První číslo vychází v průběhu května Časopis. Journal of Metallomics and Nanotechnologies vychází

První číslo vychází v průběhu května 2014. Časopis Journal of Metallomics and Nanotechnologies vychází pouze elektronicky, čtvrtletně. Jeho obsahové zaměření je v oblastí nano-biochemie, nanotechonologie, biomedicína a nanomedicína. Časopis vychází bez regionálních mutací v českém, slovenském a anglickém jazyce. Vydavatel: Laboratoř metalomiky a nanotechnologií Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00, Brno, Česká republika. Časopis Journal of Metallomics and Nanotechnologies je novým výukovým a především vědeckým časopisem, který sdružuje nově vznikající vědecký směr Metalomiku a stále více se rozvíjející Nanotechnologie. Tento časopis je volně přístupný a šiřitelný skrze své webové stránky s minimální podporou reklamy. Cílem redakce je aby články vycházející v každém ze čtyř ročních čísel obsahovaly tématiku využití jakýchkoliv technologií v měřítku nanometrů pro účely biologického, chemického či biotechnologického výzkumu anebo přímo konkrétních nanobiotechnologických aplikací.

Článek je volně šiřitelný pod licencí Creative Commons (BY-NC-ND). Musí však být uveden autor a dokument nelze měnit a použivat pro komerční účely.

Na obálce „Nanotransportér s enkapsulovaným léčivem může být označen diagnostickou značkou, kterou může být například kvantová tečka. Po aplikaci do krevního řečiště díky cílícím ligandům vyhledá na základě chemické specifity nádorovou buňku. Transportér následně do této buňky uvolní svůj obsah cytotoxický obsah. Tím dojde k velmi efektivnímu usmrcení nádorové buňky bez výraznějších vnějších negativních vlivů na okolní zdravé buňky.“

Editorial

První číslo prvního vydání vzniká v roce 2014, kdy laboratoř Metalomiky a nanotechnologií sídlící jako vědecké uskupení pod vedením Reného Kizeka na Agronomické fakultě Mendelovy univerzity v Brně zažívá velmi produktivní rok. Díky neúnavné práci se během 12ti let podařilo takřka z ničeho vybudovat centrum excelentní vědy, které je nyní velmi produktivní součástí dvou evropských vědeckých center a probíhá na něm řešení několika desítek vědeckých projektů. Nutno podotknout, že tomu tak je zejména díky existenci evropských projektů a podpory ze strany kolegů z dalších tří spolupracujících Brněnských univerzit (VUT, MU a VFU). Žádné z významných vědeckých pracovišť se neobejde bez výuky a školení svých mladých vědeckých pracovníků neboť spoléhat na import vědeckých kapacit bez masivní dotační podpory ze strany státu či evropských strukturálních fondů nelze. Proto je v tomto čísle věnován prostor právě těm nejmladším vědeckým pracovníkům z řad studentů, kteří na tomto pracovišti vykonávají svoji středoškolskou odbornou činnost anebo bakalářské či diplomové práce. Edukativní charakter časopisu tak spočívá nejen v obsahu tohoto vydání ale i v činnosti, která stojí na pozadí jeho zrodu. V dalším čísle bude v logické posloupnosti věnován prostor vědeckým článkům reprezentantů studentů postgraduálního studia, kteří představí konkrétní směry výzkumu. Tyto prezentované směry jsou jak součástí vědecké náplně jejich studia, tak součástí řešených vědeckých projektů na pracovišti. Postgraduální studenti jsou tak hlavní hybnou vědeckou silou v oblasti zejména základního výzkumu, který je na tomto pracovišti prováděn, byť s výhledem na posun do aplikační fáze. Ondřej Zítka (Editor)

3

Redakční rada časopisu Journal of Metallomics and Nanotechnologies: Vedoucí editor: Ondřej Zítka, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Asistent vedoucího editora: Michal Horák, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Asistent vedoucího editora: Sylvie Skaličková, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Odborná redakční rada: René Kizek, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Libuše Trnková, Masarykova univerzita, Česká republika Pavel Kopel, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Jaromír Hubálek, Vysoké učení technické v Brně, Česká republika Vojtěch Adam, Mendelova univerzita v Brně, Česká republika Miroslav Pohanka, Univerzita obrany, Česká republika Michal Masařík, Masarykova univerzita, Česká republika David Hynek, Středoevropský technologický institut, Česká republika Markéta Vaculovičová, Středoevropský technologický institut, Česká republika Marie Konečná, Středoevropský technologický institut, Česká republika Jitka Petrlová, Lund University, Švédsko Gabriella Emri, University of Debrecen, Hungary

Obsah

Scientific abstracts Antisens oligonukleotidy jako nástroj pro boj s nádorovými onemocněními.........................................7 Apoferritinový transportér léčiv..............................................................................................................8 Carbon nanotubes as etoposide nanocarrier..........................................................................................10 Viruses and cancer: papilloma, hepatitis, epstein-barr and rous-sarcoma virus.................................12 Separační techniky ve výzkumu rakoviny.............................................................................................14 Rakovina a možnosti nanotechnologií...................................................................................................15 Metalothionein jako prognostický nádorový marker............................................................................16 Fluorescence imaging of quantum dots.................................................................................................18

Papers Liposomální transportéry....................................................................................................................20 Moderní zobrazovací metody..........................................................................................................24 Apoferritin: nanotransportér pro cílené dopravování léčiv.....................................................................28 Miniaturizované detekční systémy a jejich aplikace..................................................................................32 Detekce nukleových kyselin pomocí metody dot-blot.........................................................................36 Sledování hladiny MT-III ve zdravé a prion-infikované myší mozkové tkáni.............................................40 Viry jako nanotransportéry léčiv.........................................................................................................43 MiRNA: od biogeneze po využití v lékařství....................................................................................48 Obecné shrnutí vzniku a mechanismu rezistence vůči těžkým kovům.................................................52 Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy..............................................................................55 Biosyntéza kvantových teček.........................................................................................................59 Zelená syntéza stříbrných a zlatých nanočástic pomocí extraktů z vyšších rostlin..................................62 Vliv různých forem glutathionu na kulturu Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus...........................65

5

Scientific abstracts

Antisens oligonukleotidy jako nástroj pro boj s nádorovými onemocněními Zbyněk Heger1,2, Ondřej Zítka1,2, Vojtěch Adam1,2, René Kizek1,2 1

2

Ústav chemie a biochemie, Mendelova Univerzita v Brně, Zemědělská 1, CZ-613 00 Brno, Česká republika – Evropská unie Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 3058/10, CZ-616 00 Brno, Česká republika, Evropská unie

Antisense oligonukleotidy (ASOs) down-regulují expresi cílové molekuly tvorbou duplexu s její kódující mRNA (Obr. 1). Ačkoliv ASOs vykazují velký aplikační potenciál, hlavní problém nastává při jejich transportu 1. Cílem práce proto byla transfekce MCF-7 buněk pomocí kationických liposomů, nesoucích antisense proti estrogenním receptorům alpha (ERα) a pozorování efektu na proliferaci a možnou chemosensitivizaci.

Obrázek 1: Obecné schéma efektu antisense oligonukleotidu, blokujícího translaci cílového proteinu

VÝSLEDKY A DISKUSE Bylo ukázáno, že enkapsulace do liposomu zefektivňuje prostup ASOs do MCF-7 buněk. Navíc bylo ukázáno, že ASOs ERα mají velký potenciál působit antiproliferativně, snižovat expresi genů i hladinu oxidačního stresu. Dalším benefitem plynoucím z aplikace ASOs ERα je, že jsou schopny chemosensitizovat nádor díky snížení hladiny GSH, metalothioneinu a genu Nf-κB1, tvořící resistenci proti běžným cytostatikům.

ZÁVĚR Námi připravené liposomy mohou sloužit jako vhodný transportérový systém, využitelný pro antisense aplikace. Z výsledků vyplývá, že transfekce probíhá již u nízkých koncentrací ASOs (1 µM).

PODĚKOVÁNÍ Práce byla finančně podpořena projektem Liga proti rakovině 16002/2013-981.

LITERATURA

1. Skoblov M. Y.: Molecular Biology, 43, 917 (2009).

7

8


Apoferritinový transportér léčiv Pavel Kopel1,2, Vojtěch Adam1,2, René Kizek1,2 1

2


Apoferritin je protein, který lze připravit odstraněním oxidů a hydroxidů železa z ferritinu, který je přítomen ve všech vyšších organizmech. Dutinu, která vznikne odstraněním sloučenin železa, lze využít pro transport různých látek použitelných pro značení případně lze transportovat i léčiva. Mechanizmy vyplnění vnitřku apoferritinu jsou dva, a to využití kanálků ve struktuře nebo lze využít otevření struktury snížením pH. K fragmentům proteinu se pak přidá léčivo a zvýšením pH se struktura uzavře1,2. Neuzavřené léčivo se odstraní nejčastěji dialýzou. Takto připravený komplex lze použít pro cílený transport do místa nádoru, kde se využívá nízkého pH vnitřního prostředí nádoru, k otevření a uvolnění léčiva. Výhodou apoferritinu je i možnost jeho povrchové modifikace, kdy lze spojit tento transportér s dalšími látkami (Obr. 1).

Obrázek 1: Obecné schéma možností využití apoferritinu k cílené léčbě

VÝSLEDKY A DISKUSE Bylo ukázáno, že povrch apoferritinu lze modifikovat pomocí biotinu a protilátky. Vazba biotin streptavidin byla využita pro připojení paramagnetického oxidu železitého. To lze využít pro purifikaci

a samozřejmě pro transport pomocí magnetického pole. Transportér lze takto využít ke kombinované léčbě a termoterapii. Magnetické vlastnosti lze navíc využít i pro zobrazení místa nádoru.

ZÁVĚR Byli jsme úspěšní v přípravě apoferritinu s doxorubicinem a platinovými léčivy. Vytvořili jsme také komplex s navázanou superparamagnetickou látkou pro cílený transport.


LITERATURA

1. Dospivova D., Hynek D., Kopel P., Bezdekova A., Sochor J., Krizkova S., Adam V., Trnkova L., Hubalek J., Babula P., Provaznik I., Vrba R., Kizek R.: International Journal of Electrochemical Science, 7, 6378 (2012). 2. Blazkova I., Nguyen H. V., Dostalova S., Kopel P., Stanisavljevic M., Vaculovicova M., Stiborova M., Eckschlager T., Kizek R., Adam V.: International Journal of Molecular Sciences, 14, 13391 (2013).

10


Carbon nanotubes as etoposide nanocarrier Amitava Moulick1,2, Hoai Viet Nguyen1,2, Zbyněk Heger1,2, Vedran Milosavljevic2, Pavel Kopel1,2, Vojtech Adam1,2 , Rene Kizek1,2 1

2


Etoposide, etoposide phosphate or VP-16 is a cytotoxic agent (anticancer drug) which acts as a topoisomerase II inhibitor. It can show activity against a wide range of cancers including testicular, small cell lung, Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma, AIDS-related Kaposi’s sarcoma and acute myelogenous leukemia 1. The present work aims to improve a better way of cancer treatment using a complex of etoposide (ETO), multiwall Carbon Nanotube (MWCN), antisense Oligonucleotide and magnetic particle (MAN) (Fig. 1).

Fig. 1: Expected diagram of the target complex

RESULTS AND DISCUSSION Different concentrations (1; 5; 10 and 15 mM) of Etoposide were used to interact with MWCN (1 mg.mL -1). Subsequently, ds DNA and magnetic particle were successfully attached to this complex. The entire complex was further used for triple hybridization with antisense oligonucleotide, complementary to estrogen receptor of estrogen receptor positive breast carcinoma cells that is still one of the leading causes of cancer-related death in woman worldwide. Using electrochemical methods, entire complex was characterized to comprise 15 mM etoposide (in case of 15 mM concentration of etoposide used for conjuga-

tion) and it was shown that recovery of conjugation is with no or minimal losses of chemotherapeutics and all etoposide molecules are conjugated to carbon nanotubes inner and outer surface. Entire complex offers simple and reproducible way of binding of etoposide and its simple purification due to presence of paramagnetic nanoparticle. Future aim is application of complex towards MCF-7 (ductal invasive estrogen receptor positive breast carcinoma cell line) and observation of antiproliferative effect, real-time expression of chosen genes, blotting analyses of protein expression and electrochemical microarray.

CONCLUSION We proposed the novel complex that can possible attack the cancer cells by two different ways: i) through inhibition of topoisomerase II via etoposide presence that can lead to alteration of DNA synthesis and triggers apoptosis, ii) through presence of antisense oligonucleotide against estrogen receptor alpha. This portion can effectively down-regulate the target ER protein that is responsible for proliferative attributes of MCF-7 cells and often causes chemoresistance of tumorous cells. Carbon nanotubes (MWCN) can help in cell penetration and successful transfection.

ACKNOWLEDGEMENT The work was financially supported by the project Liga proti rakovine 16002/2013-981.

LITERATURE

1. Kobrinsky N., Packer R., Boyett J., Stanley P., ShiminskiMaher T., Allen J., Garvin J., Stewart D., Finlay J.: Journal of Neuro-Oncology, 45, 47 (1999).

12


Viruses and cancer: papilloma, hepatitis, epstein-barr and roussarcoma virus

Branislav Ruttkay-Nedecky1,2, Ana Jimenez1,2, Dagmar Chudobova1,2, Lukas Nejdl1,2 , Vojtech Adam1,2, Rene Kizek1,2 1

2

Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic, European Union Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ-616 00 Brno, Czech Republic, European Union

HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV)

Human papillomaviruses (HPVs) are small circular, double-stranded DNA viruses infecting epithelial tissues. HPV is a virus from the papillomavirus family that affects human skin and the moist membranes that line the body, such as the throat, mouth, feet, fingers, nails, anus and cervix. The HPV 16 and 18 strains, which are known to cause nearly all cases of cervical cancer, also raise the risk of developing oropharyngeal (throat) cancer. HPV gains access to basal cells through microabrassions or by infecting the transformation zone, an abrupt transition from a columnar to a squamous epithelium 1. Infected cells actively express the early genes E1, E2, E4 and E5. Viral oncoproteins E6 and E7 are expressed in limited amounts due to transcriptional repression exerted by E2. Infected basal cells migrate to the lumen as they differentiate; differentiated epithelial cells express the late capside genes L1 and L2. (Fig. 1).

Fig. 1: Genomic organization of the human papillomavirus type 16. ORFs deduced from the DNA sequence are designated E1 to E7, and L1 and L2. The non-coding region (NCR, also known as a long control region) is also shown. A E and AL indicate early and late polyadenylation sites 2

HEPATITIS VIRUSES THAT CAUSE CANCER Hepatitis B virus (HBV), a member of the hepadnavirus group, double-stranded DNA viruses which replicate, unusually, by reverse transcription. Hepatitis B virus is endemic in the human population and hyperendemic in many parts of the world. A number of variants of this virus have been described. Hepatitis C virus (HCV), is an enveloped single-stranded RNA virus which appears to be distantly related to flaviviruses. Several genotypes have been identified. Infection with this more recently identified virus is common in many countries. Hepatitis C virus is associated with chronic liver disease and also with primary liver cancer in some countries.

EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) The Epstein–Barr virus (EBV), also called human herpesvirus 4 (HHV-4), is a virus of the herpes family, double-stranded DNA virus, and is one of the most common viruses in humans. It is best known as the cause of infectious mononucleosis (glandular fever). It is also associated with particular forms of cancer, such as Hodgkin‘s lymphoma, Burkitt‘s lymphoma, nasopharyngeal carcinoma. Infection with EBV occurs by the oral transfer of saliva and genital secretions. EBV infects B cells of the immune system and epithelial cells. Once the virus‘s initial lytic infection is brought under control, EBV latently persists in the individual‘s B cells for the rest of the individual‘s life.

ROUS SARCOMA VIRUS (RSV) The RSV is an avian sarcoma leukosis virus. As soon as RSV infects a cell, its reverse transcriptase synthesizes DNA copies of its genome. These enter the nucleus of the cell and insert themselves randomly throughout the DNA of the host‘s chromosomes. Normal gene transcription within the nucleus now produces an RSV messenger RNA (mRNA) that reenters the cytoplasm. Some copies of this mRNA are then translated by the normal machinery (e.g., ribosomes) of the host cell into protein products. Other copies of the RNA become incorporated into new virus particles. The Rous sarcoma virus has only 4 genes : gag, which encodes the capsid protein; pol, which encodes the reverse transcriptase; env, which encodes the envelope protein; src, which encodes a tyrosine kinase, an enzyme that attaches phosphate

groups to Tyr residues on a variety of host cell proteins. What makes RSV oncogenic? The answer is src. The expression of this gene in some way — still only dimly understood — is able to transform cells in culture.

AKNOWLEDGMENT Financial support from the project Liga proti rakovine Praha 16002/2013-981 is highly acknowledged.

REFERENCES

1. Chen R. W., Aaltonen L. M., Vaheri A.: Reviews in Medical Virology, 15, 351 (2005). 2. Ruttkay-Nedecky B., Jimenez A. M. J., Nejdl L., Chudobova D., Gumulec J., Masarik M., Adam V., Kizek R.: International Journal of Oncology, 43, 1754 (2013).

14


Separační techniky ve výzkumu rakoviny Markéta Vaculovičová1,2, Vojtěch Adam1,2, René Kizek1,2 1

2


Separační techniky jsou pro svou účinnost a sílu nepostradatelným pomocníkem ve výzkumu rakoviny. Můžeme je využít jak pro identifikaci a analýzu rakovinných buněk, tak pro analýzu biomarkerů ale neméně důležitou roli hrají také při vývoji a charakterizaci protinádorových léčiv. V současné době se pro svou jednoduchost a rychlost využívají v oblasti separace buněk mikrofluidní zařízení umožňující efektivní dělení zdravých a rakovinných buněk, naproti tomu v identifikaci a detekci biomarkerů má nezastupitelnou úlohu hmotnostní detekce a to právě ve spojení buď s kapalinovou chromatografií, nebo s kapilární elektroforézou. Je nutné ovšem v této souvislosti vyzdvihnout význam tvorby a napojení na databázové systémy, bez jejichž využití by nebylo možné zvládat tak velké množství dat, která tyto techniky poskytují. Separační techniky hrají významnou roli v hledání nových potencionálních biomarkerů. Gelová elektroforéza je často používána pro separaci proteinů ve vzorku před vlastním stanovením pomocí hmotnostní spektrometrie (2D-PAGE/MS), čímž je identifikováno stále více proteinových biomarkerů, jako například estrogenní receptory (ER) u ER+ karcinomů prsu 1 nebo haptoglobin Hp2 u hepatocelulárních karcinomů. Jako potencionální biomarkery mohou sloužit také mnohem menší molekuly – aminokyseliny, pro jejichž studium se mohou uplatňovat metody separace pomocí kapalinových chromatografů. Jedním z nejvíce diskutovaných biomarkerů je aminokyselina sarkosin, jež se jeví jako velmi vhodný diagnostický, ale pravděpodobně i prognostický biomarker karcinomů prostaty 2. Robustní, citlivou metodou pro studium této molekuly může být iontově-výměnná chromatografie s postkolonovou derivatizací a VIS detekcí 3. Vzorky moči jsou před vlastní separací jen jednoduše odpařeny a poté resuspendovány, díky čemuž je kvantifikace sarkosinu provedena v relativně rychlém časovém sledu a bez bolestivých zásahů jako je transrektální sonografie nebo biopsie. V neposlední řadě je třeba zmínit uplatnění separačních metod ve farmaceutickém výzkumu, kde slouží nejen k identifikaci potenciálních farmaceutik využitelných pro klinickou praxi, ale také poskytují základní informace o interakcích léčiv s dalšími biologicky aktivními molekulami.

ZÁVĚR Separační metody jsou nepostradatelným nástrojem při onkologické výzkumu a jejich potenciální praktické uplatnění ještě více vzroste s rozvojem konceptu lab-on-chip.


LITERATURA

1. Heger Z., Zitka O., Krizkova S., Beklova M., Kizek R., Adam V.: Neuroendocrinology Letters, 34, 123 (2013).

2. Cernei N., Heger Z., Gumulec J., Zitka O., Masarik M., Babula P., Eckschlager T., Stiborova M., Kizek R., Adam V.: International Journal of Molecular Sciences, 14, 13893 (2013). 3. Heger Z., Cernei N., Gumulec J., Masarik M., Eckschlager T., Hrabec R., Zitka O., Adam V., Kizek R.: Oncology Reports, 31, 1846 (2014).

PAPERS

Rakovina a možnosti nanotechnologií Ondřej Zítka1,2, Vojtěch Adam1,2, René Kizek1,2 1

2


Rakovina, známá také jako maligní neoplazma, je podle patologie širokou skupinou (až 200 typů) onemocnění. Malignita se v těle může šířit skrz lymfatický oběh nebo skrz krevní řečiště. V takovém případě ale nelze mluvit o benigní neoplazmě nebo nádorech. Ty jsou zpravidla ohraničené a nemají tendenci šířit se do okolí, díky čemuž nejsou tak nebezpečné jako ty maligní. Pro rozvoje onkologického onemocněné působí nejrůznější faktory: chemické (mutageny většinou organického původu), záření (ionizující a neionizující zdroje UV, gamma paprsky), fyzikální částice (vláknité materiály, azbest, práškový Co a Ni), hormonální (obzvláště v hormon dependentních tkáních), infekční (HPV, EBV, herpesviry) dědičnost a řada dalších. Rakovina je podle WHO (World health organization) nejčastější příčina úmrtí a je zodpovědná za více jak 8 milionů úmrtí za rok. Až 30% úmrtí lze zabránit, pokud by se zlepšila například včasná diagnostika. U rakoviny jsou diskutovány dopady jak sociální tak ekonomické. V rámci výskytu tohoto onemocnění v České republice lze říci, že každý čtvrtý člověk je postižen. To znamená, že výskyt rakoviny zasahuje ze sociálního hlediska každou rodinu. Čistě negativní důsledky toto onemocnění má, pokud zasáhne manažersky vysoko postaveného pracovníka u velké firmy, nebo jsou u některých typů rakoviny rizikovou skupinou zejména lidé v produktivním věku. Na druhou stranu jsou zde ale i pozitivní ekonomické aspekty jako je vznik nových pracovních míst ve zdravotnictví, ve vědě a zejména stimulace farmaceutického průmyslu. Vývoj nových léčiv pro onkologii patří přitom ve farmacii k oblastem s nejvyšším výskytem finančních investic. Otázkou je, zda mohou nová léčiva vyvinuta na bázi nanotechnologie a bionanotechnologie již nyní konkurovat klasickým léčivům. Ruku v ruce s vývojem léčby musí ale jít i diagnostika, díky které jsou nové případy onemocnění odhalovány. V rámci konference k příležitosti World Cancer Day (WCD), zaznělo několik prezentací, které byly zaměřeny na podstatu rakoviny a jejího vzniku, a na nové diagnostické metody, které by mohli mít potenciál v personalizované medicíně. Také byla zaměřena pozornost na nové nanotechnologické materiály použitelné pro diagnostiku a také na testování nových nanokonstruktů pro cílenou léčbu.


15

16


Metalothionein jako prognostický nádorový marker Kateřina Tmejová1,2, David Hynek1,2, Vojtěch Adam1,2, René Kizek1,2 1

2


Metalothionein (MT) je nízkomolekulární na cysteiny bohatý protein, který se vyskytuje ve všech organizmech. MT ovlivňuje homeostázi iontů kovů vážících se do jeho struktury, vstupuje do oxidačně-redukční rovnováhy uvnitř buněk, působí na transport iontů kovů a reguluje expresi řady významných genů. MT je studován jako potenciální rakovinový marker (maligní nádorová onemocnění 1, rakovina prostaty 2, rakovina krku a hlavy 3, a další 4-6).

Obrázek 1: Obecné schéma funkcí metalothioneinu v organizmu

VÝSLEDKY A DISKUSE MT vyskytující se v organizmu je rozdělen do 4 skupin (I. – IV.), přičemž I. třída zahrnuje 10 isoforem (u lidí nejčastěji MT-1A, MT-2A). Isoformy MT-1 a MT-2 jsou obvykle exprimovány v lidském organismu ve velmi nízkých koncentracích. Zvýšená exprese MT v nádorových buňkách pravděpodobně souvisí s proliferací nádorových buněk, vyšší intenzitou jejich metabolismu a invazivitou nádoru 7. Diskutováno je také spojení mezi zvýšenou expresí MT, invazivitou nádoru a funkcí matrixových metaloproteinas (MMP), které jsou zinek-dependentní proteasy schopné degradovat extracelulární matrix v okolí nádoru a tím při-

spívat k jeho zrychlenému růstu a k tvorbě metastáz. Bylo dokázáno, že MT je schopen aktivovat MMP 8 a že může potlačovat imunitní odpověď v nádoru 9. U nádorového bujení má MT pravděpodobně funkci přenašeče a zásobníku zinku, který potřebují rozmnožující se buňky pro nově exprimované enzymy či pro regulační proteiny 10. Při zvýšené koncentraci apo-MT může tento protein vyvázat Zn z tumor-supresorového proteinu p53. Tím se výrazně zhoršuje schopnost navázat se na DNA a spustit signály pro apoptózu 11. Skutečnost, že MT chrání buňku proti potenciálním škodlivým látkám, může výrazně snížit efektivitu protinádorové léčby cytostatiky 12.

ZÁVĚR Na základě uveřejněných studií se zdá, že MT je vhodným markerem onkologických onemocnění a proto je vhodné se vlastnostmi, chováním a stanovením tohoto proteinu v souvislosti s rakovinou dále zabývat.


LITERATURA

1. Krizkova S., Masarik M., Majzlik P., Kukacka J., Kruseova J., Adam V., Prusa R., Eckschlager T., Stiborova M., Kizek R.: Acta Biochimica Polonica, 57, 561 (2010). 2. Masarik M., Gumulec J., Hlavna M., Sztalmachova M., Babula P., Raudenska M., Pavkova-Goldbergova M., Cernei N., Sochor J., Zitka O., Ruttkay-Nedecky B., Krizkova S., Adam V., Kizek R.: Integrative Biology, 4, 672 (2012). 3. Krejcova L., Fabrik I., Hynek D., Krizkova S., Gumulec J., Ryvolova M., Adam V., Babula P., Trnkova L., Stiborova M., Hubalek J., Masarik M., Binkova H., Eckschlager T., Kizek R.: International Journal of Electrochemical Science, 7, 1767 (2012). 4. Gumulec J., Balvan J., Sztalmachova M., Raudenska M., Dvorakova V., Knopfova L., Polanska H., Hudcova K., Ruttkay-Nedecky B., Babula P., Adam V., Kizek R., Stiborova M., Masarik M.: International journal of oncology, 44, 923 (2014). 5. Gumulec J., Raudenska M., Adam V., Kizek R., Masarik M.: Plos One, 9, (2014). 6. Ruttkay-Nedecky B., Jimenez A. M. J., Nejdl L., Chudobova D., Gumulec J., Masarik M., Adam V., Kizek R.: International journal of oncology, 43, 1754 (2013). 7. Weinlich G., Eisendle K., Hassler E., Baltaci M., Fritsch P. O., Zelger B.: British Journal of Cancer, 94, 835 (2006). 8. Haga A., Nagase H., Kito H., Sato T.: Cancer Letters, 105, 175 (1996). 9. Popiela T. J., Rudnicka-Sosin L., Dutsch-Wicherek M., Klimek M., Basta P., Galazka K., Wicherek L.: Neuroendocrinology Letters, 27, 786 (2006). 10. Theocharis S. E., Margeli A. P., Klijanienko J. T., Kouraklis G. P.: Histopathology, 45, 103 (2004). 11. Meplan C., Richard M. J., Hainaut P.: Oncogene, 19, 5227 (2000). 12. Fabrik I., Kakacka, J., Prusa, R., Eckxchlager, T., Adam, V., Kizek, R. : http://web2.stapro.cz/bullfons/22008/ labo3.pdf [online], (2008).

18


Fluorescence imaging of quantum dots

Iva Blazkova1,2, Marketa Vaculovicova1,2 , Vojtech Adam1,2, Rene Kizek1,2 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic, European Union 2 Central European Institute of Technology, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, CZ-616 00 Brno, Czech Republic, European Union 1

Quantum dots (QDs) are small semiconductor nanoparticles with excellent optical and electronic properties. QDs exhibit high quantum yield with narrow and size tunable spectra. Quantum dots can be employed in different applications and currently they are often utilized as fluorescence labels in bioassays. Quantum dots can establish a bond with specific biomolecules, like antibodies, enzymes or oligonucleotides. These enable specific targeting with a sensitive optical detection. Quantum dots show also great potential for immunosensing. Since they are more stable than organic fluorophores, their application allows multiplex immunoassays and/or fluorescence resonance energy transfer (FRET). In contrast to functionalization with ligands, bioconjugation of QDs is more complicated, restricted with a size of the molecule used for conjugation [1]. For the targeted therapy to the tumour tissue, the active targeting by receptor-specific ligands (folic acid, carbohydrates, proteins, or peptides) can is the most advantageous. The aim is the maximal cumulation in target location and reduction of the interaction with non-target biomolecules. The fast growing tumour is nourished through pathological angiogenesis. This phenomenon results in enhanced permeability and retention effect (EPR) that enables passive targeting [2]. In can be useful in accumulation of PEGylated Ag2S quantum dots in tumorous site. PEGylated Ag2S quantum dots seem to be promising fluorescence nanoprobe for in vivo imaging, due to a high accumulation in mice model. Instead of the tumor, the quantum dots were detected in reticulo-endothelial system especially in liver and spleen. Blood circulation of this complex was 3.66 hours [3]. For the better distribution, the quantum dots were coated by silica and PEGylated. Intriguingly, this coating did not provide quenching of fluorescence. After their application into the tail vein of mouse, it was possible to detect the highest concentration in the liver, low fluorescence of quantum dots was also detected in spleen and lungs [4]. For the targeted delivery of quantum dots, it is also possible to use anaerobic bacteria Bifidobacterium bifidum. It was observed, that the bacteria culture accumulate in solid tumours, the reason is probably hypoxic microenvironment of solid tumors. The vascular cut off size is between 1.2 and 2 μm, which is enough for this bacteria. Moreover; the modification with folic acid improved the tumor targeting [5].

Figure 1: Quantum dots fluorescence (various sizes - various emission maxima) in body of laboratory rat. Scans were obtained in different angles (0°, 90°, 180°, 270° and 360° respectively). For detection was employed Multimodal Animal Rotation System, Rochester, USA)

Quantum dots are nanoparticles with very good fluorescence properties and could be used in the drug distribution studies and the tumor detection and in vivo imaging.

AKNOWLEDGMENT Financial support from the project Liga proti rakovine Praha 16002/2013-981 is highly acknowledged.

