést jejich detailní analýzu v časové i frekvenční oblasti. Také je třeba definovat parametry popisující extracelulární potenciály, nalézt a popsat jednotlivé typy extracelulárních potenciálů a navrhnout hodnocení pro jejich klasifikaci.
•
Vyhodnotit, které ze zvolených parametrů popisujících extracelulární potenciály vypovídají o změně hladiny sledovaných krevních plynů.
14
3 3.1
Metodika animálních experimentů Příprava laboratorních zvířat Animální experimenty, které probíhaly na Ústavu normální, patologické a klinické
fyziologie (ÚNPKF) Univerzity Karlovy, 3. lékařské fakulty (3. LF UK), byly schváleny Odbornou komisí pro laboratorní zvířata 3. LF UK ve shodě se zákonem č. 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a jeho pozdější úpravou podle zákona č. 77/2004 Sb. České republiky. Pro realizaci experimentů bylo použito 35 laboratorních potkanů (Albino Wistar) mužského pohlaví o váze 350–500 g. Zvířata byla anestezována podáním anestetika intramuskulárně injekcí roztoku ketaminu (Narkamon 5 %, 100 mg/kg) a xylazinu (Rometar 2 %, 16 mg/kg) [37]. U zvířat byla provedena tracheostomie pomocí endotracheální kanyly 14 G (Leica Microsystems Company, Německo) a poté pomocí kanyly 26 G zakanylována pravá a levá femorální tepna k monitorování tlaku krve a tepové frekvence a pro analýzu krevních plynů pomocí acidobazického analyzátoru AVL Compact 3 (Roche Diagnostics, Švýcarsko). V části lebky mezi bregma a lambda byla zvířatům provedena skalpace kožního krytu a pomocí zubní vrtačky odstraněna lebeční kost pro obnažení mozkové tkáně. Schéma uspořádání experimentu je zobrazeno na Obr. 6. Monitoring tělesně teploty, intra-arteriálního tlaku krve, tepové frekvence a 3-svodového EKG bylo prováděno pomocí bedside monitoru CMS6000 (Contec Medical Systems, Čína).
Obr. 6: Schéma uspořádání experimentu.
15
3.2 Ventilační podpora laboratorních zvířat Před zahájením umělé plicní ventilace byla zvířata kurarizována podáním pancuronium bromide (1 ml/toto i.v.). Pro navození hypoxie ve tkáni se pro ventilaci laboratorních zvířat zvolily dvě odlišné ventilační strategie. Obě tyto strategie byly rozděleny do dvou časových intervalů, které na sebe navazovaly a během nichž byl prováděn záznam elektrické aktivity mozku. Blokové schéma ventilačního okruhu je zobrazeno na Obr. 7. První časový interval, ventilační strategie A, zahrnuje ventilaci zvířete normoxickou směsí, tj. iniciálně směsí 21 % O2 a 79 % N2. Záznam byl vždy zahájen až v okamžiku, kdy bylo zvíře stabilizováno a kdy jeho parametry krevních plynů odpovídaly normálním hodnotám. K dosažení těchto hodnot bylo nutné postupně upravovat ventilační parametry (dechový objem VT, ventilační frekvenci fV a střední tlak v dýchacích cestách MAP, případně i frakci kyslíku v inspirační směsi FIO2) a ověřovat vliv těchto změn pomocí analýzy krevních plynů v intervalech minimálně 5 minut po provedení změny ventilačních parametrů. Druhý časový interval, který vždy časově navazoval na první časový interval, se lišil podle zvolené ventilační strategie. V prvním případě byla zvolena hypoxická směs plynů kyslíku a dusíku s obsahem 5 % O2 a 95 % N2 pro navození těžké hypoxie [34], nadále se bude označovat jako ventilační strategie B. Aplikace ventilační strategie B byla udržována po dobu 120 s, následně byla ventilace navrácena k normoxické ventilační směsi (ventilační strategie A), tj. parametrům těsně před zavedením strategie B.
Obr. 7: Schéma ventilační části experimentálního uspořádání . V případě druhém byla na zvolenou dobu ventilace zcela zastavena. Nadále bude tento stav označován jako ventilační strategie C. Strategie má simulovat stav, kdy dojde k zástavě 16
dýchání, čímž dojde k hypoxickému a hyperkapnickému stavu. Tato ventilační strategie pro její agresivitu byla udržována pouze po dobu 20 s a poté se obnovila ventilace při použití normoxické ventilační směsi a parametrům ventilace používaným ve strategii A těsně před přechodem do fáze C. K ventilaci zvířat byla použita konvenční ventilace s dechovou frekvencí 60 dechů za minutu, za konvenční lze u potkanů považovat dechové frekvence až do 240 dechů za minutu [38]. Během experimentu byla průběžně prováděna analýza krevních plynů a v případě potřeby upraven jednorázový dechový objem pro udržení konstantní hladiny kyslíku nebo oxidu uhličitého v krvi.
