Segédanyag a LÉGZÉS témakörhöz A légzés Azon biokémiai-élettani folyamatok összessége, melynek során nagyenergiájú, redukált szerves vegyületek feldarabolása, lebontása, oxidálása megy végbe légköri oxigén felhasználásával. E lebontó folyamatok közben redukált koenzimek keletkeznek és ATP szintézise folyik, természetesen a legtöbb ATP a mitokondriumban keletkezik a terminális oxidáció folyamán a redukált koenzimek lebontásakor. Az itt keletkezett ATP-t a növény más élettani folyamatokban tudja felhasználni. Nem csak szénhidrogének, hanem fehérjék, zsírok lebontása is végbemegy. A szerves vegyületek lebontásának 3 fő lépése: 1. polimerek lebontása monomerekké 2. a monomerek oxidatív lebontása (RH + KoE + O2 ⇒ CO2 + KoEH) 3. a redukált koenzimek visszaoxidálása a légköri oxigén felhasználásával Összesített egyenlet: RH + O2 ⇒ CO2 + H2O + energia E folyamatok exotermek. Légzési gázcsere figyelhető meg, amely nyomon követhető, ehhez persze nem fotoszintetizáló szövetekre van szükség. A légzési hányados (CO2 cc / O2 cc) szénhidrátokra vonatkoztatva RQCH=1, almasavra RQMA=1,3, sztearinsavra RQSA=0,69. A valódi lebontás természetesen mindig többféle szubsztrát egyidejű felhasználásával valósul meg. Egyes növényi szövetek légzésgátlókkal történő kezelés során a citokróm típusú légzési lánc gátlószereinek jelenlétében is jelentős mértékű O2-felvételt mutatnak. Ez a cianid-rezisztens légzés. Az O2-felvételért felelős enzim az alternatív oxidáz (OxALT). Ennek O2-affinitása 510x kisebb, mint a citokróm-oxidázé. Az OxALT az ubikinon poolból veszi fel az elektronokat. A szokásos (citokróm) út mellett az alternatív utak alig, vagy egyáltalán nem működnek, de ha az ADP cc / ATP cc arány csökken, vagyis az ATP relatív mennyisége megnő, az elektronok az alternatív útra kerülnek. A piroszőlősav közvetlenül hat az OxALT-ra, kapcsolódik az enzimhez és aktiválja az alternatív utat. Különböző körülmények között indukálható a cianid-rezisztens légzés (pl. öregítés, etilén kezelés, tápoldat összetételének megváltoztatása, stb.) A légzés egyes folyamatainak megismeréséhez szelektív gátlószereket, ill. szétkapcsolószert alkalmazunk. Ezek: 1. monojód-ecetsav (ME) – SH-reagens, olyan enzimek működését gátolja, amelyek SHcsoportot tartalmaznak aktív centrumukban, ilyen pl. a glicerinaldehid-3Pdehidrogenáz (vagy a citrát-szintáz). Elsősorban a glikolízist gátolja 2. fluoroecetsav (FE) – az acetil-koenzim A-val reagál, így fluoroacetil-csoport jut be a citromsavciklusba, ahol továbbalakulva a fluorocitrát az akonitáz enzimet gátolja 3. (Na-) azid – a mitokondriumban fejti ki hatását, a terminális oxidációért felelős citokrómA/A3 gátlója 4. 2,4-dinitrofenol (DNP) – szétkapcsolja a foszforilációt és az elektron transzportláncot, oly módon, hogy megszünteti a p+ gradienst s így felszabadítja a terminális oxidációt az ATP-szintézis kontrollja alól, tehát bizonyos (kis) koncentrációban serkenti az O2felhasználást, nagyobb koncentrációban már gátlószer (membrán dezintegráció)
1
O2-elektród; Winkler-módszer E két módszerrel a légzés intenzitását vizsgáljuk. Az O2-elektród használatával az oldatba helyezett szövet légzését kísérjük figyelemmel az oldat O2-tartalmának fogyásán keresztül, míg a Winkler-módszer alkalmazásakor titrálással határozzuk meg az inkubáló oldat maradék O2-tartalmát és a kontrollhoz viszonyítva következtethetünk az inkubált szövet által elfogyasztott O2 mennyiségére. Természetesen mindkét módszert időegységre vonatkoztatjuk. A fenti gátlószerek alkalmazásával a légzés egyes folyamatai és az O2-fogyasztás, vagyis a légzésintenzitás összefüggéseit vizsgálhatjuk. 1. Légzésintenzitás mérése O2-elektród használatával Búzagyökérrel dolgozunk (kicsi, hordozható készülékhez