REFERENCES

1. Esteve-Turrillas, F.A. and A. Abad-Fuentes, Applications of quantum dots as probes in immunosensing of smallsized analytes. Biosensors & Bioelectronics, 2013. 41: p. 12-29. 2. Li, X.H., et al., „Smart“ nanomaterials for cancer therapy. Science China-Chemistry, 2010. 53(11): p. 2241-2249. 3. Zhang, Y., et al., Biodistribution, pharmacokinetics and toxicology of Ag2S near-infrared quantum dots in mice. Biomaterials, 2013. 34(14): p. 3639-3646. 4. Kobayashi, Y., et al., In-vivo fluorescence imaging technique using colloid solution of multiple quantum dots/silica/poly(ethylene glycol) nanoparticles. Journal

of Sol-Gel Science and Technology, 2013. 66(1): p. 31-37. 5. Liu, Y., et al., Bacteria-mediated in vivo delivery of quantum dots into solid tumor. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012. 425(4): p. 769-774.

20

PAPERS

Liposomální transportéry

Jana Houbováa, Markéta Vaculovičováb, c, René Kizekb, c a b c

Gymnázium Brno-Řečkovice, Terezy Novákové 2, 621 00 Brno, Česká republika Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Liposomal transporters This review article is giving the overview on application of liposomes as carriers of compounds. The properties of liposomes are summarized and their advantages for transport are highlighted. Liposomes as drug carriers can encapsulate the substance or drug, which is then purposefully released. This is the reason why liposomes have wide range of using, because this is promising step in research, not only in medicine, but also in pharmacy, biopharmacy, biophysics and cosmetics industries. Numerous substances including various drugs, hormones and genes can be transported by liposomes. They can, due to its structure, penetrate into the deeper layers of the skin, even in some organs without damaging them (for example in the brain, which is one of the hardest transport ever). The utilization of liposomes for targeted delivery of drugs, hormones and nanoparticles is mentioned. Přijato k publikování: 18. 2. 2014 Klíčová slova: cílená doprava látek, enkapsulace léčiv, liposomy, terapie, léčiva

Úvod Během posledních desetiletí se v nanomedicíně značně rozšířil zájem o používání liposomálních přenašečů, neboť vykazují pozitivní výsledky v klinické praxi. Liposomy jsou uzavřené, sférické membránové váčky tvořeny dvěma částmi s odlišnou rozpustností (hydrofobní a hydrofilní část), cholesterolem a lipidy, nejčastěji tělu vlastním lecitinem. Mohou obsahovat i další fosfolipidy (fosfatidylglycerol a fosfatidylethanolamin). Většina klinicky schválených lipsomů má průměr 50 až 300 nm. Kromě klinicky využívaných liposomů, se využívají i další skupiny. Nejmenší liposomy, neboli malé unilamelární vesikuly (SUV), mají rozměry zhruba mezi 20 - 50 nm. O něco větší jsou pak velké unilamelární vesikuly (LUV), s průměrem přibližně 100 nm. Multilamelární vesikuly (MLV) jsou další ve skupině lipsomů. Dosahující velikosti 100 nm - 20 µm. Největšími liposomy jsou pak multivesikulární vesikuly (MVV) o velikosti 100 nm - 20µm1. Liposomy mají roli skoro ve všech biologických procesech. Fungují jako stavební částice nebo jako signální molekuly2. Ve složení liposomů hraje důležitou roli cholesterol, který má velký vliv na chování liposomů in vitro a in vivo3. Liposomy, jako transportéry léčiv, jsou schopny enkapsulovat danou látku či léčivo, které jsou následně cíleně uvolněny. Tento komplex nalézá své širší využití ve farmacii, biofarmacii a biofyzice (membránový a distribuční

model), v kosmetických a dermatologických přípravcích, ale hlavně v léčbě rakoviny, především rakoviny kůže, zhoubných novotvarů spojených s AIDS, rakoviny tlustého střeva a konečníku4. U transportérů jako jsou liposomy, nebo makromolekulární nosiče se často provádí PEGylace, což je strategie pro úspěšnější dodávku terapeutických léčiv. Jedná se o navázání polyethylenglykolu (PEG) na povrch liposomu. Takto upravený liposom vykazuje odlišnou farmakokinetiku, jako je například pomalejší eliminace z organismu. PEGylace zvyšuje velikost a molekulovou hmotnost konjugovaných biomolekul a zároveň zlepšuje jejich famakokinetiku, rozpustnost ve vodě, enzymatickou degradaci a imunogenní a antigenní reakce. PEGylace zároveň zlepšuje stabilitu, ale především permeační retenční účinek, který zlepšuje chemoterapeutický efekt a snižuje toxicitu enkapsulovaného léčiva5. Liposomální transportéry mohou transportovat obrovské množství látek nebo částic. Vzhledem k tomu, že jsou liposomy schopny zvýšit efektivitu enkapsulovaných složek tím, že zvyšují stabilitu a chemicko-fyzikální biologickou dostupnost in vitro a in vivo, získávají velkou pozornost, co se týče enkapsulace antioxidantů, enzymů, vitamínů, částic, atd. Nicméně je stále třeba neustále hledat nové způsoby, jak překonat některá omezení liposomů, jako je například přesné cílení v organizmu6.

Houbová et al.

Liposomální transportéry léčiv Liposomální nosiče jsou hojně využívané pro přepravu mnoha typů cytostatických léčiv. Příkladem může být doxorubicin, jež se jako jediný využívá v klinické praxi. Nicméně u komplexu liposomálního doxorubicinu (Obr. 1) je uvolňování cytostatika velmi pomalé, proto se hledají možnosti, jak tento proces urychlit, neboť pomalé uvolňování přímo ovlivňuje terapeutickou účinnost enkapsulovaného léčiva7.

21

toidní artritidu a jiná zánětlivá onemocnění, jako například diopatická artritida, psoriatická artritida, ankylozující spondylitida, Crohnova nemoc, zánět šlach a bursitida. Metoda má tu výhodu, že nerozvíjí alergické reakce u pacientů, zvyšuje bezpečnost a účinnost léku po enkapsulaci do transportéru a v neposlední řadě zabraňuje extravazaci léčiva ve tkáních prostřednictvím krevních cév11. Léčiva mohou být pomocí liposomů dodávána i do některých orgánů, jako jsou například plíce. Pro dodávku léčiva do plic byl povrch liposomu modifikován chitosanem (CH), xantanovou gumou (XG) a polyelektrolytem12.

Liposomální transportéry hormonů

Obr. 1: Enkapsulované cytostatikum doxorubicin v liposomálním přenašeči

Dalším typem léčiv, enkapsulovaných v liposomu, jsou polyenová antibiotika. Kromě antibiotik polyenových, lze enkapsulovat i jiná antibiotika, jako například streptomycin, tobramycin a chinolony. Pozitivní účinky polyenových antibiotik byly zaznamenány v léčbě systémové mykózy. Díky začlenění polyenových antibiotik do liposomů se zvyšuje dostupnost a účinnost, především díky „uvíznutí“ liposomů v cirkulujícím makrofágu/monocytu a dopravením tak až do místa infekce8. Mezi méně obvyklé lékové formy, patří sprej. Liposomální léčiva jsou schopna proniknout přes nosní sliznici a nabízejí zvýšenou penetraci ve srovnání s podáním léčiva ve formě suchého prášku. Popsaný liposom je složený ze sójového fosfatidylcholinu (SPC) a dimyristoyl fosfatidylglycerolu (DMPG) potaženého alginátem, chitosanem nebo trimethyl chitosanem (TMC). Takto vzniklý komplex by měl nabízet větší stabilitu při skladování, snadnější manipulaci a větší terapeutickou účinnost9. Jedinečnost liposomálních nosičů se potvrzuje i díky transportu léčiva do mozku, což představuje jeden z nejtěžších transportů, kvůli hematoencefalické bariéře (BBB), která odděluje krev z mozku a tím omezuje zavádění většiny terapeutických činidel. Liposomy mohou dodávat velké množství léčiv, neboť se na jejich povrch se může navázat velké množství ligandů10. S použitím léčiva anti interleukin - 1 (IL - 1), navázaném v liposomu, lze léčit i revma-

Do liposomálních přenašečů lze navázat i různé typy hormonů. Příkladem může být hormon inzulin transportovaný pomocí biotinylovaného liposomu (BLPs). Biotinylace (kovalentní vazba biotinu na protein) bylo dosaženo začleněním biotinu - konjugovaných fosfolipidů do liposomových membrán. Biotinylace byla dokázána na základě měření farmakologického účinku a hladiny krevního inzulinu. U BLPs byla zjištěna zvýšená buněčná absorpce a rychlá gastrointestinální doprava, což potvrzuje, že biotinylované liposomy mohou být využity jako potencionální nosič inzulinu pro orální podání13. Pektin je další látkou, kterou lze enkapsulovat do dutiny liposomu. Jedná se o lineární polysacharid kys. galakturonové, který by měl ve spojení s liposomálním transportérem vytvořit ochranný biofilm na povrchu zubů. Experiment proběhl s rozdílnými typy pektinů o různých koncentracích. Liposomy byly adsorbovány na hydroxiapatit (HA) a pomocí fosfátového pufru byla použita zubní sklovina jako adsorbční médium. V různých časových intervalech bylo zkoumáno udržení nepřetržitého toku na zubní sklovině. Závěrem je, že pektinový povlak může adsorbovat na HA nebo na zubní sklovinu. Jejich schopnost udržet se na smaltovém povrchu podporuje koncepci o využití liposomů s pektinovým obalem jako ochrannou konstrukci zubů14. Liposom může sloužit také jako transportér bombesinu. Bombesin je gastrointestinální peptid, který se tvoří v tenkém střevě a má stimulační efekt na trávicí ústrojí. Stimuluje uvolňování gastrinu z G buněk. Některé typy rakoviny (prostaty, plic, prsu, aj.) nadměrně exprimují receptory pro bombesin. Z tohoto důvodu by mohl být bombesin, enkapsulovaný v liposomu, užitečný pro identifikaci nádorů15. Další látkou, která by v budoucnu mohla zabránit rozvoji rakoviny, především rakoviny kůže,

Journal of Metallomics and Nanotechnologies 2014, 1, 7—10

22

je protizánětlivý nesteroidní lék celecoxib. Tento lék podporuje účinnost protinádorových léčiv na léčbu melanomu. Byl uzavřen do liposomu, právě kvůli jedinečným vlastnostem transportéru, jako je prostup do hlubších vrstev kůže bez jejího poškození16. Díky této vlastnosti byl například použit i analog vitamínu D - kalcipotriol, který se běžně používá k léčbě psoriázy, neboli lupénky, představující jedno z nejčastějších kožních onemocnění17. Liposomy byly také použity jako nanonosiče v případě oxidu dusnatého (NO), což je difúzní, plynný, volný radikál, spojený s řadou patologických a fyziologických procesů, jako neuronální signalizace, imunitní reakce a zánětlivé reakce. V organismu savců je NO vyroben z L-argininu na NADPH závislé reakci katalyzované enzymy z rodiny synthas oxidu dusnatého (NOS). Výkyvy v biologických systémech jsou spojeny s problémy, sahajícími až k závažným chronickým chorobným stavům. Liposomální nosiče by v tomto případě nesly rekombinantní NOS enzymy. Tento komplex slibuje v budoucnu velký potenciál v oblasti rozvoje platformy pro cílené doručení NO18.

Liposomální transportéry částic Další látky, které liposomální transportéry přenášejí, jsou částice, jakými mohou být například kvantové tečky (QDs). V případě kvantových teček bylo dosaženo kompletního zapouzdření do liposomální fosfolipidové dvojvrstvy (Obr. 2). U QDs bylo zjištěno, že efektivně působí pro zobrazovací aplikace. Tento hybridní nanosystém může být v budoucnu použit jako platforma pro synchronní terapeutické a diagnostické postupy19. Dalšími částicemi, které můžeme transportovat liposomy, jsou zlaté nanočástice různých velikostí a tvarů. V použití s biologicky rozložitelnými liposomy mají lepší schopnost degradace. Tato schopnost je nezbytná pro jejich využití ve zdravotnictví. Částice zlata jsou na začátku procesu zhruba 150-200 nm velké. Za použití infračerveného laseru s nízkým výkonem kontinuálních vln po dobu delší než 10 min, se partikule degradují do malých částic o velikosti 5 nm, které se tímto stávají kandidáty na renální clearance. Tyto částice jsou analyzovány pro jejich stabilitu, biokompatibilitu a fototepelné účinky na rakovinné buňky, které tak dokážou zničit. Dále jsou tyto materiály užitečné při zobrazování pomocí specifických NIR barviv pro vykazování multifunkčních vlastností pro rakovinnou teranostiku20.

Obr. 2: Kompletní zapouzdření kvantových teček do fosfolipidové dvojvrstvy

Závěr Liposomy jsou transportéry látek s obrovským potenciálem pro uplatnění v klinické praxi. Jejich velká enkapsulační kapacita umožňuje transport nákladu ve velkém množství a navíc fyzikálně chemické vlastnosti umožňují přenos jak hydrofilních tak hydrofobních látek čímž se ještě rozšiřuje portfolio transportovaných molekul. Autoři děkují za finanční podporu projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Kraft J. C., Freeling J. P., Wang Z. Y., Ho R. J. Y.: Journal of Pharmaceutical Sciences, 103, 29 (2014). 2. Saliba A. E., Vonkova I., Ceschia S., Findlay G. M., Maeda K., Tischer C., Deghou S., van Noort V., Bork P., Pawson T., Ellenberg J., Gavin A. C.: Nature Methods, 11, 47 (2014). 3. Nie Y., Ji L., Ding H., Xie L., Li L., He B., Wu Y., Gu Z. W.: Theranostics, 2, 1092 (2012). 4. Pottier A., Levy L., Meyre M., Germain M.: 44 5. Milla P., Dosio F., Cattel L.: Current Drug Metabolism, 13, 105 (2012). 6. Liu W. L., Ye A. Q., Liu W., Liu C. M., Singh H.: Agro Food Industry Hi-Tech, 24, 68 (2013). 7. Li L., ten Hagen T. L. M., Hossann M., Suss R., van Rhoon G. C., Eggermont A. M. M., Haemmerich D., Koning G. A.: Journal of Controlled Release, 168, 142 (2013). 8. Naik S. R., Desai S. K., Shah P. D., Wala S. M.: Recent patents on inflammation & allergy drug discovery, 7, 202 (2013). 9. Chen K. H., Di Sabatino M., Albertini B., Passerini N., Kett V. L.: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 50, 312 (2013). 10. Lai F., Fadda A. M., Sinico C.: Expert Opinion on Drug Delivery, 10, 1003 (2013).

Houbová et al.

11. Smith H. J., Smith J. R.: 8 12. Manca M. L., Manconi M., Valenti D., Lai F., Loy G., Matricardi P., Fadda A. M.: Journal of Pharmaceutical Sciences, 101, 566 (2012). 13. Zhang X. W., Qi J. P., Lu Y., He W., Li X. Y., Wu W.: Nanomedicine-Nanotechnology Biology and Medicine, 10, 167 (2014). 14. Nguyen S., Hiorth M., Rykke M., Smistad G.: European Journal of Pharmaceutical Sciences, 50, 78 (2013). 15. de Barros A. L. B., Mota L. D., Soares D. C. F., de Souza C. M., Cassali G. D., Oliveira M. C., Cardoso V. N.: Journal of Biomedical Nanotechnology, 9, 1636 (2013). 16. Bragagni M., Mennini N., Maestrelli F., Cirri M., Mura P.: Drug Delivery, 19, 354 (2012). 17. Knudsen N. O., Ronholt S., Salte R. D., Jorgensen L., Thormann T., Basse L. H., Hansen J., Frokjaer S., Foged C.: European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 81, 532 (2012). 18. Perera R. H., Peiris P. M., Peteu S. F., Bayachou M.: Electroanalysis, 24, 37 (2012). 19. Huang Z., Dong L., Chen J. J., Gao F. B., Zhang Z. P., Chen J. N., Zhang J. F.: Life Sciences, 91, 1207 (2012). 20. Rengan A. K., Jagtap M., De A., Banerjee R., Srivastava R.: Nanoscale, 6, 916 (2014).

23

24

PAPERS

Moderní zobrazovací metody

Zuzana Krátkáa, Iva Blažkováb, Markéta Vaculovičováb,c, Vojtěch Adamb,c, René Kizekb,c a b c

Gymnázium Brno-Řečkovice, Terezy Novákové 2, 621 00 Brno, Česká republika Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Modern imaging techniques Quantum dots are small semiconductor nanoparticles with great fluorescence properties including broad excitation and narrow emission spectra, high quantum yields, high photostability, possibility to be synthesize in a wide variety of colors and suitability for functionalization they are new member of a family of fluorescent labels. Due to their unique optical and electrochemical properties they have proven to be very beneficial not only for biomolecule labeling for in vitro analysis but also for in vivo applications. This review article is focused on the current imaging methods. The usage of fluorescence methods in diagnosis is discussed. This paper concerns to the fluorescence imaging and possibilities of the usage of quantum dots in in vivo imaging. Přijato k publikování: 21. 2. 2014 Klíčová slova: fluorescence; kvantové tečky; zobrazování

Úvod Diagnostika onemocnění je odjakživa nejdůležitější součástí medicíny a lékařství. Bez diagnózy jsou všechny moderní léky a léčebné postupy zbytečné. Některé nemoci nebo problémy zvládneme rozpoznat a určit například rýmu, vnější poranění nebo další. Ale biologické procesy uvnitř těla jsou hůře detekovatelné. Odjakživa se vědci zabývali tím, jak co nejméně invazivní formou nahlédnout do vnitřního fungování a uspořádání organizmu. Nejlepší metodou k poznání těla byla po smrti člověka pitva, kterou se lidé snažili objasnit a přiblížit životní funkce a udělat další krok ve svých vědomostech. Zobrazovací metody nám umožňují různými způsoby proniknout lidským tělem bez fyzického kontaktu, a tím nahlédnout do fungování těla a určení případných problémů či odchylek. K tomuto účelu se používá různých prostředků, ať už elektromagnetického záření, rentgenového záření, ultrazvukových vln a dalších. V současné době se však pozornost hodně zaměřila na výzkum fluorescenčních zobrazovacích metod. V tomto případě neslouží k zobrazování vnější činitel, ale do těla je vpravena látka s fluorescenčními vlastnostmi. Touto metodou by za pomoci vhodné povrchové funkcionalizace mohlo být umožněno například označování konkrétního objektu v těle (nádoru, orgánu či léčiva)1. Například protilátka navázaná na kvantové tečky, která zaručí dopravení k objektu, proti kterému je protilátka určena (například protilátka proti prostatickám nádorovým

buňkám)2. Mezi potencionálně prakticky využitelné se řadí vedle organických fluoroforů také kvantové tečky, které projevují výborné fluorescenční vlastnosti a jeví se pro toto využití jako velice vhodné3,4. Jsou však částečně toxické, takže jejich použití je omezeno použitím vhodné povrchové vrstvy, která eliminuje negativní toxické účinky kvantových teček na organismus 5. Kvantové tečky by mohly v budoucnu umožnit snadnou diagnostiku a tím dopomoci dalšímu významnému posunu v oblasti medicíny a lékařství.

Obecně o zobrazovacích technikách Zobrazovací techniky jsou techniky používané v biochemii a medicíně k zobrazování tkání a buněk, k jejich přiblížení, podrobnějšímu zkoumání struktury povrchu pozorovaného objektu, vnitřní anatomii, případně k určení velikosti objektu a dalších vlastností. Zobrazování objektů například v medicinském in vivo zobrazování nám pomáhá určit anatomii člověka, zaměřit určitý druh buněk v těle, určit typ buněk neznámého původu ze vzorku a tím určit druh onemocnění, případně detekovat viry, bakterie aj. Zobrazovací techniky nám zejména v medicíně pomáhají k zaměření odchylek od normálního stavu organismu, zachycení určitých problémů v organismu, k diagnostice onemocnění nebo určitých abnormalit v těle, a tím urychlit a navést k jejich vyřešení a uvedení do normálu, v případě diagnostiky nemoci například k nasazení vhodné léčby 6.

Krátká et al.

Zobrazovací techniky Mezi zobrazovací techniky patří například elektronová mikroskopie (EM), která umožňuje mnohonásobné přiblížení tkáně až na rozlišení jednotlivých buněk a jejich další anatomie. Umožňuje sledovat i objekty menší než 1 nm. Tato zobrazovací technika umožňuje například odlišení různých degradací buněk, pohyb buněk, pozorování mitochondrií, jejich uspořádání v pletivu atd 7. Elektronová mikroskopie využívá k zobrazení místo fotonů, které se používají u běžné optické mikroskopie, elektrony. Dělí se na různé typy, kterými jsou transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a skenovací elektronová mikroskopie (SEM)8. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) využívá k zobrazení vzorku procházející elektrony. Touto metodou lze sice zachytit i vnitřní sktrukturu vzorku, ale dá se použít jen pro zobrazení tenké vrstvy vzorku8. Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) využívá k zobrazování sekundární nebo zpětně odražené elektrony. Slouží k zobrazení povrchu vzorku. Elektronový svazek se pohybuje po vzorku řádek po řádku a tím vytváří obraz8. K mikroskopovému zobrazování s dostatečnou schopností zvětšení však nejsou řazeny pouze elektronové mikroskopy. Mikroskopie atomových sil (AFM) je mikroskopická technika, která slouží k 3D zobrazování. Základem je ostrý hrot, který bod po bodu zkoumá povrch vzorku, kontaktně nebo bezkontaktně za pomoci van der Waalsových sil9. Mezi techniky používané především v medicinské praxi, patří rentgenové záření a počítačová tomografie (CT). Rentgenové záření je forma elektromagnetického záření o vlnové délce 10 nanometrů až 1 pikometr. Rentgen se hojně využívá při lékařských vyšetřeních, ale je nebezpečný pro lidské tělo, jelikož se jedná o formu ionizujícího záření. Tato schopnost trvalého poškození tkáně je sice v zobrazování nežádoucí, avšak v léčbě rakoviny využitelná ve prospěch pacienta. Nádor se ozařuje rentgenovým zářením v přesně odměřených dávkách, které způsobí jeho cílené odstraňování. Rentgenové záření dobře proniká měkkými tkáněmi těla, například pokožkou a svaly. Počítačová tomografie je zobrazovací technika, která využívá rentgenového záření k vytváření trojrozměrných snímků. Používá přístroj, který má kružnicový tvar, a do jeho vnitřní části se zasune pozorovaný objekt (vetšinou jde o in vivo zobrazování – živý člověk). Kolem objektu

25

se pohybuje rentgenka, která ho z různých stran prozařuje rentgenovým zářením a za pomoci počítače se vytvoří 3D snímek. V zobrazování se dále používá ultrazvuk, který využívá zvukových vln o vysoké frekvenci. Tyto vlny neprojdou skrze celé tělo, ale odrazí se od každého objektu v jiné míře a vrací se zpět k vysílači zvuku. Pomocí počítače je z těchto signálů tvořen na obrazovce obraz 10. Další technikou je magnetická rezonance (MR), která využívá velké magnetické pole a elektromagnetické vlnění s vysokou frekvencí. Přístroj vypadá podobně jako CT, ale na rozdíl od něj nenese žádná zdravotní rizika. Tento přístroj umožňuje tvorbu snímků řezů objektem, a při vytvoření dostatečného množství snímků také 3D obraz. Nevýhodou tohoto zobrazování je však hlučnost a délka vyšetření. Díky této délce, která se pohybuje okolo 30 min, je nekvalitní zobrazení pohybujících se částí v těle (např. kličky ve střevech) 11. Pozitronová emisní tomografie (PET) je další lékařská zobrazovací metoda. Principem metody je lokalizace místa vzniku fotonů, které v těle vznikají při anihilaci pozitronů uvolněných podanou radioaktivní látkou (radiofarmakem) a elektronů. Detekce uvolněných fotonů je uspořádána tak, že je možná trojrozměrná rekonstrukce aktivity podané látky v těle. Pozitronová emisní tomografie tedy nezobrazuje ani tak anatomickou strukturu, jako spíše ochotu konkrétní tkáně vychytávat příslušné radiofarmakum12,13. Mezi další, méně rozšířené zobrazovací metody patří například optická koherentní tomografie, která je díky infračervenému záření schopná vytvořit kvalitní snímky biologické tkáně (vrstvy kůže, rohovky). Tento typ zobrazování se používá hlavně v oftalmologii 14.

Využití fluorescence k zobrazování V současné době se věnuje velká pozornost fluorescenčnímu zobrazování15. Ve fluorescenčním zobrazování je potřeba kvalitních zobrazovacích prostředků. Tyto fluorescenční značky, jiným názvem fluorofory, musí mít dobré fluorescenční vlastnosti, vysokou intenzitu fluorescence, dobře prozářit tkáň a také mít vhodnou velikost, která by měla být několikrát menší než zobrazované buňky, kvůli přesnějšímu zaměření objektu16. Toto zobrazování je sice zatím ve fázi vývoje, avšak připisuje se mu velký potenciál a do budoucna by mohlo jít o další široce využívanou lékařskou zobrazovací techniku. Což by mohlo přinést velký pokrok v oblasti diagnostiky 17. Fluorescence

26


je fyzikálně chemický děj, který je druhem luminiscence. Elektrony fluoroforů přecházejí po absorpci energie dopadajícího záření v atomovém obalu do vzdálenějších vrstev, takže energie atomu se zvyšuje. Tyto vyšší energetické stavy jsou však nestabilní a elektrony se během krátkého časového úseku vracejí do své původní pozice. Přebytečná energie je vyzářena v podobě fotonu18. Fluorescenčních značek by mohlo být využito například při detekci nádorových onemocnění. Do těla by mohly být vpraveny fluorofory s navázanou cílenou látkou (například protilátkou proti nádorovým buňkám), tato látka by umožnila navázání fluoroforu na nádor a tím jeho detekci pomocí fluorescenčních metod. Tato technika by se také dala využít k navázání fluoroforu na léčivo a ke sledování jeho transportu v lidském organismu. Při kombinací různých fluoroforů by se mohlo zobrazit současně také více druhů objektů. Tato technika by mohla neinvazně a bezpečně přesně určit polohu objektu v těle. Případně po vpravení většího množství druhů protilátek s navázanými různými fluorofory bychom mohli určit, která protilátka se navázala a tím určit například typ nádoru. Za pomoci kvalitního fluorescenčního zobrazovacího přístroje v kombinaci s rentgenem bychom pak mohli pořídit snímek organismu a přesně určit velikost a rozsah nádoru 19,20. Takovým přístrojem je například Carestream In-Vivo Xtreme Imaging System (Carestream Health, Inc., Rochester, USA), který umožňuje vytvoření rentgenového snímku, a poté také excitaci aplikovaných kvantových teček a nasledné vytvoření snímku emitovaného záření za pomoci 4 MP CCD detektoru. Tento přístroj je vybaven 400 W xenonovou zářivkou, 28 excitačními (410 nm – 760 nm) a 6 emisními filtry (535 nm – 830 nm). Rentgenový a fluorescenční záznam objektu je poté spojen v softwaru a tím lze přesně určit polohu, software mimo jiné také umožňuje intenzitu fluorescence fluoroforu, která prošla skrze tkáň.

Využití kvantových teček při fluorescenčním zobrazování Místo organických fluoroforů by mohly být použity anorganické materiály. Mezi takto využitelné materiály patří také kvantové tečky, což jsou polovodičové nanokrystaly s velikostí 1-100 nm. Kvantové tečky jsou podle výzkumů 20 krát jasnější a 100 krát fotostabilnější ve srovnání s běžnými fluorofory 16. Jejich

malá velikost je výhodná při kontaktu s buňkami. Mají velký kvantový výtěžek a emitují v celé viditelné oblasti spektra. Jedna nanočástice (kvantová tečka) může obsahovat 100 – 100 000 atomů21. Jejich emisní spektra jsou velmi úzká, ale excitovat mohou v celém spektru vlnových délek. Nejčastěji používané a studované kvantové tečky se skládají z jádra CdTe nebo CdSe. Kvantové tečky mohou mít různou velikost, což je způsobené odlišnými podmínkami při přípravě těchto látek. Kvantové tečky větší velikosti emitují záření větší vlnové délky (např. červené barvy – vlnová délka kolem 700 nm), tečky menší velikosti záření nižších vlnových délek (např. zelené, kolem 550 nm)22. Diskutovaná je otázka toxicity kvantových teček, což se jeví v biologickém a hlavně v in vivo zobrazování, jako určitá překážka. Proto se stále testují nové krycí povrchové vrstvy těchto kvantových teček, aby se zamezilo negativním účinkům na organismus na minimum 23,24. Kvantové tečky jsou pokrývány organickými molekulami a makromolekulami, aby byly schopné biokonjugace a byly rozpustné ve vodě. Tento povlak může být na bázi ligandu nebo polymeru, neutrální nebo nabitý. Ligandové povlaky jsou tvořené z malých molekul, které jsou přímo na anorganickém povrchu kvantové tečky. Nejčastějšími ligandy, které se používají k pokrývání kvantových teček, jsou kyselina merkaptopropionová a kyselina merkaptosukcinová 21. Popularita kvantových teček do značné míry těží z momentálního bouřlivého rozvoje nanotechnologií. Jako fluorescenční značky jistě přinesly některé výborné vlastnosti, například vysokou intenzitu fluorescence a možnosti odlišení kvantových teček zejména pomocí odlišných emisních vlnových délek různých druhů kvantových teček a různých absorbančních maxim, která jsou pro každý druh charakteristická. Komerční dostupnost kvantových teček je zatím poměrně omezená, a to zejména pokud je zapotřebí derivátů vhodných pro rychlé a pohodlné fluorescenční značení; v tomto aspektu zatím převládají organické fluorofory25. Kvantové tečky mají však také některé nevýhody, především velkou velikost, která je srovnatelná se zobrazovanými buňkami, ale hlavně toxicitu, která se musí eliminovat povrchovými vrstvami.

Výzkum a aplikace kvantových teček Zajímavou studii publikoval Choi a jeho kolegové, kteří zkoumali epigenomické a genotoxické chování CdTe kvantových teček v lidských buňkách karcinomu prsu. Naznačují tři úrovně buněčných změn

Krátká et al.

vyvolaných nanočásticemi: negenomické, genomické a epigenetické. Epigenetické změny mohou mít dlouhodobý vliv na genovou expresi, a to i dlouho poté, co byl odstraněn původní činitel. To by mohlo vést k dlouhodobým nežádoucím účinkům v organismu 26. Yong prokázal, že dodáním manganu ke kvantovým tečkám a jejich následnou povrchovou funkcionalizací pomocí lyzinu docílíme jejich rovnoměrnému rozptýlení ve vodném roztoku a že tyto tečky emitující v blízké infračervené oblasti, nezpůsobují při injekčním podávání žádné dlouhodobé nežádoucí účinky u myší. Tyto kvantové tečky by mohly najít v blízké budoucnosti využití v zobrazování a detekci rakovinných buněk slinivky břišní v lidském těle27. Chen a jeho kolegové sledovali životaschopnost, chování a zdraví myší, kterým byly nitrožilně aplikovány thiolem pokryté CdHgTe kvantové tečky, a to po dobu tří měsíců. Bylo zjištěno, že injekce 2 μg/g CdTeHg kvantových teček nevykazuje významnou toxicitu, a nebylo pozorováno abnormální chování myši v žádném z in vivo experimentů17. Nicméně, klíčovou otázkou stále zůstává, zdali mohou být kvantové tečky posunuty do klinické fáze výzkumu. Před jejich použitím v lidských aplikacích je potřeba ještě provést kompletní toxikologmii kvantových teček17.

