SANDOSTATIN ÉS BOMBEZIN HATÁSA HUMÁN DUKTÁLIS EREDETŰ HASNYÁLMIRIGY SEJTVONALAKBAN

SANDOSTATIN ÉS BOMBEZIN HATÁSA HUMÁN DUKTÁLIS EREDETŰ HASNYÁLMIRIGY SEJTVONALAKBAN

Burghardt Beáta

Ph.D. értekezés

Semmelweis Egyetem témavezető: Dr. Marcsek Zoltán MTA KOKI témavezető: Dr. Varga Gábor

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Ph.D. program és MTA - KOKI, Budapest 2001

BIBLIOGRÁFIA A doktori értekezés alapját képező közlemények: 1. Burghardt B, Wenger C, Barabás K, Rácz G, Oláh A, Flautner L, Coy DH, Gress TM, Varga G. GRP-receptor mediated signal transduction, gene expression and DNA synthesis in human pancreatic adenocarcinoma cell line HPAF. Peptides, 7: 1119-28, 2001 Impakt faktor: 1,867 2. Burghardt B, Barabás K, Marcsek Z, Flautner L, Gress T, Varga G. Inhibitory effect of a long-acting somatostatin analogue on EGF-stimulated cell proliferation in CAPAN-2 cells. J Physiol (Paris), 94, 57-62, 2000 Impakt faktor: 1,339 A doktori értekezéshez szorosan kapcsolódó közlemények: 1. Burghardt B, Rácz G, Flautner L, Gress TM, Varga G. Expression of regulatory peptide receptors in pancreatic cancer cell lines. Internetes publikáció. http://www.lif.icnet.uk/axp/mphh/biomed/index.html 2. Burghardt B, Kisfalvi K, Varga G, Papp M. Agonists and antagonists of regulatory peptides as tools to study regulation of pancreatic exocrine secretion, cell proliferation and gene expression. Scand J Gastroenterol Suppl. 228: 11-20, 1998 Impakt faktor: 2,36 3. Wallrapp C, Hähnel S, Müller-Pillasch F, Burghardt B, Iwamura, T, Ruthenbürger M, Lerch MM, Adler G, Gress TM. A novel transmembrane serine protease (TMPRSS3) overexpressed in pancreatic cancer. Cancer Research 60: 10, 2602-6, 2000 Impakt faktor: 8,614 A doktori értekezéshez szorosan nem kapcsolódó egyéb közlemények: 1. Blazsek J, Offenmüller K, Burghardt B, Kisfalvi I, Birki K, Wenczl M, Varga G, Zelles T. Content compensation possibility of epidermal growth factor of saliva in rat. Inflammopharmacology, 4: 279-295, 1996 2. Kisfalvi K, Burghardt B, Varga G, Papp M. A hasnyálmirigy-szövet védelmét befolyásoló tényezők kritikai értelmezése. Orvosi Hetilap, 137, 15, 787-791, 1996 3. Lohinai Zs, Burghardt B, Zelles T, Varga G. The effects of L-arginine/nitric oxide pathway on salivary amylase and fluid secretion in conscious rats. J Physiol (Paris), 91: 217221, 1997 Impakt faktor: 0,707

2

4. Lohinai Z, Burghardt B, Zelles T, Varga G. Nitric oxide modulates salivary amylase and fluid, but not epidermal growth factor secretion in conscious rats. Life Sci. 64(11): 953-63, 1999 Impakt faktor: 1,774 5. Varga G, Kordas K, Burghardt B, Gacsályi I, Szénási G. Effect of deramciclane, a new 5HT receptor antagonist, on cholecystokinin-induced changes in rat gastrointestinal function. Eur J Pharmacol. 367(2-3): 315-23, 1999 Impakt faktor: 2,047 6. Gresz V, Burghardt B, Ferguson CJ, Hurley PT, Takács M, Nielsen S, Varga G, Zelles T, Case RM, Steward MC. Expression of aquaporin 1 (AQP1) water channels in human labial salivary glands. Arch Oral Biol. 44 Suppl 1: S53-7, 1999 Impakt faktor: 1,04 7. Kisfalvi I, Burghardt B, Bálint A, Zelles T, Vizi ES, Varga G. Antisecretory effects of galanin and its putative antagonists M15, M35 and C7 in the rat stomach.J Physiol (Paris) 94, 37-42, 2000 Impakt faktor: 1,339 8. Kordás K, Burghardt B, Kisfalvi K, Bardocz S, Pusztai A, Varga G. Diverse effects of phytohaemagglutinin on gastrointestinal secretions in rats. J Physiol (Paris) 94, 31-36, 2000 Impakt faktor: 1,339

3

I. TARTALOMJEGYZÉK I. TARTALOMJEGYZÉK _________________________________________________ 4 II. RÖVIDÍTÉSEK_______________________________________________________ 6 III. ÖSSZEFOGLALÁS ___________________________________________________ 8 IV. SUMMARY __________________________________________________________ 9 V. IRODALMI ÁTTEKINTÉS _____________________________________________10 V.1. GASZTROINTESZTINÁLIS HORMONOK ÉS NEUROPEPTIDEK ___________________ 10 V.1.1. A GASZTROINTESZTINÁLIS PEPTIDEK BIOSZINTÉZISE ÉS TERMELŐDÉSÜK HELYE

__________________________________________________________ 13

V.1.2. A GASZTROINTESZTINÁLIS PEPTIDEK HATÁSMÓDJAI __________________ 14 V.2. A SZOMATOSZTATIN ________________________________________________ 16 V.2.1. EGF ÉS SZOMATOSZTATIN KAPCSOLATA ___________________________ 24 V.3. A BOMBEZIN ______________________________________________________ 26 V.3.1. A GRP RECEPTOROK ÉS A G-FEHÉRJÉK KAPCSOLATA __________________ 29 V.4. A SZOMATOSZTATIN ÉS A BOMBEZIN LEHETSÉGES SZEREPE A HASNYÁLMIRIGY DAGANATOK KIALAKULÁSÁBAN ______________________________________

31

VI. CÉLKITŰZÉSEK____________________________________________________ 33 VII. ANYAGOK, MÓDSZEREK __________________________________________ 34 VII.1. KÍSÉRLETI MODELLÜNK: A SEJTVONALAK ______________________________ 34 VII.2. RNS IZOLÁLÁSA A SEJTVONALAKBÓL __________________________________ 34 VII.3. RECEPTOROK KIMUTATÁSA REVERZ-TRASZKRIPTÁZ POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓVAL _______________________________________________________________ 35 VII.3.1. A RECEPTOROK KLÓNOZÁSA ÉS SZEKVENÁLÁSA ___________________ 36 VII.5. AZ INTRACELLULÁRIS SZABAD KALCIUM-KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA ____ 39 VII.6. AZ INTRACELLULÁRIS CAMP-SZINT MEGHATÁROZÁSA _____________________ 40 VII.7. GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOK _____________________________________ 40 VII.8. AZ ADATOK STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉSE ________________________________ 41 VIII. EREDMÉNYEK ___________________________________________________ 42 VIII.1. SZOMATOSZTATIN ÉS BOMBEZIN RECEPTOROK KIMUTATÁSA HASNYÁLMIRIGY SEJTVONALAKBAN

________________________________________________ 42

VIII.2. A PEPTIDKEZELÉSEK HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA ___________________ 43 4

VIII.2.1. EGF KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA ___________________ 43 VIII.2.2. SZOMATOSZTATIN KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA ________ 44 VIII.2.3. BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA ______________ 46 VIII.3. AZ INTRACELLULÁRIS SZABAD KALCIUM-KONCENTRÁCIÓ VÁLTOZÁSA BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSÁRA

_______________________________________________ 49

VIII.4. A CAMP SZINT VÁLTOZÁSA BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSÁRA_________________ 51 VIII.5. GÉNEXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSOK BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSÁRA ____________ 52 IX. MEGBESZÉLÉS ____________________________________________________ 55 IX.1. A SZOMATOSZTATIN, MINT GÁTLÓ BIOAKTÍV ANYAG SZEREPE A DAGANATOS SEJTEK OSZTÓDÁSÁNAK CSÖKKENÉSÉBEN ____________________________________

55

IX.2. A BOMBEZIN, MINT SERKENTŐ BIOAKTÍV ANYAG SZEREPE A DAGANATOS FOLYAMATOK KIALAKULÁSÁBAN

_____________________________________ 57

IX.2.1. A BOMBEZIN RECEPTOR-ANTAGONISTÁK HATÁSAI __________________ 62 X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS___________________________________________ 64 XI. IRODALOMJEGYZÉK _______________________________________________ 65 XII. MELLÉKLETEK ___________________________________________________ 76

5

RÖVIDÍTÉSEK

II. RÖVIDÍTÉSEK 2+

[Ca ]i BARK BBS bFGF BIM-23127 BME bp. BRS3-4=BB1-4 Ca2+ cAMP CCK cDNS c-fos, c-myc DEPC DG DNS DTT ECL EGF EGFR GDP GI GIP GRB2 GRP GRPR GTP HER-2,3,4=c-erbB-2,3,4 HMG-I(Y) IGF-1 IP3 MAPK MOT mRNS NCBI NMB NMBR PDGF PI-3-kináz PIP2 PKC PLC-b, g PP Raf-1 Ras-GTP

intracelluláris kalcium ion béta-adrenerg receptor kinázok bombezin „Basic fibroblast growth factor” H-Nal-cyclo-[Cys-Tyr-Trp-Orn-Val-Cys]-Nal-NH2 D-Phe6-bombezin(6-13)-metil-észter bázispár bombezin receptor altípus 1-4 kalcium ion ciklikus adenozin monofoszfát kolecisztokinin kópia DNS celluláris proto-onkogén dietil-pirokarbonát diacil-glicerol dezoxiribonukleinsav ditiotreitol enterokromaffin szerű sejtek Epidermális növekedési faktor Epidermális növekedési faktor receptor guanozin-difoszfát gasztrointesztinális traktus glükóz dependens inzulinotróp peptid „Growth factor receptor bound protein 2” „Gastrin-releasing peptide” „Gastrin releasing peptide” receptor guanozin-trifoszfát EGF receptor altípus 2, 3, 4 „High Mobility Group protein” I és Y splice variánsai „Insulin-Like Growth Factor-I” inozitol-1,4,5-triszfoszfát mitogén aktivált protein kináz motilin messenger RNS National Center for Biotechnology Information Neuromedin B Neuromedin B receptor „Platelet-Derived Growth Factor” foszfatidilinozitol-3-kináz foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát protein kináz C foszfolipáz C-b, g pankreász polipeptid szerin-treonin kináz GTP-t kötő, aktivált Ras onkogén

6

RÖVIDÍTÉSEK

RNS RT-PCR SOC medium SOS SS = SRIF SS-14, SS-28 SSTR1-5 TGF-α, β UV

ribonukleinsav reverz traszkriptáz polimeráz láncreakció 20 g/l bakto-tripton, 5 g/l élesztő kivonat, 0.5 g/l NaCl, 0.186 g/l KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM glükóz „son of sevenless” szomatosztatin = „somatotropin release-inhibitor factor” szomatosztatin, 14 illetve 28 aminosavból álló formái szomatosztatin receptor altípus 1-5 „Transforming Growth Factor- α, β” ultraviola

7

ÖSSZEFOGLALÁS

III. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk során gasztrointesztinális peptideknek a sejtosztódás sejt- és molekuláris szintű szabályozásában betöltött szerepét tanulmányoztuk humán, duktális eredetű hasnyálmirigy sejteken. Elsőként a hosszú féléletidejű szomatosztatin analóg Sandostatin sejtosztódást gátló hatását vizsgáltuk a duktális eredetű hasnyálmirigy adenokarcinóma Capan-2 sejtvonalon. A Sandostatin hatását közvetítő, élettani szempontból legjelentősebb SSTR2 receptor jelenlétét RT-PCR módszerrel mutattuk ki. Eredményeink szerint a Sandostatin kezelés szignifikáns mértékben csökkenti az epidermális növekedési faktorral (EGF) osztódásra serkentett Capan-2 sejtek DNS-szintézisét. A másik vizsgált neuropeptid a bombezin, mint növekedési faktor hatása jól ismert különböző humán daganatokban, melyet leginkább GRP vagy NMB típusú bombezin receptorokon keresztül fejt ki. Trofikus hatása a patkány hasnyálmirigy acinus sejteken közismert, azonban emberből származó, duktális eredetű normál vagy daganatos sejteken még nem térképezték fel részletesen. RT-PCR segítségével GRP receptorok mRNS-ének nagy mennyiségben való jelenlétét mutattuk ki HPAF sejteken, míg alacsonyabb szintjét MiaPaCa-2, Capan-1, és Capan-2 sejteken. Az NMB receptor mRNS-sek közel azonos, igen alacsony szinten voltak kimutathatóak a négy sejtvonalon. További vizsgálatainkat az HPAF sejtvonalon végeztük. A bombezin kezelés hatására bekövetkező sejtproliferációs változásokat [3H]-timidin beépüléssel követtük; a c-fos, c-myc és HMG-I(Y) gének expressziós szintjének változását Northern hibridizációs technikával mutattuk ki. A bombezin által aktivált szignáltranszdukciós utak feltérképezését cAMP radioimmun méréssel és intracelluláris szabad Ca2+-szint meghatározásával végeztük. Mindezen hatásokat a specifikus GRP receptor antagonista BME és NMB receptor antagonista BIM-23127 jelenlétében is megvizsgáltuk. Eredményeink szerint a bombezin fokozza a sejtek osztódását és időfüggő módon, differenciálisan növeli meg a c-fos, c-myc korai gének és HMG-I(Y) gén mRNS-szintjét a funkcionálisan aktív GRP receptorral rendelkező HPAF sejtekben. Hatását a gyorsan mobilizálódó intracelluláris szabad kalciumszint növelésén keresztül fejti ki. Mindezek alapján feltételezzük, hogy a bombezin proliferációt serkentő hatása a GRP receptorokon keresztül jön létre HPAF sejtekben.

8

SUMMARY

IV. SUMMARY In our work we examined the effects of gastrointestinal peptides on the cellular and molecular events regulating cell proliferation in pancreatic ductal cells. First, the inhibitory effects of Sandostatin, a long-acting somatostatin analogue, were investigated on Capan-2 which are a human adenocarcinoma cell line of ductal origin. Somatostatin-2 receptors (SSTR2), which mediate the effects of Sandostatin and are biologically the most important, were identified in these cells by RT-PCR. We therefore examined the effects of Sandostatin treatment on [3H]-thymidine incorporation in Capan-2 cells stimulated with epidermal growth factor (EGF). Our data show that DNA synthesis in Capan-2 cells decreased significantly when EGF treatment was combined with Sandostatin administration. The other peptide investigated was bombesin which has been implicated as a growth factor in various human cancers. It is thought to act through gastrin-releasing peptide (GRP) and/or neuromedin B (NMB) receptors. The trophic action of bombesin on pancreatic acinar cells is well documented but its effect on normal and cancerous ductal cells is less clear. We first tested four pancreatic adenocarcinoma cell lines of ductal origin (Mia-PaCa-2, Capan1, Capan-2, HPAF) to determine whether they express GRP and/or NMB receptors. Using RT-PCR we found the highest level of GRP receptor mRNA in HPAF cells. NMB receptor mRNA expression was moderate in all of the cell lines. HPAF cells were therefore selected for further investigation. Using Northern hybridisation we examined the effects of bombesin on the expression of the immediate-early genes c-fos and c-myc, and the high-mobility-group protein-IY (HMG-IY), a chromosomal protein involved in transcriptional regulation. To test the effect of bombesin on DNA synthesis, [3H]-thymidine incorporation was measured in the presence or absence of the peptide and its specific antagonists. Microfluorometry with fura-2 showed that bombesin induced rapid mobilization of intracellular Ca2+. Intracellular cAMP, measured by radioimmunoassay, was not affected by bombesin although it was raised by forskolin. Bombesin administration stimulated time-dependent expression of c-fos, c-myc and HMG-(IY) and also enhanced [3H]-thymidine incorporation. All of the actions of bombesin were blocked by BME, a selective GRP receptor antagonist, but not by the NMB receptor antagonist BIM-23127. Our data suggest that HPAF cells express high levels of GRP receptor mRNA resulting in membrane incorporation of functional GRP receptors. Occupation of these receptors leads to mobilization of intracellular Ca2+, expression of c-fos, c-myc and HMG-(IY), and stimulation of cell proliferation. We conclude that gastrointestinal peptides have significant regulatory effects on cell proliferation in pancreatic duct cells and may therefore contribute to the aetiology of pancreatic cancer and provide possible targets for therapeutic intervention. 9

IRODALMI ÁTTEKINTÉS

V. IRODALMI ÁTTEKINTÉS V.1. GASZTROINTESZTINÁLIS HORMONOK ÉS NEUROPEPTIDEK Az endokrinológia alapgondolata, miszerint a vér által közvetített sejt- vagy szövetműködés szabályozása specifikus közvetítő anyagok által jön létre, 1902-ben született meg a brit William Maddox Bayliss és Ernest Henry Starling felfedezése nyomán (10, 11). Pavlov és munkatársai megfigyeléseire alapozva, mely szerint a felső béltraktus savasodása a hasnyál elválasztásához vezet (111), kettejüknek sikerült a duodenális mukózából egy olyan anyagot izolálni, mely a vérbe jutva stimulálta a hasnyálmirigy bikarbonát szekrécióját. A stimuláció független volt a hasnyálmirigy idegi ellátottságától. Ezt az elsőként jellemzett hormont szekretinnek nevezték el. A felfedezést követően 1905-ben Starling javasolta a „hormon” szó használatát, mindazokra az anyagokra, amelyek a vér által szállítva, mint kémiai közvetítők fejtik ki hatásukat (139). Még ugyanebben az évben John Sidney Edkins, egy az antrális mukózából származó anyagot, mint a savszekréciót fokozó hormont írt le (34). Ez volt a „gastric secretin”, vagy röviden gasztrin. Az előbb leírtakból is jól kitűnik, hogy az elsőként azonosított hormonok a gasztrointesztinális traktusból származó hormonok voltak. A következő évtizedekben számos más hormon felfedezése történt meg, de az emésztés hormonális szabályozásában betöltött szerepük iránt az érdeklődés lecsökkent. 1928-ban Andrew Ivy a vékonybélből kivont kolecisztokininről (CCK), mint az epehólyag kiürüléséért felelős hormon jelenlétéről szolgáltatott döntő bizonyítékokat (59). A szekretin, a gasztrin és a kolecisztokinin alkotják a klasszikus bélhormonok „trojkáját”. Ezeket a hormonokat jellemezték először mind hatásmódjuk, mind szerkezeti tulajdonságaik alapján (53, 102, 103). A klasszikus biológia szerint a bélhormonok olyan anyagok, melyeket a proximális béltraktusban található, egy adott tulajdonsággal rendelkező endokrin sejtek termelnek. Specifikus ingerek hatására e sejtekből hormonok választódnak ki a vérbe, így a vér közvetítése révén jutnak el az akut válasszal (pl. szekréció, izomkontrakció) reagáló célszervekhez és célsejtekhez.

10


A kezdetben kutyákon végzett egyszerű, élettani kísérletek során számos gasztrointesztinális hormont azonosítottak. Ezeket általában funkciójuk és megtalálásuk helye alapján nevezték el (pl. inkretin, enterogasztron, villikinin, stb.). Később az 1970-es évek elején, amikor a „trojka” tagjai már „tiszta” fehérjékként is a rendelkezésre álltak, bonyolultabb kísérletek elvégzésére is lehetőség nyílt. Ekkor bizonyították, hogy számos hormonhatás magyarázható anyagok közötti kölcsönhatással, illetve, hogy egy eddig még ismeretlen, új hormon hatásairól van szó. A gasztrointesztinális endokrinológia 1970 óta számos új, szabályozó peptid megismerésével bővült (hormonok, peptid transzmitterek, növekedési faktorok).

Szám

Év 1. Ábra: A gasztrointesztinális traktusban napjainkig felfedezett szabályozó peptidek Rehfeld szerint (116)

11


A szerkezeti hasonlóságuk alapján hét családba sorolták a peptideket. Szekretin család Szekretin Glükagon* Glükagon-szerű peptidek* „Gastric inhibitory” polipeptid Vazoaktív intesztinális polipeptid (VIP)* Peptid hisztidin izoleucin* Növekedési hormont termelő hormon Hipofízis adenil-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP)

Gasztrin család Gasztrin Kolecisztokinin Cearulein† Cionin†

Inzulin család Inzulin Inzulin-szerű növekedési faktor I Inzulin-szerű növekedési faktor II Relaxin

Tachikinin család Substance P Neurokinin A Neurokinin B

PP-fold család Pankreász polipeptid Peptid YY Neuropeptid Y

Szomatosztatin család Szomatosztatin Kortikosztatin

EGF család Epidermális növekedési faktor Transzformáló növekedési faktor α Amfiregulin

* A peptideket egy gén kódolja † Emlősben nem találhatók meg

1. Táblázat: A gasztrointesztinális peptidcsaládok (116)

A további kutatások során derült fény arra, hogy a bélből izolált, hormon tulajdonságokkal rendelkező peptidek nagy része az idegsejtekben is megtalálható, melyekből felszabaduló peptidek valódi mediátor és/vagy neuromodulátor szerepet fejthetnek ki. Emellett a hormonként keringő peptidek befolyásolhatják az idegsejtek funkcióját, és azokból különböző neuropeptidek vagy egyéb mediátorok felszabadulását is kiválthatják. Mivel a hormonális és idegi szabályozás szerves egységet képez, ezért a gasztrointesztinális hormon kifejezés helyett a gasztrointesztinális peptid vagy neuropeptid kifejezés kezd egyre inkább elterjedni (91).