1,5-2 g; nagyhoz 0,2-0,3 g), de lehet használni élesztő szuszpenziót, vagy apróra (de nem túl apróra → sebzési légzés!) vágott gombát. Az inkubáló oldatban oldott O2 fogyását követjük, a kiindulási kontroll a (telített O2-tartalmú) CaSO4 oldat. A gyökereket csak a mérés megkezdése előtt kell felaprítani (és nem túl apróra), nehogy kiszáradjanak. „Hordozható készülék.”: Nyílt rendszer. 1.: Hőmérsékleti kalibrálás (T0 és T1). A 0 °C-ot jég-víz keverékkel állítjuk be. A készüléken a bekapcsoló gomb mellett (alatt) van a kalibráló gomb, állásától függően hőmérsékletre, ill. oldott O2-tartalomra lehet kalibrálni. Egy kalibráló tárcsával lehet állítani, de ha nem állítható vele a végpont, akkor a mellékelt csavarhúzóval a készülék oldalán levő kis potméter csavart lehet nagyon finoman (!) állítani. A szobahőmérsékleti pontot előzőleg pohárba töltött, kevertetett, sokáig állni hagyott deszt. vízzel lehet beállítani; ez lesz később a 100% oldott O2tartalom kalibrációs „oldata” is. 2.: O2-elektród illesztése. A kalibráló gomb átállítása után a nullpontot Na-szulfittal kevertetett (!) d.v. segítségével lehet beállítani, 100% lásd följebb. 50 ml térfogatokban mérünk, minden mérés között az elektródokat (elsősorban az O2elektródot) d.v.-zel kell mosni. Érdemes időeltolással indítani az egyes méréseket. A 0. időpontban is kell mérni, majd utána bizonyos ideig, ez lehet pl. (kb.) 10 percenként, vagy más adatok szerint a 40., a 80. és a 120. perc, de lehet rövidebb is; legalább 40-60 percig érdemes egy mintát követni. A gátlókat (ME, FE, azid) 10-4, a szétkapcsolót (DNP) min. 10-7 M cc.-ban szoktuk adni. A DNP várhatóan kb. (10-7,) 10-6, esetleg 5×10-5 M cc.-ban fog serkenteni, ennél töményebben már gátlás várható. Érdemes egyforma átmérőjű főzőpoharakat választani, így elkerülhetjük azt a hibát, hogy a különböző minták eltérő felületen érintkeznek a levegővel. Lehet mérni pl. két szabadon választott gátló különböző koncentrációit, vagy egy gátló és a szétkapcsoló különböző koncentrációit, vagy az összes gátló és a szétkapcsoló egy adott koncentrációját. A kezeletlen kontroll mellett a kezelések két párhuzamosát lehet mérni, esetleg úgy, hogy amelyik mérés nem sikerült tökéletesen, azt megismétlik. A mérés végén az O2-elektródot a készülékből kicsavarva, külön pohárba töltött d.v.-ben illik eltenni, szárazon semmiképpen sem szabad hagyni, a hőmérsékleti elektród maradhat szárazon. „Nagy” készülék. Zárt rendszer, vagyis buborékmentesen kell a mérőküvettát beállítani. A készüléket termosztálni kell (kalibrálni nem), 50, esetleg 100mV-os tartományban célszerű dolgozni, a rekordert 60cm/óra regisztrálásra érdemes állítani. 0,2-0,5 g gyökeret kb. fél centis darabokra vágva lehet mérni 7 ml térfogatban. Itt is fontos, hogy frissen felaprított gyökérrel dolgozzanak. Először a kontrollokat mérjük. Itt érdemes 20 perces inkubációkat tartani, a nullpont nem érdekes, a légzésintenzitások az oldott O2 koncentrációcsökkenését mutató „egyenesek” meredekségéből számolhatók. Kontrollt többször is lehet időközben mérni. A
2
