REAKTIVNÍ SLOUČENINY KYSLÍKU

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

REAKTIVNÍ SLOUČENINY KYSLÍKU

Lenka Richterová

Bakalářská práce

Vedoucí: doc. RNDr. Petr Zbořil, CSc.

Brno, Česká republika, rok 2008

1

Prohlášení Prohlašuji, že jsem při vypracování bakalářské práce pracovala samostatně s použitím uvedené literatury. V Brně dne 25.5.2008 .............................................. Lenka Richterová

2

Poděkování Při této příležitosti bych chtěla poděkovat především svému vedoucímu docentu RNDr. P. Zbořilovi, CSc. za cenné rady a připomínky při vypracování této bakalářské práce.

3

4

Obsah Obsah .......................................................................................................................................... 5 Seznam použitých zkratek .......................................................................................................... 7 1.

Úvod ................................................................................................................................... 9

2.

Co jsou to ROS ................................................................................................................. 10

3.

4.

5.

2.1.

Obecná charakteristika ROS .................................................................................... 10

2.2.

Přehled jednotlivých látek a jejich struktura ............................................................ 11

2.2.1.

Superoxid ......................................................................................................... 12

2.2.2.

Peroxid vodíku ................................................................................................. 12

2.2.3.

Hydroxylový radikál ........................................................................................ 13

2.2.4.

Peroxylový radikál ........................................................................................... 13

Vznik ROS ....................................................................................................................... 15 3.1.

Neenzymové cesty vzniku ROS ............................................................................... 16

3.2.

Enzymové cesty vzniku ROS ................................................................................... 16

Funkce a účinky ROS ....................................................................................................... 17 4.1.

Pozitivní účinky ROS ............................................................................................... 17

4.2.

Negativní účinky ROS v patogenezi ........................................................................ 20

4.2.1.

Deformace proteinů ......................................................................................... 20

4.2.2.

Lipoperoxidace ................................................................................................. 22

4.2.3.

Poškození DNA ............................................................................................... 22

4.2.4.

ROS a diabetes mellitus ................................................................................... 23

4.2.5.

ROS v kardiovaskulárním onemocnění............................................................ 24

4.2.6.

ROS a nádorová onemocnění ........................................................................... 25

4.2.7.

ROS ve stáří ..................................................................................................... 26

4.2.8.

ROS a kouření .................................................................................................. 26

4.2.9.

ROS a další choroby ......................................................................................... 26

Obrana proti ROS.............. ............................................................................................... 27 5.1.

Enzymatický antioxidační systém ............................................................................ 28

5.1.1.

Superoxiddismutasa ........................................................................................ 28

5.1.2.

Glutathionperoxidasy ....................................................................................... 28

5.1.3.

Glutathiontransferasy ....................................................................................... 28

5.1.4.

Katalasy ............................................................................................................ 28

5

5.2.

6.

7.

Neenzymatický antioxidační systém ........................................................................ 29

5.2.1.

Transferin, laktoferin a feritin .......................................................................... 29

5.2.2.

Ceruloplazmin a albumin ................................................................................. 29

5.2.3.

Glutathion (GSH, GSSG) ................................................................................. 29

5.2.4.

α - tokoferol a vitamín E .................................................................................. 30

5.2.5.

Vitamín C (kyselina askorbová) ....................................................................... 31

5.2.6.

Karotenoidy: β - karoten a vitamín A .............................................................. 32

5.2.7.

Flavonoidy ........................................................................................................ 33

5.2.8.

Koenzym Q10 (ubichinon) ................................................................................ 34

5.2.9.

Kyselina lipoová (vitamín B13) a kyselina močová .......................................... 34

Metody stanovení ROS.............. ....................................................................................... 35 6.1.

Elektronová paramagnetická rezonance (elektronová spinová rezonance).............. 35

6.2.

Stanovení superoxidu .............................................................................................. 35

6.3.

Stanovení peroxidu vodíku....................................................................................... 36

6.4.

Stanovení hydroxylového radikálu .......................................................................... 36

6.5.

Stanovení konjugovaných dienů a lipidových peroxidů, MDA ............................... 36

6.6.

Stanovení produktů AGE ......................................................................................... 36

Závěr................................................................................................................................. 37

Anotace..................................................................................................................................... 37 Annotation ................................................................................................................................ 37 Seznam použité literatury ......................................................................................................... 38

6

Seznam použitých zkratek apoB

apolipoprotein

DNA

kyselina deoxyribonukleová

GPx

glutathionperoxidasa

GSH

glutathion

GST

glutathiontransferasa

HO•

hydroxylový radikál

HO-

hydroxid

iNOS

syntasa oxidu dusnatého

KAT

katalasa

α-TO•

tokoferylový radikál

α−ΤOQ

α − tokoferolchinon

LOOH

lipidový hydroperoxid

LOH

lipidový alkohol

LO•

lipoxylový radikál

LOO•

lipoperoxylový radikál

MDA

malondialdehyd

NO•

radikál oxidu dusnatého

O2

molekula kyslíku

O2• -

superoxid

RNA

kyselina ribonukleová

ROO•

peroxylový radikál

ROS

reaktivní formy kyslíku (reactive oxygens species)

SOD

superoxiddismutasa

XO

xanthinoxidasa

7

8

1. Úvod V posledních letech se věda zabývá zkoumáním reaktivních forem kyslíku, respektive zkoumáním volných radikálů. Radikály se v krvi vyskytovaly ovšem od pradávna, ale jen v takovém množství, že je přirozené regulační mechanismy dokázaly neutralizovat [1]. Bylo zjištěno, že ROS působí na organismus nejen pozitivně ale i negativně. Původní teorie byla, že volné radikály jsou součástí chemických reakcí do té doby, než se zjistila nebezpečnost kyslíku vůči některým organismům. Přišlo se na to, že kyslík má velmi univerzální vlastnosti a je schopen se oxidovat a redukovat na nejrůznější formy dalších látek. Před 40 lety byl objeven enzym, který v organismu katalyzuje přeměnu superoxidu [2]. Po objevení skupiny enzymů superoxiddismutas (SOD) probíhala řada nejrůznějších prací na základě objevů a účinků enzymů. Časem byly objeveny různé antioxidanty. Antioxidanty jsou látky působící právě proti volným radikálům. V současné době se zkoumají různé možnosti, jak odstranit negativní vlivy radikálů formou nejrůznějších antioxidantů, například ze zeleného čaje, některých vitamínů atd.. Jinými slovy, řada reaktivních sloučenin kyslíku má význam ve fyziologii a patogenezi. Zájem lékařů a biochemiků o vážnosti problematiky ROS se zvyšoval, když bylo dokázáno, že ROS dokážou poškozovat proteiny, lipidy a nukleové kyseliny, tedy poškození DNA a genetické informace.

9

2. Co jsou to ROS Reaktivní sloučeniny kyslíku, častěji nazývané jako „volné kyslíkové radikály“ jsou reaktivní sloučeniny, které vznikají z kyslíku. Zkratka ROS je převzata z angličtiny: „Reactive oxygens species“. Tyto látky jsou schopné uvolňovat a přeměňovat energii nezbytnou pro život, jsou součástí enzymů a plní významnou funkci v buňce. Škodí v případě, když se vymknou kontrole mechanismu v buňce a pak dokážou nejen napadat a poškozovat zdravé buňky, ale také jsou jim prospěšné. Škodí biomolekule tím, že jí odejmou elektron a biomolekula se pak sama stává volným radikálem. Poškozování biomolekul trvá takovou dobu až do setkání dvou volných radikálů nebo když je řetězová reakce zastavena antioxidační látkou.

