Analýza protein SDS PAGE elektroforézou
Molekulárn biologická diagnostika n Diagnostika
na úrovni DNA, RNA a
protein n Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, p íp. metabolomu n Analýza kvalitativní i kvantitativní
Nejpoužívan jší techniky - proteiny n Dvoudimenzionální
ELFO n Rentgenová krystalografie n NMR n Hmotnostní spektroskopie n Chromatografie (HPLC) n ELISA
Metody využívané sou asnou proteomikou pro studium protein 1. Dvoudimenzionální elektroforéza
Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva doprava a pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol .
2. Rentgenová krystalografie
Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnové délce. Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istého proteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví se jakour itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazci obsahuje informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.
3. NMR - spektroskopie
Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence. Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat a ur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly. V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymu celulázy . Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídající rozmíst ní skvrn je v ásti (B).
4. Hmotnostní spektroskopie
1 5 6 1 .6 1 5 6 0 .6 1 5 5 9 .6
100
Intensity [%]
80
1 5 5 8 .6 1 5 6 2 .6
60 40
1 5 5 7 .7 1 5 6 3 .8
20 0 1550
1555
1560
1565
1570
M a s s /C h a rg e
Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda pro ur ování hmotnosti molekul a jejich ástí. Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm si molekul a iont separuje nabité ástice podle jejich efektivní hmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje je stanovit. Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejné hmotnosti v celkovém množství iont ve sm si. Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristický pro danou látku a dává cenné informace o její struktu e a na jeho základ lze v tšinou strukturu látky odvodit nebo potvrdit. Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovat látky v množství kolem 10 9 g.
SDS-PAGE
(= sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) -metoda pro separaci protein dle jejich velikosti
Pro používat akrylamidový gel k separaci protein ? n
Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix
n
Ideální pro separaci protein
n
Menší velikost pór než u agarosy
n
Proteiny jsou menší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvo en polymerací aktylamidu a N´,N´methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými i rozkladu persíranu amonného.
Jednotlivé kroky experimentu *P íprava polyakrylamidových gel * íprava vzork pro SDS-PAGE *Pova ení vzork p i 95°C po dobu 4 min. *Aplikace vzork na gel *Vlastní elektroforesa probíhá p i konstantním nap tí 200 V po 30-40 min *Barvení gelu pomocí Coomassie Blue *Odbarvení gelu MetOH/HOAc
Diskontinuální elektroforéza v PAGE n n n n
n n
n
2 r zné gely a n kolik odlišných pufr o r zném pH Porozitu lze volit podle o ekávaného spektra látek licí gel (s pufrem o hodnot pH 8,8) se p ekrývá cca 1 cm vrstvou tzv. startovacího (zaost ovacího) gelu s velkými póry (pufr o hodnot pH 6,8) Tris-glycinový elektrodový pufr (pH 8,3-8,6) – po zapnutí proudu ionty tohoto pufru putují z nádoby do startovacího gelu a p ed nimi postupují ionty z tohoto gelu Ionty s elektrod. pufru se setkávají s pH, které je daleko nižší než jejich pK a vytvá ejí proto nenabité (u glycinu obojetné) formy – nepohyblivé v el. poli Tím je zp soben lokální nedostatek nabitých ástic, vzniká velký odpor – musí být kompenzován (místním zvýšením intenzity el. pole). Anionty se pohybují rychleji, dokud nevstoupí do d licího gelu – rychlost je zpomalena p ítomností velkého množství iont v pufru ⇒ ionty makromolekul vstupují do d licího gelu v podob velmi úzkých, na sebe navrstvených proužk se azených dle své pohyblivosti Ve vyšším pH d licího gelu nabudou makromolekuly znovu svou pln nabitou formu a dále probíhá normální elektroforetické d lení (získaná hustota zón p i vstupu makromolekul do d lícího gelu zvyšuje stupe rozlišení jednotlivých molekul).
