PRODUKSI PROTEOGLIKAN SEL OTOT POLOS PADA PEMBERIAN KURKUMINOID EKSTRAK TEMU MANGGA Latar belakang Proteoglikan (PG) merupakan makromolekul matrik ekstraseluler terdiri atas protein rantai glikosaminoglikan (GAG), dihubungkan oleh oligosakarida yang tersusun atas silosa-galaktosa-galaktosa. Proteoglikan yang terdapat pada pembuluh darah secara normal disintesis oleh sel otot polos. Sedangkan proses degradasi PG melibatkan endoglukonase, eksoglukodase, sulfatase dan protease. Proses katabolisme PG intraseluler terjadi di dalam lisosom, sedangkan katabolisme untuk heparin dilakukan di hati (Poole 1988). Proteoglikan berperan dalam membentuk matrik ekstraseluler, menghubungkan dan komunikasi sel-sel, tempat masuknya beberapa virus ke dalam sel. PG dapat sebagai reservoir faktorfaktor pertumbuhan dan pada beberapa kasus dapat mengatur faktor pertumbuhan seperti fibroblas. Melalui fungsinya sebagai protein, PG juga terlibat dalam pengaturan metabolisme lipid dan mengikat monosit pada matrik sub endotel (Mounkes et al. 1998). Biointesis proteoglikan berlangsung di dalam retikulum endoplasmik dan disempurnakan di dalam golgi. Pengaturan
biosintesis melibatkan beberapa
molekul penting baik berupa hormon, seperti hidrokortison, testosteron, follicle stimulation hormone(FSH)
maupun growth factor seperti PDGF, insulin-like
growth factor II, pituitary-derived fibroblast growth factor. Setiap jenis dari masing-masing sel mempunyai fungsi yang berbeda, seperti prostaglandin E1 dan E2, pada beberapa sel granulosa menstimuli sintesis proteoglikan tetapi pada sel – sel kondroisit bersifat menghambat sintesis proteoglikan (Poole 1988). Total proteoglikan pada penderita aterosklerosis produksinya lebih rendah dari keadaan normal (Edward & Wagner 1988). Jumlah chondroitin sulfat PG (CS-PG) lebih sedikit dari dermatan sulfat PG (DS-PG). Perubahan ini sebagai akibat adanya peningkatan degradasi protein inti dan glikosaminoglikan (GAG). Kaadaan ini dapat menimbulkan gangguan terhadap integritas struktural matrik, sehingga dapat
meningkatkan permebialitas terhadap lipoprotein plasma dan
gangguan ketahanan jaringan terhadap daya tekan. Penurunan heparan sulfat PG (HS-PG) yang diikuti peningkatan kondroitin sulfat PG (CS-PG) dan dermatan
116
sulfat PG (DS-PG) dapat terjadi pada PG arteri manusia selama kembangnya aterosklerosis. (Key et al. 2002; Kunjathoor et al. 2002). Kondroitin sulfat (CS) berperan dalam permebialitas arteri, pertukaran ion. Serta transport dan penimbunan bahan-bahan plasma seperti LDL. Dermatan sulfat (DS) berperan dalam pengaturan fibrilogenesis kolagen dan secara ionic berikatan dengan LDL. Heparan sulfat (HS), terdapat pada membran dan permukaan sel mempunyai urutan oligosakarida mempunyai fungsi khusus seperti: efek antiproliferatif terhadap sel otot polos, berikatan dengan fibroblast growth factor (FGF), berikatan dengan lipoprotein lipase, dan berkatan dengan antitrombin III. Pada kondisi aterosklerosis, PG mengalami perubahan komposisi, konsentrasi, morfologi, dan sifatnya sehingga mengganggu peranan dari proteoglikan (Edward & Wagner 1988; Hurt-Camejo et al. 1997; Stary et al. 1995; Wagner 1985). Beberapa peneliti melaporkan, bahwa C6S-PG dan DS-PG yang disekresikan oleh sel-sel otot polos dan
berproliferasi pada bagian intima