2.1. Obecná charakteristika ROS Pro pochopení definice volného radikálu je vhodné čtenáři připomenout základy obecné chemie týkající se složení atomů. Elektrony se v atomu pohybují v orbitalech. Každý orbital by měl obsahovat maximálně dva elektrony s opačným spinem. Existují orbitaly s nepárovým elektronem. Látky s nepárovým elektronem jsou charakterizovány jako volné radikály. Ty jsou obvykle nestálé a velmi reaktivní, ochotně reagující s dalšími molekulami. Radikály mohou vznikat z neradikálových molekul při elektron-transportních reakcích, kdy dochází ke ztrátě nebo příjmu jednoho elektronu. Homolytické štěpení vazeb vede ke tvorbě volných radikálů. Energie na rozbití této vazby je například získána z elektromagnetického záření nebo při vysoké teplotě. Homolytické štěpení zahrnuje oxidaci a redukci [4]. Člověk se s nimi může setkávat prakticky každý den.

10

2.2. Přehled jednotlivých látek a jejich struktura Majoritním zdrojem volných radikálů v biologických systémech je molekulový kyslík [4]. Molekula kyslíku (O2) má vlastnosti diradikálu, protože má dva nepárové valenční elektrony. Může se snadno změnit v reaktivní formy kyslíku. Stačí mu dodat energii nebo přidat či ubrat elektron. Existují další typy kyslíku jako tripletový kyslík a singletový kyslík. Singletový kyslík vzniká z tripletového kyslíku a liší se od sebe směrem elektronů. (viz obr. 1) Kyslík jako molekula je schopná se redukovat na další molekuly. Část z nich se chovají jako radikály a část ne, jsou ale zahrnovány do skupiny ROS, protože se účastní vzniku radikálů. (viz tab.I.) σ*2p π*2p π2p σ2p σ*2s σ2s dioxygen (triplet) 3

∑ O2

singletový kyslík 1

singletový kyslík

∑ O2

1

∆O2

superoxidový anion

O2 • –

σ*2p π*2p 2pxpypz

π2p σ2p σ*2s 2s

σ2s peroxidový anion

oxen

O

oxid

•–

O

2–

Obr. 1.: Rozložení elektronů ve druhé (zevní) slupce molekulových orbitalů dvouatomových molekul kyslíku [3]. 11

Tab. I. Reaktivní formy kyslíku

REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU Volné radikály superoxid hydroxylový radikál peroxyl

Neradikály

O2• HO

• •

ROO •

alkoxyl

RO

hydroperoxyl

HO2•

peroxid vodíku

H2O2

kyselina chlorná

HOCl

ozon

O3

singletový kyslík

1

O2

2.2.1. Superoxid O2• Reakcí singletového kyslíku s elektronem vzniká superoxid. O2 + e- → O2•

-

Je výchozí látkou pro vznik dalších reaktivních sloučenin kyslíku. Jeví se méně nebezpečně než hydroxylový radikál, jehož poločas rozpadu je 10-6 s. Superoxid může vznikat během metabolických dějů nebo vlivem ozonu, γ záření aj. Vzniká také v buňkách (monocyty, makrofágy a dlaší), požitím drog, jedů a těžkých kovů [5]. Superoxidový radikál má výjimečné vlastnosti, díky nimiž mohou vznikat jiné volné radikály (hydroxylový radikál, peroxid vodíku a hydroperoxidový radikál). Superoxid působí lipoperoxidaci a poškozování dalších biomolekul, i když pomaleji než hydroxylový radikál [6].

2.2.2. Peroxid vodíku H2O2 Je to velmi slabá kyselina obsahující vazbu -O-O-. V čistém stavu i ve vodném roztoku je H2O2 poměrně stálý. Reakce s biomolekulami jsou pomalé. Za působení některých látek, mezi které patří platina, stříbro, železo a další kovy se jeho rozklad urychluje [4]. Z významných biomolekul má schopnost rozkládat peroxid vodíku též hemoglobin. Má oxidační a redukční vlastnosti. Pomocí enzymu superoxiddizmutázy je superoxid přeměněn na peroxid vodíku. O2• + e- + 2H+ → H2O2

Patří mezi méně reaktivní formy kyslíku. Není považován za radikál, ale do skupiny ROS patří, protože ovlivňuje vznik radikálů, tedy vznik hydroxylového radikálu. Nemá žádný větší význam, avšak účastní se důležitých reakcí s ionty Fe2+ či Cu + (viz kap. 2.2.3.).

12

2.2.3. Hydroxylový radikál HO• Vzniká rozpadem peroxidu vodíku působením jednoho elektronu v reakci. H2O2 + e- → HO• + OH

-

Může také vznikat Fentonovou reakcí peroxidu vodíku s mědí nebo železem. H2O2 + 2Cu+ → 2Cu2+ + 2HO• + 2OH H2O2 + Fe2+ → Fe 3+ + HO• + OH

-

-

Patří mezi nejreaktivnější formy O2. Okamžitě reaguje s okolními biomolekulami – ve tkáni se slučuje s téměř jakoukoli sousední biomolekulou anebo z ní vytrhne elektron a aktivuje ji. Je schopen poškozovat purinové a pyrimidinové báze v nukleových kyselinách tak, že zápis genetické informace není přesný a tím způsobuje mutace [7]. Působením dalšího elektronu reaguje hydroxylový radikál přes hydroxidový ion na molekulu vody (viz obr. 3.).

2.2.4. Peroxylový radikál ROO• Účinkem peroxylového radikálu dochází k napadení řetězce nenasycené mastné kyseliny, ze kterého ROO• odebere atom vodíku za vzniku hydroperoxidu lipidu (lipoperoxidu) [8]. Je to nekontrovatelný řetězový proces nazývaný peroxidace lipidů, při kterém dochází k rozpadu reakčního produktu a k vzniku další peroxidace sekundárních produktů. Existují dva typy peroxidace lipidů – neenzymová a enzymová peroxidace. V biologických systémech probíhá neenzymová peroxidace lipidů především v biologických membránách a lipoproteinech [9]. V membránách, které jsou složeny z fosfolipidů, jsou přítomny polynenasycené mastné kyseliny. Ty jsou důležité pro transport látek a náchylné k oxidaci (peroxidaci). V některých buňkách probíhá enzymová peroxidace. Tvoří se důležité produkty k udržování buněčných pochodů, například prostaglandiny. Rozpadem peroxidu vznikají lipoperoxidy, hydroperoxidy, kancerogenní aldehydy (např. malondialdehyd). Ty mohou způsobit poškození buněčné struktury, membránových bílkovin, změnit strukturu enzymů vázaných v membránách. Dochází k poškození dusíkatých bází DNA s možností mutací a kancerogeneze [10]. Lipoperoxidaci dokáží zastavit lipofilní antioxidanty, mezi které patří zejména vitamín E a koenzym Q10 [11].

13

R1

R2

MK fosfolipidu

R

•

ode jmutí vod ík u

RH

•

R1

R2

alkylový radikál přeusp ořád ání molekuly kon jug ace dvojných vazeb •

R1

R2

O2 příjem kyslíku

R1

R2 RH

peroxylový radikál

O O

R

•

•

příjem elektronu

cykliza ce

R1

R2 O

R2

O

hydroperoxid

O O H

O

O R2

malondialdehyd

O

•

R2

alkoxylový radikál

O

štěpe ní •

O

peroxylový radikál

O

R2

•

alkanal, alkenal

R1 H

alkeny, alkany

alkenal modifikace biomolekul

plíce

Obr. 2.: Schéma peroxidace lipidů [3]

14

3. Vznik ROS Reaktivní sloučeniny kyslíku se dají odvodit od základní molekuly O2 serií postupných redukčních jednoelektronových kroků. V organismu vznikají analogickými pochody.

tripletový kyslík

3

O2

excitace

1

O2

singletový kyslík

esuperoxid

O2

•–

+

H

HO2

•

hydroperoxylový radikál

pK = 4,8 eperoxidový ion

2–

O2

+

–

H

HO2

pK > 4,8

hydrogenperoxidový ion

+

H

H2 O2

peroxid vodíku

H2 O

voda

H2 O

voda

pK = 11,8

ehypotetický produkt

[•O23 –]

oxen

O

+

H

OH

–

+

H

hydroxidový ion

•–

+

H

HO

•

hydroxylový radikál

pK = 11 ,9 eoxid

2–

O

+

H

OH

–

hydroxidový ion Obr. 3.: Postupná redukce kyslíku [3]

15

+

H

Existují různé cesty vzniku ROS. Jsou dvě skupiny vzniku ROS v organismu: při enzymových a neenzymových cestách. Nejznámějším místem vzniku ROS je v dýchacím řetězci, kde dochází k přeměně vzdušného kyslíku na energii.