12


V.1.1. A GASZTROINTESZTINÁLIS PEPTIDEK BIOSZINTÉZISE ÉS TERMELŐDÉSÜK HELYE A klasszikus módon ható hormonok jellegzetes regionális megoszlást mutatnak. Az étel hatására korán felszabaduló hormonok általában a gyomor-bél traktus felső részén helyezkednek el: a gasztrin dominálóan az antrum „G” sejtjeiben, a CCK, a szekretin, és a glükóz-dependens inzulinotróp peptid (GIP) főként a duodenum és a jejunum „I”, „S”, illetve „GIP” sejtjeiben termelődnek. A gyomor-bél traktus disztális részén elhelyezkedő peptideknek (peptid YY, neurotenzin és enteroglükagon) fontos szerepük van az emésztés késői fázisainak szabályozásában. Az ileumból felszabaduló peptid YY például lassítja a gasztrointesztinális traktus motilitását, növeli az étel-mukóza érinkezési idejét, és jelentősen hozzájárul az emésztés és felszívódás javításához. Ezt a mechanizmust „ileal brake”-nek is nevezik. A parakrin módon ható peptidek nem mutatnak ilyen jellegzetes megoszlást, az egész béltraktus területén és a hasnyálmirigyben elszórtan helyezkednek el. A neurotranszmitterként ható peptidek a plexus myentericusban és a submucosus plexusban találhatók. A peptidek társulva, kolokalizációban is elhelyezkedhetnek; jó példa erre a neuropeptid Y és a noradrenalin együttes előfordulása (91). Az anatómiailag különböző struktúrákban elhelyezkedő peptidek között tág lehetőség nyílik a kölcsönhatásokra, melyeknek óriási szerepe van a gasztrointesztinális működés szabályozásában (91). A gasztrointesztinális endokrinológia fejlődésében döntő jelentőségű volt a peptidhormonok tisztítása, szerkezetük meghatározása és szintézisük megvalósítása. Szintetikusan előállított peptidek felhasználásával tisztázták a hormonok biológiai hatásait, és radioimmun

eljárások

kidolgozásával

megindult

fiziológiás

szerepük

kutatása.

A géntechnológia fejlődésével lehetőség nyílt a peptidek szintézisét kódoló DNS struktúrák meghatározására

is.

A

genetikai

kód

megfejtése

lehetővé

tette

a

peptidek

aminosavösszetételének meghatározását, ipari szintézisük megvalósítását és a bioszintézis lépéseinek tisztázását. A genetikai kód ismeretében végzett vizsgálatok során derült ki, hogy például a „G”-sejteken belül a gasztrin prekurzor polipeptid molekula (preprogasztrin) szintetizálódik először, amelyből a biológiailag aktív gasztrin molekula poszttranszlációs folyamat során képződik. A fenti mechanizmus érvényesül a többi hormon esetében is (pl. preprokolecisztokinin, preproglükagon). A sejtmembránokon történő vándorlás során

13


először lehasad az ún. szignál peptid, melynek eredménye a prohormon. A biológiailag aktív peptid a prohormonban foglal helyet, melyet mind a C-, mind az N-terminális végén egy-egy ún. „flanking peptid” egészít ki. A „flanking peptideket” tripszin-szerű aktivitással rendelkező endopeptidázok hasítják le. A biológiai aktivitás szempontjából ekkor zajlik le egy döntő mozzanat; az endopeptidáz hatás során a C-terminális bázikus aminosavat egy karboxipeptidáz lehasítja, majd az időközben aktiválódó amidáló enzim amidálja. A gasztrointesztinális hormonokra tehát jellemző az amidált forma. Az, hogy milyen hormon képződik a bioszintézis során, függ a szövetspecifikus poszttranszlációs folyamatoktól is. Jó példa erre, hogy az azonos gén által szintetizált preproglükagonból, ill. proglükagonból a hasnyálmirigy α-sejtjeiben pankreász-glükagon, míg az „L”-sejtekben enteroglükagon képződik. Az endokrin sejtekből kijutó nagyobb molekulatömegű hormonokból a plazmában hasadnak le a különböző kisebb molekulatömegű peptidek, melyek hatástartama eltérő lehet (91). V.1.2. A GASZTROINTESZTINÁLIS PEPTIDEK HATÁSMÓDJAI A gasztrointesztiális peptidek hatásukat legalább négyféleképpen, endokrin, neurokrin, parakrin, és autokrin (91) módon fejtik ki. A legújabb kutatások szerint azonban emlős sperma sejtekben úgynevezett spermiokrin (116) módon is felszabadulhatnak bioaktív peptidek. Endokrin

Neurokrin

Parakrin

Spermiokrin

Autokrin

2. Ábra: A gasztrointesztinális peptidek lehetséges hatásmódjai (118)

14


Az endokrin módon ható peptidek a véráram útján jutnak el a célsejtekhez; míg a neurokrin

módon

hatók

az

idegvégződésekből

felszabadulva,

a

klasszikus

neurotranszmitterekhez, illetve neuromodulátorokhoz hasonlóan fejtik ki hatásukat. A parakrin hatásmód, mely elnevezést először Feyrter (42) javasolta a harmincas évek elején arra utal, hogy az endokrin sejtekből lokálisan felszabaduló peptidek a közvetlen szomszédságukban

elhelyezkedő

sejtekre

hatva

fejtik

ki

hatásukat

(79).

Az önstimuláció vagy autokrin hatásmód kifejezést Sporn és Todaro (138) vezette be a köztudatba olyan peptidet szecernáló sejtek esetére, amelyek saját magukra hatnak vissza. Ez a mechanizmus

döntő

fontosságú

a

tumorképződés

folyamatában

(137).

Az

első

megfigyeléseket épp a gastrin-releasing peptide (GRP) autokrin stimulációja kapcsán tapasztalták kissejtes tüdőrák esetén (30, 82).

Endokrin peptidek Szomatosztatin#

Neurokrin peptidek Szomatosztatin#

Kolecisztokinin*#

Kolecisztokinin#

Szomatosztatin# Peptid YY#

Gasztrin*

„Gastrin-releasing peptide” Opioidok „Substance P” Vazoaktív intesztinális peptid Neuropeptid Y Neurotenzin Peptid HM Pankreasztatin Galanin Motilin Peptid YY#

*klasszikus

PACAP

peptidek

Szekretin Inzulin* Glükagon* Enteroglükagon Pankreász-polipeptid Neurotenzin Motilin* GIP* Peptid YY# Urogasztron/EGF

Parakrin peptidek

#multiplex

hormonhatású hatású peptidek

2. Táblázat: A peptidek csoportosítása hatásmódjuk alapján (91)

15


V.2. A SZOMATOSZTATIN 1973-ban izolálták juh hipotalamuszából azt a növekedési hormon termelődését gátló anyagot, melyet szomatosztatinnak (SS), vagy más néven SRIF-nek (somatotropin releaseinhibitor factor) neveztek el (15). Később felfedezték, hogy a peptid számos egyéb szervben is megtalálható a szervezetben. Többek között a központi idegrendszerben, ahol, mint neurotranszmitter hatással van a lokomotoros aktivitásra és a kognitív funkciókra (117), és a gasztrointesztinális traktusban, ahol nemcsak specializált endokrin sejtekben, hanem neuronokban is kimutatható. A szervezetben a natív peptid két biológiailag aktív formában van jelen, amelyek 14 illetve 28 (SS-14, SS-28) aminosavat tartalmazó ciklikus peptidek. Középen egy diszulfid híd található a peptidekben (3. Ábra). E rövid peptidek a 116 aminosavból álló preproszomatosztatinból a sejtekben lévő hasítóenzimek segítségével alakulnak ki (60).

3. Ábra: A szomatosztatin szerkezete

A szomatosztatinnak számos szintetikus, lineáris vagy ciklikus peptid analógja és nem peptid analógja (pl. alkaloidok) létezik, melyek közül legismertebb az octreotide acetát (SMS 201-995) vagy más néven Sandostatin® (4. Ábra). Ismert még a CH-275, a NC8-12, a seglitide (MK 678), a lanreotide (BIM23014), a vapreotide (RC-160), a BIM23023, a BIM23052, a BIM23056, a BIM23068, a BIM23268, a BIM23295, a BIM23313, az L-362,855 és a hazai fejlesztésű TT-232 (130, 143). Az analógok kedvező tulajdonsága, hogy féléletidejük többszöröse az SS-nek. Az octreotide-nak pl. másfél óra, szemben az SS 1-2 perces féléletidejével. Az analógok ezért nemcsak in vitro kísérletekben, de terápiásan is jó hatásfokkal alkalmazhatók (141, 142, 160, 161).

16


A szomatosztatinnal végzett kísérletek legnagyobb akadálya, hogy nem ismertek a receptorokra specifikus antagonisták. Bár a legújabb kutatások szerint az MK 678 tengerimalac szívben gátolta a SS-28 hatását (117), az L-362,855 pedig AtT-20 sejtekben az SSTR5 specifikus antagonistájaként viselkedett (117). Bass és munkatársai (6) a SSTR2 antagonistájaként egy diszulfid hidat tartalmazó ciklikus oktapeptidet [Ac-4-NO2-Phec(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys)-D-Tyr-NH2] jellemeztek. Sandostatin® = Octreotide acetát

4. Ábra: A Sandostatin szerkezete

Schonbrunn és Tashijan nagy affinitású és funkcionális szomatosztatin receptorokat először GH4C1 patkány hipofízis sejtvonalban mutatott ki (117). Később agyban, hipofízisben, mellékvesében, endokrin és exokrin hasnyálmirigyben, a gasztrointesztinális traktusban és számos sejtvonalban is kimutatták e receptorokat. Több, mint egy szomatosztatin receptor jelenlétét feltételezték, mert 21000-228000 molekulatömegű fehérjéket izoláltak. Jelenlegi ismereteink szerint 5 különböző gén kódolja az öt különböző szomatosztatin receptort (SSTR1-5), melyek mindegyike hét transzmembrán doménnel rendelkező glikoprotein. Legnagyobb hasonlóságot (30%) az opioid receptorokkal mutatnak. Az egyes SS receptorok egyedi farmakológiai tulajdonságokkal jellemezhetők, közöttük 45-61%-os homológia figyelhető meg. Fajok közötti különbségeket is leírtak; legkonzerváltabb a SSTR1 (97%-os homológia ember és rágcsálók között), míg legeltérőbb a SSTR5 (81%-os homológia ember és patkány között) (117).

17


Szomatosztatin Receptorok

Aminosavhossz

Specifikus ligandjuk

Kromoszómákon való elhelyezkedésük

SSTR1

391

Nincs

14q13

SSTR2

369

NC8-12, MK

17q24

SSTR3

418

BIM23056

22q13.1

SSTR4

388

Nincs

20p11.2

SSTR5

364

BIM23052,

16p13.3

*

L362,855 *Patkány SSTR5-re specifikus (117)

3. Táblázat: A szomatosztatin receptorok főbb tulajdonságai (119)

Az egyes receptorok mRNS-einek szöveti megjelenését Northern-blottal, RNáz védelem (RNase protection) és RT-PCR módszerrel is vizsgálták (117). Ezeket a 4. Táblázatban foglaltuk össze: Receptor Típus SSTR1 SSTR2 SSTR3 SSTR4 SSTR5

Faj Humán

Szövetek Vékonybél, gyomor, tüdő

Patkány

Agy, petefészek1

Humán

Agy, vese

Patkány

Agy, hipofízis, mellékvese

Humán

Agy

Patkány

Agy, hasnyálmirigy szigetek, prosztata1, izom1

Humán

Agy

Patkány

Agy, szív1, tüdő1

Humán

Hipofízis

Patkány

Hipofízis, szem1, máj1

1 (96)

4. Táblázat: A szomatosztatin receptorok szöveti elhelyezkedése (119, 98)

18


A szomatosztatin és analógjai receptoraikhoz kötődve G-fehérjéken keresztül, közvetve és/vagy közvetlenül hozzák létre gátló hatásukat a sejteken. A fő útvonalak a következők: 1. A Gαi1 fehérjét aktiválva az adenilát-cikláz aktivitást és ezáltal a cAMP szintet csökkenti a sejtben. 2. A Gαi3 fehérjéhez kapcsolódva K+-csatornákat nyit meg, így a sejtet hiperpolarizálja, ezáltal gátolva a feszültségfüggő Ca2+-csatornák kinyílását és a kalcium beáramlását a sejtbe. 3. A Gα02 fehérjén keresztül közvetlenül gátolja a feszültségfüggő Ca2+-csatornák megnyitását (70). 4. Szabályozza a Na+/H+ exchanger működését (96). 5. Szabályozza a szerin/treonin, tirozin és Ca2+-függő foszfatázok aktivitását (14). 6. Szabályozza a cGMP-függő protein kinázok aktivitását (96). Emellett egy ligand egy adott receptorhoz kötődve képes pertussis toxin érzékeny és nem érzékeny G-fehérjével is reakcióba lépni. A heterogén sejtvonalakon belüli receptor/G-fehérje/effektor molekulák közti kölcsönhatás azonban még nem bizonyítja e folyamatok in vivo lejátszódását is(117). A SSTR1 nagy affinitással köti a SS-t és a SS-28-at, és kapcsolódik az adenilát-cikláz jelátviteli útvonalhoz. Az SSTR2 szintén nagy affinitással köti ezeket a molekulákat és az MK 678-at is. Egérben a receptor „alternatív splicing” változatait is leírták (SSTR2A és SSTR2B) (117). Tirozin-foszfatázok révén az SS antiproliferatív hatását közvetíti (21), az adenilát-cikláz útvonalon keresztül a cAMP-szintet csökkenti, bár e folyamat ellenkezőjéről is beszámoltak (117). Az SSTR3-hoz nagy affinitással kötődik a SS és a SS-28, kisebb affinitással az MK 678 és az octreotide és szelektíven, csak ehhez a receptorhoz a BIM23056. A receptort aktiváló szomatosztatin a Gαi1 és Gαi3 G-fehérjéken keresztül fejti ki az adenilát-cikláz aktivitás gátlását.

19


Az SSTR4 61%-ban felel meg a SSTR1-nek, ennek megfelelően nagy affinitással köti a SS-t, a SS-28-at, kis affinitással a szintetikus analógokat. A receptorra specifikus agonistát még nem sikerült találni, de itt is a receptor és az adenilát-cikláz út kapcsolatát feltételezik (117). Az SSTR5 különleges farmakológiai tulajdonságokkal rendelkezik; nagyobb affinitással köti a SS-28-at, mint a SS-t. Az analógok közül az SSTR5-höz 100-szor jobban kötődik az L362,855, mint a többi receptor altípushoz. Az agonisták hatásai ennél a receptornál is az adenilát-cikláz aktivitás gátlása révén, illetve a feszültség-függő kalcium csatornák gátlása révén jön létre AtT-20 sejtekben (117). A szomatosztatin antiproliferatív hatásait a SSTR2 a foszfotirozin-foszfatáz aktivitás (21, 22), míg a SSTR5 az inozitol-foszfolipid/kalcium útvonal, illetve a szerin/treonin foszfatázok szabályozásán keresztül közvetíti (96).

Receptor altípusok SSTR1

Közvetítők Pertussis érzéketlen Pertussis érzékeny Gαi3 Pertussis érzékeny

SSTR2

SSTR3

SSTR4 SSTR5

Gαi1 Gαi2 Gαi3 Gα0(2β1/γ2) Gαi1 β/γ Gα0 β/γ Gα14, Gα16 Pertussis érzékeny Pertussis érzékeny

Effektorok Na /H exchanger gátlása PLC aktiválása Foszfotirozin-foszfatáz aktivitás szabályozása Adenilát-cikláz gátlása Foszfotirozin-foszfatáz aktivitás szabályozása PLC aktiválása Adenilát-cikláz gátlása ? K+-csatorna Ca2+-csatorna Adenilát-cikláz gátlása PLC-β3 aktiválása Adenilát-cikláz gátlása PLC-β3 aktiválása PLC aktiválása Adenilát-cikláz gátlása, aktiválása* MAPK kináz kaszkád aktiválása Adenilát-cikláz gátlása PLC aktiválása Szerin/treonin foszfatázok aktiválása +

+

*Egyes tanulmányok eltérő következtetéseket vontak le.

5. Táblázat: A receptor altípusok kapcsolódása az egyes jelátviteli utakhoz (98)

20


A receptorok az agonistákkal történt kapcsolódást követően 3-4 óra alatt a bétaadrenerg receptor kinázok (BARK) révén foszforilálódnak, melynek végeredménye a receptorok deszenzitizálódása (érzéketlenítése) S49 limfóma sejtekben (117). Ez, illetve a receptorok „downregulációja” magyarázhatja, hogy számos esetben a betegek nem reagálnak a neuroendokrin, hipofízis és gasztro-entero-pankreász tumorok esetén alkalmazott octreotide terápiára (96). Az öt receptor közül úgy tűnik, hogy a SSTR2 az élettani szempontból legjelentősebb receptor altípus, mely közvetíti a szomatosztatin gátló hatását a növekedési-hormon felszabadulására (114), a gyomorsav- (121) és glükagon szekrécióra, az antrumból történő hisztamin felszabadulására, az ECL sejtekből a gasztin felszabadulására, és a vastagbél ionszekréciójára (96). Az SSTR2 közvetíti a szomatosztatin antiproliferatív, kognitív-erősítő és lokomotoros aktivitásra kifejtett hatásait (117) is. Fontos még a SSTR5, mely az endokrin hasnyálmirigyből az inzulin szekréció gátlását, míg a két receptor együttesen az exokrin hasnyálmirigyből az amiláz felszabadulás gátlását közvetíti (117). A gasztrointesztinális traktusban a szomatosztatin tartalmú, úgynevezett „D” sejteket először a gyomorban fedezték fel 1971-ben (48), 2 évvel azelőtt, hogy juh hipotalamuszból izolálták a peptidet. Fujita és Kobayashi (48) szövettani vizsgálattal kimutatták, hogy a gyomor lumenébe jutó sav hatására bizonyos endokrin sejtekben granulumok szabadulnak fel, és feltételezték, hogy ezek a granulumok a savszekréció gátló anyagát tartalmazzák. A szomatosztatin izolálása után igazolódott, hogy a gyomor és a hasnyálmirigy igen gazdag SS-szerű immunreaktivitást mutató sejtekben (4). A gyomorban talált szomatosztatin-tartalmú sejtek („D” sejtek) olyan szorosan a fő és a parietális sejtek, illetve az antrumban a gasztrin termelő „G” sejtek mellett találhatók, hogy e megfigyelés vezetett a parakrin hatás felfedezéséhez (80). A gyomorban két fajta „D” sejt található: a) a fundusban az ún. „zárt típusú D sejt”, amely nincs kapcsolatban a lumennel, de közvetlen kapcsolatban áll a fő és parietális sejtekkel, b) míg az antrumban az ún. „nyitott típusú D sejtek”, melyek apikális membránja érintkezik a lumennel, így a gyomorban lévő sav- vagy ételmaradékok közvetlenül stimulálják ezen sejtek SS termelését (49). Az intesztinális „D” sejtek közvetlenül érintkeznek a lumennel, de a legtöbb szomatosztatin a béltraktus egész hosszában a szubmukóza és az izomréteg neuronjaiban található (57). Costa és munkatársai (29) vizsgálatai szerint tengerimalacban a vékonybél 21


szubmukózájában lévő sejtek 20%-a tartalmaz SS-szerű immunreaktivitást, a vastagbélben azonban csak kevés szomatosztatin mutatható ki. Az emésztőrendszer különböző területein más-más szomatosztatin molekulaformák vannak domináló mennyiségben: SS-14 forma gyakoribb a gyomorban, a duodenumban, a vastagbélben és a hasnyálmirigyben, míg a bélben az SS-28 található a legnagyobb mennyiségben (44). A gyomorsav negatív feedback mechanizmus révén a szomatosztatinon keresztül gátolja saját termelődését (58), míg a táplálék bizonyos összetevői (zsír, cukor) önmagukban, a savszekréciótól függetlenül is stimulálják az SS szekréciót (24). A gasztrointesztinális peptidek közül legerősebben a CCK és a gasztrin fokozza a szomatosztatin felszabadulását (25), a bombezin pedig neuronális úton növeli az SS gén kifejeződését és szintézisét (135). A szomatosztatin a gasztrointesztinális traktusban igen tág körben fejti ki gátló hatását: hormonális és parakrin úton, vagy neurotranszmitterként. Gátolja több szerv exokrin szekrécióját (gyomor, hasnyálmirigy, máj, nyálmirigyek). Gátolja a hormonok szekrécióját (gasztrin, CCK, szekretin, VIP, glükagon, stb.), a gyomor, a bél és az epeutak motilitását (az acetilkolin felszabadulás gátlásán keresztül), a zsigeri és portális véráramlást, a bélben zajló szállító folyamatokat (folyadék, elektrolit, táplálék) és gátolja a sejtosztódást (70). Morisset és munkatársai kimutatták, hogy a szomatosztatin tartós adagolása gátolja a DNS-, RNS- és fehérjeszintézist az exokrin hasnyálmirigyben, és ez vezet a DNS- és enzimtartalom csökkenéséhez (100). Az élettani ingerre válaszként létrejövő plazma szomatosztatin-szint emelkedéséhez hasonló

koncentrációjú

SS

infúzió

kutyában

és

emberben

egyaránt

gátolja

a

hasnyálmirigyenzim-szekréciót (66, 129, 150). Ezen alapul a szomatosztatin kedvező hatása az endoszkópos retrográd pankreatográfiát követő akut pankreatitiszre utaló biokémiai változások kezelésében (145, 146). Munkacsoportunk eredményei szerint (147) a szomatosztatin kivédi a CCK-analóg caeruleinnel kiváltott hasnyálmirigy növekedést patkányban, míg a normál mirigy növekedését a hormon nem befolyásolta. Sarfati és munkatársai (125) a caeruleinnel, illetve szekretinnel stimulált hasnyálmirigy növekedés során az endogén szomatosztatin-szint emelkedését észlelték és a hormont a mirigy endogén növekedésgátló faktorának tekintették.