Praktické zhotovení gelu n n n n
n n n
ipravíme ELFO skla Složíme elektroforetické kom rky pro nalití gel ipravíme základní roztok pro d licí gel, p idáme k n mu TEMED a APS pro zahájení polymerace Naneseme gel do elektroforetické kom rky, zarovnáme hladinu redestilovanou vodou a necháme tuhnout (min. 45 min). ipravíme roztok pro zaost ovací gel, p idáme k n mu TEMED a APS Nanášíme jej do elfo kom rky na povrch d licího gelu a vsadíme eben pro vytvo ení jamek a necháme jej tuhnout (min. 45 min) Odstraníme h eben, uvolníme elfo kom rky s gelem
n n n
Do elektroforetické nádoby nalejeme elfo pufr Stojan s elfo kom rkami s p ipravenými gely vložíme do elfo nádoby, doplníme elektroforetický pufr Naneseme vzorky (p ed nanášením se musí pova it se vzorkovým pufrem p i 90-100°C po dobu 5 min)
n
Doplníme elfo pufr a zapneme zdroj (80V po 0,5-1hod, 120 V po 1-1,5 hod)
n
Ukon ení elektroforézy po dob hnutí elfo barviva na konec d licího gelu Rozd láme elfo kom rky, vyndáme gely a: - barvíme - p eneseme proteiny na nitrocelulózovou membránu a blotujeme…
n
Akrylamidový gel
akrylamid
N,N‘ - methylenbisakrylamid
Akrylamidový gel
Zdroj volných radikál APS amonium persulfát (NH4)2S2O8 (peroxodisíran amonný) CAS 7727-54-0 Katalyzátor TEMED N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiamin CAS 110-18-9
Akrylamidový gel
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH3 CH2
•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent
CH2 CH2 CH2 CH2
–solubilizuje a denaturuje proteiny
CH2 CH2
–dodává protein m negativní náboj
CH2 CH2
tšina protein váže SDS ve stejném pom ru, asi 1,4 g SDS/g proteinu
CH2 CH2 O
-
O
O
SDS
O
•Zvýšená teplota denaturuje proteiny
S
-proteiny jsou tepeln denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti
Pohyb takto upravených protein v elektrickém poli: -proteiny mající negativní náboj se pohybují sm rem ke kladn nabité elektrod
SDS-PAGE standardy Protein Kalibrované MW v Tris-HCl gelu n Myosin 201,179 n β-galactosidáza 120,284 n Bovinní sérový albumin 100,236 n Ovalbumin 55,925 n Anhydráza 38,289 n Soyben trypsin inhibitor 29,678 n Lysozym 20,669 n Aprotinin 6,969
Co obsahuje vzorkový pufr pro SDS-PAGE? *Tris pufr utvá í vhodné pH *SDS (dodecyl sulfát sodný) detergent poskytující protein m negativní náboj *Glycerol vzhledem ke své vyšší specifické hmotnosti zajiš uje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení *“Bromophenol Blue“ barvivo umož ující sledovat pr h elektroforézy (pohyb ela v gelu)
Separace protein v akrylamidovém gelu
íprava gelu
Denaturované vzorky jsou naneseny na gel
Podmínky pro elektroforézu: •15 min, 50 V •15 min, 100 V •1 – 1,5 hod 150 V
K vizualizaci protein dochází v roztoku Coomasie blue.