3.1. Neenzymové cesty vzniku ROS Neenzymovou cestou vznikají ROS především účinkem vysokoenergetického záření [8]. Vlivem slunečního i ionizujícího záření vzniká velice reaktivní hydroxylový radikál. Dalším faktorem jsou například zplodiny od kouření. Konečným produktem působení hydroxylového radikálu pak může být i maligní typ buňky. Zdroje radikálů jsou popsány na obr. 4..

3.2. Enzymové cesty vzniku ROS Vznik ROS může být účelný a prospěšný pro živou buňku. Mezi takové enzymové cesty patří například metabolické vzplanutí. Účelem metabolického vzplanutí je usmrtit bakterii nebo patogen, který napadá imunitní systém. Po vzniku ROS vstupují do úlohy enzymy superoxiddismutasa, glutathionperoxidasa a další. Tyto enzymy mají za úkol ROS z buňky odstranit. Nejbohatším zdrojem vedlejších produktů ROS v buňkách je respirační (dýchací) řetězec v mitochondriích. Při pochodu se nejdřív tvoří superoxid a následně H2O2. V membránách mitochondrií se nacházejí lipidy s obsahem nenasycených mastných kyselin. Mitochondriální lipidy se snadno rozkládají a dochází k peroxidaci, která postihuje strukturu proteinů. Tyto změny v mitochondriích mohou způsobit apoptózu, tedy samozničení buňky. V endoplazmatickém retikulu superoxid vzniká z komplexu cytochromu P-450 [3]. ROS v tomto enzymu mají funkci biotransformace. Dokážou přeměnit některé látky na karcinogeny. Reagují také s endogenními látkami a xenobiotiky (látky v těle cizí). Kromě enzymových cest se může kyslík přeměnit na formy exogenních a endogenních malých molekul. Mezi takové molekuly patří například chinonová antibiotika adriamycin, daunomycin a streptonigrin, která jsou schopna zničit nádorové buňky vytvořené superoxidem. Zároveň také poškozují normální buňky, když se v organismu nahromadí.

16

BÍLÉ KRVINKY RADIOAKTIVNÍ ZÁŘENÍ

POŠKOZENÍ DNA 1

O2

•

OH

OH

O2

•

ZNEČIŠTĚNÉ OVZDUŠÍ •

•

OH O2

–•

OH •

OH

1

O2

H2 O2

KOUŘENÍ

O2

–•

UV ZÁŘENÍ METABOLISMUS

Obr. 4.: Vznik ROS enzymovou a neenzymovou cestou

4. Funkce a účinky ROS Jak bylo již dřív psáno, ROS jsou sloučeniny životu škodlivé, ale i prospěšné. Donedávna se zdůrazňovala klíčová úloha ROS hlavně při vzniku rakoviny a při stárnutí, ale v současnosti již existuje více důkazů o jejich negativním působení, mezi které patří například vznik aterosklerózy a dalších nemocí [12]. ROS dokáží nejen nemoci vyvolávat, ale také zhoršovat či komplikovat jejich průběh. Musím uvést, že ROS kromě negativních účinků mají také příznivé role, do kterých se zahrnuje nespočet funkcí popsaných v kapitole 4.1..

4.1. Pozitivní účinky ROS Do skupiny pozitivních účinků můžeme začlenit obrannou funkci ROS proti bakteriím, antigenům a parazitům, funkci jako signální molekuly, vylučování cholesterolu a žlučových kyselin z organismu, detoxikace xenobiotik. ROS také přispívají k přestavbě kostí [13].

17

Jednou z funkcí ROS ve zdravém organismu je složitý obranný mechanismus proti bakteriím, antigenům a parazitům. V imunitním systému jsou reaktivní sloučeniny kyslíku využívány ke konkrétním účelům. Pomocí leukocytů a makrofágů dochází za pomocí ROS k tzv. respiračnímu vzplanutí, jehož účelem je usmrcení bakterie a odstraňování mrtvých buněk. Fagocyty mají ve své struktuře plazmatickou membránu vybavenou enzymovým komplexem NADPH – oxidasou. Principem této oxidasy, respektive cytochromu b v ní umístěném, je aktivovat se po pohlcení bakterie nebo antigenu. Dojde k prudkému zvýšení spotřeby O2 = respirační vzplanutí, při kterém pak vzniká velké množství derivátů kyslíku vyjma superoxidu. Po odeznění respiračního vzplanutí vstupují do reakce enzymy, které neutralizují deriváty kyslíku. Peroxid vodíku vznikající přeměnou superoxidu je buď odstraňován glutathionperoxidasou nebo vstupuje do reakce s myeloperoxidasou. Reakcí H2O2 s chloridovými anionty za katalýzy myeloperoxidasy vzniká kyselina chlorná (viz obr. 5.). + H2O2 + H + Cl → HClO + H2O

Kyselina chlorná má silné oxidační vlastnosti, využívá se k „zabíjení“ bakterií. Štípek a kol. (2002) uvádí, že může být dalším zdrojem HO• po reakci se superoxidem. HClO + O2• → HO• + Cl + O2

Podobným způsobem zneškodňuje imunitní systém nádorové buňky, ničí kvasinky, viry a parazity. I když má imunitní systém tyto mechanismy zabraňující nežádoucím účinkům ROS, existuje nebezpečí vůči organismu, jestliže dojde ke zvýšenému výskytu ROS nebo nejsou dostatečně zlikvidovány [5]. Může se stát, že zánět nevymizí a imunitní buňky dále produkují ROS a následkem toho se zvyšuje hladina prostaglandinů, cytokinů do té míry, že poškozují tkáně nebo štěpí proteiny.

18

Obr. 5.: Oxidační vzplanutí leukocytu [3]

ROS významně vstupují do role při oplodnění vajíčka spermií. Pro spermii je potřebný superoxid a peroxid vodíku. O2• - je potřebný k porušení membrány ve vajíčku. H2O2 se tvoří ve vajíčku po oplodnění a zabraňuje dalšímu pronikání spermií [11]. Pokud se vytvoří nadměrné množství radikálů, změní se fyziologická funkce spermie, sníženou schopnost oplodnění vajíčka spermií způsobuje nízká koncentrace H2O2, netýká se to snížené pohyblivosti [14]. ROS se mohou chovat jako signální molekuly. Signální molekuly nazýváme takové molekuly schopné přenášet signál z buňky do buňky za účelem přijímání nových informací mezi sebou. Ovlivňují tím aktivitu enzymů a další pochody v buňce. Nejdřív dochází k přijetí informací do buněk z okolního prostředí v podobě primárních poslů. Mezi primární posly začleňujeme neurotransmitery, hormony, cytokiny a další. Pomocí speciálních enzymů zvaných buněčné transdukční cesty se pak informace dostane k cíli a k pochodům buňky [3]. V případě, že signální molekula je v tucích nerozpustná, přijme ji speciální receptor a přenáší ji přes membránu dovnitř buňky. Receptor pak může reagovat s transdukčními molekulami. Důsledkem této reakce se vytvoří sekundární a terciární poslové za působení enzymů např. proteinkinasy. Například u terciárních poslů se uvolní vápenaté ionty, které jsou důležité při kontrakci buněk ve svalech. Všeobecně panuje názor, že ROS patří mezi sekundární signální molekuly. Například v leukocytech se produkuje superoxid a jiné radikály, které způsobí produkci transkripčních 19