mérés közben folyamatosan kevertetni kell az oldatot! A hőmérsékletet állandó értéken kell tartani, mert egyrészt befolyásolja az O2 oldékonyságát, másrészt a diffúziós határáramot. Az áram az (AgCl-dal borított Ag) anódtól a (Pt) katód felé folyik, az O2 a katódon redukálódik. Mindezek a két régebbi O2-elektródra vonatkoznak, az új (nyílt rendszerű) műszert nem kell termosztálni, elvileg kalibrálni sem, de lehet. Javasolt mérési mennyiség 50 ml. Élesztő használata az új oxigén-elektróddal: 0,5 g/ml élesztő szuszpenziót készítünk. (A szuszpenzióba is lehet szacharózt tenni, de valószínűleg jobb, ha csak a mérőoldatba). 50 ml mérőoldatot (kontroll, gátló, DNP), mely szacharózra nézve 4-7 g/l tartalmú (javasolt 5, de 10 g/l alatt legyen), a mérés előtt legalább 1 percig erősen kevertetünk, majd 0,5 ml élesztő szuszpenziót teszünk bele, azzal is kevertetjük egy rövid ideig és elkezdjük a mérést. A mérés közben állandó lassú kevertetést alkalmazunk. Egy mérést 10-15 percig folyamatosan követünk, percenként, vagy félpercenként leolvasva az oxigéntartalmat. A mérés után leöblítjük az elektródot, beletesszük az új mérendőbe és kezdődhet a következő mérés. A mérések után a leöblített elektródot desztillált vízben hagyjuk. 2. Légzésintenzitás mérése Winkler módszerével A Winkler-módszer alapja is a vízben oldott O2 meghatározása, itt jodometriás titrálással határozzuk meg az inkubálás után az oldatban maradt O2 mennyiségét. Itt is növényi gyökér (búza), ill. gomba lehet a minta és a fentihez hasonlóan ez is zárt rendszer, tehát levegőbuborékoktól mentesen kell kivitelezni a mérést. 1,5-2 g búzagyökér megfelelő lehet a méréshez. Itt sem szabad kiszáradni hagyni a gyökereket. A lemért és felvágott gyökereket, ill. gombát Winkler-csövekben inkubáljuk 1-1,5 órán keresztül. Ált. elég szokott lenni az egy óra is. Lehet a fenti hatóanyagokat használni (gátlók és DNP), ill. lehet a hőmérséklet hatását vizsgálni. Mindenképpen kell a kontrollból és a kezelésekből is párhuzamos mérés. A Winkler-csövek térfogata kb. 80-100 ml, ez leginkább a két végüket lezáró gumidugóktól és azok elhelyezésétől függ, mert maguk a csövek nagyjából egyformák. A térfogatot a gumidugók közti távolságból és a cső átmérőjéből lehet kiszámolni. A folyadéküvegek térfogatát is meg kell határozni. A térfogatok megtartására és ismeretére ügyelni kell! A mérés nagyon elhúzódhat, ezt leginkább úgy lehet elkerülni, ha az elején a kísérlet megtervezése és a kísérlethez szükséges oldatok elkészítése gyorsan történik. Az inkubációig kell tehát gyorsan eljutni, hiszen ez plusz egy-másfél órát jelent. A Winkler-csöveket petricsészében kell elhelyezni, hogy a kifolyó oldatok ne az asztalra folyjanak. Fontos, hogy a gumidugókkal buborékmentesen kell lezárni a csöveket (ezt érdemes még a minták hozzáadása előtt gyakorolni vízzel, vagy CaSO4-tal), ettől a ponttól indul az inkubáció. Az inkubáció alatt érdemes párszor finoman megforgatni a csöveket, hogy az inkubált minta O2ellátását elősegítsük. Amíg az inkubáció tart, meg kell határozni a telített CaSO4 oldat O2tartalmát, ezzel a titrálást is be lehet gyakorolni. 2-3 CaSO4 kontrollt kell titrálni. A keményítőt érdemes nem azonnal tenni hozzá a titrált anyaghoz. Az inkubációs idő letelte után a csöveket össze kell rázni, az egyik dugót pedig kicserélni csapos dugóra és a folyadékból leengedni az előkészített folyadéküvegbe. Természetesen csak akkor fog folyni, ha a másik dugót eltávolítjuk. A folyadéküveget pereméig töltjük, majd a csiszolatos dugójával kiszorítjuk a fölösleges folyadékot és az üveg aljára 1 cm3 lúgos jodid oldatot, majd 1 cm3 tömény MnCl2 oldatot rétegezünk (pipettaheggyel). Az üveget gyorsan és buborékmentesen lezárjuk és az aljára rétegzett oldatot többszöri lassú elfordítással összekeverjük. A Mn(OH)3 csapadékot 10(-15) perc ülepítés után, vegyi fülkében 3 cm3 25%os sósavval feloldjuk, majd az oldatot lombikba visszük át és titrálható. 1 cm3 0,005 n Na2S2O3 40 μg O2-t mér, de előfordulhat, hogy 0,01 n tioszulfáttal dolgozunk (~80 μg O2).