3.3 Záznam elektrické aktivity mozku Záznam elektrické aktivity vždy započal v okamžiku zahájení prvního ventilačního intervalu, kdy už došlo ke stabilizaci fyziologických parametrů zvířete. Záznam dále pokračoval v průběhu druhého a třetího ventilačního intervalu a obvykle byl ukončen po vymizení elektrické aktivity v měřeném signálu.
Obr.
8: Situování foto autor.
mikroelektrody
pomocí
mikroposuvu
vzhledem
k
bregma,
17
Ke snímání extracelulární spontánní jednotkové aktivity mozkové tkáně byly použity vpichové kovové mikroelektrody typu TM33A10KT (World Precision Instruments, Inc., USA) vyrobené ze slitiny platiny a iridia o nominální hodnotě impedance 1 MΩ. Kovová mikroelektroda byla podle Swansonova atlasu zavedena pomocí hydraulického mikroposuvu do stereotaxických souřadnic: AP 4 mm, LL 2 mm a DV 1–3 mm vzhledem k bregma, Obr. 8. Stříbrná referenční elektroda byla umístěna subkutánně u levého ucha zvířete. Zesílení elektrické aktivity mozkové tkáně snímané pomocí kovových mikroelektrod bylo prováděno signálovým zesilovačem MCP Plus 8 (ALPHA OMEGA ENGINEERING, Izrael), který je sestrojen tak, aby zajišťoval optimální výsledky při snímání signálu pomocí extracelulárních mikroelektrod. Nastavení frekvenční propusti zesilovače, vzhledem k množství šumu obsaženého v signálu, bylo pro potřeby experimentu zvoleno v rozmezí frekvencí 300 Hz až 6 kHz a zvolené zesílení bylo nastaveno na hodnotu 1000. Zesílený signál byl digitalizován pomocí 32bitového A/D převodníku Micro1401 (Cambridge Electronic Design Limited, Velká Británie) se zvolenou vzorkovací frekvencí 30 kHz. Záznam dat byl prováděn pomocí programu Spike2 (Cambridge Electronic Design Limited, Velká Británie). Zpracování a vyhodnocení naměřených dat bylo realizováno pomocí programu Matlab R2007a (The MathWorks, Inc., USA) a programu STATISTICA (StatSoft, Inc., USA).
18
4
Metody zpracování naměřených dat
4.1 Předzpracování záznamu Záznam je softwarově filtrován pomocí frekvenčního filtru typu pásmové propusti s mezními kmitočty 300 Hz a 6 kHz, použit je IIR filtr typu Butterworth řádu 10. Na odfiltrovaném záznamu je provedena detekce jednotlivých EAP. K tomu je použit navržený algoritmus, který v první derivaci časového záznamu detekuje pomocí prahového detektoru dominantní záporné hroty EAP. Na vyjmutých EAP ze signálu byly pomocí vytvořeného algoritmu určeny atributy popisující jejich tvar. K popisu tvaru každého EAP v časové oblasti byly zvoleny následující příznaky, při jejichž volbě se vycházelo z Goldovy publikace zabývající se modelováním EAP [24]: výška záporného hrotu – NegHigh a jeho šířka ve 25 % jeho nalezené výšky – NegWidth25, směrnice sestupné hrany záporného hrotu – NegDif (směrnice byla dále normovaná velikostí záporného hrotu) a výška pozitivního hrotu – PosHigh. Tyto parametry, které jsou zvoleny podle referenčního odborného článku [24], jsou dále rozšířeny o následující parametry: šířka negativního hrotu v 75 % jeho nalezené výšky – NegWidth75, šířka pozitivního hrotu ve 25% a 75 % jeho nalezené výšky – PosWidth25 a PosWidth75, časová vzdálenost maxim pozitivního hrotu a negativního hrotu – NegPosDist. Tyto parametry popisující EAP, viz Obr. 9, jsou pro každý nalezený EAP uloženy do tabulky a použity ke statistickému vyhodnocení. Další příznaky popisující EAP jsou zvoleny v jeho frekvenční oblasti. Jedná se o příznaky
(Obr.
10):
poměr
|F(f)|max
a
její
následující
hodnoty
|F(f+1)|
–
SpectrumMaxsRatio) a poměr integrálů frekvenčních intervalů 1 a 2 – SpectrumAreaRatio. První frekvenční interval je zvolen v rozsahu frekvencí 300 Hz až 2,8 kHz, kdy u horní meze intervalu dochází k poklesu amplitudy spektra. Druhý interval je potom od 2,8 kHz po horní mezní frekvenci 6 kHz.
19
Obr. 9: Příznaky popisující tvar EAP v časové oblasti: NegHigh – maximální amplituda negativního hrotu, PosHigh – maximální amplituda pozitivního hrotu, NegWidth25 a NegWidth75 – šířka negativního hrotu v 25 % resp. 75 % hodnoty NegHigh, PosWidth25 a PosWidth75 – šířka pozitivního hrotu v 25 % resp. 75 % hodnoty PosHigh a NegDif směrnice sestupné hrany negativního hrotu.
