Probiotika a střevní bakteriální translokace při jaterní cirhóze

Interní hepatogastroenterologická klinika FNB a lékařské fakulty Masarykovy Univerzity Brno

přednosta kliniky a školitel Prof. MUDr. Jan Lata, CSc.

Probiotika a střevní bakteriální translokace při jaterní cirhóze

MUDr. Veronika Příbramská

Brno 2007

Poděkování: 1

Na tomto místě bych velice ráda poděkovala Prof. MUDr. Janu Latovi, CSc. za odborné vedení při zpracování této práce a za získání zájmu o hepatologii a akutní medicínu a bývalému přednostovi interní gastroenterologické kliniky Prof. MUDr. Petru Dítěti, DrSc. za zasvěcení do tajů gastroenterologie a získání zájmu pro vědeckou práci. Dále bych chtěla poděkovat za spolupráci a připomínky Prof. MUDr. Petru Fričovi, DrSc., MUDr. Janě Juránkové, Doc. MUDr. Práškovi, CSc. a v neposlední řadě střednímu zdravotnickému personálu IGEK Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie a Kliniky nukleární medicíny Fakultní nemocnice Brno a Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice v Hradci Králové.

Obsah:

2

Seznam zkratek................................................................................................................... 5 1. Úvod.................................................................................................................................... 7 2. Střevní mikroflóra............................................................................................................... 9 2.1 Vývoj střevní mikroflóry................................................................................... 9 2.2 Mikroflóra v jednotlivých částech GIT.............................................................. 10 2.3 Faktory ovlivňující složení střevní mikroflóry.................................................. 12 2.4 Funkce fyziologické mikroflóry........................................................................ 14 3. Střevní bakteriální přerůstání.............................................................................................. 17 4. Bakteriální translokace........................................................................................................ 19 4.1 Definice, obecné poznámky............................................................................... 19 4.2 Syndrom střevní dysfunkce................................................................................20 4.3 Patofyziologie bakteriální translokace u některých primárních patogenů......... 21 5. Jaterní cirhóza..................................................................................................................... 25 5.1 Definice............................................................................................................. 25 5.2 Patofyziologie.................................................................................................... 25 5.3 Klasifikace......................................................................................................... 26 5.4 Klinický obraz................................................................................................. ..27 5.5 Prognóza............................................................................................................ 31 6. Portální hypertenze............................................................................................................. 32 7. Jaterní cirhóza a infekce...................................................................................................... 34 7.1 Krvácení z jícnových varixů............................................................................. 35 7.2 Spontánní bakteriální peritonitida..................................................................... 36 7.3 Jaterní encefalopatie......................................................................................... 38 8. Antibiotika........................................................................................................................... 41 8.1 Antibiotika obecně.............................................................................................41 8.2 Antibiotika a GIT.............................................................................................. 42 9. Endotoxin............................................................................................................................ 44 9.1 Struktura, mechanismus účinku......................................................................... 44 9.2 Laboratorní průkaz bakteriálních endotoxinů................................................... 47 9.3 Limulus test …...................................................................................................48 10. Probiotika........................................................................................................................

49

10.1 Historie probiotik.......................................................................................... 49 10.2 Definice, mechanismus účinku, klinické využití............................................. 49

3

10.3 Klasifikace....................................................................................................... 52 10.4 Prebiotika......................................................................................................... 54 10.5 Synbiotika........................................................................................................ 55 11. Experimentální část............................................................................................................. 56 11.1 Soubor nemocných.......................................................................................... 56 11.2 Metodika.......................................................................................................... 57 11.3 Výsledky.......................................................................................................... 64 11.4 Statistické hodnocení....................................................................................... 70 12. Diskuze................................................................................................................................ 72 13. Závěr.................................................................................................................................... 82 14. Závěry pro praxi.................................................................................................................. 83 15. Literatura............................................................................................................................. 84

Seznam zkratek

4

AAD antibiotic associated diarrhoea AAC antibiotic associated colitis AFP

alfa-1-fetoprotein

AIDS syndrom získané imunodeficience CFU

colony forming unit = jednotka vytvářející kolonii

EPEC enteropatogenní Escherichia coli EpsA sekreční protein E.coli A EpsB sekreční protein E.coli B EpsD sekreční protein E.coli D EU

endotoxin unit = endotoxinová jednotka

GALT gut associated lymphoid tissue = lymfoidní tkáň střeva GIT

gastrointestinální trakt

HCC hepatocelulární karcinom HRS

hepatorenální syndrom

IBO

intestinal bacterial overgrowth = střevní bakteriální přerůstání

IEL

intraepitelové lymfocyty

IFN-γ interferon gama IgA

imunoglobulin A

IL-1

interleukin 1

IL-6

interleukin 6

IL-8

interleukin 8

IL-10 interleukin 10 LAB

lactic acid bacteria = bakterie mléčného kvašení

LAL

Limulus amébocytový lyzát

LPS

lipopolysacharid

MELD model for end-stage liver disease NCT

number connecting test = test spojování čísel

pNA

p-nitroanilin

PPI

inhibitory protonové pumpy

RES

retikuloendotelový systém

SC

sirný koloid

SIS

slizniční imunitní systém

s.o.

směrodatná odchylka

SPB

spontánní bakteriální peritonitida

5

Tc

technecium

TIPS transjugulární intrahepatální portosystémová spojka TNF-α tumor nekrotizující faktor alfa TGF-β tumor nekrotizující faktor beta

1. Úvod U pacientů s jaterní cirhózou jsou infekční komplikace časté a jsou obvykle způsobeny gramnegativními bakteriálními kmeny, které pocházejí z trávicího traktu. Porušení normální 6

mikrobiální rovnováhy ve střevě způsobuje bakteriální přerůstání, dochází k poruše slizniční bariéry, vzestupu bakteriální translokace, a mimo střevo se tak dostávají potenciálně patogenní bakterie. Prevence bakteriálního přerůstání, podpora slizničních bariér a modulace imunitní odpovědi jsou nezbytné v rámci profylaxe časných i pozdních infekčních komplikací u pacientů s jaterní cirhózou. K prevenci translokace patogenních bakterií se v minulých desetiletích široce používala antibiotika. Podávala se s cílem redukovat ve střevním (intraluminálním) obsahu potenciálně patogenní bakterie s následnou redukcí bakteriální translokace a snížením rizika vzniku sepse. Selektivní dekontaminace střevního traktu vykazovala dobré výsledky, ale záhy bylo jasné, že tato léčba je drahá a navíc dochází k selekci multirezistentních bakteriálních kmenů. V posledních letech se dostává do popředí alternativní strategie, a to podávání probiotik. Probiotika jsou živé mikroorganismy lidského původu, které pokud jsou podány v přiměřeném množství, mají příznivý vliv na zdraví hostitele. Při perorálním či enterálním podávání osídlí střevo, jsou zde schopny nadále přežívat a množit se. Probiotika jsou bezpečná, upravují mikrobiální rovnováhu ve střevě, posilují střevní imunitní systém a přitom jsou schopna odolávat nástrahám lidského gastrointestinálního traktu, kyselině chlorovodíkové, žluči atd. Předpokládá se, že probiotika mají příznivý účinek na všechny tři mechanizmy, které jsou spojeny s bakteriální translokací, tedy na střevní motilitu a přerůstání bakterií do tenkého střeva, strukturální slizniční bariérovou funkci a na imunitní systém. Probiotika se mohou uplatnit v léčbě jaterních onemocnění a jejich komplikací, zejména v léčbě jaterní encefalopatie, kde mohou nahradit antibiotika a potencovat účinek prebiotik, dále v prevenci a léčbě spontánní bakteriální peritonitidy. S vědomím možných nežádoucích účinků antibiotik a především jejich dlouhodobého podávání stoupá v posledních letech zájem o alternativní možnost ovlivnění infekčních komplikací u imunokompromitovaných nemocných s jaterní cirhózou, a to podáváním probiotických bakteriálních kmenů. Zejména pacienti s dekompenzovanou cirhózou jsou bakteriální infekcí ohroženi a často u nich přítomnost infekce prokážeme. Probiotika, živé nepatogenní bakteriální kmeny, představují novou možnost léčby a profylaxe infekčních komplikací, normalizací a zlepšením střevního osídlení mohou příznivě ovlivnit bakteriální přerůstání, omezit bakteriální translokaci, a tak zabránit infekčním komplikacím a následně snížit mortalitu pacientů s pokročilou jaterní dysfunkcí.. Cílem naší práce bylo podáváním probiotického kmene Escherichia coli Nissle normalizovat

mikrobiální střevní osídlení a ověřit, zda může mít příznivý vliv na hladinu

endotoxinu jako markeru bakteriální translokace, na minimální jaterní encefalopatii a funkční

7

schopnost jater u nemocných s jaterní cirhózou.

2. Střevní mikroflóra 2.1 Vývoj střevní mikroflóry Střevo dospělého člověka představuje asi deset metrů dlouhou trubici, jejíž extrémně nepravidelný vnitřní povrch je pokryt jednou vrstvou epiteliálních buněk představující plochu o 8

velikosti tenisového kurtu (cca 200 čtverečních metrů). Střevo novorozence je sterilní, avšak prvními mikroorganismy začíná být kolonizováno již v průběhu porodu. Složení mikroflóry je velice variabilní v průběhu prvních dnů života, ale již za několik málo týdnů se začíná stabilizovat. Souvisí se způsobem porodu, na okolním prostředím a typu výživy novorozence. U kojených dětí dominují střevní flóře bifidobakterie, zatímco u uměle živených novorozenců může být množství bifidobakterií až desetkrát nižší a jsou kolonizováni bakteriemi imitujícími dospělou flóru. Zdá se, že faktory prostředí významně ovlivňují střevní osídlení. U dětí porozených císařským řezem, u nichž nedošlo ke styku s vaginální a střevní flórou, dochází ke stabilizaci střevní flóry později. Střevní kolonizace u hospitalizovaných předčasně narozených dětí je narušena, přirozená zdravá mikroflóra sestávající z laktobacilů a bifidobakterií je u nich nalézána zřídka a jsou obvykle kolonizovány bakteriemi jako jsou enterokoky, stafylokoky či enterobakterie. Původní kolonizace lidského střeva je velice důležitá, neboť tyto bakterie tvoří příznivé prostředí pro svůj další růst, určují další kolonizaci bakteriemi, s nimiž se střevo setká v budoucnu. Původní kolonizace je tak podstatná pro konečné složení permanentní mikroflóry dospělého jedince. Opravdové změny střevního ekosystému se objevují po ukončení kojení a přechodu na tuhou stravu. V této době se zvyšuje počet obligátních anaerobů jako jsou bakteroidy a klostridia a střevní ekosystém se vyvíjí ve stabilní společenství (1). Jak již výše uvedeno kolonizace střeva novorozence je ovlivňována způsobem porodu a výživy. Flóra tlustého střeva obsahuje v prvních 24 hodinách po porodu bifidobakterie a laktobacily. Množství bifidobakterií rychle stoupá až na 109-13 CFU/g stolice, během týdne se objevují anaerobní koky, poměrně stoupá také množství klostridií, ale tyto u kojených dětí rychle mizí, přestože bifidobakterie dále narůstají. Klostridia, enterobakterie a enterokoky častěji nacházíme u dětí krmených kravským mlékem. Děti porozené císařským řezem jsou kolonizovány anaeroby v cca 60% a Bacteroides fragilis tvoří pouze 9%, kdežto u dětí porozených vaginálně tvoří B. fragilis až 61% (2, 3, 4, 5). Mikroflóra dospělého jedince zahrnuje nepředstavitelné množství mikroorganismů (1014, váha více než 1kg), převyšující počet buněk lidského organismu o jeden desítkový řád. Mikrobiální systém zahrnuje více než 500 druhů, většina z nich nebyla nikdy vykultivována a mnohé z nich ještě ani nebyly popsány (1). Rozlišujeme mikroflóru autochtonní, organismu vlastní, a allochtonní, zahrnující mikroorganismy vyskytující se ve střevě jen přechodně. Většina bakterií je obsažena v tlustém střevě, představují jakýsi “bioreaktor“ napomáhající při rozkládání nenatravitelných a nestravitelných polysacharidů a v syntéze mikronutrientů, jako jsou vitamíny a mastné kyseliny s

9

krátkým řetězcem. Produkty fermentace mohou zajistit až 10% denní energetické potřeby. Tento prospěšný vztah mezi bakteriemi a hostitelem je označován za komenzální a hraje důležitou roli ve vyzrávání a dalším rozvoji slizničního imunitního systému. Ve střevě člověka sídlí mikrobiální ekosystém umožňující využít jinak nevyužitelné částice potravy. Soubor všech genů obsažených v bakteriích kolonizujících střevo jsou označovány jako “mikrobiom“ (6). Tento mikrobiom může obsahovat až stokrát více genů než obsahuje náš lidský genom a je vybaven četnými metabolickými vlastnostmi. Přítomnost těchto prospěšných mikrobů (komenzálů) ve střevě brání kolonizaci a přerůstání potenciálních patogenů, což označujeme jako rezistenci ke kolonizaci (1, 7). Bakterie jsou schopny mezi sebou komunikovat prostřednictvím molekul označovaných jako autoinduktory (8). Tato mezibuněčná signalizace umožňuje bakteriím koordinovanou regulaci exprese jejich genů. Tak jsou schopny synchronizovat své chování a působit jako jakýsi mnohobuněčný organismus.

2.2 Mikroflóra v jednotlivých částech GIT Fyziologická mikroflóra trávicího ústrojí je enormně komplexní ekosystém sestávající z mikroorganismů jak aerobních tak anaerobních. Slouží spolu s imunitním slizničním systémem k ochraně organismu hostitele před invazí patogeny a příznivě se účastní některých metabolických pochodů (2). V dutině ústní převládají anaeroby před aeroby v poměru asi 100:1. Sliny obsahují přibližně 109 bakterií na ml. Převládají streptokoky, laktobacily, branhamely, peptokoky, peptostreptokoky, bakteroidy a fusobakterie. Nemocní s periodontopatiemi mají významně vyšší zastoupení anaerobů, podobně jako lidé nedodržující ústní hygienu. Mikroorganismy dutiny ústní se dostávají se slinami a potravou jícnem do žaludku. V jícnu dochází k pomnožení analogické flóry především za patologických stavů, každá obstrukce jícnu, ať organická nebo funkční, vytváří vhodné podmínky k pomnožení mikroflóry. Dalším podpůrným mechanismem jsou těžké devastující stavy, imunologická insuficience. V těcto případech se uplatňují také infekce kvasinkové, např. kandidová esofagitida, anebo virové, např. herpetická esofagitida. Tabulka č. 1. Složení mikroflóry lidského GIT (podle Norga a Kagera 1984) mikroorganismy

Počty mikroorganismů (CFU/ml nebo CFU/g) žaludek jejunum ileum 3 5 0-10 0-10 10 3-109

celkový počet bakterií aerobní bakterie Čeleď Enterobacteriacae 0-102 streptokoky 0-103

0-103 0-104 10

102 - 107 102 - 106

kolon 10 10-10 12 104 - 1010 105 - 1010

stafylokoky laktobacily kvasinky anaerobní bakterie bakteroidy bifidobakterie peptostreptokoky klostridia eubakterie

0-102 0-103 0-103

0-103 0-104 0-102

102 - 105 102 - 103 102 - 104

104 - 109 106 - 1010 104 - 106

vzácné vzácné vzácné vzácné vzácné

0-103 0-104 0-103 vzácné vzácné

103 - 107 103 - 109 102 - 106 102 - 104 vzácné

1010 - 1012 10 4 - 1011 1010- 1012 10 6 - 1011 1010- 1012

Většina mikroorganismů, které se dostanou z dutiny ústní do žaludku, jsou destruovány kyselou žaludeční šťávou. Žaludeční mikroflóra je převážně grampozitivní a aerobní. Koncentrace bakterií je obvykle méně než 103 mikroorganismů tvořících kolonie v 1 ml (CFU/ml). Nejčastěji izolovaným kmenem jsou streptokoky, stafylokoky, laktobacily a kvasinky. Anaeroby z dutiny ústní jsou přítomny v malém počtu (peptostreptokoky, fusobakterie, bakteroidy), koliformní mikroorganismy jsou fyziologicky vysloveně vzácné. Ke změně žaludeční mikroflóry dochází především za patologických stavů, k mikrobiálnímu přerůstání mají sklon všechny stavy spojené s hypaciditou a anaciditou, ale též s hrubou poruchou evakuace žaludku. Mikroorganismy se dostávají do žaludku i při duodenogastrickém refluxu. V orální části tenkého střeva se občas vyskytují i enterobakterie v koncentraci 102-5 CFU/ml. U nemocných s krvácejícím vředem dochází k neutralizaci kyselé žaludeční šťávy a vzniká vhodná živná půda pro růst mikroorganismů. Nacházíme potom směs aerobů a anaerobů. Podobně je tomu u duodenálního vředu, obstrukci pyloru či karcinomu žaludku. Problém achlorhydrie a přerůstání mikroorganismů je také spojován se snižováním žaludeční acidity léky, H2 blokátory a inhibitory protonové pumpy (PPI). Mikrobiální flóra orální části tenkého střeva má složení podobné jako žaludek a je také do jisté míry ovlivňována patologickými stavy žaludku. Normální koncentrace bakterií je 103-4 CFU/ml. K nárůstu mikroorganismů dochází zejména při městnání střevního obsahu (střevní obstrukce, syndrom slepé kličky). V jejunu převládají aeroby a grampozitivní bakterie, ale nalezneme zde i koliformní bakterie a anaeroby - častěji než v žaludku. V distálním ileu začínají převládat gramnegativní mikroorganismy nad grampozitivními. Běžně se zde vyskytují koliformní bakterie, z anaerobů bakteroidy, bifidobakterie, fusobakterie, klostridia. Podobnost s flórou tlustého střeva je dána průnikem mikroorganismů přes ileocékální chlopeň (back wash mechanismus). Aborálně od ileocékální chlopně množství aerobních a anaerobních mikroorganismů narůstá. Asi jednu třetinu fekální sušiny tvoří živé bakterie. Escherichia coli převládá mezi aeroby a může být izolována v koncentraci 107-8 CFU/g stolice. Mezi anaeroby dominuje Bacteroides fragilis a Eubacterium sp., časté jsou i anaerobní grampozitivní koky (Peptostreptococcus sp., 11

Peptococcus sp., Clostridium sp., enterokoky a různé druhy čeledi Enterobacteriacae). K výraznému narůstání bakterií kolon dochází orálně od obstrukce jakéhokoli původu. Mikroflóra tlustého střeva je velmi rozdílná v různých geografických oblastech, evidentně ovlivňována stravovacími zvyklostmi. Dle studií převažují v západní Evropě a Spojených státech anaerobní gramnegativní bakterie, zejména bakteroidy, v Indii a Japonsku jsou to grampozitivní anaerobní bakterie, zejména eubakterie (2).