22


Az alábbi táblázatban röviden összefoglaltuk a szomatosztatin főbb tulajdonságait (70). Az exokrin szekréció gátlása

A neuroendokrin szekréció gátlása

Motilitás - gátlás

Motilitás

- stimulálás

Intesztinális transzport gátlása

Egyéb

Gyomor:

Sav Pepszinogén Hasnyálmirigy: Emésztő enzimek Bikarbonát Máj: Epesavtól független epeáramlás Duktális szekréció Nyálmirigyek: Amiláz Gasztrin Kolecisztokinin Szekretin Vazoaktív intesztinális peptid GIP Motilin Bél glükagon Epidermális növekedési faktor Acetilkolin Hasnyálmirigy: Inzulin Glükagon Pankreász polipeptid Gyomorürülés késői fázisa Epehólyag kontrakciója Ileum hosszanti izom kontrakciója Gasztrikus keverőmozgások Gyomorürülés korai fázisa Intesztinális keverőmozgások Folyadék- és bikarbonátszekréció Felszívódás Kalcium Glükóz Fruktóz Xilóz Laktóz Aminosavak Trigliceridek Zsigeri véráramlás gátlása Szövetnövekedés és sejtproliferáció gátlása Táplálék felvétel - stimulálás éhező állatokban - gátlás jóllakott állatokban

6. Táblázat A szomatosztatin biológiai hatása a gasztrointesztinális traktusban (Kleuss alapján módosítva)

23


V.2.1. EGF ÉS SZOMATOSZTATIN KAPCSOLATA Ismert, hogy egyes sejtek malignus transzformációja, vagyis a rákos folyamat elindulása során növekedési faktorok és receptoraik nagy mennyiségben történő megjelenése következik be. A humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalak nagy számban hordoznak a sejtfelszínen megjelenő EGF, HER-2 és HER-3 receptorokat (84), illetve termelnek TGF-α-t, TGF-β-t, bFGF-t, IGF-1-t, PDGF-t (74, 76). Az epidermális növekedési faktort (EGF) egér szubmaxilláris mirigyéből izolálták 1962-ben (26). Kimutatták, hogy serkenti az epitheliális sejtek osztódását mind emberi, egér- és csirkeszövetekben, mind kultúrában fenntartott sejttenyészetekben (27). 1972-ben Savage és munkatársai izolálták és tisztították az 53 aminosavból álló fehérjét (127). Nyolcnapos egerek gyomrában és nyombelében EGF kezelés hatására nagymértékű ornitin-dekarboxiláz enzimaktivitás-növekedést mutattak ki. Ez az enzim nélkülözhetetlen a poliaminok szintéziséhez (38). A poliaminok keletkezése viszont az RNS szintézissel áll kapcsolatban, ugyanis az ornitin-dekarboxiláz serkenti az RNS polimerázok működését. Az EGF kezelés hatására létrejövő trofikus hatás ily módon arányos a dekarboxiláz enzim aktivitásával (124). Az EGF receptor egy 170 kDa-os glikozilált, foszforiláció révén aktiválódó fehérje, génje a 7. kromoszóma rövid karján helyezkedik el (76). A receptor a ligand-kötő helyet tartalmazó extracelluláris doménből, a transzmembrán és az intracelluláris, autofoszforilációt katalizáló tirozin-kináz helyet tartalmazó doménből áll (113). Az epidermális növekedési faktor receptorát (EGFR) számos fehérje képes aktiválni: pl. az EGF, a TGF-α, a heparin-kötő EGF-szerű növekedési faktor (HB-EGF), az amfiregulin és a betacellulin (75). A szekvenciák nagyfokú homológiája miatt a receptor képes kötni a Vaccinia vírus növekedési faktort, a Shope fibroma vírus növekedési faktort, és a Myxoma vírus növekedési faktort is (74). Ligandok kötődésekor az EGF receptor dimerizálódik, majd a tirozin alegységei auto- és transzfoszforilálódnak. A foszforilálódott alegységek szolgálnak az src homológ 2 (SH2) motívumot tartalmazó végrehajtó fehérjék kapcsolódási pontjaiként (112). Ilyen módon, pl. a „growth factor-related” kötő fehérje 2 (GRB2) kapcsolódik a „son-of-sevenless” (SOS) homológ részével, mely kapcsolódik az aktivált ras-GTP-vel. Ez utóbbi a raf-1 sejtmembránhoz történő áthelyeződését segíti elő. A raf-1 egy szerin-treonin kináz, mely a mitogén aktivált fehérje kináz kináz (MAPKK) foszforilációjára képes (2). A MAPKK a MAPK-t foszforilálja, mely azután bejut a sejtmagba, ahol pl. a jun és fos protoonkogének 24


fehérjetermékeit foszforilálja (2). Ligand kötődése az EGF receptorhoz a foszfolipáz C-γ (PLC-γ) és a foszfatidilinozitol-3-kináz (PI-3-kináz) aktivációját is kiváltja. Ráadásul az EGF receptor heterodimért képes alkotni az EGF receptor 2. altípusával (HER-2 vagy c-erbB-2), 3. altípusával (HER-3 vagy c-erbB-3) és 4. altípusával (HER-4 vagy c-erbB-4), melyek további foszforilálódások révén növelik az EGF receptor mitogén hatását (75). Fontos szerepet tulajdonítanak az EGF család tagjainak a malignus transzformáció létrejöttében. Ezt a következő megfigyelések támasztják alá. Először is az EGF család mind az öt tagja és az EGF receptor is nagy mennyiségben kifejeződik hasnyálmirigy daganatsejtekben. EGF immunreaktivitást a duktusz-szerű daganatsejtek sejtmagon belüli régióiban figyeltek meg. A TGFα ezen sejtek apikális oldalán, az amfiregulin a sejtmagban és diffúzan a citoplazmában, a HB-EGF a mebránban, a citoplazmában és az apikális oldalon is kimutatható volt. Másodszor, a HB-EGF, az EGF, a TGFα és az amfigerulin serkenti a tenyésztett, hasnyálmirigy daganatos sejtkultúrák osztódását. Harmadszor, az EGF receptor és az EGF vagy TGFα együttes megjelenése ill. felszaporodása csökkenti a hasnyálmirigy daganatos betegek egyébként is alacsony túlélési valószínűségét. Negyedszer, a ligandok és receptorok együttes megjelenése a daganatos sejtekben lezajló autokrin hatásokat feltételez. Ötödször, az amfiregulin citoplazmában való megjelenése az eddigi vizsgálatok szerint egy sokkal agresszívabb lefolyású betegséghez társítható. Hatodszor, az anti-TGFα antitest vagy amfiregulin antiszensz oligonukleotid adása csökkenti a daganatos sejtek osztódási frekvenciáját (75). Northern és in situ hibridizációs módszerrel igazolták, hogy az EGF receptorszám-, illetve HER-2 és HER-3 immunreaktivitás-növekedés hátterében az mRNS-szint emelkedés áll (84). Míg az EGF és HER-2 receptorok kifejeződésének mértéke nem (158), addig a HER-3 receptor kifejeződésének mértéke összefüggésben van a hasnyálmirigy rákos betegek alacsony túlélési valószínűségével (46). Mindent figyelembevéve az mondható, hogy az EGF és HER-3 receptoroknak fontos szerepük lehet a hasnyálmirigy daganatos sejtek növekedésében (75). A receptorok nagyszámú jelenléte hatással van a sejt áttétképző képességére és invazivitására is (74-76).

25


V.3. A BOMBEZIN A bombezin (BBS), egy a természetben is megjelenő tetradekapeptid, melyet a Bombina bombina és Bombina variegata variegata békák bőréből izoláltak 1970-ben Anastasi, Erspamer és Bucci (35). A kétéltűekből származó bombezinről kimutatták, hogy számos hatása van az emlős szervezetben is; bombezin-szerű immunreaktivitást figyeltek meg emlős agyban, tüdőben, a gasztrointesztinális traktusban (GI) (154) és a hasnyálmirigyben (51, 58). A bombezin-szerű immunreaktivitás jelenléte a hasnyálmirigyben felveti annak a lehetőségét, hogy a bombezin-szerű anyagok fiziológiás szerepet játszhatnak az endokrin és exokrin hasnyálmirigy működésének szabályozásában. Valóban, a bombezin fokozza a hasnyálmirigy hormonok (inzulin, glükagon, PP) elválasztását különböző fajokban, így emberben is (94, 128). Az exokrin hasnyálmirigy működést szintén befolyásolja a bombezin, fokozva az in vivo enzim-elválasztást patkányban (106), kutyában (73), sertésben (87) és emberben (7). Az in vitro vizsgálatok viszont ellentmondásos eredményekre vezettek. A bombezin fokozta az amiláz felszabadulást az acinusokból patkányban (61, 108), tengerimalacban (64), egérben (61) és emberben (140), de hatástalannak bizonyult kutya hasnyálmirigy acinus sejtekre (13). Több kutatócsoport számolt be a bombezin hasnyálmirigy növekedést fokozó hatásáról felnőtt és újszülött patkányokban (83, 110). Nem teljesen tisztázott azonban az, hogy milyen mechanizmusokon keresztül fejti ki hatását a bombezin az exokrin hasnyálmirigyre. Bár specifikus receptorok jelenléte az acinus sejteken (64) a peptid direkt hatását valószínűsítik, a bombezin számos gasztrointesztinális hormont szabadít fel (pl. CCK-t) mind állatokban, mind emberben (52, 71), amelyek közül egyesek befolyásolhatják a hasnyálmirigy szekrécióját és növekedését. McDonald és munkatársai (95) 1978-ban egy 27 aminosavból álló peptidet izoláltak sertés gyomorból, mely nagyfokú homológiát mutatott a bombezin C-terminális végével. Ezt a peptidet elsődleges biológiai hatása alapján gastrin-releasing peptide-nak (gasztrint felszabadító fehérjének), röviden GRP-nek nevezték el.

26


Mivel a GRP a bombezin összes hatását reprodukálni képes, ezért emlős bombezinnek is szokták nevezni (17); természetesen különböző peptidekről van szó (105). Aminosavszekvenciájuk a következő:

Bombezin

Pyro-Glu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Humán GRP-27

Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-ArgGly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

Neuromedin B

Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2

Neuromedin C= GRP-10

Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2

5. Ábra: A bombezin és bombezin-szerű peptidek aminosavszekvenciája

Békában mind a GRP, mind a bombezin megtalálható. A filogenetikai elemzések alapján a két peptid már a gerincesek és gerinctelenek szétválása előtt önállóan létezett. A GRP-27-et három mRNS kódolja, melyek különböző C-terminális extenziós peptidet kódoló szakaszt tartalmaznak. Az mRNS-ek alternatív splicing mechanizmus révén egy, a 18-adik kromoszómán lévő génből származnak. A gén három exont és két intront tartalmaz (18). Proteolitikus emésztéssel, a pre-prohormonból képződik a végső peptid (GRP-27). További endo- és exopeptidázos emésztések szükségesek a GRP-10 és GRP-23 kialakulásához. A GRP a gyomor-bél traktuson belül a legnagyobb mennyiségben a gyomorban, a vékony- és vastagbélben fordul elő. A fenti szerveket behálózó idegekből szabadul fel, mint parakrin hormon, tehát a keringésbe nem jut be. A peptid a központi idegrendszerben is nagy koncentrációban mutatható ki. Ott neurotranszmitterként, míg a fejlődő tüdőben autokrin növekedési hormonként viselkedik. A GRP a gasztrointesztinális neuropeptidek a gasztrin, a pankreász polipeptid (PP), a kolecisztokinin (CCK), a motilin (MOT), a neurotenzin, az enteroglükagon, a pankreászglükagon, az inzulin és a SS felszabadulásának leghatásosabb endogén stimulátora (18).

27


A GRP stimulálja a hasnyálmirigy szekrécióját, az epehólyag- és bélmotilitást. A GRP hatásai részben a gasztrointesztinális hormonok felszabadítása révén, részben direkt módon valósulnak meg. A GRP a CCK-hoz hasonlóan jóllakottság érzetét kelti, azonban ez a hatás a vágusztól független (148). A második bombezin-szerű peptid a neuromedin C (NMC vagy GRP-10), melyről kimutatták, hogy a bombezinhez hasonlóan elősegíti a patkányméh összehúzódását (99). A harmadik bombezin-szerű peptid a neuromedin B (NMB), melyet sertés gerincagyból izoláltak. Hasonlóan a GRP-hez megtalálható az agyban és a gasztrointesztinális (GI) traktusban is (98). A humán neuromedin B szekvenciáját hipotalamuszból származó könyvtárból klónozták; a gén a 15-s kromoszómán található (18). Mai ismereteink szerint négy bombezin receptor típus ismert, melyek a hét transzmembrán doménnel rendelkező G-fehérje kapcsolt receptorok családjába tartoznak. Az első a GRP receptor (GRPR vagy BB2), mely nagy affinitással köti a GRP-t és megtalálható a bél egész területén és számos tumorban (9, 136). A második a neuromedin B receptor (NMBR vagy BB1), mely a neuromedin B-t köti nagy affinitással és megtalálható a nyelőcső és a bél simaizom sejtjeiben (8, 152). A harmadik receptort, a bombezin receptor altípus-3-t (BRS-3 vagy BB3) heréből és tüdő karcinóma sejtekből izolálták (37). A bombezin receptor altípus-4-et (BRS-4 vagy BB4) Bombina orientalis agyában mutatták ki, de feltételezések szerint létezik emlősökben is (104). A receptor endogén ligandja a Bombina orientalis békából izolált [Phe13]bombezin, mely csak az agyban található, hasonlóan a receptorhoz (104) (6. Ábra). A szintén Bombina orientalis-ból izolált [Leu13]bombezin és [Ser3, Arg9, Phe13]bombezin (SAP bombezin) a tüdőben és a GI traktusban is kifejeződik. E peptidek nagyfokú homológiát mutatnak a [Phe13]bombezin-nel, ezért feltételezik, hogy további, a BB4-hez nagyon hasonló bombezin receptorok léteznek (104).

28


Patkány GRP Humán GRP B. orientalis GRP Patkány NMB Humán NMB Bombina orientalis NMB P. sauvagei BB4-szerű rec. R pipiens BB4-szerű rec. B. orientalis bombezin Humán BRS-3 6. Ábra: A bombezin receptorok filogenetikai kapcsolata Nagalla szerint (106)

V.3.1. A GRP RECEPTOROK ÉS A G-FEHÉRJÉK KAPCSOLATA Általánosan elmondható, hogy a bombezin kezelés hatására létrejövő GRP receptor aktiváció katalizálja a G-fehérjén a GDP GTP-re történő cseréjét, aminek következtében a G-fehérje három alegysége (α, β, γ) disszociál (7. Ábra). A GTP a Gα alegységhez kapcsolódva aktiválja annak működését, míg a β és γ alegységek dimert alkotnak. 20 különböző α, 5 β és 12 γ alegységet ismerünk, melyek kombinációi eltérő sejten belüli effektorokat aktiválnak. A Gα alegységeket a szekvenciák homológiája alapján 4 csoportba osztották: Gai, Gas, Gaq, és Ga12.

ai

as

aq

a12

GTP

GTP

GTP

GTP

Ioncsatornák, cAMP, cAMP PIP2= D G + IP3 serkentése foszfolipázok és foszfodiészterázok gátlása

?

7. Ábra: A receptorok és a G-fehérje kölcsönhatása 29


A GRP és NMB receptorok a Gαq alosztályba tartozó Gαq-n, de nem a Gαi/o és Gαt-n keresztül aktiválják a foszfolipáz-Cb (PLCβ ) útvonalat (65, 134). A PLCβ a PIP2-t (foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát) IP3-ra (inozitol-1,4,5-triszfoszfát) és DG-re (diacil-glicerol) hidrolizálja. Az IP3 az intracelluláris kalcium-szint emelkedését stimulálja, míg a DG a hagyományos PKC (protein kináz C) enzimeket aktiválja (56). A ligand aktiválta receptorok továbbá serkentik a mitogén-aktivált protein kináz útvonal elemeit (MAP kináz) (56), a foszfoinozitok bomlását, és a sejten belüli szabad Ca2+ ionok felszaporodását is (50, 62, 107) (8. Ábra). Az adenilát-cikláz enzim aktivációját szintén leírták, de ez nagymértékben függ a sejt környezetétől, illetve a szövet, szerv típusától, még egy adott fajon belül is (50, 88).

8. Ábra: A GRP receptor által szabályozott szekréció modellje (56)

Emellett a bombezin képes a Gα12 fehérje család aktiválására is, ami a Rho-függő fokális adhéziós fehérjék gyors felszaporodásához, az aktin stressz rostok kialakulásához, és az adhéziós fehérjék (FAK, paxillin és p130Cas) tirozin-foszforilációjának növekedéséhez vezet (134). A bombezin gyorsan aktiválja a szerin foszforilációs kaszkád tagjait is (p42mapk/p44mapk), ami a „korai gének” (c-fos, c-myc) expressziós szintjének emelkedését okozza. E gének mRNS-szint növekedése pedig a patkány hasnyálmirigy acinusok (92) és nem hasnyálmirigy eredetű sejtvonalak fokozott mértékű osztódásához vezet (122).

30


V.4. A

SZOMATOSZTATIN ÉS A BOMBEZIN LEHETSÉGES SZEREPE A HASNYÁLMIRIGY

DAGANATOK KIALAKULÁSÁBAN

A gasztroenterológia második leggyakoribb rosszindulatú megbetegedése a hasnyálmirigy daganat. Magyarországon évente 1500 új eset fordul elő. Az eredményes kezelés elsődleges feltétele a korai diagnózis. A legkorszerűbb képalkotó eljárások alkalmazásával ennek ellenére is csak az esetek mindössze 15%-a tekinthető műtétileg megoldhatónak. A hasnyálmirigy daganat gyakorisága az életkorral párhuzamosan emelkedik, a leggyakrabban a 70. életév után jelentkezik. A megbetegedések 82%-a az 50. és 80. életév között mutatkozik. Kismértékben gyakrabban észlelhető férfiaknál, mint a nők között. Nem lehet kimutatni egyértelmű összefüggést a krónikus hasnyálmirigy gyulladás, a cukorbetegség fennállása és a hasnyálmirigy daganat gyakorisága között. A kávéfogyasztás korábban biztosnak vélt hajlamosító szerepe napjainkra megkérdőjeleződött, ahogy az alkoholfogyasztás hatását sem lehet biztosan igazolni. Annak ellenére, hogy igen szerteágazó epidemiológiai tényezők jellemzik a betegség kialakulását, nem lehet egy határozott rizikócsoportot meghatározni. A hasnyálmirigy daganatok több, mint 90%-a a duktális epithel sejtekből kiinduló elváltozás. A legtöbb hasnyálmirigyrák mucintermelő adenokarcinóma, 90%-ban perineurális invázióval, 75%-ban nyirokcsomó-érintettséggel, 50%-ban vénára terjedéssel. A hasnyálmirigy daganatok

5%-a

az

acinussejtből

kiinduló

karcinóma,

míg

a

maradék

5%

cisztadenokarcinómák, adenopikkelyes karcinómák, mikroglanduláris karcinómák, karcinoid szarkómák, valamint malignus limfómák lehetnek. A daganatok kétharmada a hasnyálmirigy feji részére, a maradék a test-farok területére lokalizálódik. Számtalan tanulmány jelent meg arról, hogy a bombezin-szerű peptidek rákos sejtvonalakon mitogén hatással rendelkeznek (18, 39, 122). Cuttita és munkatársai kimutatták, hogy GRP szabadul fel kissejtes tüdőkarcinómában (SCLC) (30), gasztrinómában, illetve emlő, gyomor, vastagbél és hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakban (43). A tumorképződés folyamatára, mint autokrin növekedési faktorok hatnak (30). A bombezin receptorok jelenlétét és a peptid hatásait széles körben tanulmányozták patkány hasnyálmirigyen in vivo (55, 107) és AR4-2J patkány acinus sejtvonalon (89). A legtöbb hasnyálmirigy daganat azonban duktális eredetű, ahol a receptorok és peptidek szerepe még

31


kevéssé feltérképezett. A mai napig csak két duktális eredetű sejtvonalról, a Capan-ról (5) és az HPAF-ról (155) írták le, hogy tartalmaznak bombezin receptorokat. A szomatosztatin a bombezinnel ellentétben in vitro gátolja a sejtek osztódását és a tumorok szekrécióját. A Sandostatin antitrofikus hatását, a „G” és mukóza sejtek osztódásának gátlását figyelték meg Omeprazollal kezelt patkányokban és Zollinger-Ellison szindrómás betegekben (90). A szomatosztatin receptorok jelenlétét igazolták agy-, emlő-, prosztata- és tüdődaganatokban is (118, 119). Ezek alapján feltételezhető, hogy a daganatsejtek szaporodását - legalábbis a receptort kifejező esetekben - a bombezin serkenti, míg a szomatosztatin analóg Sandostatin gátolja.

32

CÉLKITŰZÉSEK

VI. CÉLKITŰZÉSEK Jelen tanulmány célja az alábbiak voltak: 1. A gasztrointesztinális peptidek közül az egymáshoz képest ellentétes proliferációs hatással rendelkező neuropeptidek, a szomatosztatin és a bombezin vizsgálata. 2. Humán

duktális

eredetű

hasnyálmirigy

sejtvonalak

felhasználásával

(Capan-1,

Capan-2, MiaPaCa-2 és HPAF) modellezni kívántuk a peptidek hatását a hasnyálmirigy adenokarcinóma növekedés szabályozására. 3. A peptidek hatásait közvetítő receptorok kimutatása. 4. A receptorok működőképességének bizonyítása. 5. A bombezin esetén annak eldöntése, hogy melyik receptor altípus vesz részt a sejtosztódás szabályozásában. 6. Vizsgálni kívántuk, hogy az aktivált G-fehérje kapcsolt receptorok a jelátviteli útvonal mely elemeit serkentik. 7. Továbbá tanulmányozni kívántuk a bombezin esetén a receptorokon létrejövő hatásokat a specifikus GRP receptor antagonista D-Phe6-bombezin(6-13)-metil-észter, röviden BME (63, 97, 148) és az NMB receptor antagonista H-Nal-cyclo-[Cys-Tyr-Trp-Orn-ValCys]-Nal-NH2, röviden BIM-23127 (78, 97) jelenlétében is.