proteinů. Patří sem např. faktor NF-κB (nuclear factor κB). NF-κB je protein ovlivňující regulaci buněk, konkrétně řídí proliferaci buněk, proteiny ovlivňující apoptózu buněk. Vyznačuje se neobvyklou vlastností tak, že podporuje růst nádorových buněk a metastáz. Jeho následné zastavení způsobí samozničení nádorové buňky (apoptózu) [15]. Dojde – li k navázání signální molekuly na receptor, vytvoří se obranné buňky, aby signální molekulu zlikvidovaly a můžou způsobit porušení kaskády enzymů. Výsledkem je vznik choroby aterosklerózy. NF-κB reguluje rozvoj aterosklerózy. Zvláštní funkci má i radikál NO•. Na obr. 5. je popsána reakce vzniku oxidu dusnatého přeměnou argininu na citrullin působením enzymu syntasy oxidu dusnatého. Patří mezi signální molekuly. Udržuje krevní oběh těla a brání tvorbě krevních sraženin, tedy vzniku mozkové mrtvice nebo srdečního infarktu [16].

4.2. Negativní účinky ROS v patogenezi Je známo, že nekontrovatelné množství ROS ovlivňují vznik a rozvoj patologických onemocnění. Platí to třeba u imunitního systému, jak jsem rozváděla výše. Jde o nerovnovážný poměr mezi kyslíkovými radikály a antioxidanty, odborným termínem nazývané oxidační stres.

4.2.1. Deformace proteinů Pokud se ROS setkají s proteiny, změní se struktura původních proteinů a zdeformují se vytvořením příčných vazeb za vzniku zesíťovaných struktur. Tím způsobem se změní enzymatická nebo signální funkce proteinů. Mezi takové případy patří např. působení MDA, který se váže na změněnou bílkovinu a vytvoří jako bifunkční agens příčnou vazbu mezi dvěma molekulami bílkoviny (viz obr. 6.).

20

N

H2

O

O

N

H2

-2 H2 O

N

N

Obr. 6.: Vazba MDA na proteiny a vznik příčných vazeb [11]

Kromě toho dochází také k přeměně aminokyselinových zbytků a následkem toho je poškozena transportní funkce proteinů [3]. Některá poškození jsou znázorněna na obrázku 7. CO

NH

R

CO

HN

NH

R

H2N

prolin

HOOC O pyroglutamát

glutamát

O C

NHR CH2

CH

O C

COR

tryptofan NH

CHO

NH2

N-formylkynurenin

kynurenin

Obr. 7.: Přeměna některých aminokyselin vlivem ROS

21

NHR CH2

CH

COR

4.2.2. Lipoperoxidace Proces peroxidace lipidů byla uvedena v kapitole 2.2.4.. Jeden z produktů lipoperoxidace je malondialdehyd, který u proteinů způsobuje změnu jejich životnosti a poruchy funkce. Významným důsledkem procesu lipoperoxiodace je změna fluidity lipidů a propustnosti membrán. U mitochondrií může dojít až k lýze jejich membrán, při poškození membrán k porušení funkce dýchacího řetězce [17]. U některých proteinů se ztrácí dvojné vazby.

4.2.3. Poškození DNA ROS, zvláště HO•, mohou výrazně změnit strukturu DNA i RNA. Ukazuje se, že reakcí HO• s DNA vznikají různé produkty se změněnou strukturou a porušenými vazbami. Tím dochází ke štěpení řetězce DNA a modifikaci bází. Výsledkem je například mutace způsobena špatným pořadím párování bází. Jedná se například o záměnu párů AT za GC a naopak. Mezi typické projevy poškození DNA patří apoptóza buňky a karcinogeneze [3]. Nesmíme zapomenout ani na stárnutí. Mitochondrie v buňkách patří mezi nejdůležitější organely. Jsou totiž hlavním konsumentem kyslíku a producentem energie pro funkci buněk. V mitochondriích se nachází dýchací řetězec navazující na Krebsův cyklus. Pro intensivně probíhající oxidační procesy za vzniku semichinonových radikálů v dýchacím řetězci jsou mitochondrie zdrojem ROS a jejich mDNA je vystavena častějšímu nebezpečí napadení a poškození [18].

22

NH 2

NH 2 N

N N

N

OH N

N

N H adenin

N H

8-hydroxyadenin OH

O

OH HN O

N HO

N H uracil

N

5-hydroxyuracil

O

CH 3

CH 3

HN O

O

N H thymin

HN O

OH N H

OH

thyminglykol

Obr. 8.: Poškození DNA způsobené modifikací bazí

4.2.4. ROS a diabetes mellitus Lidé s diabetes mellitus jsou vystavení zvýšenému nebezpečí působení ROS. Antioxidační ochrana krve a tkání je slabá. V krvi se zvyšuje množství H2O2, který pak útočí na β-buňky Langerhansových ostrůvků ve slinivce břišní, kde se tvoří inzulín. Naruší se tím metabolismus látek, zejména sacharidů a proteinů. Poškozením enzymů Krebsova cyklu pak dochází ke snížení jeho účinnosti a dochází k nedostatku energie. K průvodním znakům diabetes mellitus patří glykace proteinů, která je následkem hyperglykemie. Za normálních podmínek vzniká reakcí aminoskupiny s glukózou Schiffova báze. Za vyššího množství glukózy dochází během špatného navázání aminoskupiny proteinů k propojení cukru (konkrétně glukózy) a bílkoviny. Této sloučenině se říká Amadoriho produkt. Ten pak podléhá dalším přeměnám až vznikají tzv. konečné produkty pokročilé glykace (AGE – advanced glycation products). AGE s glukózou dávají za přítomnosti O2 vznik ROS = glykoxidace [19]. Způsobují změnu konformace bílkovin, například se jejich vlivem albumin odbourává rychleji než zdravý 23

albumin [3]. Rozvíjejí se další choroby, například Parkinsonova a Alzheimerova choroba, zvláště u diabetu 2. typu nastává předčasný vývin aterosklerózy a jejích klinických projevů jako ischemická srdeční choroba, mozková příhoda [20]. Pokud diabetik kouří, vystavuje se dalšímu nebezpečí zvýšeného příjmu volných radikálů a prohloubení potíží [21].

4.2.5. ROS v kardiovaskulárním onemocnění Kardiovaskulární onemocnění, skupina cévních a srdečních onemocnění, zahrnuje především aterosklerózu, srdeční chorobu a infarkt a mozkovou příhodu. Jde o dlouhodobý proces, který vede ke zužování tepen nebo cév. Studie ukázaly, že vliv na zužování stěn tepen nebo cév u aterosklerózy mají reaktivní sloučeniny kyslíku [22]. ROS jsou schopné oxidovat LDL-cholesterol do takové míry, že změní strukturu mastných kyselin, které jsou vázány na cholesterol. Zmodifikované LDL-částice vlivem změněné struktury apoB1. Pak nejsou rozpoznány receptory makrofágů jako vlastní struktury. Jsou jimi považovány za antigeny a odstraňovány do cévní stěny. Tomu předchází endotelová dysfunkce. V normálních podmínkách je endotel nepropustný pro LDL-cholesterol [23]. Protože jsou LDL-částice zmodifikované, jsou schopné endotelem projít. Kromě cholesterolu se do buněk včetně ROS dostává i kalcium [24]. Vše se hromadí v cévách a vytvoří se tzv. pěnová buňka, jenž zužuje a poškozuje cévní stěny. Ateroskleróza je prekurzorem dalších komplikací způsobených ROS, srdeční choroby a infarktu a mozkové příhody. Rovněž zvýšený příjem tuků v potravě představuje nebezpečí, v kombinaci s ROS je faktorem pro vznik aterosklerózy [25]. Vztah mezi ROS a vznikem aterosklerózy je možno též dokumentovat na příznivém účinku antioxidantů. Francie, zvláště oblast na jihu, je známá tím, že tamní lidé pravidelným příjmem červeného vína s vysokým obsahem flavonoidů jsou velmi málo postiženi kardiovaskulárními chorobami [26].

