Selectieve inhibitie van flavivirus (dengue koorts virus en gele koorts virus) replicatie

DV KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN FACULTEIT GENEESKUNDE BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN

Selectieve inhibitie van flavivirus (dengue koorts virus en gele koorts virus) replicatie

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen door Natacha COEN

Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie Begeleider: Dr. Suzanne KAPTEIN Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie

Leuven, 2009

Dit proefschrift is een examendocument dat na verdediging niet werd gecorrigeerd voor eventueel vastgestelde fouten. In publicaties mag naar dit werk gerefereerd worden, mits schriftelijke toelating van de promotor(en) die met naam vermeld zijn op de titelpagina.

KATHOLIEKE UNIVERSITEIT LEUVEN FACULTEIT GENEESKUNDE BIOMEDISCHE WETENSCHAPPEN

Selectieve inhibitie van flavivirus (dengue koorts virus en gele koorts virus) replicatie

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen door Natacha COEN

Promotor: Prof. Dr. Johan NEYTS Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie Begeleider: Dr. Suzanne KAPTEIN Faculteit Geneeskunde Departement Microbiologie en Immunologie Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie

Leuven, 2009

Woord vooraf

Oef, na meer dan zeven maanden praktisch werk en intensief schrijven, permitteer ik me een weltevreden zuchtje. Gedurende die tijd heb ik niet alleen mezelf volledig gegeven, maar ook een enorme aandacht opgeëist van de mensen rondom mij. Daarom wil ik me even richten tot deze personen, die mij hebben in alle tijden hebben bijgestaan en tevens mijn oprechte dankbaarheid tonen.

Allereerst wil ik Prof. Dr. Johan Neyts bedanken, die mij de kans heeft gegeven mijn eindwerkonderzoek te mogen volbrengen in zijn laboratorium. Tevens waren zijn accurate verbeteringen en verdere adviezen meer dan welkom. Dr. Suzanne Kaptein, die me de hele weg door heeft begeleid en me getoond heeft wat onderzoek doen nu werkelijk is, verdient een dikke merci. Niet te vergeten, Tine De Burghhraeve, bij wie ik altijd terecht kon. Het dengue team ‘forever’! Maar helaas, aan alle mooie dingen komt een eind…

Niet te vergeten was de toffe sfeer in het labo te danken aan de aanwezigheid van een aantal personen met elk hun unieke karakteristieken. Bedankt Pieter, Kai, Leen, Susan, Stijn en Tom. De ‘Koen’ zal jullie rake opmerkingen niet snel vergeten!

Annemie, Lesley, Julie, Tinneke, Marijke en Vicky, onze vriendschap is voor mij van onschatbare waarde. De nodige steun die jullie mij hebben gegeven, maar ook de momenten van ontspanning op de welgekende plaatsen, waren onmisbaar.

Mijn ouders en familie wil ik ten zeerste bedanken dat ze mij de kans hebben gegeven om verder te studeren en mij in alle tijden gesteund te hebben. Merci de tout coeur.

Natacha

I

Samenvatting

Het dengue virus wordt beschouwd als het belangrijkste hemorragische koorts virus in termen van humane morbiditeit en mortaliteit. Desondanks is er nog altijd geen vaccin of antivirale therapie beschikbaar. De ontwikkeling van veilige en effectieve antivirale middelen is absoluut noodzakelijk. Met dit doel voor ogen werd allereerst een DENV cel-gebaseerde assay geoptimaliseerd door het opkweken van het DENV serotype 2 voor drie passages in C6/36 cellen. In Vero cellen werd het cytopathogeen effect geanalyseerd met een luminescentie ATP detectie systeem om een zo groot mogelijke signaal/ruis verhouding te verkrijgen. Door gebruik te maken van deze methode werden in vitro twee analoge moleculen, CHI104 en CHI105, geïdentificeerd en bevestigd als selectieve inhibitoren van het DENV-2/NGC [gemiddelde 50 % effectieve concentratie (EC50) van respectievelijk 0,9 µg/ml en 0,8 µM]. Evaluatie van CHI104 in een dengue reporter virus assay onthulde een tijds- en dosis-afhankelijke inhibitie van de replicatie van het virus. Verdere karakterisatie van de CHI104 antivirale werking op basis van een DENV replicon assay en een ‘time-of-addition’ assay toont aan dat de inhibitorisch activiteit zich situeert tijdens de virale RNA synthese door directe of indirecte werking op de niet-structurele genen van het DENV. Verdere studies zijn nodig om de precieze moleculaire interactie van het molecule met het virale doelwit te identificeren. We ontdekten tevens dat beide moleculen een nog krachtigere remming uitoefenen op het verwante gele koorts virus (17D vaccin stam) [EC50 = 0,2 µg/ml (CHI104) en 0,3 µM (CHI105)]. Een verdere bevestiging van de anti-flavivirus activiteit werd verkregen door aan te tonen dat beide moleculen ook werkzaam zijn tegen het muizen flavivirus, Modoc M544 stam, en het Modoc/gele koorts chimeer virus. Dit opent perspectieven voor de evaluatie van de werkzaamheid in kleine proefdiermodellen voor flavivirus infecties.

II

Summary

The dengue viruses are considered the most important hemorrhagic fever viruses in terms of morbidity and mortality. However, no vaccine or antiviral therapy is available. The development of safe and effective antiviral drugs becomes imperative. To accomplish this objective, we cultured the DENV serotype 2 for three passages in C6/36 cells in order to optimize a DENV cell-based assay. The cytopathogenic effect in Vero cells was measured with a luminescence ATP read-out system to obtain a higher signal-to-noise ratio. Using this method, two analogous molecules, CHI104 and CHI105, were identified and confirmed in vitro as selective inhibitors of DENV-2/NGC [mean 50 % effective concentration (EC50) of 0,9 µg/ml en 0,8 µM, respectively]. The evaluation of CHI104 in a dengue reporter virus assay revealed a time- and doses-dependent inhibition on viral replication. Furthermore, characterization of the antiviral mechanism of CHI104 was assessed by a DENV replicon assay and a time-of-addition assay, demonstrating the inhibitory effect of CHI104 during the viral RNA synthesis, probably by interacting directly or indirectly with the non-structural genes of the DENV genome. Additional studies are required to fully determine the interplay between the molecule and the viral target. We discovered that both molecules exhibited a more pronounced inhibition of the related yellow fever virus (17D vaccine strain) [YFV EC50 = 0,2 µg/ml (CHI104) en 0,3 µM (CHI105)]. An additional confirmation of the anti-flavivirus activity was obtained by demonstrating the activity of both molecules against the murine flavivirus, Modoc M544 strain, and the Modoc/yellow fever chimeric virus. This provides a perspective for the evaluation of de activity in small animal models for flavivirus infections.

III

Lijst met afkortingen

ADE

‘antibody dependent enhancement’

AL

antilichamen

AMP

adenosine monofosfaat

APC

antigen presenterende cellen

ARDS

‘acute respiratory distress syndrome’

ATP

adenosine trifosfaat

ATPlite

luminescentie ATP detectie assay systeem

AZ

aminozuren

BHK

‘Baby Hamster Kidney’

C6/36 cellen

muggencellen (Ae. albopictus)

CC

celcontrole

CC50

50% cytotoxische concentratie

CHI

Chimirri

Ct-waarde

“Cycle threshold” waarde

CTL

cytotoxische T-lymfocyt

CPE

cytopathogeen effect

DC-SIGN

‘Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Non-integrin’

DENV

dengue virus

DHK

dengue hemorragische koorts

DK

dengue koorts

DMEM

‘Dulbecco’s minimum essential medium’

DNA

desoxyribonucleïnezuur

DSS

dengue shock syndroom

EMCV

encefalomyocarditis virus

EC50

50% effectieve concentratie

ER

endoplasmatisch reticulum

FAM

‘6-carboxyfluorescein’

FCS

foetaal kalfsserum

GKV

gele koorts virus

GMP

guanosine monofosfaat

GRP78/BiP

‘glucose-regulating protein 78’

GTP

guanosine trifosfaat

HCV

Hepatitis C virus

HIV

Humaan immuundeficiëntie virus

Hsp

‘heat shock proteins’

ICAM

‘intercellular adhesion molecule’ IV

i.p.

intra-peritoneaal

IRES

‘internal ribosomal entry site’

MEM

‘Minimum Essential Medium’

MGB

‘minor groove binder’

MODV

Modoc virus

MOI

‘multiplicity of infection’

MTS

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy phenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium

NAD(P)H

nicotinamide adenine dinucleotide (fosfaat)

NKV

‘not-known vector’

NGC

Nieuw-guinea C stam

NTP

nucleotide trifosfaat

OD

optische densiteit

PAC

puromycine N-acetyltransferase

PBS

fosfaat gebufferd fysiologisch zout

PFU

‘plaque forming unit’

p.i.

post-infectie

PMS

‘phenzine methosulfate’

PPi

pyrofosfaat

RBV

ribavirine

RC

replicon controle

RNA

ribonucleïnezuur

rpm

rotaties per minuut

RSV

respiratoir syncytiaal virus

RT-qPCR

‘Reverse transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction’

SI

selectiviteitsindex

S/R

signaal/ruis

Th1

T-helpercel 1

TOA

‘Time-of-addition’

UTR

onvertaalde regio

VC

viruscontrole

Vero

‘African Green Monkey’

vRNA

viraal RNA

ZO-Azië

Zuidoost- Azië

IV

Inhoudstafel

Woord vooraf ......................................................................................................................................... I Samenvatting......................................................................................................................................... II Summary ............................................................................................................................................... III Lijst met afkortingen .............................................................................................................................. IV Inhoudstafel ........................................................................................................................................... V 1

INLEIDING ......................................................................................................................... 1

2

LITERATUURSTUDIE ....................................................................................................... 2

2.1 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.2.1 2.2.2.2 2.3.2.3 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.2.3.4 2.2.3.5 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.7.1 2.7.2 2.8 2.8.1 2.8.2 2.8.2.1 2.8.2.2 2.8.2.3 2.8.2.4 2.8.3 2.8.3.1. 2.8.3.2 2.8.3.3 2.9

Epidemiologie................................................................................................................... 2 Geschiedenis ............................................................................................................... 2 Huidige status .............................................................................................................. 3 Transmissie ................................................................................................................. 4 Dengue, een escalerend probleem ............................................................................. 5 Virus structuur en compositie ........................................................................................ 6 Het genoom ................................................................................................................. 6 Structurele proteïnen .................................................................................................. 7 Enveloppe (E) proteïne ....................................................................................... 7 Membraan (M) proteïne ...................................................................................... 8 Capside (C) proteïne........................................................................................... 8 Niet-structurele proteïnen ........................................................................................... 8 Niet-structureel proteïne 1 (NS1) ........................................................................ 8 Niet-structureel proteïne 2 (NS2) ........................................................................ 8 Niet-structureel proteïne 3 (NS3) ........................................................................ 9 Niet-structureel proteïne 4 (NS4) ........................................................................ 9 Niet-structureel proteïne 5 (NS5) ........................................................................ 9 Virale replicatie................................................................................................................. 9 Adsorptie, penetratie en ontmanteling......................................................................... 9 Translatie en RNA replicatie........................................................................................ 10 Virus assemblage, maturatie en vrijstelling ................................................................ 10 Klinische presentatie ....................................................................................................... 11 Pathogenese..................................................................................................................... 12 Behandeling...................................................................................................................... 13 Preventie ........................................................................................................................... 13 Vector controle ............................................................................................................ 13 Vaccin .......................................................................................................................... 14 Therapeutische benadering ............................................................................................ 15 Ontwikkeling van antivirale middelen .......................................................................... 15 Specifieke antivirale therapie....................................................................................... 15 NS3 protease-helicase........................................................................................ 16 NS5 methyltransferase-polymerase.................................................................... 17 Gastheercel proteïnen ........................................................................................ 18 Morfolino oligomeren en andere antisense oligonucleotiden.............................. 18 Breed-spectrum moleculen ......................................................................................... 19 Ribavirine ............................................................................................................ 19 Interferon............................................................................................................. 20 Andere ................................................................................................................ 20 Diermodellen .................................................................................................................... 21

V

3

EXPERIMENTEEL WERK ................................................................................................. 22

3.1 Materiaal en Methoden .................................................................................................... 22 3.1.1 Materiaal ...................................................................................................................... 22 3.1.1.1 Cellen en virus .................................................................................................... 22 3.1.1.2 Media en oplossingen ......................................................................................... 22 3.1.1.3 Antivirale moleculen............................................................................................ 23 3.1.2 Methoden..................................................................................................................... 23 3.1.2.1 Subcultiveren van cellen ..................................................................................... 23 3.1.2.2 Virusstock ........................................................................................................... 23 3.1.2.3 Virustitratie .......................................................................................................... 24 3.1.2.4 Plaque assay....................................................................................................... 25 3.1.2.5 Antivirale en cytotoxische assay ......................................................................... 25 3.1.2.5.1 Manuele assay ......................................................................................... 26 3.1.2.5.2 Semi-automatische assay........................................................................ 27 3.1.2.6 MTS assay .......................................................................................................... 27 3.1.2.7 ATP detectie assay ............................................................................................. 28 3.1.2.8 Dengue reporter antivirale assay ........................................................................ 29 3.1.2.9 Virus yield assay ................................................................................................. 30 3.1.2.10 RT-qPCR ............................................................................................................ 30 3.1.2.11 DENV replicon assay .......................................................................................... 31 3.1.2.12 Time-of-addition assay........................................................................................ 32 3.1.2.12.1 GKV.......................................................................................................... 32 3.1.2.12.2 DENV ....................................................................................................... 33 3.2 Resultaten......................................................................................................................... 34 3.2.1 Optimalisatie van een DENV assay............................................................................. 34 3.2.1.1 Optimale testcondities......................................................................................... 34 3.2.1.2 MTS- versus ATPlite-methode............................................................................ 36 3.2.2 Hit identificatie ............................................................................................................. 37 3.2.2.1 Evaluatie DENV antivirale activiteit ..................................................................... 37 3.2.2.2 Evaluatie GKV antivirale activiteit ....................................................................... 39 3.2.3 Hit validatie .................................................................................................................. 39 3.2.3.1 Dengue reporter virus ......................................................................................... 40 3.2.3.2 DENV virus yield assay....................................................................................... 41 3.2.3.3 DENV replicon assay .......................................................................................... 41 3.2.3.4 Time-of-addition met dengue repoter virus......................................................... 42 3.2.3.5 GKV virus yield assay ......................................................................................... 43 3.2.3.6 Time-of-addition met GKV .................................................................................. 43 3.2.3.7 Virus yield assay met MOD/GK chimeer virus .................................................... 45 3.2.3.8 MODV virus yield assay ...................................................................................... 46 4

ALGEMEEN BESLUIT................................................................................................. 47

Literatuurlijst Bijlage I: Optimalisatie DENV screening assay: percentage CPE ........................................................ I

V

Hoofdstuk 1 Inleiding De hemorragische koorts virussen, dengue en het verwante gele koorts, behoren tot de familie van de Flaviviridae, in het genus flavivirus. Transmissie van deze RNA virussen naar de mens kan voortkomen uit een beet van een besmette vrouwelijke Aedes mug (Ae. aegypti als voornaamste vector). In het geval van het dengue virus (DENV) kunnen er zich milde symptomen ontwikkelen genaamd dengue koorts en kan de ziekte verder ontwikkelen tot het ernstige dengue hemorragische koorts/ dengue shock syndroom (DHK/DSS). Jaarlijks worden wereldwijd meer dan 100 miljoen individuen geïnfecteerd met het virus, waarbij het voor 20.000 fataal wordt (voornamelijk kinderen). De incidentie van het DENV stijgt dramatisch over de laatste decennia, vanwege de populatiegroei, de falende vector controle, de vector distributie door de effecten van de opwarming van de aarde en tal van andere factoren die de transmissie bevorderen. Omdat muggen niet kunnen worden uitgeroeid, moeten andere maatregelingen genomen worden om de aandoening te voorkomen of te behandelen. Een kosteneffectief vaccin is nodig voor de preventie en controle van dengue op lang termijn, maar het ontwikkelen van een DENV vaccin blijkt bijzonder moeilijk en een werkzaam vaccin wordt dan ook niet verwacht in de nabije toekomst. Daarnaast lijkt het idee van wereldwijde vaccinatie onwaarschijnlijk gezien de gebrekkige gezondheidsinfrastructuur in de ontwikkelingslanden. De nood is hoog om krachtige antivirale middelen tegen flavivirussen, zoals het DENV en het GKV te ontwikkelen. De nieuwe therapeutica dienen reizigers en de bevolking in (hyper)endemische landen te beschermen tegen ziekte, alsook de viremie te reduceren in patiënten om de kans op een ernstiger ziekteverloop (nl. DHK/DSS) te verminderen.

Globaal zijn over de jaren heen een tal van antivirale middelen op de markt gebracht, grotendeels werden ze ontwikkeld voor HIV, HBV en herpesvirus infecties. Specifieke therapieën voor hoog pathogene RNA virale infecties zijn eerder gelimiteerd en strekt zich voornamelijk uit tot de ontwikkeling van antivirale middelen voor het influenza virus, in het vooruitzicht om mensen te behandelen tijdens een pandemie. Daarentegen, bezit geen enkel flavivirus, inclusief het DENV, een gevalideerd antiviraal middel, desondanks de verscheidene potentieel geconserveerde doelwitten die aantrekkelijk zijn voor de ontwikkeling van krachtige inhibitoren. Dit sluit niet uit dat een aanzienlijk aantal producten potentiële activiteit in vitro vertonen tegen deze RNA virussen. Ribavirine, een molecule waaraan nagenoeg alle RNA virussen gevoelig zijn, toont doorgaans weinig potentie als antiviraal middel, ook tegen flavivirussen.

Het doel van deze studie was een bijdrage te leveren tot de ontwikkeling van inhibitoren van het DENV. We optimaliseerden de nodige assays en karakteriseerden de antivirale activiteit van twee potentiële inhibitoren met behulp van verscheidene andere assays, o.a. DENV reporter assay, virus yield assay, RT-qPCR, DENV replicon assay en een ‘time-of-addition’ assay.

Inleiding

1

Hoofdstuk 2 Literatuurstudie Dengue is een ziekte die, door de laatste twee eeuwen heen, verscheidene pseudoniemen verworven heeft. ‘Break-bone fever’, ‘dandy fever’, ‘denguero’, ‘bouquet fever’, ‘giraffe fever’, ‘polka fever’ en knokkelkoorts verwijzen allen naar dengue [1]. De ziekte wordt veroorzaakt door een RNA virus behorend tot het genus Flavivirus, familie Flaviviridae. De familie bestaat uit drie genera, Flavivirus, Pestivirus en Hepacivirus. Het genus Flavivirus omvat meer dan 70 virussen die verder kunnen opgedeeld worden in drie clusters, (i) virussen die worden overgedragen door muggen zoals het dengue virus (DENV), het Japanse encefalitis virus (JEV), het West Nijl virus (WNV) en het gele koorts virus (GKV), het prototype van de familie, (ii) virussen die worden overgedragen door teken o.a. het Tick-borne encefalitis virus (TBEV) en (iii) virussen geïsoleerd uit (vleer)muizen waarvoor nog geen natuurlijke transmissie route is aangetoond, bijvoorbeeld het Modoc virus (MODV) (Figuur 1) [2].

Figuur 1 | Fylogenetische boom van enkele flavivirussen. Virussen, behorende tot de cluster die wordt overgedragen door muggen: het dengue virus (DENV), gele koorts virus (YFV), St. Louis encephalitits virus (SLEV) , West nile virus (WNV), Murray Valley encephalitis virus (MVEV), Japanese encephalitis virus (JEV) en het Banzi virus. Virussen overgedragen door teken: Louping ill virus ( LIV) en Tick-borne encephalitis virus (TBEV). Virussen waar nog geen natuurlijke vector voor

omschreven

is:

het

Modoc

virus

(MODV)

en

Myotis

leukoencephalitis virus (MMLV) [2].

Het DENV verspreidt zich over de meeste tropische en subtropische regio’s in de wereld en wordt beschouwd als het belangrijkste arbovirus (transmissie via muggen of teken) in termen van humane morbiditeit en mortaliteit [1, 3]. Er circuleren vier dengue serotypes (DENV-1 tot -4) die de oorzaak zijn van verscheidene ziektebeelden in de mens, van dengue koorts (DK) tot de levensbedreigende dengue hemorragische koorts/dengue shock syndroom (DHK/DSS) [4].

2.1 Epidemiologie 2.2.1 Geschiedenis In 1779-1780 vonden er grote epidemieën van een ziekte, vermoedelijk dengue, plaats op drie continenten (Azië, Afrika en Noord-Amerika). Er zijn echter eerdere rapporteringen van dengueachtige ziekte achterhaald. Tot op heden dateert het vroegst geregistreerde gelijkaardig ziektebeeld van ongeveer 1000 jaar geleden, teruggevonden in een Chinese encyclopedie van ziektesymptomen Literatuurstudie

2

en remedies. Deze ziekte werd door de Chinezen watervergif genoemd en werd gerelateerd met vliegende insecten in associatie met water [5]. Men veronderstelt dat het DENV een Aziatische oorsprong heeft en geen Afrikaanse. Deze hypothese baseert zich op fylogenetische studies, alsook op de hoge prevalentie van de verschillende dengue serotypes in Azië [6, 7]. de

Van de 17

ste

tot de vroege 20

eeuw veroorzaakte het DENV wijdverspreide epidemieën. Sinds

de eerst werkelijk geregistreerde dengue epidemie in Philadelphia (1780) wordt het ziektepatroon gekarakteriseerd als relatief infrequent (10-40 jaren interval), maar hevig. Verscheidene van de de

de

destijds grote epidemieën waren de weerslag van de groeiende scheepvaartindustrie (17 -18 eeuw), die verantwoordelijk was voor de introductie van nieuwe dengue serotypes [5].

Het patroon wijzigt dramatisch tijdens en na de tweede wereldoorlog. Het binnendringen van de geallieerden en de Japanse soldaten in endemisch Aziatische regio’s (o.a. Stille Zuidzee), gecombineerd met populatiegroei, creëerde ideale condities voor de reproductie van Ae. aegypti, de primaire vector van het DENV. Dit heeft als resultaat dat het DENV in nieuwe geografische gebieden voorkomt en hyperendemische (co-circulatie van multipele dengue serotypes) infecties in ZO-Azië veroorzaakt. Hoogstwaarschijnlijk heeft dit bijgedragen tot het ontstaan van DHK epidemieën in de jaren 1950. De allereerste gerapporteerde DHK epidemie deed zich voor in Manilla, Filippijnen in 1953-54 [5, 7-9]. In 1981, toen het DENV-2 vanuit ZO-Azië zich introduceerde in Cuba, bleef Amerika ook niet gespaard van een DHK epidemie [10].