2.3 Faktory ovlivňující složení střevní mikroflóry Složení střevní mikroflóry je regulováno již slinami (obsahujícími lysosomy), žaludeční kyselinou (pH), žlučí (nekonjugované žlučové kyseliny), pankreatickou šťávou (lipáza) a také střevní motilitou. Důležitou roli hraje také regenerace buněk střevní sliznice. Střevní mikroflóra má vlastní regulační schopnosti (tzv. colonisation resistance), brání průniku nežádoucích organismů a látek, inhibuje patogenní mikroflóru baktericidním působením mastných kyselin s krátkým řetězcem a produkcí peroxidu vodíku a sirovodíku. Vedle těchto neimunologických obranných mechanismů existuje buněčný (GALT, T a B lymfocyty) a humorální (sekreční imunoglobulin A) imunitní obranný mechanismus (9). Nemoc a s ní spojená léčba může vážně ovlivnit střevní ekosystém. Příkladem může být redukce slinné sekrece u Sjögrenova syndromu nebo dlouhodobé radioterapie hlavy a krku, snížená produkce žaludeční kyseliny u perniciózní anémie, po chirurgických výkonech (gastrektomie, vagotomie) nebo při léčbě H2 blokátory či inhibitory protonové pumpy. Za těchto okolností dochází často k nárůstu koliformních a obligátně patogenních mikrobů, ke zvýšenému riziku salmonelové, shigelové či kandidové infekce. V případech biliární obstrukce jsou časté infekce žlučových cest. K bakteriálnímu přerůstání dochází u pankreatické insuficience při poškození sekrece žluči a pankreatické šťávy, v případech porušené motility části gastrointestinálního traktu, jako je např. stáza v divertiklu duodena či tenkého střeva, při strikturách a stenózách ilea v rámci střevních zánětlivých chorob, u diabetické gastroparézy, sklerodermie či střevní pseudoobstrukce. Změny mohou působit také prokinetika či laxativa, neboť zcela vymítí přirozenou mikroflóru, zejména anaeroby. Také radioterapie, chemoterapie a malnutriční stavy obecně ničí buňky střevní sliznice. U imunodeficitních stavů chybějí buněčné i humorální obranné mechanismy (HIV infekce, deficit imunoglobulinů) a ačkoli v některých případech neimunologické mechanismy zvládnou udržet rovnováhu v osídlení střeva dlouhou dobu, mohou tyto abnormality vést k významné střevní dysmikrobii a kolonizaci střeva patogenními mikroorganismy (9, 10). Také stárnutí hraje ve střevním osídlení svou roli. Věkem dochází k poklesu sekrece slin, 12

polykání je méně častější a je snížena obnova slizničních buněk. Tak dochází snadnějí ke kolonizaci gramnegativními bakteriemi, jako jsou enterobakterie a pseudomonády, zvyšující riziko vzniku nemocničních nákaz (pneumonie zejména u nemocných na jednotkách intenzivní péče). Věkem také klesá počet střevních bifidobakterií a predominantními se stávají koliformní bakterie, klostridia a kandidy. Tyto změny však mohou být sekundární při zhoršené motilitě a při častější atrofické gastritidě ve stáří, stejně tak jako snížená imunologická tolerance a zpomalená buněčná regenerace (9). Zevní faktory, které ovlivňují složení střevní flóry, zahrnují výživu, medikamentózní léčbu, zevní prostředí a stres. Změny ve stravování a léky, jako např laxativa (magnesium sulfuricum zvyšující střevní peristaltiku, laktulóza a laktitol zvyšující fermentaci) a antibiotika, přímo ovlivňují střevní mikroflóru. Antibiotika mohou způsobit pseudomembranózní kolitidu vyvolanou bakterií Clostridium difficile. Střevní mikroflóru ovlivňuje také stres. Toto bylo prokázáno v experimentu na zvířatech, která byla vystavena nízkým teplotám nebo delšímu hladovění, a také u lidí při pobytu ve vesmíru a při velké fyzické zátěži. Při stresu byl popsán pokles laktobacilů v proximální části zažívacího traktu a vzestup koliformních bakterií v jeho distálních částech. Geografické odlišnosti ve složení střevní flóry jsou způsobeny klimatickými a hygienickými návyky, což můžeme pozorovat u infekčních nemocí jako je cholera, tyfus a paratyfus. Některé sérotypy Escherichia coli vyskytující se v kontaminovaných vodách, sýrech a syrové zelenině způsobují hlenovité bolestivé průjmy, někdy s krví. Cestovatelský průjem vznikající časně po příjezdu do zemí Afriky, Asie, Blízkého východu či Latinské Ameriky je způsoben enterotoxigenní E. coli. Mimo jiné je vyvolán jinými klimatickými a hygienickými návyky a také určitou neadaptovaností vůči chronické infekci. Určité změny ve střevní flóře byly popsány také u chronické zácpy, zvýšený počet enterobakterií, protea, bakteroidů, v určitých případech pokles bifidobakterií a laktobacilů. Hospitalizace také představuje změnu zevního prostředí, přesto nedochází většinou k významnějším změnám mikroflóry, i když hospitalizovaní mohou být nositeli patogenní E.coli a zlatého stafylokoka. Střevní mikroflóra je ovlivňována nemocemi a jejich léčbou, nedostatečnou výživou, též emočním stresem jako je strach, zloba a deprese při nemoci. Snížená sekrece žaludeční kyseliny a střevního hlenu poškozuje střevní flóru sníženou produkcí mastných kyselin s krátkým řetězcem, změna střevní motility způsobená gastrointestinálními a stresovými hormony a snížená aktivace lymfocytů rozvrací autochtonní bakteriální populaci.

13

2.4 Funkce fyziologické mikroflóry Střevní mikroflóra musí být schopna zajistit mnoho funkcí:
udržovat mikrobiální bariéru proti patogenům a potenciálním patogenům
ovlivňovat motilitu a prokrvení střevní stěny
stimulovat imunitní střevní systém a tím i tzv. společný slizniční imunitní systém
redukovat bakteriální translokaci
produkovat vitamíny Postupný přechod dominance aerobů v orálních částech trávicí trubice k převaze anaerobů v distálních partiích představuje základní funkčně strukturální změnu. Aeroby totiž pro celý mikroekosystém zajišťují tzv. scavenger effect tím, že s dominancí E. coli spotřebovávají kyslík v reakcích oxidativní fosforylace při energetickém metabolismu. Tím klesá aborálním směrem redoxní potenciál, což umožňuje růst anaerobů, které jsou jinak citlivé na přítomnost kyslíku, protože nejsou dostatečně vybaveny enzymy k eliminaci kyslíkových radikálů (kataláza, superoxiddismutáza). Takto je zajištěna vzájemná podmíněnost existence obou skupin mikroorganismů, neboť je zřejmé, že poškození aerobů vede následně k postižení anaerobní skupiny (10, 11, 12, 13). Mikrobiální bariéra proti patogenům a potenciálním patogenům bývá označována jako kolonizační rezistence aerobů a anaerobů gastrointestinálního traktu vůči patogenům (salmonely, shigely, yersinie, kampylobakter, vibria atd) a potenciálním patogenům (helicobacter, klostridia, kandidy atd.). Součástí je také kontrola oportunní mikroflóry (proteus, pseudomonády, enterobakterie, stafylokoky, streptokoky atd.). Kolonizační rezistenci definoval van der Waaij a je zajišťována následujícími mechanismy (7, 14):
obsazení potenciálních vazebných míst střevní výstelky – tzv. receptorová blokace
brzdění růstu a/nebo usmrcení cizích mikroorganismů
konkurence v získávání látek, vitamínů a růstových faktorů
snížení střevního pH
přímý antagonismus fyziologické mikroflóry vůči mikroflóře patogenní a potenciálně patogenní Střevní mikroflóra (aeroby i anaeroby) produkuje volné mastné kyseliny s krátkým řetězcem, zejména kyselinu propionovou, octovou, máselnou, laktobacily a bifidobakterie produkují kyselinu mléčnou. Tyto kyseliny jsou resorbovány´pasivní difuzí střevní mukózou a slouží ke krytí 40-50% energetické potřeby kolocytů. Současně zvyšují kolonické prokrvení mukózy, stimulují motilitu a zvyšují sodíkovou a chloridovou absorpci v distálním kolon (15, 16, 17, 18). 14

Lidský organismus je vybaven mechanickými, chemickými a imunologickými bariérami, které v místech kontaktu brání nekontrolovatelnému průniku antigenních a mitogenních podnětů do vnitřního prostředí organismu. K hlavním bariérám a kontaktním místům patří slizniční povrchy trávicího, dýchacího a urogenitálního traktu. Imunitní systém střevní sliznice zajišťuje bariéru proti patogenním mikroorganismům, imunogenům a také rezistenci vůči těm složkám potravy, které se do něj dostaly v imunogenní podobě. K základním rysům slizničního imunitního systému patří převaha protilátek třídy IgA, přednostní osídlování sliznic a exkrečních žláz buňkami, které pocházejí ze střevních lymfatických foliklů, a konečně transport polymerních imunoglobulinů do sekretu prostřednictvím epitelových buněk. Lymfoidní tkáň střeva (GALT) je systém, který během života zpracuje informace asi ze 100200 tun stravy a je permanentně osídlen fyziologickou a intermitentně i nefyziologickou mikroflórou. Vývoj GALT probíhá hlavně v časném postnatálním období a tvoří ji organizovaná lymfoidní tkáň, volné intraepitelové lymfocyty a lymfocyty lamina propria. Organizovaná lymfoidní tkáň je kryta epitelovou vrstvou, která však obsahuje zvláštní tzv. M-buňky (microfold cells), jimž chybí kartáčový lem, a naopak jsou v úzkém kontaktu s buňkami lymfatických foliklů. M-buňky mohutně pohlcují antigeny, které patrně translokují do prostředí foliklů, čímž indukují slizniční

imunitní

reakci.

Přitom

však

M-buňky

nejsou

vybaveny

znaky

hlavního

histokompatibilního systému II. třídy, tedy informace pouze přenášejí bez dalšího imunologického zpracování. Volné intraepitelové lymfocyty (IEL) jsou vmezeřeny mezi epiteliemi klků, větsinou se jedná o T-lymfocyty, převážně CD4 (T helper) nebo CD8 (T supressor), vzácně CD5, které patří k B lymfocytům. IEL produkují lymfokiny, které hrají roli v antimikrobiální ochraně sliznic, jsou schopny reagovat s antigeny (např. heat shock proteins), jsou schopny řízeně tlumit reakce na antigenní složky potravy, brání vzniku neúměrné reakce na imunogenní podněty potravy, např. v podobě potravinové alergie. Lymfocyty lamina propria představují převážně CD4 lymfocyty (T helper), zejména ze subpopulace Th1. Méně často jsou přítomny B lymfocyty, produkující IgA, méně IgM a nejméně IgG (11, 19, 20, 21). Imunitní reakce na sliznici GIT nevedou pouze k lokální odpovědi, ale také k odpovědi v cirkulaci a na sliznicím vzdálených orgánech, jde o tzv. společný slizniční imunitní systém. Buňky, především ve střevní sliznici, po kontaktu s antigeny migrují lymfatickou cestou do krevního řečiště a odtud do všech sliznic a endokrinních žláz (tzv. homing). Některé z recirkulujících buněk se tedy vracejí zpět i na původní místa nebo na místa reagující zánětem na sliznicích. Tento děj je fyziologický a proběhne přestupem lymfocytu z cirkulace do tkáně pouze na základě aktivačního signálu prostřednictvím cytokinů. Zpět do stěny střeva se dostávají především aktivované T lymfocyty a malé paměťové T lymfocyty. Pomocí specifických vazebných míst pro adheziny

15

organizovaných lymfocytů a epitelií sliznic se pak může realizovat kaskáda aktivace určitých lymfocytů a tedy příslušná imunitní odpověď. Imunoregulační pochody jsou významně modulovány odpovědí CD4 lymfocytárních subpopulací, která vede k produkci různých cytokinů (12). Fyziologická střevní mikroflóra provádí tzv. trénink imunitního systému GIT, který tvoří jednak bariéru invazi cizích zárodků a jednak vede k tzv. paraimunitě – zvýšení specifické i nespecifické imunitní odpovědi. Děje se tak zvyšováním fagocytární schopnosti makrofágů, stimulací IgA produkujících plasmocytů lamina propria mucosae a zvýšením produkce interleukinu IL-6. Riziko bakteriální translokace stoupá u imunokompromitovaných nemocných a tedy i u nemocných s jaterní cirhózou mimojiné právě v souvislosti s alterací jejich fyziologické trávicí mikroflóry. Fyziologické kmeny E.coli, v menší míře anaeroby a snad i jiné bakterie trávicího traktu se mohou podílet na tvorbě vitamínů B12, K1 a K2. Časté a dlouhodobé užívání antibiotik může vést k narušení syntézy těchto vitamínů a následně k jejich nedostatku (12).

3. Střevní bakteriální přerůstání Mikroflóra trávicího traktu je nepřetržitě ovlivňována řadou fyzikálních, chemických a biologických faktorů, které mohou narušit její rovnováhu, a jsou tak potenciálním zdrojem onemocnění trávicího traktu či organismu jako celku. Může dojít ke změnám v celkovém množství 16

mikroorganismů, změnám spektra jejího složení v určitých lokalizacích nebo jejích metabolických aktivit. Narušení fyziologie mikroflóry trávicího traktu může vést k některým chorobným stavům přímo nebo být jejich kofaktorem. K takovým onemocněním patří především infekční průjmová onemocnění, polékové, poantibiotické a poradiační průjmy a kolitidy, funkční onemocnění trávicího traktu (chronická obstipace, syndrom dráždivého tračníku), idiopatické střevní záněty, imunodeficitní stavy, kolorektální karcinom a také některá mimostřevní onemocnění (22, 23). Zhruba u třetiny pacientů s alkoholickou cirhózou, pokročilou jaterní dysfunkcí a ascitem bylo popsáno střevní bakteriální přerůstání (intestinal bacterial overgrowth, IBO). Bakteriální přerůstání u cirhotiků patrně zvyšuje bakteriální translokaci (viz dále), a může tak přispívat ke vzniku infekce u cirhotiků obecně a především je hlavním predisponujícím faktorem spontánní infekce ascitické tekutiny - spontánní bakteriální peritonitidy (SBP) (24). Za hlavní příčiny střevního bakteriálního přerůstání u cirhotiků jsou považovány achylie, pokles sekrece IgA a malnutrice způsobená jaterní dysfunkcí případně alkoholismem. Poškozené imunitní mechanismy sliznice tenkého střeva usnadňující bakteriální přerůstání mohou být jedním z vysvětlení výskytu rekurentní spontánní bakteriální peritonitidy u pacientů s jaterní cirhózou (24). Naopak suprese nebo eradikace střevních fakultativně anaerobních gramnegativních bakterií brání bakteriální translokaci a SBP jak u cirhotických krys v experimentu, tak u pacientů s jaterní cirhózou (25). Také zpomalená střevní motilita spojená s cirhotickým poškozením jater usnadňuje bakteriální přerůstání v gastrointestinálním traktu člověka. V experimentálním modelu cirhózy indukované tetrachlormethanem byla prokázána korelace mezi jaterním poškozením a změnami ve sliznici tenkého střeva. Bylo popsáno snížení aktivity membránových enzymů, alkalické fosfatázy, aminopeptidázy, sukcinyldehydrogenázy. V jiném experimentu byla v tenkém střevě cirhotických krys signifikantně snížena hladina triglyceridů, pravděpodobně v důsledku nízké hladiny apolipoproteinu. Současně bylo popsáno porušení vstřebávání jednotlivých živin střevní stěnou, narušení transportu sacharidů, vstřebávání D-galaktózy, což je doprovázeno signifikantním prodloužením mikroklků enterocytů. V dalším experimentu biliární cirhózy byly nalezeny změny v kartáčovém lemu enterocytů krys, zahrnující vymizení strukturálních proteinů, enzymů mikroklků a triglyceridů (24). U pacientů s jaterní cirhózou se na zvýšené střevní propustnosti a tedy zhoršené funkčnosti střevní bariéry podílí zejména portální hypertenze. Dochází k dilataci cév ve sliznici střeva, edému lamina propria, fibromuskulární proliferaci, hypertrofii muscularis mucosae, je porušena integrita střevní sliznice, na níž se mohou kromě portální hypertenze podílet i toxické vlivy alkoholu na střevní sliznici, poruchy biliární sekrece, malnutrice, pokles sekrece růstových faktorů (insulin-like growth faktor I), změny ve složení a proudění žluče, zvýšené hladiny oxidu dusnatého. Zvýšení

17

střevní propustnosti je zřejmě úměrné stupni portální hypertenze, avšak nezávislé na tíži a etiologii jaterního postižení (26). U pacientů s jaterní cirhózou a portální hypertenzí totiž klesá cévní rezistence a stoupá splanchnický průtok. Tyto změny působí hypoperfuzi střevní sliznice a hypoxii, která dále poškozuje střevní stěnu. V důsledku poškození střevní stěny pak snadno dochází k translokaci střevních bakterií (27).

4. Bakteriální translokace 4.1 Definice, obecné poznámky Bakteriální translokace je definována jako aktivní či pasivní penetrace živých mikroorganismů a jejich toxinů extraluminálně skrze epiteliální vrstvu sliznice do lamina propria mucosae. Za normálních podmínek jde o malé množství endogenních bakterií, které jsou pohotově 18

ničeny imunitním systémem v lamina propria mucosae, což je umožněno jednak malým množstvím těchto endogenních bakterií, jednak indukcí specifické imunitní odpovědi v Peyerských placích. Translokace je možná teprve při vysokém množství bakterií ve střevě (v literatuře je uváděno až 108 bakterií v 1 gramu stolice) (12, 23, 25). Z hlediska klinické závažnosti rozlišujeme čtyři stupně bakteriální translokace (12, 28): 0. stupeň: bakterie a/nebo jejich komponenty pronikají submukózně pomocí různých mechanismů: aktivní intracelulární či intercelulární penetrací, difuzí, absorpcí, endocytózou nebo pomocí makrofágů, které je pohltí 1. stupeň: bakterie a/nebo jejich komponenty vstoupí do lymfatického mesenteriálního systému a jím centripetálně postupují 2.stupeň: bakterie a/nebo jejich komponenty lze detekovat v systémové cirkulaci a některých orgánech, některé bakterie mohou přestoupit přímo do malých střevních venul a jimi do portálního řečiště, část bakterií je zřejmě schopna intracelulární pasáže přes muscularis propria přímo do peritoneální dutiny (právě z tohoto důvodu byla původní Bergova definice z roku 1985, v níž označuje za bakteriální translokaci přestup bakterií a/nebo jejich komponent z lumina trávicího traktu do lymfatického systému s potenciální možností systémového průniku do různých tkání organismu, upravena) 3. stupeň: systémové zaplavení organismu bakteriemi a/nebo jejich komponentami vede k septické odpovědi Bakterie, které uniknou fagocytům a destrukci komplementem, mohou proniknout až do krve. Enterobakterie, stafylokoky a enterokoky mají schopnost translokovat, tedy živé přecházet přes střevní epitel do mezenteriálních lymfatických uzlin, krve a ostatních orgánů, zatímco většina anaerobních mikroorganismů tuto schopnost nemá. Bakteriální translokace je prokazatelná pozitivitou bakteriální kultivace z mezenteriálních lymfatických uzlin. Hlavními mechanismy vedoucími k bakteriální translokaci jsou deficit lokální slizniční imunitní odpovědi, pokles retikuloendotelové fagocytární aktivity a kvalitativní dysfunkce neutrofilů, zvýšená propustnost střevní bariéry a zmíněné intestinální bakteriální přerůstání (24, 25). Faktory, které ovlivňují bakteriální translokaci můžeme rozdělit do tří skupin. Jednak je to faktor bakteriální, představující povahu translokující bakterie + stav okolní fyziologické flóry, jednak faktor střevní stěny, tedy její morfologický a funkční stav, a v neposlední řadě tzv. defenzivní faktory, lokální a systémové antibakteriální aktivity organizmu (fagocytóza apod.) (12).