pembuluh arteri, memiliki afinitas yang tinggi terhadap apo B–100. Interaksi LDL- PG tersebut meningkatkan kemampuan LDL untuk beroksidasi dengan cara menginduksi modifikasi struktural (terutama apo B-100) dan meningkatkan waktu tinggalnya di dalam dinding arteri. Keadaan ini mengakibatkan terjadinya modifikasi hidrolitik dan oksidatif lebih lanjut. Proses penahanan dan oksidasi LDL ini akan meningkatkan pengambilan LDL oleh makrofag karena interaksi LDL teroksidasi-GAG meningkatkan afinitas lipoprotein dengan membran sel. Hal ini menyebabkan terjadinya pembentukan sel-sel busa pada makrofag (Hurt & Camejo 1987; Hurt-Camejo et al. 1992; Hurt-Camejo et al. 1997). Kaplan & Aviram (2001) mengemukakan hasil penelitiannya, selain sel-sel busa yang berasal dari makrofag, pada lesi aterosklerosis juga ditemukan sel-sel busa yang berasal dari sel otot polos. Sedangkan Vijayagopal & Glancy (1996); Kaplan & Aviram (2001); dan Racley (2006) menyatakan, bahwa kompleks PGlipoprotein pada sel otot polos, dirangsang oleh makrofag tanpa melalui reseptor (baik reseptor scavenger maupun B/E) melainkan kontak langsung antar sel. Pengaturan umpan balik pada sel otot polos tidak terjadi, sehingga menyebabkan
117
proses pengambilan kompleks tersebut berlangsung terus, sehingga menimbulkan akumulasi kolesterol ester yang pada akhirnya terbentuklah sel busa. Percobaan ini dimaksudkan untuk mendapatkan informasi tentang potensi kurkuminoid ekstrak temu mangga dalam mencegah pelepasan proteoglikan secara in vitro. Bahan dan alat percobaan yang digunakan: lima belas ekor tikus putih berumur 2-3 minggu, diperoleh dari PSSP LPM-IPB, DMEM, fetal serum albumin (FBS), fosfat bufer salin (PBS), 3.3-diaminobenzidin tetrahidro kloride, guadinin HCl, penisilin, streptomisin, nikostatin, asam glukoronat, sodium asetat, disodium EDTA, aminohrxanoic acid, tryptamin HCl. Alat yang digunakan: laminar flow, inkubator CO2, mikroskop, flask kultur, mikro pipet, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan alat gelas lainnya. Metode penelitian, arteri dibuka memanjang secara hati-hati dan diiris menjadi kecil-kecil (3-5 mm), ditempatkan dalam plate 100 mm yang telah berisi DMEM (10% FBS dan antibiotik). Kultur ditempatkan pada inkubator CO2 pada suhu 370C. Sel mulai tumbuh setelah kultur berumur satu minggu. Minggu kedua, volume media ditingkatkan karena terjadi penambahan jumlah sel. Medium diganti dua kali seminggu sampai sel konfluen. Kultur sel otot polos (komfluen) ditempatkan pada flask pertumbuhan yang mengandung FBS lalu di tripsinisasi, untuk dibekukan. Sel otot polos dapat digunakan pada pasase 3 sampai 7 dan dalam penelitian ini kultur sel digunakan pada pasase 6 (Leik et al. 2004). Prosedur Penelitian, Sebanyak 2x103 sel otot polos pada pasase ke 6 dikultur dan diinkubasikan ke dalam medium DMEM pada suhu 370C selama 24 jam. Kultur ditambahkan 10% FBS (v/v) dan 0,05% etanol dengan atau tanpa penambahan kurkuminoid ekstrak temu mangga (2 ppm/ml dan 8 ppm/ml). Kontrol dibuat tanpa menambahkan ekstrak temumangga. Setelah 24 jam, sel dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali lalu diberi 200 μg/ml fraksi LDL dan diinkubasi pada suhu 370C selama 72 jam sambil diamati setiap 24 jam. Setelah 72 jam, sel konfluen dan dapat dipanen. Konsentrasi proteoglikan ditentukan dengan mengukur asam heksarunat DENGAN menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
