PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) Denaturující proteinová elektroforéza (SDS PAGE - SDS Protein Acrylamide Gel Electrophoresis) je metoda, která se používá k separaci proteinů podle velikosti, na základě jejich migrace v gelu v elektrickém poli. SDS (sodium dodecylsulfát) je detergent, který se při PAGE přidává k vzorku proteinu, protein denaturuje a uděluje mu negativní náboj. U většiny proteinů dochází k rovnoměrnému přidělení negativního náboje na jednotku hmoty (standardně 1,4 g SDS / 1 g polypeptidu). U hodně hydrofóbních proteinů (např. membránové proteiny) není navázání SDS rovnoměrné a tyto proteiny migrují v gelu neproporcionálně své velikosti. Gel pro proteinovou elektroforézu lze vyrobit v různých koncentracích a o různých velikostech pórů. Velikost pórů určuje poměr složek akrylamidu a bisakrylamindu v gelu. Se vzrůstající koncentrací akrylamidu se póry v gelu zmenšují. V našem případě používáme poměr mezi akrylamidem a bisakrylamidem 1:30. Použité roztoky:
10% amonium persulfát 10% SDS 30% akryl – bisakrylamid mix (29:1) TEMED 1,5 M Tris (pH 8,8) 1,5 M Tris (pH 6,8) Running buffer Vzorkový pufr Coomasie Brilliant Blue (CBB) CBB odbarvovací roztok
Funkce některých důležitých chemikálií a pufrů: SDS: je silný detergent, který se používá k denaturaci a obalení proteinů negativním nábojem, k čemuž dochází při zahřátí na 100 °C. Stíní tím vnitřní náboj polypeptidů, který je tím pádem zanedbatelný. Komplex má pak jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Proteiny migrují k anodě. Running buffer: stabilizuje pH během elektroforézy, protože během elektroforézy dochází k elektrolýze vody. V našem případě používáme Tris pufr. Glycin: slouží jako protiiont, který vyrovnává vnitřní náboj running bufferu, je lehce záporně nabitý a napomáhá zanoření proteinů do horního gelu. Po zanoření do gelu svůj náboj ztrácí a dál pohyb proteinů neovlivňuje.
Bisakrylamid: 1 molekula bisakrylamidu na sebe váže 2 molekuly akrylamidu a crosslinkuje je, čímž dochází k tvorbě gelu. Poměr bisakryamidu a akrylamidu určuje porozitu gelu. Ammonium persulfát: je zdrojem volných radikálů nutných pro polymeraci gelu. Vyšší množství volných radikálů má za následek snížení průměrné délky polymerního řetězce a snížení elasticity gelu. Měla by se používat nejnižší možná koncentrace volných radikálů, která ještě vede k polymerizaci. Katalyzátor polymerace gelu. TEMED: stabilizuje volné radikály, čímž zlepšuje polymeraci gelu. Míra polymerace a vlastnosti gelu závisí na koncentraci volných radikálů. Bromfenolová modř: používá se ke zviditelnění vzorku jak při nanášení na gel, tak pro orientaci migrace vzorků gelem. Je negativně nabitá a migruje spolu s proteiny k anodě, má malou molekulovou hmotnost, takže migruje rychleji než nejmenší proteiny (je vepředu jako první). Za neutrálního a alkalického pH je modře zbarvena. Glycerol: používá se k „zatížení“ vzorků, aby klesly na dno jamky. Je nereaktivní, nenabitý a neinterferuje s průběhem elektroforézy. CBB: používá se k barvení proteinů. Kyselina octová v barvícím roztoku má za úkol stabilizovat proteiny v gelu. β-merkaptoetanol: používá se k denaturaci, redukuje disulfidické můstky v proteinech – narušuje terciární a kvartérní struktury proteinů. Příprava pufrů Tris 1,5 M, pH 8,8 navážit 18,17 g Tris rozpustit v 80 ml dH2O upravit pH na hodnotu 8,8 doplnit do 100 ml dH2O Tris 1,5 M, pH 6,8 navážit 18,17 g Tris rozpustit v 80 ml dH2O upravit pH na hodnotu 6,8 doplnit do 100 ml dH2O
10% SDS rozpustit 10 g sodium dodecylsulfátu v 90 ml dH2O a zahřát max na 68°C, aby se SDS plně rozpustilo upravit pH na 7,2 pomocí HCl doplnit objem do 100 ml pokud SDS precipituje (za nízké teploty), rozpustit krystalky zahřátím na 37°C 10% amonium persulfát (APS) rozpustit 1 g APS v 8 ml dH2O doplnit objem do 10 ml rozplnit po 0,5 ml do eppendorfových zkumavek a zamrazit na -20°C po použití vyhodit, znovu nezamrazovat Vzorkový pufr – 2X I smíchat: 10 ml 1,5M Tris (pH 6,8) 6 ml 20% SDS 30 ml glycerolu 15 ml β-merkaptoetanolu 1,8 g bromfenolové modře doplnit objem do 100 ml dH2O rozplnit do zkumavek a zamrazit na -20°C 10X Running buffer rozpustit v 800 ml dH2O: 10 g SDS 30,3 g Tris 144,1 g glycinu doplnit objem do 1 l dH2O skladovat při pokojové teplotě před použitím 10x naředit CBB R-250 smíchat: 450 ml metanolu 100 ml kyseliny octové 400 ml dH2O rozpustit 2,5 g CBB R-250 ve směsi připravené v předchozím kroku doplnit objem do 1 l dH2O skladovat při pokojové teplotě