19

4.2 Syndrom střevní dysfunkce Patologická bakteriální translokace byla prokázána při šoku, sepsi, rozsáhlých popáleninách, těžkých malnutricí nejrůznější etiologie jako součást těžkého průběhu nemoci, zejména v kombinaci s multiorgánovým postižením. Z onemocnění trávicího traktu je bakteriální translokace známa u akutní pankreatitidy, obstrukčního ikteru, intraabdominálních zanětlivých afekcí. U těchto nemocí označujeme soubor příčin, jež vedou ke zvýšení bakteriální translokace, jako syndrom střevní dysfunkce (12, 29), který byl popsán např. u těžké akutní pankreatitidy. Podkladem zvýšené permeability střevní stěny je její ischemicko reperfuzní poškození. Dochází k němu v důsledku splanchnické vasokonstrikce a s ní spojené tkáňové ischemie, acidózy, anaerobního metabolismu. Svou roli zde hraje i účinek kyslíkových radikálů. K narušení střevní stěny na úrovni epitelových buněk může dojít rovněž v důsledku použitých léčebných postupů. Totální parenterální výživa způsobuje atrofii enterocytů z inaktivity a jejich hladovění na podkladě karence glutaminu esenciální aminokyseliny pro enterocyty. Porucha imunitního systému je komplexní a týká se jak buněčné tak humorální složky. Lokální imunitní odpověď je za normálních okolností zajišťována lymfatickou tkání asociovanou se střevní sliznicí - GALT. Dysfunkce intraepiteliálních lymfocytů, snížený počet plazmatických buněk ve střevní stěně a tím snížený obsah sekrečního IgA ve střevním lumen vedou k poruše imunitního systému. K lokální poruše se záhy přidává porucha systémová na úrovni retikuloendotelového systému. Klesá výkonnost fagocytujících buněk, které jsou zahlceny komplexy proteáza-antiproteáza, bakterie-protilátky a endotoxin-protilátky. Excesivní aktivace leukocytů a jejich následná migrace do vzdálených orgánů ústí v aktivaci zánětu a tkáňové poškození. Součástí syndromu střevní dysfunkce je také porucha střevní motility. Propulzní aktivita trávicí trubice je zajišťována interdigestivním motorickým komplexem (migrating motor complex) Cyklické střídání tří fází (I období klidu, II přerušované kontrakce, III výrazná motorická aktivita) tvoří podklad nejen pro střevní peristaltiku, ale je zároveń i podnětem pro sekreci trávicích enzymů (např. pankreatická šťáva). Vznik paralytického ileu a střevní stáza podporuje změny v mikrobiologickém složení střevního obsahu a to jak po stránce kvalitativní, tak i kvantitativní. Narušení mikroekologie střevního lumen ve prospěch patogenních mikroorganismů, přičemž zároveň rostou jejich absolutní počty, znamená zvýšenou nálož translokujících bakterií. Tuto nejsou dysfunkční imunokompetentní buňky schopny zvládnout. Snížený obsah žlučových kyselin ve střevě při obstrukci žlučových cest konkrementem či tumorózní infiltrací Vaterské papily prohlubuje oblenění střevní peristaltiky a tím nárůst bakteriální translokace. Také změny pH při podávání H2 blokátorů umožňují přerůstání bakterií aborálním směrem a tím nárůst bakteriální 20

translokace. Narušením mechanismů, které se podílejí na udržování střevní bariéry, narůstá bakteriální translokace do takových rozměrů, že je organismus již není schopen zvládnout. Důsledkem těchto změn jsou infekční komplikace lokální (nekróza, absces pankreatu) a celkové, k nimž patří pankreatogenní sepse a s ní spojený rozvoj multiorgánového selhání. Nemocní s portální hypertenzí mají zvýšenou kongesci ve střevě a edém sliznice, což může zvýšit střevní propustnost a usnadnit bakteriální translokaci. Určitou roli může také hrát oxidativní stres, vůči kterému jsou enterocyty velmi citlivé. V důsledku ischemizace střeva je pak poškozena jejich funkce, rozšiřují se intercelulární prostory, dochází k produkci volných kyslíkových radikálů a stoupá riziko bakteriální translokace (24). V oblasti experimentální medicíny existují dva dobře prostudované modely bakteriální translokace na krysách (12). Metotrexátem indukovaná enterokolitida: experimentální studie opakovaně prokázaly, že podání metotrexátu vede k těžké, neperforativní enterokolitidě spojené s vysokým stupněm translokace bakterií a jejich toxinů do extraintestinálních lokalizací. Přitom dochází ve vysokém procentu k multiorgánovému poškození pokusných krys včetně jejich úmrtí. Model bakteriální translokace u žlučové obstrukce: bylo prokázáno, že biliární obstrukce je spojena s výrazným růstem bakteriální translokace, především gramnegativních bakterií a jejich toxinů. V obou modelech byl zároveň v experimentu prokázán významný léčebný efekt probiotik ve formě laktobacilů u metotrexátové enterokolitidy a prebiotické laktulózy u biliární obstrukce (30, 31).

4.3 Patofyziologie bakteriální translokace u některých primárních patogenů V současnosti je dobře znám mechanismus bakteriální invaze především u Yersinia pseudotuberculosis, Shigella flexneri a Salmonella Enterica-typhimurium a u patogenních E.coli. Přitom jedna bakterie nemusí mít k dispozici pouze jednu cestu translokace, u salmonelových bakterií existují dokonce tři alternativy (12). 1. translokace pomocí M buněk s destruující změnou epiteliálních buněk 2. transepiteliální migrace bez zásadních změn epiteliální buněčné bariéry 3. luminální pohlcení dendritickými buňkami s přímým prostupem systémově, zcela mimo epiteliální bariéru Více mechanismů translokace u jedné bakterie je způsobeno existencí různých mutant téže bakterie. Typ invaze a translokace není určen pouze druhem mikroorganismu, ale též makroorganismem, chováním makrofágů hostitele (přežívání bakterií v makrofázích s jejich lokální a snad i systémovou disseminací x apoptóza makrofágů s inflamatorní odezvou a uvolněním pohlcených 21

salmonelových bakterií). Enteropatogenní E. coli translokují podle posledních studií následujícím způsobem (32, 33): 1. první fáze – neintimní kontakt – zprostředkují filamentární organely s obsahem EPEC (enteropatogenní E.coli) – sekrečního proteinu (EpsA), který je produkován typem III. sekrečního systému. 2. druhá fáze – dochází k signálu transdukce do cytoskeletu hostitelských epiteliálních buněk, který je zprostředkován dalšími EPEC – sekrečními proteiny B a D (EpsB, EpsD) 3. ve finální fázi dochází k adhezi a posléze intracelulární invazi EPEC. Tu zahajuje další membránový protein intimin, vázaný na specifický receptor Tir (translocated intimin receptor) (34). Vedle adherence a invaze je součástí translokačního mechanismu také účast toxinů, které se na translokaci podílí různým způsobem (dle mechanismu jejich působení na stěnu trávicího traktu hostitelského makroorganismu). Bakteriální translokace byla také popsána v několika experimentálních modelech cirhózy: Při experimentálním srovnání střevní aerobní bakteriální flóry cékální stolice u právě usmrcených cirhotických a zdravých krys bylo zjištěno signifikantně vyšší celkové množství střevních aerobních bakterií ve stolici cirhotických krys oproti zdravým a též potvrzen význam tohoto přerůstání pro bakteriální translokaci (25). V dalším experimentu byla translokace častější u zvířat s cirhózou a spontánní bakteriální peritonitidou než u zvířat bez SBP nebo u zdravých kontrol. Stejné bakteriální kmeny byly zároveň izolovány v 87% případů z ascitu, z mezenteriálních lymfatických uzlin a ilea. Prokázalo se, že infekce ascitické tekutiny u cirhotických krys je způsobena translokací střevních bakterií do mezenteriálních lymfatických uzlin a že portální oběh zde představuje alternativní cestu přestupu bakterií (25, 36).

Tabulka č. 2 Přehled enterotoxinů (převzato z knihy Doc. MUDr. Zbořila, CSc. Mikroflóra trávicího traktu, klinické souvislosti, zpracováno podle Fasana) (12, 35).

Toxiny aktivující signální cesty enterocytů cyklický AMP (adenosinmonofosfát) - toxin cholerový 22

- enterotoxin patogenních E.coli termolabilní - enterotoxin salmonelový - enterotoxin Shigella dysenteriae - enterotoxin Campylobacter jejuni - enterotoxin Pseudomonas aeruginosa cyklický GMP (guanosinmonofosfát) - enterotoxin patogenních E.coli termostabilní - entoretoxin I. a II. Yersinia enterocolitica . - enterotoxin Yersinia bercovieri - enterotoxin Klebsiella pneumoniae - enterotoxin Vibrio cholereae non O1 termostabilní - enterotoxin (EAST1) enteroagregativní E.coli termostabilní) kalcium - enterotoxin Clostridium difficile - enterotoxin Ciguatera - enterotoxin Cryptosporidium - toxin Helicobacter pylori vakuolizovaný dusíkaté oxidy - enterotoxin I Shigela flexneri 2a (She T 1) póry formující toxiny - enterotoxin Clostridium perfringens - alfa toxin Staphylococcus aureus - cytolysin Vibrio cholerae toxiny blokující proteinovou syntézu - shigatoxin Shigella dysenteriae - EHEC shiga-like Toxin 1 (SLT1) a 2 (SLT2) toxiny indukující proteinovou syntézu - enterotoxin A Staphylococcus aureus - EaGGEC (enteroagregativní E.coli) toxiny působící na cytoskelet enterocytů - toxin A a B Clostridium difficile - cytotoxický nekrotizující faktor 1 (CNF 1) cytotoxického E.coli - toxin cytoletální Campylobacter jejuni - zanulla occludens toxin (ZAT) Vibrio cholerae - plazmid enkodující protein (PET) EaggEC (enteroagregativní E.coli) - toxin Bacteroides fragilis

Translokace střevních bakterií je usnadňována řadou faktorů, jedním z nich je poměrně časté narušení humorálních a buněčných obranných mechanismů proti infekčním agens právě u pacientů s alkoholickou cirhózou a ve fází fulminantního jaterního selhání (37). Zkrat portální krve napomáhá vzniku bakteriémie translokací střevních mikroorganismů, což představuje základní predisponující faktor při infekci ascitické tekutiny. U nemocných s jaterní cirhózou byla prokázána abnormální kolonizace tenkého střeva bakteriemi z kolon a bakteriální translokace byla popsána v 23

experimentálním modelu jaterní cirhózy a spontánní bakteriální peritonitidy (38). Gramnegativní aerobní bakterie, enterobakterie a streptokoky, patří mezi nejčastější patogeny, dále nacházíme v ascitu nemocných s SBP kmeny Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae a Streptococcus alfa hemolyticus (39, 40). Výjimečně může být vyvolávajícím agens Listeria monocyctogenes, Vibrio vulnificus (byla publikována práce, kdy právě tato bakterie způsobila smrtelnou sepsi cirhotika) (41). V dalším experimentu byla prokázána kolonizace cirhoticky změněných jater krys bakteriemi (E. coli, Enterobacter sp. a Bacteroides fragilis), cirhóza byla vyvolána thioacetamidem (42). Stejné bakteriální kmeny byly současně izolovány v ascitu a lymfatických mezenteriálních uzlin a v další práci byly pomocí molekulárních metod určeny stejné bakteriální kmeny jak v ascitu tak v lymfatických uzlinách mesenteria a/nebo ilea cirhotických krys s ascitem (36). Bakteriální translokaci také podporuje uvolnění oxidu dusnatého z cév, který se účastní regulace střevní motility (43). Histopatologické studie ukazují, že translokace patogenů jako je Candida albicans se děje přímou penetrací skrze enterocyty spojenou s porušením bazální membrány, translokace E.coli se také děje spíše přímo skrze enterocyt nežli mezi nimi. Translokace střevních bakterií do mesenteriálních lymfatickýxh uzlin tak zřejmě hraje zásadní roli při vzniku spontánní bakteriální peritonitidy (44).

5. Jaterní cirhóza 5.1 Definice Možnosti jater jak reagovat na nekrózu jsou omezené. Podstatné je zhroucení struktury jaterních lalůčků, tvorba difuzních fibrózních sept a nový růst jaterních buněk v uzlech. Příčin, které vyvolají hepatocelulární nekrózu je mnoho, avšak důsledek je stejný. Cirhózu jaterní definujeme jako konečné stádium fibrózy jaterního parenchymu vyúsťující do uzlové přestavby

24

jater s následnou poruchou jejich funkce. Dnešní důkazy již poukazují na možnou reverzibilitu fibrózy (45, 46).

5.2 Patofyziologie K chronickému jaternímu poškození dochází v důsledku virového, autoimunitního, metabolického či jiného onemocnění, a fibróza představuje následek v podstatě hojivého procesu, reakci na chronické postižení. Fyziologicky jsou procesy jaterní fibrogeneze a fibrinolýzy vyrovnané. K poruše této rovnováhy dochází při chronické stimulaci fibrogeneze a následnou zvýšenou tvorbou vaziva. Zánětlivě nekrotické změny aktivují Kupferovy buňky uvolňující řadu cytokinů, které stimulují hvězdicovité buňky k transformaci na myofibroblasty produkující molekuly extracelulární matrix, což vede ke množení vaziva. Hlavními cytokiny jsou tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α), fibroblastický růstový faktor (FGF) a destičkový růstový faktor (PDGF). Existuje však celá řada dalších cytokinů účastnících se fibrogeneze jako jsou např. interleukiny 1, 6, 8 zodpovědné za lymfocytární zánětlivou reakci, akumulaci leukocytů v jaterním parenchymu a poškození tkáně proteolytickými enzymy. V poslední době se předpokládá možnost patologické fibrogeneze bez předcházejících zánětlivých změn, a to zejména u alkoholem podmíněné fibrózy. Mezi nezánětlivé mediátory patří např. acetaldehyd a volné kyslíkové radikály. Proces fibrogeneze a fibrinolýzy je multifaktoriální a účastní se na něm heterogenní skupina buněk. Klíčovými jsou hvězdicovité (stelátové) buňky transformující se v místě zánětlivé reakce na myofibroblasty, které produkují extracelulární matrix, následně pak dochází ke zmnožení vaziva se všemi dalšími důsledky (47). Na smrt buněk navazuje tvorba uzlů, které narušují jaterní strukturu a rozvíjí se cirhóza. Sinusoidy zůstávají na okrajích regenerativních uzlů, v oblasti můstků mezi portální a centrální žilou. Portální krev je vedena mimo fungující jaterní tkáň, což vede k cévní nedostatečnosti v centru uzlíků a pokračování rozvoje změn v jaterní tkáni i poté, co byla příčina eliminována. Patologická vazivová hmota se ukládá v Disseho prostorech, kde pak brání metabolické výměně s jaterními buňkami. Kolem nekrotických jaterních buněk se organizují nové fibroblasty a novotvořené žlučové kanálky, fibróza progreduje z reverzibilního do ireverzibilního stadia, kdy jsou dotvořena nebuněčná permanentní septa. Za zlomový okamžik fibrogeneze je považována stimulace a následná transformace hvězdicovitých buněk v místě zánětlivě nekrotické reakce (ale také mimo ni) na myofibroblasty, produkující v nadměrné míře extracelulární matrix (45, 46, 47, 48).

25

5.3 Klasifikace cirhózy Dle

morfologicko-anatomických

změn

rozlišujeme

cirhózu

mikronodulární,

makronodulární a smíšený typ. Mikronodulární cirhóza je charakteristická silnými pravidelnými septy, malými regenerujícími uzly (maximálního průměru 3 mm) a s postižením každého lalůčku. Makronodulární cirhóza je charakterizována septy a uzly obvykle většími než 3 mm a normálními lalůčky uvnitř větších uzlů. Představuje často pozdní typ cirhózy mikronodulární. U smíšeného typu cirhózy jsou přítomny změny jak mikronodulární tak makronodulární (45, 46). Etiologie cirhózy může být různá. Ve střední Evropě dominují dvě hlavní příčiny, a to chronické virové hepatitidy a chronický abúzus alkoholu. Akutní virové hepatitidy B, C a D mohou přecházet do chronického zánětu a způsobit jaterní cirhózu. Akutní virová hepatitida B přechází do chronického stavu nejčastěji u novorozenců infikovaných vertikálně od matky (více než v 90%), v dospělosti jen v 5-10%. Na následky chronické hepatidy B, jaterní cirhózu a hepatocelulární karcinom (HCC), umírá 15-25% chronicky infikovaných osob. U virové hepatitidy C je pravděpodobnost přechodu infekce do chronicity velmi vysoká, 70-90%. Přechod do jaterní cirhózy je však velmi dlouhodobý a je ovlivněn dalšími faktory (alkoholem, věkem). K rozvoji terminálních stádií je většinou potřeba desetiletí. U chronických vironosičů povrchového antigenu HBsAg superinfekce virem hepatitidy D výrazně zhoršuje průběh choroby a až v 90% případů vede k progredující chronické hepatitidě s následným přechodem v jaterní cirhózu (48). Patogeneze alkoholických jaterních lézí není stále jasná. Většina alkoholiků má hepatomegalii v důsledku steatózy, ale jen u 20-35% z nich vzniká fibróza a cirhóza. Nekroptické nálezy prokazují jaterní cirhózu jen u 18% nemocných s chronickým abuzem alkoholu a biopticky je cirhóza verifikována u 15-30% alkoholiků. Vznik jaterní cirhózy koreluje s množstvím a délkou konzumace alkoholu. Relativní riziko vzniku jaterní cirhózy u mužů je při konzumaci 40-60g alkoholu denně 6x vyšší než při konzumaci 20g alkoholu (48). Dnes se považuje 60g alkoholu denně pro muže a 30g alkoholu pro ženy za dávku, která po 10-15 letech může vést ke vzniku jaterní cirhózy. Příčinou jaterní cirhózy může být dále autoimunní hepatitida, zánětlivé onemocnění jater charakterizované poruchou imunoregulace s typickými autoimunitními fenomeny častěji postihující ženy. Podle převažujícího typu protilátek autoimunitní hepatitidy dělíme na: I. typ s pozitivitou ANA (protilátky proti buněčným jádrům), ASMA (proti hladkému svalu), AAA (proti aktinu), ANCA (proti cytoplasmě neutrofilů), AMA (proti mitochondriím), II. typ s převažující pozitivitou LKM-1 (proti jaterním a ledvinovým mikrosomům 1. typu) a III. typ s převažující pozitivitou SLA (proti rozpustnému jaternímu antigenu) (49). 26

Z metabolických chorob vede k cirhotické přestavbě nejčastěji hereditární hemochromatóza, Wilsonova choroba, deficit α-1-antitrypsinu. Hereditární hemochromatóza je autosomálně recesivně dědičná porucha metabolismu železa, která vede k patologickému ukládání železa v parenchymatózních orgánech, zejména v játrech, slinivce a jejím konečným důsledkem může být vznik cirhózy se všemi jejími důsledky. Stejně tak Wilsonova choroba představuje autosomálně recesivně dědičné onemocnění s poruchou metablismu mědi, kdy dochází ke kumulaci mědi zejména v mozku a játrech, může vést k cirhóze jaterní a může mít i fulminantní průběh (46). V etiologii cirhózy hraje roli také polékové poškození jater, cholestatická onemocnění jako je primární biliární cirhóza, primární sklerozující cholangoitida, nealkoholická steatohepatitida a dále porfyrie.

5.4 Klinický obraz Klinický obraz jaterní cirhózy je velmi pestrý, od bezpříznakového stavu až k obrazu jaterního selhání. V klinické praxi lze cirhózu rozdělit na kompenzovanou (latentní, subklinickou) a dekompenzovanou (pokročilou). Důsledkem jaterní cirhózy je hepatocelulární selhání a portální hypertenze (48, 49). I kompenzovaná jaterní cirhóza může být diagnostikována při běžném klinickém vyšetření (45, 46), často však probíhá dlouhodobě asymptomaticky. K podezření na cirhózu mohou vést subfebrilie, váhový úbytek, nechutenství, únava, malátnost, tlaky v pravém podžebří, pocity plnosti žaludku, dyspepsie, břišní dyskomfort, neodůvodněná epistaxe či otoky dolních končetin. Cennými příznaky jsou pak tuhá zvětšená játra a splenomegalie (47, 48, 49, 50). Dekompenzovaná jaterní cirhóza se projevuje příznaky, které přinutí nemocného vyhledat lékaře. Projevuje se celkovými příznaky: slabostí, atrofií svalstva a hubnutím. Často nacházíme prořídlé ochlupení a atrofii gonád, četné pavoučkové névy, palmární erytém, bílé nehty, caput medusae (rozšířené žíly v abdominální oblasti). Mohou se objevit hematomy a epistaxe, jako příznaky koagulopatie a trombocytopenie. Protrahované subfebrilie až febrilie jsou nejčastěji důsledkem gramnegativní bakteriémie čí rozvoje spontánní bakteriální peritonitidy, pokračující nekrotizací jaterních buněk nebo přidruženého hepatocelulárního karcinomu. Klinicky dochází v mnoha případech k rozvoji jaterní encefalopatie s výskytem příznaků jako je flapping tremor a foetor hepaticus. Klinický obraz jaterní encefalopatie je však velmi variabilní a projevuje se škálou neuropsychických symptomů (blíže viz níže jaterní encefalopatie). Dále u nemocných dochází k rozvoji ascitu a objevují se otoky dolních končetin, stav se může komplikovat hematemezou či melenou v důsledku krvácení z gastroezofageálních varixů. Může dojít k rozvoji SBP. Mezi 27

klinické příznaky SBP patří subfebrilie až febrilie, únava, schvácenost, bolesti břicha, zhoršení encefalopatie, progrese jaterního onemocnění. U tenzního ascitu bývá častá umbilikální hernie, může dojít k jejímu uskřinutí a vzácně k ruptuře. Poměrně zřídka se vyskytuje tzv. hepatální hydrothorax (40, 46, 47, 48, 50, 51, 52). Hepatorenální syndrom (HRS) je v mnoha případech konečným a fatálním stavem jaterní cirhózy. Je definován jako funkční selhání ledvin (tj. ledviny jsou morfologicky intaktní, zdravé) doprovázející jaterní onemocnění s portální hypertenzí, vyskytuje se výhradně u nemocných s ascitem. Klinicky se může vyvinout velmi rychle a vést k akutnímu renálnímu selhání a smrti v průběhu týdnů - typ I (rychle progredující). Kreatinin v séru dosáhne hodnot nad 221 µmol/l v průběhu 2 týdnů. Typ II – pomalu progredující, má prognózu podstatně lepší, sérový kreatinin se zvyšuje pozvolna a obvykle nepřesáhne hodnoty 180 µmol/l. Přežití u pacientů s HRS II. typu je bez transplantace 6-9 měsíců (50). Stav je často komplikován akutním krvácením do gastrointestinálního traktu v důsledku portální hypertenze. U nemocného často diagnostikujeme jícnové a žaludeční varixy či portální gastropatii, eventuálně kolopatii (48, 50). V neposledním případě může dojít u jaterní cirhózy k rozvoji jaterního komatu s rozvojem mozkového edému (46, 48, 50). K potvrzení diagnózy jaterní cirhózy napomáhá nejen klinické, ale i laboratorní vyšetření, ultrasonografie či počítačová tomografie (CT). Ezofagogastroskopie je nutná ke stanovení přítomnosti gastroezofageálních varixů či portální gastropatie. K pomocným vyšetřením patří magnetická rezonance, endoskopická retrográdní cholangiopankreatografie (ERCP) a případně magnetická rezonanční cholangiopankreatografie (MRCP) při cholestáze extrahepatálního původu. K histologické verifikaci slouží jaterní biopsie (47, 48). V laboratorním vyšetření nacházíme normocytární nebo makrocytární, normochromní anémii, v důsledku hypersplenismu jsou sníženy počty leukocytů a trombocytů. V játrech se syntetizuje řada koagulačních faktorů: fibrinogen (faktor I), protrombin (faktor II), faktory V, VII, IX a XI. V praxi vystačíme se stanovením Quickova tromboplastinového času, který je u cirhotiků prodloužený. Jeho hodnota je vyjádřena v procentech (norma 70-100%) nebo standardizovanou hodnotou INR (International Normalized Ratio) s normou 0,8–1,2. Známkou jaterní nedostatečnosti je dále pokles antitrombinu III, inhibitoru koagulační kaskády. Jaterní selhání může být provázeno syndromem diseminované intravaskulární koagulopatie se zvýšenou hladinou D-dimerů, poklesem fibrinogenu a trombocytopenií. V biochemických nálezech je zvýšená hladina bilirubinu, snížená hladina albuminu, prealbuminu a zvýšený gamaglobulin. Jaterní cirhóza se projeví poklesem alfaglobulinů (hlavně alfa-2), mírným poklesem beta-globulinů a výrazným vzestupem gama-globulinů při vyšetření elektroforézy (ELFO) sérových bílkovin. Alkalická fosfatáza v séru je obvykle zvýšená i na dvojnásobek normálních hodnot a někdy nalezneme velmi vysoké hodnoty, zvláště při

28

alkoholické cirhóze. Sérové transaminázy mohou, ale nemusí být zvýšené. Hlavními testy aktivity jaterní cirhózy jsou alaninaminotrasferáza (ALT) a asparátaminotransferáza (AST), ke stanovení cholestázy užíváme gamaglutamyltransferázu (GMT) a alkalickou fosfatázu (ALP). Dalšími ukazateli jaterní nedostatečnosti je snížená hladina cholinesterázy a zvýšený amoniak v krvi. V moči je výrazně zvýšen urobilinogen a při ikteru je přítomen bilirubin (45, 46, 47, 48). Stanovení autoprotilátek (ANA, ASMA, anti LKM, anti SLA, ANCA, AMA a dalších) má význam diferenciálně diagnostický pro určení etiologie jaterní cirhózy a stanovení diagnózy autoimunitních hepatitid, primární biliární cirhózy (PBC) a primární sklerotizující cholangoitidy (PSC). Vyšetření alfa-1-fetoproteinu (AFP) v séru nemocných s jaterní cirhózou má pak význam k odhalení HCC. Pro průkaz chronické virové hepatitidy je důležitý průkaz virových antigenů HBsAg, průkaz protilátek anti-HCV metodou ELISA. K průkazu virémie prostřednictvím detekce nukleové kyseliny viru (HBV DNA, resp. HCV RNA) se používá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). Alfa-1-antitrypsin (AAT) je protein akutní fáze a jeho hodnota v séru bývá snížená při vrozeném deficitu alfa-1-antitrypsinu. U Wilsonovy choroby je snížená hladina ceruloplasminu v krvi a zvýšená exkrece mědi do moči. V diagnostice je však nejdůležitější stanovení koncentrace mědi v jaterním parenchymu jaterní biopsií. U hemochromatózy je pak vysoká hladina železa v séru a játrech, rovněž jsou vysoké hodnoty sérové saturace železa a ferritinu. Pro stanovení diagnózy Wilsonovy choroby, deficitu alfa-1 antitrypsinu či hereditární hemochromatózy má význam genetické vyšetření. Jaterní biopsie je definitivním potvrzením diagnózy jaterní cirhózy. Histologie, i když ne vždy, může být užitečná při stanovení diagnózy, odhadu příčiny cirhózy, stadia vývoje a aktivity a v neposlední řadě odhalení případných komplikací (HCC) (46, 47, 48). Ascites je ve velmi malém množství (100 ml) možno diagnostikovat sonograficky. Fyzikálním vyšetřením jsme schopni ascites diagnostikovat až při jeho větším množství. Poklepově zjišťujeme ascites při množství 1500-3000 ml, typická undulance je přítomna až u množství přesahujícím 10 litrů. Důležité je laboratorní vyšetření ascitu, při nálezu granulocytů v ascitické tekutině > 250 buněk/mm3 (méně přesný je počet leukocytů > 400/mm3) a/nebo pozitivní kultivační nález ascitické tekutiny je splněna diagnostika SBP. Každý nově vzniklý ascites by měl být vyšetřen diagnostickou punkcí. Základním vyšetřením je koncentrace bílkoviny v ascitu: u transudátu, který je typický pro cirhózu, je hodnota < 25g/l, u exsudátu, typického pro zánětlivou etiologii či malignitu, je > 25g/l. Přesnějším vyšetřením, které vypovídá o tom, zda je ascites spojen s onemocněním jater a portální hypertenzí, je stanovení albuminového gradientu sérum – ascites (SAAG), který se vypočte odečtením koncentrace albuminu v ascitu od koncentrace albuminu v séru. Hodnota rovná či větší než 11g/l svědčí pro portální hypertenzi. Pro portální hypertenzi svědčí

29

i hodnota triglyceridů pod 1g/l ascitu (40, 48, 49, 52). V diagnostice hepatorenálního syndromu (HRS) je základním krokem vyloučení organického poškození ledvin. Nejdůležitější je vyloučení hypovolémie při hemorrhagickém a septickém šoku, protože jsou účinně terapeuticky ovlivnitelné. Proto je nutné provést ultrazvukové vyšetření ledvin, vyšetření moče a sedimentu, stanovení odpadů v moči včetně sledování odpadů bílkovin a podle potřeby bakteriologické a imunologické vyšetření. Pro funkční poškození ledvin bývá typický nízký odpad sodíku do moči (<10 mmol/l) při nízké koncentraci v séru (<130 mmol/l) a nízká diuréza (<500ml/den). Diagnostická kritéria HRS jsou uvedená v tabulce číslo 3 (50, 53).

Tabulka č. 3. Diagnostická kritéria hepatorenálního syndromu (HRS) podle International ascites Club

Hlavní kritéria: 1. Chronické či akutní jaterní onemocnění s alterací jaterních funkcí a s portální hypertenzí 2. Nízká glomerulární filtrace indikovaná sérovým kreatininem > 135 µmol/l či kreatininovou clearence < 40 ml/min 3. Nepřítomnost šoku, probíhající bakteriální infekce a předchozí léčby nefrotoxickými léky 4. Nedojde k trvalému zlepšení renálních funkcí po doplnění intravaskulárního objemu 1,5 litru fyziologického roztoku (lépe koloidu) 5. Proteinurie < 500 mg/den. 6. Nejsou ultrazvukové známky organického onemocnění ledvin a močového traktu Doplňková kritéria (nejsou podmínkou diagnózy) 7. Diuréza < 500 ml/den 8. Natriuréza < 10 mmol/l 9. Osmolalita moči > osmolalita séra 10. Erytrocyturie < 50 v jednom zorném poli při velkém zvětšení 11. Natrémie < 130 mmol/l

5.5 Prognóza jaterní cirhózy Se zavedením transplantace jater jako léčebné metody jaterního selhání se zdůraznila potřeba přesné prognózy, aby zákrok mohl být proveden ve správnou dobu (46). Prognóza jaterní cirhózy závisí na její etiologii (48). Dobře spolupracující nemocný s kompenzovanou jaterní cirhózou, který dodržuje režimová opatření a léčbu, může bez problémů přežívat i desetiletí. Pokud je možná kauzální léčba a je zahájena včas, je prognóza příznivá (chronická virová hepatitida, Wilsonova choroba, hemochromatóza). Prognostickou cenu u nemocných má vznik ascitu, snížení hladiny albuminu, zvýšení hladiny bilirubinu, prodloužení protrombinového času či přítomnost 30

encefalopatie a HRS. Existuje řada schémat, která se pokoušejí stanovit tíží jaterního onemocnění. Historicky prvním Childova–Turcottova kriteria (z roku 1964) umožnila na základě stanovení sérového albuminu, bilirubinu, ascitu, encefalopatie a nutrice dělení nemocných do tří skupin (45, 48). Obecně nejpoužívanější jsou Childova-Pughova (ChP) kritéria, kde stav výživy je nahrazen protrombinovým časem (tabulka číslo 6, strana 61) (48, 51). Nicméně zejména pro kritické stavy v hepatologii s uvažovanou léčbou TIPS (transjugulární intrahepatální portosystémová spojka) nebo jaterní transplantací se ujala klasifikace MELD (The Model for End-Stage Liver Disease) zohledňující sérovou hladinu kreatininu jako důležitého prediktoru přežívání nemocných s jaterní cirhózou (47, 50). Výpočet MELD - skóre: 0,957 x Loge (kreatinin mg/dl) + 0,378 x Loge (bilirubin mg/dl) + 1,120 x Loge (INR) + 0,643 Automatický výpočet skóre po zadání laboratorních výsledků je možno získat na internetových stránkách. Nepříznivá

je

prognóza

u

nemocných

s

výrazným

ascitem,

krvácením

do

gastrointestinálního traktu, v pokročilém věku, s vysokou denní spotřebou alkoholu, vysokým sérovým bilirubinem, těžkou koagulopatií, nízkou hladinou albuminu a špatným stavem výživy (50). Zásady léčby jaterní cirhózy a jejich komplikací na tomto místě nezmiňuji.

6. Portální hypertenze Portální hypertenze je syndrom, který typicky provází jak akutní tak chronické onemocnění jater, základním znakem je zvýšení tlaku krve v portálním řečišti na podkladě různých příčin. Poškození jaterní funkce však není pro její rozvoj podmínkou, jak dokazují presinusoidální portální hypertenze a intraparenchymové jaterní procesy s minimální alterací jaterních funkcí. Syndrom zahrnuje zvýšenou cévní rezistenci v jaterní mikrocirkulaci, venostázu v portálním řečišti, rozvoj portosystémových kolaterál a hyperkinetické cirkulace ve splanchnickém a systémovém řečišti, zvýšenou aktivitu sympatiku a renin-angiotensin-aldosteronového systému, 31

alteraci renální perfuze a renální funkce, tvorbu ascitu a rozvoj jaterní encefalopatie. Zatímco za fyziologických podmínek tlakový gradient mezi portální žilou a jaterními žilami (pravou síní) nepřesahuje 4mmHg, za patologické situace zaznamenáme gradient i přes 40 mmHg. Za klinicky významný portosystémový gradient považujeme hranici 12mmHg, kdy prudce narůstá riziko závažných komplikací, především krvácení z jícnových varixů. V klinice se běžně setkáváme s hodnotami kolem 20mmHg. Se vzestupem tlaku v portální žíle se rozvíjí venostáza ve splanchnických orgánech, díky níž můžeme zaznamenat splenomegalii, někdy snad i s hypersplenismem, a určitou alteraci zažívacích funkcí, která může narušit nutriční stav nemocného. Zvyšuje se produkce místních vazoaktivních látek s vazodilatačním účinkem a zvýšením průtoku v preformovaných portosystémových kolaterálách, dochází k jejich remodelaci s mnohonásobným zvýšením průtokové kapacity, rozvíjí se portosystémové kolaterály. Působením produkovaných vazoaktivních látek klesá rezistence ve splanchnických arteriolách a rozšířenými portosystémovými kolaterálami nakonec proudí více krve než za fyziologických podmínek portální žilou, rozvíjí se hyperkinetická cirkulace ve splanchnickém řečišti. Díky kolateralizaci a snížené clearance v játrech unikají vazoaktivní produkty i do systémového oběhu, takže hyperkinetická cirkulace v systémovém řečišti nemusí jít jen na vrub zvýšenému průtoku splanchnikem. S poklesem periferního cévního odporu je k udržení dostatečného arteriálního tlaku nutno zvýšit srdeční výdej, což zajišťuje zvýšená aktivita sympatiku působením na srdeční β-1 receptory, α-1 vasokonstrikční účinky pak částečně koriguje pokles periferního cévního odporu. Kromě negativního dopadu dlouhodobě zvýšené aktivity sympatiku na metabolismus se též zvyšuje arteriolární rezistence v ledvinách. Následný pokles perfuze ledvin zvyšuje aktivitu renin-angiotensin-aldosteronového systému a zapřičiňuje komplexní poruchu vodního hospodářství s expanzí extracelulární tekutiny a v pokročilém stádiu i s poklesem osmolarity extracelulární tekutiny. Funkční porucha ledvin zde hraje klíčovou roli, klinicky se vyvíjí hepatorenální syndrom. Podstatou poruchy je pokles glomerulární filtrace s akcentovanou tubulární resorpcí. Výsledkem je renální selhání s oligurií, hyperosmolární močí a velmi nízkou natriurézou. Stav je v principu reverzibilní, ale ovšem pouze za podmínek odstranění příčiny, tedy portální hypertenze s hepatocelulární insuficiencí, což je velmi problematické. Ascites představuje akumulaci tekutiny charakteru ultrafiltrátu plazmy v důsledku zvýšené tvorby v játrech na straně jedné a snížené resorpce na straně druhé. Filtrace je úměrná celkové ploše funkčních sinusoid, která se v rámci jaterního onemocnění snižuje, a intrasinusoidálního filtračního tlaku, který naopak několikanásobně stoupá. Vzhledem k vysoké propustnosti sinusoidální membrány je filtrovaná tekutina bohatá na bílkoviny, přičemž právě jejich resorpce z peritoneální dutiny má omezenou kapacitu. Dalšími významnými faktory ovlivňujícími aktuální rovnováhu mezi

32

tvorbou a resorpcí jsou objem extracelulární tekutiny, který je typicky zvýšen a který lze ovlivnit do značné míry diuretiky (ovšem s rizikem prohloubení jiných dopadů portální hypertenze, především na renální funkce), a v pokročilé fázi pak snížená osmolalita extracelulární tekutiny, která podporuje osmotické zvětšení objemu již akumulované tekutiny (54). Jaterní encefalopatie je způsobená různými látkami střevního původu, které při jaterní lézi unikají do systémového oběhu. Portální hypertenze k tomuto přispívá mohutnou kolateralizací portální krve. Aktuální míra klinické manifestace encefalopatie při chronickém jaterním onemocnění je přitom do značné míry závislá na velikosti kolaterálního oběhu a může k ní dojít i při minimálním postižení hepatocelulární funkce. Tak je tomu např. v důsledku náhlého vzestupu kolateralizace po zavedení portosystémového zkratu, potom někdy hovoříme o portosystémové encefalopatii. Dle etiologie vzniku, lokalizace překážky v portální oblasti, dělíme portální hypertenzi na prehepatální, hepatální (pre- a postsinusoidální) a posthepatální (55). Prehepatální portální hypertenze je nejčastěji důsledkem kongenitální anomálie portální žíly nebo její trombózy, hepatální forma je obvykle důsledkem cirhotické přestavby jater, posthepatální forma (BuddůvChiariho syndrom) je způsobena trombózou jaterních žil v důsledku prorůstání karcinomu jater, ledvin, nebo u hyperkoagulačních stavů. Nejzávažnějším důsledkem portální hypertenze je kolaterální oběh, který se vytváří v místech spojů portální oblasti s oblastí vena cava. K nejvýznamnějším anastomózám patří ty v oblasti jícnu a žaludku, které vedou k tvorbě gastroezofageálních varixů a kongestivní gastropatii. Spojky v rektální oblasti vytvářejí rozsáhlé hemorhoidální uzly, na břišní stěně vzniká tzv. caput medusae. Kolaterální oběh vede k průniku látek do systémového oběhu před detoxikací v játrech, a tak se objevují příznaky z chybějící detoxikační činnosti jater, encefalopatie a endotoxémie, avšak nejdůležitějším a nejzávažnějším důsledkem je krvácení do gastrointestinálního traktu (54, 55)

7. Jaterní cirhóza a infekce Více než čtvrtina pacientů s jaterní cirhózou umírá na komplikaci bakteriální infekce (2040%), přičemž mnohem vnímavější jsou nemocní s alkoholickou cirhózou. Bakteriální infekce se vyskytuje asi u poloviny pacientů s jaterní cirhózou a s krvácením z jícnových varixů (36). K nejčastějším infekčním komplikacím patří spontánní bakteriální peritonitida, infekce močového traktu, respirační infekce, bakteriémie (56). Infekce močového traktu se u pacientů s jaterní cirhózou vyskytuje ve 12-29%, nejčastěji je způsobena gramnegativními bakteriemi (Escherichia coli, Klebsiella sp.). Spontánní bakteriální peritonitida se vyskytuje až ve 23% případů a jejím 33

původcem bývají gramnegativní bakterie nebo aerobní grampozitivní koky. Respirační infekty se vyskytují v 6-10% případů a primární bakteriémie ve 4-11% případů (56, 57, 58, 59). Vysoký výskyt bakteriální infekce u pacientů s jaterní cirhózou je podmíněn několika faktory (60):
útlumem retikuloendotelového systému,
zvýšením bakteriální střevní translokace,
poruchou humorální i buněčné imunity,
narůstajícím počtem invazivních diagnostických a terapeutických výkonů Bakteriální infekce u pacientů s varikózním krvácením v důsledku portální hypertenze vznikne u 20% těchto nemocných do 48 hodin od přijetí do nemocnice (58) a její výskyt narůstá na 35-66% během následujících dvou týdnů (58, 61). U pacientů hospitalizovaných z jiných důvodů je infekce při přijetí popisována pouze v 5-7% (40, 57, 58, 59). Až u 30% cirhotiků dochází po přijetí do nemocnice k rozvoji nozokomiální infekce, což znamená více než v celé populaci hospitalizovaných osob (60), infekce jsou častější u nemocných s krvácením z gastroezofageálních varixů a je vyšší také jejich mortalita (až šestkrát) (62). Selektivní střevní dekontaminace je doporučována jako metoda prevence bakteriální infekce krvácejících cirhotiků. Je založena na principu inhibice gramnegativní střevní flóry se zachováním ostatní bakteriální flóry, především anaerobní (59). Zachování anaerobních bakterií je důležité k udržení odolnosti střeva proti střevní kolonizaci, bakteriálnímu přerůstání a mimostřevnímu šíření patogenních mikrobů (63). Retikuloendotelový systém (RES), z devadesáti procent obsažený v játrech, představuje hlavní mechanismus obrany proti bakteriální infekci, jeho součástí jsou Kupfferovy buňky a endoteliální buňky jaterních sinusoid. Mechanismus útlumu fagocytární aktivity RES při cirhóze není zcela objasněn, ale předpokládá se vliv portální hypertenze se vznikem kolaterálního oběhu, čímž dochází k vyřazení fagocytární aktivity RES v sinusoidech. Uvažuje se také o přítomnosti vnitřního defektu buněk RES. Dalšími faktory mohou být alkohol, malnutrice, hypovolémie (60). U cirhotiků dochází k útlumu nespecifické humorální i buněčné imunity, je snížena proliferace a aktivace T lymfocytů, je porušena funkce neutrofilů s poklesem jejich absolutního počtu, snížena jejich fagocytární schopnost, a tak schopnost ničit patogenní mikroorganismy. Poškození buněčné imunity je pravděpodobně důsledkem malnutrice, nedostatku vitamínů a mastných kyselin (60, 64). Významnou roli při vzniku infekce u nemocných s cirhózou hraje zvýšená bakteriální translokace střevní stěnou v důsledku portální hypertenze. Původcem bakteriální infekce je nejčastěji aerobní střevní flóra - gramnegativní bakterie, především Escherichia coli, klebsiely, enterobakterie, Proteus spp. Grampozitivní bakterie jsou původcem infekce méně jak v jedné čtvrtině případů (enterokoky, streptokoky). V poslední době však vzrůstá výskyt bakteriální infekce

34

způsobené grampozitivními koky v souvislosti s nárůstem instrumentálních výkonů, zaváděním žilních a močových katetrů a nárůstem opakovaných hospitalizací u cirhotiků (56, 61, 65, 66). U nozokomiálních infekcí je nejčastějším etiologickým agens spontánní bakteriální peritonitidy Staphylococcus aureus (32%) (56). Vysoce rizikovou skupinou stran infekčních komplikací jsou imunosuprimovaní nemocní a pacienti po transplantaci jater. Bakteriální infekce se podílí nejen na vzniku krvácení, ale zhoršuje i jeho průběh a prognózu. Pokud jsou krvácející pacienti léčeni antibiotiky, je u nich výskyt infekce signifikantně nižší nežli u nemocných bez této léčby (61).

7.1 Krvácení z jícnových varixů Na vzniku ruptury a následného krvácení jícnových varixů mají zásadní vliv tři faktory – portální tlak hodnocený portosystémovým gradientem (vznik varixů nad 10mmHg, vysoké riziko ruptury varixu nad 12 mmHg), velikost varixu (vyšší riziko při průměru varixu nad 5 mm), síla jeho stěny a tíže jaterního poškození (vyjádřena dle Child – Pughovy klasifikace). Za vlastní spouštěcí mechanismus se považuje stupeň tzv. tenze stěny varixu, který je přímo úměrný transmurálnímu varikóznímu tlaku a poloměru varixu a nepřímo úměrný tloušťce stěny varixu. Uplatňují se však některé další faktory, někdy zcela nezávislé, z nichž největší význam bývá někdy přisuzován bakteriální infekci. Výše zmiňované mechanismy vedoucí k bakteriálnímu přerůstání a translokaci mohou predisponovat cirhotiky k bakteriémii. Při bakteriémii dochází k uvolňování endotoxinů, které nejsou dostatečně eliminovány retikuloendotelovým systémem do systémové cirkulace. Ty pak stimulují generalizovanou intravaskulární aktivaci mediátorů zánětu (endotelin, tromboxan A2, prostaglandin 2α) způsobující kontrakci jaterních hvězdicovitých buněk a tím zvýšení intrahepatální portální rezistence s dalším zvýšením portálního tlaku (79). Kromě toho endotoxiny indukovaný oxid dusný a prostacyklin indukovaný endotelinem mohou vést k inhibici agregace trombocytů a tím k poškození primární hemostázy. Metaanalýza studií zabývajících se podáváním antibiotik při krvácení z jícnových varixů prokázala, že antibiotická profylaxe sníží infekční komplikace a zlepší krátkodobé přežití (65). Při použití různých antibiotik byly popsány jen malé rozdíly ve výskytu infekce a přežití (67). Antibiotická léčba je tudíž doplňkem komplexní terapie krvácení z jícnových varixů a obvykle je doporučováno pěti až sedmidenní profylaktické podávání. Shoda však není ve výběru antibiotika. Obvykle je podáván norfloxacin nebo cefotaxim (oba preparáty jsou patrně stejně účinné). V některých studiích byl podáván amoxicilin v kombinaci s kyselinou klavulanovou, ciprofloxacin samotný nebo v kombinaci s Augmentinem, ofloxacin v kombinaci s Augmentinem (68). Studie, 35

které porovnávaly účinnost různých antibiotik neprokázaly rozdíl mezi jednotlivými antibiotickými režimy v mortalitě ani ve výskytu bakteriální infekce (69, 70, 71). Výběr, dávka ani způsob podání antibiotika tedy zatím není přesně stanovena, přesto však je jeho profylaktické podávání doporučováno. Vzhledem k možným vedlejším a nežádoucím účinkům antibiotik je otázkou profylaktické podávání probiotik u takto nemocných. Byly publikovány randomizované studie srovnávající výskyt infekcí u pacientů s varikózním krvácením při preventivním podávání antibiotik a bez této profylaxe. Z antibiotik byly použity fluorochinolony, buďto samostatně nebo v kombinaci s amoxicilinem a kyselinou klavulanovou anebo v kombinaci s nevstřebatelnými antibiotiky, a bylo zjištěno, že u nemocných, jimž byla podávána antibiotika profylakticky, byl výskyt bakteriální infekce a bakteriémie signifikantně nižší a naopak přežití pacientů bylo signifikantně vyšší (63, 72, 73, 74, 75). Další studie s 864 pacienty, která se zabývala efektem antibiotické profylaxe u varikózního krvácení ve srovnání s placebem nebo neléčenými pacienty prokázala, že tato léčba je efektivní, je dobře tolerována, snižuje četnost bakteriální infekce i mortalitu (76). Další studie potvrdily statisticky významné snížení výskytu bakteriální infekce u pacientů s antibiotickou profylaxí, ale neprokázaly vliv na mortalitu krvácejících cirhotiků (77, 78).

7.2 Spontánní bakteriální peritonitida Spontánní bakteriální peritonitida je definována jako bakteriální infekce ascitické tekutiny bez zjistitelného a chirurgicky řešitelného zdroje infekce. Nejčastěji je přítomna u cirhotického ascitu, výjimečně u ascitu jiné etiologie – maligního. U pacientů s ascitem po infekci ascitické tekutiny vždy aktivně pátráme a časně ji léčíme (54). V literatuře se můžeme setkat s několika pojmy při popisu infekce ascitu: 1.

spontánní bakteriální peritonitida (SBP), definovaná jako pozitivní bakteriální nález v ascitu se zvýšeným počtem granulocytů nad 250 buněk na mm3

2. culture negative neutrocytic ascites (CNNA), bez průkazu infekce při kultivačním bakteriologickém vyšetření, ale s přítomností zvýšeného počtu granulocytů >250 buněk na mm3, avšak s nutností vyloučení jiné příčiny vzniku vzestupu leukocytů v ascitu 3. monomicrobial non-neutrocytic bacterascites (MNBA), kdy je prokázána pozitivní kultivace bez zvýšeného množství leukocytů. Spontánní infekce komplikující ascites u cirhotiků je poměrně častá, v literatuře je popisována v 827% případů, a mortalita je vcelku vysoká, 20-40%. Dlouhodobá prognóza je také nepříznivá a 36

časté jsou recidivy infekce ascitické tekutiny (54, 79). V patogenezi se uplatňuje střevo, neboť nejčastěji nalézanými bakteriemi jsou Escherichia coli a Klebsiella pneumoniae. narozdíl od sekundární peritonitidy, která vzniká nejčastěji při perforaci střeva, při ileu. V případě spontánní bakteriální peritonitidy morfologická léze střevní stěny chybí. K infekci dochází v důsledku translokace bakterií skrze střevní stěnu. Za normální situace mezenteriání lymfatické uzliny translokující bakterie ničí, avšak u pacientů s cirhózou je nalézána infekce mnohem častěji a některé bakterie se dostanou až do krevního oběhu a mohou vyvolat bakteriémii. Na vzniku bakteriémie se podílí také snížená fagocytární aktivita monocytomakrofágového systému, snížená sérová hladina komplementu, poškození leukocytárních funkcí. Negativní roli hraje i vznik portokaválních spojek, které snižují clearance bakterií jaterním retikuloendotelovým systémem. Ascites může být tedy infikován sekundárně při bakteriémii. Zda k infekci dojde závisí na antimikrobiální aktivitě ascitu, v níž největší roli hraje opsoninová aktivita ascitu - schopnost ascitu zvýšit účinnost fagocytů, neutrofilů při ničení bakterií. Pro opsoninovou aktivitu je důležitá koncentrace bílkovin v ascitu, a právě SBP se vyskytuje častěji u pacientů s nízkou koncentrací bílkovin v ascitu, s nízkou hladinou komplementu a nízkou opsoninovou aktivitou. Klinický obraz SBP je variabilní a nespecifický, často probíhá asymptomaticky, naopak někdy jsou přítomny subfebrilie, difuzní bolesti břicha, časté je zhoršení průběhu choroby, jaterní selhání, nárůst ascitu, zhoršení encefalopatie, zvracení, neúčinnost diuretické léčby. Příznaky těžké břišní infekce s rozvinutým šokem a ileózním stavem byly posány zcela výjimečně. Diagnostika se jednoznačně opírá o vyšetření ascitu – stanovení množství leukocytů nad 400 buněk/ml, přesněji granulocytů nad 250buněk/ml, a event. pozitivní kultivační nález. Stanovení množství granulocytů v ascitu a kultivační vyšetření provádíme vždy při první diagnostické punkci ascitu, u cirhotiků s ascitem při nástupu do nemocnice, při zhoršení klinického stavu cirhotika, při známkách infekce (45, 54). Terapeuticky jsou zásadní antibiotika, doporučován je cefotaxim v jednotlivé dávce 2 g každých 8–12 hodin po dobu 5 dnů, alternativně je možné použít chinolony a v současné době je doporučována antibiotická terapie v kombinaci s intravenózně podaným albuminem. U pacientů po prodělané SBP je doporučováno podávat norfloxacin v jedné denní dávce 400 mg dlouhodobě.(50, 52, 80).

7.3 Jaterní encefalopatie 37

Jaterní encefalopatie představuje běžnou, ale hrozivou komplikací jaterní cirhózy. Je definována jako porušení funkcí centrálního nervového systému v důsledku jaterního selhání. Na vzniku jaterní encefalopatie u pacientů s chronickým jaterním onemocněním se podílí snížená jaterní funkce. Současně však část krve játra obchází vytvořenými kolaterálami při portální hypertenzi a dochází k transportu toxinů vstřebaných ze střeva přímo do systémového oběhu. Vlastním spouštěcím mechanismem vzniku a zhoršení stávající jaterní encefalopatie mohou být exogenní i endogenní faktory. Nejčastějšími exogenními faktory jsou zvýšený přívod dusíku (gastrointestinálním krvácením, nadměrným příjmem v potravě, mnohdy při zácpě, vzácně po krevním převodu), léky (diuretika, méně často narkotika, hypnotika, sedativa), infekce a chirurgické zákroky. Mezi endogenní faktory patří elektrolytové a metabolické poruchy (hypokalémie, hyponatrémie, alkalóza, hypoxie), sepse vyvolávající katabolismus, dehydratace zhoršující perfuzi jater, azotémie. Amoniak je tvořen ve střevě činností ureolytických a proteolytických bakterií. V centrálním nervovém systému zvyšuje membránové potenciály a negativně působí na neuroastrocytovou výměnu neuroaktivních látek. Amoniak je metabolizován v astrocytech a právě při jaterní encefalopatii bylo histologicky popsáno spíše postižení astrocytů nežli neuronů. Mimo amoniaku mohou hrát roli i další látky z gastrointestinálního traktu, biogenní aminy, merkaptany, fenoly a mastné kyseliny s krátkým řetězcem. Jako minimální jaterní encefalopatii označujeme nevysvětlitelnou poruchu kognitivních funkcí jako je např. zpomalená psychomotorika, nedostatek pozornosti, poruchy jemné motoriky a vnímavosti zrakových vjemů (54, 80, 81, 82). K diagnostice užíváme psychomotorické testy (schopnost podepsat se, namalovat hvězdu). Objektivně lze jaterní encefalopatii hodnotit pomocí testu spojování čísel - number connecting testu (NCT), parametrem je čas potřebný k jeho vyhotovení (tabulka číslo 4).

Tabulka č. 4. Normy NCT pro jednotlivé věkové skupiny

Věk (roky) 20 - 30 31 – 40 41 – 50 51 – 60 61 a více

Čas zhotovení NCT (s) 30 33 40 45 46

Směrodatná odchylka (s) 7 9 10 9 12

Dle klinického obrazu rozlišujeme čtyři stupně jaterní encefalopatie (12, 54):

38

1 porucha spánku, neklid, euforie nebo deprese, 2

dezorientace, porucha vnímání, řeči, neadekvátní chování, ataxie,

3

somnolence, neklid,

4

koma.

Etiologie encefalopatie je multifaktoriální. Důležitou roli v patogenezi hraje právě amoniak, který je jednak produkován střevními bakteriemi, jednak je přiváděn do těla potravou. U cirhotiků byla prokázána zvýšená propustnost hematoencefalické bariéry pro amoniak a zrychlený metabolismus amoniaku v mozkové tkáni (81). Jestliže dochází k vysokému zatížení organismu aminokyselinami, stravou bohatou na proteiny, může potom rozpad proteinů způsobit výrazný vzestup amoniaku v krvi a tkáních až do toxických koncentrací (1, 54). Pro jaterní encefalopatii jsou také typické změny na EEG (zpomalení základní frekvence, trifázické vlny). MRI může diagnostikovat změny v basálních gangliích, ale jejich podstata ani význam nejsou zatím objasněny. CT je vhodné jednak v rámci diferenciální diagnostiky, vyloučení mozkového edému a u pacientů v komatu (50, 82, 83). Terapie jaterní encefalopatie zahrnuje léčbu snižující produkci amoniaku v trávicím traktu, léčbu redukující falešné neurotransmitery a inhibující GABA receptory (receptory pro kyselinu gamaaminomáselnou) a benzodiazepinové receptory. V léčbě snižující tvorbu amoniaku se uplatňují dietní opatření (změny přívodu bílkovin z potravy) a medikamentózní léčba, především prebiotika a antibiotika. Z prebiotik jsou užívány nevstřebatelné disacharidy, jejichž efekt je znám již ze 70. let minulého století. Tyto látky působí snížení amoniaku jednak urychlením pasáže, tedy laxativním účinkem, jednak snížením pH v tlustém střevě, což vede ke snížené aktivitě ureolytických a proteolytických enzymů mikrobiální střevní flóry, dále ke snížení resorpce vzniklého amoniaku, a snad i dokonce ke snížení hladiny amonémie průchodem amoniaku do střevního lumina. V klinické praxi se užívá nejčastěji laktulóza, obvykle v dávce 30-60g/den, přičemž rozhodující pro dávkování by měl být pokles pH stolice pod 6,0 a zvýšení počtu stolic na 2-4 denně. Jinou léčebnou variantou je betagalaktosidsorbitol, zvaný laktitol. Ve studiích in vitro i in vivo byl prokázán pozitivní vliv těchto látek na jaterní encefalopatii a to dokonce i v případě její subklinické formy (12, 83, 84, 85, 86, 87). Antibiotická léčba účinkující na bakterie produkující ureázu používá nověji rifaximin. Neomycin již užíván není pro potenciální ototoxicitu a nefrotoxicitu. Metronidazol v denní dávce 800mg denně je užíván zřídka, zkušenosti s dlouhotrvající léčbou byly spojeny s neurotoxicitou. Podle výsledků kontrolovaných studií Festiho a Williamse se ukázalo, že efekt rifaximinu v denní dávce 3x200mg je srovnatelný s laktitolem 3x20g/den, jestliže terapie v obou skupinách trvala 5-7 dnů. Oba způsoby léčby vedly ke značnému zlepšení objektivních parametrů encefalopatie včetně normalizace elektroencefalogramu.