1

apoB je protein přenášející LDL-cholesterol do tkání 24

LDL-cholesterol oxidace mastných kyselin za pomocí ROS

Peroxidace lipidů

modifikace mastných kyselin

Modifikované LDL-částice receptory nerozliší LDL-částice

Endotel přijímá LDL-částice ukládání LDL-částic přes endotel v cévách

Vznik pěnových buněk

zužování cévních stěn

endotelová dysfunkce ateroskleróza

Vznik chorob a jejích komplikací

infarkt myokardu mozková příhoda Obr. 9.: Průběh modifikace LDL-cholesterolu a vznik zúžených cév

4.2.6. ROS a nádorová onemocnění Mitochondrie jako centrum produkce energie a buněčného dýchání, je vystavena útokům ROS, jež mohou být příčinou vzniku nádorových onemocnění. Je třeba, aby byla rovnováha antioxidantů a metabolitů kyslíku stabilní. Odhadem napadá za den 10 000 volných radikálů

25

každou buňku [10]. Pokud převažuje množství ROS nad antioxidanty, dochází k přímému poškození lipidů, aminokyselinových zbytků v bílkovinách a bazí DNA a ke vzniku mutací. Například při peroxidaci lipidů vzniká MDA a další látky působící kancerogenně. Průběh vzniku nádorové buňky má tři fáze. Iniciace, startovní stadium začíná napadením zdravé buňky (její DNA) rakovinotvornou látkou. Druhé stadium, promoce, benigní růst nádorové buňky, se může pak změnit na další dvě fáze. Buď dochází k samovolné apoptóze a eliminaci nádorové buňky, nebo promoce vyústí v propagační stadium. V tomto případě se vyvíjí nádorová buňka v maligní nádor.

4.2.7. ROS ve stáří Obecně platí, že čím je organismus starší, tím jsou buněčné funkce a pochody horší. Patří mezi ně snížená produkce antioxidační ochrany, snížení schopnosti opravy DNA a biomolekul [27]. Je-li snížená produkce antioxidační ochrany, zvyšuje se metabolismus látek a tím i oxidační stres. Produkce superoxidu a peroxidu vodíku je zvýšená, snižuje se elasticita tkání a imunitní odpověď, hromadí se proteiny a snižuje se jejich rychlost odbourávání. V kůži se můžou hromadit konečné oxidativní produkty, lipofusciny. Projevují se červenými až hnědými skvrny u starších lidí, jejich velikost vzrůstá v souvislosti s věkem lidí [28]. Pro zpomalení stáří je především třeba zvýšit hladinu antioxidačních látek a přijímat pravidelně vitamíny ke zvýšení antioxidační ochrany, včas léčit zdravotní problémy.

4.2.8. ROS a kouření Kuřáci si mohou ROS a jejich účinky sami přivolat. V kouři je obsaženo několik tisíc různých látek včetně superoxidu, akroleinu atd.. Většina těch látek může způsobit změnu funkce imunitních buněk. Třeba akrolein působí na cystein toxicky a tím pádem dojde k deficitu glutathionu a vůči leukocytům snižuje obranyschopnost proti infekci [29, 30]. Metabolity kyslíku zapříčiní v rámci kouření vznik chronické bronchitidy a chronické obstrukční plicní nemoci.

4.2.9. ROS a další choroby ROS jsou v lékařství hojně zkoumány, protože vyvolávají řadu dalších chorob. Co se týče působení ROS na červené krvinky, při dlouhodobém působení se změní tvar krvinek. V očních chorobách mají ROS vliv na změnu struktury bílkovin v čočce. U šedého zákalu dochází ke změně průhlednosti čočky a tím pádem není oko schopno správně zaostřovat

26

obraz. Zákal je většinou způsoben stárnutím čočky vlivem tvorby příčných vazeb mezi molekulami bílkovin čočky. Vlivem nadměrného přísunu slunečního záření může dojít ke vzniku rakoviny kůže, protože vlivem slunečního záření se tvoří singletový kyslík, tedy sloučenina patřící mezi ROS.

5. Obrana proti ROS Volné radikály v přírodě lidskou činností stále přibývají [5]. Zhoršování kvality životního prostředí a ovzduší související se zdravím obyvatel vyspělých států způsobuje nadměrnou tvorbu ROS. Dojde-li k nerovnováze mezi ROS a antioxidanty, dochází ke vzniku oxidačního stresu. Je charakterizován jako jev, kdy dochází k převaze ROS nad antioxidanty. Antioxidanty patří mezi látky neutralizující ROS a bránící jejich škodlivému účinku nebo je likvidují. Obecně je známo kolem 4000 antioxidantů [31]. Mohou vykonávat více funkcí. Nejúčinnější funkcí je 1) bránit se tvorbě nadměrného množství [3] reaktivních sloučenin kyslíku. Další funkce jsou uvedeny níže: 2) ROS jsou zachycovány antioxidanty a tak zneškodněny [31] 3) reakcí dvou ROS-radikálů navzájem zanikají [31] 4) mohou být snad vylučovány z organismu (není zatím zcela prozkoumáno) [31] Další skupina antioxidantů hraje důležitou roli při opravování molekul poškozených ROS. Mezi „opraváře“ patří enzymy, které také opravují poškozenou DNA. Jednou z funkcí fosfolipas je odstraňování mastných kyselin poškozených působením ROS z fosfolipidů. Pro zamezení negativního působení ROS je důležité, aby byl vůči nim vyvinut obranný imunitní mechanismus. Součástí obranného mechanismu je antioxidační systém, který se může rozdělit do dvou skupin na základě konkrétních funkcí antioxidantů, na enzymatické a neenzymatické antioxidační systémy.

Tab. II. Přehled a rozdělení antioxidačního systému Enzymatický superoxiddismutasa glutathionperoxidasy glutathiontransferasy katalasy

ANTIOXIDAČNÍ SYSTÉM Neenzymatický transferin bilirubin feritin selen ceruloplazmin glutathion vitamin C, E, A kyselina lipoová alfa tokoferol kyselina močová koenzym Q flavonoidy karotenoidy

27

5.1. Enzymatický antioxidační systém Zvláště před superoxidovým radikálem působí tři enzymy. Jejich úlohou je bránit tvorbě nových ROS tak, že existující volné radikály se přemění na méně nebezpečné molekuly ještě před možností reagovat na další sloučeniny radikálů nebo ROS přímo rozloží. Mezi takové enzymy patří superoxiddismutasa, glutathionperoxidasy a katalasy.

5.1.1. Superoxiddismutasa (SOD) Patří mezi jeden z nejdůležitějších zástupců enzymů. Nachází se v každé buňce. Katalyzuje přeměnu superoxidu na peroxid vodíku [32]. V lidském organismu se nacházejí 3 typy SOD, záleží na tom, který ion enzym SOD obsahuje. Cu/Zn SOD se objevuje v každé tkáni a orgánech člověka, většinou v cytoplazmě - přesně v cytosolu a mezimembránových prostorech mitochondrií [3]. Vyskytuje se ve formě dimeru. Převážně v mitochondriích je přítomna Mn/SOD. Třetím typem SOD je Fe/SOD. Obě superoxidasy jsou v prokaryotních organismech s vlastností dimeru.

5.1.2. Glutathionperoxidasy (GPx) Hlavní rolí enzymu obsahujícího selen je chránit erytrocyty před oxidačním poškozením. Vyskytuje se v cytosolech a mitochondriích ve formě tetrameru. Patří mezi enzymy přeměňující

několik

glutathionperoxidasa)

typů a

hydroperoxidů

fosfolipidové

mastných

hydroperoxidy

kyselin

(cytosolová

GSH-

(fosfolipidhydroperoxid-GSH-

peroxidasa) na neškodné molekuly.