33

ANYAGOK, MÓDSZEREK

VII. ANYAGOK, MÓDSZEREK VII.1. KÍSÉRLETI MODELLÜNK: A SEJTVONALAK Vizsgálatainkat négy duktális eredetű hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalon végeztük, melyeket az „American Type Culture Collection”-től szereztünk be. A Capan-1 és Capan-2, egy 56 éves kaukázusi férfitől származó, jól differenciált sejteket tartalmazó sejtvonalak, míg a MiaPaCa-2 sejtvonal, egy 65 éves férfitől származó, széles körben jellemzett egynemű, de kevésbé differenciált sejteket tartalmazó sejtvonal. Az HPAF ezzel szemben egy jól differenciált, de vegyes sejteket tartalmazó sejtvonal (123). A sejteket 37°C-on 100% relatív páratartalom mellett, 5% CO2-dal dúsított levegővel ellátott termosztátban inkubáltuk. A Capan-1 és Capan-2 sejteket 10 % fötális borjú szérumot, 100 U/ml penicillint és 100 mg/ml streptomicint tartalmazó RPMI 1640 tápfolyadékban (Sigma, Egyesült Államok), míg a MiaPaCa-2 és HPAF sejteket Dulbecco’s Modified Eagle’s (DME;

Sigma,

Egyesült

Államok)

tápfolyadékban

tenyésztettük.

A

kultúrákat

tenyészpalackokban tartottuk fenn, a tápfolyadékot 3 naponként cseréltük. A sejtek szétültetése 0,25% tripszint és 0,2% EDTA-t tartalmazó kalcium és magnézium mentes foszfát pufferben történt (37°C, 10 perc). Az összes műveletet steril körülmények között végeztük. VII.2. RNS IZOLÁLÁSA A SEJTVONALAKBÓL 75 vagy 150 cm2-es tenyésztő edényekben növesztett sejtkultúrákat 1,5 ml RNA-Clean oldattal (AGS GmbH, Németország) lizáltuk. A lizátumokból teljes RNS preparátumot készítettünk a cég előírása szerint. A DNS szennyeződések kiküszöbölése érdekében 10 mg teljes RNS mintát 10 U RNáz-mentes DNáz-I enzim (Boehringer, Németország) és 78 U Rnazin (Promega, Németország) jelenlétében, 50 ml végtérfogatban 30 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az RNS oldatot először fenol, majd fenol/kloroform/izoamilalkohol

25:24:1

arányú

keverékével,

végül

pedig

kloroform/izoamilalkohol 124:1 arányú keverékével extraháltuk. Ezzel a művelettel a fehérjéket és a DNáz-os emésztés során keletkezett szennyező termékeket távolítottuk el. Ezután az RNS oldatot egytized térfogat 3 M nátrium-acetáttal (pH=5,2) és két térfogat

34

ANYAGOK, MÓDSZEREK

absz. alkohollal -70ºC-on kicsaptuk (1 óra), majd centrifugáltuk (30 perc, 13000 rpm, 4ºC). Az RNS csapadékot 70%-os alkohollal mostuk, újra centrifugáltuk. Az alkohol leszívása után az Eppendorf-cső alján kapott fehér csapadékot vákuumszárítóban szárítottuk. Az RNS csapadékot annyi DEPC-cel (dietil-pirokarbonáttal) kezelt desztillált vízben oldottuk, hogy koncentrációja 1-3 µg/µl legyen. VII.3. RECEPTOROK KIMUTATÁSA REVERZ-TRASZKRIPTÁZ POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓVAL Az SST-2, a GRP és NMB receptorok mRNS-ének jelenlétét, mind a négy sejtvonal esetén (Capan-1, Capan-2, MiaPaCa-2 és HPAF) reverz-transzkriptáz polimeráz láncreakció segítségével mutattuk ki (RT-PCR). A 20 ml végtérfogatú reakcióelegy 50 mM Tris-HCl puffert (pH=8,3; 75 mM KCl, 3 mM MgCl2), 10 mM DTT-t, 0,5 mM-t a négyfajta dezoxinukleotid trifoszfátból, 0,5 mg oligo(dT)-t és 1-5 µg RNS oldatot tartalmazott. 2 percig 42°C-on inkubáltuk az oldatot, majd 200 U SuperScript II Rnáz H- reverz-transzkriptáz enzimet (Gibco BRL, Egyesült Államok) pipettáztunk hozzá. A keveréket 42°C-on további 50 percig inkubáltuk, majd az enzimeket 70°C-on 15 perc alatt állítottuk le. A PCR reakció 50 ml-es végtérfogatban 1-3 ml cDNS oldatot, 5 vagy 2,5 U Taq polimerázt (Sigma, Egyesült Államok), 200 mM dNTP-t (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) és az adott receptorra tervezett bal és jobb primereket (0,1 mM az SST-2 receptorra, 0,2 mM a GRP és az NMB receptorra, 1 mM a emberi, savas, riboszómális foszfoproteinre (XS13)) tartalmazó 1xTaq pufferben (Sigma, Egyesült Államok) (10 mM Tris-HCl puffer, pH=9; 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, és 0,01% Triton X-100) játszódott le. A 95°C-on történő 3 perces kezdeti denaturáció után 35 sokszorozó (amplifikációs) ciklust végeztünk az SSTR-2, a GRP és az NMB receptorok kimutatásához a következő paraméterekkel: 94°C 30 másodperc, 58°C 60 másodperc, 72°C 2 perc. Belső kontrollként a riboszómális foszfoprotein gént (XS13) használtuk, melyről a közelmúltban kimutatták, hogy mRNS-ének szintje állandó mind normál, mind rákos, mind pedig gyulladásos hasnyálmirigy szövet esetén (153). Az XS13 gén mRNS-ének kimutatásánál a

35

ANYAGOK, MÓDSZEREK

kezdeti 95°C-on történő 3 perces denaturációt egy 19 ciklusból álló (94°C, 30 másodperc; 58°C, 60 másodperc; 72°C, 2 perc) sokszorozás követett. A 7. Táblázatban a receptorok, illetve az XS13 gén mRNS-ének kimutatásához használt primereket (Interactiva, Németország) foglaltuk össze.

bal primer

jobb primer

SST-2 receptor

5’-ATGGACATGGCGGATGAGCCACT-3’

5’-TACTGGTTTGGAGGTCTCCATTGA-3’

GRP receptor

5’-GACCTCCATCCCTTCCATGAGGAA-3’

5’-GATGCTGGTGACAAAGTGGAGCAT-3’

NMB receptor

5’-GAAGTGGTCCGCATCAGTAGCTTG-3’

5’-TAAGGTGACAATCATGTGGCCTAG-3’

XS13 gén

5’-CTGGCTAAGTTGGTTGCTTT-3’

5’-GCAGCTGATCAAGACTGGA-3’

Az amplifikációt, vagyis a felsokszorozást egy befejező lépéssel (72°C, 10 perc) állítottuk le. A keletkezett PCR termékeket etídium-bromidot tartalmazó, 1,5%-os agaróz gélen történő futtatást követően UV fényben tettük láthatóvá. A képeket géldokumentációs rendszer segítségével rögzítettük (BioPrint rendszer, BioCapt program). PCR kísérleteinkhez Hybaid Express típusú Thermal Cycler-t használtunk. VII.3.1. A RECEPTOROK KLÓNOZÁSA ÉS SZEKVENÁLÁSA A PCR reakció során kapott termékeket klónoztuk („Original TA cloning kit” (Invitrogen, Egyesült Államok) majd szekvenáltuk, hogy a receptorok mRNS-eivel való azonosságukat bizonyítsuk. PCR termékeinket pCR2.1 vektorba ligáltuk az alábbi összetételű reakcióban: 4 µl víz, 1 µl 10x ligáló puffer, 2 µl vektor, 10 ng PCR termék, 1 µl T4 DNS ligáz. Éjszakán át 14ºC-on inkubáltuk az elegyet, majd „One Shot” kompetens sejtbe transzformáltuk. 2 µl ligátumot 30 percig jégen hűtöttük, majd 42ºC-on 30 másodperces hősokknak vetettük alá. Újabb kétperces hűtést követően 250 µl SOC médiumot adtunk a sejtekhez, és 37 ºC-on rázó termosztátban 1 órán keresztül inkubáltuk. A transzformációt követően a sejteket 50 µg/ml ampicillint, 50 µl (20 mg/ml) IPTG-t (izopropil-β-tio-galaktopiranozid-ot) és 100 µl (20 mg/ml) X-gal-t (5-bróm-4-klór-3-indolil-β-

36

ANYAGOK, MÓDSZEREK

galaktozid-ot) tartalmazó LB (10 g/l bakto-tripton, 5 g/l bakto-élesztő extarktum, 10 g/l NaCl, 15 g/l bakto-agar (pH=7,5)) táptalajra szélesztettük és 37ºC-on legalább 18 órán keresztül inkubáltuk. A táptalajon kék és fehér klónok nőttek ki. Ha az eredetileg lacZ- kompetens sejtekbe idegen DNS-t tartalmazó plazmidot juttatunk be transzformációval, akkor a lac operont indukáló IPTG jelenlétében β-galaktozidáz termelődik. Ez az enzim képes a jelenlévő X-gal-t, mint laktóz szintetikus analógot hidrolizálni, minek hatására a bróm-klórindol kék festék keletkezik. Így a „nem transzformált” sejtek kékek, míg a transzformált sejtek, - a β-galaktozidáz termelődés hiányában - fehérek lesznek. Kolónia PCR-rel ellenőriztük a ligálás és transzformálás eredményességét. A fehér klónokat egyenként, kacsok segítségével vittük át a 100 µl oldatot (1xPCR puffer, 200 µM dNTP, 0,4 µM T7 primer, 0,4 µM M13 primer, 5 U Taq) tartalmazó Eppendorf csövekbe. Az elegyet 1 percig 94ºC-on denaturáltuk, majd 35 cikluson keresztül amplifikáltuk (94ºC, 30 másodperc; 52ºC, 30 másodperc; 72ºC, 1 perc), melyet 72ºC-on 5 perces extenziós lépéssel fejeztünk be. Etídium-bromidot tartalmazó agaróz gélen történő futtatással mutattuk ki az 1105 (SSTR2), 377 (GRPR) és 374 (NMBR) bázispár hosszúságú termékeket. A megfelelő klónozott DNS darabot tartalmazó sejtkolóniákat 10 ml LB tápfolyadékban éjszakán át, 37ºC-on rázatva felszaporítottuk, majd belőlük plazmid preparátumokat készítettünk. A sejteket glicerines LB tápoldatban a későbbi felhasználáshoz -70ºC-on tároltuk. A plazmid preparátumok termékeit használtuk mintaként a szekvenáló reakciókban, melyhez PrismTM

DiDeoxi Terminátor Ciklikus Szekvenáló kitet (Applied

Biosystem, Egyesült Államok) és T7 primert (Interactiva, Németország) alkalmaztunk. 25 cikluson keresztül (96ºC, 30 másodperc; 50ºC, 15 másodperc; 60ºC, 4 perc) sokszoroztuk fel a termékeket, melyek bázissorrendjét 373A típusú automata szekvenálóval (Applied Biosystem, Egyesült Államok) határoztuk meg. A szekvenciák hasonlóságát az SST2, GRP és NMB receptorok teljes DNS szekvenciáihoz képest az NCBI-ban (National Center for Biotechnology Information) a BLASTN programmal történt homológia-kerestetés alapján, százalékban adtuk meg.

37

ANYAGOK, MÓDSZEREK

VII.4. A DNS-SZINTÉZIS MÉRTÉKÉNEK MEGHATÁROZÁSA TIMIDIN BEÉPÜLÉS MÉRÉSÉVEL A szomatosztatin és a bombezin sejtosztódásra gyakorolt hatását vizsgáltuk MiaPaCa-2, Capan-1, Capan-2 és HPAF sejteken. A változásokat a DNS-szintézis során a láncba beépülő tríciált timidin kontrollhoz viszonyított értékével, százalékban adtuk meg. A sejteket a VII.1. fejezetben leírtak szerint tartottuk fenn. A kísérleti időpontot 24 órával megelőzően a tápfolyadékot szérummentes médiumra cseréltük. Így a sejtek legnagyobb részét G0 fázisba kényszerítettük, vagyis szinkronizáltuk. A szomatosztatin analóg Sandostatin-t 100 és 200 ng/ml koncentrációban (Capan-2 sejten), míg a bombezint 10-14 - 10-8 M koncentrációban (HPAF sejten) közvetlenül adtuk a tápfolyadékokhoz. A sejteket további 48 (SS-sel), illetve 24 (BBS-sel) órán keresztül széndioxid termosztátban, 37ºC-on inkubáltuk. 3

A [ H]-timidin beépülés mértékét 1 µCi/ml tríciált timidin hozzáadását követően 1 óra múlva határoztuk meg. A sejteket jéghideg foszfátpufferrel (pH=7,2) kétszer mostuk, 10%-os triklórecetsavval kicsaptuk, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk (10 perc). A csapadékot 400 µl 1M NaOH-ban oldottuk, melyből 100-100 µl-t 3 ml szcintilláló koktéllal (Opti Phase HeSafe II, Pharmacia, Németország) kevertünk össze. A mintákba beépült trícium radioaktivitását Wallac 1409 típusú folyadékszcintillátorral mértük meg. A maximális hatású bombezin koncentráció meghatározása után vizsgálatainkat kiterjesztettük további három emberi hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalra. A timidin beépülés mértékét minden esetben az egynapos kezeléseket követően 1 µCi/ml tríciált timidinnel történt egyórás expozíció után határoztuk meg. A bombezin receptor antagonisták hatásait a bombezin kiváltotta DNS-szintézisre a receptorokat legnagyobb mennyiségben tartalmazó HPAF sejten vizsgáltuk. Egynapos szérummentes tápfolyadékban történt szinkronizálást követően 10-8 M bombezinnel önmagában vagy a bombezin és GRP receptor antagonista BME-vel (10-6 M), illetve bombezin és NMB receptor antagonista BIM-23127-tel (10-6 M) 24 órán keresztül kezelt sejteken határoztuk meg a timidin beépülés mértékét, melyet minden esetben a kezelést nem kapott kontroll százalékában adtunk meg (átlag ± szórás).

38

ANYAGOK, MÓDSZEREK

VII.5. AZ INTRACELLULÁRIS SZABAD KALCIUM-KONCENTRÁCIÓ MEGHATÁROZÁSA Az intracelluláris kalcium-koncentráció változás méréséhez az HPAF sejteket 24x40 mm-es

fedőlemezekre

ültettük

ki.

A

letapadt

sejteket

pufferelt

Hepes

oldattal

(HBSS: 136,7 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,34 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 4 mM NaHCO3, 5,55 mM glükóz és 20 mM Hepes (pH=7,4)) mostuk. Ezt követően a sejteket 5 mM fura-2/AM (metoxi-acetát-észter; Teflabs, Egyesült Államok) fluoreszcens kalcium indikátorral töltöttük fel 37oC-on, széndioxid termosztátban, 45 percen keresztül. A sejt észteráz aktivitása révén a vegyület sejtbe kerülése után rövid időn belül megtörténik a metoxi-észter hidrolízise. Az így keletkező fura-2 szabad sav a sejtmembránon keresztül már nem tud kidiffundálni, így a sejten belül tartós kalcium kelátorként működik. A fura-2 kalciumhoz kötött formája 340 nm-en, a szabad forma 380 nm-en mutat emissziós maximumot. Töltés után a sejteket szuperfúziós rendszerben újra mostuk a HBSS oldattal egy 37°C-ra termosztált kamrában. A feltöltött sejteken az intracelluláris szabad kalciumszint változását Nikon TDM Diaphot inverz epifluoreszcens mikroszkóp (40-szeres fluor objektív; NA:0.85, Nikon, Japan) segítségével, mikrospektro-fluorometriával (D-104 Microscope Photometer, PTI, Egyesült Államok) mértük. Az agonistát (10-8 M bombezin) a mosást követően perfúziós pumpával 5 percen keresztül juttattuk el a kamrába. A töltött sejtekből kibocsátott fluoreszcens fény intenzitását fotosokszorozóval 340 és 380 nm gerjesztőfény alkalmazása mellett 520 nm-en detektáltuk. A kalcium citoplazmatikus koncentrációjának változását a 340 és 380 nanométer hullámhosszon gerjesztett emisszió értékek hányadosaként adtuk meg. Azt, hogy a bombezin kezelés hatására bekövetkező kalcium-koncentrációnövekedés a G-fehérje kötött bombezin receptorok valamelyikén, vagy mindkettő közvetítése révén jön-e létre, a specifikus receptor antagonisták jelenlétében vizsgáltuk. 10-6 M BME-t és BIM-23127-t egyedül vagy 10-8 M bombezinnel együtt alkalmaztunk. Az agonista és az antagonista együttes használatakor az antagonistát 5 perccel előbb (összesen 10 percig) juttattuk el a sejtekhez pumpa segítségével.

39

ANYAGOK, MÓDSZEREK

VII.6. AZ INTRACELLULÁRIS CAMP-SZINT MEGHATÁROZÁSA A

bombezin

kezelés

hatására

létrejövő

intracelluláris

cAMP-koncentráció

változásokat HPAF sejteken vizsgáltuk. A sejteket 24 órán át, 37°C-os széndioxid termosztátban

szérummentes

tápfolyadékban

szinkronizáltuk,

majd

bombezinnel

(10-13 - 10-8 M) és forskolinnal (5´10-6 M) kezeltük. A forskolin egy diterpén, melyet Coleus forskohlii-ból izoláltak és az adenilát-cikláz katalitikus régiójával lép közvetlen kölcsönhatásba, ily módon aktiválva az enzimet és növelve meg az intracelluláris cAMP-szintet (131). Az immunreaktív cAMP-szint mérését a Brooker és mtsai (16) által leírt radioimmun eljárás módosított változata alapján végeztük (20). A 2-O-succinil-cAMP-HAS ellen kecskében termeltetett specifikus antitestet (No 309) (saját immunizálás) használtunk 1:8000 végkoncentrációban. A klóramin T módszer alapján 2’O-succinil-cAMP tirozin-metilészter jód származéka szolgált radioligandként. A beépült és szabad radioligand elválasztását 1 ml jéghideg etanollal végeztük. A kísérletek érzékenysége 0,05 pmol/cső volt. A kísérletek közötti variancia 14,4%-nak, míg a kísérleten belüli variancia 7,1%-nak adódott. Az adatokat az HPAF sejtek fehérje tartalmára normalizáltuk. A sejtben jelenlévő foszfodiészterázok (PDE I-V) az adenilát-cikláz aktiválását követően keletkező cAMP-t adenozin-5’-monofoszfát (5’-AMP) keletkezése közben hidrolizálják. A hidrolízist kivédendő, és a kezelés hatására ténylegesen keletkező cAMP mennyiségének meghatározása érdekében kísérleteinket a nem-szelektív foszfodiészteráz gátló 3-izobutil-1-metilxantin (IBMX) jelenlétében is elvégeztük (50). VII.7. GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOK Az HPAF sejteket 24 órán keresztül szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd bombezin nélkül (kontroll), illetve 10-8 M bombezin hozzáadását követően 30, 60, 120 és 240 percig ugyanebben a tápoldatban tovább inkubáltuk. Fontos, hogy a bombezint közvetlenül adtuk a szérummentes tápfolyadékhoz előzetes tápoldat csere nélkül, mert tapasztalataink alapján a korai gének vizsgálata esetén egy ilyen tápfolyadékcsere, mint egy stresszhatás beindítja ezen gének kifejeződését, elfedve ezzel a kezelések hatásait. A sejtekből teljes RNS-t preparáltunk az VII.2. RNS izolálása a sejtvonalakból című fejezetben leírtak szerint.

40

ANYAGOK, MÓDSZEREK

A Northern blotok készítéséhez 20 mg teljes RNS-t 1%-os agaróz és 8%-os formaldehid tartalmú denaturáló gélen futtattunk meg, majd a méret szerint elválasztott RNS-eket kapilláris transzferrel Hybond N (Amersham, Nagy-Britannia) típusú membránra vittünk át és UV besugárzással irreverzibilisen a membrán felületéhez kötöttük. A (32P-dCTP)vel radioaktívan jelölt specifikus kettősszálú DNS fragmenseket (Multiprime Labeling Kit, Amersham, Nagy-Britannia) „keresőmolekulákként”, szondákként („próba) használtuk annak eldöntésére, hogy a vizsgált RNS-mintákban jelen vannak-e a c-fos, c-myc, HMG-I(Y) és XS13 gének mRNS-ei. A filtereket 42ºC-on 4 órán keresztül előhibridizáltuk, majd a szondák jelenlétében 10 ml hibridizációs oldatban (50% (v/v) formamid, 6x SSC, 5x Denhardt oldat, 0,5% SDS, 50 mM nátriumfoszfát puffer, 100 µl(10 mg/ml) t-RNS, 10 µl (10 mg/ml) poliU-homopolimer, 75 µl (10 mg/ml) denaturált lazac-sperma DNS) éjszakán át, 42ºC-on hibridizáltattuk. A radioaktív szondákat 0,5-1 x 106 cpm/ml koncentrációban alkalmaztuk. A filtereket szobahőmérsékleten kétszer 5 percig mostuk 2x SSC/0,1% SDS oldattal, majd 30 percig 68°C-on és 0,2 x SSC/0,1% SDS oldattal további 30 percig 68°C-on. Mosás után a filtereket folpackba csomagoltuk és kazettában, röntgen film (Sigma, Kodak XAR, USA) jelenlétében -70ºC-on több napig exponáltuk. A filmeket előhívás után a géldokumentációs rendszer segítségével digitalizáltuk. A denzitometriás kiértékelésekhez a ScionImage képanalizáló programot (ScionImage, Scion Corporation) használtuk. VII.8. AZ ADATOK STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉSE A hibridizációs vizsgálatoknál két párhuzamos, a többi módszernél 3-44 párhuzamos kísérletet végeztünk. A csoportok közötti összehasonlítást Mann-Whitney féle non-paralel U teszttel, illetve ANOVA variancia analízissel, majd Bonferroni próbával végeztük a GraphPad software-csomag (San Diego, Kalifornia) segítségével. Az adatokat átlag ± szórásban adtuk meg.

