PROPOSAL KEGIATAN PENELITIAN SAMPLING SPONGE LAUT SEBAGAI SUMBER BAKTERI GRAM NEGATIF
Disusun Oleh: PRASTYO ABI WIDYANANTO RIANTI PUTRI PANGASTUTI SEPTHY KUSUMA RADJASA RACHMAT AFRIYANTO
JURUSAN ILMU KELAUTAN DEPARTEMEN ILMU KELAUTAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2017
DAFTAR ISI
HALAMAN COVER................................................................................................... DAFTAR ISI................................................................................................................ I.
PENDAHULUAN................................................................................................... 1.1. Latar belakang................................................................................................... 1.2. Tujuan penelitian...............................................................................................
II. TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................................... 2.1. Pulau Karimunjawa............................................................................................ 2.2. Organisme Laut................................................................................................... 2.3. Mikroorganisme Laut Asosiasi............................................................................ III. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan tempat penelitian............................................................................ 3.2. Alat dan bahan.................................................................................................. 3.3. Metode penelitian............................................................................................... DAFTAR PUSTAKA...................................................................................................... LAMPIRAN.......................................................................................................................
I.
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Keanekaragaman hayati di ekosistem laut lebih tinggi daripada di hutan hujan tropis (Larsen et al., 2005). Laut merupakan sumber natural product yang unik, umumnya bahan aktif ini terakumulasi pada invertebrata yang biasa hidup pada ekosistem terumbu karang seperti spons, tunikata, bryozoan, karang lunak, dan moluska. Bahan aktif tersebut merupakan senyawa alami yang dikeluarkan oleh oraganisme laut dalam pertahanan diri untuk melangsungkan kehidupannya, biasanya bahan tersebut berupa senyawa metabolit sekunder. Metabolit sekunder merupakan zat yang dimiliki oleh invertebrata laut sebagai penangkal serangan predator, dan mempertahankan eksistensinya di ekosistem. Beberapa metabolit sekunder dari invertebrata laut menunjukkan adanya aktivitas farmakologi salah satunya sebagai antibakteri dan memiliki peluang sebagai bahan obat (Proksch, 2002). Spons merupakan salah satu invertebrata laut yang memiliki kandungan metabolit sekunder, sehingga menjadi target eksplorasi sumber senyawa bioaktif alami (Sukarmi dan Radjasa, 2007). Untuk memperoleh senyawa bioaktif dari suatu organisme dapat dilakukan dengan mengekstrak organisme tersebut. Hal ini akan menimbulkan masalah baru karena dibutuhkan massa organisme dalam jumlah yang sangat besar. Menurut Proksch et al., 2003, senyawa yang sangat aktif pada invertebrata laut hanya berkisar kurang dari 10-6 dari berat basahnya. Eksploitasi spons yang berelebihan akan menjadi masalah serius bagi ekosistem terumbu karang dalam upaya konservasi. Hal tersebut dapat dihindari dengan memanfaatkan mikroorganisme seperti jamur dan bakteri yang bersimbiosis dengan spons yang memiliki