5.1.3. Glutathiontransferasy (GST) Skupina cytosolových enzymů, která dokáže přeměnit některá toxická xenobiotika (detoxikovat). Vykonává také funkci opravného mechanismu – odstraňuje produkty při peroxidaci.

5.1.4. Katalasy (KAT) Významná skupina enzymů, jejichž schopností je rozkládat H2O2 na vodu a kyslík. 2 H2O2 → 2 H2O + O2 Jejich hlavním místem výskytu jsou erytrocyty. Nespecifickou katalasovou aktivitu má též hemoglobin.

28

5.2. Neenzymatický antioxidační systém Hraje podobnou roli jako enzymatický antioxidační systém. Eliminuje volné ROS jejich přeměnou na méně toxické produkty. Do neenzymatické skupiny antioxidačního systému můžeme začlenit vysokomolekulární a nízkomolekulární endogenní antioxidanty. Mezi hlavní představitele

vysokomolekulárních

antioxidantů

patří

například

transferin,

feritin,

ceruloplazmin, albumin. Glutathion, škála vitamínů (vitamín A, C a E), flavonoidy, karotenoidy, koenzym Q, melatonin a další látky jsou součástí nízkomolekulárních endogenních antioxidantů. Kromě dalších látek mají významné zastoupení i stopové minerály (Fe, Cu, Zn, Se).

5.2.1. Transferin, laktoferin a feritin Transferin a laktoferin mají podobné vlastnosti. Mají charakter skupiny proteinů vázající železo a měnící jejich redoxní vlastnosti do stavu bránící vznik toxického hydroxylového radikálu. Transferin je glykoprotein, jehož syntéza probíhá v játrech. Vazba transferinu probíhá v plazmě, kdežto vazba laktoferinu v leukocytech. Feritin kromě vlastnosti uvedené výše má též schopnost železo ukládat. Vyskytuje se v tkáních a malá část v krvi. V medicíně je velmi prospěšný při určování obsahu železa v organismu a je velkým přínosem pro diferenciální diagnostiku anémií [33].

5.2.2. Ceruloplazmin a albumin Ceruloplazmin patří mezi proteiny sloužící jako zásobárna mědi. Má také oxidační vlastnosti, oxiduje Fe2+ na Fe3+ a takto brání tvorbě OH• [34]. Albumin patří mezi jedny z nejúčinnějších thiolových skupin antioxidantů. Vyznačuje se podobnou povahou jako proteiny vázající železo (viz výše). Váže železo a měď a brání tak účinkům ROS.

5.2.3. Glutathion (GSH, GSSG) Důležitý tripeptid vyskytující se ve dvou existujících formách. Je složený z aminokyselin glutaminu, cysteinu a glycinu. Vystupuje v redukované formě jako tiol (GSH) nebo jako disulfid = oxidovaný glutathion (GSSG). V buňkách převažuje GSH. Glutathion se vyznačuje antioxidační schopností. GSH se účastní mnoha biochemických pochodů, mezi které patří např. detoxikace, transport aminokyselin, produkce koenzymů a recyklace vitamínů E a C. Působí tak proti ROS a zachovává několik důležitých bílkovin se skupinou –SH v původním složení. Chrání tím bílkoviny, které vstupují do oprav poškozené DNA a zabraňuje vzniku případných mutací. Je významný i u erytrocytů, protože chrání jejich obal. 29

Glutathionperoxidasa Gly

Gys

Gly

Gys

SH

Gly

S

S

Gys

Glutathionreduktasa Glu

Glu

Redukovaný glutathion (monomer)

Glu Oxidovaný glutathion (dimer)

Obr. 8.: Přeměna glutathionu na jeho dvě formy

5.2.4. α - tokoferol a vitamín E Vitamín E existuje ve více formách, nejznámější je α - forma. Ochraňuje srdce (redukuje tvorbu LDL – cholesterolu a tím snižuje nebezpečí vzniku sraženiny) a tkáně. Kromě toho má příznivý účinek na detoxikační schopnosti jater, tedy pomáhá škodliviny lépe odvádět. Hlavní funkcí α − tokoferolu je chránit buněčné membrány. Má schopnost vychytávat volné radikály a tím regenerovat poškozené buňky. Na obr. 9. je popsána funkce α − tokoferolu. ROS napadají membrány, která je pokryta fosfolipidy a tvoří se lipidové radikály. Působením α − tokoferolu dochází k obnově poškozeného lipidu a současně se α − tokoferol mění na radikál. Ten je redukován ve spolupráci s vitamínem C (viz. kap. 5.2.5.). α − tokoferol také odstraňuje vznikající volné peroxylové radikály. Působením ROS totiž dochází ke stárnutí buněk a zkracování doby jejich života.

30

Obr. 9.: Funkce α − tokoferolu při opravě radikálem poškozeného lipidu; R• - lipidový radikál, R – opravený lipid α-TO• reaguje s dalším peroxylovým radikálem (lipidový peroxyl nebo lipoxylový radikál) za vzniku neradikálových produktů LOOH, LOH a α − tokoferolchinonu [35]. α-TO• + LOO• (LO•) → neradikálové produkty (α−Τ α−ΤOQ, LOOH, LOH) [36] α−Τ

5.2.5. Vitamín C (kyselina askorbová) Velmi důležitý vitamín pro buňky, který zejména díky svým redukčním schopnostem tyto buňky ochraňuje před působením ROS. Chrání fosfolipidy v buněčných membránách před oxidací peroxylovými a hydroxylovými radikály [5]. Úzce souvisí s α − tokoferolem, protože je schopna obnovovat radikál vitamínu E zpět na vitamín E. Během této reakce se askorbát přemění na askorbylový radikál (viz obr. 10.). Další reakcí s superoxidem, hydroxylovým radikálem

nebo

singletovým

kyslíkem

může

vznikat

dehydroaskorbát

(kyselina

dehydroaskorbová). Speciálním enzymem dehydroaskorbáthydrogenasou vzniká opět kyselina askorbová. Je schopna redukovat volné trojmocné železo na dvojmocné při Fentonově reakci. To platí i o redukci mědi.

31

Obr. 10.: Přeměna kyseliny askorbové na askorbylový radikál, zástupce kyseliny askorbové

5.2.6. Karotenoidy: β - karoten a vitamín A Karotenoidy jsou typické svým červeným, žlutým a oranžovým zbarvením [37]. Řadí se mezi terpeny a povahou se chovají jako lipofilní sloučeniny. Působí jako antioxidanty – zhášejí především singletový kyslík (přeměnují ho na tripletový kyslík). Existuje několik izomerů karotenů (α−,β−, γ−, δ−) lišící se od sebe počtem cyklohexenylového kruhu ve vzorku. Z některých karotenů vznikají vitaminy A1 – retinol a A2 – dehydroretinol [3]. Vitamín A je antioxidantem, který se podílí mimo jiné na zachování správné funkce zraku [5].

Obr. 11.: Zástupci karotenoidů

32

β − karoten také podléhá vlivům radikálů. Při reakci s peroxylovým radikálem vzniká stabilní β - karotenový radikál.

Obr. 12.: Vznik β - karotenového radikálu reakcí β - karotenu s peroxylovým radikálem

5.2.7. Flavonoidy V dnešní době je známo asi 4000 flavonoidů působících jako významné antioxidanty. Skupina různorodých zástupců mají ve své struktuře několik fenolových skupin jenž zabraňují peroxidaci lipidů a atakují volné radikály. Podílí se na obnově vitamínů E a C, působí protizánětlivě. Také jsou schopné vázat přechodné kovy a tak zabraňovat jejich přeměně na ROS. Mezi flavonoidy patří např. rutin, který je součástí léku Ascorutin běžně podávaného lidem se cévními problémy a rutin nalezneme i v borůvkách [38]. Vysoký obsah flavonoidů se nachází v červeném víně nebo zeleném čaji. Příjmem flavonoidů docílíme odstranění tuků z krve a tedy snížení rizika srdečního onemocnění.