41

EREDMÉNYEK

VIII. EREDMÉNYEK VIII.1. SZOMATOSZTATIN

ÉS

BOMBEZIN

RECEPTOROK

KIMUTATÁSA

HASNYÁLMIRIGY

SEJTVONALAKBAN

A szomatosztatin kettestípusú receptorát, illetve a bombezin receptorok közül a GRP és NMB receptorok jelenlétét vizsgáltuk három, illetve négy humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalban (Capan-1, Capan-2, MiaPaCa-2 és HPAF). A sejteket megfelelő körülmények között tenyésztettük, majd a sejtekből RNS-t izoláltunk. Az RNS mintákat reverz transzkriptáz reakciókban cDNS-re „írtuk át”. Az enzim nélküli reakciók szolgáltak negatív kontrollként annak bizonyítására, hogy nem genomiális DNS-t sokszorozunk fel a specifikus primerek segítségével. A PCR reakciókban a tervezett nagyságú termékeket (SSTR2: 1105 bp., GRPR: 377 bp., NMBR: 374 bp. és XS13: 500 bp.) kaptuk, ahogy ez az I.A és I.B Ábrán is látható.

A

B M 1

2

3

4

5

M 500 bp XS13

M

1

2

3 1105 bp SSTR2 377 bp GRPR

374 bp NMBR

I. Ábra: Szomatosztatin és bombezin receptorok kimutatása RT-PCR reakciókban. A mintákat etídium-bromid tartalmú 1,5 %-os agaróz gélen futtattuk meg, majd UV fényben géldokumentációs rendszer segítségével fényképeztük le. A: Az 1105 bp. nagyságú SST-2 receptor mRNS-ének kimutatása MiaPaCa-2 (1), Capan-1 (2), és Capan-2 (3) sejtekben. M=100 bázispáros létra. B: XS13 (500 bp.), GRPR (377 bp.) és NMBR (374 bp.) mRNS-einek kimutatása Capan-1 (1), Capan-2 (2), HPAF (3) és MiaPaCa-2 (4) sejtekben. Negatív kontroll (5). M=100 bázispáros létra.

42

EREDMÉNYEK

Az XS13 primerrel kapott eredmények bizonyítják az RNS koncentrációk azonosságát, melyek alapján a receptorok mRNS-einek mennyiségére vonatkozóan is óvatos megállapításokat tehetünk. Az SSTR-2 mRNS-ének szintje közel azonos volt a MiaPaCa-2 és Capan-1 sejtekben; magasabb szintet találtunk azonban a Capan-2 sejtekben (I.A Ábra). A GRP receptorok mRNS-ének jelenlétét a Capan-1, a Capan-2 és az HPAF sejtvonalakban mutattuk ki. A GRP receptorok mRNS-szintje, - a többi sejtvonalhoz képest - az HPAF sejtvonalban volt a legmagasabb (I.B Ábra). A MiaPaCa-2 sejtekben nem tudtuk a GRP receptorok jelenlétét kimutatni. Az NMB receptorok mRNS-szintje alacsony volt mind a négy sejtvonal esetén (I.B Ábra). A DNS fragmensek szekvenálása adott teljes bizonyosságot arra vonatkozóan, hogy a PCR reakciókban a receptoroknak megfelelő termékek keletkeztek-e. A SST-2 receptor esetén 87%-os (Génbank azonosító XM_012697), a GRP receptor esetén 98%-os (Génbank azonosító M73481), míg az NMB receptor esetén 99%-os (Génbank azonosító M73482) azonosságot kaptunk az adatbázisban jelölt szekvenciákhoz képest. VIII.2. A PEPTIDKEZELÉSEK HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA A peptidek sejtosztódást serkentő vagy gátló hatását leggyakrabban az osztódás során a DNS-be beépülő tríciált timidin kontrollhoz viszonyított értékével, százalékban szokás megadni. A sejtvonalból illetve sejtvonalakból származó sejteket egynapos, szérummentes tápfolyadékban történő szikronizálás után különböző koncentrációban alkalmazott peptidekkel kezeltük 48 illetve 24 órán keresztül. VIII.2.1. EGF KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA A szomatosztatin sejtosztódást gátló hatását EGF-fel osztódásra serkentett sejteken tanulmányoztuk. A maximális hatást kiváltó EGF koncentráció meghatározásához először koncentráció-hatás görbét vettünk fel. A sejteket 1-100 ng/ml koncentrációjú EGF-fel 48 órán keresztül kezeltük, majd meghatároztuk a DNS-szintézis mértékét.

43

EREDMÉNYEK

beépülés (%)

200 150

**

*

**

3H-Timidin

100 50 0 0

1 ng/ml

10 ng/ml 100 ng/ml EGF

II. Ábra: EGF hatása a Capan-2 sejtek osztódására. A sejtek osztódását serkentő EGF hatását a sejtek 24 órán szérummentes tápfolyadékban történt szinkronizáltatása után 1, 10 és 100 ng/ml koncentrációnál vizsgáltuk. A DNS-szintézis mértékét kétnapos kezelést követően határoztuk meg és a kontroll százalékában adtuk meg. *P<0,05 és **P<0,01 a kontrollhoz viszonyítva.

**

P<0,01 értékű szignifikáns hatást 10 és 100 ng/ml EGF adásakor tapasztaltunk,

mely koncentrációk alkalmazásakor 120,7 ± 6%-ra (n=12) és 127,6 ± 2%-ra (n=25) nőtt a DNS-szintézis a kontrollhoz (100 ± 5%, n=38) képest (II. Ábra). VIII.2.2. SZOMATOSZTATIN KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA A szomatosztatin analóg Sandostatin sejtosztódásra kifejtett hatásait a SST-2 receptorral rendelkező Capan-2 sejteken vizsgáltuk. Saját eredményeink alapján (19) koncentráció-hatás görbét két koncentráció alkalmazásával vettünk fel. A sejteket 24 órán keresztül szérummentes RPMI-1640 tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd 100 és 200 ng/ml Sandostatin-nal 48 órán át kezeltük. A DNS-szintézis mértékét e 48 órás expozíciót követően határoztuk meg. A Sandostatin koncentráció-függő módon gátolta a sejtek osztódását a kontrollhoz (100 ± 5%, n=38) képest.

44

3H-Timidin

beépülés (%)

EREDMÉNYEK

150 125

**

*

100 75 50 25 0 0

100 ng/ml 200 ng/ml Sandostatin

III. Ábra Sandostatin hatása a Capan-2 sejtek osztódására. A sejtek osztódását gátló Sandostatin hatását a sejtek 24 órán szérummentes tápfolyadékban történt szinkronizáltatása után 100 és 200 ng/ml koncentrációnál vizsgáltuk. A DNS-szintézis mértékét két napos kezelést követően határoztuk meg és a kontroll százalékában adtuk meg. *P<0.05 és **P<0.01 a kontrollhoz viszonyítva.

100

ng/ml

Sandostatin

alkalmazása

esetén

a

timidin

beépülés

értéke

88,3 ± 3%-ra (n=26), míg 200 ng/ml Sandostatin adásakor 79,8 ± 3%-ra (n=6) csökkent a kontrollhoz (100 ± 5%, n=38) képest. A nagyobb koncentrációnál a gátlás elérte a **P<0.01 szignifikancia szintet (III. Ábra). A Sandostatin sejtosztódást gátló hatását a 100 ng/ml EGF-fel osztódásra serkentett Capan-2 sejteken is megvizsgáltuk (IV. Ábra). Az EGF általánosan elismert sejtosztódást serkentő anyag, mely a Capan-2 sejteken 145,2 ± 6%-ra (n=25) emelte a DNS-szintézis mértékét a kontrollhoz (100 ± 5%, n=38) képest (IV. Ábra). 100 ng/ml Sandostatint önmagában adva gátolta a sejtek osztódását; 88,3 ± 3%-ra (n=26) csökkent a timidin beépülés. Az EGF-fel osztódásra serkentett sejteken a Sandostatin gátló hatása még nagyobb mértékű volt (145,2 ± 6%-ról 110,2 ± 3%-ra (n=23) csökkent), mint önmagában alkalmazva (IV. Ábra).

45

3H-Timidin

beépülés (%)

EREDMÉNYEK

200 **

150

*

++

100 50 0

0

100 ng/ml 100 ng/ml100+100 ng/ml EGF Sand EGF+Sand

IV. Ábra: EGF és Sandostatin hatása a DNS-szintézis mértékére (%) Capan-2 sejteken. A sejteket egy napig szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd 100 ng/ml EGF-fel, 100 ng/ml sandostatinnal és 100+100 ng/ml EGF+Sandostatinnal 48 órán át kezeltük. A DNS-szintézis mértékét e kétnapos kezelést követően határoztuk meg. Az értékeket a kontroll százalékában adtuk meg. *P<0.05 a kontrollhoz viszonyítva, **P<0.01 a kontrollhoz viszonyítva, ++P<0.01 az EGF kezeléshez viszonyítva.

VIII.2.3. BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSA A SEJTEK OSZTÓDÁSÁRA A bombezin sejtosztódást fokozó hatását már több sejtvonalon jellemezték (126, 132). A saját RT-PCR vizsgálataink szerint az HPAF sejtvonal fejezte ki a legmagasabb szinten a bombezin humán megfelelőjének a „gastrin-releasing peptide”-nak a receptorát (GRPR). Ezért megvizsgáltuk a bombezin koncentráció-függő hatását 10-14-10-8 M koncentrációban 24 órás kezelés esetén, majd meghatároztuk a DNS-szintézis mértékét (V. Ábra). Maximális hatást 10-8 M bombezin adásakor tapasztaltunk, mely koncentráció alkalmazásakor 136 ± 4%-ra (n=44) nőtt a DNS-szintézis a kontrollhoz képest. Az 50%-os hatásos koncentráció (EC50) 2,27 x 10-12 M-nak adódott.

46

EREDMÉNYEK

**

Timidin beépülés (%)

150

3H-

160

90

*

*

**

140 130 120 110 100 80 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 Bombezin (M)

V. Ábra: Bombezin hatása a DNS-szintézis mértékére (%) HPAF sejtekben. A sejteket egy napig szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd 10-14-10-8 M bombezinnel 24 órán át kezeltük. A DNS-szintézis mértékét ezt követően határoztuk meg és a kontroll százalékában adtuk meg. *P<0.05 bombezin hatása a kontrollhoz viszonyítva, **P<0.01 bombezin hatása a kontrollhoz viszonyítva.

A koncentráció-függés ismeretében a többi sejtvonalat már csak a maximális hatást kiváltó 10-8 M-os bombezinnel kezeltük. Eredményeinket az I. Táblázatban foglaltuk össze. Sejtvonalak

Kontroll

10-8 M bombezin

Capan-1

100 ± 3

93 ± 3

Capan-2

100 ± 6

97 ± 5

MiaPaCa-2

100 ± 10

104 ± 12

HPAF

100 ± 6

136 ± 5**

I. Táblázat: Bombezin hatása a DNS-szintézis mértékére (%) az egyes sejtvonalakban. A sejteket egy napig szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltattuk, majd 10-8 M bombezinnel 24 órán át kezeltük. Az adatok 8-16 párhuzamos mérés átlagai. **P <0.01 a kontrollhoz viszonyítva.

47

EREDMÉNYEK

A Capan-1, Capan-2 és MiaPaCa-2 sejtvonalakon nem tapasztaltunk változást a DNSszintézis mértékében, mint azt a táblázat adatai mutatják. Megállapíthatjuk, hogy bár az RT-PCR adatok szerint a GRP receptor mRNS kifejeződik a Capan-1, Capan-2 és HPAF sejteken, és kis mennyiségben az NMB receptor mRNS kifejeződése is kimutatható a négy sejtvonalon, ennek ellenére a bombezin kezelés (10-8 M) csak az HPAF sejteken fokozta szignifikáns mértékben a DNS-szintézist. Ezért további vizsgálatainkat, így az antagonisták hatásait, az intracelluláris kalcium- és cAMP-szint változását és a génexpressziós változásokat bombezin kezelés hatására csak az HPAF sejtvonalon végeztük el. A VI. Ábrán mutatjuk be az antagonisták hatásait a DNS-szintézis mértékére bombezin jelenlétében, illetve annak hiányában (kontroll). Sem a GRP receptor antagonista BME, sem az NMB receptor antagonista BIM-23127 önmagában nem növelte szignifikánsan a DNS-szintézis mértékét, tehát bombezin az antagonistákkal történt kezeléseket követően nem szabadul fel autokrin módon az HPAF sejtvonalban. BME és bombezin együttes adásakor a BME szignifikáns mértékben csökkentette a DNS-szintézist, míg a BIM-23127 nem befolyásolta a bombezin kiváltotta sejtosztódást.

3H-timidin

beépülés (%)

160 150

**

140 130 ++

120 110 100 90 80

kontroll

Bombezin

VI. Ábra: Bombezin és a szelektív antagonisták hatásai a DNS-szintézis mértékére (%). A sejteket egynapos szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd 10-8 M bombezinnel vagy 10-6 M BME vagy 10-6 M BIM-23127 receptor antagonistákkal kezeltük önmagukban ill. bombezin jelenlétében. Kontroll (üres oszlop), BME (csíkos oszlop), BIM-23127 (pöttyös oszlop). **P<0.01 bombezin hatása a kontrollhoz képest, ++P<0.01 BME hatása a bombezinhez képest. 48

EREDMÉNYEK

VIII.3. AZ

INTRACELLULÁRIS SZABAD KALCIUM-KONCENTRÁCIÓ VÁLTOZÁSA BOMBEZIN

KEZELÉS HATÁSÁRA

Annak bizonyítására, hogy a bombezin kezelés kalciumot szabadít fel a kalciumraktárakból és ezáltal növeli az [Ca2+]i-szintet, az HPAF sejteket 24x40 mm-es fedőlemezekre ültettük ki és a kalcium-koncentráció változását mértük az 5 mM fura-2/AM (metoxi-acetát-észter) fluoreszcens kalcium indikátorral feltöltött sejteken a VII.5 fejezetben leírt módon. A fluoreszcenciát fotosokszorozóval 520 nm-en detektáltuk. A perfúziós rendszerben 5 percig a sejtekhez juttatott 10-8 M bombezin 48,9 ± 12,2 %-kal (n=14) emelte az intracelluláris kalciumszintet az HPAF sejteken. A változás reverzibilisnek bizonyult, a kezelés befejeztével a 340/380 nm-en mért arány majdnem teljesen lecsökkent a kiindulási értékre (VII. Ábra).

Arány (340/380 nm)

1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6

BBS 0

500

1000

1500 Idő (másodperc)

VII. Ábra: Bombezin kezelés hatása az HPAF sejtek intracelluláris kalciumkoncentrációjára. A fedőlemezre kiültetett sejteket fura-2 fluoreszcens kalcium-indikátorral töltöttünk fel. A 340 és 380 nm hullámhosszú gerjesztőfény alkalmazása mellett 520 nm-en fotosokszorozóval detektáltuk a sejtekből kibocsátott fluoreszcens fény intenzitását. A görbe egy reprezentatív mérést mutat be. BBS=10-8 M bombezin adagolás 5 percen keresztül. 49

EREDMÉNYEK

Annak eldöntésére, hogy a bombezin kezelés hatására bekövetkező kalciumszint növekedés a G-fehérje kötött GRP és/vagy NMB receptorokon keresztül jön létre, a specifikus receptor antagonisták hatásait is megvizsgáltuk. A GRP receptor antagonista BME 10-6 M koncentrációban való alkalmazása esetén önmagában nem befolyásolta a kalciumszintet, azonban teljesen blokkolta a 10-8 M bombezinnel kiváltott választ (VIII. Ábra). Az NMB receptor antagonista BIM-23127-nek (10-6 M) ezzel szemben sem önmagában, sem a bombezin

Arány (340/380 nm)

kiváltotta kalciumszint növekedésre nem volt hatása (VIII. Ábra).

BIM

1.2 1

BME

BBS

BBS

0.8 0.6 0

300

600

900

1200

1500

Idő (másodperc) VIII. Ábra: Bombezin és az antagonisták hatása az HPAF sejtek intracelluláris kalcium-koncentrációjára. A fedőlemezre kiültetett sejteket fura-2 fluoreszcens kalcium-indikátorral töltöttük fel. A 340 és 380 nm hullámhosszú gerjesztőfény alkalmazása mellett 520 nm-en fotosokszorozóval detektáltuk a sejtekből kibocsátott fluoreszcens fény intenzitását. BBS= 10-8 M bombezin adagolás (5 perc), BME = 10-6 M GRPR antagonista adagolás (10 perc), BIM-23127 = 10-6 M NMBR antagonista adagolás (10 perc). A görbe egy reprezentatív mérést mutat be.

50

EREDMÉNYEK

VIII.4. A CAMP SZINT VÁLTOZÁSA BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSÁRA A

bombezin

kezelés

hatására

létrejövő

intracelluláris

cAMP-koncentráció

változásokat HPAF sejteken vizsgáltuk. A sejteket 24 órán át szérummentes tápfolyadékban 24 lyukú tenyésztő edényben szinkronizáltuk, majd bombezinnel (10-8 M) és forskolinnal (5´10-6 M) kezeltük. E kezeléseket a foszfodiészteráz gátló 3-izobutil-1-metilxantin (IBMX) jelenlétében is megismételtük. Méréseink szerint 10-8 M bombezin kezelés nem volt hatással az intracelluláris cAMPkoncentrációra, míg az 5´10-6 M forskolin kezelés szignifikáns mértékben növelte azt. A forskolin kezelést pozitív kontrollként is alkalmaztuk, mivel ismert, hogy a forskolin közvetlenül stimulálja az adenilát-ciklázt (IX. Ábra). A bombezin kezelés IBMX jelenlétében is hatástalan maradt. Ezzel szemben a forskolin hatását tovább erősítette a foszfodiészteráz gátló jelenléte (IX. Ábra). Növekvő koncentrációjú bombezin kezelés (10-14-10-8 M) sem befolyásolta az intracelluláris cAMP koncentrációt HPAF sejtekben (az adatokat nem tüntettük fel).

700

++

cAMP szint (%)

600 500 400 300

**

200 100 0 Kontroll

10-8 M BBS

5 x 10-6 M Foskolin

IX. Ábra: Bombezin és forskolin hatása az intracelluláris cAMP-szintre HPAF sejtekben. 24 órán át szérummentes tápfolyadékban szinkronizált sejteket (2x104 sejt/lyuk) 5 percig 5 µM forskolinnal vagy 10-8 M bombezinnel kezeltük. A foszfodiészteráz gátló alkalmazása esetén a sejteket 50 mM IBMX-el egy órán át előinkubáltuk, majd bombezinnel vagy forskolinnal kezeltük. Az adatok 8 párhuzamos mérés adatait mutatják a kontroll százalékában, mely 33 ± 6 pmol/106 sejt-nek adódott. Üres oszlop= IBMX nélkül, csíkos oszlop= IBMX jelenlétében. **P<0,01 az IBMX nélkül végzett forskolin kezelés a kontrollhoz viszonyítva; ++P<0,01 az IBMX jelenlétében végzett forskolin kezelés az IBMX nélkül végzett forskolin kezeléshez viszonyítva. BBS=bombezin. 51

EREDMÉNYEK

VIII.5. GÉNEXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSOK BOMBEZIN KEZELÉS HATÁSÁRA A bombezin sejtosztódást serkentő hatása a sejtmagon belül elhelyezkedő gének expressziós szintjének gyors változásában is megmutatkozik. Az osztódás felé „vezető úton” a c-fos és c-myc korai gének mRNS-szintjének a növekedése az egyik legelső lépés, míg a HMG-I(Y) mRNS-szint változása egy későbbi esemény. Az HPAF sejteket 24 órán keresztül szinkronizáltuk, majd bombezin nélkül (kontroll), illetve 10-8 M bombezin jelenlétében 30, 60, 120 és 240 percig inkubáltuk. A maximális DNS-szintézist kiváltó bombezin koncentrációt alkalmaztuk, mely koncentráció több tanulmányban is hatásosnak bizonyult (92). A sejtekből a VII.2 és VII.7 fejezetben leírtak szerint RNS-t izoláltunk és Northern blotokat készítettünk. A c-fos, c-myc és HMG-I(Y) DNS fragmenseket [32P]dCTP-vel jelöltük, és hibridizációban szondaként alkalmaztuk. A három gén mRNS-ének szintjét időfüggő módon növelte a bombezin kezelés: a c-fos mRNS-szint 30 percen belül a hétszeresére növekedett, majd 2 óránál lecsökkent a kontroll szintjére. A másik két gén mRNS-szintjének változása ettől eltérő lefutású volt. Kisebb mértékű növekedést figyelhettünk meg, és a maximumot 2 óránál (c-myc) illetve 4 óránál kaptuk (HMG-I(Y)) (X. Ábra). Az állandóan azonos szinten kifejeződő humán riboszómális foszfoprotein génről (XS13) (153) készített cDNS-szondával történt hibridizálás az RNS koncentrációk azonosságát jelezte.

52

EREDMÉNYEK

28 S

0 0,5 1 2 4 óra 2.2 kb c-fos

18 S 28 S

2.3 kb c-myc 18 S 28 S

2 kb HMG-I(Y)

18 S 18 S

1.5 kb XS13

X. Ábra: Bombezin kezelés hatása a c-fos, c-myc, HMG-I(Y) és XS13 gének kifejeződésére. A sejteket 24 órán át szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd 0 (kontroll) 0,5; 1; 2 és 4 óráig 10-8 M bombezinnel kezeltük. 20 mg teljes RNS-t 1% agarózt és 8% formaldehidet tartalmazó gélen való futtatást követően nejlon membránra vittünk át. A filtereket [32P]-dCTP-vel jelölt c-fos, c-myc és HMG-I(Y) szondákkal hibridizáltattuk. A koncentrációk normalizálását az XS13 szondával végzett hibridizáció alapján végeztük el. A 18 S és 28 S a két riboszómális RNS, melyek 1.9 és 4.7 kb nagyságúak. Segítségükkel határoztuk meg az általunk kapott jelek méretét.