118
Analisis Proteoglikan , kultur sel otot polos yang konfluen dalam medium kultur dipanen pada pasase 6 dan dipisahkan dari medium (ditampung) dengan menggunakan kertas saring Whatman. Sel diekstraksi dengan 4,0 M GdnHCl di dalam Na Asetat pH 4,5 (15 ml/g berat sel dalam kultur) yang mengandung disodium EDTA, 0,1 M-aminohexanoic acid dan 5 mM tryptamin HCl. Selanjutnya, ekstrak disaring dengan kertas Whatman, lalu dibilas dengan 4,0 M GdnHCl dan bilasan ini ditambahkan ke dalam ekstrak. Proteoglikan diukur sebagai asam heksarunat dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Dionex SA, viosinesle Bretonneeux, Yvelines, Frances) kolom AS 11 dengan asam glukoronat sebagai standar (Lefever et al. 2004). Bentuk monolayer kultur sel otot polos tikus (Gambar 28). Sel terlihat tumbuh dengan baik dalam medium kultur pertumbuhan DMEM. Sel-sel otot polos dalam percobaan ini diduga berasal dari lapisan media pembuluh darah yang bermigrasi dan berproliferasi ke dalam intima. Secara normal maupun keadaan abnormal, sel otot polos dapat memproduksi proteoglikan. Jumlah proteoglikan yang dihasilkan cukup baik susunannya, namun keberhasilan ini tergantung beberapa faktor pertumbuhan maupun gangguan yang ada ketika melakukan kultur sel.
Gambar 29 Monolayer sel otot polos arteri koronaria tikus putih (perbesaran 160x) ). Sel otot polos diisolasi dari arteri koronaria tikus berumur 23 minggu, dengan cara membuka rongga dada, aorta dipotong dan ditampung dalam tabung berisi PBS (penisilin200 μ/ml, streptomisin 200 ug/ml & 50 U/ml nycostatin). Sel konfluen, dieliminasi dengan cara mengganti medium tanpa diberi FBS dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Menurut St Clair et al. (1995) di dalam media pertumbuhan untuk arteri normal mamalia, ternyata hanya dijumpai sel otot polos, dan sel-sel otot polos
119
ditemukan pada bagian intima normal. Sedangkan Stary et al. (1992) menyatakan bahwa hasil uji mikroskop elektron dan imunohistokimia, terdapat dua jenis selsel otot polos pada intima arteri manusia terdiri atas sel otot polos yang banyak mengandung miofilamen atau kontraktil dan yang banyak mengandung retikulum endoplasmik kasar (r-ER) atau sintetik. Dalam percobaan, sel-sel otot polos nampak tumbuh dengan baik dan bentuk sel tersusun rapi, nampak jelas di bawah mikroskop. Proteoglikan hasil anlisis dengan mengunakan KCKT dalam percobaan ini tidak dapat ditampilkan. Hal ini dikarenakan asam heksaronat yang diestimasikan sebagai proteoglikan tidak terdeteksi. Keadaan ini diduga proteoglikan tidak dilepaskan oleh sel otot polos ke dalam medium kultur pertumbuhan. Kemungkinan lain konsentrasi proteoglikan terlalu rendah atau dalam proses pembentukan asam heksoronat tidak terjadi. Selain itu diduga juga kemungkinan kurkuminoid ekstrak temu mangga yang diikubasikan dalam kultur sel mampu menghambat reaksi oksidasi lipid pada sel.otot polos yang dikultur