Obr. 10: Příznaky popisující EAP ve frekvenční oblasti: |F(f)|max – maximální hodnota spektra, |F(x+1)| – hodnota následující po maximu spektra, INTERVAL 1 a 2 omezují frekvenční rozsah ploch pod křivkou amplitudového spektra.
20
4.2 Metody analýzy získaných parametrů Pro redukci celého stavového prostoru parametrů a ověření dvouvrcholového rozložení parametrů je použita metoda PCA. Počet parametrů popisujících tvar EAP je pomocí PCA zredukován na dvě nejvýznamnější hlavní komponenty PCA. Použité dvě nejvýznamnější hlavní komponenty byly dále normované na rozsah hodnot 0 až 1. Rozptylový diagram PCA je vyhodnocen pohledem pro nalezení významných shluků jednotek tvořených hlavními komponentami. Na tyto shluky je aplikována shluková analýza K-means a shluky jsou detekovány a rozděleny do množin. Získané množiny jednotek z PCA jsou zpětně aplikované na EAP. Z analýzy tvaru EAP obsažených v určité množině vyplývá, že tvar EAP zahrnutých v jednotlivých množinách se liší a je tak ověřen význam shluků v PCA. Množiny EAP získané pomocí shlukové analýzy ve stavovém prostoru PCA jsou využity pro statistickou analýzu parametrů odpovídajících EAP. Sledován a hodnocen je časový výskyt jednotlivých typů EAP v průběhu experimentu, tedy v době normoxie, hypoxie, nebo při vypnuté ventilaci. Pozorován je výskyt typů EAP během ventilačního manévru v okamžiku určité ventilační strategie a jejich počet. Výsledky jsou porovnány s následující fází ventilace. Pokud je procentuální zastoupení EAP určitého typu během záznamu menší než 5 %, není tento typ zahrnut do hodnocení. Pomocí studentova t-testu jsou statisticky hodnoceny změny hodnot parametrů nalezených typů EAP během jednotlivých ventilačních strategií. Zvolen je dvouvýběrový nepárový studentův t-test. Jako hraniční hladina významnosti testu je zvolena hodnota 0,05. Vždy jsou srovnávány EAP z časového intervalu délky 10 s normoxické fáze experimentu (ventilační strategie A) a z časového intervalu délky 10 s následující fáze (ventilační strategie B, C). U hypoxické ventilační strategie B jsou hodnoceny parametry EAP v časovém intervalu délky 10 s od okamžiku 40 s hypoxické fáze. U ventilační strategie C jsou hodnoceny parametry EAP v časovém intervalu délky 10 s po uplynutí 25 s od okamžiku vypnutí ventilace.
21
5
Výsledky
5.1 Celková charakteristika souboru naměřených dat V průběhu řešení disertační práce byly provedeny dvě série animálních experimentů na 35 potkanech. Během první série bylo naměřeno celkem 18 záznamů signálu u 8 potkanů; 3 potkani sloužili pro přípravu experimentů (ověření proveditelnosti a funkčnosti kanylace, trepanace lebky, zavedení elektrod, ověření celého řetězce pro snímání a záznam EAP, ověření systému pro změnu ventilačních strategií, apod.) a 4 potkani uhynuli během experimentu před dokončením všech fází. Během druhé série bylo naměřeno 25 záznamů signálu u 14 potkanů; 2 potkani sloužili pro přípravu experimentů a 4 potkani uhynuli během experimentu před dokončením všech fází. Celkem bylo zaznamenáno 43 záznamů signálu, z toho bylo při manévru A–B, přechodu z ventilační strategie A (normokapnická/normoxická) na ventilační stategii B (normokapnická/hypoxická) 15 záznamů a při manévru A–C, přechodu z ventilační strategie A na ventilační stategii C (vypnutá ventilace) 21 záznamů. Zbývající počet záznamů (7 záznamů) byl ze zpracování vyjmut pro nedostatečnou velikost amplitudy EAP nebo pro jejich malý výskyt v záznamu. Během obou sérií animálních experimentů byl prováděn záznam jak při přechodu z ventilační strategie A na B, tak při přechodu z ventilační strategie A na C.
5.2 Časový vývoj výskytu EAP v průběhu experimentu Při analýze záznamů EAP v časové oblasti byly nalezeny tři typy vývoje signálu, které se vyskytují u obou manévrů. U prvního typu vývoje signálu dochází k posupnému poklesu frekvence výskytu EAP a k následnému zániku výskytu těchto EAP. Tyto EAP si zachovávají velikost amplitudy z normoxické ventilační strategie A, nebo se jejich amplituda sníží pouze nepatrně. Druhý typ se vyznačuje postupným poklesem amplitudy EAP během ventilační strategie B nebo ventilační strategie C, který v některých případech ještě bývá doprovázen zvýšením frekvence výskytů EAP v signálu. Byly také zaznamenány signály vykazující charakteristiky, které neodpovídají předchozím dvěma typům. Tento třetí typ signálu vykazoval opačný trend počtu a amplitudy EAP v čase. Typický zástupce prvního typu vývoje EAP v časové oblasti provázený úbytkem frekvence výskytu EAP během ventilační strategie B je zobrazen na obrázku Obr. 11 (vývoj úbytku EAP je patrný od okamžiku 40. sekundy záznamu). Tento vývoj EAP v čase se vyskytoval u 67 % záznamů. 22
Obr. 11: Úbytek EAP v čase během manévru přechodu z normoxické ventilační směsi (černě, ventilační strategie A) na ventilační směs normokapnickou/hypoxickou (červeně, ventilační strategie B) a návrat k normoxické směsi.
