Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
SEKUEN REPETITIF GENOM Toxoplasma gondii DALAM PERSPEKTIF SEBAGAI PROBE MOLEKULER (Repetitive Sequence of Toxoplasma gondii Genome in Perspective as a Moleculer Probe) SUMARTONO Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
ABSTRACT The diagnosis of toxoplasmosis is necessary to be developed. Genome of T. gondii has a 529 bp and more than 300 times. It could be used as a moleculer probe. The aim of this study was to asses the homology among repetitive sequence of Toxoplasma and the specificity of the repetitive sequence to genomes of the protozoa that phylogenetically closed to Toxoplasma. The tachyzoite genome was isolated by the lytic alkali method from 6 x 107 tachyzoites of RH isolate and 8 x 107 tachyzoites of local isolate. The target sequence was amplified by PCR (polymerase chain reaction) method using 5’ GAG ACCGCGGAGCCGAAG 3’ (Tox-8) as forward primer, 5’ CCTCTCCTACGC CTCCTC 3’ (Tox-5) as reverse primer, and Ready to Go Beads (Amarsham). The PCR product was sequenced using Big Dye Terminator Mix through ABI 377A sequencer in the Laboratory Molecular Biology Eijkman, Jakarta. The homology analysis among the repetitive sequence of Toxoplasma isolates and its specificity to the protozoa that phylogenetically closed to Toxoplasma were carried out by DNA-DNA blasting. In conclusion, the results showed that the 529 bp repetitive sequence was very specifik of the Toxoplasma gondii genome and it highly homology among Toxoplasma isolates. Key Words: Toxoplasma Genome, Repetitive Sequence, Probe, Blasting ABSTRAK Diagnosis toksoplasmosis masih perlu dikembangkan. Genom Toxoplasma memiliki sekuen repetitif yang besarnya 529 bp dengan jumlah kopi sampai lebih dari 300 kali, sekuen repetitif tersebut memiliki potensi sebagai kandidat untuk diagnostik molekuler. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari homologi sekuen repetitif antar Toxoplasma gondii dan spesifisitas sekuen repetitif T. gondii terhadap genom protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma. Genom Toxoplasma diisolasi dari 6.107 takizoit T. gondii isolat RH dan 8.107 takizoit isolat lokal dengan metode alkali lisis. Amplifikasi sekuen repetitif dilakukan dengan menggunakan forward primer Tox-8: 5’ GAGACC GCGGAGCCGAAG 3’, reverse primer Tox-5: 5’ CCT CTC CTA CGC CTC CTC, dan Ready To Go Beads (Amarsham), sedang sekuensing produk PCR menggunakan Big Dye Terminator Mix dengan sequenser ABI 377A di laboratorium Biologi Molekuler Eijkman, Jakarta. Analisis homologi sekuen diantara Toxoplasma, dan spesifitasnya terhadap genom protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma dilakukan dengan cara penjajaran DNA-DNA. Kesimpulan penelitian adalah bahwa sekuen repetitif yang besarnya 529 bp sangat spesifik genom takizoit Toxoplasma dan homologinya sangat tinggi antara isolat Toxoplasma. Kata Kunci: Genom Toxoplasma, Sekuen Repetitif, Probe, Penjajaran
PENDAHULUAN Ketepatan diagnosis diperlukan untuk mengetahui adanya infeksi Toxoplasma. Diagnosis toksoplasmosis secara konvensional (berdasarkan gejala klinis dan uji biologis) memiliki kelemahan. Diagnosis immunologis memiliki kekurangan dan kelebihan.