Závěr Mezi moderní zobrazovací techniky se řadí rentgen, ultrazvuk, CT a další zobrazovací metody, které jsou hojně využívané v medicinské praxi. O fluorescenčním in vivo zobrazování se mluví jako o potencionální nové diagnostické technice, která by mohla být srovnatelná se současnými technikami. Kvantové tečky mají podle výzkumu skvělé vlastnosti a potencionál pro budoucí využití v praxi, především ve fluorescenčním zobrazování. Tato metoda by mohla najít uplatnění v medicíně a biochemii. Kvantové tečky mají však také některé nevýhody, především velkou velikost, která je srovnatelná se zobrazovanými buňkami, ale hlavně toxicitu, která se musí eliminovat povrchovými vrstvami. V budoucnu by se však mohlo jednat o dobrou, levnou a účinnou metodu, při které by se kvantové tečky za pomoci vhodné povrchové úpravy navázaly na potřebný objekt v organismu a následně by se detekovaly v zobrazovacím přístroji. Jedná se však zatím pouze o vizi, výzkum kvantových teček zatím nedospěl do klinické fáze výzkumu, ale jejich využití v budoucnosti je více než pravděpodobné.

27

Tato práce byla financována ze zdrojů CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Medintz I. L., Uyeda H. T., Goldman E. R., Mattoussi H.: Nature Materials, 4, 435 (2005). 2. Walling M. A., Novak J. A., Shepard J. R. E.: International Journal of Molecular Sciences, 10, 441 (2009). 3. Bruchez M., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A. P.: Science, 281, 2013 (1998). 4. Resch-Genger U., Grabolle M., Cavaliere-Jaricot S., Nitschke R., Nann T.: Nature Methods, 5, 763 (2008). 5. Drbohlavova J., Adam V., Kizek R., Hubalek J.: International Journal of Molecular Sciences, 10, 656 (2009). 6. Leblond F., Davis S. C., Valdes P. A., Pogue B. W.: Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, 98, 77 (2010). 7. Mohammadi-Gheidari A., Kruit P.: Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment, 645, 60 (2011). 8. Yoshimura N.: Historical Evolution toward Achieving Ultrahigh Vacuum in Jeol Electron Microscopes, 1 (2014). 9. de Pablo P. J.: Single Molecule Analysis: Methods and Protocols, 783, 197 (2011). 10. Hughes J., Velká všeobecná encyklopedie, Svojtka & Co., s.r.o., 2002. 11. Seidl Z. V. M., Magnetická rezonance hlavy, mozku a páteře, 2006. 12. Ter-Pogossian M. M., Phelps M. E., Hoffman E. J., Mullani N. A., Positron-emission transaxial tomograph for nuclear imaging (PETT), 1975. 13. Phelps M. E., Hoffman E. J., Mullani N. A., Ter-Pogossian M. M.: Journal of Nuclear Medicine, 16, 210 (1975). 14. Fercher A. F., Mengedoht K., Werner W.: Optics Letters, 13, 186 (1988). 15. Ntziachristos V., Bremer C., Weissleder R.: European Radiology, 13, 195 (2003). 16. Tan W. H., Wang K. M., He X. X., Zhao X. J., Drake T., Wang L., Bagwe R. P.: Medicinal Research Reviews, 24, 621 (2004). 17. Chen H., Wang Y., Xu J., Ji J., Zhang J., Hu Y., Gu Y.: Journal of Fluorescence, 18, 801 (2008). 18. Fišar Z.: Multimediální podpora výuky klinických a zdravotnických oborů :: Portál 1. lékařské fakulty Karlovy Univerzity v Praze [online], (2012). 19. Gao J. H., Chen K., Xie R. G., Xie J., Yan Y. J., Cheng Z., Peng X. G., Chen X. Y.: Bioconjugate Chemistry, 21, 604 (2010). 20. Ghaderi S., Ramesh B., Seifalian A. M.: Journal of Drug Targeting, 19, 475 (2011). 21. Algar W. R., Tavares A. J., Krull U. J.: Analytica Chimica Acta, 673, 1 (2010). 22. Hoshino A., Hanada S., Yamamoto K.: Archives of Toxicology, 85, 707 (2011). 23. Mohs A. M., Duan H., Kairdolf B. A., Smith A. M., Nie S.: Nano Research, 2, 500 (2009). 24. Smith A. M., Duan H., Mohs A. M., Nie S.: Advanced Drug Delivery Reviews, 60, 1226 (2008). 25. Hlavacek A., Skladal P.: Chemicke Listy, 105, 611 (2011). 26. Choi A. O., Brown S. E., Szyf M., Maysinger D.: Journal of Molecular Medicine-Jmm, 86, 291 (2008). 27. Yong K.-T.: Nanotechnology, 20, (2009).

28

PAPERS

Apoferritin: nanotransportér pro cílené dopravování léčiv Dita Münzováa, Simona Dostálováb, c, Markéta Vaculovičovác,d, René Kizekc,d a b

c d

Gymnázium Brno-Řečkovice, Terezy Novákové 2, 621 00 Brno, Česká republika Ústav biomedicínského inženýrství, Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, Vysoké učení technické v Brně, Antonínská 1, 602 00 Brno, Česká republika Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Apoferritin: nanocarrier for targeted drug delivery Routine cancer treatment often causes damage to whole human organism, because cytostatic drugs, which are used during the treatment and whose function is to stop growth of cancer cells, affect also healthy cells and untargeted tissues. Due to this fact, nanocarriers and targeted drug delivery have been recently studied. Side effects and organ damage can be reduced by using nanocarriers and targeted drug delivery. The aim of this assay was to monitor and characterize apoferritin as a nanocarrier for targeted drug delivery. In this work the surface of nanocarrier composed of apoferritin with encapsulated doxorubicin was modified with gold nanoparticles or chloroauric acid, conjugated with linker (HWR peptide) because of correct binding of the antibody and labeled with specific antibody. In this assay the resulting nanocarrier was studied with gel electrophoresis and fluorescent methods. Přijato k publikování: 21. 2. 2014 Klíčová slova: apoferritin; cílené dopravování léčiv; doxorubicin; nanomedicína; nanotransportér; teranostika

Úvod Rakovina je skupina nádorových onemocnění při kterých dochází k nekontrolovatelnému růstu a množení buněk, které ztrácí schopnost apoptózy1. Aktuálně používané metody léčby, jako je chemoterapie, radioterapie nebo chirurgická léčba, nejsou dostačující co se týče efektivnosti a počtu vyléčených pacientů 2. To je zapříčiněno i používáním cytostatických léčiv, které zastavují růst buněk, a to jak rakovinných, tak i zdravých, což způsobuje mnoho vedlejších účinků doprovázejících léčbu 3. Mezi nejčastěji používaná cytostatická léčiva patří anthracyklinové antibiotikum doxorubicin, poškozující myokard, čímž zhoršuje srdeční činnost3. Z těchto důvodů se v poslední době přikládá velká pozornost studiu nanotransportérů a cílenému dopravování léčiv 4. Jako nanotransportéry mohou být použity zlaté nanočástice 5, lipozomy6,7, kvantové tečky8 nebo proteiny, jako je apoferritin. Cílené dopravování léčiv pomocí nanotransportérů je založeno na enkapsulaci cytostatického léčiva do dutiny nanotransportéru nebo navázání léčiva na jeho povrch9. Povrch nanotransportéru může být následně modifikován specifickým druhem protilátky, díky které se nanotransportéry dostanou na místo urče-

ní, kde je po změně podmínek (změna pH, teploty) léčivo uvolněno 3. Tím dochází ke snížení vedlejších účinků a působení léčiva pouze na nádorové buňky. Kromě cíleného dopravování léčiv vznikají další nové možnosti aplikací nanočástic jako použití při diagnostickém zobrazování 10,11. Kombinace diagnostického zobrazování a cíleného transportu formuje nový, perspektivní obor nanomedicíny 4 , teranostiku 12,13. Při pouhé modifikaci povrchu nanotransportéru protilátkami vzniká stericky nejednoznačný komplex, tudíž není zajištěno, že cílící protilátka bude navázána přes Fc region a její aktivní část správně geometricky orientována k vnějším antigenům. Z tohoto důvodu se tato práce zabývá modifikací povrchu a navázáním různých komponent na nanotransportér, prokázáním jejich vazby a důkazem selektivního cílení navrženého nanotrasportéru na nádorové buňky. Základem navrženého nanotransportéru byl protein apoferritin s enkapsulovaným anthracyklinovým antibiotikem doxorubicinem, který byl do apoferritinu uzavřen na základě změny pH. Další složkou nanotransportéru byly zlaté nanočástice, HWR peptid a specifická cílící protilátka. HWR peptid (HWRGWVC) byl vyroben v naší laboratoři a je odvozen

Münzová et al.

od proteinu G, který má schopnost vázat protilátky prostřednictvím interakce s Fc regionem, což zaručuje správnou orientaci protilátky k vnějším antigenům14.

Experimentální část Chemikálie Všechny použité chemikálie v ACS čistotě byly dodány firmou Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), pokud není uvedeno jinak. Doxorubicin hydrochlorid byl pořízen v HPLC kvalitě od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Enkapsulace doxorubicinu do apoferritinu 200 µl doxorubicinu (DOX) o koncentraci 1 mg/ml bylo přidáno k 20 µl apoferritinu (APO) z koňské sleziny o koncentraci 50 mg/ml a ke 100 µl vody. Dále bylo přidáno 2,5 µl 1M kyseliny chlorovodíkové, za účelem snížení pH a otevření APO. Následně byl roztok míchán po dobu 15 minut. Posléze bylo přidáno 2,5 µl hydroxidu sodného k opětovnému zvýšení pH a enkapsulaci DOX do dutiny APO (vznik komplexu APODOX). Směs byla ponechána po dobu 15 minut při teplotě 20 °C a pak dvakrát promyta vodou přes kolonky Amicon® Ultra -0.5 ml 3K (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). Modifikace APODOX zlatem Povrch komplexu APODOX byl modifikován zlatými nanočásticemi. Příprava zlatých nanočástic probíhala podle následujícího postupu: 0,25 ml citronanu sodného o koncentraci 26,5 g/l bylo smícháno s 10 ml 1 mM kyseliny tetrachlorozlatité a třepáno po dobu 1 hodiny při teplotě 20 °C. Průměrná výsledná velikost vzniklých zlatých nanočástic byla 1,4 nm, což bylo změřeno na přístroji Zetasizer Nano Z (Malvern, Anglie). K APODOX bylo přidáno 25 µl 1mM zlatých nanočástic (následováno 3 mg NaBH4 a pozorován vývoj vodíku) a tato směs byla třepána na přístroji Orbital Shaker (Biosan, Riga, Lo) při teplotě 20 °C po dobu 12 hodin. Výsledný produkt byl šestkrát promyt vodou přes kolonky Amicon® Ultra -0.5 ml 3K (Merck Millipore, Billerica, MA, USA). ELISA Mikrotitrační destička MaxiSorp Nunclon byla pokryta kozími anti-IgG protilátkami, slepičími IgY protilátkami a lidskými IgG protilátkami, které byly naředěny uhličitanovým pufrem na koncentraci 2 µg/ml, v objemu 50 µl na jamku. Následně byla

29

mikrotitrační destička zakryta fólií a umístěna do 37 °C po dobu 2 hodin pro navázání protilátek na povrch jamky. Po uplynutí 2 hodin byly přebytečné molekuly z každé jamky odsáty a bylo přidáno 50 µl 1 % BSA (hovězí sérový albumin) v PBS (fosfátový pufr) pro zablokování povrchu jamek. Blokace probíhala 1 hodinu při teplotě 37 °C. Po zablokování povrchu byly jamky promyty 50 µl PBS-T. Ve zkumavkách byly konjugovány APODOX a APODOX modifikovaný zlatými nanočásticemi (APODOX-Nano) a kyselinou tetrachlorozlatitou (HAu) s HWR peptidem. Objem vzorku byl vždy 250 µl, 125 µl APODOX a 125 µl HWR peptidu o koncetraci 5 µg/ml. Následovala inkubace po dobu 1 hodiny při 20 nebo 45 °C a třepání 400 rpm. Po inkubaci byly vzorky dialyzovány podle návodu výrobce přes Amicon® Ultra -0.5 ml 3K při teplotě 20 °C, po dobu 15 minut a 6000 rpm. Filtrát byl doplněn do objemu 250 µl a změřeno absorpční spektrum 230 až 600 nm na UV transparentní destičce v Tecan Infinite 200 PRO (Tecan, Švýcarsko). Objem vzorků byl doplněn na 250 µl a bylo změřeno emisní spektrum při excitaci 480 mn a emisi 515 – 850 nm v Tecan Infinite 200 PRO (Tecan, Švýcarsko). Ke vzorkům bylo přidáno 0,5 µl IgG o koncentraci 14 µg/ml. Dále byly vzorky umístěny na rotátor Multi RS-60 (Biosan, Lotyšsko) po dobu 1 hodiny při teplotě 20 °C a třepání 600 rpm. Po uplynutí 1 hodiny bylo vždy 50 µl vzorku napipetováno do MaxiSorp Nunclon mikrotitrační destičky s navázanými protilátkami. Následně proběhla inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C a po jejím uplynutí bylo změřeno emisní spektrum při excitaci 480 mn a emisi 515 – 850 nm v Tecan Infinite 200 PRO (Tecan, Švýcarsko). Po změření emisního spektra byly vzorky promyty 50 µl PBS a opět změřeny. Nakonec byly přidány 2 µl 1M HCl, aby došlo ke snížení pH a otevření APODOX, a znovu změřeno emisní spektrum.

Výsledky a diskuse Modifikace povrchu zlatými nanočásticemi Povrch nanotransportéru byl modifikován zlatými nanočásticemi, z toho důvodu že zlato má vysokou afinitu k SH skupinám cysteinu na konci HWR peptidu (Obr. 1), který byl další komponentou ve struktuře nanotransportéru.


30

Obr. 1: Afinita zlata k SH skupinám cysteinu

V tomto experimentu byl sledován vliv modifikace zlatými nanočásticemi na množství navázaného nanotransportéru na povrch jamky pokryté protilátkami proti cílící protilátce na povrchu nanotransportéru. Byla použita metoda na způsob ELISA testu, kdy bylo dno mikrotitrační destičky pokryto kozími anti-lidskými-IgG protilátkami a následně nanesen nanotransportér s lidskými IgG protilátkami a proběhla inkubace. Byly zkoumány dva druhy APODOX, a to APODOX bez zlatých nanočástic s HWR peptidem a cílící protilátkou a APODOX se zlatými nanočásticemi, HWR peptidem a cílící protilátkou.

konci své struktury má schopnost vázat všechny podtřídy HIgG a hovězí, myší, kozí a králičí IgG prostřednictvím interakce s jejich Fc regionem. V tomto experimentu byl sledován vliv použití HWR peptidu na množství navázaného nanotransportéru na povrch jamky. Opět byla použita metoda na způsob ELISA testu. Byly porovnávány dva vzorky APODOX, z nichž jeden ve své struktuře obsahoval HWR peptid, přičemž ostatní komponenty zůstaly nezměněny (zlaté nanočástice, cílící protilátka). Dalším zkoumaným parametrem byla teplota, při které HWR peptid interagoval se zlatými nanočásticemi, a to buď při 20 °C, nebo 45 °C. Následně bylo provedeno fluorescenční měření.

Obr. 3: Vliv použití HWR peptidu

Obr. 2 ukazuje, že v případě APODOX se zlatými nanočásticemi byl zaznamenán vyšší fluorescenční signál než u samotného APODOX. To je důkazem toho že díky zlatým nanočásticím došlo k navázání HWR peptidu a z toho důvodu mohlo dojít k navázání většího množství správně orientované cílící protilátky a zároveň celkově většího množství nanotransportéru na kozí anti-lidské-IgG protilátky na dně jamky.

Obr. 3 ukazuje, že v případě APODOX s HWR peptidem byl zaznamenán vyšší signál než u APODOX bez HWR peptidu, což je důkazem toho, že díky HWR peptidu, byla navázána správně orientovaná cílící protilátka, která zapříčinila větší množství navázaného nanotransporétru na povrch jamky. Bez použití HWR peptidu nedošlo k vazbě protilátky přes Fc region, tudíž nebyla správně orientována aktivním místem k vnějším antigenům, v tomto případě je tedy zaznamenán nejnižší signál. U samotného APODOX bez modifikace zlatými nanočásticemi nebyla žádná změna signálu zaznamenána v závislosti na přítomnost HWR peptidu, znamená to, že nezáleží na použití dalších komponent v případě, že povrch není modifikován zlatými nanočásticemi. Na základě získaných výsledků je optimální teplota inkubace HWR peptidu se zlatými nanočásticemi je 45 °C. Tento experiment dokazuje, že HWR peptid příznivě ovlivňuje geometrii celého komplexu.

Vliv použití HWR peptidu Další navázanou komponentou na nanotransportér byl HWR peptid, který díky histidinu na aminovém

Vliv přítomnosti IgG protilátky Další komponentou, která byla součástí nanotransportéru byla lidská IgG protilátka, jejímž prostřed-

Obr. 2: Vliv modifikace zlatými nanočásticemi

Münzová et al.

nictvím došlo k navázání z vnější na antigen. Tento experiment byl zaměřen na sledování množství navázaného nanotransportéru v závislosti na použití IgG protilátky. Byl proveden opět metodou na způsob ELISA testu, stejně jako předchozí experimenty.

31

Obr. 5 ukazuje, že v případě APODOX modifikovaného zlatými nanočásticemi došlo po zvýšení koncentrace anti-IgG protilátky k navýšení signálu, zatímco signál u samotného APODOX zůstal stejný. Na samotný APODOX nemá koncentrace protilátek žádný vliv. To, že signál APODOX modifikovaného zlatými nanočásticemi po navýšení koncentrace protilátek vzrostl, ukazuje na specificitu vazby protilátek, pokud je IgG protilátka na povrchu nanotransportéru vhodně geometricky orientována svým aktivním místem k vnějším antigenům (anti-IgG protilátka).

Závěr Obr. 4: Vliv použití IgG protilátky

Obr. 4 ukazuje, že v případě APODOX modifikovaného zlatými nanočásticemi byl po interakci s lidskou IgG protilátkou zaznamenán vyšší signál, zatímco u samotného APODOX bez zlatých nanočástic nedošlo k žádné změně. Tento experiment dokazuje specificitu APODOX modifikovaného zlatými nanočásticemi. Vliv koncentrace antigenu V následujícím experimentu byl sledován vliv koncentrace kozích anti-IgG protilátky na povrchu jamky na množství navázaného nanotransportéru. Byla použita metoda na způsob ELISA testu, stejně jako u předchozích experimentů. Byl sledován APODOX a APODOX se zlatými nanočásticemi, na které byly vždy navázány HWR peptid a lidské IgG protilátky. Kozí anti-lidské-IgG protilátky o koncentracích 0,5 µg/ml a 2 µg/ml byly použity pro modifikaci povrchu jamky.

Obr. 5: Vliv koncentrace anti-IgG protilátky

Provedenými experimenty bylo potvrzeno navázání všech komponent na nanotransportér a také získán důkaz o nutnosti přítomnosti všech komponent nanotransportéru. Vytvořený nanotransportér je schopen selektivně cílit libovolné buňky, jejichž typ je závislý pouze na použitém druhu protilátky proti povrchovým antigenům daného typu buněk. Tato práce byla financována ze zdrojů CYTORES GA ČR P301/10/0356.

Literatura

1. Ferrari M.: Nature Reviews Cancer, 5, 161 (2005). 2. Chomoucka J., Drbohlavova J., Huska D., Adam V., Kizek R., Hubalek J.: Pharmacological Research, 62, 144 (2010). 3. Drbohlavova J., Chomoucka J., Adam V., Ryvolova M., Eckschlager T., Hubalek J., Kizek R.: Current Drug Metabolism, 14, 547 (2013). 4. Kawasaki E. S., Player A.: Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 1, 101 (2005). 5. Patra C. R., Bhattacharya R., Mukhopadhyay D., Mukherjee P.: Advanced Drug Delivery Reviews, 62, 346 (2010). 6. Hu Y. R., Li K., Wang L., Yin S. S., Zhang Z. Z., Zhang Y.: Journal of Controlled Release, 144, 75 (2010). 7. Malam Y., Loizidou M., Seifalian A. M.: Trends in Pharmacological Sciences, 30, 592 (2009). 8. Marchal F., Pic E., Pons T., Dubertret B., Bolotine L., Guillemin F.: Bulletin Du Cancer, 95, 1149 (2008). 9. Mishra B., Patel B. B., Tiwari S.: NanomedicineNanotechnology Biology and Medicine, 6, 9 (2010). 10. Gu F. X., Karnik R., Wang A. Z., Alexis F., LevyNissenbaum E., Hong S., Langer R. S., Farokhzad O. C.: Nano Today, 2, 14 (2007). 11. Wang J. Q., Sui M. H., Fan W. M.: Current Drug Metabolism, 11, 129 (2010). 12. Sumer B., Gao J. M.: Nanomedicine, 3, 137 (2008). 13. Svenson S.: Molecular Pharmaceutics, 10, 848 (2013). 14. Janu L., Stanisavljevic M., Krizkova S., Sobrova P., Vaculovicova M., Kizek R., Adam V.: Electrophoresis, 34, 2725 (2013).

32

PAPERS

Miniaturizované detekční systémy a jejich aplikace

Lukáš Zimaa, Lukáš Nejdlb, Branislav Ruttkay-Nedeckýb,c, Vojtěch Adamb,c, René Kizekb,c a b c

Střední průmyslová škola chemická, Brno, Vranovská 65, Česká republika Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Applications of micro-flow systems Currently, robots are mostly used in industry (production lines and machining centers), where allow high productivity and accuracy of work that human is not able to achieve. One of the many areas of operation of remote robotic systems are places for human risky or inaccessible. For this reason, there is a robotic device capable of analyzing samples in the location of their occurrence, and sending the obtanined data. Thanks to the development of these technologies environmental problems without risk to humans may be solved. The knowledge acquired from the application of these technologies can be further used in space research. In this review, we deal with microflow systems that are used for a wide range of applications, which are summarized in this work. Přijato k publikování: 10. 3. 2014 Klíčová slova: automatizace; dálkově řízená analýza; lab-on-a-chip; mikroprůtokové systémy; robot

Úvod V roce 1920 poprvé použil slovo robot ve spojení s neživou bytostí český spisovatel Karel Čapek ve svém vědeckofantastickém dramatu R.U.R (Rossumovi univerzální roboti)1. Od této chvíle se toto označení začalo používat pro stroj pracující s určitou mírou samostatnosti. První patent týkající se robotiky podal v roce 1954 George Devol. Jeho společnost Unimation poprvé vyrobila průmyslového robota, který byl zaveden do průmyslové výroby v roce 19612. První mobilní roboti se začaly objevovat v 70. letech 20. století3. Díky objevu polarografie, za kterou dostal Jaroslav Heyrovský v roce 1959 Nobelovu cenu, se od 30. let 20. století začaly rozvíjet polarografické metody4. Vynález polarografie vytvořil základ pro vývoj nových elektrochemických metod, které jsou využívány spolu s Lab-on-a-chip systémy. S rozvojem počítačových technologií byly polarografické metody automatizovány 5. Dalším krokem pro vývoj dálkových robotických systémů ( Lab-on-a-robot) byla miniaturizace zavedených metod a mikrofluidika s biosenzory. Elektrochemické biosenzory mají široké spektrum uplatnění. Uplatňují se například v potravinářském a farmaceutickém průmyslu, ve veterinární medicíně nebo v životním prostředí. Pomocí biosenzorů lze stanovit anorganické6 i organické látky 7 nebo alkoholy 8. Kromě elektrochemických biosenzorů existují biosenzory optické, jejichž principem je interakce světelného záření s chemickými látkami9. Dalším

typem jsou kalorimetrické senzory, využívající změnu teploty v průběhu enzymatických reakcí10. Současná třetí generace robotů je schopna pracovat v extrémních podmínkách (v mořských hlubinách, sopkách a vesmíru). Důraz je kladen především na efektivní komunikaci a dálkové ovládání, díky kterému provádí operátor kontrolu nad robotem v reálném čase. V současné době je značný zájem o výzkum planet, zejména Marsu, a proto jsou neustále vyvíjeny nové efektivnější miniaturizované analytické nástroje.

Mikroprůtokové systémy Vývoj v oblasti materiálů, detekčních systémů a separačních metod umožnil výrobu miniaturizovaných mikroprůtokových analytických systémů11-13. První miniaturizovaný plynový chromatograf s tepelně vodivostním detektorem (TCD) byl sestrojen v roce 1979 na Stanfordské univerzitě14. Během posledních dvou desetiletí došlo k rozvoji systémů označovaných jako „lab on a chip“ (LOC) nebo „micro total analysis systems“ (MTAS)15. Tyto analytické nástroje jsou schopny provádět všechny kroky nutné k analýze vzorku. Především se jedná o předpřípravu analytu, rozvod reagencií, míchání, separaci a detekci analytu16. Nejrozšířenější metodou pro separaci vzorků v čipu je kapilární elektroforéza (CE)17,18. CE čip může být připojen k celé řadě detekčních systémů19. Mezi nejpoužívanější patří elektrochemické detektory (ECD) založené na měření vodivosti20, nebo rovno-

Zima et al.

vážného napětí (potenciometrie)21. Další možností jsou detektory založené na Ramanově rozptylu22,23, UV/vis spektrofotometrii24,25, nebo nukleární magnetické rezonanci26. ECD detektory bývají upřednostňovány před ostatními 13,27, protože dokáží analyzovat zakalený vzorek 28, mají nízké energetické nároky28, mohou být variabilně modifikovány pro docílení větší selektivity a senzitivity 29. Mezi hlavní výhody mikroprůtokových čipů patří systémové integrace, mobilita, rychlost analýz, nízká spotřeba vzorku, reagencií, možnost zapojení do paralelního systému (multiplexování) a kontrola reakčních podmínek16. Detekční možnosti mikroprůtokových zařízení jsou srovnatelné s těmi, které najdeme u běžně používaných laboratorních přístrojů14. V dnešní době mají LOC využití ve farmaceutických, biochemických a vojenských analýzách 14. Díky jejich nízké hmotnosti a malé velikosti je možné provádět point-of-care testování, to znamená provádět klinické aplikace (diagnostické testy) přímo u pacienta nebo všude tam, kde je nedostatek technické infrastruktury. Další možností může být implementovat LOC na mobilní dálkově řízenou platformu (lab on a robot) 30-32.

Robotické mobilní platformy Spirit a Opportunity Spirit spolu s Opportunity byla vesmírná vozítka účastnící se mise Mars Exploration Rover. Spirit přistál na povrchu Marsu 4. ledna 2004, Opportunity 25. ledna 2004. Jako přistávací plocha pro Spirit byl vybrán kráter Gusev. Obě sondy se skládají z pohyblivého vozítka, plošiny pro měkké přistání, tepelného štítu, přeletového meziplanetárního stupně a z pohonných látek. Hlavním úkolem robotických vozítek bylo hledat kameny a půdu, v nichž by se našly důkazy o přítomnosti vody v minulosti na Marsu. Během mise bylo pořízeno více jak tisíc fotografií povrchu Marsu. K pořizování fotografií byla vozítka vybavena panoramatickou kamerou, která umožňovala stereoskopické snímkování terénu. Pro svá měření používaly miniaturní spektrometr tepelných emisí, který zkoumá nerosty pomocí jejich tepelného vyzařování, Mössbauerův spektrometr pro hledání sloučenin železa, spektrometr rentgenového a alfa záření, mikroskopický zobrazovač pro detailní snímky hornin a brusku pro očištění a obroušení zkoumaných kamenů. 5. března 2004 našel Spirit první náznaky vody v kameni „Humphrey“. Kámen byl zformován z magmatu. Životnost obou vozítek

33

byla odhadována na 90 marsovských dní 33, 34. Robotické vozítko Spirit vydrželo v provozu přes šest let. Poslední zprávu vyslalo 22. 3. 2010. Robotické vozítko Opportunity je stále v provozu. Phoenix Phoenix je prvním mobilním robotickým vozítkem, patřící do třídy Scout, vyslaným organizací NASA na Mars. Mise začala 25. května 2008 a trvala celkem 5 měsíců35. Hlavním úkolem Phoenixe bylo prozkoumat terén planety a hledat známky vody v půdních sedimentech. Phoenix byl vybaven robotickým ramenem z hliníku a titanu. Rameno obsahovalo lopatku s čepelí pro kopání do půdy a motorovou škrabku pro rozbíjení zmrzlé půdy 36. Během zkoumání terénu prováděl Phoenix vizuální analýzu a sběr vzorků půdy, kde sledoval především vodu a sloučeniny obsahující uhlík. Analýzy byly prováděny pomocí mikroskopického, elektrochemického a vodivostního analyzátoru (MECA). MECA se skládá ze čtyř analytických částí „wet chemistry lab“ (WCL)37, optického spektrometru a z tepelné a elektrické sondy 38. WLC je určena ke stanovení kationtů (Cd 2+), aniontů (NO3-) a rozpuštěných plynů (O2 a CO2)39. Chemická analýza probíhá v uzavřené zásuvce uvnitř robotického vozítka. Uvnitř vozítka je vodní nádrž napojená na celu. Voda v nádrži se zahřeje na vysokou teplotu a je odváděna do měřící cely vybavené elektroche -mickými analyzátory. Celá analýza probíhá při teplotě 20 ± 0,5 °C 39. Důkazy o výskytu MgCO3 a FeCO3 byly nalezeny v atmosférickém prachu40 a na povrchu skal 41. Curiosity Robotické vozítko Curiosity přistálo na povrchu Marsu v srpnu 2012 42. Životnost Curiosity je odhadována na 23 měsíců. Curiosity bylo speciálně sestaveno pro posouzení obyvatelnosti Marsu. Mobilní laboratoř obsahuje hmotnostní spektrometr, který umožňuje vyhledávat organický uhlík v půdě42. Curiosity dále obsahuje analytickou laboratoř CheMin (Chemistry and Mineralogy). CheMin se skládá z rentgenového difraktoru (XRD) a rentgenového fluorescenčního přístroje (XRF). CheMin obdrží půdní vzorky z MSL Sample Acquisition/Sample Processing and Handling (SA/SPaH) systému a zpracuje je pomocí rentgenových spektroskopických metod pro stanovení minerálního složení půdy 43.