metabolit sekunder dapat dijadikan sebagai alternatif. Kelecom (2001) menyatakan bahwa mikroorganisme simbion biasanya menghasilkan metabolit sekunder yang mirip dengan yang dihasilkan oleh inangnya. Pembagian atas jenis sel bakteri dibedakan dalam pewarnaan gram yaitu bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram negatif memilki perbedaan dengan bakteri gram positif antara lain pada pewarnaan gram (1) bakteri gram positif memunculkan warna biru akibat tertahanya reagen crystal violet yang berwarna biru pada sel bakteri, sedangkan (2) bakteri gram negatif memunculkan warna merah dari reagen safranin akibat lunturnya reagen crystal violet dari sel bakteri pada proses peluruhan. Gram
negatif merupakan sel bakteri dengan dinding sel yang mengandung peptidoglikan dalam jumlah kecil, lipopolisakarida, lipoprotein dan makromolekul kompleks lainnya (Madigan et al., 2015). Bakteri gram negatif biasanya menggunakan N-acyl homoserine lactones (AHL) sebagai molekul sinyal yang berfungsi sebagai penghubung reseptor protein untuk mengaktivasi ekpresi gen. Komunikasi bakteri terbeut difasilitasi oleh produksi dan pengakuan akibat adanya sinyal molekul kecil (autoinduser), juga bisa mengatur sifat fenotip yang penting seperti bioluminense, formasi biofilm, swarming motility, biosintesis antibiotik dan faktor produksi virulensi (Teasdale et al., 2009). Kepulauan Karimunjawa memiliki perairan dengan diversitas organisme laut yang tinggi, sehingga menjadikan tempat ini sebagai potensi pariwisata bahari karena menyajikan keindahan alam asli dengan keanekaragaman hayati. Pulau Karimunjawa juga termasuk dalam salah satu daftar kawasan konservasi nasional. Diversitas organisme yang tinggi tersebut menunjukkan bahwa kondisi lingkungan di Pulau Karimunjawa sesuai dengan lingkungan organisme laut untuk hidup dan juga bakteri asosiasinya syarat akan bahan bioaktif yang belum diexplorasi secara maksimal. Penelitian tentang organisme avertebrata laut dan bakteri asosiasinya ini diharapkan dapat menjadi salah satu upaya dalam pengembangan kawasan Karimun jawa, karena masih sedikitnya penelitian tentang organisme laut dan bahan bioaktif bakteri asosiasi pada organisme laut khususnya sponge.
1.2. Tujuan Tujuan kegiatan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri gram negatif yang berasosiasi pada invertebrata laut (spons) di Indonesia khususnya berasal dari Pulau Karimunjawa.
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Pulau Karimunjawa Secara geografis Karimunjawa merupakan kepulauan yang terletak antara 5°40’39 - 5°55’00 LS dan 110°05’57 - 110°31’15’ BT dengan luas wilayah sekitar 107.225 ha, tepatnya di sebelah utara dari Kabupaten Jepara, Jawa Tengah. Secara administratif, daerah ini termasuk wilayah Kecamatan karimunjawa, Kabupaten Jepara, Jawa Tengah. Kecamatan ini terbagi menjadi beberapa kawasan seperti kawasan pemerintahan, kawasan pemukiman, kawasan konservasi, dan kawasan pariwisata (BTNKJ, 2010). Wilayah Kepulauan Karimunjawa mempunyai iklim tropis yang dipengaruhi oleh angin laut dengan suhu rata-rata 26-30OC. Suhu maksimum 34OC dengan suhu minimum 22OC. Kelembaban antara 70-85%, dan tekanan udara berkisar antara 1,012 mbar. Dalam satu tahun terdapat dua pergantian musim, yaitu musim kemarau dan musim penghujan dengan musim pancaroba diantaranya. Musim kemarau (musim timur) terjadi pada bulan Juni-Agustus. Pada musim ini cuaca sepanjang hari cerah dengan curah hujan rata-rata <200 mm/bulan, rata-rata penyinaran matahari antara 70-80% setiap hari. Bulan kering terjadi pada Maret-Agustus dengan curah hujan sekitar 60 mm/bulan. Arah angin datang dari timur sampai tenggara dengan