Proteinchip technológia - alkalmazások

Proteinchip technológia - alkalmazások • Fehérje felfedezés • Fehérje tisztítás

• Fehérje azonosítás – peptidtérképezés, bio / betegség markerek • Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) • Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára

Fehérje felfedezés, biomarker keresés • 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás • B kivonása A-ból szoftver segítségével • Egyedi fehérje azonosítása

Fehérje tisztítás • Mikroliternyi mennyiség • Mikrokromatográfiás előtisztítás • Egyre erőteljesebb mosás a csipen • Homogén tisztaság pikomól mennyiségben • Néhány óra hónapok helyett

Epitóp térképezés • Ellenanyag kötése a csip felszínére • In situ emésztés • Nemkötődött fragmensek mosása • Kötődött fragmensek leolvasása

Fehérje-fehérje kölcsönhatások • 12,938 pont • Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz •Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni2+-en át a felülethez kötötték)

P-P interakciók elemzése microarray-jel

• Array+biotinilált kalmodulin • Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése

• Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése

Metabolomika • Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése • Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula • Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)

Metabolomika – elválasztás • Gázkromatográfia(GC) • Kapillárelektroforézis (CE) • Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) • Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC)

• GC-MS • HPLC-MS • Detektálási módszerek • NMR, MS

Metabolomika – elválasztás • Adatok értékelése – összehasonlítás, differencia analízis stb.

• Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész)

- Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika

Biológiai útlevél • Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák • Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt:

• A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző • A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják

8. A kémiai biológia alapfogalmai

Bioortogonalitás. Jelölési technikák (fluoreszcens, PET, MRI)

8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia OAc N N

N N

Kémiai biológia Fluorofórok HOH

SO2

N3

HO H

R

HO

H OH H OH OH

Bioortogonalitás

Biokémia

Kémiai biológia • Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel

• (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) • Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) • Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)

Bioortogonalitás • Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív)

• Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba – nincs keresztreakció, „szervezetidegen” funkciók • Gyors, kvázi kvantitatív („klikk”-reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális

„ártalmatlan” melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus

Bioortogonális modulok • Célvegyület (biomolekula) • „Kémiai hírvivő” – bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia)

• Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)

Bioortogonális reakciók • Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) • Staudinger ligáció (azid + foszfin) • Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes

• Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)

Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció

• Gyors • Szelektív

• Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) • UV fény

Staudinger ligáció

• Biokompatibilis • Lassú • Spontán foszfin oxidáció

Staudinger ligáció

Azid-alkin 1,3-dipoláris cikloaddíció, Huisgen reakció

• magas hőmérséklet • regioizomerek (1,4 és 1,5)

Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció

• • • •

Szerves oldószerek, vizes közeg, pH: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás

Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció

• Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) • Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexál, vagy egyéb adalélok (TBTA) TBTA

Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3dipoláris cikloaddíció • Glikoproteid jelölés • Metabolikus módosítás (Ac4ManAz)

23

Vörös, közeli IR, mega-Stokes klikk festékek

lmax /lem

523/630 nm

544/680 nm

588/744 nm

• Nem citosztatikusak • CHO sejtek jelölése: • A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után •D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után • G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel

Cu(I) mentes klikk reakció R1

R1 +

R2

N3

R1

R2

r.t. N N

N

1,4 triazol

• -C(sp3)-C(sp)- = 155-163° • ~75,3 kJ/mol gyűrűfeszültség • Nem szükséges Cu(I) • Lassabb, bonyolult reagensek

R2

+ N N

N

1,5 triazol

Ciklooktin reagensek F

F

F

F R DIFO

0.08[a]

R DIBO

0.05[a]

N R

R endo/exo BCN

0.14 / 0.11[b]

DIFBO

0.22[a]

O

BARAC

0.96[a]

0.29 / 0.19[c]

CO2Me COMBO

0.24[a] 0.80[d]

clogP

= 4,8

clogP

= 1,9

[a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v) 27

Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO

O

O

COMBO-Flu

• U937 sejtek, FACS

B. R. Varga. M. Kállay, K. Hegyi, Sz. Béni, P. Kele (2011) Chem. Eur. J. in press.

28

Membrán glikoproteid festés (ManNAz) A

• 12.5 µM COMBO-Flu

30 min B

• A-C ManNAz + • D-E ManNAz –

• Magfesték (Hoechst 33342)

45 min

C 60 min D 30 min

• Mosás nélkül !!

