Extrakce na pevné fázi (SPE)
Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Extrakce na pevné fázi (SPE) (Solid Phase Extraction)
SPE je metoda vhodná pro rychlou přípravu vzorků, která užívá pevnou fázi (sorbent) k selektivní • extrakci • koncentrování • čištění analytů před vlastní analýzou dalšími technikami, např. GC nebo HPLC SPE je mechanizmem separace totožná s kapalinovou chromatografií SPE úspěšně konkuruje v posledních letech extrakci kapalinakapalina (LLE)
Srovnání SPE s LLE Výhody SPE: lepší selektivita a specificita vyšší výtěžnost lepší odstranění nežádoucích nečistot a mechanických částic lepší reprodukovatelnost snazší manipulace a snadná automatizace, možnost zpracování více vzorků současně eliminace tvorby emulzí dramatické snížení spotřeby solventů možnost použítí méně škodlivých rozpouštědel extrakce je optimalizována užitím principů platných v chromatografii, důsledkem je velká flexibilita metody
Srovnání SPE a LC
Princip separace je stejný ALE: Cíle použití obou metod jsou odlišné, proto: • SPE je ale spíše metoda pracující v režimu „on-off”, tzn. cílem je buď analyt plně sorbovat nebo eluovat • LC naopak běžně využívá částečných sorpčních procesů
Sorbenty pro SPE • Sorbenty mají různé fyzikálně-chemické vlastnosti: měrný povrch, velikost částic a pórů, typ modifikace, typ matrice, apod. • Množství a paleta sorbentů pro SPE je pestrá a srovnatelná se stavem v HPLC Volba vhodného sorbentu je velmi podstatná Především je závislá na vlastnostech analytu a matrice vzorku V ideálním případě je specificky zadržován jen analyt, většinou je ale selektivita limitovaná a spolu s analytem jsou zachycovány i některé interferující látky, proto je třeba sorbent vybrat velmi pečlivě, a tím omezit koextrakci nečistot Volba extrakčních podmínek je také velmi důležitá Solventy, způsob eluce, atd.
Měrný povrch sorbentů
250 – 600 m2/gram
Velikost pórů
~7 nm
Velikost částic
40-60 µm
Sorbenty se silikagelovou matricí • nejčastěji používané • velmi rigidní • levné • snadno se derivatizují • dobrá chemická stabilita při pH 2-8 • nebotnají, nesráží se Polymerní sorbenty • obvykle kopolymery, např. styren-divinylbenzen • původně pouze hydrofobní sorbenty • velmi perspektivní, nové materiály “hydrofilizované” s řízenou polaritou, např. OASIS na bázi kopolymeru styrenvinylpyrolidon • povrch lze derivatizovat • chemická stabilita velká, běžně kompatbilní s pH 1-12 • malá botnavost
Extrakční mechanizmus Typy modifikací jsou obdobné jako v HPLC: reverzní (obrácená) fáze normální fáze iontoměnič afinitní sorbenty speciální nosiče a sorbenty Vliv matrice vzorku a podmínek extrakce na extrkční mechanizmus Specificita sorbentu k izolované složce je dána nejen sorbentem, ale i podmínkami extrakce, je dána především: • složením matrice vzorku • použitými solventy • pH • iontovou silou Různé sorbenty tak mohou poskytovat dělení na odlišných principech podle podmínek extrakce • Příklad: slabé ionexy
Obecný postup při extrakci na pevné fázi Obvykle 4 kroky: • kondicionace sorbentu • nanesení vzorku na sorbent • promytí lože vhodným rozpouštědlem • eluce žádaného analytu 1. Kondicionace sorbent je obvykle promyt rozpouštědlem, které „smočí“ jeho povrch, a tím vytvoří předpoklad pro následnou sorpci analytu (nebo nečistot) na sorbentu obvykle methanol, případně izopropanol– středně polární rozpouštědla pro kondicionaci RP tento krok vede k odstranění vzduchu a aktivaci povrchu stacionární fáze proces kondicionace je většinou proveden ve dvou fázích (zejména v případě dělení na RP a IEC sorbentech), nejprve se solvatuje povrch methanolem a potom kolona promyje solventem vhodným pro sorpci analytu/nečistot v dalším korku, tj. sorbent se ekvilibruje
2. Nanesení vzorku většinou je vzorek předem zředěn „slabším“ solventem, což následně zlepšuje retenci na sorbentu a snižuje vliv původní matrice vzorku volba solventu je závislá na typu sorbentu, pro RP je vzorek rozpuštěn v roztoku s vysokým podílem vody vzhledem k organickému rozpouštědlu 3. Promytí většinou nejnáročnšjí část procesu odstranění/oddělení nečistot od analytu vhodná volba solventů spolu se sorbentem vede k vysoké selektivitě separace pro RP se k promytí obvykle užívá směs vody s methanolem nebo acetonitrilem, procento organické složky je třeba optimalizovat s cílem dosažení nejlepších výsledků dělení analytu od nečistot
4. Eluce po vymytí komponent, které mají být odděleny je provedena kompletní eluce látky ze sorbentu „silným“ rozpouštědlem pro RP - methanol nebo acetonitril, 100% nebo s malým podílem vody/pufru
Techniky SPE – Retentive and non-retentive Solid phase extraction Retentive SPE cílem je selektivně zadržet a pak eluovat analyt běžnější technika Non-retentive SPE cílem je naopak zadržet interferující látky
Experimentální provedení SPE