Druhý typ vývoje EAP v časové oblasti provázený úbytkem velikosti amplitudy během ventilační strategie B popsaný v předchozím odstavci se vyskytoval u 20 % záznamů. Jeho typický zástupce je zobrazen na obrázku Obr. 12.
Obr. 12: Časový vývoj EAP během manévru přechodu z normoxické ventilační směsi (černě, ventilační strategie A) na ventilační směs normokapnickou/hypoxickou (červeně, ventilační strategie B) a návrat k normoxické směsi.
23
Třetí typ časového vývoje EAP je zobrazen na Obr. 13, jeho procentuální zastoupení mezi časovými záznamy dosahuje pouze 7 %.
Obr. 13: Třetí typ vývoje EAP v čase během manévru přechodu z normoxické ventilační směsi (černě, ventilační strategie A) na ventilační směs normokapnickou/hypoxickou (červeně, ventilační strategie B) a návrat k normoxické směsi.
5.3 Klasifikace typů EAP Z výsledků analýzy získaných parametrů EAP vyplývá, že lze v záznamech očekávat odlišné typy EAP. Rozličnost tvarů EAP je jeden z očekávaných výsledků experimentu. Z výsledků této analýzy parametrů je také zřejmé, že tyto změny tvaru EAP nastávají u většiny sledovaných parametrů. Bylo nalezeno 3408 EAP pro manévr A–B a 8216 EAP pro manévr A–C, z toho, po vyjmutí deformovaných EAP, bylo použito pro analýzu metodou PCA 10 514 EAP. Z toho pro manévr A–B 3008 EAP a pro manévr A–C 7506 EAP. Stavový prostor hlavních komponent je zobrazen na Obr. 14. Na tyto data byla aplikována shluková analýza a jednotky byly rozděleny do dvou skupin. Nalezené skupiny byly označeny EAP I zelenou barvou a EAP II modrou barvou. Detailnější informace o výsledcích klasifikace EAP naleznete v kapitole výsledků disertační práce.
24
Obr. 14: Stavový prostor PCA potkana č. 1C s barevně označenými skupinami shluků jednotek hlavních komponent; EAP I – zelená, EAP II – modrá. Výsledky shlukové analýzy byly aplikovány na vyjmuté EAP v časové oblasti, skupiny EAP jsou vykresleny na Obr. 15 přes sebe, barevné značení odpovídá značení z analýzy PCA.
Obr. 15: Dvě množiny EAP vykresleny přes sebe u potkana č. 1C; EAP I – zelená, EAP II – modrá.
25
5.4 Statistické vyhodnocení parametrů EAP v průběhu experimentu Parametry jednotlivých typů EAP byly statisticky vyhodnoceny za použití studentova t-testu s uvažovanou hladinou významnosti 0,05. Porovnávány byly vždy EAP jednoho typu v časové oblasti ventilační strategie A spolu s EAP stejného typu z časové oblasti spadající do fáze ventilační strategie B, nebo ventilační strategie C. Výsledky statistického vyhodnocení parametrů t-testem ventilačního manévru A–B pro statisticky nejvýznamnější typ EAP jsou prezentovány v Tab. 1. Detailnější informace o výsledcích statistického vyhodnocení naleznete v kapitole výsledků disertační práce. Tab. 1: Statistické vyhodnocení EAP II EAP III při ventilační strategii A a při ventilační strategii B.