Obr. 13.: Mateřská látka flavonoidů - flavon 33

5.2.8. Koenzym Q10 (ubichinon) Patří mezi důležité přírodní látky. Chemicky se jedná o deriváty benzochinonu, které se od sebe rozlišují počtem izoprenových jednotek ve svých lipofilních řetězcích. V našem případě jde o koenzym obsahující 10 izoprenových jednotek. V některých potravinách se nalézají koenzymy s nižším obsahem izoprenoidů (Q1-Q9), tělo si je schopno přeměnit je na formu Q10 [11]. Ubichinon se vyskytuje ve všech buňkách, v těle jsou jej asi 2g [13]. Především se nachází v mitochondriích, kde plní funkci v přenašeče elektronů v dýchacím řetězci. Tímto způsobem vzniká energie důležitá k dýchání a tedy pro život. Kromě další schopnosti, regenerace vitamínů C a E, působí také jako důležitý lipidový antioxidant. Blokuje tvorbu škodlivého cholesterolu a zastavuje peroxidaci lipidů. Na druhé straně je ovšem jedním z nejvýznamnějších zdrojů kyslíkatých radikálů v organismu (prooxidant).

Obr. 14.: Přechod ubichinonu na ubichinol prostřednictvím elektronů (probíhá jako dva jednoelektronové pochody, meziproduktem je semichinonový radikál)

5.2.9. Kyselina lipoová (vitamín B13) a kyselina močová Kyselina lipoová je známá spíše jako vitamín B13. Jako antioxidant se podílí na regeneraci askorbátu. Pokud se v krvi nachází vyšší hladina cukru, než je standardní, dochází ke vzniku ROS a vitamín B13 tomu právě předchází snižováním hladiny cukru [39].

Obr. 12.: Kyselina lipoová a kyselina dihydrolipoová 34

Kyselina močová je hlavním antioxidantem v krevní plazmě [13]. Nachází se v konečném produktu vylučovací soustavy člověka – v moči. Dokáže vázat železo a měď v podobě pevných chelátů – brání tím vzniku hydroxylového radikálu.

Obr. 13.: Reakce kyseliny močové s radikálem

Při zvýšené koncentraci kyseliny močové může dojít ke vzniku nemoci dna a k tvorbě ledvinových kamenů.

6. Metody stanovení ROS Existují laboratorní metody ke stanovení ROS. Stanovit ROS je ale obtížné vzhledem k jejich krátké doby života. Nejčastěji se využívají metody měření produktů působení ROS a případné změny hladiny antioxidační ochrany. Uvádím některé metody detekce přítomnosti ROS, respektive aktivitu antioxidantů.

6.1. Elektronová paramagnetická rezonance (elektronová spinová rezonance) Jedna z výhodných metod, jak stanovit ROS na základě jejich nepárových elektronů. Metoda využívá silné magnetické pole [6]. Sloučeniny s nepárovým elektronem se orientují v tomto poli vlivem vlastního nenulového spinu a jsou schopny absorbovat mikrovlnné záření. Tak je lze prokázat a charakterizovat.

6.2. Stanovení superoxidu U této metody se využívá schopnosti superoxidu redukovat tetrazoliovou sůl. Za normálních podmínek je nitrotetrazoliová modř žlutého zbarvení, ale za přítomnosti superoxidu s redukčními schopnostmi se NBT mění na tmavomodrou barvu za vzniku diformazanu [28]. 35

O2• + NBT (žlutá) → O2 + diformazan (tmavomodrá)

V laboratořích se nejčastěji využívá zachycení superoxidu za přítomnosti SOD, kde se zjišťuje množství superoxidu jako rozdíl absorbance v přítomnosti a nepřítomnosti SOD [28].

6.3. Stanovení peroxidu vodíku Metod identifikace H2O2 je víc. Mezi přesné metody H2O2 patří fluorescence za použití fluorescenční látky skopoletinu. Peroxid vodíku za přítomnosti skopoletinu fluoreskuje při 460nm, když se ale v buňkách peroxid vodíku nenachází, skopoletin po oxidaci nefluoreskuje při stejné vlnové délce. H2O2 + skopoletin (red) → 2H2O + skopoletin (ox)

6.4. Stanovení hydroxylového radikálu HO• má tendenci reagovat s aromatickými sloučeninami. Mezi zachytávače HO• patří acetylsalicylát nebo fenylalanin a výsledné produkty se měří vysoce účinnou kapalinovou chromatografií [3].

6.5. Stanovení konjugovaných dienů a lipidových peroxidů, MDA Primární produkty lipoperoxidace se často nejdřív detekují vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a pak fluorimetrem [3]. Nejpoužívanější detekcí sekundárního produktu MDA je reakce MDA s kyselinou thiobarbiturovou [17]. Výsledný produkt je fialový a měří se spektrometricky nebo fotometricky [40, 41].

6.6. Stanovení produktů AGE Konečné produkty pokročilé glykace můžeme stanovit dvěma metodami, HPLC nebo imunochemickou detekcí proteinů glykace. Jsou to ale metody náročné, i finančně. Nespecificky je lze stanovit pomocí fluorescence.

36

Závěr Je presentován přehled vlastností a účinků reaktivních sloučenin kyslíku (ROS). Struktura těchto látek má většinou charakter radikálů. Vznikají jak enzymovými tak neenzymovými pochody a jsou produkovány účelově, záměrně k plnění specifických funkcí (většinou obranných nebo signalizačních). Vedlejší účinky jejich působení jsou nežádoucí a vedou k závažným komplikacím. Existuje množství případů, kdy lze původ či alespoň příčinu komplikace chorob nalézt v působení ROS. Jsou uvedeny typické příklady těchto vztahů a možnosti obrany proti působení ROS – antioxidační systémy. Ty jsou rozděleny na enzymové a neenzymové resp. endogenní a exogenní. Je podán výčet nejvýznamnějších metod stanovení ROS a produktů jejich působení.

Anotace Reaktivní sloučeniny kyslíku (ROS) jsou intenzivně studovanou skupinou látek. Jejich reaktivita plyne většinou z radikálové struktury. Jsou schopny reagovat s řadou významných látek v organismu a obvykle jej tak poškozují. Proto mohou sloužit jako obranné prostředky proti cizím organismům a jsou pak produkovány v případě infekce záměrně. Nadprodukce nebo vedlejší nežádoucí produkce ROS však může poškozovat vlastní organismus. Tomu mohou zabránit endogenní antioxidační systémy, významný vliv zde mají látky exogenního původu (v potravě), které účinky ROS dokáží alespoň zčásti eliminovat (antioxidanty). Některé ROS mají také významné regulační funkce. Problematika ROS je velmi zajímavá též z pohledu fyziologického a zejména medicínského.

Annotation Reactive oxygens species are profoundly studied category of substance. Their reactivity is usually a result of their radical structure. They are able to react with most substances in organism and damage them. That is the reason why they can serve as a defense against extraneous organisms and in case of infection they are produced purposely. Overproduction or accessory production can damage the own organism. It can be prevented only by endogenous antioxidant systems. Also substances of exogenous origin (in food) have significant influence here, because they are able to eliminate the antioxidants (at least partially). Some oxygen reactants also have significant regulating functions. Reactive oxygens species are an interesting area of study also from the medical and physiological point of view.