kecepatan 7-10 knot, kadang-kadang mencapai 16 knot lebih. Musim pancaroba pertama terjadi pada September – Oktober, pada periode ini angin didominasi dari barat dan barat laut, juga dari timur dan utara dengan kecepatan yang sangat bervariasi (BTNKJ, 2010). Topografi Kepulauan Karimunjawa dapat dibedakan menjadi tiga, yaitu perbukitan, perbukitan bergelombang, dan dataran rendah. Perbukitan terbentang luas di Pulau Karimunjawa dengan ketinggian 200-500 m. Bertekstur kasar, berlereng terjal, dan disusun oleh batuan sedimen pra-tersier. Perbukitan bergelombang terbentang di Pulau Karimunjawa, Pulau Kemujan, Pulau Parang, dan Pulau Genting, dengan ketinggian 25200 m, bertekstur halus hingga agak kasar, berlereng landai, dan disusun oleh batuan sedimen dan batuan gunung api. Gunung Walang dan beberapa gumuk (bukit kecil) merupakan tonjolan topografi pada daerah ini. Dataran rendah terbentang di Pulau Karimunjawa, Pulau Kemujan, Pulau Parang, Pulau Genting, Pulau Menjangan, Pulau Cemara, Pulau Bengkoang, Pulau Geleang, dan Pulau Sintok dengan ketinggian antara 025 m. Penyusun substrat dataran rendah ini antara lain aluvium dan sedikit batuan gunung api atau batuan sedimen (BTNKJ, 2010). Peta Karimunjawa dapat dilihat pada
gambar 2.1. Kepulauan Karimunjawa sebagai tujuan pariwisata bahari merupakan daerah kepulauan
dengan
topografi
yang
menyajikan
keindahan
alam
asli
dengan
keanekaragaman hayati seperti terumbu karang. Gugusan terumbu karang di Kepulauan Karimunjawa umumnya dikelilingi oleh terumbu karang tepian (fringing reefs) hingga kedalaman 20 meter.
Gambar 2.1. Peta Kepulauan Karimunjawa, Jepara
2.2. Organisme Laut Terumbu karang merupakan ekosistem di perairan tropis yang kaya akan biotabiota penyusunnya, dengan keanekaragaman jenis yang tinggi. Salah satu biota penyusun
terumbu karang adalah karang lunak (Octocorallia,
Alcyionacea). Kelompok ini
diwakili oleh famili Alcyoniidae yang merupakan kelompok karang lunak yang tersebar luas di perairan Indo-Pasifik Barat dalam jumlah besar (Manuputty, 2008). Karang lunak menghasilkan senyawa bioaktif yang bermanfaat bagi karang lunak tersebut dan bagi manusia. Senyawa bioaktif merupakan metabolit sebagai produk metabolisme organisme yang melibatkan anabolisme dan katabolisme. Ada dua jenis metabolit
yang
dihasilkan
oleh
organisme
selama
masa
pertumbuhan
dan
perkembangannya yaitu metabolit primer dan metabolit sekunder. Menurut Khatab et al. (2008), senyawa bioaktif adalah senyawa kimia aktif yang dihasilkan oleh organisme melalui jalur biosintetik metabolit sekunder. Muniarsih (2005) melaporkan bahwa metabolit sekunder atau sering disebut natural product diproduksi oleh organisme pada saat kebutuhan metabolisme primer sudah terpenuhi dan digunakan dalam mekanisme evolusi atau strategi adaptasi lingkungan (fungsi penting dalam ekologi). Karang lunak menghasilkan senyawa metabolit sekunder berfungsi untuk menghadapi serangan predator, media kompetisi, mencegah infeksi bakteri, membantu proses reproduksi, dan mencegah sengatan sinar ultra violet (Harper et al. 2001). Elyakov dan Stonik (2003) melaporkan bahwa karang lunak menghasilkan beberapa dari golongan senyawa hasil metabolit sekunder, seperti alkaloid, terpenoid, steroid, flavonoid, fenol, saponin, dan peptide. Karang lunak genus Sarcophyton banyak mengandung senyawa bioakif terpenoid, seperti cembranoid diterpenoid (Yulin Li et al. 2006). Koh et al. (2000) menambahkan bahwa jenis senyawa cembranoid diterpen lain yang terdapat pada karang lunak Sarcophyton glaucum mengandung senyawa sarcophytolide memiliki sifat neurotoksik dan berperan sebagai antibakteri dan antifungi. Ekstrak eter Sarcophyton