Az előző kísérleteinkhez hasonlóan megvizsgáltuk a GRP receptor antagonista BME és az NMB receptor antagonista BIM-23127 hatását a bombezin által kiváltott c-fos gén kifejeződésére. Az HPAF sejteket egynapos szérummentes tápfolyadékban történt szinkronizálás után 5 percig 10-6 M BME-vel vagy BIM-23127-tel előkezeltük, majd 30 és 120 percig 10-8 M bombezin jelenlétében tovább inkubáltuk. A bombezin most is 30 percen belül szignifikáns mértékben növelte a c-fos mRNS-szintet, mely 2 órára visszatért a kontroll szintjére (XI. Ábra). A GRP receptor antagonista BME teljes mértékben gátolta a bombezin kiváltotta c-fos mRNS-szint növekedést, míg az NMB receptor antagonista BIM-23127 nem volt hatással az mRNS-szintekre (XI. Ábra).

53

EREDMÉNYEK

1 2 3 4

5 6 7

28S

2.2 kb c-fos 18S 18S

1.5 kb XS13 XI. Ábra: A GRP és NMB receptor antagonista BME és BIM-23127 hatása a c-fos mRNS-szintre HPAF sejteken. A sejteket 24 órán át szérummentes tápfolyadékban szinkronizáltuk, majd a sejteket a receptor antagonistákkal 5 percig előkezeltük. Ezután 0 (kontroll) 30 és 120 percig 10-8 M bombezinnel kezeltük. 20 mg teljes RNS-t 1% agarózt és 8% formaldehidet tartalmazó gélen való futtatást követően nejlon membránra vittünk át. A filtereket [32P]-dCTP-vel jelölt c-fos szondával hibridizáltattuk. A koncentrációk normalizálását az XS13 szondával végzett hibridizáció alapján végeztük el. 1=10-6 M BME+10-8 M BBS, 30 perc; 2.=10-6 M BIM+10-8 M BBS, 30 perc ; 3= 10-8 M BBS, 30 perc; 4= 10-6 M BME+10-8 M BBS, 120 perc; 5= 10-6 M BIM+10-8 M BBS, 120 perc; 6= 10-8 M BBS, 120 perc; 7= kontroll. A 18 S és 28 S a két riboszómális RNS, melyek 1.9 és 4.7 kb nagyságúak. Segítségükkel határoztuk meg az általunk kapott jelek méretét.

54

MEGBESZÉLÉS

IX. MEGBESZÉLÉS IX.1. A SZOMATOSZTATIN, MINT GÁTLÓ BIOAKTÍV ANYAG SZEREPE A DAGANATOS SEJTEK OSZTÓDÁSÁNAK CSÖKKENÉSÉBEN

Az EGF-ről és a szomatosztatin-ról számos tanulmány leírta, hogy antagonisztikus módon hatnak biokémiai és funkcionális szinteken. Az EGF növekedést serkentő hatással rendelkezik normál sejteken, és e hatás szomatosztatinnal gátolható (85). Az onkogénekkel végzett vizsgálatok alapján derült fény arra, hogy ezek a gének, mint az EGF receptor szintetizálói működhetnek; az EGF pedig, mint növekedés-serkentő faktor a kontroll nélküli sejtosztódás, vagyis a malignus transzformáció faktora is (85). 1986-ban Liebow és munkatársai számoltak be először arról, hogy MiaPaCa-2 hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalból származó sejteket növekedési faktor-mentes tápfolyadékban tartottak a kezelések előtt. Kísérleteik szerint erre azért volt szükség, mert a tenyésztés során a médiumban folyamatosan megjelenő, a sejtek által termelt EGF elfedte az egyszeri kezelés sejtosztódást serkentő hatását (85). Számos tanulmány jelent meg a szérummentes (FCS = fötális borjú szérum) tápfolyadékokhoz való alkalmazkodás témakörében is (41, 101, 157). Ennek ismeretében saját kísérleteinkben is szérummentes tápfolyadékot használtunk a kezelések alatt, ill. már a kezelések előtt egy nappal. A sejtek ilyen módon történő „éheztetésével” elértük, hogy kb. 70%-uk nyugalmi állapotba került. Ezt a folyamatot szinkronizálásnak nevezzük. A szomatosztatin sejtosztódást gátló hatását a Capan-1, a Capan-2 és a MiaPaCa-2 humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalakon vizsgáltuk. Bizonyítottuk, hogy az antiproliferatív hatást közvetítő kettes típusú receptorok (21, 22, 144) jelen vannak a sejteken. A receptor mRNS-szintekre vonatkozó megállapításainkat egy, a sejtekben állandó szinten kifejeződő gén (XS13) mRNS-ére tervezett primerrel végzett kísérletek alapján tettük (20). Specifikus primerek segítségével RT-PCR reakciókban mutattuk ki az 1105 bázispár hosszúságú cDNS termékeket Capan-1, Capan-2 és MiaPaCa-2 sejteken. A MiaPaCa-2 és Capan-1 sejtekben közel azonos mennyiségű SST-2 mRNS-t tudtunk kimutatni, míg a Capan-2 sejteken ez magasabbnak adódott (IA. Ábra). Az SST-2 receptor jelenlétét normál és daganatos vastagbél epithel sejtekben (81), normál és daganatos mellszövetekben (36), illetve

55

MEGBESZÉLÉS

prosztatában is kimutatták (119). Számos tanulmány számolt be a többi szomatosztatin receptor (SSTR-1-5) jelenlétéről is humán normál hasnyálmirigyben (21, 23, 77). Eredményeink a szomatosztatin receptor 2 altípus jelenlétét bizonyítják Capan-1, Capan-2 és MiaPaCa-2 sejtvonalakban, bár az alkalmazott sejtvonaltól és kísérleti körülményektől függően sokszor e receptor mRNS alacsony szintjéről (21, 23, 119, 159) illetve az SS immunreaktivitás hiányáról számolnak be (159). Az SST-2 receptor hiánya bizonyos szövetekben utal a tumoros folyamatok beindulására, és talán magyarázza a szomatosztatin analóg terápiák hatástalanságát is előrehaladott karcinómák esetén (23, 31, 40). A kettes típusú szomatosztatin receptor mRNS-t kifejező Capan-2 sejtvonalon tanulmányoztuk a szomatosztatin analóg Sandostatin® (octreotide acetát) hatására létrejövő, az SST-2 receptorok által közvetített folyamatokat. A sejteket egynapos szérummentes tápfolyadékban történt éheztetést követően epidermális növekedési faktor (EGF) kezeléssel serkentettük osztódásra. A 10 és 100 ng/ml EGF szignifikáns mértékben növelte a DNS-szintézis mértékét 48 órás kezelést követően (II. Ábra). Viguerie és munkatársai 24 órás 10 nM EGF kezelés alkalmazásakor hasonló eredményeket kaptak AR4-2J patkány hasnyálmirigy sejtvonalon (151). Az alkalmazandó Sandostatin koncentrációt koncentrációhatás görbe felvételével határoztuk meg (III. Ábra). Ezek ismeretében a kombinált kezelésben 100 ng/ml EGF-fet és 100 ng/ml Sandostatin-t adtunk a sejtekhez. Vizsgálatainkban a Sandostatin szignifikáns mértékben gátolta az EGF-fel osztódásra serkentett Capan-2 sejtek növekedését (IV. Ábra). AR4-2J sejteken Viguerie 10nM EGF és 10 nM koncentrációjú szomatosztatin analóg SMS 201-995 adásánál tapasztalt hasonló hatást (151). EGF-fel osztódásra serkentett MiaPaCa-2 (85) és HeLa (93) sejtek osztódásának szomatosztatinnal történt gátlásáról is beszámoltak. Később bizonyították, hogy a szomatosztatin kezelés a SST-2 receptorok aktiválása révén a tirozin-foszfatázt stimulálja; vagyis a szomatosztatin e jelátviteli útvonal beindítása révén fejti ki sejtosztódást gátló hatását (21). A Sandostatinnal azonos hatással rendelkező, RC160 nevű (vapreotide), szintén szomatosztatin analóg vegyület azonban nem gátolta sem a bazális, sem az EGF-fel osztódásra serkentett MiaPaCa-2 sejtek DNS-ének szintézisét Robertson és munkatársai szerint, melyre a [75Se]szeleno-metionin fehérje szintézis módszerrel végzett kísérletek eredményeiből következtettek (120). Ennek az ellentmondásnak az értelmezéséhez további vizsgálatok elvégzése szükséges.

56

MEGBESZÉLÉS

Eredményeink megerősítik, hogy 24 órás éheztetést követően az EGF kezelés önmagában képes serkenteni a hasnyálmirigy adenokarcinóma Capan-2 sejtek DNS-szintézisét. Egyértelműen igazoltuk, hogy a szomatosztatin analóg Sandostatin gátolja mind a kontroll (nem stimulált), mind az EGF-fel osztódásra serkentett Capan-2 sejtek DNS-szintézisének mértékét, mely összefügg a sejtciklus S-fázisába lépett populáció méretével. Az EGF-szerű növekedési faktorok szintjének csökkentése, és/vagy az általuk aktivált jelátviteli útvonalak gátlása pl. szomatosztatinnal, új terápiás megoldás lehet a hasnyálmirigy daganatos betegek kezelésében. IX.2. A

BOMBEZIN, MINT SERKENTŐ BIOAKTÍV ANYAG SZEREPE A DAGANATOS FOLYAMATOK

KIALAKULÁSÁBAN

A hasnyálmirigy növekedésének hosszútávú szabályozása fontos szerepet játszik mind az élettani, mind a patológiás folyamatokban, mint pl. a diétához való adaptációban, a gyulladás utáni regenerációban vagy a rákos sejtek burjánzásakor (92). A szabályozásban számos gasztrointesztinális hormon és neurotranszmitter vesz részt. A bombezin-szerű peptidek mind a GRP, mind az NMB receptorokon keresztül képesek hatni. RT-PCR módszerrel határoztuk meg, hogy mely receptor típusok vannak jelen és azok relatív mennyisége mennyi a négy humán hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalban (Capan-1, Capan-2, HPAF, MiaPaCa-2). A GRP receptorok mRNS-einek szintje az HPAF sejtekben volt a legmagasabb. Capan-1 és Capan-2 sejtekben ez a szint alacsonyabb volt, MiaPaCa-2 sejtekben pedig nem tudtunk GRP receptor mRNS-t kimutatni. Az NMB receptorok mRNS-einek szintje mind a négy sejtvonalban közel azonos, alacsony szinten volt (I.B Ábra). A koncentrációk hozzávetőleges azonosságát az XS13 génre tervezett primerekkel végzett PCR reakciókban kapott eredményekre normalizáltuk (I.B Ábra). A bombezin kezelés hatására létrejövő osztódás kialakulásához elengedhetetlen a GRP (és/vagy NMB) receptorok mRNS-ének jelenléte, melyet HPAF sejtekben elsőként nekünk sikerült bizonyítani RT-PCR módszerrel. Wang és munkatársai (155) HPAF és CD18 sejtekben már 1996-ban specifikus, nagy affinitású GRP kötőhelyeket találtak „receptor kötés” módszert alkalmazva. Ilyen módon azonban NMB-kötő helyeket nem tudtak kimutatni (155), míg mi a sokkal érzékenyebb RT-PCR technikával detektáltuk az alacsony szinten kifejeződő NMB receptorok mRNS-eit.

57

MEGBESZÉLÉS

Korábbi RT-PCR-ral végzett tanulmányok bombezin receptorok jelenlétét írták le különböző daganatos és nem-daganatos sejtvonalakban, így humán hörgőből származó epithel sejtekben (HBE), nem-kissejtes tüdőrákban (NSCLC) (32) és kissejtes tüdőrák NCI-H345 nevű sejtkultúrájában (1, 28, 68). Humán melanoma sejtekben (HBL, Me-28, D-10, A375-6) (109) és humán prosztata sejtvonalakban (DU-145, PC-3, LNCaP) (3) csak a GRP receptor mRNS-ének jelenlétéről számoltak be. A legújabb kísérletekben krónikusan gyulladt hasnyálmirigy exokrin parenchymájában és a duktális karcinómát körülvevő kiserek falában is találtak GRP receptorokat receptor autoradiográfiás módszerrel (43). Ugyanezen szövetminták Langerhans-szigeteiben BB3 receptort is kimutattak (43). A GRP receptorok száma változó volt, de számuk független volt a fibrózis vagy gyulladás mértékétől (43). A GRP receptorok jelenlétét Fleischmann kétféleképpen magyarázza krónikus hasnyálmirigy gyulladás esetén. Jól ismert, 1) hogy a bombezin és a bombezin-szerű peptidek mitogén hatást fejtenek ki a normál hasnyálmirigyre, és a mirigy növekedését okozzák szoptatott és felnőtt állatokban (43). Flesichmann szerint a mirigy a receptorok megjelenésével, és azon keresztül a GRP trofikus hatásával ellensúlyozza a gyulladás miatt kialakuló parenchymacsökkenést. Ilyen módon következik be a mirigy regenerációja. Továbbá a 2) krónikusan gyulladt hasnyálmirigy esetén a receptorok jelenléte kapcsolatban állhat a külső és belső beidegzés változásával is (43). A GRP receptorok rendellenes neuronális információt továbbítanak az exokrin mirigy többi részébe, mely neurotranszmisszió a gyulladás során jelentkező fájdalom feltételezett okozója (43). A GRP-ről, a CCK-ról és a szekretinről már bizonyították, hogy fokozzák a hasnyálmirigy enzim- és folyadékszekrécióját. Az RT-PCR-es kísérletekkel párhuzamosan sejtosztódási vizsgálatokat is végeztünk annak eldöntésére, vajon a GRP, illetve a bombezin rendelkezik-e trofikus hatással. A humán adenokarcinóma HPAF sejteket egynapos szérummentes tápfolyadékban történt szinkronizálást követően 10-14-10-8 M koncentrációjú bombezinnel 24 órán át kezeltük. 10-11 M koncentrációjú bombezin alkalmazása már szignifikáns mértékben növelte az HPAF sejtek DNS-ének szintézisét (V. Ábra). A hatás nagyságát a DNS-be beépült tríciált timidin kontrollhoz viszonyított értékével jellemeztük; az értékeket százalékban adtuk meg. Maximális serkentő hatást 10-8 M koncentrációjú bombezin kezelés váltott ki (V. Ábra). Eredményeink alátámasztják Hajri, Avis és Wang megállapításait, akik primér eredetű hasnyálmirigy sejtvonalban (54), Capan (5) és HPAF sejtekben (155) szintén a DNS-szintézis koncentráció- és időfüggő növekedését tapasztalták GRP kezelést

58

MEGBESZÉLÉS

követően. A bombezin azonban nemcsak hasnyálmirigy, de vastagbél (Isreco1) (126), gyomor (SIIA, AGS, MKN 45) (69) és egér embrióból származó fibroblaszt (Swiss 3T3) sejtvonalak osztódását is serkenti (132). Timidin inkorporációs kísérleteket a Capan-1, Capan-2 és MiaPaCa-2 sejtvonalakon is végeztünk. Az HPAF sejteken maximális hatást elérő bombezin koncentráció azonban egyik sejtvonal DNS-szintézisét sem fokozta (I. Táblázat). Ez a MiaPaCa-2 sejtvonal esetén nem meglepő, - melyről Liehr is beszámolt (86) - hiszen RT-PCR módszerrel mi sem tudtunk GRP receptor mRNS-t kimutatni (I.B Ábra). NMB receptor mRNS-t kis mennyiségben deteltáltunk, de hipotézisünk szerint, melyet az antagonistákkal végzett kísérleteinkben igazoltunk is, az NMB receptorok nem játszanak szerepet a bombezin kiváltotta jelátviteli folyamatokban. Capan-1 és Capan-2 sejtekben a sejtosztódás fokozódás elmaradása nem magyarázható ezzel. Mi az egyik legérzékenyebb módszert alkalmazva RT-PCR-ral (I.B Ábra), míg Avis és munkatársai „receptor kötés” módszerrel mutatták ki a GRP receptorok jelenlétét (5). Eredményeink szerint a GRP receptor mRNS-szint alacsonyabb volt Capan-1 és Capan-2 sejtekben az HPAF-ban találtakhoz viszonyítva (I.B Ábra). Tehát a receptorok megléte szükséges, de nem elégséges feltétele a bombezin kezelés hatására létrejövő DNS-szintézis emelkedésnek. Véleményünk szerint arról lehet szó, hogy bár az mRNS-ek jelen vannak, azonban vagy nem íródik át működőképes receptorfehérje, vagy a receptorszám nem elegendő a sejtosztódás beindításához. A fenti eredmények ismeretében további vizsgálataink modellezéséhez az HPAF humán, duktális eredetű hasnyálmirigy adenokarcinóma sejtvonalat választottuk. A működőképes receptorokat kifejező HPAF sejtek bombezin kezelés hatására osztódni kezdenek (V. Ábra). De vajon milyen mechanizmus(ok) révén serkenti a bombezin a jelátviteli útvonal kaszkádrendszerének elemeit, ami végül a sejtek osztódásához vezet? E

kérdéskör

megválaszolásához

elsőként

a

sejten

belüli

kalciumraktárak

kalcium-szintjének változását tanulmányoztuk bombezin kezelés hatására. Mikrospektrofluorometriás méréssel igazoltuk, hogy a kezelés a sejten belüli raktárakból a kalcium gyors felszabadulását eredményezi HPAF sejtekben (VII. Ábra). A bombezin-szerű peptidek receptorai hét transzmembrán doménnel rendelkező, egymáshoz nagymértékben hasonló fehérjékből állnak. A receptorokról a jelzést a heterotrimer GTP-kötő fehérjék (G-fehérje, a receptorok pedig a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok), mint jelátalakítók közvetítik a sejt

59

MEGBESZÉLÉS

számára. Az extracelluláris bombezin kapcsolódása a GRP és/vagy NMB receptorokhoz a receptorszerkezet változását eredményezi, melynek hatására a receptorok kölcsönhatásba lépnek a G-fehérjével. A három alegységből álló, aktivált G-fehérjéről a Gq típusú α-alegység disszociálódik és kölcsönhatásba lép a sejtmembránban található foszfolipáz C (PLC) effektor molekulával. Az aktiváció a PLC enzim hidrolíziséhez vezet, melynek során IP3 és DG keletkezik. Az IP3 további kötődéseken keresztül kalciumot szabadít fel a sejten belüli raktárakból (intracelluláris kalcium raktár) (62, 122). A bombezin kezelés hatására létrejövő kalcium-szint emelkedéssel igazoltuk, hogy az HPAF sejtek működőképes receptorokat hordoznak (VII-VIII. Ábra). Bombezin kezelés hatására létrejövő kalcium felszabadulást humán vastagbél NCI-H716 (47) és Iscreo1 sejtvonalban (126), Swiss 3T3 sejtvonalban (132), humán kissejtes tüdő sejtvonalban (NCI-H345) (28), humán gyomor eredetű SIIA sejtvonalban (69) és humán melanoma A375-6 sejtvonalban (3, 28, 47, 69, 109, 126, 132) is leírtak. AR4-2J, acinus eredetű patkány sejtvonalban szintén kimutatták a bombezin kezelés hatására létrejövő kalcium-szint növekedést (133). Hellmich és munkatársai a humán hasnyálmirigyből származó, metasztatizáló, GRP receptorokkal transzfektált BON sejtvonal esetén a bombezin koncentrációtól függő kalcium választ kapott (56). A

bombezin-szerű

peptidek

sejten

belüli

szerepének

vizsgálatához

modellrendszerként először Swiss 3T3 sejtvonalat használtak. Ezen a sejtvonalon az agonisták és a sejteken jelenlévő GRP receptorok kölcsönhatása révén nemcsak a PLC, de az adenilátcikláz jelátviteli útvonal is aktiválódik (12, 50). Saját kísérleteinkben az HPAF sejtek bombezinnel történt serkentése nem növelte a cAMP szintet, de 5 mM forskolinnal végzett kezelés igen (IX. Ábra). Ugyanezt találták kissejtes tüdőrákban (SCLC sejtvonal) és normál, rágcsálóból származó hasnyálmirigy acinus sejtek esetén is (50). A bombezin receptoroknak az a tulajdonsága, hogy egyes sejtvonalakban képesek, másokban viszont nem képesek a cAMP-szint emelésére, kapcsolatban lehet azzal, hogy a PKC a különböző sejtekben eltérő adenilát cikláz altípust aktiválhat, más PKC izoforma lehet jelen, vagy a PLA2 aktiválása jön létre. Az még tisztázatlan, hogy a bombezin receptor hogyan képes a különböző, sejttípustól függő jelátviteli utak aktiválására (50). A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok aktiválása a jelátviteli útvonal újabb és újabb elemeinek

működésbe

lépésén

keresztül

a

sejtmagon

belüli

protoonkogének

és

tumor-szuppresszor gének mRNS-szintjének növekedését idézi elő (149). Hormonok és

60

MEGBESZÉLÉS

neuropeptidek aktiválják receptoraikat, ami a c-fos, c-jun és c-myc korai gének, vagy másképpen transzkripciós faktorok szintjének gyors emelkedését eredményezi (123). A megemelkedett c-fos mRNS-szint a transzlációt követően gyors c-Fos fehérje termelődéshez vezet. A c-Fos fehérje kölcsönhatásba lép a c-Jun fehérjével, a létrejövő heterodimer pedig aktiválja a növekedést serkentő gének AP-1 régióját (TGACTCA) (72), ami végül a sejtek osztódásához vezet. Vizsgálatokat végeztünk annak eldöntésére, hogy vajon a bombezin-szerű peptidek mely gének aktiválásán keresztül fokozzák a sejtek osztódását. Számos, nem hasnyálmirigy eredetű sejtvonal, így Swiss 3T3 (123), SAII (69), SCLC (33) és patkány hasnyálmirigy acinus sejtek (92) esetén már bizonyították, hogy bombezin kezelés hatására nő a celluláris onkogének (c-fos, c-myc, c-jun, jun-B) mRNS-szintje. Félórás, kétórás és négyórás bombezin kezelés hatására létrejövő c-fos, c-myc és HMG-I(Y) mRNS-szintek változásait vizsgáltuk Northern hibridizációval. A c-fos gén mRNS-ének szintje 30 perces bombezin kezelést (10-8 M) követően a hétszeresére emelkedett, míg a c-myc gén mRNS-ének szintje kétórás kezelésnél érte el maximális értékét (X. Ábra). Ez a kezelés idejétől függő mRNS-szint változás megegyezik a (nyugvó) Swiss 3T3 fibroblaszt sejteken kapott mintázattal (123, 132). A HMG-I(Y) a nagy mobilitású fehérjék családjába tartozó gének, amiket „késleltetett korai géneknek” is szoktak hívni (45), egy másik fontos összekötő kapocs a receptor aktiválása és a jelátviteli út végén létrejövő sejtosztódás között. A HMG-I és Y mRNS-ek alternatív splicing termékei, a gén a 6. kromoszóma rövid karján található (67). A HMG-I(Y) gén mRNS-ének szintje NIH/3T3 sejtekben gyorsan növekszik, mialatt a sejtek a nyugvó állapotból (G0/G1) osztódni kezdenek (késői S) (67). A G2 és M fázisokban szintjük állandó, kifejeződésük már nem a sejtciklus által szabályozott, bár egyéb celluláris faktorok, mint a c-fos vagy c-myc protoonkogének aktiválhatják, ill. növelhetik a HMG-I(Y) mRNS-szintet (67). In vivo a HMG-I(Y) génről termelődött nem-hiszton fehérje a metafázisos kromoszómák A-T gazdag G/Q és C kötéseihez és szerkezetstabilizáló, úgynevezett “scaffold-kapcsolt régióihoz” kötött (115). Tudjuk, hogy elsődlegesen a B-forma DNS A-T szekvenciáinak keskeny, kicsi barázdáinak a szerkezetét ismerik fel, így közvetlenül képesek befolyásolni a kromatin konformációját.