Odbarvovací roztok smíchat: 450 ml metanolu 100 ml kyseliny octové doplnit do 1 l dH2O skladovat při pokojové teplotě Příprava gelu Dolní gel (separační) – 12%; 1 gel smíchat: 1,6 ml dH2O 2 ml 30% akryl – bisakrylamidu 1,3 ml Tris, pH 8,8 50 µl 10% SDS 50 µl APS 2 µl TEMEDu Horní gel (zaostřující) – 5%; 1 gel smíchat: 1,4 ml dH2O 330 µl 30% akryl – bisakrylamidu 250 µl Tris, pH 8,8 20 µl 10% SDS 20 µl APS 2 µl TEMEDu Dolní i horní gel se míchá čerstvě. Jako poslední se k roztoku přidává APS a TEMED. Roztok se velmi pečlivě zamíchá a pipetou se nalije mezi sestavená skla, cca do 2/3 objemu. Nalitý roztok se převrství butanolem a gel se nechá ztuhnout. Po ztuhnutí se butanol vylije, namíchá se čerstvý horní gel (TEMED a APS jako poslední), pečlivě se promíchá a pipetou se nanese na dolní gel. Mezi skla se vloží hřebínek, který nám v gelu vytvoří jamky pro nanesení vzorku. Horní gel se nechá zatuhnout, hřebínek se vyndá a jamky se mohou propláchnout destilovanou vodou. Takto připravený gel mezi skly se použije k sestavení elektroforézy. Příprava vzorků Příprava buněčných lyzátů buněčnou suspenzi zamrazte na -80°C/min 12h rozmrazte při teplotě 37°C (vodní lázeň, do úplného rozmražení) buněčný lyzát centrifugujte 900xg/30min/20°C ihned po ukončení centrifugace opatrně odeberte supernatant (roztok, obsahuje proteiny)
odebraný supernatant skladujte v lednici nebo -20°C do analýzy proveďte analýzu proteinů pomocí SDS-PAGE (kvalitativní - molekulová hmotnost proteinů) a stanovte koncentraci proteinů ve vzorku metodou dle Bradfordové (kvantitativní – stanovení celkového množství proteinů).
Příprava vzorků pro SDS PAGE Vzorek proteinů (např. buněčný lyzát) smíchám v poměru 1:1 se vzorkovacím pufrem (2X I) a 5 – 10 minut povařím při 100°C. Vzorek stočím na centrifuze na maximum (cca 5000 otáček) po dobu 1 minuty. Takto připravený vzorek můžu nanést do jamky v gelu. V závislosti na tom, jaký marker molekulových hmotností používám, je možné, že bude potřeba stejným způsobem připravit a zavařit i marker (pozor! „ready to use“ se již nevaří!). Elektroforéza Pomocí dvou skel s gelem sestavím vnitřní vaničku na horní pufr. Místo jednoho skla mohu případně použít plastovou vložku. Vaničku vložím do vany a do obou naliji running buffer. Do horní až úplně po vrch, do dolní tak, aby spodní elektroda byla ponořena v pufru. Postupně nanesu do první jamky marker molekulových hmotností (podle druhu markeru nanáším 3 – 5 µl) a do každé další jamky vzorek (po dohodě se školitelem). Vanu zakryji víkem, připojím elektrody ke zdroji (pozor na (+) a (-), musí vše lícovat!!!) a ten spustím. Napětí nastavím na 90 V a nechám cca 15 minut běžet (minimálně po dobu, než mi vzorky zajedou do gelu a vytvoří jednu linii). Poté mohu napětí zvednout na 120 V. Elektroforéza běží cca 1 – 1,5 hodiny, podle použitého napětí. Barvení Po dokončení elektroforézy opatrně od sebe oddělím skla, mezi kterými mám gel. Od gelu odříznu horní zaostřovací gel a odříznu i kousek horního rohu u markeru. Tím si označím orientaci gelu. Gel vložím do misky s CBB a nechám míchat na míchačce přes noc. Druhý den sliji CBB (lze použít opakovaně), gel propláchnu v destilované vodě a dám odbarvovat do odbarvovacího roztoku do té doby, než se gel úplně neodbarví a nezůstanou obarvené pouze proteiny. Odbarvovací roztok lze měnit dle potřeby. Po obarvení gelu lze gel krátkodobě skladovat v destilované vodě a naskenovat, případně vložit do sušícího roztoku na noc a pak vložit mezi celofán, vypnout do rámečku a nechat uschnout. Takto lze gel dlouhodobě skladovat.