516
Kekurangan teknik immunologis adalah tidak dapat diterapkan pada individu yang imunosupresif, sedang kelebihannya dapat menentukan adanya infeksi baru (deteksi IgM) maupun infeksi yang sudah lama (IgG) dengan berbagai bentuk aplikasinya seperti immunoabsorbent agglutination assay (ISAGA), yang biasanya untuk deteksi IgM,
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
direct agglutination (DA), dan enzym linked immunosorbent assay (ELISA) yang biasanya untuk deteksi IgG. Sebaliknya, untuk deteksi adanya antigen dalam tubuh dapat juga dilakukan dengan teknik ELISA (LAPPIN, 1994), polymerase chain reaction (PCR) (FRANZEN et al., 1997; ANGEL et al., 1997), PCR-deoxyribonucleic acid (DNA) enzyme immunoassay (PCR-DEIA) (NGUYEN et al., 1966), PCR dan hybridization immunoassay (PCR-DIA) (MULLER et al., 1996) dan light cycler-PCR (LC-PCR) (REISCHL et al., 2003) yang aplikasinya memerlukan dukungan peralatan yang cukup mahal. Di Indonesia, sampai saat ini optimalisasi diagnosis toksoplasmosis berdasarkan genom Toxoplasma masih perlu dikembangkan. Menurut REISCHL et al. (2003), genom takizoit memiliki fragmen repetitif 529 bp dengan kopi lebih dari 300 kali. Dibanding fragmen gena B1 yang hanya memiliki kopi 30 kali (OWEN et al., 1988), fragmen 529 bp tersebut memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai probe molekuler. Namun untuk dapat dikembangkan sebagai suatu probe, sekuen repetitive tersebut perlu diketahui lebih dulu homologi diantara T. gondii, spesifisitasnya terhadap genom protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari homologi sekuen repetitif diantara isolat T. gondii dan genom protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma. MATERI DAN METODE Isolasi genom T. gondii Sebanyak 1 ml suspensi takizoit T. gondii (6.107 takizoit isolat RH dan 8.107 isolat lokal), masing-masing dimasukkan ke dalam tabung steril 15 ml. Setelah ditambah 2 ml bufer ekstraksi (10 mM Tris HCl pH. 8.0, 10mM NaCl, 10mM EDTA), suspensi takizoit dihomogenisasi dengan tissue homogenizer. Suspensi kemudian ditambah 0,2 ml SDS 10% dan 2 µl proteinase-K 10 µg/ml dan diinkubasikan satu jam pada suhu 50°C. Homogenat lalu disentrifuse lima menit pada kecepatan 3500 rpm. Supernatan diambil dan ditampung dalam tabung Eppendorf steril 1,5 ml, untuk dilakukan separasi. Separasi DNA
dari debris sel dilakukan dengan phenolchloroform-isoamylalcohol sebanyak 0,5 x volume supernatan yang terambil, lalu disentrifus 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Lapisan yang berisi DNA (lapisan paling atas) diambil dan dimasukkan kedalam tabung Eppendorf 1,5 ml yang baru. Larutan DNA lalu dipresipitasi semalam pada suhu 50 C, setelah diberi sodium asetat 2 M dan alkohol absolut dingin masing-masing sebanyak 0,5 volume dan 2x volume larutan DNA. Larutan yang mengandung presipitat DNA lalu disentrifus selama 5 menit 12.000 rpm. Setelah presipitat DNA dicuci 2 kali, masing-masing dengan alkohol 80% dan alkohol 70% dingin dengan cara sentrifugasi 5 menit 12.000 rpm, presipitat DNA dikeringkan pada suhu kamar. Presipitat DNA lalu diberi 50 µl TE dan diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer untuk mengetahui optical densitinya (OD). Amplifikasi sekuen repetitif 529 bp dengan metode PCR Sebanyak 0,52 µg genom T. gondii isolat lokal dan 0,23 µg genom T. gondii isolat RH digunakan untuk amplifikasi sekuen repetitif 529 bp genom T. gondii, sedangkan Primer Tox-8: 5’ GAGACCGCGGAGCCGAAG 3’, dan primer Tox-5: 5’ CCTCTCCTACGCCTC CTC, masing-masing digunakan sebagai forward dan reverse primer dan solution miksnya menggunakan Ready To Go Beads (Amarsham). Pengaturan waktu dan siklus reaksi pada thermocycler adalah predenaturasi 95°C, 5 menit, denaturasi 94°C, 1 menit, annealing 56,8°C, 1 menit, elongasi 72°C, 1 menit, terminasi 72°C, 5 menit dan siklusnya 35 kali. Elektroforesis dan dokumentasi hasil amplifikasi Pembacaan hasil amplifikasi dilakukan dengan cara elektroforesis dengan menggunakan gel agarose 1%, buffer TBE 1x, sodium ethidium bromide sebagai cat DNA dan didokumentasi dengan film polaroid. Sekuensing hasil amplifikasi sekuen repetitif Sekuensing sekuen repetitif hasil amplifikasi dilakukan dengan Big Dye Terminator Mix (ABI 377A sequencer) di
517
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
laboratorium Biologi Molekuler, Eijkman, Jakarta. Analisis sekuen repetitif produk PCR Analisis sekuen dilakukan antara isolat RH dengan isolat lokal, dan analisis sekuen produk PCR dengan protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma. Analisis sekuen tersebut dilakukan dengan cara penjajaran (blasting) dengan menggunakan software yang langsung di download dari internet (http://www. tigar.org). HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil isolasi genom takizoit T. gondii dan hasil amplifikasi sekuen repetitif yang di elektroforesis dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar pita-pita DNA pada lane 1 dan 2, masing-masing merupakan hasil isolasi genom Toxoplasma isolat RH dan isolat lokal. Pita genom tersebut cukup besar diatas 10000 bp.