Következésképpen

közvetett

módon

befolyásolják

olyan

gének

(in)aktivációját, melyek hatással vannak a sejtek osztódására és/vagy differenciációjára (67).

61

MEGBESZÉLÉS

Ezek a tulajdonságok, és az, hogy képes több ismert transzkripciós faktorral is kölcsönhatásba lépni, képessé teszik a HMG-I(Y) fehérjét arra, hogy számos emlős gén esetén úgynevezett „szerkezeti transzkripciós faktorként” működjön (115, 156). Kísérleteink szerint a bombezin kezelés megemelte a HMG-I(Y) gén mRNS-ének szintjét HPAF sejtekben . A legnagyobb mRNS-szint változást 4 órás (maximális idejű) kezelést követően tapasztaltuk (X. Ábra), ami arra utal, hogy a HMG-I(Y) gén „működésének beindulása” egy későbbi esemény a jelátviteli folyamatok kaszkádrendszerében. A HMG-I(Y) gén és a G-fehérje kapcsolt receptorokon keresztül a sejtek osztódásához vezető folyamatról először mi számoltunk be. IX.2.1. A BOMBEZIN RECEPTOR-ANTAGONISTÁK HATÁSAI Annak eldöntésére, hogy a bombezin hatása GRP és/vagy NMB receptorok által közvetített folyamat-e, a sejteket a specifikus receptor antagonisták jelenlétében is kezeltük. Az első GRP receptor elleni antagonista (BME) szelektíven csak a GRP receptorokon keresztül ható agonisták hatásait gátolta. A BME affinitás konstansa 1.29 nM a GRP receptorokra (63, 97, 148). Ladenheim és Coy (78) ezt követően szintetizálták és jellemezték a BIM-23127 nevű, szelektív NMB receptor antagonistát. A BIM-23127 100-szor nagyobb affinitással kötődik az NMB, mint a GRP receptorokhoz (78, 97). A korábbiakban leírt sejtosztódási kísérleteket végeztünk azzal az eltéréssel, hogy a specifikus receptor antagonistákat a bombezin kezelést megelőzően öt perccel alkalmaztuk. Kimutattuk, hogy 10-6 M BME szignifikánsan csökkentette a bombezinnel osztódásra serkentett HPAF sejtek DNS-ének szintézisét (VI. Ábra). Wang és munkatársai hasonló következtetésre jutottak; az RC-3095 specifikus bombezin antagonista alkalmazásakor (155). A sejtosztódási kísérletekhez hasonlóan 10-6 M BME kezelés visszaszorította a bombezin adására felszabaduló intracelluláris kalcium-szintet (VIII. Ábra). Frucht és munkatársai humán vastagbél sejtvonalon szintén BME kezeléssel gátolták a [Tyr4]bombezin adását követő [Ca2+]i emelkedést (47). Megvizsgáltuk az antagonisták hatásait a gének kifejeződésére is. Eredményeinkkel első ízben sikerült igazolni, hogy a szelektív GRP receptor antagonista BME teljes mértékben visszaszorítja a bombezin (30 perces kezelés) kiváltotta c-fos mRNS-szint növekedést (VIII. Ábra).

62

MEGBESZÉLÉS

Az NMB receptor antagonista BIM-23127 nem volt hatással sem a sejtosztódásra (VI. Ábra), sem a kalcium-szint változására (VIII. Ábra), sem a gének mRNS-einek kifejeződésére (XI. Ábra). Ennek alapján azt mondhatjuk, hogy a bombezin hatása a gének kifejeződésére, a kalcium-szint változására és a sejtek osztódására az HPAF sejtvonalban a GRP receptorok által közvetített folyamat. Habár kimutattuk az NMB receptorok mRNS-ének jelenlétét is, az antagonista alkalmazásakor nem tapasztaltunk gátlást. Ebből arra következtetünk, hogy az mRNS-ről képződött NMB receptor fehérje nincs jelen, vagy a működőképességhez elégtelen számban. Bunnetthez hasonlóan azt a megállapítást tehetjük, hogy a perifériális bombezin receptorok legnagyobb hányada a GRP típusú receptorok családjába tartozik emlősökben (18). A halállal végződő daganatos megbetegedések között a hasnyálmirigy daganatok az ötödik helyet foglalják el a nyugati társadalmakban. A betegség egyéves túlélési rátája 12%, míg az ötéves csak 3-5% (75). A betegség diagnosztizálása általában olyan késői fázisban történik, ahol már műtéttel sem lehet segíteni. A műtét nélküli gyógymódok pedig egyelőre nem elég hatásosak a tumor nagyfokú áttétképési hajlama és a citotoxikus anyagokkal szembeni rezisztenciája miatt. A receptorok meghatározása és jellemzése segíthet abban, hogy e betegség kimenetele peptid analógokkal végzett terápiák segítségével befolyásolható legyen. Kísérleteink alapján a humán adenokarcinóma HPAF sejtvonal megfelelő modellrendszer a bombezin-szerű peptidek alkalmazásakor lejátszódó folyamatok, és ezáltal a peptid sejtosztódást befolyásoló hatásainak a tanulmányozásához.

63

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

X. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani egyetemi témavezetőmnek Dr. Marcsek Zoltánnak, aki már diákéveim alatt bevezetett a tudományos kutatómunka szépségébe, döntően befolyásolva ezzel pályaválasztásomat. További köszönetet szeretnék mondani tanítómesteremnek Dr. Varga Gábornak, az MTA Doktorának, akinek szakmai segítsége és tanácsai nélkül e munka nem készülhetett volna el. Ő tanított meg a tudományos gondolkodásra és Neki köszönhetem, hogy számos konferencián, illetve hosszabb idejű tanulmányúton vehettem részt. Hálával tartozom munkatársaimnak, akik fáradságot és időt nem kímélve, nagy segítségemre voltak a dolgozat elkészítésében: Dr. Barta Adriennek, Benkő Juliannának, Horváth Évának, Kordás Krisztinának, Dr. Morschl Évának, Dr. Kittel Ágnesnek, Rácz Gábornak, Dr. Sarkady Emesének és Dr. Szalmay Gábornak. Külön köszönet Harasztiné Jacso Mártának, aki az első perctől kezdve a szívébe zárt, és nemcsak a munkámban, de lelkiekben is a társam volt. A doktori értekezésben szereplő tudományos eredmények létrejöttében kulcsszerepet játszottak Barabás Kornélia, Mergl Zsuzsanna, Flautner Lajos Professzor, Dr. Thomas Gress, PD. és Martin C. Steward, Ph.D., akiknek ezért külön köszönöm igen értékes munkájukat. Végül, de nem utolsósorban szeretném megköszönni Szüleimnek és Nagymamámnak, hogy egy élet munkájával megteremtették a feltételeit annak, hogy a tudományos pályát választhassam.

64

IRODALOMJEGYZÉK

XI. IRODALOMJEGYZÉK 1. Aguayo SM, Miller Y, Boose D, Holley M, Portanova LB, Schuyler KD, Kane MA. (1996) Nonconstitutive expression of the gastrin-releasing peptide autocrine growth system in human small cell lung carcinoma NCI-H345 cells. Cell Growth Differ 7: 563-72. 2. Ahn NG. (1993) The MAP kinase cascade. Discovery of a new signal transduction pathway. Mol Cell Biochem 127-128: 201-9. 3. Aprikian AG, Han K, Chevalier S, Bazinet M, Viallet J. (1996) Bombesin specifically induces intracellular calcium mobilization via gastrin-releasing peptide receptors in human prostate cancer cells. J Mol Endocrinol 16: 297-306. 4. Arimura A, Sato H, Dupont A, Nishi N, Schally AV. (1975) Somatostatin: abundance of immunoreactive hormone in rat stomach and pancreas. Science 189: 1007-9. 5. Avis I, Jett M, Kasprzyk PG, Cuttitta F, Treston AM, Maneckjee R, Mulshine JL. (1993) Effect of gastrin-releasing peptide on the pancreatic tumor cell line (Capan). Mol Carcinog 8: 214-20. 6. Bass RT, Buckwalter BL, Patel BP, Pausch MH, Price LA, Strnad J, Hadcock JR. (1996) Identification and characterization of novel somatostatin antagonists. Mol Pharmacol 50: 709-15. 7. Basso N, Giri S, Lezoche E, Materia A, Melchiorri P, Speranza V. (1976) Effect of secretin, glucagon and duodenal acidification on bombesin-induced hypergastrinemia in man. Am J Gastroenterol 66: 448-51. 8. Battey J, Wada E, Corjay M, Way J, Fathi Z, Shapira H, Harkins R, Wu J, Slattery T, Mann E. (1992) Molecular genetic analysis of two distinct receptors for mammalian bombesinlike peptides. J Natl Cancer Inst Monogr 13: 141-4. 9. Battey JF, Way JM, Corjay MH, Shapira H, Kusano K, Harkins R, Wu JM, Slattery T, Mann E, Feldman RI. (1991) Molecular cloning of the bombesin/gastrin-releasing peptide receptor from Swiss 3T3 cells. Proc Natl Acad Sci U S A 88: 395-9. 10. Bayliss WM, Starling EH. (1902) The mechanism of pancreatic secretion. J Physiol (Lond) 28: 325-353. 11. Bayliss WM, Starling EH. (1902) On the causation of the socalled peripheral reflex secretion of the pancreas. Proc R Soc Lond B Biol Sci 69: 352-353. 12. Benya RV, Fathi Z, Kusui T, Pradhan T, Battey JF, Jensen RT. (1994) Gastrin-releasing peptide receptor-induced internalization, down- regulation, desensitization, and growth: possible role for cyclic AMP. Mol Pharmacol 46: 235-45. 13. Bommelaer G, Rozental G, Bernier C, Vaysse N, Ribet A. (1981) Action of secretagogues on amylase release from dog pancreatic acini. Digestion 21: 248-54. 14. Bousquet C, Puente E, Buscail L, Vaysse N, Susini C. (2001) Antiproliferative effect of somatostatin and analogs. Chemotherapy 47: 30-9.

65

IRODALOMJEGYZÉK

15. Brazeau P, Vale W, Burgus R, Ling N, Butcher M, Rivier J, Guillemin R. (1973) Hypothalamic polypeptide that inhibits the secretion of immunoreactive pituitary growth hormone. Science 179: 77-9. 16. Brooker G, Harper JF, Terasaki WL, Moylan RD. (1979) Radioimmunoassay of cyclic AMP and cyclic GMP. Adv Cyclic Nucleotide Res 10: 1-33. 17. Brown M, Marki W, Rivier J. (1980) Is gastrin releasing peptide mammalian bombesin? Life Sci 27: 125-8. 18. Bunnett N. (1994) Gastrin-releasing peptide. pp. 423-445 in Gut Peptides: Biochemistry and Physiology. Walsh JH, Dockray GJ (eds), Raven Press, New York. 19. Burghardt B, Kisfalvi K, Varga G, Papp M. (1998) Agonists and antagonists of regulatory peptides as tools to study regulation of pancreatic exocrine secretion, cell proliferation and gene expression. Scand J Gastroenterol Suppl 228: 11-20. 20. Burghardt B, Wenger C, Barabas K, Racz G, Olah A, Flautner L, Coy DH, Gress TM, Varga G. (2001) GRP-receptor-mediated signal transduction, gene expression and DNA synthesis in the human pancreatic adenocarcinoma cell line HPAF. Peptides 22: 1119-28. 21. Buscail L, Delesque N, Esteve JP, Saint-Laurent N, Prats H, Clerc P, Robberecht P, Bell GI, Liebow C, Schally AV, et al. (1994) Stimulation of tyrosine phosphatase and inhibition of cell proliferation by somatostatin analogues: mediation by human somatostatin receptor subtypes SSTR1 and SSTR2. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 2315-9. 22. Buscail L, Esteve JP, Saint-Laurent N, Bertrand V, Reisine T, O'Carroll AM, Bell GI, Schally AV, Vaysse N, Susini C. (1995) Inhibition of cell proliferation by the somatostatin analogue RC-160 is mediated by somatostatin receptor subtypes SSTR2 and SSTR5 through different mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 1580-4. 23. Buscail L, Saint-Laurent N, Chastre E, Vaillant JC, Gespach C, Capella G, Kalthoff H, Lluis F, Vaysse N, Susini C. (1996) Loss of sst2 somatostatin receptor gene expression in human pancreatic and colorectal cancer. Cancer Research 56: 1823-7. 24. Chayvialle JA, Miyata M, Rayford PL, Thompson JC. (1980) Effects of test meal, intragastric nutrients, and intraduodenal bile on plasma concentrations of immunoreactive somatostatin and vasoactive intestinal peptide in dogs. Gastroenterology 79: 844-52. 25. Chiba T, Sugano K, Park J, Yamada T. (1987) Potential mediation of somatostatin secretion from canine fundic D-cells by protein kinase c. Am J Physiol 253: G62-7. 26. Cohen S. (1962) Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the newborn anomal. J. Biol. Chem. 237: 1155-1162. 27. Cohen S, Taylor JM. (1974) Epidermal growth factor: chemical and biological characterization. Recent Prog Horm Res 30: 533-50. 28. Corjay MH, Dobrzanski DJ, Way JM, Viallet J, Shapira H, Worland P, Sausville EA, Battey JF. (1991) Two distinct bombesin receptor subtypes are expressed and functional in human lung carcinoma cells. J Biol Chem 266: 18771-9.

66

IRODALOMJEGYZÉK

29. Costa M, Furness JB, Smith IJ, Davies B, Oliver J. (1980) An immunohistochemical study of the projections of somatostatin-containing neurons in the guinea-pig intestine. Neuroscience 5: 841-52. 30. Cuttitta F, Carney DN, Mulshine J, Moody TW, Fedorko J, Fischler A, Minna JD. (1985) Bombesin-like peptides can function as autocrine growth factors in human small-cell lung cancer. Nature 316: 823-6. 31. Delesque N, Buscail L, Esteve JP, Saint-Laurent N, Muller C, Weckbecker G, Bruns C, Vaysse N, Susini C. (1997) sst2 somatostatin receptor expression reverses tumorigenicity of human pancreatic cancer cells. Cancer Res 57: 956-62. 32. DeMichele MA, Davis AL, Hunt JD, Landreneau RJ, Siegfried JM. (1994) Expression of mRNA for three bombesin receptor subtypes in human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol 11: 66-74. 33. Draoui M, Chung P, Park M, Birrer M, Jakowlew S, Moody TW. (1995) Bombesin stimulates c-fos and c-jun mRNAs in small cell lung cancer cells. Peptides 16: 289-92. 34. Edkins JS. (1905) The chemical mechanism of gastric secretion. J Physil (Lond) 34: 133-144. 35. Erspamer V, Erpamer GF, Inselvini M. (1970) Some pharmacological actions of alytesin and bombesin. J Pharm Pharmacol 22: 875-6. 36. Evans AA, Crook T, Laws SA, Gough AC, Royle GT, Primrose JN. (1997) Analysis of somatostatin receptor subtype mRNA expression in human breast cancer. Br J Cancer 75: 798-803. 37. Fathi Z, Corjay MH, Shapira H, Wada E, Benya R, Jensen R, Viallet J, Sausville EA, Battey JF. (1993) BRS-3: a novel bombesin receptor subtype selectively expressed in testis and lung carcinoma cells. J Biol Chem 268: 5979-84. 38. Feldman EJ, Aures D, Grossman MI. (1978) Epidermal growth factor stimulates ornithine decarboxylase activity in the digestive tract of mouse. Proc Soc Exp Biol Med 159: 400-2. 39. Feldman RI, Bartholdi MF, Wu JM. (1996) Bombesin-like peptide receptor subtypes promote mitogenesis, which requires persistent receptor signaling. Mol Pharmacol 50: 134654. 40. Ferjoux G, Bousquet C, Cordelier P, Benali N, Lopez F, Rochaix P, Buscail L, Susini C. (2000) Signal transduction of somatostatin receptors negatively controlling cell proliferation. J Physiol Paris 94: 205-10. 41. Fernandez E, Fallon MJ, Frazier ML, de Llorens R, Cuchillo CM. (1994) Expression of acinar and ductal products in Capan-1 cells growing in synthetic serum and serum-free media. Cancer 73: 2285-95. 42. Feyrter F. (1954) Über die peripheren endokrinen (parakrinen) Drüsen des Menschen. 43. Fleischmann A, Laderach U, Friess H, Buechler MW, Reubi JC. (2000) Bombesin receptors in distinct tissue compartments of human pancreatic diseases. Lab Invest 80: 1807-17.

67

IRODALOMJEGYZÉK

44. Francis BH, Baskin DG, Saunders DR, Ensinck JW. (1990) Distribution of somatostatin14 and somatostatin-28 gastrointestinal-pancreatic cells of rats and humans. Gastroenterology 99: 1283-91. 45. Friedmann M, Holth LT, Zoghbi HY, Reeves R. (1993) Organization, inducible-expression and chromosome localization of the human HMG-I(Y) nonhistone protein gene. Nucleic Acids Res 21: 4259-67. 46. Friess H, Yamanaka Y, Kobrin MS, Do DA, Buchler MW, Korc M. (1995) Enhanced erbB-3 expression in human pancreatic cancer correlates with tumor progression. Clin Cancer Res 1: 1413-20. 47. Frucht H, Gazdar AF, Park JA, Oie H, Jensen RT. (1992) Characterization of functional receptors for gastrointestinal hormones on human colon cancer cells. Cancer Res 52: 111422. 48. Fujita T, Kobayashi S. (1971) Experimentally induced granule release in the endocrine cells of dog pyloric antrum. Z Zellforsch Mikrosk Anat 116: 52-60. 49. Fujita T, Kobayashi S. (1973) The cells and hormones of the GEP endocrine system --the current of studies. pp. 1-16 in Gastro-entero-pancreatic endocrine system. A cell-biological approach. Fujita T (eds), Igaku Shoin, Tokyo. 50. Garcia LJ, Pradhan TK, Weber HC, Moody TW, Jensen RT. (1997) The gastrin-releasing peptide receptor is differentially coupled to adenylate cyclase and phospholipase C in different tissues. Biochim Biophys Acta 1356: 343-54. 51. Ghatei MA, George SK, Major JH, Carlei F, Polak JM, Bloom SR. (1984) Bombesin-like immunoreactivity in the pancreas of man and other mammalian species. Experientia 40: 884-6. 52. Ghatei MA, Jung RT, Stevenson JC, Hillyard CJ, Adrian TE, Lee YC, Christofides ND, Sarson DL, Mashiter K, MacIntyre I, Bloom SR. (1982) Bombesin: action on gut hormones and calcium in man. J Clin Endocrinol Metab 54: 980-5. 53. Gregory H. (1964) The antral hormone gastrin. I. Structure of gastrin. Nature 204: 931-933. 54. Hajri A, Balboni G, Koenig M, Garaud JC, Damge C. (1992) Gastrin-releasing peptide: in vivo and in vitro growth effects on an acinar pancreatic carcinoma. Cancer Res 52: 3726-32. 55. Hajri A, Koenig M, Balboni G, Damge C. (1996) Expression and characterization of gastrin-releasing peptide receptor in normal and cancerous pancreas. Pancreas 12: 25-35. 56. Hellmich MR, Ives KL, Udupi V, Soloff MS, Greeley GH, Jr., Christensen BN, Townsend CM, Jr. (1999) Multiple protein kinase pathways are involved in gastrin-releasing peptide receptor-regulated secretion. J Biol Chem 274: 23901-9. 57. Hokfelt T, Johansson O, Efendic S, Luft R, Arimura A. (1975) Are there somatostatincontaining nerves in the rat gut? Immunohistochemical evidence for a new type of peripheral nerves. Experientia 31: 852-4.