Parametr NegHigh (µV) NegWidth25 (ms) NegWidth75 (ms) NegDif (V/s) PosHigh (µV) PosWidth25 (ms) PosWidth75 (ms) SpectrumMaxsRatio (-) SpectrumAreaRatio (-) NegPosDist (ms) * p < 0,05
ventilační strategie A směrodatná průměr odchylka -96,1 0,381 0,168 0,409 58,0 0,911 0,398 1,48 6,79 1,66
21 0,070 0,035 0,10 18 0,22 0,12 0,62 2,0 0,15
EAP II ventilační strategie B směrodatná průměr odchylka -89,8 0,426 0,187 0,403 50,2 0,833 0,356 1,89 7,60 1,67
27 0,11 0,051 0,15 24 0,31 0,16 1,6 2,2 0,38
p 0,017 0,0000023 0,000060 0,64 0,00051 0,0052 0,0068 0,00027 0,00069 0,54
* * * * * * * *
26
6
Závěr Hlavním cílem disertační práce bylo nalezení závislosti mezi hladinou kyslíku
a elektrickou aktivitou mozku v oblasti kortexu. Pro dosažení cíle disertační práce byla navržena metodika animálních experimentů a zajištěna technická podpora pro jejich realizaci. V metodice experimentů byl navržen protokol definující jednotlivé kroky při realizaci experimentů. Protokol obsahoval postup přípravy zvířat pro experiment, dále pak pokyny pro postup při realizaci samotného experimentu, tj. ventilační podpoře a při záznamu elektrické aktivity. V oblasti technického zajištění experimentu byl navržen a sestaven měřicí set určený pro záznam fyziologických parametrů laboratorních zvířat během animálních experimentů. Parametry setu byly laboratorně ověřeny a zároveň proběhlo jeho otestování při pilotních animálních experimentech. Ve spolupráci s kolegy z katedry elektromagnetického pole Fakulty elektrotechnické ČVUT v Praze byly ověřeny parametry měřicího zesilovače pro záznam elektrické aktivity, pro zajištění dostatečného odstupu signál šum. Sestavený měřicí set byl schopen měřit extracelulární elektrickou aktivitu mozkových buněk a dalších fyziologických parametrů laboratorních zvířat, kterými jsou hodnoty krevních plynů, arteriální tlak krve, tepová frekvence a tělesná teplota zvířete. Byla navržena a zkonstruována aparatura pro aplikaci UPV, která je schopna během animálních experimentů zajišťovat ventilaci laboratorních zvířat. Ventilační aparatura umožňuje vytvoření jak hypoxického, tak i hyperkapnického stavu u ventilovaného laboratorního zvířete. K dosažení cíle disertační práce byly realizovány dvě série animálních experimentů, během nichž bylo naměřeno celkem 43 záznamů elektrické aktivity mozkových buněk u 35 laboratorních zvířat. Během první série bylo naměřeno celkem 18 záznamů signálu u 8 potkanů a během druhé série bylo naměřeno 25 záznamů signálu u 14 potkanů. Hypoxie mozkových buněk bylo dosaženo pomocí dvou ventilačních strategií. Pro zpracování naměřených záznamů byl navržen algoritmus v prostředí Matlab pro předzpracování a filtraci záznamů. Dále byla pomocí tohoto algoritmu na množině záznamů provedena detekce a následné vyjmutí jednotlivých EAP ze záznamu. Na množině vyjmutých EAP byla provedena extrakce parametrů popisujících tyto EAP. Byly definovány parametry, podle kterých lze hodnotit vliv hypoxie na EAP. Při volbě těchto parametrů se vycházelo ze stávající literatury. Tento počet parametrů byl ještě rozšířen o další navržené parametry. Bylo 27
vybráno deset parametrů popisujících i tvarové vlastnosti EAP v časové i frekvenční oblasti. Celkem bylo ze záznamů vyjmuto a zpracováno 10 514 EAP, z toho 3008 EAP při experimentu s využitím ventilační strategie B a 7506 EAP při experimentu s využitím ventilační strategie C. Ze studie vyplývá, že ventilační parametry ovlivňují elektrickou aktivitu mozku. Podařilo se najít parametry popisující EAP, které odrážejí změnu ventilačních parametrů. Týká se to však pouze určitých typů EAP a obecně to neplatí pro všechny typy EAP. V případě výsledků této studie vychází velmi významný rozdíl parametrů při hypoxické ventilační strategii B u typu EAP II a to zejména prodloužením trvání záporného hrotu (NegWidth25 a NegWidth75), zmenšením amplitudy kladného hrotu (PosHigh), nárůstem poměru hodnot ve spektru (SpectrumMaxsRatio) a nárůstem poměru ploch intervalů 1 a 2 ve spektru (SpectrumAreRatio). U typu EAP III této ventilační strategie se to projevuje zejména zkrácením trvání kladného hrotu (PosWidth75). Pro ventilační strategii C (vypnutá ventilace) pro EAP I vychází významná změna parametru PosHigh, zmenšením amplitudy kladného hrotu. Pro EAP II dochází spolu s hypoxií ke snížení amplitudy záporného hrotu (NegHigh) a zkrácení trvání záporného hrotu (NegWidth25 a NegWidth75). U uvedených parametrů jsou změny velmi významné a bylo by možné rozpoznat vliv hypoxie analýzou signálů EAP. Uvedená
disertační
práce
představuje
komplexní
transdisciplinární
přístup
k problematice poškození mozkové tkáně nedostatečným okysličováním. Jejím cílem bylo určit, zda závažnost takového poškození lze posuzovat na základě elektrofyziologických změn mozkové aktivity. Práce, založená na využití technologických a fyziologických znalostí a jejich aplikaci při pokusu na živém zvířeti, vedla ke konkrétním, i když zdaleka ne jednoznačným výsledkům. Hypoxie a hyperkapnie, vyvolané modulací ventilačních parametrů, zřetelně vedou k časoprostorovým změnám elektrické aktivity mozku. Nalezené výsledky nevylučují, že jejich analýza by mohla pomoci objektivnímu hodnocení funkčního stavu mozkové tkáně. V tomto smyslu výsledky této práce představují první metodologický základ pro detailnější multidisciplinární studium, jež by mělo přesněji definovat elektrofyziologická kritéria funkčního stavu mozkové tkáně při těžkých hypoxických změnách u pacientů po kraniotraumatu.
