Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů
Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627
[email protected] Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140
Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin R
CH
R
COOH
+
H3N
NH2
+
H3O
C
-
COO
H
-
OH
Aminokyseliny - amfionty R
CH NH3+
COO-
R
R +
H3N
C
COOH
H
H2N
C
-
COO
H
Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-) Amfolyty - sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady
pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty Proteiny – amfolyty - na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězců AK schopných disociace
Isoelektrický bod (pI) Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule R CH COO1 pI = (pK1 + pK2) 2
amfolyty přijímají H+
NH3+ pI
NH3+RCOOH pI proteinů: neutrální cca 5-6 kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11
amfolyty odštěpují H+
NH2RCOO-
Purifikace proteinů Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství enzymu) Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátu počet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finanční náročnost Žádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužit Typ purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky. - záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)
Metody obecně používané v biochemických laboratořích Metody základní • rozpuštění • hrubé oddělení
převedení biomolekul do kapalné fáze
homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace
speciální • izolace • stanovení
chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ...
Volba separační metody Dělení látek podle rozdílných vlastností: molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita
Metoda pokusu a omylu obvykle nedává optimální výsledky Metody používané v programu: purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace) kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení
Srážení (NH4)2SO4 - vysolování
protein
(NH4)2SO4 zvýšení rozpustnosti
různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích
vsolování – snižování hydrofobních int.
(NH4)2SO4 snížení vysolování – ztráta hydratačního obalu rozpustnosti Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)
Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.
Dialýza Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentrace Použití: odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru) koncentrační gradient Membrány, dutá vlákna Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa voda, pufr s nízkou iontovou silou elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli
odsolování – MWCO 10 (25) kDa
Ionexová chromatografie Chromatografie na měničích iontů Ion Exchange Chromapography - IEC Princip: separace podle náboje Iontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázané ionizovatelné skupiny. porézní materiály elektrostatické interakce – eluce změnou pH, iont. síly
Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj katex - výměna kationtů
anex - výměna aniontů
Na+, H+
Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku
Cl-, OH-
Vliv pH na velikost náboje: P-
P+
pH: většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilní obvykle v rozmezí pH 6 - 9 katex: pH 3 – 8 (bazické proteiny) většinou vazba na anex anex: pH 5 – 10 Vliv iontové síly: vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex
Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH (sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny) Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislá na pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj Funkční skupiny CM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katex S sulfomethyl- silný katex SHP sulfohydroxypropyl- silný katex DEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anex QAE kvarterní aminoethyl- silný anex Q kvarterní amin – silný anex TMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex
Průtoková rychlost: závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částic rychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h) Eluce: vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směr gradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění, nižší rozlišení) celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony
Chromatografie s hydrofobní interakcí Hydrofobní interakce Makromolekuly - hydrofobní skupiny (na povrchu nebo zanořené v kapsách) Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace) hydrofobní sorbenty – hydrofobní zóny ligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-
Síla vazby roste s: rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou, nejsilnější interakce: pH – pI Síla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul
Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.
Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu relat. nezávislá na složení mobilní fáze Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys. malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonou velké molekuly – volně protékají nesferické molekuly - chovají se jako by byly větší
Stupeň rozlišení: Rs =
vzdálenost mezi separovanými zónami šířka zón
Rs > 1.2
Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon Aplikace vzorku: objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30% neúčinné dělení zředěných vzorků!!!
Frakcionační rozsah gelu: Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu. Sephadex G-25
1 – 5 kDa
Sephadex G-100
4 – 150 kDa
mez vyloučení velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórů gelu
molekuly penetrují do gelu bez zábran V e → Vt molekuly nepronikají do gelu Ve → V0
Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.
Použití: orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa) purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25) Výhody: šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotě levná, jednoduchá Omezení: nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezení vlivu difuse
techniky s vysokou kapacitou
techniky s nízkou kapacitou
Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.
precipitace hydrofobní interakce
dialýza, gelová f. G-25
ionexová chromatogr.
(afinitní chromatogr.) (elektroforesa) zakoncentrování vzorku
gelová filtrace obsah solí, pH – není důležité objem a koncentrace vzorku
odstranění částečně zdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů
Obsah protokolu: 1. Číslo a charakteristika enzymu 2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité metody a nastavení jejích parametrů 3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace 4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky Izolace enzymu
Protein (mg)
Enzym (U)
Výtěžek enzymu (%)
Nabohacení
Časová náročnost (čl./hod)
Na začátku izolace
511
14700
100
1
0
Amonium sulfát
181
14831
100
2,8
0,01
Hydrofobní interakce
172
14075
95,7
2,8
0,06
Ionex
26,4
13879
94,4
18,3
0,12
Gelová filtrace
20,2
13544
92,1
23,3
0,18
5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu
