Proteinchip technológia - alkalmazások • Fehérje felfedezés • Fehérje tisztítás • Fehérje azonosítás – peptidtérképezés, bio / betegség markerek • Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) • Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára
Fehérje felfedezés, biomarker keresés • 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás • B kivonása A-ból szoftver segítségével • Egyedi fehérje azonosítása
Fehérje tisztítás • Mikroliternyi mennyiség • Mikrokromatográfiás előtisztítás • Egyre erőteljesebb mosás a csipen • Homogén tisztaság pikomól mennyiségben • Néhány óra hónapok helyett
Epitóp térképezés • Ellenanyag kötése a csip felszínére • In situ emésztés • Nemkötődött fragmensek mosása • Kötődött fragmensek leolvasása
Fehérje-fehérje kölcsönhatások • 12,938 pont • Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz •Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni2+-en át a felülethez kötötték)
P-P interakciók elemzése microarray-jel
• Array+biotinilált kalmodulin • Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése • Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése
Metabolomika • Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése • Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula • Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)
Metabolomika – elválasztás • Gázkromatográfia(GC) • Kapillárelektroforézis (CE) • Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) • Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC) • GC-MS • HPLC-MS • Detektálási módszerek • NMR, MS
Metabolomika – elválasztás • Adatok értékelése – összehasonlítás, differencia analízis stb. • Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész) - Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika
Biológiai útlevél • Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák • Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt: • A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző • A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják
Bölömbika
8. A kémiai biológia alapfogalmai
Bioortogonalitás. Jelölési technikák (fluoreszcens, PET, MRI)
8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia OAc N N
N N
Kémiai biológia Fluorofórok HOH
SO2
N3
HO H
R
HO
H OH H OH OH
Bioortogonalitás
Biokémia
Kémiai biológia • Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel • (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) • Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) • Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)
Bioortogonalitás • Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) • Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba – nincs keresztreakció, „szervezetidegen” funkciók • Gyors, kvázi kvantitatív („klikk”-reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális
„ártalmatlan” melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus
Bioortogonális modulok • Célvegyület (biomolekula) • „Kémiai hírvivő” – bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) • Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)
Bioortogonális reakciók • Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) • Staudinger ligáció (azid + foszfin) • Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes • Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)
Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció
• Gyors • Szelektív • Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) • UV fény
Staudinger ligáció
• Biokompatibilis • Lassú • Spontán foszfin oxidáció
Staudinger ligáció
Azid-alkin 1,3-dipoláris cikloaddíció, Huisgen reakció
• magas hőmérséklet • regioizomerek (1,4 és 1,5)
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció
• • • •
Szerves oldószerek, vizes közeg, pH: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció
• Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) • Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexszál, vagy egyéb adalélok (TBTA) TBTA
Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció • Glikoproteid jelölés • Metabolikus módosítás (Ac4ManAz)
24
Vörös, közeli IR, mega‐Stokes klikk festékek
λmax /λem
523/630 nm
544/680 nm
588/744 nm
• Nem citosztatikusak • CHO sejtek jelölése: • A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után •D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után • G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel
Cu(I) mentes klikk reakció R1
R1 +
R2
N3
R1
R2
r.t. N N
N
1,4 triazol
• -C(sp3)-C(sp)- = 155-163° • ~75,3 kJ/mol gyűrűfeszültség • Nem szükséges Cu(I) • Lassabb, bonyolult reagensek
R2
+ N N
N
1,5 triazol
Ciklooktin reagensek F
F
F
F R DIFO
0.08[a]
R DIBO
0.05[a]
N R
R endo/exo BCN
0.14 / 0.11[b]
DIFBO
0.22[a]
O
BARAC
0.96[a]
0.29 / 0.19[c]
CO2Me COMBO
0.24[a] 0.80[d]
clogP
= 4,8
clogP
= 1,9
[a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v) 28
Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO
O
O
COMBO-Flu
• U937 sejtek, FACS
B. R. Varga. M. Kállay, K. Hegyi, Sz. Béni, P. Kele (2011) Chem. Eur. J. in press.
29
Membrán glikoproteid festés (ManNAz) A
• 12.5 µM COMBO-Flu
30 min B
• A-C ManNAz + • D-E ManNAz – • Magfesték (Hoechst 33342)
45 min C 60 min D 30 min
• Mosás nélkül !!
E 60 min
30
Diels-Alder reakció
• Biokompatibilis • Gyors • Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)
Diels-Alder reakció
Kémiai hírvivők • Kötődés a célterülethez - Ritka funkciós csoportokon át kémiai úton - Metabolizmus segítségével (módosított metabolittal) - Bioortogonalizált építőelemek genetikai bevitele (STOP kodonhoz kötődő tRNS-en át) • Reakció a jelzővegyülettel (bioortogonális reakcióval)
Jelzés bevitele • Előre jelzett kémiai hírvivő (egylépéses jelzés) - Kémiai funkció módosulhat - Lipofilitás túl nagy lehet (penetrációs tulajdonságok) - Háttérzaj (pl. háttérfluoreszcencia) – rosszabb jel/zaj arány
Jelzés bevitele • Kétlépéses (szekvenciális) jelzés - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)
Jelzések • Fluoreszcens jelzés - Fluoreszcens, fluorogén (nem fluoreszcens, csak a kapcsolás (ligáció) után válik azzá) - Nagyon érzékeny (femtomól) - Jó felbontás (subnanométeres térbeli, submikroszekundumos időbeli) - Olcsó - Korlátok: - mélység (UV legrosszabb, NIR nagyon jó) - Nem túl jó kontraszt
Jelzések • Pozitron jelzés (PET) - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18F) - Érzékeny, jó kontraszt, jó felbontás, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros
Jelzések • NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny
Jelzések • Kombinált jelzések • NIR fluorofór + PET • Jó kontraszt + érzékeny detektálás
Példa: halembrió glikolizációja
• Glikolizáció vizsgálata időben és térben • Három különböző színű ciklooktin • Három különböző időben adott Ac4GalNAz