2.2.2 Huidige status De voorbije 30 jaar is de geografische verspreiding van het DENV dramatisch veranderd, zowel binnen een land, als tussen gebieden en continenten. Dit resulteert in een toename van DK epidemieën in alle tropische regio’s van de wereld en het zich voordoen van epidemisch DHK in de Stille Zuidzee en tropisch Amerika [7]. In Azië kunnen jaarlijkse epidemieën en de stijgende frequentie aan sequentiële infecties bij kinderen verklaard worden door het endemisch voorkomen van de vier DENV serotypes in de steden ste

en door de epidemische DK frequentie in de eerste 50 jaar van de 20 ste

werden epidemieën van DK gerapporteerd aan het begin van de 20

eeuw [7, 8]. In Zuid-Afrika

eeuw. Sinds 1980 wordt een

dramatische stijging van DK waargenomen, veroorzaakt door de vier serotypes. Echter, omwille van de povere monitoring is de ware prevalentie op dit continent onduidelijk [6, 7, 11]. Vooral Zuid-Amerika lijdt onder het probleem van de opkomende DK/DHK. De ‘Pan American Health Organization’ (PAHO) heeft, in een poging om gele koorts te bestrijden, een campagne opgericht voor de eradicatie van Ae. aegypti (eveneens verantwoordelijk voor de transmissie van het GKV). In centraal en Zuid-Amerika werden hierdoor nog enkel sporadisch epidemieën waargenomen in 1950-1960. Echter, na de stopzetting van de campagne in 1970 raakte de distributie van de mug nog wijder verspreid dan voor de aanvang van het eradicatie programma [11]. Rond 1970-1980 volgde hieruit een verhoogde epidemische activiteit en DHK, dit in tegenstelling tot ZO-Azië, waar het fenomeen zich reeds in de jaren ’50 en ’60 voordeed [12]. In Rio de Janeiro werden dit jaar nog zo’n 75.399 mensen geïnfecteerd met het DENV. Tijdens die periode zouden 80 mensen zijn omgekomen, waarvan meer dan de helft kinderen jonger dan 13 jaar [13]. Literatuurstudie

3

Vandaag de dag leeft meer dan twee vijfde van de wereldbevolking (2,5 biljoen mensen) in potentiële DENV risicogebieden (Figuur 2) [9]. Het DENV infecteert jaarlijks 50-100 miljoen mensen, waarbij 500.000 gevallen van DHK en meer dan 20.000 doden, voornamelijk kinderen [3, 14]. De mortaliteit voor DHK bedraagt 5% en kan gereduceerd worden tot 1% bij correct medisch handelen. Het aantal rapporteringen van patiënten tijdens een epidemie (1 per 100 tot 1 per 1000 van de populatie) ligt 5 à 10 keer lager dan het aantal daadwerkelijke infecties, omdat mensen met een mild ziektebeeld niet om medische zorgen vragen [11]. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) meldt dat ongeveer de helft van de risicopatiënten in ZO-Azië leeft, waarvan Indonesië in 2006 verantwoordelijk was voor 57% van de dengue-gevallen [15]. Het aantal geregistreerde DENV gevallen blijft stijgen. Zo kende Indonesië in 2006-2007 een stijging van 10%, wat neerkomt op meer dan 100.000 patiënten. Verscheidene andere landen ondervinden dit zelfde scenario, o.a. in Thailand en Myanmar met een respectievelijke stijging van 27% en 33% [18]. [16]

Figuur 2 | WHO 2007. De risicogebieden voor dengue transmissie. DENV transmissie in tropische en subtropische gebieden zijn weergegeven in het groen. Een geografische uitbreiding van dengue werd waargenomen door de internationale handel tussen 2000 en 2007 (donker groen). De januari- en juli-isotherm 10°C bakent het leefgebied van de dengue vector (Ae. Aegypti) af [16].

2.2.3 Transmissie In tegenstelling tot de meeste andere flavivirussen is voor het DENV en het GKV de mens de natuurlijke gastheer [17]. Het DENV wordt overgebracht door de vrouwelijke Aedes mug (subgenus Stegomyia) o.a. Ae. aegypti, Ae. albopictus en Ae polynesiensis. De virussen overleven door een urbane (mug-humane) cyclus met periodieke epidemieën die hoofdzakelijk onderhouden wordt door Ae. aegypti, ruraal soms lokale andere Aedessoorten. Daarnaast bestaat er nog een sylvatische (mug-primaten) cyclus in de regenwouden van Azië en Afrika [3, 5]. Ae. aegypti is een geacclimatiseerde mug die wordt teruggevonden dicht bij menselijke leefomgevingen. Ze bijt hoofdzakelijk overdag (vooral in de vroege ochtend en namiddag) binnen of in beschutte

gebieden.

Literatuurstudie

Broedplaatsen

voor

de

larven

van

Ae.

aegypti

omvatten

artificiële 4

watercontainers zoals banden, dakgoten, bloempotten, gebrekkig afvalbeheer, enzovoort [8]. Virus transmissie impliceert bloedopname door muggen tijdens de viremische fase en de passage naar een volgende ontvankelijke gastheer. Door het onderbreken van de bloedmaaltijd als gevolg van de kleinste bewegingen kan Ae. aegypti meerdere personen per bloedmaaltijd infecteren. Dit gedrag maakt Ae. aegypti een efficiënte epidemische vector [5]. Bovendien kan het DENV transovarieel in de mug worden doorgegeven naar de volgende generatie [8]. Ae. albopictus (tijgermug) is een wit-zwart gestreepte mug die oorspronkelijk afkomstig is uit ZOAzië, maar zich de laatste decennia over alle continenten heeft verspreid. De import van goederen heeft bijgedragen aan de geografische expansie van Ae. albopictus naar Amerika, Frankrijk, Spanje en Italië. Tevens wordt het Chikungunya virus (Togaviridae, Alfavirus), evenals minstens 21 andere virussen, overgedragen door de tijgermug. De mug kan zowel verscheidene diersoorten als de mens infecteren en onderhoudt op die manier de transmissie tussen de sylvatische en urbane cyclus van het DENV [18].

2.2.4 Dengue, een escalerend probleem Vandaag de dag is dengue één van de belangrijkste opkomende tropische virale ziektes in de wereld. De laatste 50 jaar steeg de morbiditeit en mortaliteit aanzienlijk, waardoor de impact vergelijkbaar wordt met die van malaria, tuberculose en bacteriële meningitis [19]. Dit manifesteert zich in een dramatische stijging van de frequentie van DK, de verspreiding van hyperendemische transmissie en de verhoogde incidentie van DHK met bovendien het voorkomen van DHK in nieuwe regio’s (Figuur 3) [9]. Aan de basis van dit gezondheidsprobleem liggen de veranderingen in menselijke demografie en het gedrag [8, 14]. Beïnvloedende factoren betreffen (i) de ongekende globale populatiegroei, welke geassocieerd gaat met ongecontroleerde verstedelijking (vooral in de ontwikkelingslanden), (ii) een stijging in het aantal broedplaatsen voor de larven door een verslechtering van behuizing, water, riool en vuilbeheer [5, 7, 8, 19] en (iii) het gebrek aan effectieve vector controle in endemische gebieden en

Figuur 3 | Het jaarlijks gemiddeld aantal DK/DHK-gevallen gerapporteerd aan de WHO en het jaarlijks gemiddeld aantal landen dat dengue rapporteert. De toename in het aantal dengue-gevallen per decennia is te wijten aan een stijging in DK/DHK incidentie, maar ook aan een verbeterde rapportering. Vóór 1970 waren er slechts 9 landen waar DHK voorkwam; sindsdien is het aantal toegenomen met een factor 4 en deze trend zet zich nog steeds voort. [16]

Literatuurstudie

5

de achteruitgang van de medische infrastructuur (met het tekort aan getrainde specialisten). Daarbij is de toename aan mobiliteit, voornamelijk via vliegtuigen, een ideaal mechanisme voor de transmissie van dengue tussen verschillende menselijke populaties in de wereld. Het geheel creëert ideale condities voor de transmissie van arbovirussen en bevordert sterk de wereldwijde geografische distributie en populatiedensiteit van Ae. aegypti. De opwarming van de aarde zou mogelijk ook kunnen bijdragen aan de verdere spreiding van Ae. albopictus naar warmere regio’s in Amerika en Europa [20]. Ondanks de relatief lage wintertemperaturen heeft de tijgermug zich al weten te vestigen in Noord-Amerika, Noord-Japan en Noord-Italië. De zomertemperaturen zijn daar geschikt voor de overleving en de succesvolle reproductiecyclus van Ae. albopictus [18]. Desondanks vormt het klimaat niet de voornaamste factor in de toename van DENV transmissie. Het menselijk handelen en de impact hiervan op de lokale ecologie speelt een meer significante rol [9, 21]. [22]

2.2 Virus structuur en compositie Gelijk andere flavivirussen beschikt het DENV over een positief, enkelstrengs RNA ((+)ssRNA). Het eicosahedraal nucleocapside (NC) kapselt het ~10,7kb RNA in een lipide enveloppe met 180 kopijen van twee glycoproteïnen, het enveloppe en het precursor membraan proteïne. Het complete virion is 3

ongeveer 50 nm in diameter met een densiteit van 1,23 g/cm (Figuur 4) [1, 3]. A

B

Figuur 4 | Het dengue virion. (A) Cryo-electronenmicroscopische opname van het dengue virion. (B) Schematische representatie van een matuur virion. E, enveloppe proteïne; prM, precursor membraan proteïne; M, membraan proteïne; C, capside proteïne [1].

2.2.1 Het genoom Het viraal RNA (vRNA) gelijkt op een messenger RNA (mRNA) vermits het een type I cap bevat aan het 5’-uiteinde; anderzijds ontbreekt de poly(A)-staart aan het 3’-uiteinde [1, 3]. Het genoom bevat één open leesraam met als resultaat de vorming van slechts één polyproteïne (Figuur 5). De amino(N)terminus codeert voor drie structurele proteïnen: het caspide (C) proteïne, het membraan precursor (prM) proteïne en het enveloppe (E) proteïne. Deze zijn essentieel voor de vorming van het viruspartikel. Verder codeert het genoom voor zeven niet-structurele proteïnen NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5. Deze maken de virale replicatie mogelijk [3, 23]. De individuele functionele proteïnen worden verkregen door de activiteit van gastheercel proteasen in het endoplasmatisch reticulum (ER), zoals signalase en furine, en door het virale protease (serine protease) dat zich in het cytoplasma bevindt [3]. Het open leesraam wordt geflankeerd door een 5’- en Literatuurstudie

6

3’-onvertaalde regio (UTR) die secundaire structuren bevat en cruciaal zijn voor de initiatie en regulatie van translatie, replicatie en virus assemblage [4].

2.2.2 Structurele proteïnen 2.2.2.1 Enveloppe (E) proteïne Het E-glycoproteïne (~53 kD) is van belang voor de opname van het virus in de doelwitcel. Het fusieproces en de interactie met oppervlaktereceptoren zijn geassocieerd met het E-proteïne en bepalen het celtropisme [1]. Voor het correct functioneren van het glycoproteïne bevat deze drie domeinen. Domein I is een centraal structureel domein, deze bevat de N-terminus en wordt geflankeerd door domein II en III. Aan het distale eind van domein II bevindt zich een fusiepeptide. Het immunoglobuline-achtig domein III bevat vermoedelijk de receptor bindingsplaats [23]. Epitopen in het E-proteïne zijn verantwoordelijk voor het generen van mogelijk neutraliserende antilichamen tegen het DENV. De horizontale organisatie van de E-proteïne dimeren op het virion-oppervlak is cruciaal voor het functioneren van de dimeren en creëert een binnen- en buitenoppervlak, waardoor enkel de buitenste AZ blootgesteld worden aan mogelijke neutraliserende antilichamen. Tijdens het fusieproces bevordert de lage pH conformatieveranderingen in de organisatie van de dimeren. Dit resulteert in de blootstelling van AZ die oorspronkelijk binnen in het dimeer lagen en nu meer toegankelijk worden voor antilichamen, waardoor nieuwe epitopen tot stand gebracht worden [24].

Figuur 5 | Het DENV genoom en de verwerking van het polyproteïne. Het genoom is onderverdeeld in structurele (rood) en niet-structurele (grijs) genen. Het 5’-uiteinde bevat een type I cap en aan het 3’-uiteinde ontbreekt een poly-(A)-staart. Proteolytische verwerking van het polyproteïne door virale (NS2b/NS3pro) en gastheercel proteasen (signalase en furine) resulteert in drie structurele proteïnen (C, capside of prM, precursor membraan of E, enveloppe proteïne) en zeven nietstructurele proteïnen (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b en NS5). NS3pro klieft op de juncties NS2a/NS2b, NS2b/NS3, NS3/NS4a en NS4b/NS5 en nog bijkomende sites in de virale proteïnen zelf. De N-terminus bevat een 5’ UTR en de Cterminus een 3’ UTR [31].

Literatuurstudie

7

2.2.2.2 Membraan (M) proteïne De specifieke proteolytische klieving van het geglycosyleerd prM-proteïne (~26 kD) tijdens virusmaturatie resulteert in de vorming van het membraan (M)-proteïne. Deze cruciale stap in de morfogenese van het virion gebeurt in de zure vesikels van het trans-Golgi netwerk door het gastheer furine, die de N-terminus vrijstelt van het prM-proteïne. Dit proces is verantwoordelijk voor een toename van de infectiviteit van het virus en de reorganisatie van het E-proteïne op het virus oppervlak die essentieel is voor het fusieproces [1, 3]. Op die manier zou het prM-proteïne een chaperonne functie bezitten voor de vouwing en assemblage van het E-proteïne [4, 23].

2.2.2.3 Capside (C) proteïne Het C-proteïne (~11 kD) is het eerste virale polypeptide dat gesynthetiseerd wordt tijdens translatie. Het is rijk aan lysine en arginine residuen (25%). Het basisch karakter van dit membraangeassocieerde proteïne is waarschijnlijk nodig om een interactie aan te gaan met het vRNA [1]. Bijgevolg is het verantwoordelijk voor het verpakken van het vRNA en de vorming van het NC [3, 23].

2.2.3 Niet-structurele proteïnen 2.2.3.1 Niet-structureel proteïne 1 (NS1) NS1, het eerste niet-structurele proteïne, heeft een molecuulgewicht van ~46 kD en wordt gesynthetiseerd in het ruw endoplasmatisch reticulum (rER) als een hydrofiel monomeer glycoproteïne. Na het passeren van het Golgi-apparaat kan het gesecreteerd worden als oplosbaar NS1 (sNS1) proteïne, membraan-gebonden blijven of deel uitmaken van het viraal replicatie-complex [1, 4]. De functie van NS1 is nog niet volledig opgehelderd, maar blijkt betrokken te zijn in de synthese van negatief strengs-RNA [25]. Experimenten op muggencellen toonden aan dat de glycosylatie op 2 residuen van belang zijn voor virus-replicatie [4]. Op immunologisch vlak speelt het ook zijn rol, aangezien cellen die NS1 op hun oppervlak tot expressie brengen, een doelwit zijn voor cytolyse [1]. In het bloed van patiënten kan sNS1 teruggevonden worden, waarbij de concentratie correleert met de viremie. Dit suggereert een mogelijke relatie tussen de concentratie sNS1 en de ernst van het ziektebeeld [4].

2.2.3.2 Niet-structureel proteïne 2 (NS2) De coderende regio van NS2 bevat twee proteïnen, namelijk NS2a (~22 kD) en NS2b (~14 kD). NS2a is een hydrofoob proteïne met verscheidene mogelijke transmembraan domeinen en medieert proteolytische verwerking van de C-terminus van NS1[1]. NS2b fungeert als cofactor voor de activatie van het NS3-protease (NS3pro) via binding aan het protease enerzijds en cellulaire membranen anderzijds [3, 4]. NS2b dient als chaperonne dat het NS3pro stabiliseert en assisteert bij het vouwen tot de actieve conformatie [26].

Literatuurstudie

8

2.2.3.3 Niet-structureel proteïne 3 (NS3) NS3 is een hydrofiel multifunctioneel proteïne (~70 kD). Allereerst is het N-terminaal serine protease domein essentieel voor de verwerking van het polyproteïne tot de afzonderlijke functionele proteïnen [1, 4]. Verder is de RNA 5’-trifosfatase (RTPase) functie vereist voor de verwijdering van een 7

fosfaatgroep in het nieuwgevormde RNA, waardoor de 5’ mG capping mogelijk is. Als laatste zijn het RNA helicase en RNA-stimulerend nucleoside trifosfatase (NTPase) domein in de C-terminale regio vereist voor virale RNA-synthese [1, 3, 4]. Tijdens replicatie ontwindt het helicase het dubbelstrengs RNA. Dit is een energie-afhankelijk proces waarbij het NTPase de nodige energie levert uit de hydrolyse van ATP [3].

2.2.3.4 Niet-structureel proteïne 4 (NS4) Na proteolytische splitsing vormen zich nog twee kleine hydrofobe, functionele proteïnen, NS4a (~16 kD) en NS4b (~27 kD) [1, 4]. Het integraal membraan-proteïne NS4a draagt bij tot het vormen van het viraal replicatie-complex. NS4b wordt geco-lokaliseerd met het NS3-proteïne en dubbel strengig RNA (dsRNA) in ER-membraan structuren waar de RNA replicatie plaatsvindt. De identiteit en functie van de posttranslationele modificatie van het NS4b-proteïne moeten nog bepaald worden [25].

2.2.3.5 Niet-structureel proteïne 5 (NS5) Het NS5 (~103 kD) proteïne is een RNA-afhankelijk RNA-polymerase (RaRp), maar bezit eveneens een methyltransferase (Mtase) activiteit. Het Mtase is S-adenosylmethionine (SAM)-afhankelijk en verantwoordelijk voor de methylatie van de cap. Het RaRp is essentieel voor de synthese van een intermediaire RNA-streng en voor de verdere synthese van het (+)ssRNA [1, 3, 4].

2.3 Virale replicatie 2.3.1 Adsorptie, penetratie en ontmanteling De virale replicatie (Figuur 6) begint wanneer het DENV een cel infecteert. Het cellulair tropisme omvat voornamelijk monocyten, macrofagen en dendritische cellen (DCs). Doorgaans verloopt de opname van DENV via receptor-gemedieerde endocytose (RGE) [1, 4]. Onder de verscheidene kandidaatreceptoren voor RGE is DC-SIGN de voornaamste. Andere reeds beschreven receptoren zijn

o.a.

heparaansulfaat,

hsp70,

hsp90,

CD14,

GRP78/BiP,

37-kD/67-kD

hoge-affiniteit

lamininereceptor en vermoedelijk nog andere niet-geïdentificeerde receptoren [4, 23]. De opname van het virus begint met adsorptie, door de binding aan een veel voorkomende lageaffiniteitsreceptor, waarschijnlijk o.a. heparaan sulfaat. Vervolgens zou het virion een binding aangaan met een minder voorkomende, hoge-affiniteitsreceptor dat de internalisatie medieert [3, 4]. DC-SIGN is een lectine dat eerder de adsorptie van DENV bevordert dan de internalisatie [27, 28]. Tijdens RGE, dat onder zure condities in het endosoom plaatsvindt, ondergaat het E-proteïne dimeer een irreversibele conformatieverandering tot een trimeer [4, 23, 29]. Deze clusteren op het virale oppervlak, waarna de blootgestelde fusiepeptiden op de tip van de trimeren de membraanfusie

Literatuurstudie

9

initiëren. Na de fusie wordt het NC vrijgesteld in het cytoplasma en verdere dissociatie van het NC leidt tot het vrijkomen van het vRNA [3, 23].

2.3.2 Translatie en RNA replicatie Translatie en replicatie gebeuren in associatie met intracellulaire membraanstructuren. Tijdens de replicatie wordt de negatieve RNA-streng als templaat gebruikt voor de productie van een overmaat aan positieve RNA-strengen. Het nieuw gevormde (+)ssRNA dient vervolgens zowel als vRNA, als mRNA [4]. De niet-structurele proteïnen associëren om het viraal replicatie-complex te vormen. Vervolgens bindt het complex geconserveerde structuren in het vRNA, waardoor de synthese geïnitieerd wordt. De synthese wordt gereguleerd door de binding van het replicatie-complex aan specifieke sequenties in het 3’ UTR [30]. De efficiëntie van de vroege translatie is afhankelijk van het DENV-serotype en de geïnfecteerde cel. Na het rekruteren van de translatie-machinerie en wanneer de kleine ribosomale subeenheid het eerste startcodon (AUG) heeft bereikt, kan de initiële translatie starten. Het gevormde polyproteïne wordt co- en posttranslationeel gekliefd door virale en cellulaire proteases in de drie structurele en zeven niet-structurele proteïnen (cfr. supra) [4, 27, 31].

2.3.3 Virus assemblage, maturatie en vrijstelling Het membraan-geassocieerde C-proteïne is de cruciale factor voor de stimulatie van de virion assemblage. Meerdere kopijen van het C-proteïne en één kopij van het vRNA vormen samen het NC [3]. Tijdens de vorming van het NC wordt de virale enveloppe verkregen door passage van het NC door het ER-membraan, dat integraal E- en prM-proteïnen bevat. Dit verklaart waarom de lipide

Figuur 6 | De replicatiecyclus van het DENV. Via receptor-gemedieerde endocytose worden DENV-partikels geïnternaliseerd. Na het vrijstellen van het RNA uit het nucleocapside in het cytoplasma wordt het polyproteïne gesynthetiseerd. Associatie van de niet-structurele proteïnen tot een replicatie-complex laat de vorming van dsRNA toe, dat vereist is voor de verdere replicatie van het vRNA. Maturatie in het trans-Golgi-netwerk laat fusie met de gastheercel toe. Het proces van ‘antibody-dependent enhancement’ bevordert de internalisatie van het DENV door aanwezigheid van Fcreceptoren op de doelwitcel [66].

Literatuurstudie

10

samenstelling van de enveloppe eerder gelijkt op intracytoplasmatische membranen dan het plasmamembraan [1]. Passage door het Golgi-netwerk resulteert vervolgens in virusmaturatie. De blootstelling aan een lage pH veroorzaakt een irreversibele conformatieverandering, waardoor de furine klievingsplaats in het prM proteïne wordt blootgesteld [29]. De omvorming van het prM- tot M-proteïne na klieving resulteert weer in de conformatieverandering van het E-proteïne, waardoor de 60 prM-E trimeren op het virusoppervlak gereorganiseerd worden tot 90 E homodimeren, de definitieve conformatie [23]. De vrijstelling van virus-partikels, zowel infectieuze en niet-infectieuze (subvirale), gebeurt via exocytose. De kleinere subvirale partikels worden eveneens geproduceerd in het ER, maar bevatten enkel het lipide membraan en de glycoproteïnen; het NC en vRNA ontbreekt [23]. Het aantal infectieuze partikels is sterk afhankelijk van het virus [29].