glaucum tersebut dapat menghambat bakteri S. aureus, E. coli, dan Saccaromyces cerevisiae, sedangkan ekstrak etil asetat dapat menghambat bakteri S. aureus, Clostridium albicans, dan S. cerevisiae. ( Badria et al, 1998). Senyawa kimia tersebut berpotensi sebagai sumber obat alami. Hasil penelitian yang dilakukan Badria et al. (1998) dan Swant et al. 2006) menunjukkan bahwa senyawa kimia aktif yang terdapat pada karang lunak Sarcophyton sp. menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri, antifungi, antitumor, neurotoksik, dan anti-inflamantori yang bermanfaat bagi industri farmasi. 2.3. Mikroorganisme laut Asosisasi Karakteristik bakteri laut ialah untuk pertumbuhannya memerlukan air laut atau kadar garam, sehingga bakteri laut digolongkan ke dalam kelompok bakteri halofilik
(NaCl). Berdasarkan toleransi kadar garamnya, menurut Ogenski dan Umbreit (1959) bakteri laut hanya dibagi dua yaitu bakteri halofilik moderat yaitu bakteri yang untuk pertumbuhannya memerlukan 1% hingga 20% NaCl sedangkan bakteri halofilik ekstrim yaitu bakteri yang memerlukan konsentrasi NaCl lebih dari 15% hingga 31%. Bakteri laut 95% adalah Gram negatif, sebagian aktif bergerak, 70% mengandung pigmen dan mempunyai toleransi yang besar terhadap suhu tetapi sensitif terhadap suhu tinggi (Pelczar dan Chan, 1986). Mampu hidup dalam tekanan hidrostatik yang ekstrim di laut yang sangat dalam (palung/trench). Berdasarkan taksonominya bakteri dimasukkan ke dalam kategori prokaryota oleh karena selnya tidak mempunyai kompartemen nukleus (inti sel). Sedangkan sel yang mempunyai kompartemen nukleus disebut eukariota, yaitu biota tingkat tinggi yang sudah mempunyai susunan jaringan tubuh yang lengkap. Prokaryota dibagi menjadi dua kelompok utama yaitu eubakteria dan archaebakteria. Eubakteria adalah bakteri yang sudah dikenal secara umum. Sedangkan yang termasuk kelompok archaebakteria adalah bakteri penghasil metan, bakteri yang ekstrim halofil (kadar garam) dan ekstrim termofili (suhu). Bakteri ekstrim halofil adalah bakteri yang hidup pada saturated brine (kadar garam yang sangat tinggi) dan ekstrim termofil adalah kelompok bakteri yang hidup pada suhu lebih besar dari 80°C (Fenchel, 2001). Bakteri laut memiliki kecenderungan untuk berasosiasi dengan suatu lapisan permukaan padat. Penyebaran bakteri di laut dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti gerakan air laut, jarak dari pantai, kedalaman, cahaya matahari, iklim dan organisme lain (Sidharta, 2000). \
III. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Mei - Agustus 2017
yang berupa
pengambilan sampel di Karimun Jawa, Jawa Tengah pada bulan Mei 2017. Sedangkan penelitian yang berkaitan dengan kultur bakteri dan senyawa bioaktif bakteri dilaksanakan di Laboratorium Umum Unit Pelaksana Terpadu (UPT) Universitas Diponegoro. 3.2. Alat dan Bahan Daftar alat dan bahan yang digunakan dapat dilihat pada tabel berikut: Tahapan 1. Koleksi dan identifikasi
2. Isolasi mikroorganisme asosiasi
3. Peremajaan bakteri uji
Alat Scuba Diving, Snorkeling Kamera underwater Plastik tahan panas Timbangan analitik Kertas label Cool box Es batu Buku identifikasi spons Cawan petri Jarum ose tusuk Gunting Tabung reaksi Laminar Air Flow Bunsen Inkubator Mortar Mikropipet Autoclave Rak Tabung reaksi Vortex Salinometer Mikroskop Pinset Tabung reaksi Kapas Aluminium foil Autoklaf Pipet Akuades Jarum ose Cawan petri Inkubator
Bahan Air laut Sampel (Sponge)
Alkohol 70% Media Zobel 2216E Air laut Steril Sampel (Sponge)
Media Zobel 2216E
4. Pewarnaan gram bakteri
5. Pemurnian mikroorganisme bakteri gram negatif
6. Kultur isolat bakteri
7. Ektraksi isolat
8. Analisis Kandungan senyawa