Hal ini sesuai dengan pendapat AJIOKA et al. (2001) dan BLACK dan BOOTHROYD (2000) yang menyatakan bahwa genom inti saja dari Toxoplasma besarnya 87 MB. Sumber DNA Toxoplasma selain dari genom inti juga berasal dari DNA plastid, atau disebut juga DNA apicoplast atau DNA episomal yang bentuknya sirkuler seperti pada genom organisme fotosintetik yang besarnya 35 kb dan genom mitokondria yang besarnya hanya 6 kb. Pada lane 3 dan 4 terdapat pita-pita DNA yang tampak homolog satu dengan yang lain yang merupakan hasil amplifikasi sekuen repetitif dari isolat RH dan isolat lokal. Pita yang berukuran 500 – 750 bp adalah pita sekuen repetitif seperti yang dimaksud REISCHL et al. (2003), yaitu besarnya 529 bp yang memiliki banyak kopi. Selanjutnya, untuk mengetahui kesamaan sekuen repetitif antara isolat RH dan isolat lokal, pita-pita homolog yang berada diantara 500 – 750 bp yang bawah, baik yang dari takizoit isolat RH maupun dari isolat lokal disekuensing untuk dianalisis lebih lanjut.
10000 bp
50 bp
529 bp
500 bp
M
1
2
3
4
Gambar 1. Hasil amplifikasi sekuen repetitif genom takizoit T.gondii,Agarose 1%, TBE 1X, sodium ethidium bromide (M: marker, 1: DNA total isolat lokal, 2: DNA total isolat RH, 3. hasil PCR isolat lokal, 4. hasil PCR isolat RH)
518
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
Hasil sekuensing dan homologi antara isolat RH dan isolat lokal dapat dilihat pada Tabel 1. Hasil sekuensing dari pita yang homolog antara isolat lokal dengan isolat RH pada gambaran elektroforesis menunjukkan bahwa sekuen yang terekam pada sekuensing untuk kedua isolate tidak semua nukleotida terbaca secara sempurna. Namun demikian, hasil sekuensing dari kedua isolat tersebut yang masih dapat terbaca dan dapat disejajarkan untuk mengetahui seberapa besar homologinya.
Gambar 2 menunjukkan bahwa hasil blasting sebagian fragmen (215 nt) sekuen repetitif isolat lokal dengan sekuen repetitif isolat RH memiliki homologi yang cukup tinggi yaitu 215/225 atau 95,5%. Adanya kesamaan tersebut menunjukkan bahwa sekuen repetitif genom Toxoplasma yang memiliki lebih dari 529 kopi, memiliki spesifisitas untuk dapat digunakan sebagai probe diagnosis baik untuk infeksi Toxoplasma isolat lokal maupun isolat RH.
