Proteinové znaky dětské leukémie identifikované pomocí genových expresních profilů
M.Vášková a spol. Klinika dětské hematologie a onkologie 2.LF UK a FN Motol
Childhood Leukemia Investigation Prague
Průtoková cytometrie v diagnostice dětské leukémie AML
T ALL (zralá B vs.)
BCP ALL
proB ALL CD19+CD10neg
cALL CD19+CD10+ iIgMneg
praeB ALL
Mejstříková et al., Haematologica 2010
CD19+CD10+ iIgMpoz
+ exprese aberantních molekul, stanovení DNA ploidie (DNA indexu)
Genotypové podskupiny dětské ALL B prekursorová ALL Zralá B ALL
T ALL
Pui et al., N ENGL J MED, 2004
Pui et al., Blood 2012
Genové expresní profily dětské ALL
Yeoh et al., 2002, Ross et al. 2003, ……………………………………………….. …geny korelující s imunofenotypovými a genotypovými podskupinami, odpovědí na léčbu, rezistencí na léčebné přípravky, odlišující maligní buňky od nemaligních…
Výběr nových proteinových znaků pro průtokovou cytometrii Proteiny korelující s genotypem, rizikem relapsu, odpovědí na léčbu odlišující maligní a nemaligní buňky
analýza autorů naše reanalýza dat
FC testování v případě dostupné protilátky protilátka nedostupná ověření pomocí RQ-PCR
příprava vlastní protilátky
Reanalýza primárních dat 100
cutoff pro každý gen
80
y%
% pacientů nad cutoff, negativní
x%
prediktory CD44
negativity
60 nekorelující geny
40
20
0 0
prediktory pozitivity
20
40
60
80
CD27 100
% pacientů nad cutoff, TEL/AML1 pozitivní Vášková et al., Leukemia 2005
Identifikace TEL/AML1 pozitivních pacientů pomocí exprese CD44 a CD27
CD44 (Pgp-1):
(%)
receptor pro kyselinu hyaluronovou
CD27 (TNFRSF7): tumor necrosis factor receptor superfamily T buňky, NK buňky, paměťové B buňky, časné prekurzory B buněk
(%) n=526
PCR TEL/AML1 negativní pacienti Žaliová et al., Pediatr Blood Cancer 2011: TEL/AML1-positive patients lacking TEL exon 5 resemble canonical TEL/AML1 cases
Tel_ex5/Aml1_ex2/3
1
2
3
1
4
2
5
3
4
2
3
4
3
5
4
6
5
7
916 :
Tel_ex4/Aml1_ex3
1078 :
Tel_ex4/Aml1_ex2
6
7
8
Ostatní negativní pacienti…společné genetické změny?
8
Hledání OPÁLu C. Willman et al, Albuquerque, NM, USA % pacientů nad cutoff, relaps
OPAL-1 (Outcome Predictor in Acute Leukemia 1)
100
80
60
40
OPAL1
20
0 0
20
40
60
80
100
% patientů nad cutoff, bez relapsu
…prediktor TEL/AML1 % patientů nad cutoff, negativní
TEL/AML1 100
80
60
40
OPAL1
20
0 0
20
40
60
80
% patientů nad cutoff, pozitivní
100
SEC-MAP Size-exclusion Chromatography - Microsphere-based Affinity Proteomics …umoţňuje detekci více neţ 1700 proteinů v buněčném lyzátu 1 2 3 4 5 6 7
izolace proteinů značení proteinů biotinem rozdělení proteinů na chromatografické koloně imunoprecipitace chromatografických frakcí se SEC-MAP array detekce proteinů pomocí streptavidinu-PE měření na průtokovém cytometru analýza
protein G PROTEIN-BIOTIN
STREPTAVIDIN - PE
Goat anti Mouse Mouse anti Human
Wu, Antibody array analysis with label-based detection and resolution of protein size. Mol Cell Proteomics 2009 Slaastad, Multiplexed immuno-precipitation with 1725 commercially available antibodies to cellular proteins. Proteomics 2011 Stuchly, An automated analysis of highly complex flow cytometry-based proteomic data. Cytometry A 2012
Drebrin Podle expresních profilů má nízká exprese předpovídat vyšší riziko relapsu a špatnou odpověď na léčbu Podle FC korelace s TEL/AML1
n=20
n=66
Vášková et al., Leukemia Research 2011
podle SEC-MAP BCP ALL vyšší exprese neţ AML
Další metody pro verifikaci proteinové exprese Průtoková cytometrie: CD27, CD44, CD135, CD49f, CD99, CD103, TNFRR2, ICOSL, IL10RB, CD97
Potvrzení korelace pomocí RQ-PCR a následná příprava protilátky: Drebrin, OPAL1, ARHGEF4, CLIC5, DDIT4L, PCLO, LARGE probíhající: SEC-MAP plánovaná: buněčná analýza hmotnostní cytometrií verifikace a další biologické informace v širším kontextu
Poděkování O. Hrušák E. Mejstříková T. Kalina V. Kanderová D. Černá J. Stuchlý M. Kováč P. Volná M. Ţaliová J. Zuna J. Trka J. Starý
F. Lund-Johansen
V. Hořejší T. Brdička P. Angelisová J. Špička K. Drbal
immature B preB II
Le Bien, Blood 2000 Loken, Blood 1987 CD19+CD10+ :
preB I proB
Loken III Loken II
Loken I 27+44-
27+44+
44+2744+2744+2727-44+
44-2727-44- 27-4444-2727-4427-44-
cytoplasmic IgM TdT RAG-1 highCD10
CD34, cytoplasmic VpreB VHJH rearranged L chain rearranged
leukemias TELAML1 others large cells (FSc) CD20
Vášková et al., Tissue Antigens 2007
Size-exclusion Chromatography
FPLC = fast protein liquid chromatography
24 frakcí 670 kDa – 10 kDa
automatická detekce populací kuliček
definice proteinových forem
čárový graf
kvantifikace