Cawan petri Bunsen preparat Pipet Kapas Tisu Aluminium foil Laminar Air Flow Cawan petri Bunsen Jarum ose Hotplate Pipet Tabung reaksi Kapas Aluminium foil Autoclave Laminar Air Flow Refrigerator Erlenmeyer Bunsen Hotplate Pipet Tabung reaksi Kapas Aluminium foil Autoclave Laminar Air Flow Refrigerator Alat-alat gelas Evaporator Kertas saring Shaker bath Silicat Si 60 Pipa kapiler Penggaris UV transilluminator
Reagen pewarnaan gram (crystal violet, safranin, alcohol, dan iodine)
Media Zobel 2216E Akuades Air laut steril
Media MEA (MaltExtractBrooth) Air laut steril Jamur asosiasi aktif
Kultur jamur asosiasi aktif Metanol Ekstrak jamur asosiasi aktif Pelarut (solven) Metanol
3.3. Metode Penelitian 3.3.1. Koleksi dan Karakterisasi Penelitian semi-eksploratif ini akan dilaksanakan dengan menggunakan metode experimental laboratorium untuk proses isolasi dan identifikasi mikrosimbioan dan bahan bioaktif. Dengan metoda semi-eksploratif, sampling biota dilakukan secara acak, tetapi ditentukan jenis biota laut mana saja yang akan diambil. Jenis biota laut yang akan diambil yaitu Sponges, tiga sampai sepuluh spesies.
Sampel yang digunakan dikoleksi dari Pulau Karimunjawa, Jawa Tengah. Sampel dikoleksi dengan metoda scubadiving pada kedalaman 3 hingga 10 m. Jumlah sampel yang diambil sebanyak tiga sampel dari setiap keenam biota laut. Setiap sampel diambil sebanyak 5-10 cm/sampel, kemudian dimasukkan ke dalam plastik tahan panas. Setelah sampai di daratan maka dilakukan isolasi bakteri asosiasi pada media agar zobel 2216E yang telah disiapkan sebelumnya. Berikutnya sampel tersebut ditransportasikan dalam keadaan dingin dengan menggunakan cool box yang diberi es. Pemberian label, difoto, dan dicatat karakterisasi dari sampel yang diambil.
3.3.2. Isolasi Mikroorganisme Asosiasi Sampel ditumbuk dengan mortar sehingga mikroba yang ada di permukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air laut steril. Perbandingan antara berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Lalu akan dilakukan pengenceran untuk memperoleh konsentrasi 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5. Setelah dilakukan pengenceran kemudian diambil sebanyak 100 µl untuk dilakukan inokulasi pada media zobel 2216E dengan cara spreading. 3.3.3 Peremajaan bakteri Penyegaran atau peremajaan bakteri yang sudah single koloni menggunakan media zobel 2216E strength agar. Media tersebut ditimbang sesuai ketentuan kemudian dilarutkan ke dalam 500 ml air laut, media tersebut dihomogenkan menggunakan hotplate pada suhu ±100oC, setelah homogen, bahan dituang ±15 ml kedalam cawan petri. Sebelum digunakan, media disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Media didinginkan di tempat yang steril pada suhu ruang. Setelah media agar siap, kemudian sebanyak satu sampai dua ose bakteri single koloni dimasukkan ke dalam media secara aseptik menggunakan metode streak. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC. 3.3.4 Pewarnaan Gram Pewarnaan gram bakteri memiliki empat langkah yaitu kultur bakteri single koloni tersebut ke dalam media zobel cair dengan optical density (OD) antara 0,5-0,8 (Lalitha, 2004). Kemudian ambil pipet dan letakan sampel di atas preparat, lakukan fiksasi. Crystal violet dituangkan ke atas preparat tersebut, tunggu hingga 1 menit dan kemudian dibasuh dengan air. Selanjutnya, iodine dituangkan ke atas preparat, tunggu hingga 1
menit dan dibasuh kembali dengan air, lakukan fiksasi. Dekolorisasi dengan alkohol 95 % dengan cara dituangkan ke atas preparat. Akhirnya, safranin dituangkan ke atas preparat dan tunggu hingga 30 detik, basuh kembali dengan air dan lakukan fiksasi.