E 60 min

Diels-Alder reakció

• Biokompatibilis • Gyors • Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)

Diels-Alder reakció

Kémiai hírvivők • Kötődés a célterülethez - Ritka funkciós csoportokon át kémiai úton - Metabolizmus segítségével (módosított metabolittal) - Bioortogonalizált építőelemek genetikai bevitele (STOP kodonhoz kötődő tRNS-en át) • Reakció a jelzővegyülettel (bioortogonális reakcióval)

Jelzés bevitele – egy lépésben • Előre jelzett kémiai hírvivő (egylépéses jelzés) - Kémiai funkció módosulhat - Lipofilitás túl nagy lehet (penetrációs tulajdonságok) - Háttérzaj (pl. háttérfluoreszcencia) – rosszabb jel/zaj arány

Jelzés bevitele két lépésben - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)

Fluorogén jelzővegyületek • Fluorogén: csak a kapcsolást követően lesz fluoreszcens – Minimális háttérfluoreszcencia – Jobb jel / zaj arány

• •

Herner et al. Org. Biomol. Chem., 2014, 11, 3297 Herner et al. Bioconjugate Chem., 2014, 25, 1370

Fluorogén jelzések

Normalized fluorescence intensity / a.u.

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00 400

450

500

550

600

650

l / nm

A. Herner, I. Nikic, M. Kállay, E. A. Lemke, P. Kele (2013) Org. Biomol. Chem. 11, 3297.

Jelzések • Fluoreszcens jelzés

- Nagyon érzékeny (femtomól, 1 molekula) - Jó felbontás (~1-100 nm térbeli, ns, ps időbeli) - Olcsó - Korlátok: - mélység (UV legrosszabb, NIR nagyon jó)

- Nem túl jó kontraszt

Jelzések • Pozitron jelzés (PET) - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18F) - Az annihiláció eredménye nagy energiájú foton - Érzékeny, jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros, gyengébb felbontóképesség

Jelzések • NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny, gyengébb felbontás

Jelzések • Kombinált jelzések • NIR fluorofór + PET • Jó kontraszt + érzékeny detektálás

Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan • Metabolikus • Módosított metabolittal (pl. azido-cukor)

• Glikoziláció követése

• Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 • Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

Kémiai hírvivő beépítése metabolikusan • Metabolikus • Módosított metabolittal (pl. azido-cukor)

• Glikoziláció követése

• Laughlin et al. Nat. Protoc. 2007, 2, 2930 • Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

Glikolizáció követése az embrionális fejlődés során

• Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

Glikolizáció követése

• Laughlin et al. Science, 2008, 320, 664

Bioortogonális funkciók genetikai bevitele

A transzláció • Genetikai kód: a DNS-en tárolt genetikai információ fehérjére való átírásának szabályrendszere • A fehérjére átírandó gén a DNS-ről mRNS-re másolódik • Az mRNS-ról a riboszómák végzik a fehérjeszintézist • A képződő fehérjéhez az aminosavakat a tRNS-ek szállítják (aminoacil) • A tRNS-ek kodonokat ismernek fel az mRNS-en • Kodon: egy aminosavat kódoló bázishármas (64) az mRNSen • Antikodon: a kodonnal komplementer bázishármas a tRNSen

A STOP kodon • Terminációs/nonszenz kodonok • Nincs olyan tRNS, melynek antikodonja komplementer lenne velük→nem kötődik hozzá tRNS→leáll a fehérjeszintézis • STOP kodont felismerő tRNS: a genetikai kód kiterjesztése 3 típus: • UAG: amber („különutas” baktériumoknál pl. Pyl) • UGA: opal • UAA: ochre