Jak funguje SDS-PAGE? s-s
•Negativn nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrod •Menší proteiny se pohybují rychleji •Proteiny se rozd lují podle velikosti (molekulové hmotnosti)
SDS, zah átí Proteiny s SDS
-
+
Molekulová hmotnost protein n
velikost m ena v daltonech (Da) i kilodaltonech (kDa)
n
Dalton
= jednotka atomové hmotnosti = p ibližn se rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x 10 -24 g) = definován také jako 1/16 hmotnosti atomu kyslíku
n
Pr
rná aminokyselina = 110 Da
n
Pr
rný nukleotidový pár = 649 Da
Blotting protein a nukleových kyselin Pro další charakterizaci nebo p i mikropreparaci je nutné extrahovat proteiny i nukleové kyseliny z gelu, kteý je nevhodný pro manipulaci i pro provád ní detek ních chemických reakcí. Je p itom nutné zabránit smísení separovaných biomakromolekul. Nej ast ji se používají techniky tzv. blottingu (angl. blot = skvrna, ka ka, esky p enos) . P i blottingu se pásy separované elektroforézou p enášejí na ur itou membránu, kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Po vazb na membránu je pak možné provád t analýzu znými zp soby. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979)
Southern blotting DNA je z gelu p enesena na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. ítomnost ur ité jedno et zcové DNA je pak potvrzena hybridizací vazbou komplementárního DNA et zce (sonda i proba), který je zna en radioaktivn , biotinylací nebo vazbou antigenu pro imunodetekci. Použití nap . pro azení fragment restrik ního št pení genomové DNA jednotlivým gen m. Northern blotting Separovaná RNA je p enesena na membránu. Specifická detekce se d je hybridizací s komplementární DNA sondou, která je zna ena. Ob metody mají velký význam pro molekulární biologii, ale v sou asné dob jsou ast ji zastupovány PCR technikami.
Western blotting Proteiny jsou separovány SDS-PAGE a následn p eneseny na nitrocelulózovou nebo polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu. Barvení na membrán se provádí pomocí Ponceau S, Fast Green nebo Amido erni10 B. Specifická detekce protein se provádí použitím primárních protilátek; vzniklý imunokomplex se visualizuje vazbou zna ené sekundární protilátky nebo zna eného proteinu A i G (zna ení nej ast ji vazbou enzymu - nap . alkalické fosfatasy a peroxidasy, ale i koloidním zlatem, radioaktivn , luminiscen i fluorescen . Detekce glykoprotein se d je modifikovanou Schiffovou reakcí, alcianovou mod í, vazbou lektin . N které enzymy lze prokázat b žnou reak ní sm sí nebo p i blottingu asto dochází k renaturaci již denaturovaných bílkovin.
Blokování Vzhledem k tomu, že v tšina používaných detek ních systém po blottingu obsahuje jako indika ní složky proteiny, je nutné po vlastním p enosu blokovat zbývající vazebná místa na membrán , aby zde nedocházelo k nespecifické vazb t chto bílkovin. Nesmí však dojít k vyt sn ní vzorku, jeho modifikaci nebo k interferenci s detek ní reakcí. Používají se: inertní proteiny BSA, kasein, hemoglobin, želatina p íp. nízkotu né mléko. Nespecifické vazb protein na membránu p i detekci brání v n kterých aplikacích použití neionogenních detergent . Obdobn je nutné inaktivovat volné reaktivní skupiny diazotovaných membrán a membrán aktivovaných CNBr. To se d lá použitím 10% roztoku ethanolaminu.
Rozd lení metod blottingu podle provedení Difuzní blotting - prostá difuze v tanku s p enosovým pufrem, dlouhá doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou difuze do stran zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - blotovací membrána umíst na na povrchu gelu, který leží na porézní podložce v nádob s p enosovým pufrem, na ní pak vrstva vlhkého filtra ního papíru a ada vrstev suchých filtra ních papír . Celá jednotka je zatížena. Suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - obdobné uspo ádání jako u kapilárního blottingu, místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatn rychlejší (30 min). Výhodou též ost ejší pásy (potla ení difuze).
Kapilární blotting
Rozd lení metod blottingu podle provedení Elektroblotting - nejrychlejší a nejú inn jší metoda. Hnací silou je v tomto p ípad síla elektrického pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. „tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semidry)“ blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Hlavními výhodami polosuchého blottingu v porovnání s tankovým jsou: 1) homogenní elektrické pole, 2) možnost vyššího nap ového gradientu , 3) menší spot eba p enosového pufru, 4) možnost simultánního p enosu z n kolika gel Volba p enosového pufru je podmínkou pro úsp šný blotting. ležitý pro výb r složení je zejména typ použité membrány, u elektroblottingu p istupuje ješt pH pufru a iontová síla.
Elektroblotting
Difuzní blotting a tankový elektroblotting
Polosuchý elektroblotting