34

Závěr V práci je popsán vývoj miniaturizovaných mikroprůtokových čipů (lab-on-a-chip, „micro total analysis systems“) a jejich univerzální využití v širokém spektru aplikací jako jsou point-of-care aplikace a robotické dálkové systémy. Vzhledem k tomu, že se moderní technologie stávají dostupnější, jsou vyvíjeny nové robotické systémy 31,44-49. Autoři děkují za finanční podporu projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Kinyon K.: Science-Fiction Studies, 26, 379 (1999). 2. Ballard L. A., Sabanovic S., Kaur J., Milojevic S.: Ieee Robotics & Automation Magazine, 19, 114 (2012). 3. Raphael B.: Computers and People, 25, 7 (1976). 4. Heyrovsky J.: Nature, 176, 865 (1955). 5. Pizeta I., Branica M.: Journal of Electroanalytical Chemistry, 250, 293 (1988). 6. Evtyugin G. A., Stoikov, II, Budnikov G. K., Stoikova E. E.: Journal of Analytical Chemistry, 58, 1151 (2003). 7. Garcia C. A. B., Neto G. D., Kubota L. T.: Analytica Chimica Acta, 374, 201 (1998). 8. Reshetilov A. N., Lobanov A. V., Morozova N. O., Gordon S. H., Greene R. V., Leathers T. D.: Biosensors & Bioelectronics, 13, 787 (1998). 9. Kuznetsov V. V., Sheremet’ev S. V.: Journal of Analytical Chemistry, 62, 270 (2007). 10. Danielsson B.: Journal of Biotechnology, 15, 187 (1990). 11. Mora M. F., Garcia C. D.: Electrophoresis, 28, 1197 (2007). 12. Mora M. F., Giacomelli C. E., Garcia C. D.: Analytical Chemistry, 79, 6675 (2007). 13. Wang J.: Electroanalysis, 17, 1133 (2005). 14. Nugen S. R., Asiello P. J., Connelly J. T., Baeumner A. J.: Biosensors & Bioelectronics, 24, 2428 (2009). 15. Arora A., Simone G., Salieb-Beugelaar G. B., Kim J. T., Manz A.: Analytical Chemistry, 82, 4830 (2010). 16. Mirasoli M., Guardigli M., Michelini E., Roda A.: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 87, 36 (2014). 17. Dittrich P. S., Tachikawa K., Manz A.: Analytical Chemistry, 78, 3887 (2006). 18. Auroux P. A., Iossifidis D., Reyes D. R., Manz A.: Analytical Chemistry, 74, 2637 (2002). 19. Uchiyama K., Nakajima H., Hobo T.: Analytical and Bioanalytical Chemistry, 379, 375 (2004). 20. Chai C. Y., Liu G. Y., Li F., Liu X. F., Yao B., Wang L.: Analytica Chimica Acta, 675, 185 (2010). 21. Yunus S., Attout A., Vanlancker G., Bertrand P., Ruth N., Galleni M.: Sensors and Actuators B-Chemical, 156, 35 (2011). 22. Quang L. X., Lim C., Seong G. H., Choo J., Do K. J., Yoo S. K.: Lab on a Chip, 8, 2214 (2008). 23. Guzman E., Baeten V., Pierna J. A. F., Garcia-Mesa J. A.: Talanta, 93, 94 (2012). 24. Salmeron J. F., Gomez-Robledo L., Carvajal M. A., Huertas R., Moyano M. J., Gordillo B., Palma A. J., Heredia F. J., Melgosa M.: Journal of Food Engineering, 111, 247 (2012).

25. de Vargas-Sansalvador I. M. P., Fay C., Phelan T., Fernandez-Ramos M. D., Capitan-Vallvey L. F., Diamond D., Benito-Lopez F.: Analytica Chimica Acta, 699, 216 (2011). 26. Perlo J., Demas V., Casanova F., Meriles C. A., Reimer J., Pines A., Blumich B.: Science, 308, 1279 (2005). 27. Vandaveer W. R., Pasas-Farmer S. A., Fischer D. J., Frankenfeld C. N., Lunte S. M.: Electrophoresis, 25, 3528 (2004). 28. An H. J., Liu Q. D., Ji Q. L., Jin B.: Biochemical and Biophysical Research Communications, 393, 571 (2010). 29. Garcia C. D., Henry C. S.: Electroanalysis, 17, 223 (2005). 30. Garcia C. D., Henry C. S.: Electroanalysis, 17, 1125 (2005). 31. Lamberti F., Sanna A., Paravati G., Montuschi P., Gatteschi V., Demartini C.: International Journal of Advanced Robotic Systems, 10, (2013). 32. Berg C., Valdez D. C., Bergeron P., Mora M. F., Garcia C. D., Ayon A.: Electrophoresis, 29, 4914 (2008). 33. Allison M.: Geophysical Research Letters, 24, 1967 (1997). 34. Kochan A.: Industrial Robot-an International Journal, 31, 392 (2004). 35. Smith P. H., Tamppari L. K., Arvidson R. E., Bass D., Blaney D., Boynton W. V., Carswell A., Catling D. C., Clark B. C., Duck T., DeJong E., Fisher D., Goetz W., Gunnlaugsson H. P., Hecht M. H., Hipkin V., Hoffman J., Hviid S. F., Keller H. U., Kounaves S. P., Lange C. F., Lemmon M. T., Madsen M. B., Markiewicz W. J., Marshall J., McKay C. P., Mellon M. T., Ming D. W., Morris R. V., Pike W. T., Renno N., Staufer U., Stoker C., Taylor P., Whiteway J. A., Zent A. P.: Science, 325, 58 (2009). 36. McKay C. P., Stoker C. R., Glass B. J., Dave A. I., Davila A. F., Heldmann J. L., Marinova M. M., Fairen A. G., Quinn R. C., Zacny K. A., Paulsen G., Smith P. H., Parro V., Andersen D. T., Hecht M. H., Lacelle D., Pollard W. H.: Astrobiology, 13, 334 (2013). 37. Plemmons D. H., Mehta M., Clark B. C., Kounaves S. P., Peach L. L., Renno N. O., Tamppari L., Young S. M. M.: Journal of Geophysical Research-Planets, 113, (2008). 38. Hecht M. H., Marshall J., Pike W. T., Staufer U., Blaney D., Braendlin D., Gautsch S., Goetz W., Hidber H. R., Keller H. U., Markiewicz W. J., Mazer A., Meloy T. P., Morookian J. M., Mogensen C., Parrat D., Smith P., Sykulska H., Tanner R. J., Reynolds R. O., Tonin A., Vijendran S., Weilert M., Woida P. M.: Journal of Geophysical Research-Planets, 113, (2008). 39. Kounaves S. P., Lukow S. R., Comeau B. P., Hecht M. H., Grannan-Feldman S. M., Manatt K., West S. J., Wen X., Frant M., Gillette T.: Journal of geophysical research, 108, 13 (2003). 40. Bandfield J. L., Glotch T. D., Christensen P. R.: Science, 301, 1084 (2003). 41. Ehlmann B. L., Mustard J. F., Murchie S. L., Poulet F., Bishop J. L., Brown A. J., Calvin W. M., Clark R. N., Des Marais D. J., Milliken R. E., Roach L. H., Roush T. L., Swayze G. A., Wray J. J.: Science, 322, 1828 (2008). 42. Grotzinger J. P., Crisp J., Vasavada A. R., Anderson R. C., Baker C. J., Barry R., Blake D. F., Conrad P., Edgett K. S., Ferdowski B., Gellert R., Gilbert J. B., Golombek M., Gomez-Elvira J., Hassler D. M., Jandura L., Litvak M., Mahaffy P., Maki J., Meyer M., Malin M. C., Mitrofanov I., Simmonds J. J., Vaniman D., Welch R. V., Wiens R. C.: Space Science Reviews, 170, 5 (2012).

Zima et al.

43. Zimmerman W., Blake D., Harris W., Morookian J. M., Randall D., Reder L. J., Sarrazin P., Ieee: 2013 Ieee Aerospace Conference, (2013). 44. Tao W. J., Ou Y., Feng H. T.: International Journal of Advanced Robotic Systems, 9, (2012). 45. Dobie G., Pierce S. G., Hayward G.: Ndt & E International, 58, 10 (2013). 46. Kulich M., Chudoba J., Kosnar K., Krajnik T., Faigl J., Preucil L.: Ieee Transactions on Education, 56, 18 (2013). 47. Li D. R., Liu Y., Yuan X. X.: Science China-Information Sciences, 56, (2013). 48. Susperregi L., Martinez-Otzeta J. M., Ansuategui A., Ibarguren A., Sierra B.: International Journal of Advanced Robotic Systems, 10, (2013). 49. da Costa E. T., Neves C. A., Hotta G. M., Vidal D. T. R., Barros M. F., Ayon A. A., Garcia C. D., do Lago C. L.: Electrophoresis, 33, 2650 (2012).

35

36

PAPERS

Detekce nukleových kyselin pomocí dot-blot

Marcela Vlčnovskáa, Kristýna Šmerkováa, Markéta Vaculovičováa,b, Soňa Křížkováa,b, René Kizeka,b a b

Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Nucleic acids detection by dot-blot method Dot-blot is one of biological methods that are normally used in research laboratories and especially in the diagnostics. It is the most commonly used method for identification and immunodetection of particular proteins which may be markers of various diseases. The main aim of the experiment was to develop a simple, inexpensive and rapid method for specific detection of nucleic acids, especially DNA, and then this procedure apply to the detection of DNA modified by platinum cytostatic drugs. Despite platinum cytostatic drugs‘ common use in chemotherapy of various cancer types, their biochemical effect is still not completely clear. The generally accepted opinion is that the drug binds to cellular DNA. It was observed that cisplatin is bound to the DNA the most compared to oxaliplatin and carboplatin. Přijato k publikování: 21. 2. 2014 Klíčová slova: cytostatická léčiva; DNA; dot-blot; imunodetekce; protilátka

Úvod Dot-blot patří mezi jednoduché, ale důležité biologické metody, které se běžně uplatňují ve výzkumných laboratořích a především v diagnostice. Jedná se o zjednodušený northern blot, nebo Southern blot, což jsou metody, které kombinují elektroforetickou separaci a imunodetekci1,2. Při dot-blotu nemusí být prováděna gelová elektroforéza, což značí velkou časovou úsporu a hlavní výhodou této metody je možnost užití poměrně malého množství biologického vzorku. Pro detekci se využívá specifických vazeb antigen-protilátka. Nejčastěji se používá pro identifikaci a imunodetekci především proteinů, které mohou být markery nejrůznějších onemocnění3, nicméně tuto metodu lze využít i pro studium nukleových kyselin. Protilátky proti DNA byly poprvé objeveny roku 19574 a jedná se o podskupinu antinukleárních protilátek, které se váží na jednořetězcovou anebo dvouřetězcovou DNA. Zpravidla jsou to IgM nebo IgG protilátky5-7. Hlavním cílem experimentu bylo vyvinout jednoduchou, časově a finančně nenáročnou metodu specifické detekce nukleových kyselin, především DNA, a následně tento postup aplikovat na detekci DNA ovlivněné platinovými cytostatickými léčivy. Cytostatika na bázi platiny jsou již desetiletí úspěšně aplikována při chemoterapiích různých typů rakoviny, ale i přesto není zcela znám jejich biochemický účinek. Dnes obecně uznávaným názorem je, že tato léčiva tvoří adukty s buněčnou DNA a následně tak narušují transkripci a replikaci DNA8,9.

Experimentální část Dot-blot DNA

Na nylonovou membránu Zeta Probe (Bio-Rad, USA) byly naneseny po 2 µl vzorky DNA (PCR produkt, 498 bp). Po vysušení v inkubátoru při teplotě 37 °C byla membrána připravena k blokování v blokovacím pufru (10 mg/ml BSA/sušené mléko v PBS), které probíhalo 30 minut v mikrozkumavce, či falkonce (v závislosti na velikosti použité membrány) na rotátor-mixeru Multi RS-60 (Biosan, Lotyšsko) – 60 rpm. Objem byl zvolen tak, aby se roztok neustále přelíval přes membránu, aby se zabránilo jejímu vysušení. Membrána byla následně umístěna do roztoku primární protilátky [Anti-ds DNA antibody HYB331-01/ Anti-platin modified DNA antibody CP9/19; (Abcam, Anglie)] ředěné v protilátkovém pufru (1 mg/ml BSA v PBS) v objemovém poměru 1:1000. Mikrozkumavka, či falkonka byla opět umístěna po dobu 60 minut na otáčecí rotátor. Vzápětí musela být membrána 3x promyta PBS w/0,05% Tween 20 na Petriho misce, vždy po dobu 5 minut, aby se odstranily veškeré zbytky protilátky, které neinteragovaly se vzorkem DNA. Petriho miska byla umístěna na kývací třepačku (Rocking Shaker WT 12, Biometra, Německo). Objem promývacího roztoku byl zvolen v závislosti na velikosti Petriho misky tak, aby byla membrána neustále ponořena. Následně byla membrána vložena do roztoku sekundární protilátky anti-mouse Dako P 0260, ředěné v protilátkovém pufru

Vlčnovská et al.

v poměru 1:1500. Byla umístěna na otáčecí třepačku po dobu 60 minut 60 rmp a poté opět 3x promyta. K substrátovému pufru (0,1 M acetátový pufr; pH 5,4) bylo přidáno AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) v DMF (N, N Dimethylformamide) a peroxid vodíku v poměru 1000:10:1. Membrána byla do roztoku ponořena lícovou stranou se vzorky a následně otočena tak, aby bylo možné pozorovat změny. Poté, co se dostatečně výrazně objevily tečky, byla membrána opláchnuta vodou a nechána uschnout. Postup byl proveden podle Krizkova et al.10.

37

vhodná pro dot-blot DNA. Pomocí této protilátky je možné ve vzorku detekovat i relativně malé množství DNA a to až do řádů desítek pikogramů (Tab. 1).

Interakce DNA s cytostatiky

Roztok fragmentu DNA byl smíchán s cisplatinou, oxaliplatinou a karboplatinou o různých koncentracích, viz výsledky, vždy v poměru 1:1 (v/v) v prostředí 10 mM NaClO4. Směs DNA s cytostatiky byla poté inkubována po dobu 24 hodin při 37 °C (Thermomixer 5355, Eppendorf, Německo).

Výsledky a diskuze Zjištění citlivosti metody dot-blotu a její následná optimalizace byla prováděna na PCR produktu o délce 498 bp. Následně byla tato DNA inkubována v různých koncentracích tří cytostatických léčiv na bázi platiny. Konkrétně byla zvolena cisplatina, oxaliplatina a karboplatina. Detekce takto vytvořených komplexů byla prováděna pomocí protilátky anti-Pt DNA, která je specifická na DNA ovlivněnou platinovým léčivem. Dot-blot DNA pomocí protilátky HYB 331-01 V prvním experimentu prováděném touto metodou byla vytvořena půleným ředěním koncentrační řada PCR fragObr. 1: Koncentrační řada DNA mentu, která byla následně detekována na dot-blotovací membráně pomocí protilátky HYB 331-01. Z obrázku 1 vyplývá, že anti-ds DNA protilátka HYB 331-01 je

Tab. 1: Přepočet koncentrace na hmotnost DNA ve 2 µl vzorku Intenzita zbarvení spotů je závislá na koncentraci DNA ve vzorku. Se snižujícím se množstvím DNA se snižuje i intenzita zabarvení, což potvrzuje Graf 1. Intenzita zbarvení spotů byla vyhodnocena pomocí Carestream molecular imaging softwaru (Carestream Health, USA).

Graf 1: Závislost intenzity zabarvení spotu na množství DNA (inset – lineární úsek křivky)


38

Obr. 2: Intenzita zabarvení blotovací membrány v závislosti na délce blokování a použitém blokovacím roztoku

Optimalizace blokovacího roztoku Z důvodu velmi tmavého zabarvení pozadí membrány, ke kterému došlo v předchozím experimentu, byla provedena optimalizace postupu. Jednalo se o změnu složení blokovacího roztoku. Místo BSA byl použit 1% roztok sušeného mléka a současně byl zkoumán i vliv délky blokování na následnou míru zabarvení membrány. Byly zvoleny dva časové intervaly 0,5 a 2 hodiny.

na DNA ovlivněnou platinovým cytostatikem. Na obrázku 3 lze vidět dot-blot aduktů DNA s třemi platinovými cytostatickými léčivy o různých koncentracích. Z výsledků plyne, že intenzita jednotlivých spotů neklesá pouze s koncentrací použitého platinového léčiva, ale liší se i u stejných koncentrací různých cytostatik. U cisplatiny byla detekována nejvyšší, zatímco u karboplatiny nejnižší intenzita zbarvení spotu, což opět potvrzuje i graf 2. Z toho vyplývá, že se za stejných podmínek váže nejlépe do DNA cisplatina, dále oxaliplatina a nejméně karboplatina.

Graf 2: Závislost intenzity zabarvení spotu na množství a druhu aplikovaného cytostatického léčiva

Z výsledků plyne, že u BSA je zásadní doba, po kterou blotování probíhá, zatímco u roztoku sušeného mléka byl rozdíl v sytosti membrány nepatrný. Pro další pokus byl tedy, jako optimální blokovací roztok, vybrán 1% roztok sušeného mléka a vhodný čas blokování 30 minut. Celá optimalizace byla prováděna na PCR produktu o délce 498 bp a koncentraci 12,5 µg/ml. Dot-blot platinovaných fragmentů DNA Následně byl experiment proveden i na platinovaných fragmentech DNA pomocí protilátky specifické

Obr. 3: Dot-blot platinových aduktů DNA

Vlčnovská et al.

Závěr Bylo zjištěno, že metoda dot-blot je velmi vhodná pro specifickou detekci nukleových kyselin pomocí protilátky proti DNA, jako například k detekci platinových aduktů DNA pomocí protilátky anti-Pt, která specificky reaguje s DNA ovlivněnou právě cytostatickými léčivy na bázi platiny. Dot-blot se tedy jeví jako velmi spolehlivá a poměrně rychlá metoda pro identifikaci přítomnosti navázaného platinového léčiva ve struktuře DNA. I přesto, že se nejedná o kvantifikační, ale pouze o detekční metodu, z výsledků vyplývá, že se do DNA za daných podmínek váže nejvíce cisplatina, méně oxaliplatina a nejméně karboplatina. To potvrzuje obecně uznávaný fakt, že z těchto tří platinových cytostatik je karboplatina pro člověka a jeho DNA nejméně toxická. Autoři děkují za finanční podporu projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Scitable by nature education; Northern blot; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.nature.com/ scitable/definition/northern-blot-287. 2. Scitable by nature education; Southern blot; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.nature.com/ scitable/definition/southern-blot-289. 3. Dot Blot Analysis; Teacher‘s Guidebook; [online]. [cit. 2014-01-20] Dostupné z: http://www.gbiosciences.com/ PDF/Protocol/502_Dot_Blot_Analysis_TEACHER.pdf. 4. Ceppellini R., Polli E., Celada F.: Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 96, 572 (1957). 5. Rothfiel.Nf, Stollar B. D.: Journal of Clinical Investigation, 46, 1785 (1967). 6. Schur P. H., Sandson J.: New England Journal of Medicine, 278, 533 (1968). 7. Tojo T., Friou G. J.: Science, 161, 904 (1968). 8. Fuertes M. A., Castilla J., Alonso C., Perez J. M.: Curr. Med. Chem., 10, 257 (2003). 9. Wang D., Lippard S. J.: Nat. Rev. Drug Discov., 4, 307 (2005). 10. Krizkova S., Adam V., Eckschlager T., Kizek R.: Electrophoresis, 30, 3726 (2009).

39

40

PAPERS

Sledování role iontů kovů a metalothioneinu při vývoji prionových onemocnění Alžběta Cardováa, Pavlina Sobrovaa, Raymond Bujdosob, Vojtěch Adama,c, René Kizeka,c a b c

Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Fakulta veterinárního lékařství, Univerzita v Cambridge, Madingley Road, Cambridge, CB3 OES, United Kingdom Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika

Monitoring of the role of metal ions and Metallothionein in the prion diseases development In this study we tried to describe the role of prion proteins in living organisms. PrPC is a metal binding protein and there is a presumption that the metals may play a role in the pathogenic conversion of PrPC to PrPSc. Equally important link between prion diseases and metals is a protein Metallothionein (MT). The brain specific form of Metallothionein is MT–III. MT-III participates in formation of neurodegenerative diseases and maintains the metal balance in a brain. It was revealed that the lower level of MT-III can lead to the formation of neurofibrillary clusters characteristic of Alzheimer‘s disease. Recently, there are hypotheses that prion diseases may have common mechanisms of other neurodegenerative diseases such as Alzheimer‘s, Parkinson‘s or Huntington‘s disease. These hypotheses obviously ignited great scientific interest in the subject and the common features of these diseases are now intensively studied. Přijato k publikování: 5. 3. 2014 Klíčová slova: metalothionein, metalothionein-III, MT-III, prionový protein, PrPC, PrPSc, scrapie

Úvod Buněčné prionové proteiny (PrPC) se mohou po jejich přeměně na patologickou formu prionu (PrPSc) stát infekčními a mohou způsobovat neurodegenerativní onemocnění nazývaná transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE). TSE mohou postihnout jak člověka, tak zvířata a v současné době jich existuje 16 druhů. Prionová onemocnění je možné rozpoznat podle charakteristické změny morfologie mozkové tkáně. Veškerá tato onemocnění mají velmi dlouhou inkubační dobu, která znesnadňuje jejich výzkum, jsou fatální a prozatím také ireverzibilní. Vzhledem k tomu, že je PrPC kov-vázající protein, existuje předpoklad, že kovy mohou hrát roli v patogenní přeměně z PrPC na PrPSc. Neméně důležitým pojítkem mezi prionovými onemocněními a kovy je i protein metalothionein. Jeho mozkově specifická forma metalothionein-III (MT-III) se účastní vzniku neurodegenerativních onemocnění a zajišťuje právě udržování koncentrace kovů v mozku. Bylo odhaleno, že při snížení hladiny MT-III dochází k formaci neurofibrilárních shluků charakteristických pro Alzheimerovu chorobu1. V poslední době existují i hypotézy o tom, že prionová onemocnění mohou mít společné mechanismy vzniku s dalšími neurodegenerativními chorobami, jako je Alzheimerova, Parkinsonova nebo Huntingtonova choroba2. Tyto hypotézy samozřejmě podnítily velký vědecký zájem

o toto téma a společné znaky těchto chorob jsou nyní intenzivně studovány.

Buněčný prionový protein (PrPC) PrPC je povrchový buněčný glykoprotein, který je exprimován především v mozku3. Mezi hlavní místa exprese PrPC patří například neurony, gliové buňky, leukocyty, ale také okolní tkáně zahrnující jednojaderné periferní krevní buňky4,5. Co se týče genetického hlediska, prionový protein je u člověka kódován vysoce konzervovaným genem PRNP, jež je lokalizován na chromozomu 206. Pomocí zatím neobjasněného mechanismu se tento protein může stát infekčním.

Patogenní forma prionového proteinu (PrPSc) Přirozená a infekční forma proteinu se od sebe liší pouze změněnou konformace7. Ve struktuře PrPC převládá konformace a-šroubovice, zatímco u infekčního PrPSc převládá konformace β-skládaného listu. Po shromáždění několika monomerů PrPSc do uspořádaného jádra se přidávají další monomery PrPC a mění se v PrPSc. Pokud se intermolekulární interakce takto pozměněných infekčních agregátů stanou silnými a tím pádem nevratnými, odolávají mechanismům buněčné smrti a šíří se z jedné buňky do druhé, kde k sobě váží další monomery, nazývají se

Cardová et al.

41

tyto částice priony8-10. Patogenní priony jsou v jádře stabilizovány a vytvářejí amyloid, což je patologická fibrilární forma proteinu struktury β-skládaného listu. Amyloid vzniká agregací původně solubilní formy proteinu s výrazně zastoupenou β-strukturou do formy fibrilární, která je rezistentní k degradaci proteázami. Pokud tento agregát fragmentuje, navyšuje se počet jader, která mohou přeměňovat další PrPSc 11. Toxicita obtížně degradovatelného PrPSc a nedostatek fyziologického PrPC pak zapříčiňují vznik progresivních neurodegenerativních chorob, známých jako transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE).

buňkách choroidního plexu, endoteliu a meningeálních buňkách25,26. Úroveň exprese MT-I a MT-II v neuronech není vždy stejná27. MT-III je exprimován v mozku a původně byl pojmenován jako „inhibiční faktor růstu“ 1; jako MT-III byl pojmenován až později28. MT-III obsahuje oproti jiným MT sedm přídatných aminokyselin. Na rozdíl od jiných isoforem má MT-III schopnost inhibice růstových vlastností neuronových kultur 1. MT-IV je exprimován ve tkáních obsahujících buňky vrstevnatého dlaždicového epitelu, kde hraje roli při specifické diferenciaci tohoto epitelu29.

Esenciální kovy a vznik prionových onemocnění

Metalothionein-III (MT-III) a prionová onemocnění

Existují předpoklady, že do procesu přeměny PrPC na PrPSc mohou být zapojeny ionty kovů. PrPC se účastní buněčné signalizace a může vázat či transportovat ionty mědi či zinku13 ,14. Pro správnou fyziologii mozku je nutná přísná regulace rovnováhy těchto iontů15. Z našeho pohledu je velice důležité zapojení kovů do procesů neurodegenerace a vývoje neurodegenerativních onemocnění 16. V průběhu TSE hrají kovy roli při tvorbě oxidativních poškození mozku, akumulaci proteinových agregátů a při ztrátě neuronů. Zdá se, že ionty kovů a jejich chelátory mohou ovlivnit i biochemické vlastnosti PrPSc a tím i jeho migraci při denaturační elektroforéze 17. Tato vlastnost umožňuje i odlišení různých kmenů prionů a obecně odlišení PrPC od PrPSc 18. Velkým rozdílem mezi PrPC a PrPSc je i jejich preference vazeb s kovy. Zatímco PrPC má největší afinitu k mědi, v případě PrPSc je preferována vazba se zinkem či manganem19. Dalším zajímavým zjištěním bylo, že právě po inkubaci PrPC s manganem či zinkem může protein získat částečnou rezistenci k proteázám 20.

Metalothionein-III je známý kov-vázající protein, který udržuje stálou koncentraci iontů kovů v mozku. Společnými vlastnostmi MT-III a PrP C je právě udržování rovnováhy kovových iontů v buňce, přičemž tento společný rys mimo jiné poukazuje na jejich možnou kooperaci při konformační změně PrPC na PrPSc a při zrodu prionového onemocnění 13,14,21,30. Prionová onemocnění sdílí mnoho podobných vlastností s dalšími chorobami, vznikajícími mechanismem nesprávného sbalování proteinů a projevujícími se ztrátou neuronů. V případě Parkinsonovy choroby jde o nesprávné sbalování proteinu α-synukleinu, u Alzheimerovy choroby jde o amyloid β a protein Tau a u Huntingtonovy choroby je to protein huntingtin10. Toto zjištění vyprovokovalo mnoho snah o odhalení potenciální role MT-III při vzniku neurodegenerativních onemocnění 30.

Metalothionein Zástupci proteinů ze skupiny metalothioneinů (MT) jsou přítomni téměř u všech žijících organismů 22. Molekulární hmotnost MT se pohybuje okolo 7 kDa. Studie struktur a biologických funkcí ukázaly, že MT mohou vázat esenciální kovy (Zn, Cu) a toxické kovy (Cd, Hg), a také odhalily existenci 4 hlavních isoforem MT 23,24. Různé isoformy MT jsou strukturně identické, mají stejný počet cysteinových reziduí a vysokou afinitu ke kovům. MT-I a -II jsou exprimovány ve všech savčích tkáních. V mozku jsou MT-I a -II lokalizovány zejména v astrocytech, dále však i v epiteliálních

Závěr I přesto, že se výzkumu na toto téma věnuje mnoho vědeckých skupin, přesný proces patologické přeměny PrPC na PrPSc není stále objasněn. Také odhalení role esenciálních kovů v procesech neurodegenerace je klíčové. Je evidentní, že kovy a také kov-vázající proteiny se na patologických přeměnách podílejí, avšak není jasné, jakým způsobem. Pokud by se podařilo jejich roli objasnit, bylo by v budoucnu možné i lepší zacílení léčby TSE. Tato práce byla financována z projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.


42

Literatura

1. Uchida Y., Takio K., Titani K., Ihara Y., Tomonaga M.: Neuron, 7, 337 (1991). 2. Yokoyama T., Mohri S.: Current medicinal chemistry, 15, 912 (2008). 3. Dormont D.: FEBS letters, 529, 17 (2002). 4. Cashman N. R., Loertscher R., Nalbantoglu J., Shaw I., Kascsak R. J., Bolton D. C., Bendheim P. E.: Cell, 61, 185 (1990). 5. Dodelet V. C., Cashman N. R.: Blood, 91, 1556 (1998). 6. Parchi P., Gambetti P.: Current opinion in neurology, 8, 286 (1995). 7. Legname G., Baskakov I. V., Nguyen H. O., Riesner D., Cohen F. E., DeArmond S. J., Prusiner S. B.: Science, 305, 673 (2004). 8. Prusiner S. B.: Science, 216, 136 (1982). 9. Prusiner S. B.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 13363 (1998). 10. Brundin P., Melki R., Kopito R.: Nature reviews. Molecular cell biology, 11, 301 (2010). 11. Campana V., Sarnataro D., Zurzolo C.: Trends in Cell Biology, 15, 102 (2005). 12. Huang Z., Prusiner S. B., Cohen F. E.: Current topics in microbiology and immunology, 207, 49 (1996). 13. Gavier-Widen D., Stack M. J., Baron T., Balachandran A., Simmons M.: Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 17, 509 (2005). 14. Kozlowski H., Luczkowski M., Remelli M., Valensin D.: Coordination Chemistry Reviews, 256, 2129 (2012). 15. Cai L., Li X. K., Song Y., Cherian M. G.: Current medicinal chemistry, 12, 2753 (2005). 16. Bush A. I.: Current Opinion in Chemical Biology, 4, 184 (2000). 17. Wadsworth J. D., Hill A. F., Joiner S., Jackson G. S., Clarke A. R., Collinge J.: Nature cell biology, 1, 55 (1999). 18. Shaked Y., Rosenmann H., Hijazi N., Halimi M., Gabizon R.: Journal of virology, 75, 7872 (2001). 19. Wong B. S., Chen S. G., Colucci M., Xie Z. L., Pan T., Liu T., Li R. L., Gambetti P., Sy M. S., Brown D. R.: Journal of Neurochemistry, 78, 1400 (2001). 20. Brown D. R., Hafiz F., Glasssmith L. L., Wong B. S., Jones I. M., Clive C., Haswell S. J.: The EMBO journal, 19, 1180 (2000). 21. Lehmann S.: Current Opinion in Chemical Biology, 6, 187 (2002). 22. Coyle P., Philcox J. C., Carey L. C., Rofe A. M.: Cellular and Molecular Life Sciences, 59, 627 (2002). 23. Aschner M., Cherian M. G., Klaassen C. D., Palmiter R. D., Erickson J. C., Bush A. I.: Toxicology and Applied Pharmacology, 142, 229 (1997). 24. Takahashi S.: Journal of Hematology & Oncology, 5, (2012). 25. Penkowa M., Giralt M., Thomsen P. S., Carrasco J., Hidalgo J.: Journal of Neurotrauma, 18, 447 (2001). 26. Hidalgo J., Aschner M., Zatta P., Vasak M.: Brain research bulletin, 55, 133 (2001). 27. Campagne M. V., Thibodeaux H., van Bruggen N., Cairns B., Gerlai R., Palmer J. T., Williams S. P., Lowe D. G.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96, 12870 (1999). 28. Palmiter R. D., Findley S. D., Whitmore T. E., Durnam D. M.: Proceedings of the National Academy of Sciences

of the United States of America, 89, 6333 (1992). 29. Quaife C. J., Findley S. D., Erickson J. C., Froelick G. J., Kelly E. J., Zambrowicz B. P., Palmiter R. D.: Biochemistry, 33, 7250 (1994). 30. Kawashima T., Doh-ura K., Torisu M., Uchida Y., Furuta A., Iwaki T.: Dementia and Geriatric Cognitive Disorders, 11, 251 (2000).