3
A számolásnál figyelembe kell venni a hozzáadott 1-1 cm3 reagenst, de a gyökerek térfogata elhanyagolható. A direkt végoxidázok közvetlenül légköri, molekuláris O2-t használnak föl szerves vegyületek oxidálására, élettani szerepük azonban alapvetően különbözik a terminális oxidációétól. Aktivitásukat nem kíséri ATP képződése, a felszabaduló energia hő formájában távozik. Prosztetikus csoportjuk, vagy koenzimjük leggyakrabban átmenetifém ion, vagy flavin nukleotid. Aktivitásuk többnyire nő • öregedés • kompartmentalizáció változása • védekezési mechanizmus esetén (pl. polifenol-oxidázok), de pl. a glikolsavoxidáz aktivitásának növekedése a fotoszintézis fényszakaszának erős működésekor figyelhető meg (ld. fotorespiráció).
Glikolsavoxidáz aktivitás mérése A glikolsavoxidáz a kloroplasztiszból származó glikolsavat oxidálja glioxálsavvá a peroxiszómában. Koenzimje FMN, működése során H2O2 keletkezik, melyet katalázok bontanak le. (A H2O2 képződése minden flavoproteinre jellemző) Szintézise és szabályozása fényindukált folyamat (fitokróm rendszer); fényen nevelt és etiolált (sötétben nevelt) növényeknél jelentős aktivitásbeli eltérést várunk tehát, koenzimje, az FMN hozzáadásával általában az aktivitás növelhető, bár tudnivaló, hogy a gyakorlat során elkészített „enzimkivonat” (valójában durva extraktum, amelyben sok minden van) FMN-t is tartalmaz. Fotometrálással a termék mennyiségét (cc) detektáljuk, mivel fenilhidrazinnal színes reakciókomplex keletkezik.
3. Glikolsavoxidáz aktivitás mérése 1, esetleg 2 g búza csíranövény levelet aprítunk dörzsmozsárba, ahol 3 cm3 foszfát pufferben, kevés kvarchomok jelenlétében eldörzsöljük. Először szárazon érdemes dörzsölni, esetleg kevés kvarchomokkal, később lehet hozzátenni a puffert. Ezután 3×1 cm3 pufferrel centrifugacsövekbe mossuk. Az átmosáshoz üvegtölcsért és négyrét hajtott gézlapot használunk. A centrifugálás előtt gondoskodni kell a megfelelő tömegszimmetriáról (tárázás). 4
Centrifuga: 10 perc / 6000 g. A felülúszó lesz az enzimkivonat: leöntjük a csapadékról és pufferrel, osztott kémcsőben, 10 cm3-re kiegészítjük, jégkásába ágyazva tároljuk. Elkészítjük a jegyzetben megadott reakcióelegyeket (a gátlást ált. nem vizsgáljuk), lehetőleg két párhuzamos sorozatban. Az enzimkivonat hozzáadásával elindítjuk a reakciót, amelyet 10, vagy 15 perc múlva állítunk le triklórecetsavval (30 % oldat, 0,5 cm3). A kicsapódott fehérjéket centrifugálással távolítjuk el (10000 g, 5 perc). A leöntött felülúszóhoz adunk 1 cm3 fenilhidrazint (0,3%) és 15 perc után 4 cm3 tömény sósavat (elszívófülke alatt, savpipettával!), összerázzuk, majd vízcsap alatt óvatosan lehűtjük. 1 cm3 1,5 %-os vörös vérlúgsó hozzáadása után, 20 perc várakozás elteltével lehet mérni az oldat extinkcióját 540 nm hullámhossznál, spektrofotométeren. A két mintasorhoz (fényen nevelt, ill. etiolált) 11 vak minta tartozik, célszerű az egyik vakot, majd a hozzá tartozó mintasort mérni először, utána a másik mintasort, szintén a vakkal kezdve. A színreakció részletes leírása és a számításhoz szükséges kalibrációs görbe a gyakorlati jegyzet függelékében a 235-236. oldalakon található. A kalibrációs egyenesek egyenletei: 1) x=128,85y+7,5 illetve 2) x=84,61y+19. A töréspontig, azaz y=0,26 abszorpcióig az 1., fölötte a 2. egyenlet érvényes.