37

Seznam použité literatury 1. POKORNÝ, Jan. Antioxidanty ve výživě moderního člověka. Chemické listy. 2005, 99, č. 7, s. 454. ISSN 0009-2770. 2. McCORD, J. M., FRIDOVICH, I.: Superoxide dismutase. J. Biol. Chem. 1969, 244, 6049-6055. [cit. z 3] 3. ŠTÍPEK, Stanislav et al.. Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Praha : Grada Publishing, Avicenum, 2000. 314 s. ISBN: 08-7169-704-4. 4. HUDCOVSKÁ, Lenka. Oxidativní stres v rostlinách – reaktivní radikály a antioxidační ochrana : ročníková práce. Brno: Masarykova univerzita, Fakulta přírodovědecká, 2002. 32 l.. 5. Antioxidanty a volné radikály. Pharma News [online]. Březen 2006, č. 2, [cit. 200803-24]. Dostupný z WWW: . 6.

HOLEČEK, Václav. Volné radikály, způsoby stanovení jejich účinků a antioxidanty [online]. Český Těšín : Finclub Zpravodaj LG - Farma 2002. c2002 [cit. 2008-02-28]. Dostupný z WWW: .

7. MAROUNEK, Milan. Povaha a mechanismus účinku antioxidantů, význam ve výživě zvířat a lidí : studie. Praha: Vědecký ústav živočišné výroby, prosinec 2006. 39 l.. 8. MASOPUST, Jaroslav. Reaktivní formy kyslíku (volné kyslíkové radikály). Klinická biochemie [online]. [cit. 2008-03-03]. Dostupný z WWW: . 9. Peroxidace lipidů [online]. c2005 – 2007 [cit. 2006-04-21]. Dostupný z WWW: . 10. HOLEČEK, Václav. Volné radikály a antioxidanty [online]. c2004 [cit. 2005-01-31]. Dostupný z WWW: . 11. RACEK, Jaroslav. Oxidační stres a možnosti jeho ovlivnění. 1.vyd. Praha : Galén, 2003. 89 s. ISBN 80-7262-231-5. 12. GINTER, Emil. Nový pohl´ad na aterosklerózu. Úloha vol´ných radikálov. Vesmír. 1991, 70, č. 1, s. 30-31. ISSN 0042-4544.

38

13. ROKYTA, R.; HOLEČEK, V.; STOPKA, P.. Volné radikály : nemoci, které nelze ovlivnit antioxidanty. Vesmír. 2006, 85, č. 10, s. 617-619. ISSN 0042-4544. 14. Referátový výběr a aktuality z urologie [online]. 2006, č. 1 [cit. 2006-09-13]. Dostupný z WWW: . 15. NEUWIRTOVÁ, Radana. Ubikvitin - proteasomový systém a transkripční faktor NF-

κB

[online].

c2006

[cit.

2006-12-02].

Dostupný

z WWW:

. 16. KOUKAL, Milan. Jak moc se můžeme bránit mrtvici? 21. století. 2007, č. 4 [cit. 2007-04-19]. Dostupný z WWW: . 17. JAKUŠ V.; LOPUCHOVÁ M.. Úloha vol´ných radikálov, oxidačného stresu a antioxidačných systémov pri ochoreniach pečene. Bratislavské lekarske listy, 1999, 100, č. 10, s. 548-559. ISSN 0006-9248. 18. VYKONALOVÁ, Radka. Metody stanovení oxidativního stresu – lipidní peroxidace v rostlinách a řasách : ročníková práce. Brno : Masarykova univerzita, Fakulta přírodovědecká, 2002. 34 l.. 19. BENEŠ, L.. Úloha reaktivních forem kyslíku a dusíku u některých nemocí : prezentace k přednáškám Antioxidanty a volné radikály šk. r. 2003/2004. 20. KAZDOVÁ, L.; MALÍNSKÁ, H.; MARKOVÁ, I.; OLIYARNYK, O.. Antioxidanty, diabetes a kardivaskulární onemocnění [online]. [cit. 2008-03-03].

Dostupný

z WWW: <www.vitamins.cz/archiv/2003/doc/l/L_20.doc>. 21. Cukrovka a vliv volných radikálů [online]. c2006-2008 [cit. 2008-04-28]. Dostupný z WWW:


id5225.html>. 22. VEŠKRNOVÁ E.; KEMPNY, B.. Ateroskleróza [online]. [cit. 2008-05-12]. Dostupný z WWW: . 23. KREJSEK, Jan. Ateroskleróza – důsledek dlouhodobě poškozující zánětové reakce. Sanguis [online]. 2007, č. 49., s. 20. [cit. 2008-04-12].

Dostupný z WWW:

. 24. Jak nám volné radikály škodí [online]. c2007 [cit. 2008-04-12]. Dostupný z WWW: . 25. GINTER, Emil. Antioxidanty v l´udskej výžive. Vesmír. 1998, 77, č. 8, s. 434-437. ISSN 0042-4544. 39

26. HOLEČEK, Václav. Bioflavonoidy a pycnogenol [online]. Český Těšín : Finclub Zpravodaj LG - Farma 2002. c2008 [cit. 2008-04-05]. Dostupný z WWW: 27. HOLEČEK, Václav. Stárnutí a možnosti jeho ovlivnění preparáty Finclubu [online]. Český Těšín : Finclub Zpravodaj LG - Farma 2002. c2008 [cit. 2008-04-21]. Dostupný z WWW: . 28. BERGENDI, Ludovít. Superoxid a iné bioreaktívne formy kyslíka. 1. vyd. Bratislava : Veda Vydavatel´stvo slovenskej akadémie vied, 1988. 198 s.. 29. SLEZÁK, R.; RYŠKA, A; KOSORÍNOVÁ, K.. Karcinogenní účinky tabákového kouře [online]. Hradec Králové : Stomatologická klinika a Fingerlandův ústav patologie LF UK, c2004 [cit. 2008-02-22]. Elektronický výukový materiál. Dostupný z WWW: . 30. MASOPUST, Jaroslav et al.. Patobiochemie buňky Praha : 2. lékařská fakulta UK, 2003. c2008 [cit. 2008-03-02]. Dostupný z WWW: 31. HLÚBIK, P.; STŘÍTECKÁ, H.; FAJFROVÁ, J.. Antioxidanty v klinické praxi. Praktické lékarenství [online]. 2006, č. 6, s.255. [cit. 2008-05-02]. Dostupný z WWW: . 32. Oxidační

stres

[online].

c2008

[cit.

2008-03-31].

Dostupný

z WWW:

. 33. ZUBER, Roman. Feritin v laboratorní diagnostice [online]. [cit. 2008-05-14]. Dostupný z WWW: . 34. SLANÁ, Zuzana; SLANÝ, Jaroslav. Problematika volných kyslíkových radikálů. In Sborník prací přírodověděcké fakulty Ostravské univerzity. Fyzika, chemie. Ostrava, 1996, 156, č. ¾, s. 61-66. ISBN 80-7042-740-X. 35. Winston G.W., v knize : Stress Responses in Plants: Adaption and Acclimation Mechanisms, str. 57. Willey – Liss, 1990. 36. PITERKOVÁ, J.; TOMÁNKOVÁ, K.; LUHOVÁ, L.. Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chemické listy.

2005,

99,

č.

7,

s.

455-466.

ISSN

0009-2770.

Dostupné

z WWW.:.

40

také

37. Dietní antioxidanty [online]. Poříčí nad Sázavou : Mars. [cit. 2008-04-24]. Dostupný z WWW:


antioxidanty/>. 38. Flavonoidy [online].

Wikipedia. c2008 [cit. 2008-04-24]. Dostupný z WWW:

. 39. ALA – kyselina alfa-lipoová nejen pro diabetiky [online]. c1999-2006 [cit. 2004-0325]. Dostupný z WWW: . 40. OKHAWA, H.; OHISHI, N.; YAGI, K.. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 1979, 95, s. 351 – 358. [cit. z 3] 41. BUTLER, J.; KOPPENOL, WH.; MARGOLIASH, E.. Kinetics and mechanism of the reduction of ferricytochrome c by superoxide anion. J. Biol. Chem. 1982, 257, s. 10747 – 10750. [cit. z 3]

41