Tabel 1. Teks file hasil sekuensing sekuen repetitif genom Toxoplasma isolat RH.dan isolat lokal Isolat RH
Isolat lokal
NNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTGTCTCCCTCGCC CTCTTNTCCNCTCTTCATTCTCTCCGNCNNCNNN NCGAGGAAAGCGTCGTCTCGTCTAGATCGCATT CCGGTGTCTCTTTTCCACCCTCCAGGAAAAGCAG CCAAGCCGGAAACATCTTCTCCCTCTCCGACTCT CGTCGCTTCCCAACCACGCCACCCCCTCATCCTC ACCCTCGCCTTCATCTACAGTCCTGATATCTCTC CTCCAAGACGGCTGGAGGAGCGGCATCGCGTCT GTAGTCCCCTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTGGCT CCNAGCACAGGCGAGCTCGCCTGTGAAAAAACA AAAAAAAATCAAAAAAANAAAACNNNNTTNGG NNNCNNNGGNNNNNNNCNNANNNAGGCNGNNG GGCNGGAGTCAAAAAAAANAAAANNNNNNAAA ACCAAANNGAAAAAAAAATTNNAAAANNNNTT TTTNNNNNTNCNNNCNNNNNNNNNNNNNGNNT NNNGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NTTNNNCNAANNNNNNNNNNNNNNGTNNCNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNANNNNNGNNNNNNNNTNNNNNNTATATNTN NNNNNGNNNNNNNNNNNAGNNNGAGNGGNNN NNNNNNNNNNCNGNNNNGNNNNAGNNNGCAGG NANNNNNNNNNNNCNNNNNNNNNAANNNANAN NNNNNANNNNNTNNNNNNCTTNNNNNNTNTNN TGTTNNNNNNNGNGNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTGTCTCCCT CGCCCTCTTCTCCNCTCTTCATTCTCTCCGNN NNNNNNACGAGGNNGNGTCGTCTCGTCTAG ATCGCATTCCGGTGTCTCTTTTCCACCCTCC AGGAAAAGCAGCCAAGCCGGAAACATCTTC TCCCTCTCCGACTCTCGTCGCTTCCCAACCA CGCCACCCCCTCATCCTCACCCTCGCCTTCA TCTACAGTCCTGATATCTCTCCTCCAAGACG GCTGGAGGAGCGGCATCGCGTCTGTAGTCC CCTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTGGCTCCNA GCACAGGCGAGCTCGCCTGTGAAAAAACAA AAAAAAATCAAAAAAANAAAACNNNNTTN GGNTCCNNGGNNNNANNNNGNNNGANGNN NNNGGNCCNNNNNCAAAAAAAANAAANNN NNNAAAANNNANNNNAAAANAAANNNNNN NNTTTTTNNTNTTNCTNCCNNNNNNNACNC NNNGNNNNNGGNNNNCNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNTTGTNNCNANNNNNNNNNNT NTNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNCNNANNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNAAANNTNNNNNTNNNNNT TNNTNNNNNNNNNNNNN
1=lk ----------GTCGTCTCGTCTAGATCGCATTCCGGTGTCTCTTTTCCACCCTCCAGGAA 2=RH CGAGGAAAGCGTCGTCTCGTCTAGATCGCATTCCGGTGTCTCTTTTCCACCCTCCAGGAA ************************************************** 1=lk AAGCAGCCAAGCCGGAAACATCTTCTCCCTCTCCGACTCTCGTCGCTTCCCAACCACGCC 2=RH AAGCAGCCAAGCCGGAAACATCTTCTCCCTCTCCGACTCTCGTCGCTTCCCAACCACGCC ************************************************************ 1=lk ACCCCCTCATCCTCACCCTCGCCTTCATCTACAGTCCTGATATCTCTCCTCCAAGACGGC 2=RH ACCCCCTCATCCTCACCCTCGCCTTCATCTACAGTCCTGATATCTCTCCTCCAAGACGGC ************************************************************ 1=lk TGGAGGAGCGGCATCGCGTCTGTAGTCCCCTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTGGCTCC 2=RH TGGAGGAGCGGCATCGCGTCTGTAGTCCCCTTCGACTTCTGTCCCTTCTGTGGCTCC ********************************************************* Gambar 2. Hasil penjajaran sekuen repetitif genom Toxoplasma antara isolat lokal dengan isolat RH
519
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
Tabel 2. Hasil penjajaran sekuen repetitif genom Toxoplasma antara isolat lokal dengan isolat RH dan dengan protozoa lain yang secara filogenetik dekat dengan Toxoplasma Sumber Genom
No. Accesión pada gen Bank
Homologi
Isolat lokal vs isolat RH
95%
AY940487
Tidak ada homologi
S. cruzi
AF0170120
Tidak ada homologi
S. tenella
AF076899
Tidak ada homologi
S. caprae canis
AF012885
Tidak ada homologi
DQ022686
Tidak ada homologi
EU532137
Tidak ada homologi
Antar isolat Toxoplasma Protozoo Neospora sp. Sarcocystis
Hammondia H. hammondi Cryptosporidium C. parva