ARTICLES

Viry jako nanotransportéry léčiv

Simona Dostálováa,b, c, Markéta Vaculovičováb, Vojtěch Adama,b René Kizeka,b a b c

Ústav chemie a biochemie Agronomická fakulta, Mendelova univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika Středoevropský technologický institut, Vysoké učení technické v Brně, Technická 10, 616 00 Brno, Česká republika Ústav biomedicínského inženýrství, Fakulta elektrotechniky a komunikačních technologií, Vysoké učení technické v Brně, Antonínská 1, 602 00 Brno, Česká republika

Viral drug nanocarriers In this study we reviewed the use of viral vectors for delivery of drugs and genes. Viruses are monouniformic and they can be easily produced in high yield. The drug encapsulation into viral capsid differs based on the viral species used. Some viruses undergo pH dependent swelling due to the change in pH or ions concentration of surrounding solution. In others, drug can intercalate into viral nucleic acid. This work was focused on often studied viruses, adenoviruses, plant viruses (CPMV, CCMV and RCNMV) or bacteriophages (MS2 or M13). Přijato k publikování: 6. 3. 2014 Klíčová slova: doprava léčiv; enkapsulace léčiv; nanotransportéry; viry

Úvod

Vlastnosti virových nanotransportérů

V současné době se velmi rozvíjí použití nanomateriálů pro dopravu léčiv. Enkapsulací léčiva do nanotransportéru totiž dojde ke snížení jeho systémové toxicity 1, je možné jej uvolňovat postupně a dopravit jej cíleně jen do požadovaného místa v těle pacienta 2. Dojde tak ke zvýšení efektivity působení léčiva na nemocnou tkáň a snížení vedlejších účinků 3. Nanotransportéry je také možné použít jako platformu pro teranostiku a využít tak některých jejich vlastností pro zobrazování průběhu onemocnění a léčby, nebo umístění nádorového ložiska v těle pacienta 1,2,4. Nanotransportéry pro teranostické aplikace se mohou skládat až ze 4 komponent, kterými jsou emitor signálu, terapeutický náklad, přenašeč nákladu a cílící ligand 5. Nanočástice akumulují v nádorové tkáni více než ve zdravé kvůli EPR efektu (Enhanced Permeability and Retention Effect) 6,7. Je způsoben abnormální transportní dynamikou molekul i tekutin. Nádorové buňky stimulují angiogenezi, ale nové cévy jsou často defektní, endoteliální buňky jsou špatně propojené a vznikají tak velké póry bez vrstvy hladkého svalstva. Často také postrádají lymfatické cévy 8,9. Nanotransportéry mohou být sestaveny z různých materiálů, které je možné rozdělit do několika skupin (Obr. 1) – anorganické nanotransportéry, polymerní nanotransportéry, lipidové nanotransportéry a proteinové nanotransportéry, jejichž speciálním případem jsou virové kapsidy 10.

Virové kapsidy jsou často používaným typem proteinových klecí. Virová částice je obvykle tvořena několika stovkami až tisíci proteinových molekul, které jsou sebesestavující a tvoří dutou kostru pro nukleovou kyselinu. Jejich velikost se pohybuje od 10 nm až po 1 µm a mohou mít různý tvar, nejčastěji sférický nebo ikozahedrální (tvořený 20 trojúhelníkovými plochami a 12 rohy), ale i tyčinkovitý a další. Jako nanotransportéry jsou nejvíce používané adenovirus, virus chlorotické skvrnitosti vigny, virus mozaiky vigny, virus nekrotické mozaiky jetele lučního, bakteriofágy MS2, M13 nebo Qβ, nebo virus tabákové mozaiky 11. Velkou výhodou virových nanotransprotérů je to, že jsou geneticky naprogramovány tak, aby byly sebesestavující a tvořily morfologicky uniformní struktury o přesně definované velikosti a tvaru. Struktura mnoha virů je navíc známa na atomární úrovni a je možné je na této úrovni modifikovat funkčními skupinami mnohem snadněji než v případě syntetických nanočástic. Snadná je i jejich genetická modifikace. Během evoluce byly navíc viry vyvinuty právě pro dopravu nákladu, kterým je genetická informace, do hostitelské buňky 12. Na rozdíl od některých nanotransportérů, které jsou tělu vlastní, virové kapsidy mohou způsobovat imunitní odpověď organismu pacienta. To i přesto, že jejich hostitelem jsou nejčastěji rostlinné buňky nebo bakterie. Příkladem může být rostlinný virus CCMV, jehož přítomnost zvyšuje produkci IgG a IgM

43


44

Obr. 1: Rozdělení nanotransportérů

protilátek v myších, což bylo prokázáno imunologickými studiemi 13. Tato imunogenicita může být snížena pokrytím povrchu viru polyethylenglykolem14. Tyčinkovité fágy jsou imunogenní v organismu myší 15 ani člověka 16. U virů dochází k rychlému vyloučení z organismu, do 24 hodin po aplikaci vyloučily sledované myši močí 57-73 % aplikovaného viru CCMV 13,17. Některé viry jsou po aplikaci rovnoměrně distribuovány v celém organismu pacienta (CCMV 13), jiné se koncentrují jen v některých tkáních (CPMV v játrech a slezině a díky povrchovému vimentinu v nádorových buňkách 17). Léčivo je ve virových kapsidách vázáno pevně, ať již díky supramolekulární chemii, kovalentní vazbě nebo elektrostatickými silami. Častá je například interkalace léčiva do nukleové kyseliny viru 11. Nedochází tak k úniku léčiva póry ve struktuře nanotransportéru, jako je tomu například v případě apoferritinu, kde se léčivo pouze volně nachází v jeho dutině 18. Purifikace funkčních virových kapsid probíhá nejčastěji centrifugací pro odstranění hostitelských buněk a následnou ultracentrifugací v sacharózovém gradientu 19. Nevyžaduje tedy složité separační metody jako některé jiné nanotransportéry. Při enkapsulaci léčiva do viru je neuzavřené léčivo odstraněno dialýzou podobně jako u jiných nanotransportérů 20,21.

Nejvíce používané viry Adenovirus Adenovirus je savčí DNA virus z rodiny Adenoviridae. Lidské hostitele má 6 druhů adenovirů (označují se jako A-F a rozdělují se do sérotypů), které se odlišují podílem cytozinů a guaninů v molekule DNA a

schopností aglutinovat červené krvinky 22. Kapsida adenovirů je neobalená, má ikozahedrální tvar a průměr 70-90 nm. Stěny ikozahedronu jsou tvořeny 12 kopiemi trimerů proteinu a každý vrchol je tvořen pentamery proteinu spojenými s trimery vláknitého proteinu 22. Obsahuje 13 strukturních proteinů, které se podílejí na infekci a umožňují vstup viru do hostitelských buněk i jeho rozmnožování. Indukují také imunitní systém 23. Kapsida slouží jako ochrana adenovirálního genomu před vnějšími podmínkami v hostiteli a způsobuje jeho infektivitu 24. Genom je dlouhý 36 kb 25. Nejčastěji jsou adenoviry, zejména adenovirus typu 5, studovány pro dopravování genů do lidských buněk. Gen je obvykle integrován do virového genomu a adenovirální infekcí se dostane do požadovaných hostitelských buněk. Aby nebyly adenoviry toxické pro pacienta, je možné odstranit některé jejich geny a znemožnit tak jejich replikaci26,27. I přesto často adenoviry způsobují záněty v těle pacienta28. Do těchto vektorů je možné uzavřít i 7,5 kb cizorodé DNA 22. Adenoviry byly použity pro dopravu tumor supresorových genů p53 29 a p1630, antisense DNA, ribozymů a protilátek 31. Prázdná kapsida adenoviru (proteiny exprimovány v bakteriálním plazmidu), jejíž průměr je za fyziologických podmínek 110 nm, se v pH 4 zvětší až na 1637 nm, a po návratu pH na fyziologickou hodnotu (7,4) se opět zmenší na 60 nm. Tímto postupem byly do kapsidy uzavřeny 20 nm nanočástice, fluorescenční značky nebo siRNA a dopraveny do HEK buněk. siRNA byly uzavřením do kapsidy ochráněny před degradací 32. Pro cílenou dopravu byl povrch adenovirů modifikován malými molekulami,

Dostálová et al.

proteiny nebo nanosystémy33. Kovové nanočástice na povrchu adenovirů byly použity pro fototermální terapii 34 a kombinovanou terapii při současné dopravě genů 35. CCMV Virus chlorotické skvrnitosti vigny (CCMV – cowpea chlorotic mottle virus) je rostlinný RNA virus z rodiny bromovirů 36. Z infikovaných rostlin je možné získat velké koncentrace tohoto viru (1-2 mg/g) a expresí v kvasinkách je možné produkovat proteiny CCMV kapsidy, které jsou sebesestavující do prázdných částic bez genetického materiálu 37. CCMV se skládá ze 180 identických podjednotek kapsidy, které jsou uspořádány jako 20 hexamerů a 12 pentamerů, a tvoří ikozahedron o průměru 28 nm, s vnitřní dutinou o průměru 18 nm. Každý z proteinů virové kapsidy obsahuje 190 aminokyselin, jejichž N-konec je orientován směrem do nitra virové kapsidy. Na N-konci jsou převážně bazické skupiny z aminokyselin argininu a lyzinu, interagující se záporně nabitou RNA. Při zkrácení N-konce se vytvoří částice o průměru 18 nebo 22 nm, které mají tvar dvanáctistěnu 36. Struktura CCMV je dynamická, dochází u něj k reverzibilnímu jevu, kdy se za určitých podmínek (pH 7,5 nebo zvýšená iontová síla) zvětší průměr viru až o 10 % v důsledku vytvoření 60 2 nm pórů ve virové kapsidě. Díky tomu může být jednoduše odstraněna virová RNA a díky kladně nabitému vnitřnímu povrchu kapsidy je možné do viru uzavřít především záporně nabitá léčiva 38. CCMV virus byl využit pro uzavření ftalocyaninu zinku, který je vhodný pro fotodynamickou terapii rakoviny. Toto záporně nabité léčivo bylo úspěšně dopraveno do makrofágových buněk, které následně umřely po ozáření červeným světlem 39. Pro dopravu kladně nabitých léčiv je možné genetickou modifikací upravit vnitřní povrch CCMV kapsidy 40. Na vnější povrch CCMV byly navázány fluorescenční molekuly a peptidy přes karboxylové skupiny nebo aminoskupiny CCMV40. V kapsidě CCMV byly také mineralizací syntetizovány anorganické částice 38. CPMV Dalším rostlinným ssRNA virem je virus mozaiky vigny (CPMV – cowpea mosaic virus) z rodiny Comoviridae, který také tvoří ikozahedron. Ve vysoké koncentraci je možné jej získat z listů nakažených rostlin

45

(0,8-1 mg/g) 41. Jeho průměr je 30 nm a obsahuje 60 asymetrických jednotek složených vždy z malé a velké podjednotky. Je stabilní v širokém rozsahu teplot (do 60 °C) a pH (3-9) i v přítomnosti některých organických rozpouštědel 42. Jeho genom je rozdělen na 2 segmenty, větší RNA1 kóduje procesy potřebné pro replikaci viru, menší RNA2 kóduje kapsidové proteiny a protein sloužící k pohybu viru 43. CPMV nemůže vytvořit dospělé kapsidy in vitro 44. CPMV obsahuje 60 molekul lysinu na jedné virové částici 45, může ale být geneticky modifikován, aby vytvářel víc reziduí lysinu a také cysteinu 46, na která mohou být navázané fluorofory, kovové komplexy nebo celé proteiny 47. Do CPMV byla úspěšně uzavřena fluorescenční barviva propidium jodid nebo akridinová oranž a léčivo proflavin, které bylo dopraveno do buněk nádorů prsu, děložního čípku a střeva. Je takto možné uzavřít léčiva, která interkalují do RNA, která tak v tomto případě slouží jako houba. Vstup do buněk byl umožněn molekulami vimentinu na povrchu CPMV 48. Malé molekuly jsou schopny difundovat dovnitř kapsidy, pravděpodobně mezerou mezi osami kapsidy 49. Z CPMV byla alkalickou hydrolýzou odstraněna RNA, čímž byly vytvořeny prázdné kapsidy, a na cysteinová rezidua na vnitřní stěně kapsidy byla navázána fluorescenční barviva. Životnost takto vytvořených kapsid však byla pouze 7 – 10 dní 50. RCNMV Často používaný je i virus nekrotické mozaiky jetele lučního (RCNMV – red clover necrotic mosaic virus), rostlinný RNA virus patřící do rodiny Tombusviridae. Skládá se ze 180 identických podjednotek (37 kDa) tvořících ikozahedron s vnějším průměrem 36 nm a dutinou o průměru 17 nm. V důsledku přítomnosti divalentních kationtů změní RCNMV svoji strukturu, vytvoří póry a uvolní genomovou RNA 51. V 6,5 < pH < 8 se reverzibilně zvětší průměr RCNMV z 36 nm na 46 nm 52. Do tohoto viru byly uzavřeny 10 nm zlaté nanočástice 53. Infúzí do něj byla enkapsulována léčiva a jeho povrch byl konjugován s cílícími peptidy přes propojující molekuly, jako je sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sSMCC) nebo succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-hexaethyleneglycol]ester (SMPEG) 54.

46


MS2 Z virů napadajících bakterie se jako možný nanotransportér studuje MS2 bakteriofág, jehož hlava tvoří ikozahedron o průměru 27 nm. Kapsida obsahuje 180 identických monomerů, které mohou být nezávisle exprimovány v bakteriích a jsou sebesestavující. Nachází se v ní 32 pórů, jejichž průměr je 1,8 nm. Kapsida je stabilní v širokém rozsahu pH (3-10), teploty, iontové síly i za přítomnosti organických rozpouštědel 11. Genom MS2 bakteriofága je tvořen ssRNA a má délku 3569 bází 55. Z infikovaných bakterií Escherichia coli je možné jednoduše získat miligramy tohoto viru (30 mg z 1 litru kultury) 56. Je možné jednoduše odstranit genomovou RNA fosfátovou hydrolýzou při pH 11,8 po dobu 4 hod a vytvořit tak prázdné kapsidy 57 nebo exprimovat kapsidový protein v bakteriích, který je sebesestavující. Vnitřní i vnější povrch prázdné kapsidy MS2 bakteriofága jde modifikovat simultánně. Vnější povrch byl modifikován řetězci polyethylenglykolu s biotinem pro připojení cílících ligandů a do jeho kapsidy bylo uzavřeno fluorescenční barvivo, přičemž kapsida zůstala v sestaveném stavu 58. Cílení je umožněno i genetickou modifikací kapsidového proteinu pro vystavení cizorodých peptidů na povrchu kapsidy, které mají až 24 aminokyselin 59. MS2 bakteriofág byl použit pro dopravu porfyrinů pro fotodynamickou terapii60 a pro cílenou dopravu nanočástic, doxorubicinu, cisplatiny a proteinových toxinů do buněk lidského hepatocelulárního karcinomu61. Po uzavření siRNA do MS2 bakteriofága je siRNA chráněna před degradací a, po modifikaci vnějšího povrchu MS2 bakteriofága transferinem, je možné ji dopravit do HeLa buněk 62. Podobně byly dopraveny i různé miRNA do různých buněk 63 nebo do živých myší 64. M13 M13 bakteriofág je DNA virus, tvořící trubičkovité útvary o délce 880 nm a šířce 6,6 nm. Jednořetězcová DNA je obklopená 2700 kopiemi hlavního kapsidového proteinu P8, který je možné geneticky modifikovat, a 5 kopiemi 4 různých minoritních kapsidových proteinů. Konce viru je možné modifikovat cílícími peptidy. Není stabilní v nízkém pH11. Konec M13 bakteriofága byl modifikován pro cílené dopravení ftalocyaninu zinku uzavřeného v lipozomu do buněk nádoru prsu. Lipozomy byly na stěně

bakteriofága uchyceny elektrostatickou interakcí65. Povrch M13 bakteriofága byl konjugován s folátem pro cílenou dopravu doxorubicinu do nádorů a jeho uvolnění vlivem snížení pH66.

Závěr Viry jsou v současné době velmi používanými nanotransportéry pro dopravu genů, DNA vakcín nebo léčiv. Viry jsou strukturně uniformní a mohou být snadno produkovány ve velkých množstvích. Jsou také biokompatibilní a jde snadno modifikovat vnější i vnitřní povrch kapsidy funkčními skupinami. Proces uzavření léčiva do virové kapsidy se liší podle zvoleného druhu viru. Některé tvoří póry, kterými může léčivo procházet, v důsledku změny pH, jiné již póry ve své struktuře obsahují a léčivo může interkalovat do nukleové kyseliny viru. V této práci byly představeny nejčastěji studované viry a uvedeny příklady jejich použití. Tato práce byla financována ze zdrojů CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura 1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.

Sumer B., Gao J. M.: Nanomedicine, 3, 137 (2008). Svenson S.: Molecular Pharmaceutics, 10, 848 (2013). Park K.: Acs Nano, 7, 7442 (2013). Leonard B., Cancer Nanotechnology: Going Small for Big Advances: Using Nanotechnology to Advance Cancer Diagnosis, Prevention and Treatment, DIANE Publishing Company, 2009. Fang C., Zhang M. Q.: Journal of Controlled Release, 146, 2 (2010). Duncan R., Sat Y. N.: Annals of Oncology, 9, 39 (1998). Maeda H.: Journal of Controlled Release, 164, 138 (2012). Matsumura Y., Maeda H.: Cancer Research, 46, 6387 (1986). Vasey P. A., Kaye S. B., Morrison R., Twelves C., Wilson P., Duncan R., Thomson A. H., Murray L. S., Hilditch T. E., Murray T., Burtles S., Fraier D., Frigerio E., Cassidy J., Canc Res Campaign Phase I. I. I. C.: Clinical Cancer Research, 5, 83 (1999). Peer D., Karp J. M., Hong S., FaroKhzad O. C., Margalit R., Langer R.: Nature Nanotechnology, 2, 751 (2007). Ma Y. J., Nolte R. J. M., Cornelissen J.: Advanced Drug Delivery Reviews, 64, 811 (2012). Steinmetz N. F.: Molecular Pharmaceutics, 10, 1 (2013). Kaiser C. R., Flenniken M. L., Gillitzer E., Harmsen A. L., Harmsen A. G., Jutila M. A., Douglas T., Young M. J.: International Journal of Nanomedicine, 2, 715 (2007). Raja K. S., Wang Q., Gonzalez M. J., Manchester M., Johnson J. E., Finn M. G.: Biomacromolecules, 4, 472 (2003). Manchester M., Singh P.: Advanced Drug Delivery Reviews, 58, 1505 (2006). Kickhoefer V. A., Garcia Y., Mikyas Y., Johansson E.,

Dostálová et al.

17. 18. 19. 20.

21.

22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

29. 30. 31.

32. 33. 34. 35.

36. 37. 38. 39. 40.

Zhou J. C., Raval-Fernandes S., Minoofar P., Zink J. I., Dunn B., Stewart P. L., Rome L. H.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, 4348 (2005). Singh P., Prasuhn D., Yeh R. M., Destito G., Rae C. S., Osborn K., Finn M. G., Manchester M.: Journal of Controlled Release, 120, 41 (2007). Zhen Z. P., Tang W., Chen H. M., Lin X., Todd T., Wang G., Cowger T., Chen X. Y., Xie J.: Acs Nano, 7, 4830 (2013). Yang Q., Catalano C. E.: Virology, 305, 276 (2003). Blazkova I., Nguyen H. V., Dostalova S., Kopel P., Stanisavljevic M., Vaculovicova M., Stiborova M., Eckschlager T., Kizek R., Adam V.: International Journal of Molecular Sciences, 14, 13391 (2013). Tmejova K., Hynek D., Kopel P., Dostalova S., Smerkova K., Stanisavljevic M., Nguyen H. V., Nejdl L., Vaculovicova M., Krizkova S., Kizek R., Adam V.: International Journal of Electrochemical Science, 8, 12658 (2013). Douglas J. T.: Molecular Biotechnology, 36, 71 (2007). Russell W. C.: Journal of General Virology, 90, 1 (2009). Norrby E.: Journal of General Virology, 5, 221 (1969). Shenk T. E., Adenoviridae: The Viruses and Their Replication, Marienfeld U., Haack A., Thalheimer P., Schneider-Rasp S., Brackmann H. H., Poller W.: Gene Therapy, 6, 1101 (1999). Schaack J.: Frontiers in Bioscience, 10, 1146 (2005). Morsy M. A., Gu M. C., Motzel S., Zhao J., Su Q., Allen H., Franlin L., Parks R. J., Graham F. L., Kochanek S., Bett A. J., Caskey C. T.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95, 7866 (1998). Roth J. A.: Expert Opinion on Biological Therapy, 6, 55 (2006). Ma J., He X., Wang W., Huang Y., Chen L., Cong W., Gu J., Hu H., Shi J., Li L., Su C.: Digestive Diseases and Sciences, 54, 1425 (2009). Alvarez R. D., Barnes M. N., Gomez-Navarro J., Wang M. H., Strong T. V., Arafat W., Arani R. B., Johnson M. R., Roberts B. L., Siegal G. P., Curiel D. T.: Clinical Cancer Research, 6, 3081 (2000). Rao V. R., Upadhyay A. K., Kompella U. B.: Journal of Controlled Release, 172, 341 (2013). Singh R., Kostarelos K.: Trends in Biotechnology, 27, 220 (2009). Zharov V. P., Kim J.-W., Curiel D. T., Everts M.: Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine, 1, 326 (2005). Everts M., Saini V., Leddon J. L., Kok R. J., Stoff-Khalili M., Preuss M. A., Millican C. L., Perkins G., Brown J. M., Bagaria H., Nikles D. E., Johnson D. T., Zharov V. P., Curiel D. T.: Nano Letters, 6, 587 (2006). Speir J. A., Munshi S., Wang G. J., Baker T. S., Johnson J. E.: Structure, 3, 63 (1995). Brumfield S., Willits D., Tang L., Johnson J. E., Douglas T., Young M.: Journal of General Virology, 85, 1049 (2004). Douglas T., Young M.: Advanced Materials, 11, 679 (1999). Brasch M., de la Escosura A., Ma Y. J., Uetrecht C., Heck A. J. R., Torres T., Cornelissen J.: Journal of the American Chemical Society, 133, 6878 (2011). Gillitzer E., Willits D., Young M., Douglas T.: Chemical Communications, 2390 (2002).

47 41. Porta C., Spall V. E., Findlay K. C., Gergerich R. C., Farrance C. E., Lomonossoff G. P.: Virology, 310, 50 (2003). 42. Singh P., Gonzalez M. J., Manchester M.: Drug Development Research, 67, 23 (2006). 43. Lomonossoff G. P., Johnson J. E.: Progress in Biophysics & Molecular Biology, 55, 107 (1991). 44. Shanks M., Lomonossoff G. P.: Journal of General Virology, 81, 3093 (2000). 45. Wang Q., Kaltgrad E., Lin T. W., Johnson J. E., Finn M. G.: Chemistry & Biology, 9, 805 (2002). 46. Chatterji A., Ochoa W. F., Paine M., Ratna B. R., Johnson J. E., Lin T. W.: Chemistry & Biology, 11, 855 (2004). 47. Chatterji A., Ochoa W., Shamieh L., Salakian S. P., Wong S. M., Clinton G., Ghosh P., Lin T. W., Johnson J. E.: Bioconjugate Chemistry, 15, 807 (2004). 48. Yildiz I., Lee K. L., Chen K., Shukla S., Steinmetz N. F.: Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 172, 568 (2013). 49. Wang Q., Lin T. W., Tang L., Johnson J. E., Finn M. G.: Angewandte Chemie-International Edition, 41, 459 (2002). 50. Ochoa W. F., Chatterji A., Lin T. W., Johnson J. E.: Chemistry & Biology, 13, 771 (2006). 51. Sherman M. B., Guenther R. H., Tama F., Sit T. L., Brooks C. L., Mikhailov A. M., Orlova E. V., Baker T. S., Lommel S. A.: Journal of Virology, 80, 10395 (2006). 52. Loo L., Guenther R. H., Basnayake V. R., Lommel S. A., Franzen S.: Journal of the American Chemical Society, 128, 4502 (2006). 53. Loo L. N., Guenther R., Lommel S., Franzen S.: Biophysical Journal, 88, 232A (2005). 54. Wang R. Q., Lockney D. M., Goshe M. B., Franzen S.: Bioconjugate Chemistry, 22, 1970 (2011). 55. Fiers W., Structure and Function of Rna Bacteriophages, Plenum Press, 1979. 56. Cargile B. J., McLuckey S. A., Stephenson J. L.: Analytical Chemistry, 73, 1277 (2001). 57. Hooker J. M., Kovacs E. W., Francis M. B.: Journal of the American Chemical Society, 126, 3718 (2004). 58. Kovacs E. W., Hooker J. M., Romanini D. W., Holder P. G., Berry K. E., Francis M. B.: Bioconjugate Chemistry, 18, 1140 (2007). 59. Mastico R. A., Talbot S. J., Stockley P. G.: Journal of General Virology, 74, 541 (1993). 60. Cohen B. A., Kaloyeros A. E., Bergkvist M.: Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy Xx, 7886, (2011). 61. Ashley C. E., Carnes E. C., Phillips G. K., Durfee P. N., Buley M. D., Lino C. A., Padilla D. P., Phillips B., Carter M. B., Willman C. L., Brinker C. J., Caldeira J. D., Chackerian B., Wharton W., Peabody D. S.: Acs Nano, 5, 5729 (2011). 62. Galaway F. A., Stockley P. G.: Molecular Pharmaceutics, 10, 59 (2013). 63. Pan Y., Zhang Y., Jia T. T., Zhang K., Li J. M., Wang L. N.: Febs Journal, 279, 1198 (2012). 64. Pan Y., Jia T. T., Zhang Y., Zhang K., Zhang R., Li J. M., Wang L. N.: International Journal of Nanomedicine, 7, 5957 (2012). 65. Ngweniform P., Abbineni G., Cao B. R., Mao C. B.: Small, 5, 1963 (2009). 66. Suthiwangcharoen N., Li T., Li K., Thompson P., You S. J., Wang Q.: Nano Research, 4, 483 (2011).

48

ARTICLES

MiRNA: Od biogeneze po využití v lékařství

Veronika Vlahováa, Kristýna Šmerkováa, Markéta Vaculovičováa,b, René Kizeka,b a b


MiRNA: From biogenesis to medical utilization MicroRNAs are small non-coding RNA molecules that are involved in post-transcriptional regulation of gene expression. They take up about 2 % of the genome and affects up to one third of the protein-coding genes. Their biogenesis starts in the cell nucleus and passes into the cytoplasm where the functional forms of miRNAs participate in the process of RNA interference. Nowadays, the biggest interest focuses on the role of miRNAs during carcinogenesis. Mutations in the genes for various miRNAs types is to promote proliferation and inhibition of apoptosis. Therefore, the miRNA counts as a good diagnostic marker or even as a treatment method.

Přijato k publikování: 27. 2. 2014 Klíčová slova: biogeneze, diagnostický marker, Dicer, Drosha, MiRNA, RNA interference

Úvod MicroRNA (miRNA) jsou malé endogenní molekuly RNA, které patří do skupiny nekódujících malých jaderných RNA. Velikost aktivních molekul miRNA se pohybuje zhruba okolo 22 nukleotidů. Význam těchto molekul spočívá v jejich schopnosti regulovat genovou expresi na posttranskripční úrovni1. Tento proces probíhá navázáním na 3ÚTR konec cílové mediátorové RNA (mRNA). Cílová mRNA je poté buď degradována, nebo je pozastavena její translace. Jedna molekula miRNA je navíc schopna ovlivnit více molekul mRNA. Tímto způsobem je negativně regulována až třetina kódujících genů v genomu, což dělá z miRNA nejpočetnější skupinu regulátorů v buňce2. Její působení reguluje proliferaci buněk, jejich diferenciaci a apoptózu a všeobecně ovlivňuje množství důležitých biologických procesů3,4. Geny pro miRNA jsou rozprostřeny napříč celým genomem a jejich výskyt je značný, zabírají až 2 % celého genomu5. Jejich výskyt je velmi konzervativní, u velmi příbuzných druhů jsou zachovány téměř všechny miRNA a homology se vyskytují i u druhů velmi vzdálených6. V dnešních dnech je výzkumu miRNA věnována velká pozornost, a to hlavně díky jejímu vlivu na nádorovou transformaci buněk. Zhruba 50 % genů kódujících miRNA se nachází na fragilních částech chromozomů, které bývají pozměněny buď amplifikací, nebo delecí

v průběhu karcinogeneze7. MiRNA se vyskytuje jak v pozici onkogenu, kdy exprese takovéto molekuly v tumorových buňkách narůstá, tak i v pozici tumor-supresorového genu, kdy dochází ke snížení nebo naprosté absenci exprese dané miRNA4,8. Z tohoto pohledu je jasné, že díky svým vlastnostem by miRNA mohly sloužit jako ideální diagnostické markery pro zjištění pravděpodobnosti recidivity onemocnění, její odpovědi na léčbu a pravděpodobnosti vzniku metastáz. Dalším pozitivem je její větší stabilita oproti mRNA, která byla běžně používána jako diagnostický marker. Velký potenciál má miRNA ve využití v protinádorové terapii. Díky procesu RNA interference, které se miRNA účastní, lze cíleně umlčet určité geny podporující např. proliferaci v nádorovém bujení. V dnešních dnech probíhá velké množství studií, které se zabývají otázkou cíleného transportu miRNA do buněk nádoru, a to aniž by došlo k aktivaci imunitní odpovědi. Další otázkou je, jak docílit tlumení pouze cílových mRNA 9.