2.4 Klinische presentatie DENV-infecties verlopen doorgaans asymptomatisch. Daarnaast kan het virus, na een incubatieperiode van 3 tot 15 dagen (gewoonlijk 5 tot 8 dagen), twee ziektebeelden veroorzaken, dengue koorts en dengue hemorragische koorts. De patiënt ervaart een acute koortsachtige ziekte die typisch 3 tot 7 dagen duurt [1, 32, 33]. DK is een ziekte van (oudere) kinderen en volwassenen die gepaard gaat met plotseling hoge koorts, frontale hoofdpijn, retro-orbitale pijn, myalgie, arthralgie (vandaar de naam ‘break bone fever’), ‘nausea’, transiënte huiduitslag, braken en verlies van eetlust. Patiënten kunnen ook aan anorexia lijden, een veranderde smaakperceptie hebben en milde keelpijn ervaren. Doorgaans verdwijnen deze symptomen zonder complicaties 10 dagen na het opkomen van het ziektebeeld [1, 5, 32]. In ongeveer 3% van de DENV-gevallen manifesteert DHK/DSS zich zoals beschreven volgens de WHO-criteria (Figuur 7) [34, 35]. DHK/DSS wordt geclassificeerd in vier graden (van milde graad I tot de meest ernstige graad IV) op basis van klinische presentatie en laboratorium bevindingen [34, 36]. Symptomen van DK zijn hierin terug te vinden, alsook vasculaire permeabiliteitsdefecten. Deze defecten resulteren in plasmalekkage, hemostatische abnormaliteiten zoals thrombocytopenie (< 3

100,000 cellen/mm ), stijging van de bloeddruk, een verhoogd hematocriet (≥ 20%) en hemorragische diathese [33, 37]. Verandering in de vasculaire permeabiliteit kan leiden tot circulair falen met als gevolg hypovolemische shock, DSS [38]. Veel DHK-patiënten hebben slechts geringe hemorragische manifestaties, waarbij petechiae vaak het enige klinische teken is. Deze petechiae kan worden

Figuur 7 | Criteria volgens de WHO voor

de

classificatie

van

DHK-

patiënten. Tekenen en symptomen die voldoen aan de graad van ziekte (I tot IV). Graad III en IV zijn geassocieerd met DSS [1].

Literatuurstudie

11

opgewekt via de tourniquettest [33]. Naast DK en DHK/DSS zijn er nog atypische manifestaties van dengue die steeds meer voorkomen, maar toch weinig gerapporteerd worden. Vasculaire permeabiliteit en stollingsstoornissen kunnen een variëteit aan systemische stoornissen veroorzaken, zoals encefalopathie, hepatitis, hartritmestoornissen, acuut renaal falen, ARDS, lymfadenopathie en splenomegalie [39].

2.5 Pathogenese Ondanks de vele studies, is de pathogenese van DHK nog steeds niet geheel opgehelderd. Zowel virale, gastheer als immuun-factoren blijken de graad van ernst van het ziektebeeld te beïnvloeden [40]. Individuele factoren die het risico verhogen zijn leeftijd, ras, voedingstatus en onderliggende chronische ziektes, zoals astma [33]. Onder de voorgestelde hypothesen voor de verklaring van de pathogenese is de ‘antibody-dependent enhancement’ (ADE) theorie de voornaamste (cfr. infra) [37]. In primaire DENV-infecties zijn immature Langerhans cellen de initiële plaats van virale replicatie. Adsorptie van DENV stimuleert de DC-maturatie en -activatie [37]. DCs zijn de eerste lijn van defensie van het immuunsysteem, evenals de naturel killer (NK) cellen die de activatie van geïnfecteerde DCs bevordert door de secretie van IFN-γ en dus een rol heeft in de bescherming en virale klaring [34, 36]. Vervolgens migreren de DCs naar T-cel rijke regio’s zoals de lymfoïde organen [37]. T-cel activatie stimuleert een geheugenrespons en de activatie van macrofagen (via IFN-γ), het complement-systeem en bloedplaatjes. Dit alles resulteert in een verandering in vrijstelling van de pro-inflammatoire cytokines IFN-γ, IL-1, IL-8 en TNF-α, alsook de anti-inflammatoire cytokines IL-6 en IL-10 [4, 30, 41, 42]. Het bevorderen van de vasculaire permeabiliteit in DHK is deels te verklaren door de verhoogde productie aan TNF-α [33]. Hiermee is evident dat cytokines een sleutelrol spelen in DHK pathogenese [43]. Een primaire DENV-infectie voorziet de gastheer van een levenslange immuniteit voor dat serotype, maar slechts een gedeeltelijke en transiënte (<12 weken p.i.) immuniteit voor de drie andere DENV serotypes [4, 27, 31, 37]. DHK/DSS kan geïnduceerd worden tijdens een primaire of secundaire DENV-infectie [36]. DHK tijdens een eerste primaire infectie in de eerste levensjaren is te wijten aan de aanwezigheid van antilichamen (AL) afkomstig van een geïnfecteerde moeder [10, 33]. Doorgaans is DHK geassocieerd met een secundaire infectie van een heterogeen serotype; daarbij treedt een belangrijk immuunpathogeen proces op, ADE [34]. ADE ontstaat doordat kruisreagerende, maar niet neutraliserende AL complexen vormen met het DENV die binden aan Fc-receptorbevattende cellen (Figuur 6) [44]. Bijgevolg wordt de infectie bevorderd door een toename van het aantal geïnfecteerde cellen en niet door een toename van de virusproductie binnen de cel [36]. Secundaire infecties activeren preferentieel kruisreagerende geheugen T-cellen die specifiek gericht zijn tegen de pirmaire infectie (eerder dan tegen de huidige infectie). Met dit fenomeen wordt verwezen naar ‘original antigenic sin’ en wordt de eliminatie van het virus vertraagd [33]. Terwijl intracellulaire defensiemechanismen, vrije radicalen en antivirale cytokines worden gereduceerd, neemt de productie van immuunsuppresieve cytokines toe. Gezamenlijk manifesteert zich dit in een hogere mate van viremie en een verergering van het ziektebeeld [41].

Literatuurstudie

12

2.6 Behandeling Ondanks de toename van de gezondheids- en economische impact van dengue, is er nog geen specifieke behandeling voor deze infecties [34]. Patiënten worden symptomatisch behandeld en afhankelijk van hun conditie (aantal bloedplaatjes, leverfunctie, elektrolyten en bloedgassen) kunnen ondersteunende maatregelen genomen worden [14]. De patiënt wordt aangeraden te rusten en veel te drinken om dehydratatie te vermijden. In geval van DHK stabiliseren corticosteroïden de capillaire permeabiliteit

en

voorkomen

ze

plasma

lekkage

[45].

Niet-steroïde

anti-inflammatoire

geneesmiddelen, zoals ibuprofen en aspirine, moeten ten sterkste vermeden worden omwille van hun antistollingseigenschappen. Bij zwaar gehospitaliseerde individuen kan controle over de vitale orgaanfuncties, vloeistofbalans en hematologische parameters doorslaggevend zijn [11].

2.7 Preventie 2.7.1 Vector controle Er bestaan geen universele richtlijnen voor de bestrijding van arbovirussen, aangezien fluctuaties in de immuniteit, de contacteigenschappen tussen de mens en mug, vector-ecologie en klimaatpatronen de transmissiedynamiek sterk doet variëren [46]. Eerder werd voor het GKV een succesvol vector controleprogramma opgesteld door de PAHO voor de eradicatie van Ae. aegypti. Zo’n succesvol programma vereist geïnformeerde, adequaat gefinancierde en een goed georganiseerde leiding. Tevens is de deelname van de gemeenschap essentieel. Personen die het insect rondom hun huis bestrijden, o.a. door pesticiden, zijn nog steeds kwetsbaar door de omgeving waar geen interventies worden genomen [47]. Er is consensus over het feit dat een significante reductie in de vectorpopulatie een effect heeft op het voorkomen van de ziekte en dat de enige parameter om na te gaan of een programma werkt, de afname in incidentie is [46]. Controle-methodes i.v.m. het milieu omvatten het beheer van watervoorzieningen, vermijden van broedplaatsen voor de mug, afvalbeheer en het veranderen van de leefomgeving van de larven. Muggensteken kunnen vermeden worden door persoonlijke bescherming zoals kleren, afweermiddelen met diëthyltoluamide (DEET) en larviciden. In geval van een epidemie kunnen insecticiden worden toegepast [14]. Evenzeer kunnen ‘larvicidal ovitraps’ dienen als hulpmiddelen voor vector controle. Dit zijn zwarte met water gevulde cilindrische containers waar besmette muggen hun eieren in leggen die de later-gevormde volwassen muggen gevangen houden onder een netwerk van draden en verdrinken [48]. DengueNet (http://www.who.int/denguenet) is een op internet gebaseerd systeem voor de globale toezicht op DK en DHK welke door het WHO in het leven is geroepen. Het is een netwerk van gestandaardiseerde data om incidentie en trends van dengue te detecteren en te controleren, waardoor nationale data meer vergelijkbaar worden. Daarnaast verleent DengueNet nog een onbeperkte toegang tot nuttige informatie voor werknemers van de volksgezondheid om zich beter voor te bereiden op de eerste aanwijzingen van DENV-epidemieën. Het DengueNet bevordert de beoordeling van de gezondheids- en economische lasten evenals, de doelmatigheid van nieuwe en reeds bestaande controle-interventies [49, 50].

Literatuurstudie

13

2.7.2 Vaccin Uit het verleden is gebleken dat vector controle onvoldoende effectief is of slechts succesvol op korte termijn. Bijgevolg is de ontwikkeling van een vaccin cruciaal voor een langdurige controle [42]. In tegenstelling tot het GKV en het JEV, bestaat er vandaag de dag nog altijd geen DENV-vaccin. Toch zijn er wel enkele kandidaten in fase van ontwikkeling [51]. Onder de mogelijke vaccinstrategieën behoren levend-geattenueerd (chimeer) virus, geïnactiveerd virus, DNA-plasmide en subeenheid vaccin [14, 52]. De moeizame pogingen om een DENV-vaccin te ontwikkelen, is toe te schrijven aan het gebrek aan een adequaat diermodel voor dengue. Tevens zou een ideaal vaccin een individu moeten beschermen tegen alle vier de DENV-serotypes omwille van het risico op ADE in DENVendemische gebieden. Ook moet het makkelijk te gebruiken zijn, veilig voor kinderen tussen 9-12 maanden, goedkoop en een langdurig beschermende immuniteit opwekken (>10 jaar) [12]. Levend-geattenueerde vaccins kunnen bekomen worden door het afzwakken van het virus via seriële passage in celcultuur [52]. Theoretisch zou het afgezwakt DENV zowel een humorale (neutraliserende AL) als een cellulaire (Th1/CTL) immuniteit moeten opwekken [53, 54]. Naast het probleem van onvoldoende/over-attenutatie, is ook het samenstellen van een monovalent tot tetravalent vaccin een obstakel [52]. De aanwezigheid van een ongebalanceerde immuunrespons bij een tetravalent vaccin is te wijten aan het optreden van interferentie tussen de verschillende serotypes. De immuunrespons van bepaalde serotype domineert in dat geval boven de andere, wat een potentieel risico op ADE met zich meebrengt [42, 53]. Een eerst mogelijke levend tetravalent vaccin werd vervaardigd door Walter Reed Army Institute of Research and Glaxo-SmithKline en is het eerste vaccin dat een 100% immunologische respons opwekt voor alle DENV serorypes [26]. Deze bevindt zich echter nog in klinische fase II in Thailand. Een ander vaccin, ontwikkeld door Acambis, werd bekomen door de genetische manipulatie van DENV-genen. Het plaatsen van de DENV structurele genen in een kloon van het gele koorts 17D vaccin levert een chimeer (ChimeriVaxDENV), levend-geattenueerd vaccin op. Enkel inductie van AL voor DENV kunnen worden waargenomen en niet voor GKV. In collaboratie met Sanofi Pasteur, werden chimeren gecreëerd voor de vier DENV-serotypes en gecombineerd tot een tetravalent vaccin die zich momenteel in klinische fase I bevindt [52, 55]. De ‘National Institutes of Health’ (NIH) hanteerde een andere strategie gebaseerd op ‘reverse genetics’, waarbij een verminderde immuunrespons bekomen werd door het creëren van deleties in het 3’ UTR van het DENV-4 genoom [53]. Resultaten van een fase I klinische studie gaven een redelijke veiligheid en immunogeniciteit weer. Op dezelfde manier creëerde CDC (inviragen) een tetravalent vaccin (in preklische fase) met als basis een DENV-2 mutant waarbij prM- en E-genen vervangen werden door die van DENV-1,-3 en -4 [52]. Een andere benadering, aangewend door Hawaii Biotech leidde tot een tetravalent ‘subunit’ vaccin. Het mengel bevat de vier serotypes van het E-proteïne, samen met het NS1-proteïne van DENV-2 als immunogeen [52]. Andere preklinische ontwikkelingen zijn DNA-vaccins en adenovirale vectoren voor het tot expressie brengen van één of meerdere DENV-genen [53]. Het internationaal vaccin instituut in Korea richtte in 2003 het pediatrische dengue vaccin initiatief (PDVI) op dat gefinancierd wordt door de Bill and Melinda Gates Foundation [56]. Het maakt deel uit Literatuurstudie

14

van één van de vele lopende vaccin ontwikkelingsprogramma’s en richten zich vooral op het versnellen van de ontwikkeling en introductie van dengue vaccins. Hun doel is een betaalbaar vaccin dat toegankelijk is voor arme kinderen in endemische landen [51].

2.8 Therapeutische benadering 2.8.1 Ontwikkeling van antivirale middelen De weg die een molecule aflegt tot een erkend geneesmiddel, is lang en complex. Het ontwikkelingsproces start bij het basisonderzoek. Het proces impliceert ‘high throughput screening’ (HTS), dat grote bibliotheken van chemische moleculen test voor een gewenst effect. Een alternatief op HTS is ‘rational-drug design’, dat effectieve moleculen construeert op basis van structurele informatie [57]. Op die manier kunnen specifieke moleculen worden geïdentificeerd die de functie van een viraal eiwit of de virale replicatie verstoren in levende cellen. Deze moleculen noemen we ‘hits’. Geselecteerde hits worden geoptimaliseerd tot ‘lead’ moleculen door varianten, met grotere potentie en betere farmacologische eigenschappen, te creëren. Na in vivo validatie zal uiteindelijk één of meerdere kandidaatmoleculen met de gewenste eigenschappen verder in klinische studies getest worden [58]. Belangrijke aspecten in de evaluatie van nieuwe moleculen zijn het werkingsmechanisme en de selectiviteit. De selectiviteit stelt het verschil in dosis voor waar een antiviraal effect (EC50) en een cytotoxisch effect (CC50) optreedt. Het begrijpen van beide aspecten gebeurt het best via de studie van resistentie-ontwikkeling. Het waarnemen van resistentie tegen een antiviraal middel impliceert dat het selectief is. Bijgevolg interfereert het molecule eerder met een direct virus-specifiek proces dan met een gastheercel proces. Naast de verworven resistentie, vereist het virus een behoud van pathogeniciteit om nog een ziektebeeld te kunnen uitlokken. Door de gevormde mutaties in kaart te brengen, kan het doelwit en het verdere mechanisme geïdentificeerd worden. Om resistentie tegen te gaan, biedt combinatietherapie een mogelijke oplossing. Dit brengt echter nadelen met zich mee zoals de bijkomende toxiciteit en de verminderde compliantie [58]. Voor flavivirussen zou een antiviraal middel bij voorkeur een breed-spectrum activiteit moeten bezitten. Dit vergroot de toepasbaarheid van het molecule wanneer ze verscheidene RNA-virussen (bijvoorbeeld alle DENV serotypes en gerelateerde flavivirussen) kan onderdrukken. Bijgevolg zal de farmaceutische industrie meer geneigd zijn om het antiviraal middel te ontwikkelen [50].

2.8.2 Specifieke antivirale therapie Om de obstakels van vaccinontwikkeling te omzeilen, zouden specifieke therapeutica een oplossing kunnen bieden. Voor de ontwikkeling van een DENV inhibitor, komen meerdere essentiële stadia tijdens de virale cyclus in aanmerking, zoals de binding en opname van het virus in de cel, de maturatieprocessen, de vRNA synthese en bepaalde gastheercel-proteïnen [3, 57]. Moleculen die interfereren met de initiële virus-gastheercel interactie, zorgen voor een eerste remming van virale replicatie [59]. Bepaalde gesulfateerde proteoglycanen blijken receptormoleculen te zijn voor DENV. Vandaar dat bepaalde sterk gesulfateerde polysacchariden uit zeewier, zoals fucoidans en Literatuurstudie

15

galactomannanen, het DENV inhiberen [60]. De cap-synthese van vRNA vereist cytoplasmatische virale enzymen, zoals het Mtase (N-terminaal domein van het NS5-proteïne) en het RNA-trifosfatase (C-terminaal domein van het NS3-proteïne). Zodoende kan de remming van zulke enzymen beschouwd worden als een potentieel antiviraal mechanisme. [50]. De zoektocht naar specifieke inhibitoren vereist bijgevolg een grondige kennis van de biochemische en structurele eigenschappen van de essentiële virale proteïnen [25].

2.8.2.1 NS3 protease-helicase Protease. Structurele studies suggereren dat het multifunctioneel NS3-proteïne is opgebouwd uit een NS3pro, dat ruimtelijk georiënteerd bovenop het subdomein I en II van het NS3-helicase ligt (Figuur 8) [61]. Het protease is essentieel voor de maturatie van het dengue polyproteïne en bevat de katalytische aminozuren His-51, Asp-75 en Ser-135 (triade). Peptiden worden gekliefd in een consensusplaats, waarbij een dibasisch (Arg/Lys)-Arg motief op posities P2 en P1 worden waargenomen en een klein aminozuur (Gly, Ala, ser) op positie P1’ [25, 61]. Een recombinante vorm van het NS3pro, gefuseerd door een glycine linker (Gly4-Ser-Gly4) aan 40 AZ van de cofactor NS2b (CF40GlyNS3pro), werd tot expressie gebracht in Escherichia coli [62]. Alvorens een proteaseinhibitor te creëren, is men genoodzaakt de specificiteit van het protease-substraat te bepalen. Afhankelijk van deze substraten worden dan kleine moleculen ontworpen en getest op hun inhiberende activiteit [26]. De proteasen van DENV-1 tot -4 delen een zeer gelijkaardige substraatspecificiteit. Dit impliceert dat het mogelijk zou zijn slechts één molecule te ontwikkelen tegen het protease van elk serotype. Dit zou eveneens gelden voor verwante flavivirussen zoals het GKV en het WNV [63-65]. Zo blijkt er een klasse van inhibitoren (pyrazoline klasse) geïdentificeerd te zijn, die de NS2b-bindingsplaats in het WNV NS3pro blokkeert. Dit belemmert vervolgens de interactie tussen NS2b en NS3pro [66, 67]. De interactie tussen beide proteïnen lijkt vereist te zijn voor een degelijke vouwing van het WNV NS3pro en de correcte interactie met het substraat. Het blokkeren van de proteïne-interactie biedt een mogelijkheid aan voor het ontwikkelen van nieuwe selectieve inhibitoren [26, 66].

Helicase. In de C-terminale regio van het NS3-proteïne bevindt zich het helicase, bestaande uit drie subdomeinen (Figuur 8). Structurele gelijkenissen zijn terug te vinden in andere flavivirussen [61]. De ontwinding, uitgevoerd door het helicase, zou op drie manieren verhinderd kunnen worden: door te interfereren met de ATP-binding, het voorkomen van de RNA-binding of het blokkeren van de helicase translocatie [25]. Bij eerder uitgevoerde plaats-specifieke mutagenese studies ondervond men echter resterende helicase activiteit die ATP-onafhankelijk blijkt te zijn. Deze observatie ontmoedigt het ontwikkelen van competitieve inhibitoren voor de ATP-bindingsplaats in het helicase [66]. Anderzijds kan het NS3pro ook als doel dienen om de helicase activiteit te remmen. In aanwezigheid van het protease wordt de enzymatische activiteit van het helicase met een factor 30 vergroot en daarbij ook de affiniteit voor ATP verhoogd [57, 61, 66]. N-alkyl derivaten van 1H-benzotrialzool en 1H-benzimidazool blijken een sterke activiteit uit te oefenen tegen het helicase van verscheidene flavivirussen (DENV, GKV, JEV en het hepatitis C virus

Literatuurstudie

16

(HCV)) [68]. Verder inhiberen een aantal 5’-O-(4-fluorosulfonylbenzoyl (FSB))-esters van nucleosiden (adenosine, guanosine, inosine), alsook FSB-esters van ribavirine (RBV), de NTPase/helicase activiteit van Flaviviridae (o.a. het DENV). De geobserveerde cytotoxiciteit van deze esters is te wijten aan het blokkeren van de NTP bindingsplaats van cellulaire enzymen [69].

2.8.2.2 NS5 methyltransferase-polymerase Methyltranferase. Mutationele studies wijzen op de essentiële rol van het Mtase in de virale replicatie. Het functioneel domein van het Mtase methyleert de N-7 positie van de 5’-guanosine cap, evenals de 7

ribose op de 2’-OH positie van het eerst afgeschreven nucleotide (m GpppAm) [25, 61]. Beide methylaties gebruiken SAM als methyl-donor [70]. De zoektocht naar Mtase-inhibitoren is gestart, maar vereist nog veel onderzoek [25]. De cap-methylatie kan voorkomen worden door guanosineanalogen die in competitie treden om de Mtase-bindingplaats. Benarroch et al. toonde in vitro aan dat RBV trifosfaat de DENV-Mtase activiteit inhibeert. Dit zou een deel van de antivirale activiteit van RBV in flavivirussen verklaren (cfr. infra) [71].

Figuur 8 | De kristalstructuur van de niet-structurele proteïnen NS3 en NS5. NS3 is links weergegeven. Het protease domein (residues 1-168) is N-terminaal gelegen in het molecule. De katalytische aminozuren zijn weergegeven in het blauw (His-51), het paars (Asp-75) en het geel (Ser-135). Rood stelt de cofactor NS2b voor. De Gly-Ser linker tussen het protease en het helicase is in het blauw afgebeeld. Twee-derde van het proteïne vormt het C-terminale helicase domein (residues 180-618). De zeven verschillende motieven, verantwoordelijk voor de activiteit, hebben elk een aparte kleur gekregen op de figuur. NS5 is rechts weergegeven. Het methyltranferase is afgebeeld in verscheidene kleuren, waarbij de cap-structuur van het vRNA in het zwart is gekleurd en het bijproduct van SAM in het rood. Het polymerase bevat een vinger domein (residu’s 273-315; 416-496; 543-600) afgebeeld in het blauw, het palm domein (residu’s 497-542; 601-705) in het groen en het duim domein (residu’s 706900) in het rood. De NLS-sequentie is weergegeven in het geel en het bruin (residu’s 320-368; 369-405) [61].