Polifenol-oxidáz aktivitás mérése A szövetek sérülése, stb. során lejátszódó barnulási reakciók a polifenol-oxidázok működéséhez köthetők, fenoloidok oxidálásával kinonvegyületek képződnek, amelyek polimerizációra hajlamosak. Ez áll a legtöbb jól ismert növényi barnulási folyamat hátterében. A növény legtöbb szövetében normálisan is jelen vannak ezek a réztartalmú enzimek, de sérüléskor de novo is keletkeznek. Sok ilyen enzim van, széles szubsztrát specifitással. Élettani szerepük többek közt a védekezésben van, a keletkező kinonok mérgezőek – a kórokozón kívül többnyire a növényi sejtet is elpusztítják, így jöhetnek létre nekrotikus foltok. A keletkező kinonok sokszor színesek, pl. barnák, főként polimerizációs termékeik. Heteropolimereket is alkothatnak, sőt fehérjék is belekerülhetnek a polimerbe. 4. Polifenol-oxidáz aktivitás mérése Az előzőhöz hasonló nyers enzimkivonattal dolgozunk; a kívülről hozzáadott szubsztrát (DOPA) átalakulásával keletkező (színes) kinoidális vegyület keletkezését kísérjük figyelemmel fotométer segítségével és a reakció időbeli lefutását követjük. 5 g mintát (répa, burgonya, gomba, karalábé) dörzsmozsárban először „szárazon”, majd 5 cm3 foszfát puffer hozzáadásával homogenizálunk (többnyire nincs szükség kvarchomokra), üvegtölcsérbe helyezett, négyrét hajtott gézlapon átszűrjük, 3×2,5 cm3 foszfát pufferrel átmossuk, majd centrifugáljuk (20 perc 10000 g). A felülúszót osztott kémcsőbe öntjük át, pufferrel 10 cm3-re kiegészítjük, ez lesz az enzimkivonat, amelyet ezután jégkásába ágyazva tartunk. Normál (1 cm-es) küvettákba 2 cm3 foszfát puffert és 0,5 cm3 DOPA oldatot (1 mM) mérünk. Az enzimkivonatban nyilván jelen vannak természetes szubsztrátok is, mi azonban a
5
feleslegben kívülről hozzáadott dihidroxi-vegyület, a DOPA átalakulását fogjuk tudni mérni. A fotométeren (amennyiben a 4 utas készüléket használjuk) beállítjuk a 0 és 100% transzmisszió értékeket a beállító gombok és a vak minta (2,5 cm3 puffer + 0,5 cm3 DOPA) segítségével. A reakciót 0,5 cm3 enzimkivonat hozzáadásával indítjuk, és azonnal fotométerbe helyezzük a küvettákat. Az extinkció változását 480 nm hullámhosszon, kezdetben percenként, később hosszabb szünetekkel lehet mérni, általában elég 10 percig, de ha valamilyen anomáliát tapasztalunk, érdemes 25-30 percig is követni.
A feladat: összehasonlítani az enzimreakciók időgörbéit, összevetni a különböző minták viselkedését, elemezni a de novo enzimszintézis lehetőségét, összefüggést keresni a minták („természetes”) barnulása és a kapott eredmények között.
Aminek a tankönyvből, előadási jegyzetből stb. utána kell/lehet/ajánlatos nézni: • • •
a légzés általában légzésgátlók hatásmechanizmusa glikolsav-glioxálsav átalakuláshoz köthető folyamatok (RUBISCO, fotorespiráció, glicin-szerin anyagcsere, stb.) és kompartmentalizáció (kloroplasztisz, peroxiszóma, glioxiszóma, mitokondrium) 6