28
7
Literatura
[1] Hansen, A. J.: Effect of Anoxia on Ion Distribution in the Brain. Physiological Reviews, vol. 65, no. 1, 1985 Jan, s. 101-147. [2] Hansen, A. J., Lundbaek, J. A.: Ion distributions in brain during ischemia. J Neurosurg Anesthesiol, vol. 1, no. 4, 1989 Dec, s. 353-356. [3] Jiang, C., Haddad, G. G.: Differential responses of neocortical neurons to glucose and/or O2 deprivation in the human and rat. J Neurophysiol., vol. 68, no. 6, 1992 Dec, s. 21652173. [4] Rosen, A. S., Morris, M. E.:Depolarizing effects of anoxia on pyramidal cells of rat neocortex. Neurosci Lett., vol. 124, no. 2, 1991 Apr 1, s. 169-173. [5] GU, X. Q., HADDAD, G. G.: Decreased neuronal excitability in hippocampal neurons of mice exposed to cyclic hypoxia. J Appl Physiol, vol. 91, 2001, s. 1245–1250. [6] Cummins, T. R., Jiang, C., Haddad, G. G.: Human neocortical excitability is decreased during anoxia via sodium channel modulation. J. Clin. Invest., vol. 91, no. 2, 1993 Feb, s. 608-615. [7] Hansen, A. J., Hounsgaard, J., Jahnsen, H.: Anoxia increases potassium conductance in hippocampal nerve cells. Acta physiol. Scand., vol. 115, 1982, s. 301–310. [8] Haddad, G. G., Jiang, Ch.: Mechanisms of anoxia-induced depolarization in brainstem neurons: in vitro current and voltage clamp studies in the adult rat. Brain Research, vol. 625, 1993, s. 261–268. [9] Nieber, K., Sevsic, J. a Illes, P.: Hypoxic changes in rat locus coeruleus neurons in vitro. J. Physiol., vol. 486, 1995, s. 33–46. [10] Fujimura, N., Tanaka, E., Yamamoto, S., Shigemori, M., Higashi, H.: Contribution of ATP-sensitive potassium channels to hypoxic hyperpolarization in rat hippocampal CA1 neurons in vitro. J. Neurophysiol., vo. 77, no. 1, 1997 Jan, s. 378-385. [11] Hyllienmark, L., Brismar, T.: Effect of hypoxia on membrane potential and resting conductance in rat hippocampal neurons. Neuroscience, vol. 91, no. 2, 1999, s. 511-517. [12] Englund, M., Hyllienmark, L., Brismar, T.: Chemical hypoxia in hippocampal pyramidal cells affects membrane potential differentially depending on resting potential. Neuroscience, vol. 106, no. 1, 2001, s. 89-94. [13] Lipton, P., Whittingham, T. S.: The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. J. Physiol., vol. 287, 1979 Feb, s. 427-438. [14] Fujiwara, N., Higashi, H., Shimoji, K., Yoshimura, M.: Effects of hypoxia on rat hippocampal neurones in vitro. J. Physiol., vol. 384, 1987 Mar, s. 131-151. [15] Sebastião, A. M., de Mendonc¸ A., Moreira, T., Ribeiro, J. A.: Activation of Synaptic NMDA Receptors by Action Potential-Dependent Release of Transmitter during Hypoxia 29
Impairs Recovery of Synaptic Transmission on Reoxygenation. The Journal of Neuroscience, November 1, vol. 21, no. 21, 2001, s. 8564–8571. [16] Englund, M., Bjurling, M., Edin, F., Hyllienmark, L., Brismar, T.: Hypoxic Excitability Changes and Sodium Currents in Hippocampus CA1 Neurons. Cellular and Molecular Neurobiology, vol. 24, no. 5, 2004, s. 685–694. [17] Plonsey, R.: Volume conductor fields of action currents. Biophys Journal, vol. 4, 1964, s. 317-328. [18] Terzuolot, C. A., Arakit, T.: An analysis of intra- versus extracellular potential changes associated with activity of single spinal motoneurons. Ann N Y Acad Sci., vol. 94, 1961 Sep 6, s. 547-558. [19] Rall W., Shepherd, G. M.: Theoretical Reconstruction of Field Potentials and Dendrodendritic Synaptic Interactions in Olfactory Bulb. Journal of Neurophysiology, vol. 31, 1968, s. 884-915. [20] Holt, G. R., Koch, C.: Electrical interactions via the extracellular potential near cell