Literatuurstudie

17

RNA-afhankelijk RNA-polymerase. De kristalstructuur veronderstelt dat het DENV RaRp gelijkaardig is met andere RaRp-moleculen. De samenstelling volgens een rechterhand conformatie bestaat uit een palm, vingers en een duim subdomein (Figuur 8) [61]. De actieve plaats is gelegen in het palm subdomein, waar een asparaginezuur residu betrokken is in de katalytische activiteit. Het vinger subdomein is uiterst stabiel en verantwoordelijk voor conformatieveranderingen. De interactie tussen het palm en duim subdomein speelt een rol in de binding van NTP’s [72]. Het nucleus lokalisatie signaal (NLS) is verantwoordelijk voor de lokalisatie van het NS5-proteïne in de nucleus. De reden voor deze nucleaire lokalisatie wordt ten heden intensief onderzocht [57, 61]. Aangezien het RaRp afwezig is in humane cellen, sterk geconserveerd is onder en essentieel is voor de flavivirussen, is het NS5-proteïne één van de meest belovende doelwitten voor antivirale therapie. De inhibitie van het NS5-proteïne en bijgevolg de RNA replicatie, kan zowel door middel van nucleoside als nietnucleoside analogen (NA/NNA). NA worden gefosforyleerd tot 5’trifosfaten om vervolgens in het vRNA geïncorporeerd te worden. NNA zijn allosterische inhibitoren, waarbij de kans op resistentieontwikkeling groter is dan NA [25]. Allosterische inhibitoren blijken effectief te zijn in de onderdrukking van het HIV reverse transcritpase en de polymerase activiteit van het hepatitis B virus [73]. Proteïneproteïne interacties en proteïne-RNA interacties van het polymerase zijn minder bestudeerd als antivirale strategie [72].

2.8.2.3 Gastheercel proteïnen Virus-gastheercel interacties zijn belangrijk voor de virale levenscyclus, echter ook voor de pathogenese. Een aantal cellulaire proteïnen die binden aan het vRNA zijn reeds bekend o.a. EF-1α (elongatie factor) en PTB (polypyrimidine tract binding protein), welke DENV-4 RNA binden. Hun bijdrage aan de virale replicatie blijft echter nog onbekend [25]. Inhibitoren van gastheercel proteïnen kunnen zowel de interactie van het proteïne met het translatiecomplex verstoren, als het metabolisme van de gastheercel [50]. Voorbeeld zijn RBV en 6-azauridine (zie paragraaf 2.8.3).

2.8.2.4 Morfolino oligomeren en andere antisense oligonucleotiden Morfolino oligomeren zijn antisense synthetische moleculen die gebruikt worden om de genexpressie te beïnvloeden. De klasse fosforodiamidaat morfolino oligomeren (PMO) bevat een natuurlijke base op een morfolino-ring (i.p.v. op de deoxyribose-ring zoals in DNA) gekoppeld via een fosforodiamidaatgroep (i.p.v een fosfodiester) (Figuur 9). In tegenstelling tot ‘small interfering RNA’ [74]

(siRNA) degraderen ze het doelwit RNA niet, maar werken ze als een sterische blokker. Kinney et al. identificeerden twee locaties in het DENV-2 genoom die resulteerden in reductie van virale replicatie na het toedienen van een peptide-gebonden P4-PMO molecule. Deze zijn gelegen in de 5’ proximale nucleotiden (5’ UTR) en de 3’ cyclisatie sequentie (3’ UTR) [75]. Fosforothioaat antisense oligonucleotiden zijn nucleïnezuurfragmenten die hybridizeren met de complementaire sequenties van RNA. Het zijn antisense oligonucleotiden waarbij het zuurstofatoom in de PO-dubbele binding van DNA vervangen werd door een zwavelatoom. Deze substitutie maakt ze resistent aan cellulaire nucleasen en bewerkstelligen zo een succesvolle inhibitie van DENV-replicatie [76]. Naast het

Literatuurstudie

18

selectief binden aan RNA, brengt het echter ook neveneffecten met zich mee door mogelijke interactie met DNA en proteïnen [59].

Figuur 9 | De opbouw van DNA en morfolino-esters. DNA

Figuur 10 | De structuur van ribavirine. Ribavirine is een

is opgebouwd uit een base (A,G,T,C) op een deoxyribose-

breed-spectrum inhibitor voor virale RNA replicatie [50].

ring gekoppeld via een fosfodiester-verbinding. Morfolino’s bevatten een base (A,G,T,C) op een morfolino-ring gekoppeld via een fosforodiamidaat-groep [75].

2.8.3 Breed-spectrum moleculen 2.8.3.1. Ribavirine Ribavirine (RBV, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide, Figuur 10) is een breed-spectrum inhibitor van de virale RNA replicatie. RBV wordt beschouwd als een guanosine-analoog die interfereert met de replicatie van een aantal flavivirussen in vitro, waarvan de potentie kan variëren naar gelang het virus [50]. Slechts in enkele diermodellen blijkt RBV een beschermend effect uit te oefenen [77]. Voor de verklaring van de antivirale activiteit bestaan er verscheidene moleculaire mechanismen. Het meest prominente mechanisme voor flavivirussen grijpt in op de synthese ‘pathway’ van GMP wegens de inhibitie van het inosine 5’-monofosfaat (IMP) dehydrogenase [50, 78]. Dit resulteert in een tekort in de GTP-voorraad, welke nodig is voor de synthese van nieuw vRNA [58]. Anderzijds zou RBV de virale cap-vorming tegengaan door een negatief effect uit te oefenen op de NS5 Mtase activiteit van het DENV [31, 71]. Verder wordt er een inhibitie van het RaRp door RBV trifosfaat waargenomen, althans in vitro voor het influenza virus en het HCV. Finaal werkt RBV op de activiteit van het viraal NTPase/helicase. De inhibitie van de helicase activiteit wordt gesuggereerd voor reovirussen [50]. De aandacht moet eveneens gevestigd worden op het feit dat RBV een mutagene en immunomodulerende activiteit zou bezitten. Het mutageen effect kan gegenereerd worden door het incorporeren van RBV tegenover de pyrimidine basen cytidine en uridine in de groeiende RNA keten van het poliovirus. De accumulatie van mutaties (met een factor 10) in het viraal genoom is het resultaat van het zogenaamde proces ‘error-catastrofe’ [50]. Bovendien stimuleert RBV de secretie van cytokinen (IL-2, IFN-γ, and TNF-α) door T-cellen, om op die manier de immuunrespons te moduleren. Deze cytokines bevorderen de Th-1respons en remmen de Th-2 repons tijdens een immuunreactie [79]. RBV wordt toegepast bij RSV-infecties en als therapie voor HCV-patiënten in combinatie met IFNα [78]. Over het algemeen is RBV geen effectieve molecule voor de behandeling van flavivirus Literatuurstudie

19

infecties. Het bestuderen van de activiteit en toxiciteit van RBV analogen (levoviridine en mizoribine) en ‘prodrugs’ (viramidine) leidde tot de conclusie dat meer potente en veiligere analogen gecreëerd moeten worden. EICAR, een 5-ethynyl analoog van RBV, toont in vitro een 10 tot 30 keer verhoogde antivirale activiteit, maar dit impliceerde helaas een stijging in toxiciteit als gevolg van een meer uitgesproken inhibitie van het IMP dehydrogenase [50].

2.8.3.2 Interferon De IFN-respons vertegenwoordigt de vroege gastheercel defensie en draagt bij tot het aangeboren immuunsysteem [34]. Het is reeds in vitro aangetoond dat zowel IFN-α/β als IFN-γ een beschermend effect heeft gedurende een DENV-infectie [4]. DENV/diermodellen bekrachtigen dit resultaat, waarbij IFN-receptor-deficiënte muizen een hogere DENV-titer bezitten [4]. De suppressie van het DENV zou te wijten zijn aan het blokkeren van de translatie van het initieel vRNA [34]. Vermits het virus mechanismen heeft ontwikkeld om de IFN signaling ‘pathway’ te omzeilen (via de inhibitie van transcriptie factor STAT-1 door NS2b, NS4a en NS4b), zal IFN-α enkel over een antiviraal effect beschikken indien het wordt toegediend voordat de infectie plaatsvindt. [41]. Dit verklaart de aanwezigheid van hoge DENV-titers in individuen ondanks het circuleren van grote hoeveelheden IFN-α [34]. Analyse van IFN signaal transductie ‘pathways’ onthulde het bestaan van TRAIL (tumor necrosis factor [TNF]-related apoptosis-inducing ligand) als een proteïne met potentiële antivirale activiteit. Deze nieuwe functie van TRAIL werd reeds eerder aangetoond in vivo voor influenza en encefalomyocarditis virusinfectie. TRAIL promoot specifiek apoptose in cellen na binding aan zijn ‘death’ receptoren. Warke et al. vermoedt naast een apoptose-afhankelijke DENV inhibitie ook een apoptose-onafhankelijke functie van TRAIL. De DENV studie gaf weer dat het virus in staat is de expressie van TRAIL te induceren in imuuncellen via de IFN-α signaal transductie pathway. Men stelt een mogelijk werkingsmechanisme voor, maar verder onderzoek zal dit moeten uitwijzen. De hypothese bestaat erin dat de antivirale werking het resultaat zou zijn van een verhoogde expressie van gekende of nieuwe antivirale cellulaire proteïnen, die vervolgens gesecreteerd worden [80].

2.8.3.3 Andere Het mycofenolzuur (MPA) is, in tegenstelling tot RBV, een competitieve niet-nucleoside inhibitor van het IMP dehydrogenase en bevordert eveneens depletie van de GTP-voorraad. Het MPA voorkomt de replicatie van zowel positieve als negatieve strengs RNA-virussen. Klinische applicatie van MPA bestaat erin de afstoting van getransplanteerde organen tegen te gaan. Het MPA als immuunsuppressief agens ligt bij concentraties ver boven de DENV-inhiberende concentraties [77]. ZX-2401 (2-amino-8-(β-D-ribofuranosyl) imidazo [1,2-a]-striazine-4-one of 5-aza-7-deazaguanosine), een nucleoside analoog met een breedspectrum antivirale activiteit, inhibeert in vitro de replicatie van minstents vijf virussen van de Flaviviridae familie (o.a. het GKV, DENV en WNV). De activiteit tegen het DENV blijkt sterker te zijn dan RBV, alsook minder toxisch. Verder onderzoek moet aantonen welke de verschillen en gelijkenissen zijn in het werkingsmechanisme van ZX-2401 en RBV [81].

Literatuurstudie

20

Het triazine nucleoside, 6-azauridine, interfereert met het metabolisme van de cel, in het bijzonder de vorming van nucleïnezuren. Na een intracellulaire fosforylatie van 6-azauridine tot zijn 5’monofosfaat vorm, grijpt het in op het orotidine monofosfaat decarboxylase dat verantwoordelijk is voor de biosynthese van pyrimidines. Dit molecule zal echter niet enkel de virale replicatie inhiberen, maar ook een cytostatisch effect uitoefenen. Het nucleoside analoog, pyrazofurine, zou eenzelfde antivirale activiteit bezitten [50, 82]. In vele signaal transductie ‘pathways’ staat fosforylatie van proteïnen door kinasen centraal. Dit laat toe biochemische signalen door te geven, zoals celoverleving en het ontwijken van het immuunsysteem. Ook virale proteïnen, o.a. het DENV NS5-proteïne, worden gefosforyleerd. Hierdoor veronderstelt men dat kinase-inhibitoren een invloed hebben op DENV-replicatie. In DENV-infecties blijken kinsases van de Src-familie belangrijk te zijn. Dasatinib is geïdentificeerd als een nietselectieve Src-familie kinase-inhibitor die de assemblage van virus partikels verhindert. Voorts wordt AZD0530 uit diezelfde familie geclassificeerd als een selectieve kinase inhibitor [83]. Verder blijken deoxynojirimycine (een iminosuiker) en castanospermine (een natuurlijk alkaloïde) een remmend effect te hebben op de DENV-replicatie. Beiden zijn α-glucosidase inhibitoren van het ER die de vouwing van de prM-, E- en NS1- glycoproteïnen belemmeren door de posttranslationele modificatie met mannose-rijke suikers te remmen. Niet-correcte vouwing werkt de secretie van de proteïnen achteraf tegen en resulteert in een reductie van de virale infectiviteit in vitro voor alle DENVserotypes. Alsook blijken deoxynojirimycine en castanospermine de overleving van DENV-2 geïnfecteerde muizen te verbeteren. Het GKV en het WNV, daarentegen, zijn meer resistent voor de effecten van castanospermine [84, 85].

2.9 Diermodellen Voor het testen van antivirale therapeutica en vaccins is het van belang te beschikken over een adequaat diermodel die relevantie vertoont met het humane ziektebeeld. Het gebruik van niet-humane primaten, die gevoelig zijn voor DENV-infecties, omvat Rhesus makaken (Macaca mulatta) en Cynomolgus apen (Macaca fascicularis). Deze modellen kunnen aangewend worden bij het testen van potentiële vaccins en antivirale middelen omwille van het genereren van een viremie en neutraliserende AL [53, 86]. Gezien de hoge kosten, de geringe beschikbaarheid en de ethische problemen zijn geschikte muismodellen onontbeerlijk [86]. Moeilijkheden omtrent het creëren van zulke modellen vloeien voort uit de moeizame DENV-replicatie in de muis en de vroege letaliteit als gevolg van paralyse (het dominante klinische fenotype na een DENV-infectie) [86]. Bestaande DENV/muismodellen omvatten intracerebrale infectie van muizen, infectie van muizenhersenen aangepaste stammen, chimere muizen met getransplanteerde humane cellen (o.a. NOD/SCID-muizen bezitten geen T- of B-cellen, C5, NK-cellen en APC-functies [87]) en immuun-gecompromitteerde muizen (o.a. A/J muizen bezitten complement C5 deficiëntie) [86]. Inoculatie (i.p.) van AG129-muizen (deficiënte IFN-α/β en IFN-γ receptoren) met D2S10 (een virulentere DENV-stam) resulteert in muizen met verhoogde vasculaire permeabiliteit en TNF-α concentraties. Deze muizen vertonen geen vroege letaliteit als gevolg van paralyse en kunnen gebruikt worden voor meer relevant onderzoek naar DHK/DSS [88]. Literatuurstudie

21

Hoofdstuk 3 Experimenteel werk 3.1 Materiaal en Methoden 3.1.1 Materiaal 3.1.1.1 Cellen en virus De experimenten werden uitgevoerd op continue cellijnen van ‘African Green Monkey’ epitheliale niercellen [Vero-B cellen, ‘American Type Culture Collection’ (ATCC) CCL-81], ‘African Green Monkey’ niercellen [Vero cellen, ‘European Collection of Cell Cultures (ECACC), 84113001], ‘Baby Hamster Kidney’ cellen (BHK-21; ATCC CCL10) en C6/36 cellen (muggencellen afkomstig van Ae. albopictus, ATCC CRL-1660). Virussen gebruikt voor infectie van bovenstaande cellijnen, zijn (i) het dengue virus serotype 2, Nieuw-guinea C stam (DENV-2 NGC, ter beschikking gesteld door Dr. V. Deubel) gekweekt in Vero cellen of C6/36 cellen, (ii) het gele koorts virus 17D vaccin stam [Stamaril, Aventis Pasteur (MSD, Brussel, België)] opgekweekt in Vero cellen, (iii) het Modoc virus (MODV) stam M544 (ATCC VR415) gekweekt in BHK-21 cellen en (iv) het MOD/GK17D chimeer virus gekweekt in Vero cellen (Charlier N et al., 2004).

3.1.1.2 Media en oplossingen


Groeimedium Vero cellen: 10% FCS/MEM

Minimum Essential Medium (MEM)-Rega3 (Invitrogen, Merelbeke, België) werd aangevuld met 10% geïnactiveerd foetaal kalfserum (FCS; Integro, Zaandam, Nederland), 2 mM L-glutamine (Invitrogen) en 0,075% natriumbicarbonaat (Invitrogen).


Assay medium voor Vero cellen: 2% FCS/MEM

MEM-Rega3 werd aangevuld met 2% FCS, 2 mM L-glutamine en 0,075% natriumbicarbonaat.


Groeimedium BHK-21 cellen: 10% FCS/DMEM

Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM; invitrogen) werd aangevuld met 10% FCS, 2 mM Lglutamine en 0,075% ml natriumbicarbonaat.


Assay medium BHK-21 cellen: 2% FCS/DMEM

Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM; invitrogen) werd aangevuld met 2% FCS, 2 mM Lglutamine en 0,075% ml natriumbicarbonaat.


Groeimedium C6/36 cellen: 8% FCS/MEM

MEM-Rega3 werd aangevuld met 8% FCS, 2 mM L-glutamine, 0,01 M HEPES buffer (invitrogen), 1x niet-essentiële aminozuren (Invitrogen) en penicilline (100 U/ml) / streptomycine (100 µg/ml) oplossing (Invitrogen).

Materiaal en Methoden

22




2x MEM

100 ml 10x MEM (Invitrogen) werd gemengd met 400 ml steriel H20, 20 ml FCS, 10 ml l-glutamine en 10 ml natriumbicarbonaat.


1% Avicel-oplossing

Na afwegen van 1 g Avicel RC/CL (FMC BioPolymer, Brussel, België) werd 100 ml steriel dH2O toegevoegd en opgemengd tot een homogene vloeistof voor ongeveer twee uur en vervolgens geautoclaveerd voor 20 minuten op 120°C.

3.1.1.3 Antivirale moleculen Moleculen CHI104 en CHI105 (de structuren kunnen hier omwille van intellectuele eigendomsrechten niet worden getoond), werden ter beschikking gesteld door Prof. Dr. Alba Chimirri (Universiteit van Messina, Italië). RBV werd aangekocht bij ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, Californië) en vormt de positieve controle in de verschillende assays. De antivirale moleculen werden afgewogen en opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) tot stockoplossingen van 20 mg/ml en 10 mg/ml voor RBV en CHI104CHI105, respectievelijk. De moleculen werden bewaard bij 4°C, CHI104 bij kamertemperatuur omwille van relatieve instabiliteit.

3.1.2 Methoden 3.1.2.1 Subcultiveren van cellen 2

Vero cellen werden opgegroeid in 75 cm cultuurflessen met filter (Micron Séparation Europe, Brainel'Alleud) bevattende 20 ml 10% FCS/MEM geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 en 99% relatieve luchtvochtigheid (incubator CB 210, BINDER GmbH, Tuttlingen, Duitsland). Wanneer de cellen als een confluente monolaag liggen, werden ze doorgezet door het groeimedium te verwijderen en de cellen te wassen met 5 ml PBS (BioWhittaker, Verviers, België). Na het afzuigen van de PBS werd 3 ml trypsine-EDTA (0.05%, 1x, GIBCO, Invitrogen, Paisley, Verenigd Koninkrijk) toegevoegd, gevolgd door een aantal minuten incubatie. De losgekomen cellen werden geresuspendeerd in 3 ml 10% FCS/MEM. Vervolgens werd de celsuspensie 6 minuten gecentrifugeerd bij 1.100 rpm en werd het supernatans verwijderd. De pellet werd geresuspendeerd in 1ml 10% FCS/MEM, waarna 200 µl (1:5) 2

werd overgebracht in een nieuwe 75 cm cultuurfles met 20 ml 10% FCS/MEM en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO 2. Dezelfde procedure werd aangewend voor het subcultiveren van BHK-21 cellen, uitgevoerd met 10% FCS/DMEM. Wanneer een celsuspensie noodzakelijk was voor verdere experimenten, werd de pellet geresuspendeerd in 1 ml assay medium. Om het gewenste aantal cellen per well in de microtiterplaten te verkrijgen, werd de celtelling uitgevoerd met behulp van een Z1 Coulter Particle Counter (Beckman Coulter TM, Analis, Gent, België).

3.1.2.2 Virusstock DENV-2 NGC werd gekweekt in muggencellen en Vero cellen. Het DENV repliceert beter in C3/36 cellen, maar is niet in staat om plaques te vormen. Hiervoor zijn enkele passages in Vero cellen vereist. C6/36 cellen werden 1:3 doorgezet in 75 cm cultuurflessen (EasY flask, Nunclon™∆) en de 2

Materiaal en Methoden

23

volgende dag geïnfecteerd met 0,5 – 1 ml virus in 15 ml 8% FCS/MEM. Eén cultuurfles werd niet geïnfecteerd en bewaard als negatieve controle. Na incubatie gedurende 1 à 2 uur bij 28°C in afwezigheid van CO2, werd het medium afgezogen en vervangen door 15 ml MEM 8 % FCS. De cultuurflessen werden uit de incubator gehaald en het virus geoogst wanneer een volledig cytopathogeen effect (CPE) werd waargenomen (meestal rond de 7 dagen p.i.). Met behulp van een schrapertje werden alle cellen in het medium gecollecteerd en gecentrifugeerd gedurende 10 – 15 minuten bij 2.000 rpm. Het supernatans (vrij van celdebris) werd gealiquoteerd, verder verdeeld over cryotubes en bewaard bij -80°C. Op identieke wijze werd de infectie van Vero cellen met het DENV-2 NGC en het GKV 17D uitgevoerd in 2% FCS/MEM in cultuurflessen met filter, geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2. 3.1.2.3 Virustitratie Op basis van het CPE laat een diagonale virustitratie toe de virusverdunning te bepalen die optimaal is voor het gebruik in verdere assays. Hiervoor werd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA voor GKV 17D of tissue culture-treated white view plate, Perkin-Elmer, Boston, Massachusetts, USA voor DENV-2, NGC) 100 µl/well 2% FCS/MEM aangebracht, met uitzondering van de wells op de eerste rij (well B2-B10) waar 125 µl 2% FCS/MEM werd aangebracht. In de allereerste well werd 125 µl virusstock toegevoegd en horizontaal verdund door een 1:2 virusverdunning aan te houden (125 µl werd overgebracht van well B2-B10). Vervolgens werd een verticale 1:5 verdunning bekomen door 25 µl over te brengen van rij tot rij. Eén kolom werd vrijgehouden voor de celcontrole. Na toevoegen van nog 100 µl celsuspensie in elke wells (doorgaans 6.000 cellen/well voor het DENV en 20.000 cellen/well voor het GKV) werden de platen geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2. Het CPE werd microscopisch opgevolgd totdat in elke well (met bepaalde virusverdunning, zie Figuur 11) CPE waarneembaar was en volledig CPE te detecteren was bij een welbepaalde dilutie (meestal na 7 dagen). De platen werden vervolgens afgelezen met ATPlite (ingeval van DENV, zie paragraaf 3.1.2.7) en MTS (ingeval van GKV, zie paragraaf 3.1.2.6). Op basis van het berekende percentage CPE van de virusverdunningen kon de optimale assay virusverdunning bepaald worden. Analyse in Microsoft Excel: %CPE = 100 - (W virusdilutie – W kleinste virusdilutie)/( W gemiddelde CC 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

B

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

CC

C

20

40

80

160

320

640

1280

2560

5120

12

A

D

100

200

400

800

1600

3200

6400

12800

25600

E

500

1000

2000

4000

8000

16000

32000

64000

128000 640000

F

2500

5000

10000

20000

40000

80000

160000

320000

G

12500

25000

50000

100000 200000

400000

800000

1600000 3200000

H

Figuur 11 | Een diagonale virustitratie. Een diagonale virusverdunning over een 96-well plaat werd bekomen door het virus horizontaal (1:2) en verticaal (1:5) te verdunnen. De optimale virusverdunning in verdere assay werd bepaald door het gemiddelde te berekenen van de virusverdunningen in de wells met minstens 75% CPE.