Historie miRNA V roce 1993 zkoumali Lee a Ambros se spolupracovníky molekuly RNA, vznikající z genu lin-4 u Caenorhabditis elegans10. Tyto molekuly byly dvojího typu – delší měla 61 nukleotidů a kratší 22 nukleotidů. 5´konce těchto molekul byly identické, což vedlo k domněnce, že delší molekula slouží v buňce jako

Vlahová et al.

prekurzor její kratší variantě. Důležitým zjištěním bylo, že tyto molekuly RNA se nepřepisují do žádného proteinu. Navíc obě tyto molekuly byly komplementární k 3ńepřekládanému konci (3ÚTR konci) mRNA genu lin-14. Vědci zjistili, že lin-4 se váže na mRNA genu lin-14 a tím zamezuje jejímu přepisu do proteinu. Pokles hladiny tohoto proteinu zapříčiňuje přechod z prvního larválního stádia do druhého. V roce 2000 byla objevena další malá molekula RNA s názvem let-7 u C. elegans11. Vědci objevili, že tato malá molekula RNA s délkou 21 nukleotidů se váže podobně jako lin-4 na mRNA genů ovlivňujících larvální vývoj C. elegans. Po zvýšení exprese let-7 dochází k posttranslační regulaci mRNA genů lin-41 a lin-42, což způsobí přechod z larválního stádia do stádia dospělce. Také bylo zjištěno, že geny pro let-7 jsou vysoce konzervované a objevují se u různých živočišných druhů, jako u dospělých stádií kroužkovců a měkkýšů, zebřiček a u octomilek12.

Biogeneze miRNA Geny pro miRNA se kromě chromozomu Y nacházejí na všech chromozomech. Nejčastější výskyt je v klastrech, ale mohou se vyskytovat i samostatně. Jejich největší zastoupení (asi 40%) je v intronech kódujících genů nebo v genech pro nekódující RNA13. K biosyntéze miRNA (Obr. 1) dochází v jádře buňky a to prostřednictvím RNA polymerázy II, která vytváří transkript zvaný pri-miRNA, který je opatřen na 3´konci guanidinovou čepičkou a na 5´konci nese polyadenylový zbytek14. Tyto transkripty vznikají z intronových částí genomu o velikosti zhruba 400 nukleotidů a k jejich přepisu dochází po vystřihnutí z primárního transkriptu13. Pri-miRNA má částečně komplementární strukturu a tvoří vnitřní vlásenkové struktury15. Tyto struktury jsou rozeznávané komplexem zvaným Mikroprocesor. Tento komplex se skládá ze dvou základních proteinů – z RNázy III, který je nazýván Drosha a z proteinu DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8), který je znám jako Pasha16. Protein Drosha je schopný rozeznat pri-miRNA od ostatních prekurzorů RNA, které také nesou vlásenky, a protein Pasha rozeznává dsRNA a vyhledává na molekule místo sestřihu, který zajistí RNázová aktivita proteinu Drosha17. Po sestřihu zprostředkovaným Mikroprocesorem se mění prekurzor na pre-miRNA. Tento prekurzor má strukturu úplné vlásenky

49

s přesahem 2 nukleotidů na 3´konci a délkou zhruba 70 nukleotidů18. Tyto procesy probíhají v jádře. Za přepravu prekurzoru pre-miRNA skrze jaderné póry z jádra do cytoplazmy je zodpovědný transportní komplex Exportin 519. Ten za přítomnosti kofaktoru Ran rozpoznává specifickou sekvenci vlásenky pre-miRNA. Na kofaktor Ran se váže GTP. Po hydrolýze GTP na GDP dochází k aktivaci komplexu Exportin 5 a k transportu pre-miRNA do cytoplazmy buňky20. V cytoplazmě je pre-miRNA rozpoznávána enzymem Dicer, což je ATP-dependentní multidoménový enzym, který se řadí do skupiny RNáz typu III o velikosti až 200 kD9. Dicer je v komplexu s dsRNA vazebným proteinem TRBP (trans-activator RNA binding protein). Tento komplex štěpí dlouhé pre-miRNA na krátké fragmenty o délce zhruba 22 nukleotidů, které se účastní RNA interference21.

RNA interference Po působení enzymu Dicer vznikly tedy krátké duplexy RNA:RNA 22. Tento duplex se rozděluje na vedoucí („guide“) řetězec a za „passenger“ řetězec (často značený RNA*), přičemž vedoucí řetězec se účastní umlčování mRNA, zatímco vedlejší řetězec je degradován. Nicméně v posledních studiích se zjistilo, že se aktivními řetězci mohou stát oba řetězce z duplexu RNA:RNA, kdy jeden je značen 5p a druhý 3p. Preference jednoho či druhého řetězce závisí na druhu tkáně23. Řetězec miRNA je navázán na komplex RISC (RNA-induced silencing complex), zatímco druhý řetězec je v cytoplazmě ihned degradován. Aktivní miRNA navázaná v RISC se váže na 3ÚTR konec mRNA podle komplementarity bází, tento proces probíhá na polyribozomech. Centrum komplexu RISC tvoří proteiny z argonautové rodiny, speciálně Ago 224. Tento protein se váže se dvěma doménami, které jsou důležité v procesu RNA interference – domény PIWI a PAZ25. Na doménu PAZ se vážou dva nukleotidy přesahující na 3´konci miRNA. Na PIWI doménu se váže 5´konec miRNA. PIWI doména funguje jako endoribonukleáza a štěpí mRNA, která se páruje s danou miRNA v komplexu. Ago 2 protein je řídícím centrem štěpící aktivity komplexu RISC26. Proces RNA interference (RNAi) může probíhat dvěma způsoby a je závislý na míře komplementarity sekvencí miRNA a cílové mRNA. Jestliže dochází k přesnému párování sekvencí mezi miRNA a mRNA,


50

dochází k degradaci mRNA. Tento případ není u savců příliš běžný28. Jestliže dochází jen k částečnému párování sekvencí, vznikají v duplexu vlásenky a výdutě. V tomto případě dochází k potlačení translace29. Díky nepřesnému párování má jedna miRNA vliv na velké množství různých mRNA a má tak velký vliv na buněčnou fyziologii5

MiRNA a rakovina Zjištění, že více jak polovina genů pro miRNA leží na fragilních částech chromozomů, které nejvíce podléhají mutačním změnám při rakovinném bujení, ať už se jedná o delece, amplifikace či translokace, vedlo k přesvědčení, že tyto malé molekuly hrají velikou roli ve vývoji rakoviny. V dnešních dnech probíhají mnohé studie ohledně výskytu a role jednotlivých miRNA v různých typech nádorů. Jak už bylo dříve zmíněno, miRNA se vyskytují v genomu v podobě onkogenů i v podobě tumor-supresorových genů a podle toho také kolísá hladina jejich výskytu v rakovinové tkáni. Proto se s miRNA počítá jako s dobrým diagnostickým markerem, který by mohl určit jak druh tumoru, tak prognózu nebo stanovit míru reakce na podané léčivo. Příkladem je studie z roku 2005, kdy bylo využito

stanovení miRNA pro určení progresu u chronické lymfoidní leukémie30 nebo určení 7 typů miRNA u rakoviny žaludku, jejichž přítomnost zaručila přežití pacientů bez relapsu onemocnění31. Obdobně u kožního melanomu bylo zjištěno, že nízká hladina miR-191 a vysoká hladina miR-193 byla spojena s krátkou dobou přežití32. Ovšem důležitější využití miRNA jako biomarkeru je v predikci reakce na specifickou terapii. Například u pacientů trpících hepatocelulárním karcinomem je snížená hladina miR-26 spojena s horší prognózou, avšak tito pacienti lépe reagují na léčbu interferonem-α33. Tím by bylo možné určení pacientů, pro které je léčba interferonem vhodnější. Naopak při určení zvýšené hladiny miR-21 se projevila snížená odpověď na léčbu gemcitabinem u pacientů s rakovinou slinivky34. S touto problematikou také souvisí využití miRNA pro překonání rezistence vůči chemoterapeutikům. Jedna z prvních studií v této oblasti proběhla v roce 2006, kdy v buněčné kultuře buněk cholangiokarcinomu proběhla inhibice miR-21 a miR-200b, což způsobilo zvýšenou citlivost na léčivo gemcitabin35. Tyto hypotézy jsou ovšem zatím na bázi in vitro studií. Další možností využití miRNA v souvislosti s rakovi-

Obr. 1: Biogeneze miRNA. Prekurzor miRNA (pri-miRNA) je přepsán RNA polymerázou II. Pomocí komplexu Drosha/Pasha je pri-miRNA sestřihnuta na pre-miRNA, která je následně transportována do cytoplazmy pomocí komplexu Exportin 5. V cytoplazmě je pre-miRNA vyhledána komplexem Dicer, který sestřihne prekurzor na krátké duplexy RNA:RNA. Jeden řetězec z duplexu je degradován a druhý je navázán do komplexu RISC. Převzato a upraveno dle27

Vlahová et al.

nou je terapie pomocí jejího dodání do organismu-tedy vnesení supresorové miRNA, která byla mutací při vzniku rakoviny ztracena, nebo zavedení oligonukleotidů, které by blokovaly v organismu pomocí procesu RNA interference onkogenní formy miRNA36.

Závěr MiRNA je jedním z nejdůležitějších činitelů v procesu regulace genové exprese. Její význam stále roste s přibývajícími poznatky ohledně principu jejího působení v procesu RNA interference. Její role v projevech rakovinného bujení je jasnou příčinou stále se zvyšujícího zájmu ze strany vědecké veřejnosti. MiRNA má nesporně velký potenciál v diagnostice a léčbě rakoviny, ovšem je zde ještě mnoho nevyřešených otázek. V budoucnu je nutné zabývat se problémy při transportu miRNA k cílovým buňkám v organismu pacienta. Překážek je mnoho: překonání oběhového a imunitního systému, transport až k cílové buňce, překonání buněčné membrány a konečně samotné uvolnění miRNA do cytoplazmy. Tato práce byla financována z projektu NanoBioTECell GA ČR P102/11/1068.

Literatura

1. Ambros V.: Current Opinion in Genetics & Development, 21, 511 (2011). 2. Pasquinelli A. E., Ruvkun G.: Annual Review of Cell and Developmental Biology, 18, 495 (2002). 3. He L., Hannon G. J.: Nature Reviews Genetics, 5, 522 (2004). 4. Johnstone R. W., Ruefli A. A., Lowe S. W.: Cell, 108, 153 (2002). 5. Friedman R. C., Farh K. K. H., Burge C. B., Bartel D. P.: Genome Research, 19, 92 (2009). 6. Rhoades M. W., Reinhart B. J., Lim L. P., Burge C. B., Bartel B., Bartel D. P.: Cell, 110, 513 (2002). 7. Calin G. A., Sevignani C., Dan Dumitru C., Hyslop T., Noch E., Yendamuri S., Shimizu M., Rattan S., Bullrich F., Negrini M., Croce C. M.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101, 2999 (2004). 8. Kumar M. S., Lu J., Mercer K. L., Golub T. R., Jacks T.: Nature genetics, 39, 673 (2007). 9. Iorio M. V., Croce C. M.: EMBO molecular medicine, 4, 143 (2012). 10. Lee R. C., Feinbaum R. L., Ambros V.: Cell, 75, 843 (1993). 11. Reinhart B. J., Slack F. J., Basson M., Pasquinelli A. E., Bettinger J. C., Rougvie A. E., Horvitz H. R., Ruvkun G.: Nature, 403, 901 (2000). 12. Pasquinelli A. E., Reinhart B. J., Slack F., Martindale M. Q., Kuroda M. I., Maller B., Hayward D. C., Ball E. E., Degnan B., Muller P., Spring J., Srinivasan A., Fishman M., Finnerty J., Corbo J., Levine M., Leahy P., Davidson E., Ruvkun G.: Nature, 408, 86 (2000). 13. Rodriguez A., Griffiths-Jones S., Ashurst J. L., Bradley

51 A.: Genome Research, 14, 1902 (2004). 14. Zimmerman A. L., Wu S. Y.: Cancer Letters, 300, 10 (2011). 15. Kim Y. K., Kim V. N.: Embo Journal, 26, 775 (2007). 16. Lee Y., Kim M., Han J. J., Yeom K. H., Lee S., Baek S. H., Kim V. N.: Embo Journal, 23, 4051 (2004). 17. Lee Y., Ahn C., Han J. J., Choi H., Kim J., Yim J., Lee J., Provost P., Radmark O., Kim S., Kim V. N.: Nature, 425, 415 (2003). 18. Bernstein E., Caudy A. A., Hammond S. M., Hannon G. J.: Nature, 409, 363 (2001). 19. Yi R., Qin Y., Macara I. G., Cullen B. R.: Genes & development, 17, 3011 (2003). 20. Gwizdek C., Ossareh-Nazari B., Brownawell A. M., Doglio A., Bertrand E., Macara I. G., Dargemont C.: Journal of Biological Chemistry, 278, 5505 (2003). 21. Gregory R. I., Yan K. P., Amuthan G., Chendrimada T., Doratotaj B., Cooch N., Shiekhattar R.: Nature, 432, 235 (2004). 22. Carthew R. W., Sontheimer E. J.: Cell, 136, 642 (2009). 23. Bhayani M. K., Calin G. A., Lai S. Y.: Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 731, 14 (2012). 24. Okamura K., Ishizuka A., Siomi H., Siomi M. C.: Genes & development, 18, 1655 (2004). 25. Lee I., Ajay S. S., Yook J. I., Kim H. S., Hong S. H., Kim N. H., Dhanasekaran S. M., Chinnaiyan A. M., Athey B. D.: Genome Research, 19, 1175 (2009). 26. Krol J., Loedige I., Filipowicz W.: Nature Reviews Genetics, 11, 597 (2010). 27. Winter J., Jung S., Keller S., Gregory R. I., Diederichs S.: Nature Cell Biology, 11, 228 (2009). 28. Su H., Trombly M. I., Chen J., Wang X. Z.: Genes & development, 23, 304 (2009). 29. Doench J. G., Sharp P. A.: Genes & development, 18, 504 (2004). 30. Calin G. A., Ferracin M., Cimmino A., Di Leva G., Shimizu M., Wojcik S. E., Iorio M. V., Visone R., Sever N. I., Fabbri M., Iuliano R., Palumbo T., Pichiorri F., Roldo C., Garzon R., Sevignani C., Rassenti L., Alder H., Volinia S., Liu C. G., Kipps T. J., Negrini M., Croce C. M.: New England Journal of Medicine, 353, 1793 (2005). 31. Li X. H., Zhang Y., Zhang Y. F., Ding J., Wu K. C., Fan D. M.: Gut, 59, 579 (2010). 32. Caramuta S., Egyhazi S., Rodolfo M., Witten D., Hansson J., Larsson C., Lui W. O.: Journal of Investigative Dermatology, 130, 2062 (2010). 33. Ji J. F., Shi J., Budhu A., Yu Z. P., Forgues M., Roessler S., Ambs S., Chen Y. D., Meltzer P. S., Croce C. M., Qin L. X., Man K., Lo C. M., Lee J., Ng I. O. L., Fan J., Tang Z. Y., Sun H. C., Wang X. W.: New England Journal of Medicine, 361, 1437 (2009). 34. Giovannetti E., Funel N., Peters G. J., Del Chiaro M., Erozenci L. A., Vasile E., Leon L. G., Pollina L. E., Groen A., Falcone A., Danesi R., Campani D., Verheul H. M., Boggi U.: Cancer Research, 70, 4528 (2010). 35. Meng F. Y., Henson R., Lang M., Wehbe H., Maheshwari S., Mendell J. T., Jiang J. M., Schmittgen T. D., Patel T.: Gastroenterology, 130, 2113 (2006). 36. Calin G. A., Cimmino A., Fabbri M., Ferracin M., Wojcik S. E., Shimizu M., Taccioli C., Zanesi N., Garzon R., Aqeilan R. I., Alder H., Volinia S., Rassenti L., Liu X., Liu C. G., Kipps T. J., Negrini M., Croce C. M.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105, 5166 (2008).

52

PAPERS

Shrnutí vzniku a mechanismu rezistence vůči těžkým kovům

Matěj Sklenářa, Dagmar Chudobováa, Kristýna Číhalováa, Marie Konečnáa,b, Vojtěch Adama,b, René Kizeka,b a b


REVIEW: General Mechanisms of Microbial resistance to metals In this review is presented general mechanism of bacterial resistence against metals. Bacteria was adapting to outer conditions during the evolotion. Ability of resistence is carried by genetic informations in DNA which may be located in different parts of cell. According to character of resistence there are different localization of genetic information where metal resistance is coded. It dependes on the fact if the metal is essential or non-essential (plasmid, chromosome, transposome). There are six postulated mechanisms of metal resistence in microorganisms, metal exclusion by permeability barrier, active transport of metal away from the cell, intracellular sequeatration of the metal by protein biding, extracellular sequestration, enzymatic detoxification to less toxic form, reduction in metal sensitivity of cellular targets. Přijato k publikování: 27. 2. 2014 Klíčová slova: bakteriální rezistence, mechanismus rezistence, těžké kovy, toxicita kovů

Úvod Bakteriální rezistence představuje závažný globální problém pro lidskou populaci, nejvíce v oblasti zdravotnictví1. Týká se všech hlavních bakteriálních patogenů, které se snadno šíří pomocí kapénkové infekce2. V dnešní době se napříč odbornou zdravotnickou veřejností diskutuje o antibiotické rezistenci jako o zásadním problému. V posledních letech probíhá výzkum léčiv alternativních k dosud využívaným antibiotikům3. Antimikrobiální účinky kovů jsou známé již z minulosti a díky moderním technikám na bázi nanotechnologie je možné vytvářet jejich nanočástice, čímž je dosaženo zvýšené antimikrobiální aktivity4. Nanočástice se díky svým velmi malým rozměrům a velkou aktivní plochou ve srovnání s běžnými částicemi kovů snáze distribuují v lidském organismu 5. Pro udržení funkčnosti těchto léčiv po co nejdelší dobu je nutné zahájit výzkum zabývající se vznikem bakteriální rezistence vůči iontům těžkých kovů. Výzkum vychází ze základních poznatků, jako princip vstupu kovu do buňky a mechanismus, kterým kov buňku eliminuje 6. Dalším cenným zdrojem informací jsou poznatky z oboru ekologie, kde bylo vynaloženo velkých prostředků na výzkum bakteriálních kmenů v oblastech znečištěných těžbou kovů apod. Antibiotická i kovová rezistence jsou obě geneticky podmíněné, jejich informace je uložena v některé z buněčných částí. Geny uložené v chromosomech, plasmidech nebo transpozomech kódují rezistenci vůči

specifickému kovu 7. Většina kovů však esenciálních není a jsou pro bakterie potenciálně toxické. Při vysoké koncentraci jsou i esenciální kovy pro buňku toxické a mohou narušovat cytoplazmatickou membránu 8. Přítomnost kovů v půdě vytváří stresové podmínky pro bakteriální kmeny. Tento proces vede k postupnému vývoji rezistence k téměř všem toxickým kovům 9. Bakteriální rezistence vůči kovům je heterogenní jak v biochemické, tak genetické podstatě. Od 70. let minulého století bylo identifikováno několik mikroorganismů rezistentních vůči kovům. Tyto studie se týkaly především aerobních bakterií Staphylococcus sp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Bacillus sp.10-14. Systém kovové rezistence se pravděpodobně vyvinul krátce po vzniku prokaryotického života a v současnosti se nachází téměř u všech bakteriálních druhů 15. Kovová rezistence v mnoha případech spojena s antibiotickou10,16-18. Tyto dvě rezistence jsou distribuovány mezi jinými populacemi konjugací nebo transdukcí 12.

Mechanismus toxicity kovu a vstup kovu do buňky Mechanismus toxicity kovů v buňce je dán interakcí konkrétního kovu se specifickým biologickým druhem9. Kovy vstupují do buňky dvěma způsoby 19. Prvním způsobem, skrze nespecifické transportéry, se do buňky dostávají nejen esenciální, ale i těžké kovy 20. Tato cesta umožňuje rychlý transport kovů do

Sklenář et al.

buňky přes cytoplazmatickou membránu, je řízena chemoosmotickým gradientem buňky 21. K transportu kovu do buňky však dochází i ve stavu přebytku kovu v buňce. Tento systém se nazývá „open gate“, při tomto transportu může dojít k průniku těžkého kovu do buňky a oškodit ji. Druhý způsob, specifický transport iontů, který je oproti prvně jmenovanému pomalejší, spotřebovává energii a probíhá pouze v situaci potřeby, jako je nedostatek výživy či jiných esenciálních látek22. Hlavním mechanismem toxicity je lipidová peroxidace, kdy probíhá přímá reakce kyslíku s vícenenasycenými mastnými kyselinami, částmi lipidové membrány, vedocí k tvorbě radikálových meziproduktů. Tyto radikály snadno reagují s orgány buňky a dochází k jejich poškození. Železo nebo měď mohou fungovat jako katalyzátory reakcí, při kterých dochází k tvorbě radikálů. Ve výsledku dochází k tvorbě vysoce toxických hydroxylových radikálů. Tyto radikály jsou vysoce reaktivní a interagují s jakýmikoliv biologickými molekulami v bezprostředním okolí. Kovové ionty snižují nebo zvyšují enzymatickou aktivitu nebo mění enzymovou specifitu pomocí indukční konformace.

Regulace esenciálních a neesenciálních kovů rozdílnými způsoby Některé kovy jsou důležité pro výživu buňky, nazýváme je esenciální, v nadbytku však mohou být toxické 15. Působení kovu na buňku tedy není pouze negativní. Esenciální kovy (např. kobalt, měď a nikl) fungují ve stopovém množství jako redoxní činitelé k stabilizaci molekul nebo při elektrostatické interakci jako součást enzymů pro regulaci osmotického tlaku. Mezi rezistencí zprostředkovanou chromosomy a plasmidy jsou značné rozdíly. Gen rezistence na chromosomu obvykle zodpovídá za regulaci nadbytku esenciálních kovů a mechanismus je složitější než u plasmidu. Gen rezistence obsažený v plasmidu pak odpovídá za ochranu před ionty neesenciálních toxických kovů, jedná se o efluxní mechanismus. Efluxní mechanismus přenášený plasmidem zajišťuje snadnou mobilitu v buňce a přenos mezi jednotlivými jedinci, zároveň pro buňku neznamenají zátěž v podobě dalších genů a jsou použity pouze v případech potřeby 23. Mechanismy rezistence neseny pomocí DNA plasmidu jsou nejběžnější, velmi specifické a byly nalezeny u téměř všech studovaných skupin eubakterií 24,25. Rezistence vůči kovu a zároveň antibiotiku může být zprostředkována jedním plasmidem 10.

53

Způsoby ochrany buňky Buňka se stává rezistentní za účelem ochrany citlivých míst své struktury, toho docílí různými způsoby. Rezistence v buňce může mít různý rozsah, to závisí na následujících faktorech: počet a druh systémů, kterými je kov přijímán15, způsob interakce kovu v metabolickém systému buňky, funkce kovu v buňce (esenciální x neesenciální) a také schopnost kazety genové rezistence plně se projevit23. Počet faktorů ovlivní způsob a stupeň ochrany.

Obecné mechanismy rezistence Je zprostředkována jedním nebo více geny kódovanými chromosomy, plasmidy nebo transposomy. Buňka zajišťuje rezistenci vůči kovům zabráněním nebo omezením přístupu kovu k citlivým částem buňky nebo snížením citlivosti daných částí buňky. Je stanoveno 6 obecných biochemických mechanismů, které se podílejí na výsledné rezistenci bakterií 9,23. Jedná se o vyloučení kovu pomocí propustné bariéry; vyloučení kovu pomocí aktivního transportu z buňky; vnitrobuněčné fyzické odloučení kovu pomocí obalení kovu proteinem, vedoucí k zabránění narušení části buňky, které jsou vůči kovům citlivé; mimobuněčná sekvestrace (vyloučení); průběh chemické reakce, v níž se toxická aktivita kovu sníží a v neposlední řadě snížení citlivosti cílových orgánů buňky, které jsou náchylné vůči působení kovů. Chemická reakce vedoucí ke snížení toxicity dané buňky probíhá zvýšením aktivity alternativní (přepínací) metabolické cesty, která zajišťuje relativní rezistenci vůči kovům. Různé mechanismy rezistence mohou působit samostatně nebo mohou participovat na rezistenci vůči různým kovům v jednom druhu26. Specifická obrana těchto citlivých buněk může být dosažena čtyřmi způsoby: mutací citlivých částí buňky vedoucí k snížení senzitivity bez výrazného ovlivnění jejich běžné funkce; navýšením množství struktur náchylných na kov, buňka tak vytvoří prostor, kde toxická aktivita působí, ale nezničí prostor celý; opravou buněčných komponent, v praxi možné pouze pro DNA 27 nebo upravením metabolické cesty za využití plasmidu obsahujícího genetickou informaci pro rezistenci, tak aby toxická aktivita nepůsobila na chromosomální složku, jež odpovídá za slabost buňky 28. Tento mechanismus je analogický antibiotické rezistenci proti trimetoprimu.


54

Závěr Bakteriální rezistence vzniká přizpůsobením mikroorganismu stresovým podmínkám okolí. Pro úspěšné zavedení kovů nebo jejich nanočástic jako antiseptického činidla místo antibiotik v boji proti bakteriím je nutné znát přesný mechanismus rezistence. Pro stanovení typu mechanismu rezistence by bylo nutné sledovat přímý vývoj tohoto mechanismu. Z teoretických poznatků zmíněných v tomto příspěvku lze odvodit, že pokud by byla sledována genetická informace kultury, která není rezistentní vůči kovu a kultury vystavené umělým stresovým podmínkám v podobě přídavku malé koncentrace kovu v pravidelných intervalech, mělo by docházet u této „stresované“ kultury k tvorbě rezistence, a tudíž genovým změnám. V případě zkoumání kovu esenciálního pro bakterie by docházelo ke změnám na chromosomální DNA a v případě neesenciálních kovů v kruhové DNA plasmidu. Sledováním změn v sekvenci nukleových kyselin odpovědných za rezistenci by bylo možné zcela pochopit její mechanismus. Tato práce byla podpořena grantem NanoCeva TA ČR TA01010088.

Literatura

1. Paterson G. K., Harrison E. M., Holmes M. A.: Trends in Microbiology, 22, 42 (2014). 2. O‘Grady K. A. F., Whiley D. M., Torzillo P. J., Sloots T. P., Lambert S. B.: Bmc Infectious Diseases, 13, (2013). 3. Rasool R., Hasnain S., Nishat N.: Designed Monomers and Polymers, 17, 217 (2014). 4. Magdolenova Z., Collins A., Kumar A., Dhawan A., Stone V., Dusinska M.: Nanotoxicology, 8, 233 (2014). 5. Kanmani P., Rhim J. W.: Food Chemistry, 148, 162 (2014). 6. Passow H., Rothstein A.: Journal of General Physiology, 43, 621 (1960). 7. Altimira F., Yanez C., Bravo G., Gonzalez M., Rojas L. A., Seeger M.: Bmc Microbiology, 12, (2012). 8. Gutteridge J. M. C., Halliwell B.: Trends in Biochemical Sciences, 15, 129 (1990). 9. Rouch D. A., Lee B. T. O., Morby A. P.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 132 (1995). 10. Nakahara H., Ishikawa T., Sarai Y., Kondo I., Kozukue H., Silver S.: Applied and Environmental Microbiology, 33, 975 (1977). 11. Marques A. M., Congregado F., Simonpujol D. M.: Journal of Applied Bacteriology, 47, 347 (1979). 12. Harnett N. M., Gyles C. L.: Applied and Environmental Microbiology, 48, 930 (1984). 13. Belliveau B. H., Starodub M. E., Trevors J. T.: Canadian Journal of Microbiology, 37, 513 (1991). 14. Wang Y. T., Shen H.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 159 (1995). 15. Silver S., Ji G. G.: Environmental Health Perspectives, 102, 107 (1994).

16. Harnett N. M., Gyles C. L.: Applied and Environmental Microbiology, 48, 930 (1984). 17. McEntee J. D., Woodrow J. R., Quirk A. V.: Applied and Environmental Microbiology, 51, 515 (1986). 18. Schwarz S., Blobel H.: Journal of Veterinary Medicine Series B-Zentralblatt Fur Veterinarmedizin Reihe B-Infectious Diseases and Veterinary Public Health, 36, 669 (1989). 19. Nies D. H., Silver S.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 186 (1995). 20. Schreurs W. J. A., Rosenberg H.: Journal of Bacteriology, 152, 7 (1982). 21. Nieboer E., Richardson D. H. S.: Environmental Pollution Series B-Chemical and Physical, 1, 3 (1980). 22. Nies D. H.: Applied Microbiology and Biotechnology, 51, 730 (1999). 23. Silver S., Walderhaug M.: Microbiological Reviews, 56, 195 (1992). 24. Misra T. K., Brown N. L., Fritzinger D. C., Pridmore R. D., Barnes W. M., Haberstroh L., Silver S.: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences, 81, 5975 (1984). 25. Ji G. Y., Silver S.: Journal of Industrial Microbiology, 14, 61 (1995). 26. Bagg A., Neilands J. B.: Biochemistry, 26, 5471 (1987). 27. Braun V., Gunter K., Hantke K.: Biology of Metals, 4, 14 (1991). 28. Cervantes C., Silver S., Inorganic cation and anion transport-systems of Pseudomonas, Amer Soc Microbiology, Washington, 1990.