39

Vedlejší účinky léčby byly zanedbatelné (67, 88, 89). Dle novějších studií probiotický kmen Lactobacillus acidophillus snižuje bakteriemi produkovanou ureázu a tím klesá hladina amoniaku v séru (90).

8. Antibiotika 8.1 Antibiotika obecně Antibiotika jsou látky, které inhibují růst a množení mikroorganismů, eventuelně je usmrcují. Jsou produkována aktinomycetami, plísněmi či bakteriemi, mají tedy přirozený původ. Jejich deriváty jsou připravovány polysynteticky nebo i čistě syntetickou cestou. Podle mechanismu účinku rozlišujeme antibiotika, která narušují syntézu bakteriální stěny, poškozují protoplasmatickou membránu, inhibují proteosyntézu bakterií nebo narušují tvorbu nukleových kyselin či působí kompetitivní inhibici. Podle účinku rozlišujeme antibiotika primárně baktericidní, která mohou bakteriální buňku usmrtit, a bakteriostatická, která pouze zastaví růst a množení bakterie. Avšak i bakteriostatická antibiotika mohou působit ve vysokých koncentracích baktericidně. Praktický význam tohoto dělení tkví v tom, že baktericidní látky působí irreverzibilně, 40

a také rychlost účinku je různá. Baktericidní látky působí rychleji, klinický efekt se projeví obvykle do 48 hodin. V praxi často používáme kombinaci dvou, někdy i více antibiotik. Smyslem je rozšířit bakteriální spektrum, snížit toxicitu jednotlivých antibiotik, oddálit vznik rezistence a dosáhnout synergistického působení, a tak vyššího léčebného účinku (91). I když jsou antibiotika léky velmi prospěšné, často zachraňující život, nesmíme opomíjet a přehlížet jejich možné nežádoucí účinky, jež mohou pacienta vážně ohrozit. Nežádoucí účinky mohou být toxické, alergické a biologické. Toxické nežádoucí účinky vznikají obvykle při podávání vysokých dávek nebo při kumulaci antibiotika v organismu následkem jeho špatné eliminace ledvinami či játry. Tyto účinky mohou být nejen gastrointestinální a hepatotoxické, jako je nauzea, zvracení, průjmy, vzestup bilirubinu a jaterních testů, hepatitida po podání tetracyklinů, chloramfenikolu, erytromycinu, rifampicinu, ale i neurotoxické, např poškození sluchového a vestibulárního nervu po aminoglykosidech, poruchy CNS po megadávkách penicilinu, polyneuritidy po kolistinu, psychické poruchy po amfotericinu B, dále nefrotoxické (snížení filtrace až oligurie, proteinurie a hematurie), přičemž nejvíce toxické jsou aminoglykosidy, polymyxin, vankomycin, a hematotoxické s hypoplastickou až aplastickou anémií, agranulocytózou či trombocytopenií. Alergické projevy bývají nejčastěji po penicilinech, méně časté po cefalosporinech, sulfonamidech. Klinicky může jít o kopřivku, angioneurotický edém, astmatický záchvat až anafylaktický šok. Biologické účinky vznikají zásahem antibiotika do metabolismu člověka, do ekologické rovnováhy jednotlivých systémů organismu a zásahem do projevů a průběhu infekčního onemocnění. Jako komplikace pak může vzniknout pseudomembranózní kolitida, příznaky z bakteriolýzy, je ovlivněna tvorba vitamínů B a K, mění se imunitní reakce organismu (91, 92).

8.2 Antibiotika a GIT Antibiotika významně ovlivňují mikroflóru trávicího traktu. Mezi negativní vlivy patří vznik dysmikrobie, postantibiotické průjmy, pseudomembranózní kolitida, někdy se hovoří o antibiotic associated diarrhoea a antibiotic associated colitis. Mezi pozitivní vlivy pak patří možnost terapie střevních infekcí, cestovatelských průjmů, symptomatických nekomplikovaných divertikulárních nemocí, idiopatických střevních zánětů, syndrom bakteriálního přerůstání (syndrom slepé kličky), léčba jaterní encefalopatie. Důležitou indikační oblast představují antibiotika v léčbě kolitid, které vznikly v asociaci s nepříznivě působící antibiotickou léčbou, dále v pre a postoperační profylaxi infekčních komplikací 41

v

gastrointestinální

chirurgii,

a

konečně

v

tzv.

selektivní

střevní

dekontaminaci

u

imunokompromitovaných nemocných. Negativní vlivy antibiotik se mohou projevit jako antibiotic associated diarrhoea (AAD), která představuje prostý průjem v průběhu antibiotické léčby a krátce po ukončení užívání antibiotik spontánně ustoupí, a jako antibiotic associated colitis (AAC), která představuje stupňovitě střevní dysmikrobii – postantibiotický průjem – pseudomembranózní kolitidu. Jako důsledek použití v podstatě kteréhokoli antibiotika se tedy může objevit široká škála příznaků, od epizody průjmu bez kolitidy, epizody průjmu s kolitidou až po epizodu průjmu s pseudomembranózní kolitidou, která představuje nejzávažnější formu s možností komplikací toxického megakolon a perforace tračníku (12). Při AAD a u lehkých AAC příznaky častou ustoupí po vysazení antibiotik bez terapie, ovšem manifestní AAC, dokonce s nálezem klostridiových toxinů, musí být léčena antibiotiky, zejména pokud jde o pseudomembranózní kolitidu. V antibiotické léčbě lze použít metronidazol, vankomycin a nověji také rifaximin. Lékem volby v první linii je metronidazol s vědomím jeho systémových nežádoucích účinků (nauzea, periferní neuropatie, ataxie a psychické změny). Vankomycin je z digestivního traktu špatně vstřebatelný, má vysokou koncentraci ve stolici, bývá dobře tolerován a většina kmenů Clostridium difficile je na něj citlivá. Vždy však nutno myslet na riziko selekce vankomycin rezistentních enterokoků (VRE), které mohou vést k sepsi a které jsou jen obtížně léčebně zvladatelné. Relativně novou variantou v terapii AAC asociované s kolitidou reprezentuje rifaximin, který je nevstřebatelný, má vysokou slizniční koncentraci a rezistence je zatím nevýznamná. Otevřená randomizovaná studie oproti vankomycinu podávala denní dávku rifaximinu 3x200mg a prokázala jeho téměř stejnou účinnost jako při podávání vankomycinu. Pozitivní vlivy antibiotik na mikrobiální ekosystém trávicího traktu mají několik úrovní efektivity, které popsal v experimentu Krčméry:
vlastní antimikrobiální efekt na patogenní mikroorganismus
modulující vlivy na mikroflóru trávicího traktu
imunologické vlivy antibiotik. K imunologickým vlivům patří zejména pokles chemotaxe, pokles blastické transformace lymfocytů, pokles fagocytózy. Přímé antimikrobiální vlivy a vlivy na strukturu mikrobiálního digestivního ekosystému představují hlavní indikace použití antibiotik z hlediska mikroflóry trávicího traktu (12, 93).

42

9. Endotoxin 9.1 Struktura, mechanismus účinku Ve stěně gramnegativních i grampozitivních bakterií je peptidoglykanová vrstva. U gramnegativních bakterií je vně od této peptidoglykanové vrstvy ještě povrchová vrstva zevní membrány tvořená fosfolipidy, lipopolysacharidem, kyselými polysacharidy a významným množstvím (asi 50%) bílkovin. Biologicky aktivní složku tvoří lipopolysacharidový komplex, který je označován jako endotoxin (obou termínů se dosud užívá). Lipopolysacharidy jsou polymery dosahující až mnohamilionové molekulární hmotnosti. Mají tzv. strukturální oblasti, a to specifický polysacharid, který je spojen s dřeňovou oblastí a ta je napojena na lipid A. Základní princip struktury je stejný u všech endotoxinů, ale jednotlivé

43

bakteriální druhy se liší ve složení polysacharidových řetězců í ve složení lipidu A. Polysacharidová část je tvořena O specifickým řetězcem a dřeňovou částí. Specifický řetězec je polymer složený z oligosacharidů, nese antigenní determinanty a určuje serologickou specifitu bakteriálního druhu. Bylo zjištěno, že O specifický řetězec chybí u Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis. Dřeňová část je společná pro celou skupinu. Dřeňový oligosacharid je kovalentně vázán na lipid A, jehož kostra se skládá ze dvou molekul glukosaminu, které jsou spojeny fosfátovými můstky. Hydroxylové skupiny jsou esterifikovány vyššími mastnými kyselinami. Polysacharidová část se podílí na virulencí bakterie (může přispívat k adhezi, aktivovat komplement), lipid A je zodpovědný za toxicitu. Lipopolysacharid je uspořádán jako dvojvrstva, kde hydrofilní část je tvořena polysacharidem, hydrofobní část lipidem. Lipopolysacharid brání vstupu těžkých kovů, žlučových kyselin a větších molekul do bakteriální buňky. Biologická aktivita se může projevit jen tehdy, když se uvolní lipopolysacharid ze zevní membrány. Uvolňuje se rozpadem bakteriální buňky anebo také ve formě volného endotoxinu, kdy se drobné fragmenty aktivně během života bakterie oddělují z povrchu ve formě droboučkých puchýřků. Toxicita endotoxinu se uplatňuje při systémových onemocněních, při bakteriémii, avšak ne v lumen zažívacího traktu. K masivnímu zaplavení organismu endotoxinem dochází při rozpadu bakterií účinkem vlastních autolytických enzymů (zejména u meningokokcémií), v důsledku cytolýzy komplementem, účinkem membránově působících antibiotik. Endotoxémie hrozí při sepsi vyvolané gramnegativními bakteriemi.

Obrázky č. 1, 2, 3 převzaty z internetové stránky http://www.zuova.cz/informace/nrlpab09.php

44

Endotoxin se účastní na vzniku toxického šoku v souvislosti s nedostatečným přísunem kyslíku u šokových stavů nejrůznější etiologie (hypovolemie, stres, operační zátěž apod.). Porušená

45

střevní bariéra se pak stává prostupnou a umožňuje průnik endotoxinu a jeho uplatnění. Svými účinky endotoxin stav nemocného zhoršuje, nezřídka až k letálnímu konci. Za normálních okolností se endotoxin z gramnegativních bakterií rezidentní flóry tlustého střeva vstřebává jen v minimálním množství a stimuluje imunitní systém. Endotoxin se uvolňuje do krevního oběhu z různých primárních ložisek gramnegativní flóry, ale nejčastěji při perforaci střeva, popáleninách, obstrukcích močového traktu, infekcích žlučníku. Nejčastějšími druhy jsou bakterie flóry tlustého střeva (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacteroides fragilis). Reakce makroorganismu na endotoxin závisí na množství uvolněného endotoxinu. V nízkých dávkách svou interakcí s makrofágy, neutrofily, B lymfocyty a komplementovým systémem vyvolává horečku, vazodilataci, zvýšenou syntézu protilátek a zánětlivou reakci, při vysokých dávkách přistupuje ještě intravaskulární koagulopatie a šok. Lipopolysacharid (LPS) interaguje s plasmatickými proteiny a s buněčnými povrchy. Pro biologickou aktivitu endotoxinu je důležitá vazba na plasmatický protein, který se podílí na vazbě LPS na CD14 receptor v buňkách (monocyty, neutrofily). Ovlivňuje i další proteiny (Hagemanův faktor, prekallikrein, faktor XI kininogen) a další faktory zúčastňující se krevního srážení a komplementové kaskády. Cílovými buňkami jsou buňky monocytomakrofágové řady, z nichž se uvolňují mediátory, neutrofilní leukocyty, B lymfocyty (zvyšuje se tvorba protilátek), endotelie. Pyrogenní reakce vzniká po velmi malých množstvích endotoxinu: Po intravenózním podání 100 ng endotoxinu dobrovolníkovi vyvolalo prokazatelné zvýšení teploty (množství endotoxinu odpovídá asi 106 gramnegativních střevních tyček). Horečka vzniká jako odpověď na endogenní pyrogeny uvolněné z makrofágů. Jako endogenní pyrogeny se chovají např. IL-1, TNFα. Aktivace komplementového systému účinkem endotoxinu probíhá zpravidla alternativní cestou. Důsledkem této aktivace je cytolýza buněk spojená s dalším uvolňováním endotoxinu, zvýšení chemotaxe a opsonizace. Neutrofily jsou do ložiska přitahovány fragmentem C5a. Fragment C3b se chová jako opsonin, a tak zvyšuje fagocytózu. Při aktivaci komplementu se uvolňují anafylatoxiny (fragmenty C3a a C5a), které zvyšují kapilární permeabilitu, a z neutrofilů se uvolňují lysosomální enzymy. Aktivace komplementu zprostředkuje zánětlivou reakci. Endotoxin je schopen vázat se na receptory CD14 na povrchu buněk monocytomakrofágové řady a stimulovat zvýšenou produkci lyzosomálních enzymů, zvyšovat rychlost fagocytózy a uvolňovat hydrolytické enzymy. Aktivované makrofágy účinněji odstraňují partikule z prostředí a jsou schopny zpracovat větší množství mikroorganismů. Aktivované makrofágy rovněž mohou snáze likvidovat nádorové buňky, a to přímo vazbou nebo zprostředkovaně uvolňovaným TNF-α. Interakce endotoxinu s makrofágy je spojena s mediátorovou bouří, tj. nekontrolovaným

46

uvolňováním cytokinů, zejména TNF-α, IL-1 a IL-6. Tyto cytokiny spouštějí uvolňování bioaktivních lipidů a kaskádu dalších cytokinů a kyslíkových radikálů z řady buněk. Důsledkem je zvýšená vaskulární permeabilita, snížení kontraktility srdečního svalu, vazodilatace, plicní hypertenze a diseminovaná intravaskulární koagulopatie. Interleukin 1 zvyšuje proliferaci B buněk, které po dozrání produkují více protilátek, čímž se endotoxin uplatňuje jako nespecifické imunoadjuvans. Popsané účinky menších dávek endotoxinu ukazují, že mohou být pro hostitelský organismus výhodné (adjuvantní účinky pro tvorbu protilátek, zvýšená aktivita makrofágů, protinádorové účinky). Naopak vysoké dávky endotoxinu vedou plynule k příznakům endotoxinového šoku s rizikem letálního konce. Zde se uplatňuje zejména vazodilatace a snížení výkonu myokardu, což má za následek poruchy oxidace a multiorgánové selhání spolu s diseminovanou intravaskulární koagulopatií (DIC). Klíčovou příčinou hypotenze je uvolnění TNFα a IL-1. Diseminovaná intravaskulární koagulopatie, charakterizovaná vznikem trombů v malých cévách, zhoršuje krevní zásobení orgánů, což se projevuje zejména v kůře ledvin, kde vznikají nekrózy. Z dalších orgánů jsou postiženy zejména mozek, plíce (syndrom dechové tísně) a nadledviny. Endotoxin ovlivňuje krevní srážlivost čtyřmi způsoby: 1. aktivuje faktor XII., tzv. Hagemanův, čímž spouští srážecí kaskádu, 2. ovlivňuje krevní destičky, uvolňuje se obsah granul, který se účastní na srážení, 3. iniciuje uvolňování bazických proteinů z neutrofilů, 4. ovlivňuje endotelie (94).

9.2 Laboratorní průkaz bakteriálních endotoxinů Gramnegativní bakterie produkují endotoxiny, protože je ke svému životu potřebují. Lipopolysacharidová vlákna gramnegativních bakterií vytvářejí tzv. glykokalyx - rigidní hmotu, díky níž bakterie adherují ke tkáním a sliznicím, a zahajují tak vlastní infekční proces. Kromě toho rigidní lipopolysacharidová hmota brání pronikání nežádoucích látek do nitra buněk. Zvláště nepříjemná je tato skutečnost během antibakteriální terapie. Většina gramnegativních bakterií díky lipopolysacharidovým vláknům odolává i poměrně vysokým dávkám antibiotik mnohem účinněji než "holé" buňky grampozitivních bakterií. Jak ve volné přírodě, tak i v laboratorních podmínkách, nebyly nalezeny ani popsány kmeny gramnegativních bakterií, které by neměly ve své buněčné stěně lipopolysacharidy. V podmínkách in vitro dochází pouze ke snížení počtu lipopolysacharidů v buněčné stěně, což má za následek 47

velice nepříjemný a nežádoucí fenomén: ztížení nebo dokonce nemožnost průkazu endotoxinů u izolovaných, několikrát pasážovaných kmenů patogenních gramnegativních bakterií. Proto je velký důraz kladen na přímý průkaz endotoxinů ve vzorcích klinického materiálu. Laboratorní průkaz bakteriálních toxinů je poměrně obtížný. V současné době jsou k průkazu bakteriálních endotoxinů u gramnegativních bakterii k dispozici komerčně vyráběné identifikační systémy, které umožňují jak kvalitativní, tak i kvantitativní průkaz endotoxinů. K průkazu endotoxinů jsou používány amébocyty z hemolymfy ostrorepa amerického (Limulus polyphemus), které po kontaktu s LPS gramnegativních bakterií vykazují výrazný koagulační efekt. Celá koagulace je zvýrazněna chromogenním barvivem. Kvantitativní průkaz endotoxinů G- bakterií je prováděn fotometrickým stanovením intenzity případné koagulace endotoxinu ve vyšetřovaném vzorku s amébocyty ostrorepa. Množství endotoxinu je pak stanoveno pomocí lineární regresní křivky a jeho koncentrace je uváděna přímo v jednotkách EU/ ml vzorku.