Materiaal en Methoden

24

– W kleinste

virusdilutie)*100,

met W de waarde bekomen na uitlezen van de platen. De optimale

virusverdunning werd berekend door het gemiddelde van de virusverdunningen te nemen waar minstens 75% CPE bereikt werd. Deze waarde is de hoogste virusverdunning waar CPE doorkomt, aanvaardbaar voor verder gebruik in de daarop volgende experimenten.

3.1.2.4 Plaque assay Plaque assays werden uitgevoerd om het virustiter te kunnen determineren. Het bepaalt de mogelijkheid van een virusstock om één cel te infecteren, daarin te repliceren en naburige cellen te infecteren. Dit geeft aanleiding tot het vormen van plaques. De maat voor infectieuze viruspartikels kan uitgedrukt worden in PFU/ml (plaque forming unit/ml). Eén dag voorafgaand aan het experiment werden 6-well microtiterplaten (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) met Vero cellen (ongeveer 500.000 cellen/well) aangelegd. De dag van het experiment werd het groeimedium afgezogen en 2 ml van de virusverdunningen (in 2% FCS/MEM) aan de wells toegevoegd. Na 1 à 2 uur incubatie werd het inoculum verwijderd en het niet-geabsorbeerde virus drie keer weggewassen met 2 ml assay medium. Een homogene oplossing van 1% avicel-oplossing (goed schudden voor gebruik) werd in dezelfde hoeveelheid (1:1) in 2x MEM toegevoegd, waarna 3 ml van deze warme Avicel-MEM oplossing per well werd aangebracht. De 6-well platen werden vervolgens in de incubator geplaatst gedurende 7 dagen. Dan werd de Avicel-MEM oplossing voorzichtig verwijderd en de cellen met 2 ml PBS gewassen. De cellen werden gefixeerd met 1,5 ml 70% ethanol gedurende minstens 10 minuten. Na het drogen van de platen werden de levende cellen gekleurd met 1 ml 1% methyleenblauw. Ongeveer een 10-15 minuten later werd de kleurstof verwijderd door middel van H2O en de platen minstens één uur aan de lucht gedroogd. Na het tellen van het aantal gevormde plaques in de verschillende

virusverdunningen

kan

het

virustiter

berekend

(PFU/ml

=

aantal

plaques*

verdunningsfactor/ aantal ml virusoplossing toegevoegd).

3.1.2.5 Antivirale en cytotoxische assay De antivirale activiteit van moleculen, als percentage inhibitie van het virus-geïnduceerde CPE, kan bepaald worden aan de hand van een antivirale assay en de activiteit verder vergeleken worden op basis van de EC50. Deze waarde stelt de concentratie voor waar 50% activiteit (% inhibitie t.o.v. viruscontrole) bereikt wordt. Uit een cytotoxische assay kan een CC50 waarde (de concentratie waarbij 50% cytotoxiciteit optreedt) berekend worden om de toxiciteit van antivirale moleculen, uitgeoefend op de cellen, te omschrijven. Het protocol van de DENV assays maakte gebruik van één dag vooraf uitgezaaide cellen in een 96well microtiterplaat met meer bepaald 6.000 cellen/well. Alle antivirale assays werden afgelezen m.b.v. de ATPlite-methode (zie paragraaf 3.1.2.7) nadat het CPE visueel werd goedgekeurd. De luminescentie-gebaseerde assays werden telkens uitgevoerd in witte platen met een doorschijnende bodem (tissue culture-treated white view plate). Daarentegen werden de DENV cytotoxische assays geanalyseerd via de MTS-methode (zie paragraaf 3.1.2.6) en hierom uitgevoerd in een doorschijnende plaat (Becton Dickinson).

Materiaal en Methoden

25

GKV assays, zowel antivirale als cytotoxische, maakten gebruik van één dag vooraf uitgezaaide cellen, meer bepaald 20.000 cellen/well in een 96-well plaat (Becton Dickinson). Nadat het CPE microscopisch werd goedgekeurd, werden de platen afgelezen met MTS.

3.1.2.5.1

Manuele assay

In een 96-well plaat met 100 µl virussuspensie in 2% FCS/MEM (optimale virusverdunning uit virustitratie) werden antivirale moleculen 1:2 horizontaal verdund (concentratie van 0,04 - 10µg/ml of µM voor CHI104 - CHI105 respectievelijk), rekening houdend met de finale concentratie die moest bekomen worden. De laatste kolom werd voorbehouden aan celcontroles en viruscontroles (Figuur 12). Vervolgens werd 100 µl assay medium of celsuspensie toegevoegd. De antivirale assay platen werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 en het CPE microscopisch opgevolgd. Wanneer de viruscontroles nagenoeg 100% CPE vertoonde werden de assay platen afgelezen met MTS (zie paragraaf 3.1.2.6) of platen ATPlite (zie paragraaf 3.1.2.7). Vervolgens werden de data verwerkt zodat de antivirale activiteit van de moleculen berekend werden, uitgedrukt als EC50 waarden. Hiervoor werd het bekomen signaal omgerekend tot een percentage CPE: %CPE = 100-((W - W VC)/(W CC – W VC)*100) met W: signaal gemeten van virus geïnfecteerde cellen behandeld met een welbepaalde concentratie van een antivirale molecule, W VC: signaal gemeten van het gemiddelde van de viruscontroles en W CC: signaal van het gemiddelde van de celcontroles. Logaritmische interpolatie laat toe hieruit een EC50 waarde te berekenen (Microsoft Excel). Het percentage cel protectie (inhibitie) kan berekend worden als 100 - %CPE.

1 A

2

µg/ml 10

3 5

4

5

6

7

8

9

10 11 12 Figuur 12 | Manuele antivirale assay. In een 96-

2,5 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04

well

B

Cps1

C

Cps2

D

Cps3

E

Cps4

F

Cps5

G

RBV

CC

plaat,

bevattende

een

welbepaalde

hoeveelheid cellen en virus, werden 9 horizontale verdunning (1:2) van maximaal 6 moleculen (cps1-5 met RBV) verricht. De laatste kolom werd voorbehouden aan de CC (enkel cellen) en de VC

H

VC

(zowel virus als cellen). Een cytotoxiciteit assay werd op dezelfde manier opgesteld, met het verschil dat er geen virus werd toegevoegd, waardoor de laatste kolom volledig aan CC werd voorbehouden.

Naast een antivirale assay werd steeds een cytotoxiciteit assay parallel ingezet, deze assay verloopt identiek, maar de virusoplossing werd vervangen door assaymedium. Daarom wordt de laatste kolom van de plaat voorbehouden aan een reeks celcontroles. Wanneer de overeenkomstige antivirale platen volledige CPE vertoonden (meestal 7 dagen voor GKV of 8 dagen voor DENV), werden de metabool actieve cellen gedetermineerd met MTS (zie paragraaf 3.1.2.6). De bekomen optische densiteit (OD) werd omgerekend tot een percentage CPE (%CPE = OD/ODCC*100, met OD: OD van de cellen behandeld met een welbepaalde concentratie van een antivirale molecule, ODCC: OD van het gemiddelde van de celcontroles). Door middel van een logaritmische interpolatie werd hieruit een CC50 waarde berekend (Microsoft Excel). Materiaal en Methoden

26

3.1.2.5.2

Semi-automatische assay

De evaluatie van een aanzienlijk aantal chemische moleculen, teneinde hun antivirale activiteit en cytotoxiciteit te bepalen, werd geautomatiseerd door antivirale en cytotoxiciteit assays in te zetten met ®

behulp van een geïnformatiseerd platform (Freedom EVO , tecan). Allereerst werd er in elke well van een 96-well plaat 100 µl 2% FCS/MEM gepipetteerd. Van een 4 mg/ml stockoplossing van de chemische moleculen werd een 0,5 mg/ml werkoplossing gemaakt (8,57 µl van de stockoplossing werd in 60 µl 2% FCS/MEM toegevoegd). Hiervan werd 25 µl overgebracht in de eerste well en vervolgens een 1:5 verdunningen bekomen door 25 µl steeds over te zetten. Vervolgens werd 50 µl virusoplossing toegevoegd (4x geconcentreerd om de finale virusverdunning te respecteren), gevolgd door 50 µl celsuspensie of 2% FCS/MEM. Van de maximaal 12 antivirale moleculen op één plaat werden zo de finale concentraties van 50, 10, 2 en 0,4 µg/ml bekomen. Standaard werden CC en VC mee inbegrepen, alsook een positieve controle, nl. RBV (Figuur 13). Na een week incubatie bij 37°, 5% CO2 en het bereiken van nagenoeg volledig CPE in de VC, werden de antivirale assays afgelezen met behulp van MTS of ATPlite (zie paragraaf 3.1.2.6 en 3.1.2.7). De data werden geanalyseerd gebruik makende van een software programma (Query Editor) tot het bekomen van een EC50 waarde. Parallel werd op identieke wijze ook cytotoxiciteit assays voor dezelfde moleculen ingezet, enkel werd de virusoplossing vervangen door 50 µl 2% FCS/MEM. De cytoxiciteit assay werd afgelezen met behulp van MTS en de resultaten verwerkt tot het bekomen van een CC50 waarde (Query Editor). De data van beide experimenten werden finaal samen in grafiek gebracht.

1 A

2

3

µg/ml 50

10

4

5

2

0,4

6

7

8

9

10 11 12 Figuur 13 | Semi-automatische antivirale assay. In een 96-well plaat, bevattende een

B

Cps1

VC Cps7

C

Cps2

Cps8

D

Cps3

Cps9

E

Cps4

Cps10

F

Cps5

Cps11

G

Cps6

RBV

CC

welbepaalde hoeveelheid cellen en virus, werden 4 horizontale verdunning (1:5) van maximaal 12 moleculen (cps1-11 met RBV) verricht. De zesde kolom werd voorbehouden aan de VC (zowel virus als cellen) en de laatste kolom bevat de CC (enkel cellen). Parallel werd op identieke wijze cytotoxiciteit assays opgesteld, waar geen virus werd toegevoegd.

H

3.1.2.6 MTS assay Het

colorimetrisch

uitlezen

van

assay

platen

met

MTS

(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-

carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) geeft de cellulaire reductie capaciteit van het NADH en NADPH weer, geproduceerd door dehydrogenases in de mitochondria. Metabool actieve cellen zijn in staan om de oplossing van het gele MTS met PMS (phenazine methosulfate) te reduceren tot het bruine formazan product. Bij verminderde leefbaarheid van de cellen, nl. door cellulaire toxiciteit/cytostatische activiteit uitgeoefend, daalt de productie van NADH en NADPH en dit resulteert bijgevolg in een verminderde performantie van de assay. De hoeveelheid bruinkleuring, aldus de omzetting van MTS, is recht evenredig met het aantal levende cellen in cultuur (Figuur 14). Materiaal en Methoden

27

Na de platen uit de incubator gehaald te hebben, werd het medium afgezogen en 100 µl 10% MTS (MTS/PMS; Promega, Leiden, Nederland) stockoplossing in kleurloos medium (1x MEM, Invitrogen) toegevoegd. Na maximaal 2 uur incubatie bij 37°C, 5 % CO2 werd de absorbantie, uitgedrukt als OD, spectrofotometrisch bepaald (Safire, Tecan, Mechelen, België) bij een golflengte van 498 nm. Levende cel Mitochondriale reductie

MTS

Formazan product

Figuur 14 | Colorimetrie met MTS/PMS. De reductie van MTS tot zijn formazan product vindt plaats in de mitochondrion van levende cellen en neemt af in minder metabool actieve cellen. Visueel uit dit zich in de omzetting van een gele kleur, afkomstig van MTS, naar een bruine kleur, afkomstig van het formazan product (Promega).

3.1.2.7 ATP detectie assay ATP is aanwezig in alle metabool actieve cellen, echter de hoeveelheid ATP vermindert sterk als gevolg van necrose of apoptose. Vandaar dat intracellulair ATP een goede marker blijkt te zijn voor de leefbaarheid van de cellen. De reactie van ATP in aanwezigheid van een substraatoplossing (luciferine/luciferase) resulteert in de emissie van licht, waarvan bewezen proportioneel te zijn aan de aanwezige ATP concentratie.

Reactieschema: ATP + D-luciferine + O2

Luciferase

oxyluciferine + AMP + PPi + CO2 + licht

2+

Mg TM

ATPlite

luminescentie ATP detectie assay systeem (ATPlite, PerkinElmer, Massachusetts, USA),

gebaseerd op het vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase, werd aangewend voor het uitlezen van DENV assays volgens de instructies van de fabrikant. Vermits deze techniek duurder uitkomt in vergelijking met MTS, reduceerden we de hoeveelheid substraatoplossing tot het toevoegen van 30 µl, zonder de geloofwaardigheid van de resultaten aan te tasten. Kort samengevat, werd 30 µl (i.p.v. 50 µl) cellysis oplossing toegevoegd in 60 µl (i.p.v. 100 µl) suspensie en 5 minuten op de schudder (700 rpm) geplaatst. Hierdoor werden de cellen gelyseerd en het vrijgekomen ATP gestabiliseerd door inactivatie van endogene ATPases. Vervolgens werd 30 µl substraatoplossing toegevoegd. Na nogmaals 5 minuten schudden (700 rmp) werden de platen voor 10 minuten in het donker geplaatst en de luminescentie vervolgens gekwantificeerd (Safire, Tecan, Mechelen, België). Materiaal en Methoden

28

3.1.2.8 Dengue reporter antivirale assay Een andere benadering voor het bestuderen van de virale replicatie van het DENV in aanwezigheid van een molecule, omvat het gebruik van een reporter virus. Het gebruikte dengue reporter virus is een infectieus ‘full-length’ DENV construct, zoals eerder vermeld in Mondotte et al., 2007 [89]. Hierbij werd een Renilla luciferase expressie cassette, waarvan de translatie onder controle staat van een EMCV ‘Internal ribosomal entry site’ (IRES), upstream van het 3’ UTR geïntegreerd (Figuur 15).

5’UTR

3’UTR C

prM

E

NS1

NS2A

NS2B

NS3

NS4A

NS4B

NS5

Ren

Figuur 15 | Dengue reporter virus. Het DENV construct bevat een Renilla luciferase coderende sequentie dat het 3’ UTR voorafgaat en waarvan de translatie gecontroleerd wordt door het encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site (EMCV IRES). Opname van het dengue reporter virus in BHK-21 cellen resulteert in een productieve virale replicatie (bewerkte Figuur uit [89]).

Na toevoegen van coelenterazine (het substraat) geeft het gegenereerde bioluminescentie signaal de Renilla luciferase activiteit weer en reflecteert het dusdanig de hoeveelheid reporter virus aanwezig in de cellen (Figuur 16). Het Renilla Luciferase assay systeem is een geschikte alternatief aan het vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase systeem (ATPlite).

Figuur 16 | Renilla Luciferase Assay Systeem. De bioluminescentie reactie gekatalyseerd door het Renilla luciferase (Promega).

Eén dag voorafgaand aan het experiment werden BHK-21 cellen (10.000 cellen/well) uitgezaaid in een tissue culture-treated white view 96-well plaat. De volgende dag werden de cellen geïnfecteerd 5

met 2 x 10 PFU/well van het dengue reporter virus in afwezigheid en aanwezigheid van 0,1 – 1 – 10 µg/ml CHI104. Het virusinoculum werd na één uur verwijderd en drie keer gewassen met PBS. Na 8, 24, 48 en 72 uur p.i. werd de luciferase activiteit gemeten (Safire) gebruik makende van het Renilla Luciferase Assay Systeem (Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Het cytotoxisch effect van deze moleculen werd parallel geëvalueerd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson) door middel van celtelling.

Materiaal en Methoden

29

3.1.2.9 Virus yield assay Een virus yield assay meet het effect van een antiviraal molecule op de productie van infectieus virus. De 50.000 cellen/well werden één dag vooraf uitgezaaid in 96-well microtiterplaten (Becton Dickinson). De monolaag cellen werd vervolgens geïnfecteerd met 100 µl virusoplossing. Na ongeveer 2 uur incubatie bij 37°C, 5% CO 2 werden de cellen drie keer gewassen met 100 µl 2% FCS/MEM om

het niet-geadsorbeerde virus te verwijderen. Vervolgens werd 100 µl 2% FCS/MEM aangebracht en

een verdunningsreeks (1:2) van de geteste antivirale moleculen (CHI104, CHI105) uitgevoerd door steeds 100 µl over te zetten en een finale concentratiereeks te bereiken van 10 µg/ml tot 0,4 µg/ml. Uiteindelijk werd een volume van 200 µl te bekomen door 100 µl 2% FCS/MEM aan elke well toe te voegen. De microtiterplaten werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO 2 voor 4 dagen. De assay werd in drievoud ingezet zodat uit elke well met een bepaalde molecule concentratie 50 µl supernatans werd

gecollecteerd en vervolgens gepoold. Het celdebris werd verwijderd door gedurende één minuut te centrifugeren bij 2.400 rpm en het 150 µl supernatans (bevattende de infectieuze viruspartikels) te bewaren voor RNA extractie (-80°C). Het geïsoleerde RNA werd bekomen met behulp van de ‘NucleoSpin® RNA Virus kit’ (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Na 7 dagen p.i. werd nogmaals 300 µl supernatans bewaard bij –80°C, om vervolgens een plaque assay mee uit te voeren (zie paragraaf 3.1.2.4).

3.1.2.10 ‘Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction’ (RT-qPCR) Real-time PCR (polymerase-kettingreactie) is een techniek die toelaat het RNA te kwantificeren in een staal. De methode maakt gebruik van een Taq polymerase (bevat naast een polymerase activiteit ook een 5’-3’ exonuclease activiteit) en een TaqMan probe (fluorofoor gelabelde oligonucleotide probe welke een fluorescent signaal uitzendt na klieving). De TaqMan probe bindt een specifieke doelwitsequentie in het DENV genoom tussen de twee gekozen primers (Tabel 1) en wordt gekliefd tijdens de elongatiefase door het Taq polymerase. De gekliefde TaqMan probe (quencher wordt ontkoppeld van het reporter molecule) resulteert in de emissie van fluorescent signaal dat direct gerelateerd kan worden met een verhoogde amplificatie van de specifieke doelwitsequentie. De kwantificatie is mogelijk doordat de Ct-waarden (het aantal cycli nodig waar het fluorescent signaal een gekozen drempelwaarde overschrijdt) bepaald worden tijdens de exponentiële fase van de PCR. Eén-staps RT-qPCR werd uitgevoerd in een totaalvolume van 25 µl bevattende 6,25 µl One-step Reverse Transcriptase qPCR MasterMix (Eurogentec, Seraing, België), 13,94 DNase/RNase-vrij water (ACROS Organics, Geel, België), 0,375 µl ‘forward’ primer (900 nM finale concentratie), 0,375 µl ‘reverse’ primer (900 nM finale concentratie), 1 µl TaqMan probe (200 nM finale concentratie), 0,0625 µl ‘Reverse’ Transriptase en 3 µl RNA staal (staal met ongekende hoeveelheid RNA, standaard of negatieve test controle). De reactie werd verricht door ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Branchburg, New Jersey, USA) met volgend “thermocycling” profiel: 30 min bij 48°C, 10 min bij 95°C, 45 cycli van 15 sec bij 95°C en 1 min bij 60°C.

Materiaal en Methoden

30

Tabel 1| Primers en probes gebruikt voor RT-qPCR. Positie t.h.v.

Primer/Probe

Sequentie (5' → 3')

Forward

TCGGAGCCGGAGTTTACAAA

4628 – 4647

Reverse

TCTTAACGTCCGCCCATGAT

4722 – 4741

Probe

FAM-ATTCCACACAATGTGGCAT-MGB

4656 – 4674

GKV 17D en

Forward

TGGCATATTCCAGTCAACCTTCT

4645 – 4667

MOD/GK17D

Reverse

GAAGCCCAAGATGGAATCAACT

4767 – 4788

Probe

FAM-TTCCACAATGTGGCATG-MGB

4712 – 4739

Forward

TTGGAGAAAGCAAGTTGGAATA

4587 – 4607

Reverse

CTCACTCGCAGAGCACTTCCT

4657 – 4677

Probe

FAM-CCTCAAGGAAGGAGTGTT-MGB

4615 – 4632

Virus

NS3

DENV-2 NGC

Chimeer virus

MODV M544

De nucleotide sequentie en de positie van de primers en probes in het genoom werden afgeleid van de nucleotide sequentie van het NS3 proteïne in het DENV-2 Nieuw-guinea C stam (GenBank accession: M29095), GKV 17D (GenBank accession no. X03700), MODV M544 (GenBank accession no. NC003635) en MOD/GK17D chimeer virus (Charlier et al., 2007). Aan het 5’ uiteinde van de probe is 6-carboxyfluorescein (FAM) de reporter molecule, aan het 3’ uiteinde is ‘minor groove binder’ (MGB) de quencher.

3.1.2.11 DENV replicon assay Het DENV replicon systeem bestaat uit een artificieel geconstrueerde celcultuur, waarbij een subgenomisch replicon (een autonoom replicerend vRNA) stabiel getransfecteerd werd in BHK-21 cellen. In het replicon werden de structurele genen van het DENV verwijderd, zodat het vormen van infectieuze viruspartikels uitgesloten is. BHK-21 cellen werden getransfecteerd met een subgenomisch dengue replicon [afgeleid van dengue replicon construct (Jones et al., 2005)], waarin een antibiotica selectie cassette (coderend voor een antibiotica resistentie gen: puromycine N-acetyltransferase, PAC) samen met een vuurvlieg (Photinus pyralis) luciferase expressie cassette. De positie van het LUC-gen wordt niet vrijgegeven vanwege

intellectuele

eigendomsrechten.