3.3.5. Pemurnian mikroorganisme penghasil bahan bioaktif Pada tahap ini, koloni mikroorganisme asosiasi diisolasi secara aseptis untuk dipindahkan pada media baru. Proses isolasi ini dilakukan beberapa kali sehingga mendapatkan isolat asosiasi aktif yang murni (De Rosa et al., 2000).
3.3.6. Ekstraksi senyawa bioaktif Mikroorganisme asosiasi yang telah diperbanyak kemudian diekstrak dengan cara maserasi (perendaman) dengan metanol. Proses maserasi dilakukan selama 24 jam dengan tiga kali pengulangan. Kemudian hasil maserasi akan disentrifugasi untuk memisahkan media dan larutan ekstrak. Larutan ekstrak lalu disaring dengan dengan kertas saring sebelum proses pemekatan ekstrak dengan rotari evaporator.
3.3.7. Analisis kandungan senyawa bioaktif pada metabolit sekunder Mikroorganisme asosiasi baik jamur maupun Actinobacteria kandidat yang telah diuji aktivitas antibakteri dianalisis kandungan senyawa bioaktifnya. Tahap ini dilakukan dengan metoda uji TLC (Suzuki and Watanabe, 2005) dengan cara bahan bioaktif akan ditotolkan pada plat TLC kemudian di-visualisasi dengan berbagai reagen sehingga akan menghasilkan retention time dan warna yang khas yang mengindikasikan berbagai kelas senyawa yang terkandung dalam sampel tersebut (Touchstone and Dobbins, 1983).
DAFTAR PUSTAKA De Rosa, S.; A. Milone, A. Kujumgiev, K. Stefanov, I. Nechev, S. Popov. 2000. Metabolites from a marine bacterium Pseudomonas:Alteromonas, associated with the spons Dysidea fragilis, Comp. Biochem. Phys. Part B,126: 391–396.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Bender, K.S., Buckley, D.H., and Stahl, D. A. 2015. Brock Biology of Microorganism (14th ed.). U.S: Pearson Education, Inc., 81 p.
Teasdale, M.E., Liu, J., Wallace, J., Akhlaghi, F., and Rowley, D.C. 2009. Secondary Metabolites Produced by the Marine Bacterium. Appl. Environ. Microbiol., 75(3):567–572.
LAMPIRAN
KEGIATAN SAMPLING SPONGE LAUT SEBAGAI SUMBER BAKTERI GRAM NEGATIF DI TAMAN NASIONAL LAUT KARIMUNJAWA, JAWA TENGAH
Penanggung Jawab
: Prof. Dr. Ocky Karna Radjasa, M. Sc. Dr. Ir. Agus Triyanto, M. Sc.
Tim Ahli
: Muslihudin Aini, S.Pi., M.Si. Sakti Imam Muclishin, S.Kel.
Tim Pelaksana
: Prastyo Abi Widyananto Rianti Putri Pangastuti Septhy Kusuma Radjasa Rachmat Afriyanto
Lokasi pengambilan
: Pulau Menjangan Pulau Burung Pulau Gelean Pulau Sintok Pulau Kecil Pulau Gosong
Objek yang diambil
: Sponges 10 – 15 spesies @ 3-6 cm