68

IRODALOMJEGYZÉK

58. Holst JJ, Jensen SL, Knuhtsen S, Nielsen OV, Rehfeld JF. (1983) Effect of vagus, gastric inhibitory polypeptide, and HCl on gastrin and somatostatin release from perfused pig antrum. Am J Physiol 244: G515-22. 59. Ivy AC. (1928) The hormone mechanism for gallbladder contraction and evacuation. Am J Physiol 86: 599-613. 60. Iwanaga T, Ito S, Yamada Y, Fujita T. (1983) Cytochemical demonstration of somatostatin 28-(1-14)-like immunoreactivity in the rat hypothalamus and gastro-entero-pancreatic endocrine system. Endocrinology 113: 1839-44. 61. Iwatsuki N, Petersen OH. (1978) In vitro action of bombesin on amylase secretion, membrane potential, and membrane resistance in rat and mouse pancreatic acinar cells. A comparison with other secretagogues. J Clin Invest 61: 41-6. 62. Jensen RT. (1994) Receptors for Bombesins. pp. 1387-1393 in Physiology of the Gastrointestinal tract. Johnson LR (eds), Raven Press, New York. 63. Jensen RT, Coy DH. (1991) Progress in the development of potent bombesin receptor antagonists. Trends Pharmacol Sci 12: 13-9. 64. Jensen RT, Jones SW, Lu YA, Xu JC, Folkers K, Gardner JD. (1984) Interaction of substance P antagonists with substance P receptors on dispersed pancreatic acini. Biochim Biophys Acta 804: 181-91. 65. Jian X, Sainz E, Clark WA, Jensen RT, Battey JF, Northup JK. (1999) The bombesin receptor subtypes have distinct G protein specificities. J Biol Chem 274: 11573-81. 66. Johansson C, Kollberg B, Efendic S, Uvnas-Wallensten K. (1981) Effects of graded doses of somatostatin on gallbladder emptying and pancreatic enzyme output after oral glucose in man. Digestion 22: 24-31. 67. Johnson KR, Disney JE, Wyatt CR, Reeves R. (1990) Expression of mRNAs encoding mammalian chromosomal proteins HMG-I and HMG-Y during cellular proliferation. Exp Cell Res 187: 69-76. 68. Kane MA, Toi-Scott M, Johnson GL, Kelley KK, Boose D, Escobedo-Morse A. (1996) Bombesin-like peptide receptors in human bronchial epithelial cells. Peptides 17: 111-8. 69. Kim HJ, Evers BM, Guo Y, Banker NA, Hellmich MR, Townsend CM, Jr. (1996) Bombesin-mediated AP-1 activation in a human gastric cancer (SIIA). Surgery 120: 130-6; discussion 136-7. 70. Kleuss C, Scherubl H, Hescheler J, Schultz G, Wittig B. (1993) Selectivity in signal transduction determined by gamma subunits of heterotrimeric G proteins. Science 259: 8324. 71. Knigge U, Holst JJ, Knuhtsen S, Petersen B, Krarup T, Holst-Pedersen J, Christiansen PM. (1984) Gastrin-releasing peptide: pharmacokinetics and effects on gastro-entero-pancreatic hormones and gastric secretion in normal men. J Clin Endocrinol Metab 59: 310-5. 72. Koh SW, Leyton J, Moody TW. (1999) Bombesin activates MAP kinase in non-small cell lung cancer cells. Peptides 20: 121-6.

69

IRODALOMJEGYZÉK

73. Konturek SJ, Krol R, Tasler J. (1976) Effect of bombesin and related peptides on the release and action of intestinal hormones on pancreatic secretion. J Physiol 257: 663-72. 74. Korc M. (1991) Growth factors and pancreatic cancer. Int J Pancreatol 9: 87-91. 75. Korc M. (1998) Role of polypeptide growth factors and their receptors in human pancreatic cancer. pp. 21-32 in Pancreatic cancer: pathogenesis, diagnosis and treatment. Reber HA (eds), Humana Press Inc., Totowa, NJ. 76. Korc M, Meltzer P, Trent J. (1986) Enhanced expression of epidermal growth factor receptor correlates with alterations of chromosome 7 in human pancreatic cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 83: 5141-4. 77. Kumar U, Sasi R, Suresh S, Patel A, Thangaraju M, Metrakos P, Patel SC, Patel YC. (1999) Subtype-selective expression of the five somatostatin receptors (hSSTR1-5) in human pancreatic islet cells: a quantitative double-label immunohistochemical analysis. Diabetes 48: 77-85. 78. Ladenheim EE, Taylor JE, Coy DH, Moran TH. (1994) Blockade of feeding inhibition by neuromedin B using a selective receptor antagonist. Eur J Pharmacol 271: R7-9. 79. Larsson LI. (1980) Gastrointestinal cells producing endocrine, neurocrine and paracrine messengers. Clin Gastroenterol 9: 485-16. 80. Larsson LI, Goltermann N, de Magistris L, Rehfeld JF, Schwartz TW. (1979) Somatostatin cell processes as pathways for paracrine secretion. Science 205: 1393-5. 81. Laws SA, Gough AC, Evans AA, Bains MA, Primrose JN. (1997) Somatostatin receptor subtype mRNA expression in human colorectal cancer and normal colonic mucosae. Br J Cancer 75: 360-6. 82. Layton JE, Scanlon DB, Soveny C, Morstyn G. (1988) Effects of bombesin antagonists on the growth of small cell lung cancer cells in vitro. Cancer Res 48: 4783-9. 83. Lehy T, Puccio F, Chariot J, Labeille D. (1986) Stimulating effect of bombesin on the growth of gastrointestinal tract and pancreas in suckling rats. Gastroenterology 90: 1942-9. 84. Lemoine NR, Hughes CM, Barton CM, Poulsom R, Jeffery RE, Kloppel G, Hall PA, Gullick WJ. (1992) The epidermal growth factor receptor in human pancreatic cancer. J Pathol 166: 7-12. 85. Liebow C, Hierowski M, duSapin K. (1986) Hormonal control of pancreatic cancer growth. Pancreas 1: 44-8. 86. Liehr RM, Melnykovych G, Solomon TE. (1990) Growth effects of regulatory peptides on human pancreatic cancer lines PANC-1 and MIA PaCa-2. Gastroenterology 98: 1666-74. 87. Lilja P, Greeley GH, Jr., Thompson JC. (1984) Pancreatic exocrine secretion. Release of gastrin and cholecystokinin in response to bombesin in pigs. Arch Surg 119: 825-8. 88. Logsdon CD. (1999) The influence of the cellular context on receptor function: a necessary consideration for physiologic interpretations of receptor expression studies. Life Sci 64: 369-74.

70

IRODALOMJEGYZÉK

89. Longnecker DS. (1991) Hormones and pancreatic cancer. Int J Pancreatol 9: 81-6. 90. Lonovics J. (1992) Somatostatin és Sandostatin gasztrointesztinális hatásai. Magyar Belorv. Arch. 45: 125-135. 91. Lonovics J. (1998) Gastrointestinális hormonok és neuropeptidek. pp. 7-13 in Gastroenterológia. Vince V (eds), Medicina Könyvkiadó, Budapest. 92. Lu L, Logsdon CD. (1992) CCK, bombesin, and carbachol stimulate c-fos, c-jun, and cmyc oncogene expression in rat pancreatic acini. Am J Physiol 263: G327-32. 93. Mascardo RN, Sherline P. (1982) Somatostatin inhibits rapid centrosomal separation and cell proliferation induced by epidermal growth factor. Endocrinology 111: 1394-6. 94. McDonald TJ, Houghton P, Challis JR, Hramiak IM. (1988) The effect of gastrin-releasing peptide on the endocrine pancreas. Ann N Y Acad Sci 547: 242-54. 95. McDonald TJ, Jornvall H, Nilsson G, Vagne M, Ghatei M, Bloom SR, Mutt V. (1979) Characterization of a gastrin releasing peptide from porcine non-antral gastric tissue. Biochem Biophys Res Commun 90: 227-33. 96. Meyerhof W. (1998) The elucidation of somatostatin receptor functions: a current view. Rev Physiol Biochem Pharmacol 133: 55-108. 97. Milusheva EA, Kortezova NI, Mizhorkova ZN, Papasova M, Coy DH, Balint A, Vizi ES, Varga G. (1998) Role of different bombesin receptor subtypes mediating contractile activity in cat upper gastrointestinal tract. Peptides 19: 549-56. 98. Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. (1983) Neuromedin B: a novel bombesin-like peptide identified in porcine spinal cord. Biochem Biophys Res Commun 114: 541-8. 99. Minamino N, Kangawa K, Matsuo H. (1984) Neuromedin C: a bombesin-like peptide identified in porcine spinal cord. Biochem Biophys Res Commun 119: 14-20. 100. Morisset J, Genik P, Lord A, Solomon TE. (1982) Effects of chronic administration of somatostatin on rat exocrine pancreas. Regul Pept 4: 49-58. 101. Murphy LO, Abdel-Wahab YH, Wang QJ, Knezetic JA, Permnert J, Larsson J, Hollingsworth AM, Adrian TE. (2001) Receptors and ligands for autocrine growth pathways are up-regulated when pancreatic cancer cells are adapted to serum-free culture. Pancreas 22: 293-8. 102. Mutt V, Jorpes JE. (1968) Structure of porcine cholecystokinin-pancreozymin. 1. Cleavage with thrombin and with trypsin. Eur J Biochem 6: 156-62. 103. Mutt V, Jorpes JE, Magnusson S. (1970) Structure of porcine secretin. The amino acid sequence. Eur J Biochem 15: 513-9. 104. Nagalla SR, Barry BJ, Creswick KC, Eden P, Taylor JT, Spindel ER. (1995) Cloning of a receptor for amphibian [Phe13]bombesin distinct from the receptor for gastrin-releasing peptide: identification of a fourth bombesin receptor subtype (BB4). Proc Natl Acad Sci U S A 92: 6205-9.

71

IRODALOMJEGYZÉK

105. Nagalla SR, Gibson BW, Tang D, Reeve JR, Jr., Spindel ER. (1992) Gastrin-releasing peptide (GRP) is not mammalian bombesin. Identification and molecular cloning of a true amphibian GRP distinct from amphibian bombesin in Bombina orientalis. J Biol Chem 267: 6916-22. 106. Namba M, Ghatei MA, Ghiglione M, Bloom SR. (1986) Effects of decapeptide of mammalian bombesin and neuromedin B on pancreatic exocrine secretion in the rat. Digestion 34: 105-14. 107. Nishino H, Tsunoda Y, Owyang C. (1998) Mammalian bombesin receptors are coupled to multiple signal transduction pathways in pancreatic acini. Am J Physiol 274: G525-34. 108. Otsuki M, Fujii M, Nakamura T, Tani S, Oka T, Baba S, Yajima H. (1987) Actions of neuromedin-B and neuromedin-C on amylase release from isolated rat pancreatic acini. Pancreas 2: 252-7. 109. Pansky A, Peng F, Eberhard M, Baselgia L, Siegrist W, Baumann JB, Eberle AN, Beglinger C, Hildebrand P. (1997) Identification of functional GRP-preferring bombesin receptors on human melanoma cells. Eur J Clin Invest 27: 69-76. 110. Papp M, Dobronyi I, Varga G, Scarpignato C. (1987) Bombesin promotes pancreatic growth in suckling rats. Experientia 43: 201-2. 111. Pavlov IP. (1901) Le travail des glandes Digestives. Paris: Masson et Cie : . 112. Pawson T, Olivier P, Rozakis-Adcock M, McGlade J, Henkemeyer M. (1993) Proteins with SH2 and SH3 domains couple receptor tyrosine kinases to intracellular signalling pathways. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 340: 279-85. 113. Prigent SA, Lemoine NR. (1992) The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Prog Growth Factor Res 4: 1-24. 114. Raynor K, Murphy WA, Coy DH, Taylor JE, Moreau JP, Yasuda K, Bell GI, Reisine T. (1993) Cloned somatostatin receptors: identification of subtype-selective peptides and demonstration of high affinity binding of linear peptides. Mol Pharmacol 43: 838-44. 115. Reeves R, Nissen MS. (1995) Cell cycle regulation and functions of HMG-I(Y). Prog Cell Cycle Res 1: 339-49. 116. Rehfeld JF. (1998) The new biology of gastrointestinal hormones. Physiol Rev 78: 1087108. 117. Reisine T, Bell GI. (1995) Molecular properties of somatostatin receptors. Neuroscience 67: 777-90. 118. Reubi JC, Lamberts SW, Maurer R. (1988) Somatostatin receptors in normal and tumoral tissue. Horm Res 29: 65-9. 119. Reubi JC, Waser B, Schaer JC, Markwalder R. (1995) Somatostatin receptors in human prostate and prostate cancer. J Clin Endocrinol Metab 80: 2806-14. 120. Robertson JF, Watson SA, Hardcastle JD. (1995) Effect of gastrointestinal hormones and synthetic analogues on the growth of pancreatic cancer. Int J Cancer 63: 69-75.

72

IRODALOMJEGYZÉK

121. Rossowski WJ, Gu ZF, Akarca US, Jensen RT, Coy DH. (1994) Characterization of Somatostatin Receptor Subtypes Controlling Rat Gastric-Acid and Pancreatic Amylase Release. Peptides 15: 1421-1424. 122. Rozengurt E. (1998) Signal transduction pathways in the mitogenic response to G protein-coupled neuropeptide receptor agonists. J Cell Physiol 177: 507-17. 123. Rozengurt E, Sinnett-Smith J. (1988) Early signals underlying the induction of the c-fos and c-myc genes in quiescent fibroblasts: studies with bombesin and other growth factors. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 35: 261-95. 124. Russell DH, Byus CV, Manen CA. (1976) Proposed model of major sequential biochemical events of a trophic response. Life Sci 19: 1297-305. 125. Sarfati PD, Genik P, Morisset J. (1985) Caerulein and secretin induced pancreatic growth: a possible control by endogenous pancreatic somatostatin. Regul Pept 11: 261-73. 126. Saurin JC, Nemoz-Gaillard E, Sordat B, Cuber JC, Coy DH, Abello J, Chayvialle JA. (1999) Bombesin stimulates adhesion, spreading, lamellipodia formation, and proliferation in the human colon carcinoma Isreco1 cell line. Cancer Res 59: 962-7. 127. Savage CR, Jr., Inagami T, Cohen S. (1972) The primary structure of epidermal growth factor. J Biol Chem 247: 7612-21. 128. Scarpignato C, Gioffre M, Gulino FM, Micali B. (1988) Different effects of bombesin on glucose- and tolbutamide-induced insulin release in man. Br J Pharmacol 94: 1023-8. 129. Schusdziarra V, Harris V, Conlon JM, Arimura A, Unger R. (1978) Pancreatic and gastric somatostatin release in response to intragastric and intraduodenal nutrients and HCl in the dog. J Clin Invest 62: 509-18. 130. Schwab RE, Froidevaux S, Paku S, Tejeda M, Szende B, Pap A, Beglinger C, Eberle AN, Keri G. (2001) Antiproliferative efficacy of the somatostatin analogue TT-232 in human melanoma cells and tumours. Anticancer Res 21: 71-5. 131. Seamon KB, Daly JW. (1986) Forskolin: its biological and chemical properties. Adv Cyclic Nucleotide Protein Phosphorylation Res 20: 1-150. 132. Seckl M, Rozengurt E. (1993) Tyrphostin inhibits bombesin stimulation of tyrosine phosphorylation, c- fos expression, and DNA synthesis in Swiss 3T3 cells. J Biol Chem 268: 9548-54. 133. Simeone DM, Yule DI, Logsdon CD, Williams JA. (1995) Ca2+ signaling through secretagogue and growth factor receptors on pancreatic AR42J cells. Regul Pept 55: 197206. 134. Sinnett-Smith J, Santiskulvong C, Duque J, Rozengurt E. (2000) [D-Arg(1),DTrp(5,7,9),Leu(11)]Substance P inhibits bombesin-induced mitogenic signal transduction mediated by both G(q) and G(12) in Swiss 3T3cells. J Biol Chem 275: 30644-52. 135. Sjovall M, Ekblad E, Lundell L, Sundler F. (1990) Gastrin-releasing peptide: neuronal distribution and spatial relation to endocrine cells in the human upper gut. Regul Pept 28: 47-55.

73

IRODALOMJEGYZÉK

136. Spindel ER, Giladi E, Brehm P, Goodman RH, Segerson TP. (1990) Cloning and functional characterization of a complementary DNA encoding the murine fibroblast bombesin/gastrin-releasing peptide receptor. Mol Endocrinol 4: 1956-63. 137. Sporn MB, Roberts AB. (1985) Autocrine growth factors and cancer. Nature 313: 745-7. 138. Sporn MB, Todaro GJ. (1980) Autocrine secretion and malignant transformation of cells. N Engl J Med 303: 878-80. 139. Starling EH. (1905) The Croonian lecture on the chemical correlation of the function of the body. Lancet II: 339-341. 140. Susini C, Estival A, Scemama JL, Ruellan C, Vaysse N, Clemente F, Esteve JP, Fourmy D, Ribet A. (1986) Studies on human pancreatic acini: action of secretagogues on amylase release and cellular cyclic AMP accumulation. Pancreas 1: 124-9. 141. Szende B, Zalatnai A, Schally AV. (1989) Programmed cell death (apoptosis) in pancreatic cancers of hamsters after treatment with analogs of both luteinizing hormone-releasing hormone and somatostatin. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 1643-7. 142. Takacs T, Hajnal F, Nemeth J, Lonovics J, Pap A. (2000) Stimulated gastrointestinal hormone release and gallbladder contraction during continuous jejunal feeding in patients with pancreatic pseudocyst is inhibited by octreotide. Int J Pancreatol 28: 215-20. 143. Tejeda M, Gaal D, Schwab RE, Pap A, Keri G. (1999) In vivo antitumor activity of TT232 a novel somatostatin analog. Anticancer Res 19: 3265-8. 144. Torrisani J, Bouisson M, Puente E, Capella G, Laurent-Puig P, Berger A, Vaysse N, Susini C, Buscail L. (2001) Transcription of SST2 somatostatin receptor gene in human pancreatic cancer cells is altered by single nucleotide promoter polymorphism. Gastroenterology 120: 200-9. 145. Tulassay Z, Papp J. (1991) The effect of long-acting somatostatin analogue on enzyme changes after endoscopic pancreatography. Gastrointest Endosc 37: 48-50. 146. Tulassay Z, Papp J, Korányi L. (1981) Somatostatin hatása az endoszkópos retrográd pancreatográfiát követo anyagcsere változásokra. Kísérl Orvostud 33: 357-361. 147. Varga G, Papp M, Solomon TE. (1989) A somatostatin hatása patkányok pancreasának enzimelválasztására in vivo és in vitro. Orv Hetil 33: 1769-1772. 148. Varga G, Reidelberger RD, Liehr RM, Bussjaeger LJ, Coy DH, Solomon TE. (1991) Effects of potent bombesin antagonist on exocrine pancreatic secretion in rats. Peptides 12: 493-7. 149. Vaysee N, Buscail L, Seva C, Delesque N, Negre F, Dufresne M, Clerc P, Susini C, Pradayrol L, Fuormy D. (1996) Gastrointestinal peptides and receptors in pancreatic cancer. pp. 61-67 in Pancreatic cancer, molecular and clinical advences. Neoptolemos JP, Lemoine NR (eds), Blackwell, Oxford. 150. Vaysse N, Chayvialle JA, Pradayrol L, Esteve JP, Susini C, Lapuelle J, Descos F, Ribet A. (1981) Somatostatin 28: comparison with somatostatin 14 for plasma kinetics and lowdose effects on the exocrine pancreas in dogs. Gastroenterology 81: 700-6.

74

IRODALOMJEGYZÉK

151. Viguerie N, Tahiri-Jouti N, Ayral AM, Cambillau C, Scemama JL, Bastie MJ, Knuhtsen S, Esteve JP, Pradayrol L, Susini C, et al. (1989) Direct inhibitory effects of a somatostatin analog, SMS 201-995, on AR4-2J cell proliferation via pertussis toxin-sensitive guanosine triphosphate-binding protein-independent mechanism. Endocrinology 124: 1017-25. 152. Wada E, Way J, Shapira H, Kusano K, Lebacq-Verheyden AM, Coy D, Jensen R, Battery J. (1991) cDNA cloning, characterization, and brain region-specific expression of a neuromedin-B-preferring bombesin receptor. Neuron 6: 421-30. 153. Wallrapp C, Muller-Pillasch F, Solinas-Toldo S, Lichter P, Friess H, Buchler M, Fink T, Adler G, Gress TM. (1997) Characterization of a high copy number amplification at 6q24 in pancreatic cancer identifies c-myb as a candidate oncogene. Cancer Res 57: 3135-9. 154. Walsh JH, Wong HC, Dockray GJ. (1979) Bombesin-like peptides in mammals. Fed Proc 38: 2315-9. 155. Wang QJ, Knezetic JA, Schally AV, Pour PM, Adrian TE. (1996) Bombesin may stimulate proliferation of human pancreatic cancer cells through an autocrine pathway. Int J Cancer 68: 528-34. 156. Wood LJ, Mukherjee M, Dolde CE, Xu Y, Maher JF, Bunton TE, Williams JB, Resar LM. (2000) HMG-I/Y, a new c-Myc target gene and potential oncogene. Molecular and Cellular Biology 20: 5490-5502. 157. Yamaguchi N, Yamamura Y, Koyama K, Ohtsuji E, Imanishi J, Ashihara T. (1990) Characterization of new human pancreatic cancer cell lines which propagate in a proteinfree chemically defined medium. Cancer Res 50: 7008-14. 158. Yamanaka Y, Friess H, Kobrin MS, Buchler M, Beger HG, Korc M. (1993) Coexpression of epidermal growth factor receptor and ligands in human pancreatic cancer is associated with enhanced tumor aggressiveness. Anticancer Res 13: 565-9. 159. Zalatnai A. (1999) Epidermal growth factor receptor, somatostatin and bcl-2 in human pancreatic tumor xenografts. An immunohistochemical study. Pathol Oncol Res 5: 146-51. 160. Zalatnai A, Pogany V. (2000) [Somatostatin analogs in the treatment of pancreatic cancer: utopia or feasible alternative?]. Orv Hetil 141: 2333-8. 161. Zalatnai A, Schally AV. (1989) Responsiveness of the hamster pancreatic cancer to treatment with microcapsules of D-Trp-6-LH-RH and somatostatin analog RC-160. Histological evidence of improvement. Int J Pancreatol 4: 149-60.

75

MELLÉKLET

XII. MELLÉKLETEK

76

SANDOSTATIN ÉS BOMBEZIN HATÁSA HUMÁN DUKTÁLIS EREDETŰ HASNYÁLMIRIGY SEJTVONALAKBAN

Recommend Documents