Deze

cellen,

BHK-Rep-Pac-LUC

cellen,

werden

gecultiveerd in 10% FCS/DMEM in aanwezigheid van 3,3 µg/ml puromycine (Sigma-Aldrich, Bornem, België). Het antibiotica puromycine is een positieve selectie merker, vermits enkel cellen die het PAC bevatten, bijgevolg het replicon, overleven. De BHK-Rep-Pac-LUC cellen werden één dag voorafgaand aan het experiment uitgezaaid (10.000 cellen/well) in een tissue culture-treated white view 96-well plaat. De volgende dag werd het medium vervangen door 100 µl 10% FCS/DMEM met 0.1, 0.5, 1, 5, 10 en 20 µg/ml CHI104. Na 72 uur p.i. werd de luciferase activiteit gemeten (Safire) gebruik makende van Luciferase Assay Systeem volgens de instructies van de fabrikant (Promega). De hieruit bekomen resultaten werden vergeleken met de onbehandelde replicon cellen (RC). Het cytotoxisch effect van deze moleculen werd parallel geëvalueerd in een 96-well microtiterplaat (Becton Dickinson) door middel van celtelling.

Materiaal en Methoden

31

3.1.2.12 ‘Time-of-addition’ assay 3.1.2.12.1

GKV

Een antiviraal molecule kan inwerken op iedere fase van de virale replicatiecyclus. Om te achterhalen op welk ogenblik het antiviraal molecule de replicatiecyclus van het virus verstoort, kan een ‘time-ofaddition’ (TOA) assay uitgevoerd worden. De TOA omvat het toevoegen van het antiviraal molecule op verschillende tijdstippen, waarna (24 hr p.i.) het vRNA gekwantificeerd werd, zowel intracellulair als extracellulair door middel van RNA isolatie gevolgd door een RT-qPCR (Figuur 17). Het percentage inhibitie werd berekend t.o.v. de VC. Eén dag voor infectie werden 5 x 105 Vero-B cellen uitgezaaid in een 12-well plaat (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA). De cellen werden één uur geïnfecteerd met het GKV aan een MOI = 5. Vervolgens werd het virus 3 à 4 keer weggewassen met 2% FCS/MEM, waarna voor zeer korte tijd (< 2 min) citraat buffer [20 mM citraatzuur, 10mM KCl en 135 mM NaCl, (pH = 3)] werd toegevoegd zodat al het niet opgenomen virus gedissocieerd werd. Na nogmaals 3 à 4 keer wassen met 2% FCS/MEM werd 1ml assay medium toegevoegd. Op tijdstip 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 hr p.i. werd het antiviraal molecule CHI104 toegevoegd aan het medium aan een concentratie van 10 mg/ml (zeker actief aan die concentratie en niet toxisch). Na 24 hr p.i. werd 150 µl virusinoculum en 1,5 x 105 gecollecteerd. Uit elk virusinoculum werd het viraal RNA geïsoleerd met ‘NucleoSpin® RNA Virus kit’ (Macherey-Nagel, Düren, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant en het vRNA gekwantificeerd door RT-qPCR (zie paragraaf 3.1.2.10). Daarnaast werden de gecollecteerde cellen kort afgedraaid bij 13000 rpm (centrifuge Thermo Electron Corporation), waarna 350 µl RTL lysis buffer werd toegevoegd om het vRNA te isoleren met ‘RNeasy Mini Kit’ (Qiagen) en te kwantificeren met RT-qPCR (zie paragraaf 3.1.2.12).

CHI104 T=0

CHI104 T=2

CHI104 T=4

CHI104 T=6

CHI104 T=8

CHI104 T=10

CHI104 T=12

CHI104 T=14

CHI104 T=16

CHI104 T=18

VC

150 µl virusinoculum (voor extracellulaire vRNA meting)

1,5 x 105 cellen (voor intracellulaire vRNA meting)

Figuur 17 | GKV time-of-addition assay. De cellen werden één uur onderheven aan het GKV 17D en op verschillende tijdstippen (T) werd 10 mg/ml van CHI104 toegevoegd aan het medium. Na 24u p.i. werden het supernatans en de cellen gecollecteerd. Uit alle stalen werd vRNA geïsoleerd en gekwantificeerd.

Materiaal en Methoden

32

3.1.2.12.2 DENV

Om te achterhalen of de anti-DENV activiteit van een molecule eerder vroeg of laat tijdens de replicatiecyclus optreedt, werd een TOA assay uitgevoerd met het dengue reporter virus. De 5

procedure verloopt eenvoudiger dan de TOA assay van GKV. Eén dag voor de infectie werden 2 x 10

BHK-21 cellen uitgezaaid in een 96-well plaat (white view plate). De cellen werden één uur 5

geïnfecteerd met het dengue reporter virus aan een MOI = 1 (overeenkomstig met 2 x 10 PFU/well). Vervolgens werd het virus 4 keer weggewassen en 100 µl 2% FCS/DMEM toegevoegd. Op tijdstippen 0, 2, 4, 6, 8, 10 en 12 werd 5 µg/ml of 10 µg/ml CHI104 toegevoegd, uitgezonderd in de VC (zie Figuur 18). Na 24 hr p.i. werd de luminescentie over heel de plaat bepaald (Safire).

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12

A

Figuur 18 | ‘Time-of-addition’ met dengue reporter virus. Na één uur infectie met het

B C

VC T=

0

CHI 104 2

4

6

8

10

12

D E F

10 µg/ml CHI104 op verschillende tijdstippen (T)

10 µg/ml

toegevoegd, waarna de luminescentie op 24 hr p.i. bepaald werd.

VC T=

0

reporter virus op BHK-21 cellen, werd 5 µg/ml of

5 µg/ml

2

4

G

6

8

10

12

5 µg/ml 10 µg/ml

H

Materiaal en Methoden

33

3.2 Resultaten Een belangrijke initiële stap voor de ontwikkeling van een antiviraal middel tegen het DENV was het tot stand brengen van een geoptimaliseerde cel-gebaseerde ‘medium-to-high-throughput screening’ assay. Met een dergelijke assay kunnen een aanzienlijk aantal chemische moleculen geëvalueerd worden op hun antivirale activiteit, waarbij reproduceerbare kwalitatieve gegevens verkregen worden. Om die reden zijn we gestart in dit onderzoek met het ontwikkelen en verder optimaliseren van een adequate DENV assay, zodat in een tweede fase, de antivirale activiteit van chemische moleculen werd geëvalueerd. Na identificatie van inhibitoren volgt een reeks hertesten/validaties, waarna de interessantste moleculen vervolgens hertest werden. In een derde fase handelt dit onderzoek over de bevestiging en het verder analyseren van de antivirale activiteit van twee geselecteerde moleculen die potentiële activiteit vertoonden tegen het DENV en het GKV uit de screening assay.

3.2.1 Optimalisatie van een DENV assay Aanvankelijk werd beoogd een geoptimaliseerde DENV screening assay uit te werken en te valideren teneinde

betrouwbare,

reproduceerbare

en

kwalitatieve

data

te

bekomen.

Belangrijke

aandachtspunten hierbij zijn het selecteren van een geschikte (i) cellijn, (ii) virus, (iii) het aantal cellen/well en (iv) de afleesmethode. De betrouwbaarheid van de bekomen resultaten uit een antivirale assay is mede afhankelijk van de kwaliteit van de uitgevoerde assays. Deze onmisbare parameter werd uitgedrukt als een score: 100-[(CC/VC)*100] met VC de gemiddelde waarde van de viruscontole, CC de gemiddelde waarde van de celcontrole. Om uit de antivirale testen representatieve data te bekomen, zou men een score hoger dan 65 moeten bereiken.

3.2.1.1 Optimale testcondities Al bij al repliceert het DENV relatief inefficiënt in vitro en genereert het virus ondermaats CPE in de meeste celculturen. Om die reden is het essentieel een cellijn na te streven waarin het opgekweekte DENV doeltreffend repliceert. Continue muggencellijnen (o.a. C6/36) zijn zeer ontvankelijk voor DENV infecties, waardoor ze werden gebruikt om het virus tot een hoge titer op te groeien. Echter, deze cellen zijn niet bruikbaar voor de cel-gebaseerde antivirale assays om de reden dat ze weinig tot geen CPE vertonen. Het DENV werd voor drie passages opgekweekt hebben in muggencellen (DENV C6/36 P3), waarna we andere cellijnen infecteerden met dit virus in de hoop voldoende replicatie en CPE waar te nemen. De cellijnen waarin de replicatie werd onderzocht omvatten de Vero, Vero-B, Vero E6, Raji DC-SIGN, Huh, Lunet, HepG2, Hek293, BHK-21, cos-7 en werden elk in een 6-well plaat uitgezaaid aan 500.000 cellen/well, vervolgens geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3 aan een 4

MOI = 0,1 (overeenkomstig met 5 x 10 PFU/ml). Na 4 dagen p.i. werd het vRNA uit het supernatans gekwantificeerd d.m.v. RNA isolatie gevolgd door een RT-qPCR (Tabel 2). Uit deze Real-time PCR bleek dat de virale replicatie van het DENV het efficiëntste plaats vond in de Vero cellen, gevolgd door de Vero-B cellen. Hun lage Ct-waarde wijst op een minder aantal cycli nodig zodat het fluorescent signaal een gekozen drempelwaarde bereikt, beduidend op een hogere virustiter in het staal.

Resultaten

34

Afgezien van de replicatie is tevens het induceren van het

Tabel 2 | RT-qPCR van het DENV C6/36 P3

CPE in de cellijnen van belang. Het verschil in CPE vorming

in verscheidene cellijnen.

tussen Vero en Vero-B cellen werd duidelijk na een diagonale virustitratie van het DENV C6/36 P3 virus op

Cellijnen

Ct-waarde

Vero

27,74

Vero-B

29,53

dagen p.i. een voortreffelijke CPE vorming over de volledige

Vero E6

30,28

96-well plaat. Parallel werd het experiment op Vero-B cellen

Raji DCS

30,3

beide cellijnen (Bijlage I). De Vero cellen vertoonden na 8

Huh

32,21

Lunet

34,27

termen van CPE vorming. We konden op dit ogenblik

HepG2

38,32

concluderen dat het gebruik van Vero cellen ons de

Hek293

38,58

efficiëntste replicatie én CPE vorming verschaft, wanneer ze

BHK-21

38,83

Cos-7

38,86

ingezet, welke teleurstellende resultaten opleverde in

geïnfecteerd werden met een virus dat voor een laag aantal passages in muggencellen werd opgekweekt (DENV C6/36 P3).

De bepaling van het optimaal aantal cellen voor de DENV assays kwam voort uit eerder bekomen informatie. Hieruit werd besloten 6.000 cellen/well te gebruiken omwille van het analyseren van de platen m.b.v. de ATPlite-methode (paragraaf 3.1.2.7). De lineariteit tussen de ATP concentratie en het luminescentie signaal wordt enkel behouden binnen bepaalde limieten. Bijgevolg vereist het protocol van de assay een weinig aantal cellen, zodat de lineariteit behouden blijft. Nochtans stelt 6.000 cellen/well een relatief weinig aantal cellen voor, waardoor de assay vrij streng wordt. Dit impliceert dat het cytostatisch effect van een antiviraal middel meer zal doorwegen en kan ook de potentiële antivirale activiteit lichtjes onderschat worden. Om de geoptimaliseerde DENV assay (DENV C6/36 P3, 6.000 Vero cellen/well, afgelezen met de ATPlite-methode) te valideren, werd een antivirale assay met RBV getest (Figuur 19A). Finaal werd tevens de plaque vorming van het DENV op Vero cellen adequaat bevonden na het uitvoeren van een plaque assay (Figuur 19B) zoals beschreven in paragraaf 3.1.2.4.

A

B

10x

50x

250x

1250x

6250x

31250x

Figuur 19 | Optimalisatie van DENV assays. (A) Validatie van de optimale condities voor een DENV screening assay blijkt uit de antivirale assay met RBV als positieve controle (CC50 > 50, EC50 =24,6 ± 3,8). (B) Voortreffelijke plaques worden gevormd met het DENV (virusverdunning 10, 50, 250, 1250, 6250 en 31250 voudig).

Resultaten

35

3.2.1.2 MTS- versus ATPlite-methode De kwaliteit van de bekomen resultaten hangt eveneens af van de afleesmethode die gehanteerd wordt, welke snel, efficiënt en betrouwbaar zou moeten zijn. Om het percentage CPE, bijgevolg de leefbaarheid van de cellen in aanwezigheid van virus, correct te kunnen scoren is een adequate techniek vereist. De MTS-methode, afhankelijk van de metabole activiteit van cellen, wordt hiervoor regelmatig gebruikt. Visueel wordt waargenomen dat het MTS (geel gekleurd) minder gereduceerd wordt tot het formazan product (bruin gekleurd) naarmate de cellen meer zijn aangetast door het virus (hoger % CPE aanwezig). Indien we deze colorimetrische methode hanteerden voor de bepaling van het % CPE in de DENV antivirale assays, bleek de MTS-analyse meermaals twijfelachtige data te verstrekken in vergelijking met het visueel gescoorde DENV-geïnduceerde CPE. De onderliggende reden voor deze onenigheid ontleent zich aan de aanwezigheid van celdebris (als gevolg van CPE) en door een resterend aantal levende cellen vanwege onvolledige CPE vorming. Dit produceert een hoog achtergrond signaal (ruis). Omwille van de ruis zal bij een MTS geanalyseerde DENV assays de OD waarde in de VC wells relatief hoog liggen. Deze zal nu dichter aanleunen bij de waarde van de CC, bijgevolg daalt de kwaliteit van de assay en worden de data onzekerder. Met andere woorden is de verhouding tussen het signaal en de ruis (S/R ratio) sterk verlaagd, waardoor het venster waarin men het antiviraal effect wil meten desgelijks wordt verkleind (Figuur 20A). De accuraatheid van de berekende EC50 en CC50 waarde zal op een systeem dat veel ruis meet, ondermaats zijn.

A

1

B

Kleine signaal/ruis verhouding

108

Grote signaal/ruis verhouding

Signaal

Signaal

Ruis Ruis 0 []

10 []

Figuur 20 | MTS- versus ATPlite-methode. (A) De MTS-methode genereert een kleine signaal/ruis verhouding (grote ruis), waardoor het antivirale effect van een molecule moet gescoord worden in een klein venster. (B) De ATPlite-methode geeft na analyse van het luminescentie signaal een grote signaal/ruis verhouding, bijgevolg kan het antiviraal effect gemeten worden in een groot venster, waardoor meer kwalitatieve en betrouwbare resultaten gegenereerd kunnen worden.

Deze complicatie (lage S/R verhouding) voor het DENV kan doorslaggevend zijn op de betrouwbaarheid van onze data en spoorde ons daarom aan te zoeken naar een alternatieve afleesmethode, nl. het luminescentie ATP detectie assay systeem (ATPlite-methode). Om na te gaan of deze tweede methode kwalitatief de MTS-methode overtreft, werden twee diagonaal titraties in dezelfde condities ingezet (6.000 Vero cellen/well geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3) en het CPE geanalyseerd met zowel de MTS als het ATP-gebaseerde systeem. De berekende kwaliteit van beide titraties leverde een score op van 43 na MTS-analyse, in tegenstelling tot een score van 93, gegenereerd met de ATP-analyse. Bij de laatst genoemde methode is de gemeten storende ruis Resultaten

36

kleiner, waardoor de S/R verhouding groter is [89]. Bijgevolg zal een merkwaardige verbetering van kwaliteit onze data minder betwistbaar en meer betrouwbaar maken (Figuur 20B). Daarbij biedt de ATPlite-methode nog bijkomende voordelen. Deze omvatten (i) het eenvoudig gebruik, (ii) 10 minuten na het toevoegen van de substraatoplossing kan de luminescentie gemeten worden, in tegenstelling tot de MTS-methode met een relatief lange incubatie tijd van 1,5 à 2 uur, (iii) het geproduceerde signaal bevat een halfwaardetijd groter dan 5 uur (dit laat de ononderbroken verwerking van veelvuldige platen toe), en (iv) de hoge sensitiviteit van het systeem. Door afwezigheid van de CPE gegenereerde ruis in DENV cytotoxiciteit assays blijven we deze assays aflezen met MTS. Dit is nog steeds een goedkopere methode en zolang betrouwbare data bekomen worden blijft dit de primaire optie.

3.2.2 Hit identificatie Eens de optimale condities vastgelegd en gevalideerd waren, kon een aanzienlijk aantal moleculen geëvalueerd worden op een snelle en efficiënte manier dankzij de aanwezigheid van een geautomatiseerd en geïnformatiseerd platform in het laboratorium. Gepreselecteerde moleculen werden geleverd door het “Center for Drug Design & Discovery” (CD3, KULeuven) en collaborerende medicinale scheikundigen. Zowel de DENV als de GKV semi-automatische antivirale assays verliepen zoals beschreven in paragraaf 3.2.1.7. Daarnaast werden eveneens moleculen handmatig gescreend volgens het protocol van paragraaf 3.2.1.5 en 3.2.1.6. De resulterende EC50 en CC50 waarde, alsook hun selectiviteitindex (SI50=CC50/EC50) werden samen in tabel gebracht. Daarnaast werden het antiviraal en cytotoxisch verloop van de moleculen in grafiek gebracht onder de vorm van een dosisrespons formaat. Moleculen werden vervolgens als hit geïdentificeerd (‘hit’ identificatie) wanneer het CPE geïnhibeerd werd boven een vooraf bepaalde drempelwaarde. De identificatie berust op het volgende criterium: moleculen die het virus geïnduceerde CPE in celcultuur nagenoeg volledig inhiberen, meerbepaald > 70 % CPE inhibitie en waarvan de leefbaarheid van de cellen niet is aangetast (minimale toxiciteit). De activiteit van de meest interessante hits werden voorts hertest in de hoop hun potentiële antivirale activiteit te reproduceren ofwel de hits met vals-positieve activiteit uit de primaire screen te elimineren (‘hit’ verificatie).

3.2.2.1 Evaluatie DENV antivirale activiteit In een poging om een reeks moleculen te identificeren die actief zijn tegen het DENV, bereikten we de evaluatie van de antivirale activiteit van circa 1.400 moleculen, aan de hand van zowel semiautomatische als handmatige antivirale assay. Visueel toont Figuur 13 aan hoe de indeling op de semi-automatische assay platen plaats vond en Figuur 12 deze van de handmatige antivirale platen. Na verwerking van de resultaten bleken een 58-tal moleculen interessant op basis van het reeds vermelde criterium (> 70% DENV activiteit, zonder toxiciteit). We kozen hiervan de 34 meest interessante moleculen om hun potentiële DENV activiteit te hertesten. Dit onderzoek handelt verder over twee aantrekkelijke moleculen, nl. CHI104 en CHI105 [ter beschikking gesteld door Prof. Dr. Alba Chimirri (Universiteit van Mesa, Italië)] uit deze groep van moleculen en werden evenzeer hertest. De

Resultaten

37

inhibitorische activiteit van CHI104 en CHI105 (analogen) uit drie onafhankelijke antivirale assays zijn weergegeven in Figuur 21 en Tabel 3. Op Vero cellen vertoont CHI104 en CHI105 significante activiteit tegen het DENV-2 NGC. Voor deze analogen berekenden we een gelijkaardige EC50 waarde onder de 1 µg/ml of µM en lijken ze ietwat meer toxisch te worden naarmate de concentratie stijgt. De berekende selectiviteitindex weerspiegelt de verhouding tussen de CC50 en de EC50. Een grote SI waarde betekent een groot therapeutisch venster waarbij de EC50 en de CC50 liefst zo ver mogelijk uit elkaar liggen. Hoe groter de

Figuur 21 | Dosis respons curve van CHI104 en CHI105 tegen het DENV-2 NGC. Vero cellen werden geïnfecteerd met het DENV en behandelt met CHI104 of CHI105 in drie onafhankelijke assays. Na 8 dagen p.i. werd het % cel bescherming (rood) en het % cel metabolisme (groen) gemeten, welke voor beide moleculen een gelijkaardig profiel oplevert. De drempel van 50% activiteit of cytotoxiciteit t.o.v. de controle is afgebeeld in geel.

SI waarde, hoe selectiever het molecule werkt en wordt daarmee ook therapeutisch interessanter. CHI104 en CHI105 kunnen respectievelijk het CPE tot 62% en 60% inhiberen bij een concentratie van 1,3 mg/ml of µM (maximale % aan celbescherming). De percentages liggen enigszins lager dan ons vooropgesteld selectiecriterium. Echter, we moeten voor ogen houden dat de antivirale activiteit met een zeer strikte assay (6.000 cellen/well) bepaald werd. Bij andere experimenten voor het valideren van de activiteit zal het % inhibitie alleszins hoger liggen, alsook de toxiciteit bij de hogere concentraties minder sterk doorkomen. Tabel 3 | Inhibitorische activiteit van geselecteerde moleculen.

Virus

Molecule

EC50

CC50

SI50

Conc. eenheid

CHI104

0,94 ± 0,34

> 10

> 11

µg/ml

CHI105

0,78 ± 0,47

> 10

> 13

µM

RBV

14,8

> 100

>7

µg/ml

CHI104

3,45 ± 1,91

> 10

>3

µg/ml

CHI105

0,47 ± 0,21

> 10

> 21

µM

RBV

12,28 ± 3,74

> 100

>8

µg/ml

DENV-2 NGC

GKV 17D

Resultaten

38

3.2.2.2 Evaluatie GKV antivirale activiteit Vanwege de potentiële antivirale activiteit van CHI104 en CHI105 tegen het DENV, werd eveneens de activiteit onderzocht tegen het verwante gele koorts virus. Niet enkel CHI104 en CHI105, maar ook de andere geïdentificeerde hits uit de primaire DENV screening werden geëvalueerd op hun activiteit tegen het GKV. De antivirale assays verliepen op eenzelfde wijze als de DENV antivirale assays, enkel werden deze op 20.000 cellen/well uitgevoerd en geanalyseerd met MTS, nadat het CPE visueel werd goedgekeurd (normaliter na 7 dagen p.i.). Hier rapporteren we de inhibitorische activiteit van CHI104 en CHI105 (Figuur 22 en Tabel 3). CHI104 (in een concentratiereeks van 10 µg/ml – 0,04 µg/ml op Vero-B cellen) vertoont enige activiteit tegen het GKV 17D; CHI105 bezit een krachtigere anti-GKV activiteit en kan nagenoeg het CPE volledig inhiberen (97% bij 2,5 µM). CHI104 inhibeert het CPE met slechts 65% bij 5 µg/ml. De moleculen vertonen een sterkere inhibitie t.o.v. het DENV en mindere toxiciteit aan hogere concentratie, dit zou deels verklaard kunnen worden door het hoger aantal cellen dat in deze antivirale assay werd toegepast.