bodies. J. Comput. Neurosci., vol. 6, no. 2, 1999 Mar-Apr, s. 169-184. [21] Buzsáki G, Penttonen M, Nádasdy Z, Bragin A.: Pattern and inhibition-dependent invasion of pyramidal cell dendrites by fast spikes in the hippocampus in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 93, no. 18, 1996 Sep 3, s. 9921-9925. [22] Henze, D. A., Borhegyi, Z., Csicsvari, J., Mamiya, A., Harris, K. D., Buzsáki, G.: Intracellular Features Predicted by Extracellular Recordings in the Hippocampus In Vivo. J. Neurophysiol, vol. 84, 2000, s. 390-400. [23] Nadasdy Z., Csicsvari J., Penttonen M., Hetke J., Wise K., Buzsaki G.: Extracellular recording and analysis of neuronal activity: from single cells to ensembles. In: Neuronal Ensembles: Strategies for Recording and Decoding, edited by Eichenbaum HB and Davis JL. New York: Wiley-Liss, 1998, s. 17–55. [24] Gold, C., Henze, D. A., Koch, C.: Using extracellular action potential recordings to constrain compartmental models. J. Comput. Neurosci., vol. 23, 2007, s. 39-58. [25] Gold, C., Henze, D. A., Koch, C., Buzsáki, G.: On the Origin of the Extracellular Action Potential Waveform: A Modeling Study. J Neurophysiol., vol. 95, no. 5, 2006 May, s. 3113-3128. [26] Robinson, D. A.: The Electrical Properties of Metal Microelectrodes. Proceedings of the IEEE 56, 1968, s. 1065-1071. [27] Simon, R. P., Swan, J. H., Griffiths, T., Meldrum, B. S.: Blockade of N-methyl-Daspartate receptors may protect against ischemic damage in the brain. Science, vol. 226, 1984, s. 850–852. [28] Rothman, S. M., Olney, J. W.: Glutamate and the pathophysiology of hypoxic-ischemic brain damage. Ann Neurol 19, 1986, 105–111.
30
[29] Sattler, R., Xiong, Z., Lu, W-Y, MacDonald, J. F., Tymianski, M.: Distinct roles of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in excitotoxicity. J Neurosci, 2000, vol. 20, s. 22–33. [30] Dale, N., Pearson, T., Frenguelli, B. C.: Direct measurement of adenosine release during hypoxia in the CA1 region of the rat hippocampal slice. J Physiol, London, vol. 526, 2000, s. 143–155. [31] Pedata, F., Latini, S., Pugliesi, A. M., Pepeu, P.: Investigations into the adenosine outflow from hippocampal slices evoked by ischemia-like conditions. J Neurochem, vol. 61, 1993, s. 284–289. [32] Dillon, G. H., Waldrop, T. G.: In vitro responses of caudal hypothalamic neurons to hypoxia and hypercapnia. Neuroscience, vol. 51, no. 4, 1992, s. 941–950. [33] Ryan, J. W., Waldrop, T. G.: Hypoxia sensitive neurons in the caudal hypothalamus project to the periaqueductal gray. Respiration Physiology, vol. 100, 1995, s. 185–194. [34] Pierrefiche, O., Bischoff, A. M., Richter, D. W., Spyer, K. M.: Hypoxic response of hypoglossal motoneurones in the in vivo cat. Journal of Physiology, vol. 505.3, 1997, s. 785–795. [35] Juul, N., Morris, G. F., Marshall, S. B.: Intracranial hypertension and cerebral perfusion pressure: influence on neurological deterioration and outcome in severe head injury. Journal of Neurosurgery, vol. 92, 2000, s. 1–6. [36] Georgiadis, D., Schwarz, S., Baumgartner, R. W., Veltkamp, R., Schwab, S.: Influence of Positive End-Expiratory Pressure on Intracranial Pressure and Cerebral Perfusion Pressure in Patients With Acute Stroke. Stroke, vol. 32, 2001, s. 2088–2092. [37] Vaculín, Š., Franěk, M. and Rokyta, R.: Dorsal Rhizotomy Changes the Spontaneous Neuronal Activity of Nuclei in the Medial Thalamus. Physiological research, vol. 49, 2000, s. 279-283. [38] Hess, L., Dvořáček, I., Svobodník, J.: Anestézie laboratorních zvířat [Hess, Ladislav, 1.]. Praha: Avicenum, 1984. 256 s.