PAPERS

Prionové proteiny a jejich interakce s těžkými kovy Eliška Sedláčkováa, Alžběta Cardováa, Vojtěch Adama,b, René Kizeka,b a b


Prion proteins and its interaction with heavy metals In this study we attempted to characterize cellular prion-like protein (PrPC) properties and its possible interactions with metal ions. In the first part of this study we described the structure of prion-like protein, its biochemical properties and its role in human or animal organism. In the next and the most important part we summarized accessible information about the metals and heavy metals which can bind prion-like protein. Especially the heavy metals could have really important role in the process of protein misfolding, but this role is still unknown. In the last section we focused on transmissible spongiform encephalopathies, their incubation period and clinical signs. Přijato k publikování: 28. 2. 2014 Klíčová slova: kovy, prionová onemocnění; prionový protein, PrPC, PrPSc, těžké kovy, TSE

Úvod Buněčný prionový protein (PrP ) je povrchový protein kotvený do buněčného povrchu glykosylfosfatidylinositolovou kotvou (GPI). Role tohoto proteinu v lidském těle není prozatím objasněna1. Protein je na buněčný povrch vázán glykosidickou vazbou se dvěma asparaginovými zbytky a disulfidovým můstkem2. PrPC je lokalizován na buněčném povrchu a podílí se na procesech příjmu ligandu a na transmembránové signalizaci3. PrPC je u savců kódován sekvencí chromozomálního genu PRNP a o daném kmenu produkovaného PrPC rozhoduje část genu, která je replikována jako poslední4. Experimenty s tkáňovou kulturou mozečku ukazují, že buňky, kterým chybí PrPC jsou mnohem náchylnější k oxidačnímu stresu a snadno podléhají buněčné smrti3. Existuje několik různých prionových kmenů, které se vyskytují u většiny živočišných druhů 5. Priony jako takové vyvolaly hojnou diskuzi až v roce 1986, kdy ve Velké Británii propukla nemoc zvaná BSE – Bovinní spongioformní encefalopatie 6. C

Prionový protein (PrPC) Prionový protein může existovat ve dvou formách, buď jako přirozený buněčný protein (PrPC), nebo ve své patologické izoformě (PrPSc). Mezi těmito dvěma formami proteinu nemohou být detekovány žádné sekvenční rozdíly, ale jejich rozdílné vlastnosti se mohou projevit rozdílnou konformací

proteinu7. Stejně jako ostatní membránové proteiny je PrPc syntetizován na drsném endoplazmatickém retikulu (ER) a transportován pomocí Golgiho aparátu na buněčný povrch 8. Buněčný prionový protein (PrPC) je z převážné části tvořen α-helikální strukturou a je kódován genem PRPN na 20. chromosomu. PrP C je monomerický a štěpitelný proteázou. Infekční (pozměněná) forma prionového proteinu (PrPSc) je z 45% tvořena strukturou β-skládaného listu a z 30 % α-helixem. PrPSc tvoří nerozpustné agregáty a je odolný vůči štěpení proteinázou K 9,10.

Patogenní forma prionového proteinu (PrPSc) V porovnání se znalostmi o PrPC toho o PrPSc víme jen velmi málo. To stejné platí i o mechanismu přeměny PrPC na PrPSc. Toxicita PrPSc je spojována s procesem uvolňování vápníku z endoplazmatického retikula a se zrychlenou regulací několika chaperonů ER. Rozsah prionové replikace úzce koreluje se zrychlenou regulací u ER chaperonových proteinů, které podléhají stresu11. Rozdílem PrPSc oproti PrPC je jeho již zmíněná rezistentnce vůči proteináze K, fosfolipáze C a také k vysokým teplotám. PrPSc má stálý metabolismus, je nerozpustný v detergentech a ve vodě, také má silnou schopnost agregovat a polymerizovat. Tento protein je u infikovaných jedinců přítomen v počtu, který je úměrný stádiu infekce12. Štěpná reakce PrPSc probíhá nejspíš v endozomech či lyzozomech. Na rozdíl od

55

56


proteolytického postranslačního štěpení PrPC, však PrPSc narušuje amyloidogenní a neurotoxickou oblast polypeptidového řetězce 13. V případě dědičných prionových chorob vznikají abnormální formy PrPSc vlivem mutací v PRNP genu 14. K identifikaci rozdílných kmenů PrPSc slouží jejich biochemické vlastnosti jako glykosylace, elektroforetická pohyblivost, rezistence vůči proteáze či sedimentace 5.

Interakce prionových proteinů s esenciálními kovy Ionty přechodných kovů, jako je měď, železo nebo mangan, jsou známy tím, že se obecně podílí na oxidačních a zánětlivých procesech. Tyto procesy se často vznikají při stárnutí a vývoji neurodegenerativních chorob, jako je Parkinsonova či Alzheimerova choroba a amyotrofická laterální skleróza 15. V průběhu posledních tří desetiletí přitahuje úloha kovových iontů při vývoji TSE zvýšenou pozornost. Již v roce 1970 bylo zjištěno, že chelatace Cu2+ může vyvolávat histopatologické změny velmi podobné scrapii 16. Také je velmi dobře známo, že PrPC může tvořit vazby s mědí a dokonce může být izolován pomocí afinitní měděné kolony. Četné studie využívaly rekombinantní prionový protein k měření vazebné afinity různých sekvencí aminokyselin prionového proteinu na měď. Ačkoli se navrhované vazebné afinity liší, většina vědců se shoduje, že měď se specificky váže na oblast oktapeptidu k N-konci prionového proteinu. Doplňkové studie ukázaly, že zvýšená exprese PrPC má za následek vyšší vazby mědi v membránové frakci, což dále podporuje představu o tom, že PrPC je přenašeč mědi17. Již dříve bylo dokázáno, že měď vázaná na PrPC může být přijata do buněk 18. Regulace dodávek mědi prostřednictvím endocytózy PrPC z buněčného povrchu do endozomu probíhá vlivem změn pH. Vědci se domnívají, že měďnaté ionty mohou usnadňovat nebo inhibovat a to – buď agregaci patogenních prionových proteinů, nebo konverzi PrPC na PrPSc 19. Je také známo, že mědí vázané proteiny mohou často vázat i jiné dvojmocné kationty – například zinek a to pouze za určitých okolností. Schopnosti PrPC vázat další kationty jsou stále předmětem mnoha studií. Rekombinantní prionové proteiny za normálních okolností nevykazují vysokou afinitu vůči zinku 18. Zinek je kromě mědi jediný kov, jenž vyvolává u PrPC endocytózu. Stejně tak jako měď může inhibovat tvorbu fibril a podporovat intermolekulární interakce 11.

Interakce prionových proteinů s těžkými kovy Kadmium (Cd) je kov kontaminující životní prostředí a to buď přirozeně, nebo vlivem průmyslové výroby. Toxicita kadmia je historicky velmi úzce spjata s homeostázou zinku a oxidativním stresem v buňkách savců. Z tohoto důvodu je možné, že existuje jeho spojení i s prionovými proteiny, které mají taktéž svou roli v regulaci oxidativního stresu. Rozšířený výskyt kadmia v životním prostředí představuje nadále hrozbu pro lidské zdraví a to i přes snahu omezit jeho technické využití. Biologicky významná iontová forma kadmia – Cd2+ váže mnoho biologických molekul a tyto interakce jsou základem mechanismu, který způsobuje toxicitu kadmia. Je také velmi pravděpodobné, že toxicita kadmia je nejčastěji zprostředkována biologickými systémy zesilovanými signály, jež se spouští přítomností Cd2+ kationtů 20.

Prionová onemocnění Prionové choroby, nazývané také přenosné spongiformní encefalopatie (TSE) jsou skupinou onemocnění, která ovlivňují mozek a nervovou soustavu člověka a zvířat10. U lidí tato skupina zahrnuje například Creutzfeld-Jakobovu nemoc a u zvířat bovinní spongiformní encefalopatii (BSE), chronické chřadnutí jelenovitých (CWD) a scrapii 9. Tyto choroby mají jedinečný mechanismus přenosu a přesto, že jsou poměrně vzácné, jsou i velmi obávané. V poslední době se objevila nová variantní forma CJD (vCJD), která byla spojena s konzumací masa kontaminovaného BSE. Tato skutečnost postavila priony do úplně nového světla 7. Prionová onemocnění se mohou dále také projevit jako sporadické, genetické nebo jako infekční neurodegenerativní poruchy10. Prionová infekce je obvykle zahájena v periferních orgánech, ale mechanismy podílející se na infekcí rozšířených do mozku nejsou prozatím úplně objasněny 9. Hlavním rysem těchto chorob je post-translační konverze buněčného prionového proteinu PrPC do jeho abnormální izoformy označované jako PrPSc 21. Stanley B. Prusiner pojmenoval tuto pozměněnou formu jako takzvaný prion, což bylo označení malé proteinové infekční částice, která postrádá genomicky kódované nukleové kyseliny 10. Primárním symptomem lidského prionového onemocnění je demence. Demence je obvykle doprovázena ještě projevy motorické dysfunkce, jako je cereberální ataxie, myoklonie a pyramidální či extrapyramidální znaky8. Infekční šíření prionů

Sedláčková et al.

probíhá přes PrPSc formu přeměny endogenního fondu PrPC molekul. Tento proces samostatného množení proteinů se vyskytuje analogicky i u ostatních druhů 22. Jak bylo řečeno již dříve, prionová onemocnění dělíme na dva druhy-lidské a zvířecí 23.

Prionová onemocnění člověka Creuzfeldt-Jakobova choroba (CJD) Creuzfeldt-Jakobova choroba (CJD) je rychlé progresivní spongiformní neurodegenerativní onemocnění centrálního nervového systému. Mezi základní symptomy této choroby patří demence, ataxie a myoklonie. V jedné třetině případů se toto onemocnění může z počátku projevovat nespecifickými psychiatrickými symptomy, jako je únava, úzkost nebo změna osobnosti 24. Rozeznáváme 4 druhy CJD: Sporadická CJD (sCJD) – spontánní proteinová transformace nebo mutace somatické buňky, která je zodpovědná za 85 % případů této choroby. Genetická/familiární CJD (fCJD) – vzniká v důsledku familiární mutace, je dědičná a zodpovídá přibližně za 15 % případů tohoto onemocnění. Získaná/Iatrogenní CJD (iCJD) – způsobená kontaktem s infikovanou tkání (méně jak 1% případů). Například „kuru“ – nákaza je možná rituálním kanibalismem nebo při zdravotnických zákrocích, avšak tyto případy jsou ojedinělé. Variantní CJD (vCJD) – po požití masa ze zvířat nakažených bovinní spongiformní encefalopatií 25. Fatální familiární insomnie (FFI) Toto onemocnění bylo poprvé popsáno v roce 1986 26, avšak jeho genetická podstata byla objevena až v roce 1992. FFI se projevuje nespavostí, ataxií, dysartrií, později nastupuje myoklonie a mohou se objevit i pyramidové příznaky 27. Ke konci choroby nastupuje úplná insomnie s těžkou demencí, dystonií, rigiditou a mutismem. Příčinou tohoto onemocnění je mutace D178N asociovaná s methioninem v pozici 129 28. Gerstmannův-Sträusslerův- Scheinkerův syndrom (GSS) Jedná se o autozomálně dominantní onemocnění, jehož příznaky se poprvé objevují zpravidla ke konci čtvrtého decennia. Onemocnění má delší dobu trvání

57

než například výše zmíněná CJD. Typickým symptomem pro onemocnění je ataxie s poruchami chůze. Dalšími příznaky mohou být bolestivé parestezie a dyestezie či pruritus. GSS může probíhat také atypicky. Byly popsány případy geneticky potvrzené GSS, avšak probíhající pod obrazem sporadické CJD či progresivní supranukleární obrny. První rozpoznanou mutací zodpovědnou za GSS je P102L. Tato mutace byla zjištěna rovněž u původní rodiny a popsána Gerstmannem 29.

Prionová onemocnění u zvířat Bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) Tato choroba, často nazývaná jako „nemoc šílených krav,“ se poprvé objevila ve Velké Británii 30. Spongiformní degenerace tkání se u této choroby vyskytuje v infikovaném mozku bez zánětlivé odezvy. Z tohoto důvodu nejsou v krevním séru ani mozkomíšním moku přítomny specifické protilátky. Inkubační doba je různá a může trvat i několik let 31. Bovinní spongiformní encefalopatie je chorobou, která spadá pod povinnost ohlášení v případě výskytu nákazy, a u které je pečlivě kontrolována likvidace mozků nakažených zvířat 32. Scrapie Scrapie se řadí mezi přenosné spongiformní encefalopatie (TSE), které se vyskytují převážně u ovcí a koz. Tato nemoc neurologického původu způsobuje u ovcí a koz změny chování, citlivosti a pohybu. Scrapie jako taková má spíše pomalý průběh a klinické příznaky nejsou často rozeznatelné od jiných neurologických diagnóz u malých přežvýkavců 33. Sledování změn v lymforetikulárním systému ovcí se scrapií bylo prováděné pomocí expresní profilární studie několika genů 33.

Závěr Studium prionových proteinů je stále aktuální téma a v poslední době se jim věnuje zvýšená pozornost. Prionové proteiny způsobují také řadu onemocnění, jak již bylo zmíněno výše a případná léčba těchto onemocnění je stále ve fázi výzkumu. Jedná se o infekční částice, které jsou tvořeny pouze bílkovinou. Existuje spousta medikamentů, které zmírní symptomy, avšak nemoc zcela nevyléčí. Z našeho pohledu jsou velmi důležité interakce s kovy esenciálními a těžkými. Vzhledem k tomu, že je PrPC kov-vázající protein je velmi pravděpodobné, že se budou kovy podílet na mechanismech přeměny nepatogenní formy prionů


58

(PrPC) na svou patogenní formu (PrPSc). Interakce prionů a těžkých kovů není ještě dostatečně prozkoumána a z tohoto důvodu bychom se v budoucnu rádi věnovali právě výzkumu této problematiky. Nejen esenciální, ale i těžké kovy se mohou zapojovat do procesů probíhajících v organismu. Jejich ovlivnění těchto dějů však může být větší, než bychom očekávali. Z esenciálních kovů je velice důležitá měď, kterou PrPC váže v metabolismu přirozeně. Tato práce byla financována z projektu (CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068)

Literatura 1

2

3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16

S. Mouillet-Richard, M. Ermonval, C. Chebassier, J. L. Laplanche, S. Lehmann, J. M. Launay, O. Kellermann, Science 2000, 289, 1925-1928 DOI 10.1126/ science.289.5486.1925. S. Kralovicova, S. N. Fontaine, A. Alderton, J. Alderman, K. V. Ragnarsdottir, S. J. Collins, D. R. Brown, Molecular and Cellular Neuroscience 2009, 41, 135-147 DOI 10.1016/j.mcn.2009.02.002. D. R. Brown, W. J. SchulzSchaeffer, B. Schmidt, H. A. Kretzschmar, Experimental Neurology 1997, 146, 104-112 DOI 10.1006/exnr.1997.6505. S. B. Prusiner, M. R. Scott, S. J. DeArmond, F. E. Cohen, Cell 1998, 93, 337-48. R. Morales, K. Abid, C. Soto, Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease 2007, 1772, 681-691 DOI 10.1016/j.bbadis.2006.12.006. M. E. Arnold, J. W. Wilesmith, Preventive Veterinary Medicine 2004, 66, 35-47 DOI 10.1016/j. prevetmed.2004.07.007. C. W. Yi, W. C. Xu, J. Chen, Y. Liang, Acta Biochimica Et Biophysica Sinica 2013, 45, 520-526 Doi 10.1093/ Abbs/Gmt052. D. A. Harris, Clinical Microbiology Reviews 1999, 12, 429-+. B. Fevrier, D. Vilette, F. Archer, D. Loew, W. Faigle, M. Vidal, H. Laude, G. Raposo, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004, 101, 9683-9688 DOI 10.1073/pnas.0308413101. Z. Zhou, G. F. Xiao, Acta Biochimica Et Biophysica Sinica 2013, 45, 465-476 Doi 10.1093/Abbs/Gmt027. E. D. Walter, D. J. Stevens, M. P. Visconte, G. L. Millhauser, Journal of the American Chemical Society 2007, 129, 15440-+ Doi 10.1021/Ja077146j. D. Dormont, Febs Letters 2002, 529, 17-21 Pii S00145793(02)03268-4 Doi 10.1016/S0014-5793(02)032684. S. G. Chen, D. B. Teplow, P. Parchi, J. K. Teller, P. Gambetti, L. Autiliogambetti, Journal of Biological Chemistry 1995, 270, 19173-19180. E. Gaggelli, H. Kozlowski, D. Valensin, G. Valensin, Chemical Reviews 2006, 106, 1995-2044 Doi 10.1021/ Cr040410w. S. Lehmann, Current Opinion in Chemical Biology 2002, 6, 187-192 Doi 10.1016/S1367-5931(02)00295-8. A. Rana, D. Gnaneswari, S. Bansal, B. Kundu, ChemicoBiological Interactions 2009, 181, 282-291 DOI

10.1016/j.cbi.2009.07.021. 17 C. J. Choi, A. Kanthasamy, V. Anantharam, A. G. Kanthasamy, Neurotoxicology 2006, 27, 777-787 DOI 10.1016/j.neuro.2006.06.004. 18 D. R. Brown, Brain Research Bulletin 2001, 55, 165-173 Doi 10.1016/S0361-9230(01)00453-1. 19 S. P. Leach, M. D. Salman, D. Hamar, Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 2006, 7, 97-105 10.1017/ S1466252307001181. 20 J. M. Moulis, Biometals 2010, 23, 877-896 DOI 10.1007/ s10534-010-9336-y. 21 J. D. F. Wadsworth, J. Collinge, Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease 2007, 1772, 598-609 DOI 10.1016/j.bbadis.2007.02.010. 22 E. Biasini, J. A. Turnbaugh, U. Unterberger, D. A. Harris, Trends in Neurosciences 2012, 35, 92-103 DOI 10.1016/j.tins.2011.10.002. 23 M. Glatzel, E. Abela, M. Maissen, A. Aguzzi, The New England journal of medicine 2003, 349, 1812-20 10.1056/NEJMoa030351. 24 F. Coppede, M. Mancuso, G. Siciliano, L. Migliore, L. Murri, Bioscience reports 2006, 26, 341-67 10.1007/ s10540-006-9028-6. 25 R. G. Macfarlane, S. J. Wroe, J. Collinge, T. A. Yousry, H. R. Jager, Journal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry 2007, 78, 664-670 DOI 10.1136/ jnnp.2006.094821. 26 E. Lugaresi, F. Cirignotta, P. Montagna, Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry 1986, 49, 37580. 27 R. Medori, H. J. Tritschler, A. Leblanc, F. Villare, V. Manetto, H. Y. Chen, R. Xue, S. Leal, P. Montagna, P. Cortelli, P. Tinuper, P. Avoni, M. Mochi, A. Baruzzi, J. J. Hauw, J. Ott, E. Lugaresi, L. Autiliogambetti, P. Gambetti, New England Journal of Medicine 1992, 326, 444-449 Doi 10.1056/Nejm199202133260704. 28 L. Monari, S. G. Chen, P. Brown, P. Parchi, R. B. Petersen, J. Mikol, F. Gray, P. Cortelli, P. Montagna, B. Ghetti, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994, 91, 2839-42. 29 S. Collins, C. A. McLean, C. L. Masters, Journal of clinical neuroscience : official journal of the Neurosurgical Society of Australasia 2001, 8, 387-97 10.1054/ jocn.2001.0919. 30 S. B. Prusiner, Trends in Biochemical Sciences 1996, 21, 482-487 Doi 10.1016/S0968-0004(96)10063-3. 31 T. A. Holt, J. Phillips, British medical journal 1988, 296, 1581-2. 32 J. W. Wilesmith, G. A. Wells, M. P. Cranwell, J. B. Ryan, The Veterinary record 1988, 123, 638-44. 33 T. Konold, L. Phelan, Journal of visualized experiments : JoVE 2014, 10.3791/51101.

PAPERS

Biosyntéza kvantových teček

Alexandra Donovalováa, Markéta Komínkováa, Ondřej Zítkaa,b, René Kizeka,b a b


Biosynthesis of quantum dots Nanoparticles are used in a wide range of disciplines due to their properties. The most common preparation is by physical and chemical synthesis, which uses a toxic chemicals that are not environmentally friendly and also limits the potential of the nanoparticles in their clinical applications. It is because of the negative properties of nanoparticles prepared by classical synthesis that a new type of synthesis comes to the fore. This is made possible by the ability of organisms to biosynthesize the nanoparticles either in the body or in the environment. Ability of the biosynthesis was demonstrated in a variety of microorganisms, but also in arthropods or even in mammals. Biosynthesis ability of organisms can be used both for the preparation of nanoparticles and for the reduction of contamination, since the raw materials for the synthesis are obtained from the environment. Biosynthesis by microorganisms could be a suitable alternative to conventional synthesis of quantum dots, mainly due to their low demands on the feedstock and the resulting biocompatibility of nanoparticles. Přijato k publikování: 12. 3. 2014 Klíčová slova: biosyntéza, CdTe, Escherichia coli (E. coli), kvantové tečky, kvasinky, toxicita, žížala

Úvod Nanočástice jsou vzhledem ke svým vlastnostem a možnostem využití nejvyhledávanější v mnoha oblastech, především v optice, elektronice, zemědělství, životním prostředí a v medicíně. Jsou přibližně 1 – 100 nm velké. Nanočástice mohou být syntetizovány pomocí fyzikálních, chemických a biologických procesů. Mohou mít tvar koule, trojúhelníku, šestiúhelníku, tyčinek, drátů nebo trubek. Při fyzikální a chemické syntéze nanočástic se používají toxické a chemické látky, které nejen že zatěžují životní prostředí, ale také omezují jejich klinickou aplikaci1. Je dobře známo, že elektronické, katalytické a optické vlastnosti nanočástic jsou do značné míry ovlivňovány jejich velikostí, tvarem a strukturou2. Novým směrem pro syntézu nanočástic je biosyntéza, díky které vznikají nanočástice s vysokou biokompatibilitou. Další výhodou je možnost využití organismu v remediacích. Pro biosyntézu se využívá mnoho živočišných organismů. Právě biosyntéza je v současné době velmi diskutovaným tématem.

Kvantové tečky Kvantové tečky (QDs) jsou nanočástice z polovodičových materiálů, které se skládají ze stovek až několika tisíc atomů. Vyznačují se fluorescenčními vlastnostmi, jejich excitační a emisní spektrum je dáno jejich veli-

kostí. Jejich všestranné využití lze uplatnit při mnoha příležitostech. Velký potenciál zaznamenávají QDs v zobrazovacích technikách v medicínských oborech3. Toxicita kvantových teček je u různých organismů rozdílná. Např. u améb (měňavek) nebyl detekován žádný vliv na růst buněk a QDs neměly žádný toxický účinek na buněčnou signalizaci a motilitu buněk; u rostlin se zjistilo, že poměr snížení hladiny glutathionu (GSH) vzhledem k oxidovanému glutathionu (GSSG) ukazuje, že kvantové tečky způsobují oxidativní stres; u zvířat mohou kvantové tečky ohrozit nejen mitochondrie, ale i vývoj endoteliálních buněk a mohou vést až k apoptóze4. Absorpce, distribuce, metabolismus, vylučování a toxicita kvantových teček závisí na řadě faktorů odvozených z fyzikálně-chemických vlastností a podmínek životního prostředí, koncentrace, náboje, velikosti kvantových teček, mechanické stabilitě a v neposlední řadě i na jejich složení5. CdTe kvantové tečky jsou jedny z nejvíce syntetizovaných a jsou široce využívány v průmyslových a biomedicínských aplikacích díky jejich fotoluminescenci ve viditelné části spektra. Ukázaly se jako slibné při zobrazování v živých buňkách. CdTe kvantové tečky emitují v zelené oblasti viditelného spektra. Mají mnoho výhod jako je dobrá fotostabilita, dostatečné kvantové výtěžky 6.

59


60

Biosyntéza Biosyntéza je jednou z nových možností pro syntézu nanočástic. Mezi její hlavní výhody patří biokompatibilita a schopnost získání surovin z půdního prostředí. Biologické systémy nabízejí jedinečné a slibné nanomateriály, které mají předem určené vlastnosti. Na rozdíl od fyzikální či chemické syntézy je biosyntéza šetrná k životnímu prostředí7. Biosyntéza nanočástic může být spuštěna několika sloučeninami, jako jsou karbonylové skupiny, terpenoidy, fenoly, aminy, amidy, bílkoviny, barviva, alkaloidy a jiná redukční činidla přítomna v biologických extraktech8. Mezi organismy, které jsou schopny syntetizovat kvantové tečky, patří například bakterie (Escherichia coli, Rhodobacter sphaeroides, Klebsiella pneumoniae), kvasinky (Saccharomyces cerevisiae, Rhodosporidium diobovatum), houby (Fusarium oxysporum) nebo žížaly (Lumbricus rubellus, Eisenia fetida)9,10,8. Ačkoli organismy byly vytvořeny různé varianty kvantových teček (ZnS, PdS, CdS a CdSe) mezi nejvíce syntetizované patři CdTe kvantové tečky6. Mikrobiální syntéza může účinně vyřešit problém s toxicitou a nespecifickými problémy syntézy kvantových teček, které nemohou být dále ignorovány a tento proces je obnáší. Mikrobiální syntéza přináší také několik problémů, které stále nejsou vyřešené. Jsou to například problémy s kontrolou velikostí a tvarů kvantových teček, zvýšení syntézy6.

Biosyntéza CdTe kvantových teček pomocí kvasinek Pro tuto biosyntézu se mohou použít například kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Tyto kvasinky jsou schopny jednoduše a efektivně syntetizovat vysoce flurescenční CdTe kvantové tečky s jednotnou velikostí (2,0 – 3,6 nm)6. Buňky Saccharomyces cerevisiae jsou velmi propracovaný mini-stroj, ve kterém řídí buněčné chování tisíce biochemických reakcí. Rychle a přesně reagují na měnící se prostředí. Syntéza kvantových teček vyžaduje, aby dané látky byly v příslušných valenčních stavech, a musí reagovat navzájem na správném místě a ve vhodnou dobu. Tato biosyntéza má vysoký výtěžek (téměř 90 %). CdTe kvantové

tečky mohou být z kvasinek snadno odebrané a emitují ve vlnové délce 490 – 560 nm s relativně vysokou fotoluminescencí. Mají vysokou stabilitu, biokompabilitu, a jsou přirozeně uzavřeny s proteiny v biosystému 6.

Biosyntéza CdTe kvantových teček pomocí Escherichia coli (E. coli) Bakterie jsou nejrozšířenější mikroorganismy na Zemi. Jsou to prokaryotické buňky rozdílné velikosti, tvaru a způsobu získávání energie. Žijí ve všech přírodních podmínkách11. Escherichia coli je gramnegativní všudypřítomná bakterie, která se velmi často využívá jako modelový organismus při biologických studiích, zejména v molekulární biologii. Většina kmenů E. coli je neškodných a mohou být snadno kultivovány za anaerobních nebo aerobních podmínek. E. coli se jeví jako ideální biofaktor pro biosyntézu CdTe kvantových teček12. Studie prokázaly, že zatímco některé bakterie jsou schopny syntetizovat nanočástice uvnitř buňky, jiné je dokáži syntetizovat extracelulárně. Vlastnosti nanočástic (velikost, tvar) je možno ovlivnit změnou parametrů, jako je teplota, pH, koncentrace daných látek, měnící se inkubační doba. Tyto parametry mohou biosyntentickou reakci i urychlit, nebo naopak zpomalit. Pro získání intracelulárně biosyntetizovaných nanočástic je nutná řada extrakčních postupů jako jsou ultrazvukové rozrušení a reakce s vhodnými detergenty. Biosyntézu lze ovlivnit i genovou manipulací daných organismů. Bylo prokázáno, že biosyntéza pomocí E. coli je nejvýhodnější v porovnání s dosud testovanými organismy díky své finanční nenáročnosti a rychlosti biosyntetické reakce11. Syntetizované kvantové tečky mají velmi dobré optické vlastnosti i biokompatibilitu 6.

Biosyntéza CdTe kvantových teček pomocí hub Houby jsou eukaryotické organismy, které žijí v širokém spektru přírodních stanovišť. Jsou to většinou dekompoziční organismy. Jsou výbornými kandidáty pro biosyntézu kvantových teček. Nejběžněji používaná houba je Fusarium oxysporum, která je schopna syntetizovat vysoce fluorescenční extracelulární CdTe kvantové tečky.

Houbová et al.

Výsledným produktem jsou kovové nanočástice o velikosti 20 – 50 nm11. Proces biosyntézy využívá iontů Cd a Te ve velmi zředěné formě a umožňuje postupné vytvoření kvantových teček. Tyto kvantové tečky jsou biosyntetizovány proteiny, které vylučuje houba. Proteiny umožňují kvantovým tečkám stabilitu ve vodném roztoku tím, že brání jejich aglomeraci. Dále byla u těchto kvantových teček prokázána antibakteriální aktivita proti gramnegativním bakteriím13,14.

Biosyntéza CdTe kvantových teček pomocí členovců Žížaly se využívají jako ukazatelé kontaminace půdy. Jsou schopné provádět biosyntézu CdTe kvantových teček, které emitují v zelené oblasti viditelného spektra při excitaci v ultrafialové oblasti. Schopnost biosyntézy byla prokázána např. u žížal druhu Lumbricus rubellus nebo Eisenia fetida. CdTe kvantové tečky jsou pak izolovány ze stěny chloragogenous a je možné je plně využít například k zobrazování. Thioly na základě limitování látky reagují s prekurzory kadmia a jsou uvedeny jako základní jednotka na povrchu výsledné kvantové tečky. Využití těchto kvantových teček je například při remediaci, nebo při zobrazovacích metodách v medicínském oboru15,16.

Závěr Nanomateriály jsou v poslední době velmi využívány v mnoha odvětví průmyslu (optika, elektronika, zemědělství, medicína). Zejména o kvantové tečky je veliký zájem, díky jejich optickým vlastnostem. Syntéza kvantových teček může probíhat pomocí fyzikálních nebo chemických procesů a je značně toxická. Proto se v současné době začínají využívat pro syntézu živé organismy, jako jsou bakterie, kvasinky, houby či členovci. Tato práce byla financována ze zdrojů CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Mala J. G. S., Rose C.: Journal of Biotechnology, 170, 73 (2014). 2. Nath D., Banerjee P.: Environmental Toxicology and Pharmacology, 36, 997 (2013). 3. Alivisatos A. P.: Science, 271, 933 (1996).

61

4. Valizadeh A., Mikaeili H., Samiei M., Farkhani S. M., Zarghami N., Kouhi M., Akbarzadeh A., Davaran S.: Nanoscale Research Letters, 7, (2012). 5. Hardman R.: Environmental Health Perspectives, 114, 165 (2006). 6. Bao H. F., Lu Z. S., Cui X. Q., Qiao Y., Guo J., Anderson J. M., Li C. M.: Acta Biomaterialia, 6, 3534 (2010). 7. Dhillon G. S., Brar S. K., Kaur S., Verma M.: Critical Reviews in Biotechnology, 32, 49 (2012). 8. Asmathunisha N., Kathiresan K.: Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 103, 283 (2013). 9. Park T. J., Lee S. Y., Heo N. S., Seo T. S.: Angewandte Chemie-International Edition, 49, 7019 (2010). 10. Kowshik M., Deshmukh N., Vogel W., Urban J., Kulkarni S. K., Paknikar K. M.: Biotechnology and Bioengineering, 78, 583 (2002). 11. Quester K., Avalos-Borja M., Castro-Longoria E.: Micron, 54-55, 1 (2013). 12. Monras J. P., Diaz V., Bravo D., Montes R. A., Chasteen T. G., Osorio-Roman I. O., Vasquez C. C., Perez-Donoso J. M.: Plos One, 7, (2012). 13. Syed A., Ahmad A.: Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 97, 27 (2012). 14. Syed A., Ahmad A.: Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 106, 41 (2013). 15. Sturzenbaum S. R., Hockner M., Panneerselvam A., Levitt J., Bouillard J. S., Taniguchi S., Dailey L. A., Khanbeigi R. A., Rosca E. V., Thanou M., Suhling K., Zayats A. V., Green M.: Nature Nanotechnology, 8, 57 (2013). 16. Maboeta M. S., Reinecke S. A., Reinecke A. J.: Environmental Research, 96, 95 (2004).