9.3 Limulus test Limulus amébocyty lyzát (LAL) je vodný extrakt krevních buněk (amébocytů) ostrorepa Limulus polyphemus. V přítomnosti endotoxinu dojde k aktivaci faktorů přítomných v LAL a je zahájen kaskádovitý proteolytický proces, jehož výsledkem je štěpení bezbarvého substrátu (uměle vyrobený peptid) přítomného v lyzátu (obchodní název Pyrochrome). Proteolytické štěpení substrátu uvolňuje p-nitroanilin (pNA), který je žlutý a absorbuje světlo s vlnovou délkou 405nm. Test se provádí přidáním objemu Pyrochromu k objemu vzorku a inkubací reakční směsi při 37°C. Čím vyšší je koncentrace endotoxinu ve vzorku, tím rychleji je uvlňován pNA. Blíže viz experimentální část (95, 96, 97).

Obr. č. 4. Ostrorep Limulus polyphemus

Obr. č. 5 Limulus trest Pyrochrome

10. Probiotika 48

10.1 Historie probiotik Termín probiotikum je odvozeno z řeckého spojení pro bios = pro život. Zmínky bychom mohli nalézt již ve Starém zákonu. Za zakladatele učení o probioticích je považován ruský mikrobiolog Ilja Mečnikov (1845-1916), který je autorem koncepce antibiózy, potlačování růstu a jiných životních projevů jednoho mikroorganismu jiným mikroorganismem. Popsal bakterii Lactobacillus bulgaricus, která je schopna ve střevě potlačit bakterie produkující toxiny, a tak zlepšit zdraví člověka. Tato koncepce byla potvrzena Flemingovým objevem penicilinu a následnou érou antibiotik. Mečnikov viděl realizaci této koncepce v tzv. mikrobiální interferenční terapii, jejíž podstatou je podávání některých kmenů komenzální střevní mikroflóry ke změně a stabilizaci rezidentní mikroflóry (mikroflóry přítomné ve zdravém střevě). Tímto způsobem lze příznivě ovlivnit zdravotní stav hostitele a dosáhnout prevence některých chorob nebo zlepšení jejich průběhu (1, 10, 98, 99, 100). Němečtí autoři uvádějí za zakladatele teorie o probioticích Döderleina, který ve své práci asi 16 let před Mečnikovem navrhl užití vaginálních bakterií produkujících kyselinu mléčnou k inhibici růstu patogenních mikrobů (101). Od té doby bylo vytvořeno mnoho definicí probiotik, snažících se co nejlépe popsat mechanismy jejich příznivého působení. Roku 1989 popsal Fuller probiotika jako živé mikrobiální potravinové doplňky, které příznivě ovlivňují hostitele tím, že upraví jeho střevní mikrobiální systém. Schrezenmeir a spol. pak označili probiotika jako preparáty nebo produkty obsahující živé a definované mikroorganismy v dostatečném množství a ovlivňující střevní mikroflóru a tím i zdraví hostitele (1, 99, 102, 103). Všechny známé definice probiotik poukazují na skutečnost, že spektrum jejich účinku je široké a univerzální, přestože mechanismy účinku jsou podobné. Probiotika obecně mohou obsahovat nejen jeden, ale i několik probiotických kmenů, mohou působit imunomodulačně a ovlivnit i jiné systémy lidského těla než je střevo. Proto Isolauri a spol. definovali probiotika jako specifické živé nebo inaktivované kultury mikroorganismů schopné snížit morbiditu a zlepšit nutriční parametry nemocných (1, 104).

10.2 Probiotika – definice, mechanismus účinku, klinické využití Probiotika jako živé mikroorganismy lidského původu ovlivňují příznivě zdraví člověka, jsou nepatogenní, mají schopnost odolat nástrahám lidského gastrointestinálního traktu (procesům trávení, kyselině chlorovodíkové, žluči), upravují mikrobiální rovnováhu střeva, porušenou slizniční bariéru, posilují střevní imunitní systém, usnadňují eliminaci toxinů a eradikaci patogenních mikrobů a je možné je typizovat. Jsou to například Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Escherichia coli, Lactobacillus delbrueckii bulgaricus, Lactobacillus 49

johnsonii,

Bifidobacterium

bifidum,

Bifidobacterium

brevis,

Bifidobacterium

infantis,

Bifidobacterium longum, laktokoky, enterokoky a streptokoky a také kvasinka Saccharomyces boulardii, která však není lidského původu, není tedy pravým probiotikem, a označujeme ji jako bioterapeutikum (viz níže). Pro medicínské využití probiotických kmenů bakterií je nutné, aby identita zárodků byla jasně definována, byla zaručena jejich čistota, enterální neinvazivita, nesmí produkovat žádné enterotoxiny nebo cytotoxiny, musí být zcela nepatogenní (1, 98, 103). V současnosti probíhá řada studií zkoumající možnosti terapeutického využití probiotik v klinické praxi. Velký zájem je soustředěn na možnost ovlivnění nespecifických střevních zánětů, zejména ulcerózní kolitidy (10, 105). Probiotika se užívají i v léčbě některých specifických průjmových onemocnění – průjmů u nedonošených novorozenců, rotavirových průjmů, průjmů po antibiotické terapii, včetně klostridiových, průjmů u nemocných s AIDS. Zkoušejí se i u nemocných s vředovou chorobou gastroduodena jako varianta ovlivňující výskyt infekce Helicobacter pylori, infekcí močových cest, pomáhají nemocným s dráždivým tračníkem, laktózovou intolerancí. Nadějnou oblastí využití probiotik jsou alergické dermatitidy a potravinové alergie, neboť podporou funkce střevní bariéry ovlivní střevní translokaci, a redukují tak alergickou reakci organismu. Další možností, vzhledem k uvažovanému antimutagennímu a antikarcinogennímu efektu, jsou nádorová onemocnění, kde se předpokládá vliv detoxikační činnosti střevní mikroflóry snižující aktivitu mikrobiálních enzymů (glukuronidázy, glukosidázy, nitroreduktázy) hrající významnou roli v kancerogenezi (98). Nežádoucí účinky probiotických kmenů byly popsány jen velmi zřídka, např. infekce způsobená laktobacily nebo bifidobakteriemi (v 0,05-0,4% případech infekční endokarditida a sepse), dále fungémie u dvou imunokompromitovaných pacientů a exacerbace průjmu u dvou pacientů s ulcerózní kolitidou, kteří užívali Saccharomyces boulardii (104). Účinek probiotik předpokládá schopnost kompetice probiotik s patogenními mikroby v adhezi na střevní epitelie, tvorbu peptidů s bakteriostatickými a baktericidními vlastnostmi (kolicinů a mikrocinů), regulace funkce střevní bariéry a mikrobiální translokace, modulace funkce střevních epitelií a dendritických buněk, ovlivnění lokální a systémové imunity, schopnost zabránit přerůstání patogenů, stimulovat eliminaci toxinů, tvořit steroidy z cholesterolu, ovlivnit sekreci hlenu, vstřebávání, motilitu a průtok krve splanchnickým řečištěm (10). Komenzální mikroflóra, rezidentní i importovaná, má imunomodulační vlastnosti. Rozsah a trvání imunostimulační aktivity a imunomodulace se však liší. Rezidentní mikroflóra vytváří s hostitelem asociaci trvalou - autochtonní mikroflóra. Probiotika jsou přítomna ve střevě během aplikace a krátkou dobu po ní (většinou několik týdnů) a vytvářejí s hostitelem dočasnou asociaci -

50

alochtonní mikroflóra. Příčiny tohoto rozdílu nejsou zcela přesně známy. Předpokládá se, že hostitelská buňka nemá pro probiotikum vytvořeny permanentní receptory nebo že probiotikum není schopno trvalé kompetice s rezidentní autochtonní mikroflórou o úzký vztah k epitelu. Imunitní buňky mají poznávací receptory pro probiotika. Zatím však není známo, zda k indukci imunity je třeba perzistence a replikace importované mikroflóry nebo zda je dostatečné setkání s epitelem, které spustí signalizační kaskády vedoucí k aktivaci imunitních buněk v lamina propria s následnou “upregulací“ cytokinů a bioaktivních molekul. Kolonizace střeva mikrobiální flórou po narození má kritický význam pro vytvoření orální tolerance. Tento proces se však realizuje po narození zcela nahodilým způsobem a je známo, že v časných stádiích vývoje imunitního systému u novorozence je odpověď na antigeny prostředí vychýlena ve prospěch Th2 cytokinového profilu, který je typický pro alergická onemocnění. Nedostatečná postnatální expozice střeva mikroflóře, která je nutná pro vyvážené vyzrání imunitního systému do neatopického stavu, se považuje za pravděpodobnou příčinu výrazného zvýšení atopických onemocnění ve vyspělých zemích. K úpravě tohoto stavu přichází v úvahu řízená časná postnatální expozice probiotickými kmeny (1, 10). Střevní slizniční bariéra reguluje transportní pochody mezi střevním lumen a vnitřním prostředím, jednotlivé absorpční mechanismy jsou jemně regulovány podle fyziologických potřeb organismu prostřednictvím membránových pump, iontových kanálů a těsných spojení. Tolerance ke komenzální mikroflóře a imunitní reakce na patogeny vyžaduje intaktní zachycení, rozpoznání a zpracování antigenu, jakož i přiměřenou imunitní odpověď. Porucha těchto procesů, zejména porucha mikrobiální translokace v důsledku zvýšené permeability, a selhání orální tolerance v důsledku nepřiměřené interakce mezi střevním epitelem a T-lymfocyty mohou vést k zánětu a poškození tkáně. Procesy spojené s adhezí rezidentní mikroflóry a probiotik na střevní epitel jsou zatím objasněny jen částečně. Adheze probiotik na střevní epitel se liší více podle druhu probiotika než podle živočišného druhu. Probiotika v experimentu působí příznivě na fyziologickou funkci střevní bariéry a jejich aplikace snižuje aktivitu zánětlivého procesu ve střevní sliznici včetně poklesu TNF-α a IFN-γ. Podobně Lactobacillus plantarum upravuje zvýšenou permeabilitu střevní bariéry vyvolanou E. coli, Bifidobacterium lactis významně snižuje riziko bakteriální translokace při experimentálním syndromu krátkého střeva. Translokace komenzální mikroflóry do mezenteriálních uzlin je prokázána a tento proces je rozhodující pro aktivaci střevního imunitního systému, což může příznivě ovlivnit celkový stimulační efekt takto se chovajících probiotik. Epiteliální adheze může naopak indukovat

51

specifičtější účinky. Při adhezi probiotik na M-buňky lze předpokládat především aktivaci odpovědi sekrečního IgA a naopak při afinitě ke kolocytům protizánětlivé účinky (1, 10, 104).

10.3 Přehled probiotických kmenů, klasifikace V literatuře jsou probiotika rozdělována do dvou skupin na základě jejich účinku (1). První skupina zahrnuje laktobacily, v terapii nejčastěji užívané mikroorganismy. Jde o heterogenní skupinu grampozitivních bakterií s přísně fermentativním metabolismem, konečným produktem je kyselina mléčná s protektivním antimikrobiálním účinkem. Heterogenita laktobacilů byla posílena genotypizací. Mezi tyto bakterie řadíme i bifidobakterie, méně často užívanými kmeny jsou enterokoky a streptokoky. Bifidobakterie jsou od laktobacilů geneticky vzdáleny, ale jsou také schopny produkovat kyselinu mléčnou, a proto jsou do této skupiny řazeny. Druhou skupinou probiotických mikroorganismů jsou kmeny, které obecně za bezpečné považovány nejsou. Potlačují však růst patogenních bakterií. Zahrnujeme mezi ně nepatogenní bakterii Escherichia coli, která je schopna snížit incidenci průjmu a alergie, navodit remisi u nespecifických střevních zánětů a zabránit kolonizaci střeva nedonošených novorozenců nozokomiálními kmeny. Clostridium butyricum je další bakterie, která byla označena jako potenciální probiotický kmen vzhledem ke schopnosti produkovat kyselinu butyrovou, což je mastná kyselina s krátkým řetězcem, která představuje důležitý zdroj energie pro kolocyty epiteliální buňky sliznice tlustého střeva (zajišťuje 60-70% potřebné energie) a má protizánětlivou aktivitu. Zdá se tak nadějnou bakterií při terapii nespecifických střevních zánětů a poantibiotických průjmů u dětí. Saccharomyces boulardii je nepatogenní kvasinka, která je také účinná v léčbě poantibiotických průjmů. Terapie antibiotiky je spojena s přerůstáním Clostridium difficile a rizikem vzniku vážné pseudomembranózní kolitidy. Právě Saccharomyces boulardii je schopna ovlivnit produkci specifických proteáz zmírňujících toxicitu klostridiového toxinu A (1, 104). Bifidobakterie zahrnují v současné době 38 druhů bakterií, z nichž však pouze 6 druhů patří mezi probiotika a to jsou B. bifidum, B. brevis, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. animalis. Bifidobakterie jsou grampozitivní anaerobní bakterie, produkují L-kyselinu mléčnou, která je v lidském střevě snadno metabolizována. Tato probiotika dokáží zmírnit infekční průjem (ochrana proti kolonizujícím bakteriím), stimulují imunitní systém a mohou chránit před kancerogenními působky. Navíc jsou bezpečné, neboť infekce způsobená bifidobakteriemi je extrémně vzácná, přestože jejich konzumace výrazně narůstá. Laktobacily jsou grampozitivní fakultativně anaerobní bakterie, které osídlují nejen 52

gastrointestinální, ale i genitální trakt. V současné době je známo více než 128 druhů laktobacilů, přesto pouze některé z nich je možné považovat za probiotické a prospěšné u střevních a mimostřevních onemocnění. Stejně jako u bifidobakterií, byly i u laktobacilů nežádoucí účinky popisovány jen velmi zřídka, otázkou je však užívání L. rhamnosus u imunokompromitovaných jedinců. Opatrnosti je třeba zejména u podávání obligátního L. bulgaricus produkující D-laktát novorozencům, kteří ještě nejsou schopni D-laktát metabolizovat a pro které tak může být tento druh potenciálně toxický (1). Roku 1985 Schleiffer a kolektiv popsali nepatogenní bakterie z rodu streptokoků (pouze pět kmenů), označované jako Lactococcus sp.. Laktokoky jsou grampozitivní, nesporulující a nepohyblivé bakterie, které tvoří dvojice a krátké řetízky. Tyto bakterie žijí na rostlinách, na kůži a srsti zvířat a jsou využívány při výrobě sýrů. Přestože nedávné studie popsaly kmen Lactococcus lactis jako jednoho z časných kolonizátorů střeva novorozence, o jejich roli ve střevě dospělých ještě mnoho známo není. Fermentativní procesy laktokoků vedou výhradně k produkci L-laktátu a dále jsou schopni syntetizovat vitamín K. Laktokoky mají schopnost produkovat tzv. baktericidní proteiny, zatím nejznámější je nisin, který je podrobně zkoumán již mnoho let. Je to baktericidní protein s grampozitivním spektrem působící proti potravním patogenům jako je Listeria monocytogenes (1). Bakterie Escherichia coli Nissle byla izolována ze stolice vojáka za 1. světové války, který narozdíl od ostatních vojáků netrpěl střevními obtížemi v tehdy velmi zamořené Dobrudži. Profesor Nissle tento kmen kultivoval roku 1917 a vyrobil kapsle, které obsahovaly výsev z 1-3 agarových ploten. Dnes jsou bakterie kultivovány ve fermentorech, lyofilizovány a je možno je uchovávat několik měsíců v chladném prostředí. Pro léčebné využití bakterií je nezbytně nutné, aby byly zcela bezpečné. Musí být tedy jasně definována identita zárodků, jejich typizace molekulárně-genetická, serologická, mikrobiologická a biochemická, musí být zaručena jejich čistota. Bakterie nesmí produkovat žádné enterotoxiny ani cytotoxiny, nesmí být enteroinvazivní ani uropatogenní, nesmí působit hemolýzu, obsahovat geny rezistence vůči antibiotikům nebo být sérorezistentní. Escherichia coli Nissle díky svému metabolismu vytváří ve střevě prostředí, ve kterém se mohou usídlit anaeroby. Typické koliformní bakterie se přednostně usazují na sliznici tlustého střeva, kde vytvářejí mikrobiální bariéru proti cizím kmenům, a svojí imunogenitou přispívají k “tréninku“ střevního imunitního systému. Svými metabolity také metabolicky podporují přísun energie do slizničních buněk kolon. Krátké mastné kyseliny vznikající mikrobiální činností podporují zpětnou resorpci vody, motilitu střeva a prokrvení střevní sliznice. Escherichia coli Nissle je schopna se uchytit na střevní sliznici pomocí fimbrií, exprimuje mikrociny a působí

53

antagonisticky na jiné mikroorganismy. Pohyblivost je umožněna bičíky. Princip léčby je založen na biologických zvláštnostech, životaschopnosti a velkém počtu podaných zárodků. Bakterie podporuje obranný systém a funkčnost střevní bariéry antagonistickým působením vůči patogenním zárodkům,

působí

imunomodulačně.

Umožňuje

regeneraci

a

ochranu

anaerobní

flóry

spotřebováváním kyslíku. Podporuje metabolismus kolocytů, fermentaci uhlohydrátů na esenciální mastné kyseliny s krátkým řetězcem (kyselina octová, propionová a máselná) nutné pro výživu kolocytů, snižují pH a ovlivňují střevní motilitu. Bakterie jsou také schopny produkovat vitamíny, zejména vitamín K (1, 10, 99, 100).