Agar tidak menimbulkan kerancuan dalam diagnosis, sebagai suatu materi diagnostik, sekuen repetitif tersebut harus tidak memiliki homologi dengan protozoa lain, paling tidak protozoa yang dekat secara filogenetik dengan Toxoplasma. Menurut SU et al. (2003) dan BUTKAUSKAS et al. (2007), protozoa-protozoa seperti Neospora, Sarcocystis, Hammondia, Cryptosporidium secara filogenetik merupakan protozoa yang dekat satu sama lain. Hammondia hammondi, Neospora caninum, dan Toxoplasma gondii merupakan protozoa yang secara filogenetik terdapat dalam satu grup, sedangkan Sarcocystis dan Cryptosporidium merupakan protozoa lain yang dekat dengan Toxoplasma tetapi diluar grup tersebut. Hasil penjajaran (Tabel 2) menunjukkan bahwa sekuen repetitif Toxoplasma hasil amplifikasi tidak ada homologi dengan spesies-spesies dari genus Neospora, Sarcocystis, Hammondia, maupun Cryptosporidium, sehingga dapat dikatakan bahwa sekuen repetitif hasil amplifikasi sangat spesifik pada genom Toxoplasma. KESIMPULAN Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa sekuen repetitif 529 bp sangat spesifik genom takizoit T. gondii dan homologinya sangat tinggi diantara isolat lokal dengan isolat RH.
520
DAFTAR PUSTAKA AJIOKA, J.W., J.M. FITZPATRIK and C.P. REITTER. 2001. Toxoplasma gondii genomics: Shedding light on pathogenesis and chemotherapy. Experts reviews in Molecular Medicine. 3: 1 – 19. Http://www.Journals Cambridge.org/ action/search. (3 Desember 2007). ANGEL, S.O., M. MATRAJT, J. MARGARIT, M. NIGRO, E. ILLESCAS, V. PSZENNY, M.R. AMENDOEIRA, R. GUARNERA and J.C. GARBER. 1997. Screening for active toxoplasmosis in patients by DNA hybridization with ABGTg7 probe in blood samples. J. Clin. Microbiol. 35 (3): 591 – 595. BLACK, M.W. and J.C. BOOTHROYD. 2000. Lytic cycle of Toxoplasma gondii. Microbiol and Mol Biol Review 64(3): 607 – 623. BUTKAUSKAS, D., A. SRUOGA, L. KUTKIENE and P. PRAKAS. 2007. Investigation of the phylogenetic relationships of Sarcocystis spp. From Greylag (Anser anser) and Whitefronted (Anser albifrons) geese to other cyst forming coccidian using 18s and 28s rRNA gene sequences. Acta Zoologica Lituanica. 17(2): 124 – 128. FRANZEN, C., M. ALTFELD, P. HEGENER, P. HARTMAN, G. ARENDT, H. JABLONOWSKI, J. ROCKSTROH, V. DIEHL, B. SALZBERGER and G. FATKENHUER. 1997. Limited value of PCR for detection of Toxoplasma gondii in blood from human immunodeficiency virus-infected patients. J. Clin. Microbiol. 35(10): 2639 – 2641
Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2008
LAPPIN, M.R. 1994. Feline toxoplasmosis. Weltham Focus. 4(4): 2 – 8. MULLER, N., V. ZIMMERMAN, B. HENTRICH and B. GOTTSTEIN. 1996. Diagnosis of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infection by PCR and hybridization immunoassay. J. Clin. Microbiol. 34(11): 2850 – 2852. NGUYEN, T.D., M. DE KESEL, D., BIGAIGNON, P. HOEF, G. PAZZAGLIA, M. SAMMENS and M. DELMEE. 1966. Detection of Toxoplasma gondii tachyzoites and bradyzoites in blood, urine, and brains of infected mice. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3: 635 – 639.
REISCHL, U., S. BRETAGNE, D. KRUGER, P. ERNAULT and J.M. COSTA. 2003. Comparison of two DNA targets for the diagnosis of toxoplasmosis by real-time PCR using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes. BMC. Infect. Dis. May 2,3(1): 7. SU, C., D. EVANS, R.H. COLE, J.C. KISSINGER, J.W. AJIOKA and L.D. SIBLEY. 2003. Recent expansion of Toxoplasma through enhanced oral transmission. Report. Science. 299(5605): 414 – 416.
521