KEPUSTAKAAN Edwards IJ, Wagner WD. 1988. Distinct synthetic and structural characteristic of proteoglycans produced by cultured artery smooth muscle cells of atherosclerosis-susceptible pigion. The Journal of Biological Chemistry 263(20):9612-9620. Hurt E, Camejo G. 1987. Effect of arterial proteoglycans on the interaction of LDL with human monocyte-derived macrophage. Atherosclerosis 67:115126. Hurt-Camejo E, Camejo G, Rosengren B, Lopez F, Ahlstro C, Fager B, Bonjers G. 1992. Effect of arterial proteoglycans and glycosamino glycans on LDL oxidation and Its uptake be human macrophages and arterial smooth muscle cells. Arteriosclerosis and Thrombosis 12:569-583. Hurt-Camejo E, Olsson U, Wiklun O, Bonjers G, Camejo G. 1997. Cellular consequences of the association of Apo B lipoprotein with proteoglycans. Arteriolscler Thromb Vas Biol. 17: 1011-1017 Lefever G et al. 2004. Characterization of cell wall enzyme activities, pectin composition, and technological criteria of strawberry cultivars (Fragaria x ananassa Duch). J. food science . 69(4):222-224
120
Leik CE, Willey A, Graham MF, Walsh SW. 2004. Isolation and culture of arterial smooth muscle cells from human placenta. http://hyper.ahajournals.org/cgi/cgi/content/full/43/4/837 [16 Agustus 2008] Mounkes LC, Zong W, Cipres-Palacin G, Heath TD, Debs RJ. 1998. Proteglycans mediate catione liposome-DNA complex-based gene delivery in vitro and in vivo. The Journal of Biological Chemistry 273(40):26164-26170. Kaplan M, Aviram M. 2001. Retention of oxidation LDL by extracellular matrix proteoglycans leads to its uptake by macrophages an alternative approach to Study lipoprotein cellular uptake. J. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21:386393. Key SN, Platt JL, Vercellotti GM. 1992. Vascular endothelial cell proteoglycans are susceptible to cleavage by netrophils. Arteriosclerosis and Thrombosis 12:836-842. Kunjathoor VV, Chiu DS, O’Brien KD, LeBoeuf RC. 2002. Accumulation of bigglycan and perlecan, but not versican, in Lessions of murine models of atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22:462-468. Poole AR. 1988. Proteoglycans in health and disease: structure and functions. Biochem. J. 236: 1-10. Rackley CE. 2006. Phathogenesis of Atherosclerosis. http://www.patiens.update.com/print.asp?print=true&file=chd/2109 [12 Juli 2009]. Stary HC, Blakenhom DH, Chandler AB, Glagov S, Insull W, Richardson ME, Rosenfeld ME, Schaffer SA, Schwart CJ, Wagner WD and Wisller RW.1992. A definition of the initial, fatty streak, and intermediate lesion of atherosclerosis-prone region. Atherosclerotic Thrombosis., 12:1:120-134. Stary HC, Chandler AB, Glagov S, Gayton W, Insull W, Richadson ME, Rosenfeld ME, Schwartz CJ, Wagner WD and Wisller RW.1994. A definition of the intima of human arteries and its atherosclerosis=prone region. Atherosclerotic thrombotic, 12:1:120-130. Stary HC, Chandler AB, Dinsmor RE, Fuster V, Glagov S, Insull W, Rosenfeld ME, Schwart CJ, Wagner WD and Wisller RW.1995 A definition of advanced types of atherosclerotic Lesions and histological classification of atherosclerosis. Atherosclerotic thrombotic Vasc. Biol. 15:1512-1531. St. Clair RA . 1985. Pathogenesis of the atherosclerotic lesion. Current concept s of cellular an biochemical events. Atherosclerosis, hypertension, and vasospasmus, 1-29. Vijayagopal P, Glancy DL 1996. Macrophages stimulate cholesteryl ester accumulation in cuetured muscle cells incubated with lipoprotein proteoglycan complex. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16:1112-1121. Wagner WD. 1985. Proteoglycans strucrue and function as related to atherosclerosis. Annal New York Academy of Scienes 454:52-68.
121