Nem-természetes aminosavak bevitele fehérjékbe

A genetikai kód kiterjesztéséhez szükséges • Ortogonális tRNS-szintáz/tRNS pár • Amber stop kodon a fehérjében • Nem természetes aminosav

Ortogonális tRNSUAG-aminoacil-tRNSszintáz pár • Ortogonális: olyan tRNS-szintáz, mely nem aminoacilezi a sejt többi tRNS-ét+olyan tRNS mely nem szubsztrátja a sejt többi szintázának • Az ortogonalitás mindig csak adott gazdaszervezetre érvényes

Gyakorlatban használt ortogonális tRNS/tRNSszintáz párok • Methanococcus janaschii tirozil-tRNSszintáz/tRNSCUA-MjTyrRS (E. coli) • E. coli leucil-tRNS-szintáz/tRNSCUA–EcLeuRS (élesztő, emlős) • E. coli tirozil-tRNS-szintáz/tRNSCUA-EcTyrRS (élesztő, emlős) • Methanosarcina pirrolizil-tRNS-szintáz/tRNSCUApyIRS (E. coli, élesztő, emlős, C. elegans)

Ortogonális tRNS/tRNS-szintáz kifejlesztése

Amber stop kodon bevitele fehérjékbe: Site-directed mutagenesis • Vagy meglevő Amber kodonra viszek be, vagy beépítek egy Amber kodont • Szükséges egy rövid oligonukleotid DNS primer: megfelelő helyen tartalmazza a kívánt mutációt (amber stop kodon) és komplement a mutálandó DNS-sel • DNS-hibridizáció: a DNS kettős szála hő hatására szétválik, majd a primer a megfelelő génszakaszhoz kötődik (annealing), azzal duplexet képez • A (már a mutációt tartalmazó gént) DNS-polimeráz írja tovább • A mutált gén klónozzák (PCR), majd elválasztják a mutációt nem tartalmazóktól

Helyspecifikus mutagenezis pl. Val cseréje Ala-ra

Kémiai hírvivő genetikai beépítése

•

Plass et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 3878

Inzulin receptor - expresszió követése

•

Nikic et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 2245

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése • Amfifil fehérjék szintézise baktériumban

• A kódoló gén bevitele (transzgenikus baktérium) • A kifejeződő fehérjék önszerveződése vezikulumokká • A szerveződési folyamat valós idejű követése

• A hidrofil részhez GFP-t is toldanak • Egyéb funkcióval való felruházás bizonyítása • Nem természetes –bioortogonális- aminosav beépítése és jelölése • Hatóanyagok direkt szintézise a betegben •

Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése

•

Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése

•

Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

Mesterséges organellumok önszerveződése, jelölése

•

Huber et al. Nat. Mater. 2014, doi: 10.1038/NMAT4118

Kémiai módosítás • Egyedi motívumok reaktivitása

• -SH, Ar-OH, Trp-indol • Natív kémiai ligáció

Tyrosine specific tagging

mega-Stokes, near infra-red dye HSA

HSA

labs = 560 nm lem = 700 nm

G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

Tyr specifikus jelölés

HSA

HSA

G. B. Cserép, A. Herner, O. S. Wolfbeis, P. Kele (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5776

Cys jelölés

HSA

HSA

G. B. Cserép, Zs. Baranyai, D. Komáromy, K. Horváti, Sz. Bősze, P. Kele Under review

Natív kémiai ligáció – N-terminális Cys C-term

N-term

1. Transztioészterifikálás (nukleofil támadás: lágy nukleofil Cys –SH)

2. S→N acil transzfer (amid stabilabb)

•Rekombináns, hely-specifikus módosítást (pl. poszttranszlációs) tartalmazó ciklikus peptidek, fehérjék szintézise •Kemoszelektív reakció egy tioészter-tartalmú és egy N-terminális Cys-t tartalmazó peptidfragmens között •Hátrány: természetes Cys kis száma