Figuur 22 | Dosis respons curve van CHI104 en CHI105 tegen het GKV/17D. De antivirale en cytotoxische activiteit van CHI104 en CHI105 op Vero-B cellen uit twee onafhankelijke assays (in een concentratiereeks van 10 – 0,04 µg/ml of µM). Antivirale activiteit: % cel bescherming (rood), cytotoxiciteit: % cel metabolisme (groen), 50% activiteit of cytotoxiciteit t.o.v. de controle (geel).

3.2.3 Hit validatie De voorgaande assays zijn gebaseerd op het detecteren van een luminescentie signaal of absorbantie, gerelateerd met het virus geïnduceerde CPE. Verdere technieken zullen uitmaken of de bovenstaand geobserveerde antivirale activiteit kan worden gevalideerd. Dit onderzochten we m.b.v. een dengue reporter virus, DENV replicon assay, evenals een virus yield assay met het DENV en het GKV, alsook met het MOD/GK chimeer virus en het MODV.

Resultaten

39

DENV 3.2.3.1 Dengue reporter virus Om op een alternatieve wijze de antivirale activiteit van de potentiële inhibitoren te bestuderen werd een reporter systeem aangewend. Na infectie van BHK-21 cellen (10.000 cellen/well vooraf uitgezaaid) met het volledig infectieus dengue genoom, bevattende het reporter gen, werd de luminescentie gemeten op de tijdstippen 8, 24 en 48 p.i. De luminescentie representeert de virale replicatie van het dengue reporter virus in aanwezigheid van drie verschillende concentraties CHI104 (0,1 – 1 – 10 µg/ml) en in afwezigheid van CHI104 (VC) (Figuur 23). Na 24 hr p.i. vertoont CHI104 een duidelijke dosis-afhankelijke inhibitie van het luminescentie signaal t.o.v. de VC (lagere replicatie van het luciferase gen bevattende virus). In mindere mate gaat de inhibitie door tot 48 hr p.i.. Voor CHI104 aan een concentratie van 10 µg/ml, kan na 24 hr p.i. een EC50 waarde berekend worden van 1,99 µg/ml met 88% inhibitie t.o.v. de VC. Eveneens werd na 48 hr p.i. een EC50 waarde van 2,99 µg/ml berekend met een 93% inhibitie bij 10 µg/ml CHI104. We kunnen uitsluiten dat de waargenomen antivirale activiteit te wijten is aan mogelijke toxische activiteiten van het molecule uitgeoefend op de BHK-21 cellen. De toxiciteit bepaalden we door de celgroei te analyseren aan de hand van celtelling; aan een concentratie van 10 µg/ml CHI104 werd geen remming in celgroei gedetecteerd.

Figuur 23 | CHI104 antivirale activiteit met het dengue reporter virus. BHK-21 cellen werden geïnfecteerd met het dengue reporter virus. Op 8, 24 en 48 hr p.i. werd het luminescentie signaal gemeten, welke de replicatie van het luciferase gen coderende DENV weerspiegelt. Een dosisafhankelijke inhibitie van de replicatie was te detecteren na 24 en 48 hr p.i. voor de CHI104 concentraties 0,1 – 1 – 10 mg/ml. Deze laatste concentratie inhibeerde 93 % van de virale replicatie t.o.v. de VC na 48 hr p.i. Aan een concentratie van 10 µg/ml (en lager) heeft CHI104 op de proliferatie van BHK-21 cellen geen remmend effect.

Resultaten

40

3.2.3.2 DENV virus yield assay Een gevoeligere, maar arbeidsintensievere techniek bestaat erin het vrijgestelde, nieuw aangemaakte virus te kwantificeren als maat voor de antivirale activiteit van een potentiële inhibitor. De potentie van zowel CHI104 als CHI105 om in vitro de productie van virale partikels te remmen, wordt weergegeven in Figuur 24 en Tabel 4. Na het uitvoeren van een virus yield assay volgens het protocol beschreven in paragraaf 3.1.2.9 en kwantificatie met RT-qPCR, werd een welgevormde dosis-respons curve verkregen; de bekomen EC50 waarde liggen lager dan in de overeenkomstige antivirale CPE assays. Dit zou kunnen door de hogere gevoeligheid van de gebruikte techniek en het groter aantal gebruikte cellen (50.000 cellen/well). Beide moleculen bieden vrijwel volledige inhibitie tegen virus-geïnduceerd CPE aan concentraties van 5 en 10 µg/ml (CHI104) of 5 - 10 µM (CHI105). Door de afwezigheid van cytotoxiciteit is de antivirale activiteit volledig toe te schrijven aan een selectieve inhibitie van virale replicatie en niet aan pleiotrope effecten op de cel.

Figuur 24 | DENV virus yield met CHI104 en CHI105. In vitro werd het totaal aantal vRNA gedetermineerd in het supernatans van DENV geïnfecteerde Vero cellen (50.000 cellen/well) waarbij CHI104 en CHI105 is toegevoegd. De hoeveelheid vRNA werd omgerekend naar een % celbescherming (rood). De antivirale activiteit wordt niet beïnvloed door mogelijke toxiciteit van de moleculen (groen).

3.2.3.3 DENV replicon assay Tijdens de virale infectie laat de replicatie van het replicon toe het effect van CHI104 op de functionele NS-proteïnen te bestuderen. Het luminescentie signaal werd 72 hr, na het toevoegen van 0.1, 0.5, 1, 5, 10 en 20 µg/ml CHI104 aan de BHK-Rep-Pac-LUC cellen, gemeten en vervolgens gecorrigeerd voor cytostatische effecten (de replicon bevattende cellen blijken relatief gevoelig aan cytostatische effecten). Figuur 25 toont de werkelijke inhibitie (als percentage van de replicon controle) die CHI104 uitoefent op de replicatie van het DENV replicon. Aan 20 µg/ml kan CHI104 gemiddeld 90% van de replicon replicatie remmen. Een dosis afhankelijke inhibitie werd waargenomen met een EC50 van 1,2 µg/ml voor CHI104 in het replicon systeem.

Resultaten

41

Figuur 25 | Activiteit van CHI104 in de DENV replicon assay. Een dosis afhankelijke inhibitie van de replicon replicatie in BHK-21 cellen, gemeten o.b.v. luminescentie. Bij een concentratie van 20 µg/ml van CHI104 t.o.v. de replicon controle wordt een inhibitie van gemiddeld 90% waargenomen. Het signaal werd gecorrigeerd voor cytostatische effecten.

3.2.3.4 ‘Time-of-addition’ met dengue reporter virus Om een inzicht te krijgen over wanneer CHI104 zal interfereren met de virale replicatie van het DENV, werd een ‘time-of-addition’ experiment ingezet. Dit laat ons toe na te gaan of de inhibitorische activiteit van het molecule vroeg, laat of in het midden van de replicatiecyclus gebeurt. Twee concentraties van CHI104 (5 en 10 µg/ml) werden op zes verschillende tijdstippen (0, 2, 4, 6, 8, 10 en 12 hr p.i.) toegevoegd aan het medium van cellen die werden geïnfecteerd met het reporter virus. De doeltreffendheid van de virale replicatie in BHK-21 cellen werd bepaald op 24 hr p.i. o.b.v. een luminescentie meting. Een percentage inhibitie t.o.v. de VC werd berekend voor beide concentraties op de verschillende tijdstippen (Figuur 26). CHI104 remt de replicatie van het dengue reporter virus

Figuur 25 | Het effect van CHI104 op de replicatiecyclus in een ‘time-of-addition’ studie. De BHK-21 cellen geïnfecteerd met het dengue reporter virus, werden behandeld met 5 µg/ml of 10 µg/ml CHI104, toegevoegd op tijdstippen 0, 2, 4, 6, 8 10 en 12 hr p.i.. Na 24 hr p.i. werd de luciferase activiteit bepaald en het percentage inhibitie berekend t.o.v. de onbehandelde controle.

Resultaten

42

met 95% en 97% aan een concentratie van respectievelijk 5 µg/ml en 10 µg/ml. Zelfs wanneer CHI104 werd toegediend tot 6 hr p.i. kan het de replicatie met meer dan 85% inhiberen. Toevoegen van het molecule aan de geïnfecteerde celculturen op latere tijdstippen, resulteert in een gedeeltelijk tot volledig verlies van de inhibitorische activiteit op de virale replicatie.

GKV 3.2.3.5 GKV virus yield assay In een volgende stap werd eenzelfde virus yield experiment opgesteld voor het GKV als voor het DENV. Uit Figuur 27 en Tabel 4 blijkt duidelijk dat beide moleculen de productie van viruspartikels (gekwantificeerd d.m.v. RT-qPCR) efficiënt remmen. Een vrijwel volledige inhibitie (≥ 99% t.o.v. de VC) werd waargenomen aan de hoogste concentratie. De resultaten werden niet beïnvloed door de toxiciteit van CHI104 en CHI105 aangezien die niet aanwezig is aan ≤10 µg/ml of µM.

Figuur 27 | GKV virus yield met CHI104 en CHI105. Het totaal vRNA gedetermineerd d.m.v. RT-qPCR in het supernatans van GKV geïnfecteerde Vero-B cellen (50.000 cellen/well) op tijdstip x uur p.i. in met CHI104 en CHI105 behandelde cellen, werd omgerekend naar een % celbescherming (rood). De antivirale activiteit is niet te wijten aan cytotoxiciteit (groen).

2.3.6 ‘Time-of-addition’ met GKV Eveneens werd voor het GKV het stadium van de virale replicatiecyclus, dat geïnhibeerd wordt door CHI104, gedetermineerd. CHI104 werd op tijdstip 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 en 18 hr p.i. toegevoegd aan het medium aan een concentratie van 10 µg/ml. De virustiter werd 24 hr p.i. intracellulair en extracellulair gedetermineerd en berekend als een percentage inhibitie van de onbehandelde celcontrole (Figuur 28). CHI104 is in staat om 95% van de virusproductie te remmen wanneer het molecule werd toegediend tijdens de infectie. Als CHI104 werd toegevoegd op latere tijdstippen na infectie, neemt het beschermend effect af.

Resultaten

43

Figuur 28 | Het effect van CHI104 op de GKV replicatie in een ‘time-of-addition’ experiment. De geïnfecteerde BHK-21 cellen met het GKV (17D vaccin stam), werden behandeld met 10 µg/ml CHI104, dat werd toegevoegd op 0 tot 18 hr p.i.. Op tijdstip 24 hr p.i. werd intracellulair en extracellulair het viraal RNA gekwantificeerd en de hoeveelheid uitgedrukt als percentage van de onbehandelde conditie.

Tabel 4 | Samenvatting van de antivirale activiteit van geselecteerde moleculen uit de virus yield assay.

Molecule

CHI104 µg/ml

CHI105 µM

RBV µg/ml

Virus

EC50

CC50

SI50

DENV

0,90

> 10

> 11

GKV

0,15

> 10

> 67

MOD/GK chimeer virus

2,35

> 10

>4

MODV

7,10

> 10

>1

DENV

0,42

> 10

> 24

GKV

0,25

> 10

> 40

MOD/GK chimeer virus

0,76

> 10

> 13

MODV

2,66

> 10

>4

DENV

20,51

> 100

>5

GKV

10,11

> 100

> 10

MOD/GK chimeer virus

> 100

> 100

>1

MODV

25

>1 00

>4

DENV-2 Nieuw-guinea C stam, GKV 17D, MODV M544 en MOD/GK17D chimeer virus (Charlier et al., 2007)

Resultaten

44

3.2.3.7 Virus yield assay met MOD/GK chimeer virus Om de verdere gevoeligheid van de GKV antivirale activiteit van beide moleculen te valideren, werd een virus yield met het MOD/GK chimeer virus uitgevoerd. Zoals beschreven in Charlier et al., 2004, werd hierbij het GKV 17D als ‘backbone’ gebruikt, waarbij de structurele genen, prM en E, werden vervangen door deze van het neuroinvasief MODV, een muis flavivirus (Figuur 29) [90]. Dit laatste virus behoort tot de cluster van ‘not-known vector’ (NKV) flavivirussen [90].

5’UTR

3’UTR C

prM

LLMTGGTILS/IEV

E

NS1

NS2A

NS2B

NS3

NS4A

NS4B

NS5

TTGVMG/DQGCAI

Figuur 29 | Genomische organisatie van het MOD/GK17D chimeer virus. De constructie van het chimeer virus werd verwezenlijkt door het vervangen van de GKV 17D prM en de E genen door de overeenkomstige genen van het MODV (groen). De aminozuur sequentie in de overgangsgebieden (C/prM en E/NS1) zijn weergegeven; de onderlijnde sequenties behoren tot het MODV. De schuine streep stelt de voorspelde klievingsplaats voor (bewerkte Figuur uit [90]).

De virus yield werd ingezet met het chimeer virus in aanwezigheid van CHI104 en CHI105 op Vero-B cellen. Eerder werd al aangetoond dat het chimeer virus quasi even efficiënt repliceert in Vero-B cellen als het parentale GKV 17D [90]. CHI104 is in staat om aan een concentratie van 5 en 10 µg/ml vrijwel volledig de replicatie van het chimeer virus te inhiberen, nagenoeg hetzelfde produceert zich voor CHI105 (Figuur 30 en Tabel 4). De EC50 waarden van het chimeer virus (2,35 µg/ml en 0,76 µM voor CHI104 en CHI105, respectievelijk) zijn gelegen tussen de EC50 waarden van de moleculen tegen het GKV en het MODV (zie verder). Net zoals in de GKV virus yield assay werd geen toxiciteit van de moleculen waargenomen in de Vero-B cellen aan de hoogst geteste concentratie.

Figuur 30 | Virus yield met het MOD/GK 17D chimeer virus. CHI104 en CHI105 werd toegevoegd aan geïnfecteerde Vero-B cellen (50.000 cellen/well), waarna het vRNA gekwantificeerd werd in het supernatans op x hr p.i.. De kwantiteit vRNA is uitgedrukt als % t.o.v. de onbehandelde controle (rood). CHI104 en CHI105 oefenen geen cytotoxiciteit uit op de cellen aan een concentratie van 10 µg/ml (of 10 µM) of lager.

Resultaten

45

3.2.3.8 MODV virus yield assay Het evalueren van CHI104 en CHI105 op de replicatie van het muis Modoc virus is van betekenis voor eventuele latere in vivo experimenten. Vero-B cellen (50.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het MODV (M544) in de aan- of afwezigheid van CHI104 of CHI105. Het vRNA, afkomstig van het supernatans, werd gekwantificeerd op dag 4 p.i.. De resultaten (Figuur 31 en Tabel 4) tonen aan dat de beide moleculen aan de hoogste concentratie de MODV replicatie efficiënt remmen.

Figuur 31 | Virus yield met het MOD/GK 17D chimeer virus. Het vRNA werd gekwantificeerd in het supernatans 4 dagen p.i. (MODV/GKV 17D op Vero-B cellen met/zonder CHI104 en CHI105). De kwantiteit van het vRNA werd omgerekend naar een % t.o.v. de onbehandelde controle (rood). CHI104 en CHI105 zijn niet cytotoxisch aan een concentratie van 10 µg/ml (of 10 µM) of lager.

Resultaten

46

Hoofdstuk 4 Algemeen besluit Dit onderzoek had als objectief een bijdrage te leveren tot de ontwikkeling van krachtige antivirale moleculen tegen het dengue hemorragische koorts virus. DENV inhibitoren zouden bij voorkeur eveneens een activiteit moeten vertonen tegen andere flavivirussen, zoals het GKV. Verscheidene pogingen om dergelijke inhibitoren te ontwikkelen werden reeds gepubliceerd, maar tot op heden werden geen van de moleculen verder ontwikkeld [52, 62, 63, 65, 91-93]. De efficiëntie van een antiviraal middel wordt bevorderd wanneer het sneller na een infectie wordt toegediend. Daarom zou de ontwikkeling van differentieel diagnostische technieken, die op een snelle manier andere ziekten (van andere virale, bacteriële of parasitaire oorsprong) kunnen uitsluiten, toelaten vroeg na infectie de geneesmiddelen toe te dienen, waardoor een verbeterde antivirale respons gerealiseerd kan worden [14, 57, 94]. Aangezien dengue acuut optreedt [54] en een antiviraal middel hierdoor slechts voor korte duur (1 à 2 weken) zou moeten worden gegeven, zou de kans op resistentieontwikkeling kleiner zijn, dan bijvoorbeeld HCV, dat een chronische ziekte kan veroorzaken en jarenlange therapie vereist. De dengue antivirale middelen zouden allereerst de viremie in patiënten moeten reduceren, zodat een minder ernstig ziekteverloop ontwikkeld wordt [95]. In het geval van dengue zal een verminderd risico van dengue koorts of dengue hemorragische koorts/dengue shock syndroom optreden in volwassen, alsook in kinderen. Het potentieel gebruik van dergelijke antivirale middelen omvat: (i)

het profylactisch gebruik tijdens epidemische situaties, voornamelijk belangrijk in hyperendemische regio’s.

(ii)

het gebruik in endemische gebieden bij patiënten met vermoedelijk of laboratorisch bewezen een dengue infectie.

(iii)

het profylactisch gebruik voor mensen die naar of door DENV endemische gebieden reizen.

(iv)

het profylactisch gebruik voor personeel van niet-gouvernementele hulporganisaties, zoals artsen zonder grenzen, of militairen die in endemische regio’s humanitaire acties verrichten.

In een eerste deel van dit werk hadden we de intentie om een efficiënte antivirale screenings-assay voor dengue te ontwikkelen. Omdat het DENV relatief inefficiënt in celcultuur repliceert en het onvoldoende CPE bleek te produceren voor het gebruik in een reproduceerbare assay, kozen we ervoor om het virus eerst op te kweken in een meer natuurlijke situatie [1]. Om hoge titers van het virus te krijgen, werd het DENV voor drie passages op muggencellen gekweekt (DENV C6/36 P3). Dit virus werd vervolgens gebruikt voor de infectie van Vero cellen, waarin CPE werd geïnduceerd. Het analyseren van het CPE in een cel-gebaseerde assay met de MTS-methode (o.b.v. de metabole celactiviteit) leverde weinig bruikbare resultaten op vanwege een hoge “ruis”. De signaal/ruis verhouding konden we vergroten door over te schakelen op een alternatieve aflees methode (ATPlitemethode) [89]. Gong et al. ontwikkelde en valideerde deze luminescentie-gebaseerde methode voor

Algemeen besluit

47

positief strengs-RNA virussen om de ATP levels in levende cellen, beschermd van het virusgeïnduceerde CPE door aanwezigheid van een antiviraal molecule, te determineren. Deze gevoelige methode verschafte ons inderdaad, i.t.t. MTS-methode, de nodige betrouwbare, reproduceerbare resultaten die toelaten de verdere EC50 en CC50 waarden nauwkeuriger te bepalen. Uit de ‘medium-to-high-throughput screening’ van een selectie van ongeveer 1.400 moleculen voor de evaluatie van de antivirale activiteit tegen het DENV-2 NGC, identificeerden we twee potentiële inhibitoren nl. CHI104 en CHI105. HTS cel-gebaseerde assays zijn reeds gebruikt om bibliotheken van moleculen te evalueren op de inhibitorisch activiteit tegen flavivirussen, zoals het WNV [72]. Bepaalde van de geïdentificeerde moleculen voor het WNV vertoonden ook inhibitie tegen het DENV en andere flavivirussen, zoals het GKV. Deze cel-gebaseerde methode, i.t.t. de ‘target’-gebaseerde methode, laat toe het al dan niet gewenste werkingsmechanismen te onderzoeken en tevens moleculen, die eender welke stap in de virus replicatie blokkeren, te identificeren in levende cellen [58]. De opzet was om de activiteit van CHI104 en CHI105 te bevestigen en te karakteriseren. De gemiddelde EC50 van beide moleculen in Vero cellen ligt beneden 1 µg/ml of µM, met een CC50 groter dan > 10 µg/ml (of µM voor CHI105). Deze activiteit is aanzienlijk beter dan de activiteit van ribavirine.

Het dengue reporter virus (dat eerder ontwikkeld werd voor de studie van de rol van de glycosylatie van het DENV E-proteïne tijdens virale regulatie) werd aangewend om de inhibitorische effecten van CHI104 op de virale replicatie verder te bestuderen [89]. Dit luciferase coderende virus liet toe om de tijds- en dosis-afhankelijke inhibitie van de virale replicatie door CHI104 te bevestigen. Vrijwel volledige inhibitie werd waargenomen aan een concentratie van 10 µg/ml (na 48 hr p.i.). Dergelijke krachtige inhibitie werd ook bekomen in de DENV virus yield assay.

Een stabiel subgenomisch replicon bevattende cellijn is een nuttig systeem om de anti-DENV activiteit van CHI104 additioneel te bevestigen en verder te karakteriseren. Deze subgenomische replicon constructen bevatten alle genetische elementen die nodig zijn voor de amplificatie ervan in de gastheercel (BHK-21 cellen). Door het ontbreken van het overgrote deel van de structurele genen kan het replicon wel repliceren maar niet in een viruspartikeltje verpakt worden. Het experiment toont aan dat CHI104 in staat is om de replicatie van dit artificieel vRNA zo goed als volledig te remmen. Dit impliceert een directe inwerking van CHI104 op de DENV NS-genen of een indirecte werking op het functioneren van het replicatiecomplex. CHI104 zal een meer selectief antivirale molecule zijn, indien ze inwerkt op de virale proteïnen, dan eerder wanneer ze indirect de gastheercel capaciteiten beïnvloedt. In geval van een directe werking op virale proteïnen, zal het cytotoxisch effect minder uitgesproken zijn, maar kan het fenomeen van resistentie wel sneller optreden [58]. Verder laten deze resultaten toe te concluderen dat het positief antiviraal effect niet te wijten is aan een remmend effect ter hoogte van de virale adsorptie of fusie fase, alsook de virus assemblage of vrijstelling, aangezien het inwerkt op de vRNA replicatie zelf. Algemeen besluit

48

Met een ‘time-of-addition’ (TOA) studie voor CHI104 zijn we erin geslaagd de bovenstaande conclusie uit het replicon systeem te bevestigen. Het feit dat CHI104 zijn inhibitorisch effect hoogstwaarschijnlijk niet uitoefent tijdens de adsorptie/fusie fase van de replicatie, werd in de ‘time-of-addition’ (TOA) studie weerspiegeld als een behoud van het antiviraal effect tijdens de eerste uren na infectie. Wanneer CHI104 werd toegediend tijdens de eerste 6 uur na infectie, werd de activiteit grotendeels behouden, toedienen van CHI104 op latere tijdstippen resulteerde in een belangrijk verlies van de activiteit. CHI104 faalt volledig na toevoegen op 12 uur p.i., de tijdspanne die het DENV nodig heeft om één replicatiecyclus te voltooien. Eerder rapporteerde men de typische duur van 12 tot 16 uur vooraleer nieuw virus kan gedetecteerd worden in het extracellulair medium voor het DENV in celcultuur [31]. Vermoedelijk zal het molecule interfereren met de virale RNA synthese van het DENV (vb. het NS3pro of RaRp), maar verdere in vitro studies, zoals resistentiekweek en de evaluatie in enzymatische assay, moeten deze assumpties en het uiteindelijke werkingsmechanisme uitwijzen. ‘Proof-of-principle’ voor de inhibitie van het DENV NS3pro, blijkt uit de ondernomen pogingen in het verleden [3, 26, 65, 96]. Deze omvatten substraat gebaseerde inhibitoren met natuurlijke dengue protease herkenningssequentie die het DENV-2 op een competitieve manier in vitro remmen [62, 63, 91, 92].