31
32
8
Publikace GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Possibilities of Intracranial Monitoring of Local Physiological Parameters. Lékař a technika. 2008, vol. 38, no. 2, p. 156-159. ISSN 0301-5491. GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Technical Support of Intracranial Single Unit Activity Measurement. Proceedings of World Academy of Science, Engineering and Technology. Waset.org: World Academy of Science, Engineering and Technology. Venice. 2008, vol. 34, p. 235-238. ISSN 2070-3740. GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Studium vlastností signálů a akčních potenciálů v mozku při umělé plicní ventilaci. Technical Computing Prague 2007 [CD-ROM]. Praha: Humusoft, 2007, ISBN 978-80-7080-658-6. GRÜNES, R., STRNADOVÁ, A.: Single-Unit Activity Monitoring. POSTER 2010 Proceedings of the 14th International Conference on Electrical Engineering [CDROM]. Praha: ČVUT v Praze, FEL, 2010, ISBN 978-80-01-04544-2. GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Single-unit activity evaluation. YBERC 2010 - The Fourth Biomedical Engineering Conference of Young Biomedical Engineers and Researches. Košice: TU of Košice, 2010. ROUBÍK, K., JURSA, T., ROŽÁNEK, M., WALDAUF, P., FRIC, M., GRÜNES, R.: Real-Time Diagnostic and Monitoring Tool for Efficient Application of HighFrequency Oscillatory Ventilation. Proceedings of the 5th European Symposium on Biomedical Engineering [CD-ROM]. Vienna: International Federation for Medical & Biological Engineering, 2006 GRÜNES, R., ROUBÍK, K., ROŽÁNEK, M., KOPELENT, V., BLÁHA, K.: Využití elektrické impedanční tomografie pro sledování distribuce dechového objemu při umělé plicní ventilaci. Trendy v biomedicínském inženýrství, Sborník 7. československé konference. Praha: ČVUT v Praze, Fakulta biomedicínského inženýrství, 2007, s. 115-117. ISBN 978-80-01-03777-5. ROUBÍK, K., GRÜNES, R., ROŽÁNEK, M., KOPELENT, V., BLÁHA, K.: Advances in Monitoring of Artificial Lung Ventilation and its Application in Ventilatory Regimen Optimisation. Trendy v biomedicínském inženýrství, Sborník 7. česko-slovenské konference. Praha: ČVUT v Praze, Fakulta biomedicínského inženýrství, 2007, s. 104-107. ISBN 978-80-01-03777-5. ROUBÍK, K., GRÜNES, R., ROŽÁNEK, M.: Signal Processing and Evaluation in Artificial Lung Ventilation Monitoring. Technical Computing Prague 2007 [CDROM]. Prague: HUMUSOFT, 2007, ISBN 978-80-7080-658-6. GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Motivated Rehabilitation and its Technical Solution. Lékař a technika. 2006, vol. 36, no. 2, s. 315-316. ISSN 0301-5491.
33
ROUBÍK, K., PACHL, J., GRÜNES, R., ROŽÁNEK, M., WALDAUF, P., et al.: Technické zajištění podrobné diagnostiky mechaniky respirační soustavy pacientů s ARDS v reálném čase. Lékař a technika. 2006, vol. 36, no. 3, s. 10-19. ISSN 03015491. GRÜNES, R., ROUBÍK, K.: Elektrická impedanční tomografie a její využití v respirační péči. Lékař a technika. 2008, vol. 28, no. 1, p. 42-47. ISSN 0301-5491. KNEPPO, P., ROSÍK, V.,TYŠLER, M., KARAS, S., HÁNA, K., SMRČKA, P., HEBLÁKOVÁ, E., MUŽÍK, J., GRÜNES, R.: EKG mapovací systém s vysokým rozlišením pro neinvazivní diagnostiku srdce. Lékař a technika. 2008, vol. 38, no. 4. ISSN 0301-5491. GRÜNES, R., ROUBÍK, K., ROŽÁNEK, M.: Zdravotnická technika – umělá plicní ventilace. Biomedicínské inženýrství před námi. Praha: ARSCI, 2007, 1. vydání, s. 3740. ISBN 978-80-86078-83-0. ROUBÍK, K., GRÜNES, R., ROŽÁNEK, M.: Spontánní a umělá plicní ventilace: Pokroky v umělé plicní ventilaci. Biomedicínské inženýrství před námi. Praha: ARSCI, 2007,1. vydání, s. 65-71. ISBN 978-80-86078-83-0. ROŽÁNEK, M., ROUBÍK, K., GRÜNES, R.: Modelování respirační soustavy: využití elektroakustické analogie. Biomedicínské inženýrství před námi. Praha: ARSCI, 2007,1. vydání, s. 29-35. ISBN 978-80-86078-83-0. HOZMAN, J. a kolektiv: Praktika z biomedicínské techniky. 1. vyd. Praha: České vysoké učení technické v Praze, 2007. 154 s. ISBN 978-80-01-03956-4. ROUBÍK, K., ROŽÁNEK, M , GRÜNES, R.: Praktika z biomedicínské a klinické techniky 4. Speciální senzorová a přístrojová technika. první vydání, Praha: České vysoké učení technické v Praze, 2008. 122 s. ISBN 978-80-01-04023-2. ROUBÍK, K., GRÜNES, R.: Monitor vysokofrekvenční ventilace a plicní mechaniky [Prototyp]. Vlastník: ČVUT FBMI, 2007. STRNADOVÁ, A., GRÜNES, R.: Optimization of a Semi-Closed Circuit for a New Way of Heliox Application in COPD Exacerbation Patients. POSTER 2010 Proceedings of the 14th International Conference on Electrical Engineering [CDROM]. Praha: ČVUT v Praze, FEL, 2010, ISBN 978-80-01-04544-2. (3. místo v kategorii Biomedical Engineering)
34