62

PAPERS

Zelená syntéza stříbrných a zlatých nanočástic pomocí extraktů z vyšších rostlin Michal Žůreka, Pavel Kopelb, David Hyneka, Vojtěch Adama,b, René Kizeka,b a b


Green synthesis of silver and gold nanoparticles with extracts from higher plants Metal nanoparticles belong to the most fabricated nanomaterials because of their unique physical and chemical properties which can be used for analytical, biochemical and biotechnological applications. Biosynthesis of metal nanoparticles has been extensively studied since the present production of nanoparticles by chemical and physical methods is difficult in terms of the use of toxic chemicals and energy consumption. In plants, there is the largest accumulation of heavy metals in the ecosystem. Therefore plants have a great potential for the biosynthesis of nanoparticles. Influence of various external reaction´s conditions can affect appearance of produced nanoparticles. This fact opens unlimited possibilities for biosynthesis of novel nanoparticles that may vary in size, shape and surface modification.

Přijato k publikování: 20. 3. 2014 Klíčová slova: biologická syntéza; rostlinné extrakty; fytosyntéza; nanočástice

Úvod Nanobiotechnologie je interdisciplinární věda, která se pohybuje na pomezí věd nanotechnologie a biotechnologie, což je oblast věnující se tvorbě, vylepšení a použití nanomateriálů v pokročilých biotechnologiích. Důležitou oblastí v tomto výzkumu je syntéza nanočástic s různým chemickým složením, velikostí a tvarem. Během posledních dvou dekád získala biosyntéza kovových nanočástic značnou pozornost díky rostoucí potřebě vyvinout technologie pro výrobu materiálů, které jsou šetrné k životnímu prostředí. Nanočástice se těší takové oblibě díky zcela odlišným vlastnostem než materiály makroskopické [1]. Některé nanočástice, například kvantové tečky mají fluorescenční vlastnosti. Vlnová délka emisního světla je závislá na velikosti částice. Jiné polovodičové nanokrystaly se vyznačují magnetickými vlastnostmi. Nanočástice mají vzhledem ke své velikosti relativně velký povrch. Tato vlastnost souvisí s mnoha faktory, jako jsou reaktivita, toxicita a katalytické vlastnosti. Syntéza nanočástic je uskutečňována pomocí rutinních chemických a fyzikálních metod. Nicméně tyto metody jsou energeticky velmi náročné a neobejdou se bez použití toxických chemikálií. V procesu syntézy nanočástic jsou přidávány další syntetické a vazebná chemická činidla, která brání v jejich aplikaci v klinic-

kých a biomedicínských oborech [2]. V posledních letech se mikrobiální syntéza nanočástic ukázala jako slibná oblast nanobiotechnologického výzkumu. O mikroorganizmech jako jsou bakterie, houby, aktinomycety, kvasinky a viry je známo, že mají přirozený potenciál produkovat kovové nanočástice buď intra nebo extracelulárně a jsou považovány za potenciální biologické továrny na výrobu nanočástic [3]. Kromě výše uvedených metod syntézy je tu také fytosyntéza, která využívá celou rostlinu jako biologickou továrnu k syntéze kovových nanočástic [4]. Ve srovnání s mikroorganismy fytosyntéza postrádá složité a vícekrokové způsoby jako např. mikrobiální izolaci, kultivaci, údržbu atd. Fytosyntéza je nákladově velmi efektivní a rychlá, což může být velmi snadno využito k hromadné výrobě nanočástic [5]. Bylo prokázáno, že fytosyntéza je rychlejší než syntéza za pomoci mikroorganismů, a vyrobené nanočástice jsou stabilnější [6]. Díky použití technik kultivace rostlinných pletiv, jejich optimalizaci a následnému zpracování, je možné syntetizovat nanočástice kovů v průmyslovém měřítku [7].

Biosyntéza kovových nanočástic rostlinami Shankar a kol. zjistili, že pokud nechají reagovat extrakt z Cymbopogon flexuosus spolu s AuCl4− ionty,

Žůrek et al.

tak se v roztoku vytvoří zlaté nanotrojúhelníky, které mají velikost 50-1800 nm [8]. Vytvořené struktury jsou složeny z několika kulovitých nanočástic, které jsou poskládány do sebe. V určitých vlastnostech se podobají kapalině. Tato „tekutost“ vzniká díky tvorbě komplexů aldehydů/ketonů na povrchu nanočástic, jejich komplexy pochází z extraktu citronové trávy, které jsou bohaté právě na výše zmíněné skupiny sloučenin. Z celkového počtu částic v extraktu mají nanočástice s trojúhelníkovým tvarem 45% zastoupení, což je daleko větší procento než v ostatních publikacích [8]. Stejný tým vědců, ještě o rok dříve, zkoumal také stříbrné nanočástice [9], které jsou známé svými antibakteriálními vlastnostmi a jsou hojně používány nejen ve zdravotnictví. Zjistili, že ve vodních rostlinných extraktech z Pelargonium peltatum jsou z dusičnanu stříbrného vytvořeny nanočástice, které jsou vysoce stabilní. Pozorovali, že reakční doba tvorby nanočástic je velmi krátká (60 minut) a spolehlivá v porovnání s mikroorganizmy.

Faktory ovlivňující fytosyntézu nanočástic Cílem přípravy nanočástic pomocí rostlin je kontrola jejich tvaru a velikosti a také snaha o co největší homogenitu připravených částic. Existuje několik faktorů, které ovlivňují výše uvedené vlastnosti. Mezi tyto faktory patří pH, teplota, reakční a inkubační čas. Závislost na pH byla obecně definována tak, že při nižším pH (2-4) jsou tvořeny větší nanočástice [10]. Vysvětlení je takové, že při nižším pH (pH 2) se nanočástice (v tomto případě zlato) agregují a tak vznikají částice větších velikostí. Naopak při pH 4 jsou přítomny karbonylové a hydroxylové skupiny, které jsou nutné pro vazbu na biomolekuly, proto se komplexy Au (III) preferenčně vážou na různé skupiny molekul pocházejících z extraktu namísto tvorby agregátů. Takové je současné vysvětlení pro tvorbu menších nanočástic při vyšším pH. Co se týče vlivu teploty, je evidentní, že množství nanočástic má pozitivní korelaci se zvýšenou teplotou [11]. Tento jev je vysvětlován tím, že při zvýšené teplotě se kinetika reakcí značně urychluje a tudíž se zvyšuje i množství syntetizovaných částic, které mají menší velikost v porovnání se standardní teplotou [12]. Starší práce ukazují, že reakční a

63

inkubační čas mají též vliv na syntézu nanočástic. Je to vlastně doba, která je nutná pro dokončení všech reakčních kroků. Dubei a kol. [10] pozorovali v extraktu z Tanacetum vulgare, že syntéza nanočástic započala po 10 minutách reakce. Dále zjistili, že s přibývajícím časem se hrany nanočástic „zostřují“, což platí pro stříbrné i zlaté částice. Pravděpodobným vysvětlením tohoto jevu je, že do určité doby nanočástice zaujímají termodynamicky nejstabilnější strukturu – kouli. Zajímavé je, že od určité velikosti (od určitého počtu atomů) jsou tvořeny méně stabilní struktury a dochází k dalšímu nepravidelnému agregování atomů kovu na povrchu částice.

Mechanismus fytosyntézy nanočástic Charakteristický tvar a velikost nanočástic je dána unikátním složením různých skupin makromolekul obsažených v extraktu. Poměr těchto látek je v každé rostlině a tudíž i extraktu jiný. Tyto sloučeniny nejsou často charakteristické přímo pro danou rostlinu, ale tvoří se jako sekundární metabolity [13]. Z dostupných informací plyne, že přítomnost proteinů a sekundárních metabolitů způsobuje redukci stříbrných iontů a oxidaci karbonylových skupin [14]. V dnešní době je již známo, že tato redukce a stabilizace neprobíhá pomocí rostlinných enzymů, protože příprava extraktů probíhá při 90 °C a veškeré enzymy jsou při této teplotě degradovány. Naopak za tyto reakce jsou pravděpodobně zodpovědné fytochemikálie jako jsou terpenoidy, fenoly, polysacharidy, seskviterpeny a flavonoidy [15]. Sekundární metabolity, jako jsou bioflavonoidy, mohou redukovat trichlorzlatitou kyselinu, ale karboxylová skupina, která je přítomna v proteinech, může působit jako surfaktant, který obalí zlaté nanočástice a elektrostatisticky je stabilizuje. Také bylo zjištěno, že oxidace polysacharidu, konkrétně hydroxylové skupiny na skupinu karbonylovou, hraje důležitou roli v redukci solí kovů na nanočástice. Kromě toho, redukující konec polysacharidu může být také použit pro zavedení aminoskupiny schopné tvořit komplexy a stabilizovat kovové nanočástice [16].

Závěr Nanotechnologie obecně jsou jednou z nejrychleji rozvíjejících se oblastí vědy. Existuje velké množství rostlinných druhů použitelných pro produkci nanočástic. Výsledná podoba i vlastnosti nanočástic lze ovlivňovat vnějšími podmínkami při syntéze z rostlinných extraktů. Pokud bude popsán a vysvětlen


64

do detailu mechanismus tvorby nanočástic a budou určeny látky, které tyto reakce způsobují či je významně ovlivňují, je zde možnost z fytosyntézy vytvořit standardní metodu, ekonomicky a ekologicky srovnatelnou s konvenčními technikami přípravy nanočástic. Tato práce byla financována ze zdrojů CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Kim, B.S. and J.Y. Song, Biological Synthesis of Gold and Silver Nanoparticles Using Plant Leaf Extracts and Antimicrobial Application, in Biocatalysis and Biomolecular Engineering2010, John Wiley & Sons, Inc. p. 447-457. 2. Jain, N., et al., Extracellular biosynthesis and characterization of silver nanoparticles using Aspergillus flavus NJP08: a mechanism perspective. Nanoscale, 2011. 3(2): p. 635-41. 3. Narayanan, K.B. and N. Sakthivel, Biological synthesis of metal nanoparticles by microbes. Adv Colloid Interface Sci, 2010. 156(1-2): p. 1-13. 4. Harris, A. and R. Bali, On the formation and extent of uptake of silver nanoparticles by live plants. Journal of Nanoparticle Research, 2008. 10(4): p. 691-695. 5. Shankar, S.S., et al., Rapid synthesis of Au, Ag, and bimetallic Au core–Ag shell nanoparticles using Neem (Azadirachta indica) leaf broth. Journal of Colloid and Interface Science, 2004. 275(2): p. 496-502. 6. Iravani, S., Green synthesis of metal nanoparticles using plants. Green Chemistry, 2011. 13(10): p. 2638-2650. 7. Jha, A.K., et al., Plant system: Nature‘s nanofactory. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2009. 73(2): p. 219-223. 8. Brown, S., M. Sarikaya, and E. Johnson, A genetic analysis of crystal growth. J Mol Biol, 2000. 299(3): p. 725-35. 9. Shankar, S.S., A. Ahmad, and M. Sastry, Geranium leaf assisted biosynthesis of silver nanoparticles. Biotechnol Prog, 2003. 19(6): p. 1627-31. 10. Dubey, S.P., M. Lahtinen, and M. Sillanpää, Tansy fruit mediated greener synthesis of silver and gold nanoparticles. Process Biochemistry, 2010. 45(7): p. 1065-1071. 11. Sathishkumar, M., K. Sneha, and Y.S. Yun, Immobilization of silver nanoparticles synthesized using Curcuma longa tuber powder and extract on cotton cloth for bactericidal activity. Bioresour Technol, 2010. 101(20): p. 7958-65. 12. Dwivedi, A.D. and K. Gopal, Biosynthesis of silver and gold nanoparticles using Chenopodium album leaf extract. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2010. 369(1–3): p. 27-33. 13. Akhtar, M.S., J. Panwar, and Y.-S. Yun, Biogenic Synthesis of Metallic Nanoparticles by Plant Extracts. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, 2013. 1(6): p. 591-602. 14. Shankar, S.S., et al., Bioreduction of chloroaurate ions by geranium leaves and its endophytic fungus yields gold

nanoparticles of different shapes. Journal of Materials Chemistry, 2003. 13(7): p. 1822-1826. 15. Narayanan, K.B. and N. Sakthivel, Extracellular synthesis of silver nanoparticles using the leaf extract of Coleus amboinicus Lour. Materials Research Bulletin, 2011. 46(10): p. 1708-1713. 16. Singh, A., et al., Biosynthesis of gold and silver nanoparticles by natural precursor clove and their functionalization with amine group. Journal of Nanoparticle Research, 2010. 12(5): p. 1667-1675.

PAPERS

Vliv různých forem glutathionu na kulturu Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus Zuzana Lackováa, Markéta Komínkováa, Ondřej Zítkaa,b, René Kizeka,b a b


Influence of different forms of glutathione on Lactobacillus casei ssp. rhamnosus culture. Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (L. rhamnosus) of the genus Lactobacillus belongs to the facultatively heterofermentative lactic acid bacteria. In the human body it occurs mainly in the intestine, where it brings a beneficial effect on the immune system. Further, the antioxidant properties and action against oxidative stress belong among its major advantages. In the genus Lactobacillus also the ability to reduce clinical symptoms of influenza was demonstrated. Similar properties to that of the genus Lactobacillus are demonstrated also in glutathione (γ-glutamylcysteinylglycin), one of the most important thiols present in both plant and animal tissues, and also in number of microorganisms. Due to the wide field of application of bacteria of the genus Lactobacillus and possibilities to improve some of their properties in the presence of glutathione, the use of lactobacilli with the addition of glutathione can be considered for the treatment of influenza and support the treatment of influenza illness. Přijato k publikování: 5. 3. 2014 Klíčová slova: redukovaný glutathion (GSH); Lactobacillus casei ssp. rhamnosus; oxidovaný glutathion (GSSG); S-nitrosoglutathion (GSNO);

Úvod Druh Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (L. rhamnosus), z rodu Lactobacillus patří mezi fakultativně heterofermentativní bakterie mléčného kvašení1. Tento druh se řadí mezi probiotické bakterie, které příznivě působí na zažívací trakt člověka. Běžně se L. rhamnosus vyskytuje např. ve střevě či slinách člověka a ve fermentovaných mléčných výrobcích1,2,3. Dřívější studie L. rhamnosus prokázaly příznivé působení na imunitní systém, antioxidační vlastnosti a působení proti oxidačnímu stresu4. Podobné vlastnosti vykazuje i glutathion (γ-glutamylcysteinylglycin) jako jedna z nejvýznamnějších thiolových sloučenin, je přítomný jak v rostlinných a živočišných tkáních, tak i u řady mikroorganismů. Podílí se na buněčných procesech, včetně ochrany proti reaktivním formám kyslíku a podporuje redoxní rovnováhu buněk5,6,7,8,9. U grampozitivních mikroorganismů není jeho fyziologická úloha zcela objasněna. I když je prostup glutathionu do buněk problematický, byla zjištěna jeho výrazná ochranná role pro L. rhamnosus, avšak molekulární základ této vlastnosti není plně znám10. V současné době byly také prokázány příznivé účinky probiotických bakterií rodu Lactobacillus na zažívací trakt myší a vliv těchto bakterií na snížení příznaků chřipky u myší11,12,13,14,15.

Lactobacillus casei ssp. rhamnosus L. casei ssp. rhamnosus, také označovaný jako L. rhamnosus, patří do rodu Lactobacillus. Paleontologické nálezy naznačují výskyt laktobacilů již před třemi miliardami let, avšak poprvé byl rod Lactobacillus popsán v roce 1901 nizozemským botanikem a mikrobiologem M. W. Beijerinckem10,7. L. rhamnosus je široce rozšířený v prostředí, nachází se v potravinách rostlinného i živočišného původu, např. nápojích, čisté i znečištěné vodě, siláži, kysaném zelí či startovacích kulturách (mlékařský průmysl). Také se vyskytuje v gastrointestinálním traktu, vagině či ústní dutině ptáků a savců1,2. Patří mezi fakultativně heterofermentativní bakterie, které se vyznačují tím, že fermentují hexózy na kyselinu mléčnou, nebo na směs kyseliny mléčné, mravenčí, octové a etanolu a pentózy fermentují na kyselinu mléčnou a octovou1,2. Buňky L. rhamnosus mají tvar pravidelných tyček, které jsou většinou dlouhé a jsou uspořádané v palisádách nebo krátkých řetízcích. L. rhamnosus je grampozitivní a nesporulující bakterie. Má vysoké požadavky na výživu, zvláště na sacharidy, aminokyseliny, peptidy, estery mastných kyselin, soli, vitamíny a deriváty nukleových kyselin. Zdroj uhlíku tvoří glukóza5,2. Optimální růstová teplota se pohybuje v

65


66

rozmezí 30 až 40 °C a optimální hodnota pH je 5,5 až 6,21. Pokud hodnota pH klesne pod 4, dochází k zastavení růstu většiny laktobacilů16. U Lactobacillus casei ssp. rhamnosus byly prokázány příznivé účinky na střevní mikroflóru a posílení imunity. U zvířat může přítomnost L. rhamnosus zlepšovat konverzi krmiva a tím jejich hmotnost10,17,18.

Glutathion Podobné pozitivní účinky na organismus jako u L. rhamnosus byly zaznamenány i u glutathionu10,12,19. Je to tripeptid γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycin, složený ze tří aminokyselin. Patří k nejrozšířenějším a hlavním thiolovým sloučeninám vyskytujících se v mnoha organismech5. Vyskytuje se v rostlinných, živočišných, lidských i bakteriálních buňkách a byl izolovaný i z droždí8. Tato sloučenina má řadu důležitých fyziologických funkcí, jako jsou antioxidační vlastnosti, je kofaktorem enzymů, chrání volné thiolové skupiny bílkovin při redoxních reakcích, účastní se detoxikace volných peroxidů a radikálů, hraje roli v metabolismu a transportu oxidu dusnatého a aminokyselin a vytváří rezervní thiolové skupiny. Účastní se také detoxikace xenobiotik, kde je glutathion hlavní sloučeninou vystupující z této reakce9,19,20. Glutathion se vyskytuje ve dvou formách. V redukované formě se jedná o thiol (GSH) a v oxidované formě o disulfid (GSSG)19.

S-nitrosoglutathion (GSNO) S-nitrosoglutathion je také zkoumán v souvislosti s probiotickými bakteriemi, hlavně při zkoumání oxidativního stresu u rodu Lactobacillus11. Je to nejrozšířenější nízkomolekulární S-nitrosothiol, který vzniká v aerobním prostředí reakcí redukovaného glutathionu (GSH) s reaktivními formami dusíku (kyselina dusitá). Také může vznikat jako meziprodukt metabolismu oxidu dusnatého (NO). GSNO hraje důležitou roli při udržování fyziologické hladiny celkových nízkomolekulárních i vysokomolekulárních S-nitrosothiolů v buňkách21. Také tvoří součást fyziologické funkce oxidu dusnatého (NO) a zdroj biologicky dostupného NO. Oxid dusnatý vzniká z GSNO v anaerobních podmínkách6

Mechanismus transportu glutathionu v buňkách u grampozitivních bakterií Některé studie grampozitivních bakterií naznačují schopnost těchto bakterií přepravovat glutathion z média a následně ho využít v buněčných reakcích. Schopnost grampozitivních bakterií vázat glutathion z média je prokazována transportním proteinem CydCD, který je složený z dvou podjednotek CydC a CydD (Obr: 1). Tento protein pomáhá v buňce vytvářet redukční prostředí, které umožňuje lepší transport glutathionu a cysteinu. Pokud má bakterie schopnost přepravovat glutathion z média, musí tento transport-

Obr. 1: Vznik oxidovaného glutathionu (GSSG) z glutathionu redukovaného (GSH) Spojením dvou molekul GSH přes atom Síry (žlutá barva), dochází ke vzniku molekuly GSSG vlivem tvorby disulfidické skupiny S-S (žlutá barva)

Lacková et al.

ní protein obsahovat. Na metabolismu glutathionu se podílejí dva enzymy, které přeměňují glutathion na oxidovanou (GSSG) a redukovanou (GSH) formu. Enzym glutathion peroxidáza umožňuje přeměnu GSH na GSSG, kdežto glutathion reduktáza mění GSSG zpět na GSH19. Biosyntéza GSH začíná tvorbou peptidové vazby mezi cysteinem a kyselinou glutamovou za katalýzy γ-glutamylcystein syntetázy. Následně dochází pomocí glutathion syntetázy k vytvoření peptidové vazby mezi γ-glutamylcysteinem a glycinem19 (Obr. 1). Vznik γ-glutamylcysteinu a glycinu (E-C) spojením C a E se uskutečňuje pomocí γ-glutamylcystein syntetázy (GSHA). Vstup glutathionu z média do buňky by měl být umožněn transportním proteinem CydCD. Přeměnu redukované formy glutathionu (GSH) na oxidovanou formu (GSSG) zajišťuje enzym glutathion peroxidáza (GPO) a enzym glutathion reduktáza (GSHR) umožňuje opačnou přeměnu glutathionu. Působení degradačního enzymu (GGT) dochází k degradaci glutathionu na γ-glutamyl a cyteinylglycin. Jelikož mechanismus vstupu a tvorby glutathionu u grampozitivních buněk není zcela objasněn, je toto

67

schéma pouze možností, jak by transport glutathionu mohl probíhat.

Vliv probiotických bakterií rodu Lactobacillus na klinické příznaky chřipky Na základě zjištěných účinků probiotických bakterií rodu Lactobacillus se současné studie zaměřují také na zmírnění klinických příznaků chřipky6. Ve studiích je vliv probiotických bakterií zkoumán u myší, které byly infikovány chřipkovým virem H1N1. Infikovaným myším byl perorálně podáván probiotický kmen Lactobacillus a sledovala se koncentrace interferonu-α. Interferon-α je glykoprotein, který je syntetizován leukocyty a má antivirové účinky. Data získaná v těchto studiích potvrdila snížení klinických příznaků chřipky u myší při každodenním podávání probiotické kultury o hmotnosti 10 mg. Také antioxidační vlastnosti glutathionu by mohli podpořit působení probiotických bakterií, a tím i docílit snížení klinických příznaků chřipky. Z výsledků těchto studií vyplývá možné budoucí využití probiotických bakterií při léčbě chřipky12,13,5.

Obr. 2: Schéma pravděpodobného vstupu glutathionu do buňky u grampozitivních bakterií 17,5 –Glutathion (GSH) se skládá z glycinu (G), z cysteinu (C) a z kyseliny glutamové (E).


68

Závěr Probiotické kmeny rodu Lactobacillus mohou zmírňovat klinické příznaky chřipky a příznivě působit na zažívací trakt. Vzhledem k široké oblasti využití bakterií rodu Lactobacillus a možnosti zlepšení některých jejich vlastností v přítomnosti glutathionu, je možné uvažovat o využití lactobacilů s přídavkem glutathionu pro léčbu chřipky a podpořit tak léčbu chřipkových onemocnění. Uvedené informace ukazují velký potenciál mikroorganismů v léčbě virových onemocnění. V současné době byly pokusy prováděny pouze na myších, avšak do budoucna by mohly být tyto bakterie využity i při léčbě virových onemocnění u lidí. Tato práce byla financována z projektu CEITEC CZ.1.05/1.1.00/02.0068.

Literatura

1. Sedláček I., Taxonomie prokaryot, Masarykova univerzita, 2007. 2. Collins M. D., Phillips B. A., Zanoni P.: International Journal of Systematic Bacteriology, 39, 105 (1989). 3. Holzapfel W. H., Haberer P., Geisen R., Bjorkroth J., Schillinger U.: American Journal of Clinical Nutrition, 73, 365S (2001). 4. Kamaladevi A., Ganguli A., Kumar M., Balamurugan K.: Pesticide Biochemistry and Physiology, 105, 213 (2013). 5. Masip L., Veeravalli K., Georgioui G.: Antioxidants & Redox Signaling, 8, 753 (2006). 6. Broniowska K. A., Diers A. R., Hogg N.: Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 1830, 3173 (2013). 7. Stiles M. E., Holzapfel W. H.: International Journal of Food Microbiology, 36, 1 (1997). 8. Li Y., Hugenholtz J., Abee T., Molenaar D.: Applied and Environmental Microbiology, 69, 5739 (2003). 9. Knejzlik Z., Kas J., Ruml T.: Chemicke Listy, 94, 913 (2000). 10. Bernardeau M., Guguen M., Vernoux J. P.: FEMS Microbiology Reviews, 30, 487 (2006). 11. Peran L., Camuesco D., Comalada M., Bailon E., Henriksson A., Xaus J., Zarzuelo A., Galvez J.: Journal of Applied Microbiology, 103, 836 (2007). 12. Waki N., Yajima N., Suganuma H., Buddle B. M., Luo D., Heiser A., Zheng T.: Letters in Applied Microbiology, 58, 87 (2014). 13. Park M. K., Ngo V., Kwon Y. M., Lee Y. T., Yoo S., Cho Y. H., Hong S. M., Hwang H. S., Ko E. J., Jung Y. J., Moon D. W., Jeong E. J., Kim M. C., Lee Y. N., Jang J. H., Oh J. S., Kim C. H., Kang S. M.: Plos One, 8, (2013). 14. Kiso M., Takano R., Sakabe S., Katsura H., Shinya K., Uraki R., Watanabe S., Saito H., Toba M., Kohda N., Kawaoka Y.: Scientific Reports, 3, (2013). 15. Hori T., Kiyoshima J., Shida K., Yasui H.: Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 8, 593 (2001). 16. Klaban V., Ekologie mikroorganismů: ilustrovaný lexikon biologie, ekologie a patogenity mikroorganismů, Galén, 2011. 17. Salminen S. J., Gueimonde M., Isolauri E.: Journal of

Nutrition, 135, 1294 (2005). 18. Klaenhammer T. R., Kullen M. J.: International Journal of Food Microbiology, 50, 45 (1999). 19. Pophaly S. D., Singh R., Kaushik J. K., Tomar S. K.: Microbial Cell Factories, 11, (2012). 20. Kullisaar T., Songisepp E., Aunapuu M., Kilk K., Arend A., Mikelsaar M., Rehema A., Zilmer M.: Applied Biochemistry and Microbiology, 46, 481 (2010). 21. Kubienova L., Ticha T., Jahnova J., Luhova L., Petrivalsky M.: Chemicke Listy, 107, 202 (2013).

Lacková et al.

69

www.medesa.cz

Glykovaný hemoglobin

Analýza glukózy

PRESEPSIN

PŘIPRAVENO

PRO VÁS Biochemie

Imunoanalýza

Hematologie

Osmolalita

ABR

SPOLEHLIVÁ ŘEŠENÍ PRO VAŠI LABORATOŘ

Další novinka: Eppendorf Reference® 2

Spolehlivě ...

... s novým dávkovačem Eppendorf Multipette® M4: jednoduše, bez námahy, ergonomicky. S Multipette M4 bude pipetování velkých sérií vzorků rychlejší a snazší: z jednoho naplnění zásobníku Combitip můžete vydat až 100 dávek. Bez ohledu na to, zda pracujete s vodnými roztoky, viskózními kapalinami nebo s těkavými látkami bude dávkování vždy přesné.

> Ovládání s vynaložením minimální síly a pouze jednou rukou (včetně odhazovače) > Počítadlo dávek > Dávky volitelné v rozpětí 1 µl – 10 ml (můžete vydat až 100 dávek)

www.eppendorf.com/m4 Eppendorf®, the Eppendorf logo, Multipette® M4, Eppendorf Combitips®, Combitips®, Combitips advanced® and Eppendorf Reference® are registered trademarks of Eppendorf AG. All rights reserved, including graphics and pictures. Copyright © 2013 by Eppendorf AG.

Q-Sense Omega Auto Měření hmotnosti, tloušťky a strukturních vlastností molekulárních vrstev

• •

Adsorpce Desorpce

• •

Agregace Vazby

APLIKACE: 1. Adsorpční a desorpční kinetika 2. Příprava a uchování léčiv 3. Solární články nové generace 4. Imunokompatibilita implantátů 5. Polyelektrolytické vrstvy 6. Interakce protein-DNA 7. Tvorba lipidových vrstev 8. Koroze palivových článků 9. Strukturní změny proteinů ● ● ● ● ● ●

Nová technologie QCM-D Vysoká citlivost (ng) Plně automatizovaný systém 2x4 senzory pro simultánní měření Zabudovaná kontrola teploty „Real-time“ a „Label-free“

• •

Interakce Degradace

10. Účinnost detergentů 11. Aktivita enzymů 12. Interakce Ab-Ag 13. Degradace celulózy 14. Nanotoxikologie 15. Analýza toxinů 16. Buněčná adheze 17. DNA hybridizace 18. Pokovování

Máte-li zájem o zaslání aplikačních listů z uvedeného seznamu, napište nám jejich čísla na adresu [email protected]

Zastupuje CHROMSPEC spol. s r.o. 252 10 Mníšek pod Brdy Lhotecká 594 Tel.: 318 599 083 [email protected]

634 00 Brno Plachty 2 Tel.: 547 246 683 www.chromspec.cz

plynová chromatografie ICP-OES příprava elementární ANALÝZA elektrochemie analýza

povrchů

REOLOGIE

separační

ATOMOVÁ kapalinová

vzorku

SEA techniky

spektroskopie chromatografie

GC temperace UV-VIS spektrometrie LIMS lyofilizátory B.E.T. GC-MS koncentrátory CHNSO analýza AAS hmotnostní SPEKTROMETRIE HPLC centrifugy EXTRUZE ICP-MS SERVIS Hypercarb

termická analýza AIR monitoring TracePLOT XPS TEXTURA spotřební materiál NMR automatické dávkování

w w w.p r a g ol ab . c z

vyska195x280.qxd:Sestava 1

10/31/13

12:10 PM

Stránka 1

Tato molekula má správnou diagnózu od roku 1953 Jsme přesvědčeni, že současná léčba musí odpovídat individuálním potřebám pacienta a jeho typu onemocnění. Informace v lidských genech a proteinech jsou naším manuálem, ve kterém můžeme číst pomocí systémů cobas® a Ventana Benchmark. naše inovace léčby a diagnostiky pomáhají milionům lidí po celém světě zmírnit jejich potíže a zlepšit kvalitu jejich života. Dáváme lidem naději.

Journal of Metallomics and Nanotechnologies Vydavatel: Mendelova univerzita v Brně Vedoucí editor: Ondřej Zítka Vydání: první 2014 Počet stran: 62 Vychází elektronicky ISSN 2336-3940

První číslo vychází v průběhu května Časopis. Journal of Metallomics and Nanotechnologies vychází

Recommend Documents