Uiteraard is het van uiterst belang dat dengue geneesmiddelen actief zijn tegen alle vier de serotypes; in dit werk toonden we de activiteit aan van CHI104 en CHI105 tegen het DENV-2 NGC. Het laboratorium beschikt ook over de andere DENV serotypes; deze produceren echter weinig of geen CPE. Momenteel worden hiervoor de nodige methoden op punt gesteld, o.a. antigeen detectie m.b.v. flow cytometrie en RT-qPCR.

Doordat flavivirussen een gelijkaardige genomische opbouw en replicatie delen, is er een perspectief om breed-spectrum inhibitoren te ontwikkelen met een antivirale activiteit tegen verschillende flavivirussen [25]. CHI104 en CHI105 blijken eveneens een activiteit te vertonen tegen het GKV, zelfs meer uitgesproken dan de anti-DENV activiteit. De ‘time-of-addition’ assay, net zoals voor het DENV, laat vermoeden dat de CHI-moleculen direct inwerken op een mechanisme in de replicatiecyclus van flavivirussen, dat ongeveer 6 uur na infectie gebeurt.

We evalueerden evenzeer het potentieel inhibitorisch effect van CHI104 en CHI105 tegen een virus, verder gelegen in de fylogenetische boom, nl. het MODV. Dit muizen flavivirus (uit de NKV cluster) bleek ook gevoelig aan de antivirale activiteiten van CHI104 en CHI105, weliswaar met mindere potentie (hogere EC50 waarde). De activiteit van deze klasse van moleculen opent echter perspectieven voor de evaluatie in proefdiermodellen. Om potentiële moleculen, die in vitro een antivirale activiteit hebben aangetoond tegen verschillende flavivirussen, in vivo te testen, is het

Algemeen besluit

49

aangeraden ze eerst te evalueren in eenvoudig te manipuleren diermodellen, zoals de Modoc modellen in SCID-muizen en -hamsters [2]. Vervolgens evalueerden we de activiteit van CHI104 en CHI105 op de replicatie van een MOD/GKV chimeer virus. Dit chimeer virus werd bekomen door de prM en E structurele genen van het genoom van het GKV 17D vaccin stam te vervangen door de overeenkomstige genen van het MODV. Opnieuw bevestigen deze experimenten de antivirale werkzaamheid. Het chimere virus werd geconstrueerd met de bedoeling een GKV te ontwikkelen, dat in tegenstelling tot het parentale vaccin virus, repliceert in muizen. De activiteit van de CHI-moleculen die we aantoonden tegen dit chimere virus opent verdere perspectieven voor in vivo evaluatie.

Samengevat: we optimaliseerden een DENV cel-gebaseerde assay, waarmee we twee moleculen (uit een sterk geselecteerde reeks) identificeerden met een activiteit tegen het DENV-2. Na het verder valideren van de activiteit tegen dit serotype, bleek uit de TOA studie het inhiberend effect van de moleculen vroeg in de RNA replicatie plaats te vinden. De activiteit tegen het GKV, het MODV en het chimeer virus suggereert een breed-spectrum anti-flavivirus activiteit.

Algemeen besluit

50

Literatuurlijst

[1]

Henchal EA, Putnak JR. The dengue viruses. Clinical microbiology reviews 1990;3(4):376-96.

[2]

Charlier N, Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Rodent models for the study of therapy against flavivirus infections. Antiviral research 2004;63(2):67-77.

[3]

Qi RF, Zhang L, Chi CW. Biological characteristics of dengue virus and potential targets for drug design. Acta biochimica et biophysica Sinica 2008;40(2):91-101.

[4]

Clyde K, Kyle JL, Harris E. Recent advances in deciphering viral and host determinants of dengue virus replication and pathogenesis. Journal of virology 2006;80(23):11418-31.

[5]

Gubler DJ. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clinical microbiology reviews 1998;11(3):480-96.

[6]

Holmes EC, Twiddy SS. The origin, emergence and evolutionary genetics of dengue virus. Infect Genet Evol 2003;3(1):19-28.

[7]

Gubler DJ. The changing epidemiology of yellow fever and dengue, 1900 to 2003: full circle? Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 2004;27(5):319-30.

[8]

Monath TP. Dengue: the risk to developed and developing countries. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994;91(7):2395-400.

[9]

Reiter P. Climate change and mosquito-borne disease. Environmental health perspectives 2001;109 Suppl 1:141-61.

[10]

Halstead SB. Dengue. Lancet 2007;370(9599):1644-52.

[11]

Centers for Disease Control and Prevention. Vectorborne Infectious Diseases. Dengue Fever. April 16, 2008.

[12]

Mackenzie JS, Gubler DJ, Petersen LR. Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nature medicine 2004;10(12 Suppl):S98-109.

[13]

Centers for Disease Control and Prevention. Outbreak Notice Update: Dengue, Tropical and Subtropical Regions. April 16, 2008.

[14]

Gibbons RV, Vaughn DW. Dengue: an escalating problem. BMJ (Clinical research ed 2002;324(7353):1563-6.

[15]

World Health Organisation. Regional Office for South-East Asia. Dengue/DHF, Reported Cases of DF/DHF in Selected Countries in SEA Region (1985 – 2006). Laatste update Juli 6, 2007.

[16]

World

Health

Organization

2008.

Impact

of

Dengue.

http://www.who.int/csr/disease/dengue/impact/en/index.html. [17]

Solomon T, Mallewa M. Dengue and other emerging flaviviruses. The Journal of infection 2001;42(2):104-15.

[18]

M.M. Jager AH, A.S. de Boer, W. Takken, E.J. Scholte,J.H.J. Reimerink, M.P.G. Koopmans. Import van de tijgermug, risico voor volksgezondheid? Infectieziekten 2008;3:108-12.

[19]

Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and economic problem in the 21st century. Trends in microbiology 2002;10(2):100-3.

[20]

Shope R. Global climate change and infectious diseases. Environmental health perspectives 1991;96:171-4.

[21]

Gould EA, Solomon T. Pathogenic flaviviruses. Lancet 2008;371(9611):500-9.

[22]

World Health Organization. WHO calls for Collaboration on Dengue "Controlling Dengue has to be everyone's business". Phuket/ New Delhi, september 19, 2007. .

[23]

Mukhopadhyay S, Kuhn RJ, Rossmann MG. A structural perspective of the flavivirus life cycle. Nature reviews 2005;3(1):13-22.

[24]

Seligman SJ, Bucher DJ. The importance of being outer: consequences of the distinction between the outer and inner surfaces of flavivirus glycoprotein E. Trends in microbiology 2003;11(3):108-10.

[25]

Sampath A, Padmanabhan R. Molecular targets for flavivirus drug discovery. Antiviral research 2008.

[26]

Melino S, Paci M. Progress for dengue virus diseases. Towards the NS2B-NS3pro inhibition for a therapeutic-based approach. The FEBS journal 2007;274(12):2986-3002.

[27]

David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Immunopathogenetic Mechanisms, pp.1208-1217, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.

[28]

Miller JL, deWet BJ, Martinez-Pomares L, Radcliffe CM, Dwek RA, Rudd PM, Gordon S. The mannose receptor mediates dengue virus infection of macrophages. PLoS pathogens 2008;4(2):e17.

[29]

van der Schaar HM, Rust MJ, Waarts BL, van der Ende-Metselaar H, Kuhn RJ, Wilschut J, Zhuang X, Smit JM. Characterization of the early events in dengue virus cell entry by biochemical assays and single-virus tracking. Journal of virology 2007;81(21):12019-28.

[30]

McBride WJ, Bielefeldt-Ohmann H. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology. Microbes and infection / Institut Pasteur 2000;2(9):1041-50.

[31]

David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Flaviviridae: The viruses and their Replication. Flaviviruses., pp.1103-1112, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.

[32]

Kurane I, Takasaki T. Dengue fever and dengue haemorrhagic fever: challenges of controlling an enemy still at large. Reviews in medical virology 2001;11(5):301-11.

[33]

Rothman AL. Dengue: defining protective versus pathologic immunity. The Journal of clinical investigation 2004;113(7):946-51.

[34]

Navarro-Sanchez E, Despres P, Cedillo-Barron L. Innate immune responses to dengue virus. Archives of medical research 2005;36(5):425-35.

[35]

Halstead SB, Lan NT, Myint TT, et al. Dengue hemorrhagic fever in infants: research opportunities ignored. Emerging infectious diseases 2002;8(12):1474-9.

[36]

Chaturvedi UC, Nagar R, Shrivastava R. Macrophage and dengue virus: friend or foe? The Indian journal of medical research 2006;124(1):23-40.

[37]

Chaturvedi UC, Shrivastava R, Tripathi RK, Nagar R. Dengue virus-specific suppressor T cells: current perspectives. FEMS immunology and medical microbiology 2007;50(3):285-99.

[38]

Luplertlop N, Misse D. MMP cellular responses to dengue virus infection-induced vascular leakage. Japanese journal of infectious diseases 2008;61(4):298-301.

[39]

Gulati S, Maheshwari A. Atypical manifestations of dengue. Trop Med Int Health 2007;12(9):1087-95.

[40]

Boonnak K, Slike BM, Burgess TH, et al. Role of dendritic cells in antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. Journal of virology 2008;82(8):3939-51.

[41]

Chareonsirisuthigul T, Kalayanarooj S, Ubol S. Dengue virus (DENV) antibody-dependent enhancement of infection upregulates the production of anti-inflammatory cytokines, but suppresses anti-DENV free radical and pro-inflammatory cytokine production, in THP-1 cells. The Journal of general virology 2007;88(Pt 2):365-75.

[42]

Stephenson JR. Understanding dengue pathogenesis: implications for vaccine design. Bulletin of the World Health Organization 2005;83(4):308-14.

[43]

Bozza FA, Cruz OG, Zagne SM, Azeredo EL, Nogueira RM, Assis EF, Bozza PT, Kubelka CF. Multiplex cytokine profile from dengue patients: MIP-1beta and IFN-gamma as predictive factors for severity. BMC infectious diseases 2008;8:86.

[44]

Goncalvez AP, Engle RE, St Claire M, Purcell RH, Lai CJ. Monoclonal antibody-mediated enhancement of dengue virus infection in vitro and in vivo and strategies for prevention. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007;104(22):9422-7.

[45]

Mairuhu AT, Wagenaar J, Brandjes DP, van Gorp EC. Dengue: an arthropod-borne disease of global importance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004;23(6):425-33.

[46]

Morrison AC, Zielinski-Gutierrez E, Scott TW, Rosenberg R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS medicine 2008;5(3):e68.

[47]

Igarashi A. Impact of dengue virus infection and its control. FEMS immunology and medical microbiology 1997;18(4):291-300.

[48]

Ooi EE, Goh KT, Gubler DJ. Dengue prevention and 35 years of vector control in Singapore. Emerging infectious diseases 2006;12(6):887-93.

[49]

World Health Organization. Weekly epidemiological record: DengueNet.

6 September

2002;36(77):300-4. [50]

Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral research 2008;78(1):9-25.

[51]

International

Vaccine

Institute.

The

Pediatric

Dengue

Vaccine

Initiative

Program.

http://www.pdvi.org/. Seoul, 2008. [52]

Nair V, Chi G, Shu Q, Julander J, Smee DF. A heterocyclic molecule with significant activity against dengue virus. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2009;19(5):1425-7.

[53]

Guy B, Almond JW. Towards a dengue vaccine: progress to date and remaining challenges. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases 2008;31(2-3):239-52.

[54]

Whitehead SS, Blaney JE, Durbin AP, Murphy BR. Prospects for a dengue virus vaccine. Nature reviews 2007;5(7):518-28.

[55]

Monath TP. Dengue and yellow fever--challenges for the development and use of vaccines. The New England journal of medicine 2007;357(22):2222-5.

[56]

Edelman R. Dengue vaccines approach the finish line. Clin Infect Dis 2007;45 Suppl 1:S5660.

[57]

Rawlinson SM, Pryor MJ, Wright PJ, Jans DA. Dengue virus RNA polymerase NS5: a potential therapeutic target? Current drug targets 2006;7(12):1623-38.

[58]

David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Antiviral agents. Principals and Mechanisms of Specific Antiviral Drugs, pp.447-476, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.

[59]

Leyssen P, De Clercq E, Neyts J. Perspectives for the treatment of infections with Flaviviridae. Clinical microbiology reviews 2000;13(1):67-82.

[60]

Hidari KI, Takahashi N, Arihara M, Nagaoka M, Morita K, Suzuki T. Structure and anti-dengue virus activity of sulfated polysaccharide from a marine alga. Biochemical and biophysical research communications 2008;376(1):91-5.

[61]

Perera R, Kuhn RJ. Structural proteomics of dengue virus. Current opinion in microbiology 2008;11(4):369-77.

[62]

Leung D, Schroder K, White H, et al. Activity of recombinant dengue 2 virus NS3 protease in the presence of a truncated NS2B co-factor, small peptide substrates, and inhibitors. The Journal of biological chemistry 2001;276(49):45762-71.

[63]

Li J, Lim SP, Beer D, et al. Functional profiling of recombinant NS3 proteases from all four serotypes of dengue virus using tetrapeptide and octapeptide substrate libraries. The Journal of biological chemistry 2005;280(31):28766-74.

[64]

Lohr K, Knox JE, Phong WY, et al. Yellow fever virus NS3 protease: peptide-inhibition studies. The Journal of general virology 2007;88(Pt 8):2223-7.

[65]

Ganesh VK, Muller N, Judge K, Luan CH, Padmanabhan R, Murthy KH. Identification and characterization of nonsubstrate based inhibitors of the essential dengue and West Nile virus proteases. Bioorganic & medicinal chemistry 2005;13(1):257-64.

[66]

Lescar J, Luo D, Xu T, Sampath A, Lim SP, Canard B, Vasudevan SG. Towards the design of antiviral inhibitors against flaviviruses: the case for the multifunctional NS3 protein from Dengue virus as a target. Antiviral research 2008;80(2):94-101.

[67]

Noueiry AO, Olivo PD, Slomczynska U, et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of West Nile virus infection. Journal of virology 2007;81(21):11992-2004.

[68]

Bretner M, Baier A, Kopanska K, et al. Synthesis and biological activity of 1H-benzotriazole and 1H-benzimidazole analogues--inhibitors of the NTpase/helicase of HCV and of some related Flaviviridae. Antiviral chemistry & chemotherapy 2005;16(5):315-26.

[69]

Bretner M, Schalinski S, Haag A, et al. Synthesis and evaluation of ATP-binding site directed potential inhibitors of nucleoside triphosphatases/helicases and polymerases of hepatitis C and other selected Flaviviridae viruses. Antiviral chemistry & chemotherapy 2004;15(1):35-42.

[70]

Zhou Y, Ray D, Zhao Y, et al. Structure and function of flavivirus NS5 methyltransferase. Journal of virology 2007;81(8):3891-903.

[71]

Benarroch D, Egloff MP, Mulard L, Guerreiro C, Romette JL, Canard B. A structural basis for the inhibition of the NS5 dengue virus mRNA 2'-O-methyltransferase domain by ribavirin 5'triphosphate. The Journal of biological chemistry 2004;279(34):35638-43.

[72]

Malet H, Masse N, Selisko B, et al. The flavivirus polymerase as a target for drug discovery. Antiviral research 2008;80(1):23-35.

[73]

De Clercq E. Recent highlights in the development of new antiviral drugs. Current opinion in microbiology 2005;8(5):552-60.

[74]

Corey DR, Abrams JM. Morpholino antisense oligonucleotides: tools for investigating vertebrate development. Genome biology 2001;2(5):REVIEWS1015.

[75]

Kinney RM, Huang CY, Rose BC, Kroeker AD, Dreher TW, Iversen PL, Stein DA. Inhibition of dengue virus serotypes 1 to 4 in vero cell cultures with morpholino oligomers. Journal of virology 2005;79(8):5116-28.

[76]

Raviprakash K, Liu K, Matteucci M, Wagner R, Riffenburgh R, Carl M. Inhibition of dengue virus by novel, modified antisense oligonucleotides. Journal of virology 1995;69(1):69-74.

[77]

Diamond MS, Zachariah M, Harris E. Mycophenolic acid inhibits dengue virus infection by preventing replication of viral RNA. Virology 2002;304(2):211-21.

[78]

David M. Knipe PMH, ed. Fields Virology. Antiviral drugs and immunoglobulins, pp.1218, 5th edn. Philadelphia: Wolters Kluwer, 2007.

[79]

Tam RC, Lau JY, Hong Z. Mechanisms of action of ribavirin in antiviral therapies. Antiviral chemistry & chemotherapy 2001;12(5):261-72.

[80]

Warke RV, Martin KJ, Giaya K, Shaw SK, Rothman AL, Bosch I. TRAIL is a novel antiviral protein against dengue virus. Journal of virology 2008;82(1):555-64.

[81]

Ojwang JO, Ali S, Smee DF, Morrey JD, Shimasaki CD, Sidwell RW. Broad-spectrum inhibitor of viruses in the Flaviviridae family. Antiviral research 2005;68(2):49-55.

[82]

Crance JM, Scaramozzino N, Jouan A, Garin D. Interferon, ribavirin, 6-azauridine and glycyrrhizin: antiviral compounds active against pathogenic flaviviruses. Antiviral research 2003;58(1):73-9.

[83]

Chu JJ, Yang PL. c-Src protein kinase inhibitors block assembly and maturation of dengue virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007;104(9):3520-5.

[84]

Whitby K, Pierson TC, Geiss B, Lane K, Engle M, Zhou Y, Doms RW, Diamond MS. Castanospermine, a potent inhibitor of dengue virus infection in vitro and in vivo. Journal of virology 2005;79(14):8698-706.

[85]

Wu SF, Lee CJ, Liao CL, Dwek RA, Zitzmann N, Lin YL. Antiviral effects of an iminosugar derivative on flavivirus infections. Journal of virology 2002;76(8):3596-604.

[86]

Yauch LE, Shresta S. Mouse models of dengue virus infection and disease. Antiviral research 2008;80(2):87-93.

[87]

Bente DA, Melkus MW, Garcia JV, Rico-Hesse R. Dengue fever in humanized NOD/SCID mice. Journal of virology 2005;79(21):13797-9.

[88]

Shresta S, Sharar KL, Prigozhin DM, Beatty PR, Harris E. Murine model for dengue virusinduced

lethal

disease

with

increased

vascular

permeability.

Journal

of

virology

2006;80(20):10208-17. [89]

Mondotte JA, Lozach PY, Amara A, Gamarnik AV. Essential role of dengue virus envelope protein N glycosylation at asparagine-67 during viral propagation. Journal of virology 2007;81(13):7136-48.

[90]

Charlier N, Molenkamp R, Leyssen P, et al. Exchanging the yellow fever virus envelope proteins with Modoc virus prM and E proteins results in a chimeric virus that is neuroinvasive in SCID mice. Journal of virology 2004;78(14):7418-26.

[91]

Chanprapaph S, Saparpakorn P, Sangma C, Niyomrattanakit P, Hannongbua S, Angsuthanasombat C, Katzenmeier G. Competitive inhibition of the dengue virus NS3 serine protease by synthetic peptides representing polyprotein cleavage sites. Biochemical and biophysical research communications 2005;330(4):1237-46.

[92]

Yin Z, Patel SJ, Wang WL, et al. Peptide inhibitors of Dengue virus NS3 protease. Part 1: Warhead. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2006;16(1):36-9.

[93]

Wang QY, Patel SJ, Vangrevelinghe E, et al. A Small Molecule Dengue Virus Entry Inhibitor. Antimicrobial agents and chemotherapy 2009.

[94]

Bray M. Highly pathogenic RNA viral infections: challenges for antiviral research. Antiviral research 2008;78(1):1-8.

[95]

Vaughn DW, Green S, Kalayanarooj S, et al. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity. The Journal of infectious diseases 2000;181(1):2-9.

[96]

Liu-Young G, Kozal MJ. Hepatitis C protease and polymerase inhibitors in development. AIDS patient care and STDs 2008;22(6):449-57.

Bijlage I

Optimalisatie DENV screening assay: percentage CPE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

B

66

63

62

75

94

97

98

94

93

CC

C

64

79

92

100

98

95

88

56

39

D

94

95

95

96

94

72

50

13

6

12

A

E

97

98

87

77

43

25

13

30

8

F

64

57

49

42

18

30

0

0

0

G

49

6

5

30

0

0

0

0

0

H

Vero cellen (6.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3. Na 8 dagen p.i. werd de titratie afgelezen met ATPlite en de resultaten verwerkt tot het verkrijgen van een kwaliteit van 93 en een virusverdunningsfactor van 1:600. Een geschikte overgang in % CPE wordt waargenomen over de volledige 96-well plaat.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

CC

12

A B

100

88

56

48

19

19

0

100

100

C

89

47

16

17

0

0

1

100

0

D

28

8

9

8

0

0

3

100

0

E

0

0

0

0

0

0

0

0

18

F

0

0

0

0

10

7

0

0

0

G

0

0

0

0

3

0

9

24

36

H

Vero-B cellen (25.000 cellen/well) werden geïnfecteerd met het DENV C6/36 P3. Na 8 dagen p.i. werd de titratie afgelezen met ATPlite en de resultaten verwerkt tot het verkrijgen van een kwaliteit van 71 maar een virusverdunningsfactor van 1:10. Enkel in de drie laagste virusverdunningen is voldoende % CPE waarneembaar, waardoor de virusverdunningsfactor te laag ligt om optimaal bruikbaar te zijn in daaropvolgende assay .

I