10.4 Prebiotika Prebiotika jsou nenatravitelné neživé součásti potravy, které selektivně stimulují růst a/nebo aktivitu jedné či několika bakterií v tlustém střevě. Současně mohou přímo i nepřímo inhibovat růst a metabolickou aktivitu nedominantní složky střevní mikroflóry. V konečném výsledku tak zlepšují proces trávení a z dlouhodobého hlediska mohou zlepšit zdravotní stav hostitele (12). Z hlediska vlastního mikrobiálního ekosystému to znamená především podporu růstu laktobacilů a bifidobakterií a potlačení růstu a aktivit bakteroidů, fusobakterií a klostridií. Chemicky

mezi

prebiotika

patří

oligosacharidy,

například

fruktooligosacharidy,

galaktooligosacharidy, maltooligosacharidy, a polysacharidy. Nejsou natravitelné enzymy lidského tenkého střeva a jsou fermentovány střevními bakteriemi. Jako tzv. tračníková potrava se stávají substráty mikrobiálních enzymů a významně se podílejí na výživě kolocytů (krátké mastné kyseliny, aminokyseliny, polyaminy, růstové faktory, vitamíny, antioxidancia). Prebiotické oligosacharidy a disacharidy modulují složení střevní mikroflóry ve prospěch fyziologických mikroorganismů. Kvantitativní i kvalitativní změnu ve struktuře mikroflóry kolon dokládají mimo jiné i studie Rowlanda a Tanaky, kdy po užití oligosacharidů se redukoval v kolon počet koliformních bakterií, přidáním fruktooligosacharidů se značně snížilo zastoupení bakteroidů, fusobakterií a klostridií. Počet tzv. bifidogenních kmenů, tedy bifidobakterií a laktobacilů však významně narostl. Jestliže dominujícím metabolickým pochodem v kolon je fermentativní přeměna cukrů vázaná na bifidogenní kmeny, je tedy užití prebiotika příkladem zdraví prospěšné manipulace s mikroflórou trávicího traktu. Konečným efektem je potlačení růstu škodlivých mikroorganismů a stimulace vlastní přirozené mikroflóry pozitivně ovlivňující nutriční stav a obranyschopnost organismu. Prebiotika jsou obsažena v zelenině a ovoci, např. v cibuli, chřestu, banánech, pórku, 54

fazolích, hrachu, čekance, artyčoku, ale mohou být přidávány i do uměle vyráběných potravin, nápojů, mléčných výrobků. Zdá se, že prebiotika mohou mít u člověka nežádoucí účinky ve smyslu větší flatulence, borborygmů, břišního dyskomfortu a nadýmání (1, 10, 12, 102, 103, 104). Základem prebiotik jsou přirozená potravinová prebiotika, především vláknina. Jako vlákninu označujeme složku potravy, která přichází do tračníku v nezměněné podobě, látky rostlinného původu, které nejsou rozkládány enzymy GIT. Jde o chemicky značně rozsáhlou skupinu látek. Obvykle rozlišujeme tzv. hrubou vlákninu – crude fiber (celulóza, hemicelulóza, lignin), kterou pak s pektiny a jinými druhy vlákniny označujeme jako vlákninu potravy – dietary fiber. Potravinové vláknině je přisuzován velký význam v korekci hyperlipidémií a prevenci kolorektálního karcinomu. Laktulóza - (4-O-beta-D-galaktopyranosyl-D-fruktóza) představuje osmoticky působící neresorbovatelný disacharid, který se v tenkém střevě prakticky nevstřebává, a v kolon je bakteriální flórou štěpena na nízkomolekulární látky kyselé povahy. Laktobacily a bifidobakterie hydrolyzují laktulózu velmi snadno, naopak ostatní bakterie (E.coli, B. fragilis) hydrolyzují laktulózu velmi pomalu. Během 12-24 hodin po podání laktulózy dochází ke stimulaci sekrece vody a elektrolytů a zvýšené propulzní aktivitě kolon až k osmoticky navozenému průjmu. Laktitol - (4-O-beta-D-galaktopyranosyl-D-glucitol) patří mezi osmoticky působící neresorbovatelné disacharidy. Inulin - polymer fruktooligosacharidů, přirozeně obsažen v zelenině (chřest, pórek, cibule, česnek), ve větším množství spolu s dalšími fruktooligosacharidy v artyčoku a čekance. Karubin – vláknina ze svatojánského chleba, chemicky galaktoman (poměr galaktózy k manóze 1:4), v malém množství obsahuje další komplex sacharidů, pentosany a celulózu. V pediatrické praxi je užíván k zahuštění žaludečního obsahu a zabránění ublinkávání, v potravinářství slouží jako barvivo a aditivum.

10.5 Synbiotika Synbiotika představují směsi probiotik a prebiotik, zlepšují přežívání živých mikrobiálních součástí potravin v gastrointestinálním traktu, stimulují růst bakterií nebo aktivaci jejich metabolismu, a jsou tak pro zdraví prospěšné. Přestože je stále počet studií se synbiotiky malý, jejich pozitivní účinek byl pozorován v terapii ulcerózní kolitidy, v léčbě minimální jaterní encefalopatie u cirhotiků, prevenci infekce při jaterní transplantaci, a dokonce ve zvířecím modelu se snížil výskyt rakoviny tlustého střeva (1, 10, 12, 104).

11. Experimentální část 55

Cílem naší práce bylo zjistit, zda je možné a přínosné u pacientů s jaterní cirhózou, kteří jsou častěji ohroženi infekčními komplikacemi, ovlivnit střevní bakteriální přerůstání a následnou bakteriální translokaci podáváním probiotického kmene Escherichia coli Nissle. Toto jsme se pokusili ověřit monitorací bakteriálního osídlení střeva při podávání probiotika,

sledováním hladiny endotoxinu jako markeru bakteriální translokace, testováním

minimální jaterní encefalopatie, hodnocením jaterních funkcí pomocí Child-Pugh skóre. Také jsme se pokusili monitorovat motilitu zažívacího traktu pomocí dynamické scintigrafie žaludku. Střevní propustnost jsme posuzovali pomocí testu s laktulózou a manitolem. Cílem studie bylo tedy ověřit příznivý vliv podávání probiotika E. coli Nissle v prevenci infekce nemocných s pokročilou jaterní dysfunkcí.

11.1 Soubor pacientů Do studie byli zařazeni v průběhu let 2002-2005 ambulantní nemocní s klinicky či biopticky diagnostikovanou jaterní cirhózou. Nemocní nesměli užívat antibiotika a laktulózu čtyři týdny před zahájením a v celém průběhu studie, vyloučeni byli pacienti s aparentní infekcí a s anamnézou krvácení do gastrointestinálního traktu v posledních šesti týdnech. Randomizace byla provedena metodou náhodných bloků. Obě skupiny jsou srovnatelné. Soubor nemocných zahrnuje celkem 39 pacientů, 24 mužů a 15 žen. Probiotikum bylo podáváno 22 cirhotikům, placebo 17 cirhotikům. Průměrný věk nemocných byl 53,2 let ve skupině léčené probiotikem, 51,4 let léčené placebem. Etiologie jaterní cirhózy byla většinou toxonutritivní, u 34 pacientů, 1 pacient trpěl chronickou virovou hepatitidou C, 2 pacienti měli histologicky verifikovanou primární biliární cirhózu, u 2 pacientů byla etiologie kryptogenní. V úvodu studie bylo 12 cirhotiků ve funkčním stadiu Child-Pugh A, 16 nemocných Child-Pugh B, 11 pacientů Child-Pugh C. Soubor nemocných je uveden v tabulce č. 5.

Tabulka č. 5. Soubor nemocných.

56

n

muži ženy

Etiologie Toxo VHC PBC

Probiotikum 22 Placebo

17

Child.Pugh skóre Nezn

A

B

C

Průměrný věk

14

8

19

1

1

1

7

9

6

53,2 (35-65)

10

7

15

0

1

1

5

7

5

51,4 (34-59)

Etiologie: Toxo – toxonutritivní, VHC – virová hepatitida C, PBC – primární biliární cirhóza, Nezn – nestanovena (kryptogenní)

11.2 Metodika První skupině nemocných bylo podáváno probiotikum obsahující živou lyofilizovanou bakterii Escherichia coli Nissle v množství 2,5 - 25 x 109 bakterií v jedné kapsli (Mutaflor, vyrobeno firmou Ardeypharma, Německo) a druhé skupině nemocných bylo podáváno placebo (sacharóza ve stejné tobolce, připraveno Ardeypharma, Německo). Kapsle byly podávány ráno nalačno, první čtyři dny jedna, od pátého dne dvě kapsle. Oběma skupinám byly preparáty podávány 2 x 6 týdnů, tedy celkem 84 dnů. Před podáním, ve 42. a 84. dnu bylo provedeno standardní klinické vyšetření pacienta, obvyklá hematologická a biochemická vyšetření krve (krevní obraz, protrombinový čas, urea, kreatinin, natrium, kalium, chloridy, celkový bilirubin, ALT, AST, GMT, ALP, glykémie, amoniak), ve spolupráci s Oddělením klinické mikrobiologie bylo provedeno bakteriologické vyšetření stolice (kultivace standardně za aerobních a anaerobních podmínek) a stanovena hladina endotoxinu v žilní krvi, dále proveden test spojování čísel (number connecting test - NCT), potvrzena přítomnost E.coli ve stolici pomocí PCR. Ve spolupráci s Klinikou nukleární medicíny bylo provedeno vyšetření evakuace žaludku a pasáž střevem značeným radionuklidem.

a) Kvantitativní mikrobiologické vyšetření stolice bylo prováděno standardně za aerobních a anaerobních podmínek po sterilním rozmíchání 0,5 g stolice ve 4,5 ml sterilního pufrovaného fyziologického roztoku se vznikem základního ředění 10 -1. Z tohoto ředění bylo odpipetováno 0,1 ml do 9,9 ml sterilního pufrovaného fyziologického roztoku a připraveno ředění 10-3, 10–5 a 10-7. Z těchto ředění byl vzorek kalibrovanou kličkou očkován na krevní agar, Endovu půdu, XLD agar a VL agar s amikacinovým diskem, a kultivován 24 hod při 37°C; kultivace VL agaru byla prodloužena na 48 hod při 37°C v anaerobním boxu. Poté byl spočítán počet kolonií na

57

jednotlivých půdách a identifikace byla prováděna podle růstových vlastností, morfologie kolonií a biochemických vlastností. K umožnění statistického zpracování byl bakteriologický nález hodnocen jako 1 při nálezu fyziologické střevní flóry včetně laktobacilů a bifidobakterií, které jsou ukazatelem příznivého střevního osídlení, jako 2 pokud byla přítomna střevní flóra s příznivým poměrem aerobních a anaerobních bakterií, avšak bez laktobacilů a bifidobakterií, jako 3 při nálezu potenciální patogenní mikroflóry (Citrobacter spp., Proteus spp., Morganella sp, Providencia sp., E.coli hemolytické). Nejzávažnější nález hodnocený jako 4 v případě nálezu obligátních střevních patogenů (Salmonella spp., Shigella spp.).

b) Střevní propustnost byla vyšetřována pomocí testu s laktulózou a manitolem (LAMA test laktulózo/manitolový test střevní propustnosti). Pro hodnocení střevní permeability lze použít celou řadu markerů (monosacharidy, disacharidy, polyethyleneglycol), resp. jejich kombinace. U nás je nejpoužívanější právě laktulózo/manitolový test, popsány jsou kombinace s cellobiózou, případně se sacharózou. Laktulóza je markerem paracelulární absorpce a např. při céliakii dochází k rozvolnění buněčných vazeb, rozšíření těsnézóny a zvýšení prostupu laktulózy. Manitol je markerem aktivního transportu přes buňku (enterocyt) a při céliakii je absorpce manitolu snížena redukcí aktivního povrchu při atrofii střevní sliznice. LA/MA testu střevní permeability lze využít také při monitorování postoperační chemoterapie (106). Laktulózo/mannitolový test lze kombinovat i s podáním D-xylózy. Perorálně je podán roztok 10g laktulózy, 2g manitolu, 2g D-xylózy a 11g glukózy ve 100 ml destilované vody, hyperosmolarita roztoku 1500 mosm/l zvyšuje senzitivitu testu. Pacient musí být nalačno (12 hodin, obvykle přes noc) a po vypití testovacího roztoku sbírá 5 hodin moč. Analýza jednotlivých cukrů je provedena technikou plynové chromatografie, vypočteny jsou relativní množství jednotlivých cukrů v poměru k podanému množství a konečné indexy permeability LA/MA a LA/XY. Průměrná hodnota LA/MA indexu je u kontrolní skupiny 0,016 ± 0,008, indexu LA/XY 0,013 ± 0,009. Některé další studie doporučují širší kombinace tří substrátů, např. s podáním sucralózy - stabilní během pasáže tlustým střevem, jiné studie doporučují kombinovaný test stanovení permeability laktázy. V našem souboru jsme vyšetřovali střevní propustnost pomocí testu s laktulózou a manitolem (LAMA test). Testovací roztok o objemu 100ml obsahoval 10g laktulózy, 2g manitolu, 2g D-xylózy a 11g 10% glukózy v destilované vodě s osmolalitou 1500 mosm/l. Nemocní vypili roztok po nočním lačnění, poté sbírali moč po dobu pěti hodin, kdy jim byl perorálně povolen jen

58

příjem čisté pramenité vody. Večer před testem vyloučili potraviny i tekutiny s obsahem cukru. Slepý vzorek moči byl ranní před testem, další vzorek moči byl odebrán z posbírané moči za dobu 5 hodin, která byla stabilizována 5% thiomersalem. Vzorky byly zamraženy na -20°C. Koncentrace cukru v moči byla následně stanovena na biochemickém pracovišti Fakultní nemocnice v Hradci Králové chromatografem Hewlett Packard 58090II a integrátorem Hewlett Packard 3396A. Při hodnocení bylo množství cukrů vyjádřeno jako procento požité látky a index střevní propustnosti jako poměr laktulóza/manitol.

c) Endotoxin byl stanoven pomocí Limulus testu - Limulus amébocytového lysátu (LAL). Amébocyty z hemolymfy ostrorepa amerického (Limulus polyphemus) vykazují po kontaktu s lipopolysacharidem stěny gramnegativních bakterií výrazný koagulační efekt. V přítomnosti endotoxinu jsou faktory obsažené v LAL aktivovány v proteolytické kaskádě, jejímž důsledkem je rozštěpení umělého bílkovinného substrátu, který je obsažen v LAL. Celá koagulace je zvýrazněna chromogenním barvivem. Kvantitativní průkaz endotoxinů gramnegativních bakterií je prováděn fotometrickým stanovením intenzity případné koagulace endotoxinu ve vyšetřovaném vzorku s amébocyty ostrorepa. Množství endotoxinu je pak stanoveno pomocí lineární regresní křivky a jeho koncentrace je uváděna přímo v jednotkách EU/ml vzorku.

Limulus test Pyrochrome Limulus amébocytový lyzát (LAL), obchodní název Pyrochrome, je vodný extrakt krevních buněk (amébocytů) ostrorepa Limulus polyphemus. V přítomnosti endotoxinu dojde k aktivaci faktorů přítomných v LAL a je zahájen kaskádovitý proteolytický proces, jehož výsledkem je štěpení bezbarvého substrátu (uměle vyrobený peptid) přítomného v LAL. Proteolytické štěpení substrátu uvolňuje p-nitroanilin (pNA), který je žlutý a absorbuje světlo s vlnovou délkou 405 nm. Test se provádí přidáním objemu Pyrochromu k objemu vzorku a inkubací reakční směsi při 37°C. Čím vyšší je koncentrace endotoxinu ve vzorku, tím rychleji je uvlňován pNA. Pyrochome se používá na kvantifikaci koncentrace endotoxinu dvěma způsoby: 1. U kinetické reakce je stanoven čas, kdy dojde k uvolňování pNA a zvýšení absorbance při 405 nm. Vyšší koncentrace dávají kratší prahový čas. Stanovení vyžaduje speciální pomůcky pro inkubaci mnohonásobných vzorků při kontrolované teplotě a pro odečítání optické denzity v pravidelných intervalech. Standardní křivky mohou být sestrojeny vynesením logaritmu prahového času proti logaritmu koncentrace standardu endotoxinu a

59

použijí se na výpočet koncentrace endotoxinu ve vzorcích. 2. Druhá varianta je metoda konečného bodu (endpoint), kdy je měřeno množství uvolněného pNA po fixní době inkubace. Standardní křivka sestávající ze změřené optické denzity vynesené proti známé koncentraci endotoxinu, se použije na zjištění koncentrace ve vzorcích. Citlivost chromogenní metody konečného bodu může být zvýšena použitím diazosloučenin. Při této metodě reaguje pNA vzniklý při chromogenní metodě konečného bodu s dusitany v prostředí HCl, a pak reaguje s N-(1-naftyl)-etylendiaminem (NEDA) za vzniku diazoderivátu, který má růžovofialovou barvu a absorbuje světlo vlnové délky 540550 nm. Pyrochrome LAL metody jsou rychlé, specifické, lehce proveditelné a vysoce citlivé. Detekční limit závisí na metodě a použitých zařízeních. Citlivost metod může být až 0,005 endotoxinových jednotek (EU) na ml (94, 95).

Biologický princip Limulus testu Howell popsal srážení krve druhu Limulus v roce 1885 (95). V roce 1950 Bang z Marine Biological Laboratory objevil, že srážení krve druhu Limulus způsobují gramnegativní bakterie. Levin a Bang později určili, že reakce je enzymatická a že enzymy jsou lokalizovány v amébocytech (97, 107). Dále zjistili, že srážení je iniciováno unikátní strukturální složkou bakteriální buněčné stěny, nazývanou endotoxin nebo lipopolysacharid (108). Běžný výklad je ten, že reakce sestává z kaskádové aktivace enzymů a je ukončena štěpením peptidu, koagulogenu. Nerozpustný produkt štěpení koagulogenu, koagulin, je spojen interakcemi iontů. Vytvoří-li se dostatek koagulinu, objevuje se zákal a následně dochází k tvorbě gelu. Tato interakce ja základem stanovení endotoxinů označovaného jako Limulus amébocyt lyzát (LAL) test. V roce 1977 objevili japonští vědci, že endotoxin zaktivovaný LAL může také štěpit malé chromogenní peptidy, které mají ve vazebném místě obdobné aminokyseliny jako koagulogen a chromofor paranitroanilid (109). Štěpení vede k uvolňování pNA, který je žlutý a absorbuje světlo při 405 nm. Pokud je přidán endotoxin ke chromogennímu LAL, vytvoří se zbarvení přednostně před tvorbou zákalu nebo gelu. U všech verzí stanovení LAL platí, že čím větší množství endotoxinu je přítomno ve vzorku, tím rychleji je dosaženo konečného bodu reakce a je pozorovatelný gel, zákal či barva.

d) funkční schopnost jater byla hodnocena standardně pomocí Child – Pughovy klasifikace, která pomocí bodů hodnotí jednak hladinu celkového bilirubinu, albuminu, protrombinového času,

60

jednak klinickou přítomnost encefalopatie a ascitu, viz tabulka č. 6. Tabulka č. 6. Child-Pugh skóre. Klinické a biochemické nálezy encefalopatie ascites bilirubin mmol/l albumin g/l protrombinový čas - INR (prodloužení o sekundy)

Skóre vyjádření v bodech:

Bodové hodnocení 1 není není < 34 < 35 < 1,6 (1 - 3)

2 1.-2. stupně malý 34-51 28-35 1,6-2,0 (4 - 6)

3 3.-4. stupně velký - refrakterní > 51 > 28 > 2,0 (> 6)

Child-Pugh A = 5 – 6 bodů Child-Pugh B = 7 – 9 bodů Child-Pugh C = 10 – 15 bodů

e) Minimální jaterní encefalopatii jsme testovali pomocí testu spojování čísel – number connection test (NCT). Při každé kontrole pacient řešil jinou variantu testu, byl měřen čas ke zhotovení NCT v sekundách. Existují 4 varianty testu, které jsou rovnocenné.

Obr. č. 6. NCT pacienta.

f) Přítomnost nepatogenní Escherichie coli Nissle 1917 (sérotyp O6:K5:H1) se dá díky kmenově

61

specifickým vlastnostem prokázat polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) ve stolici, což jsme si ověřili u pacientů, kterým jsme Mutaflor podávali. Stolice pacientů byla zamražena tekutým dusíkem a poté přítomnost E.coli Nissle potvrzena metodou PCR. Poznámka: Jako primer se používají sekvence DNA, které korespondují s fimbriemi typu 1 (fimA), popřípadě typem F1C (focA) nebo s oběma kryptickými plazmidy pMUT (Muta 5/6) a pMUT2 (Muta 7/8 a 9/10). V literatuře je uváděno, že v rámci ověřování metody bylo srovnáno 354 patogenních a nepatogenních kmenů E. coli různého původu a ukázalo se, že použití primeru založeného na plasmidech je nejvhodnější a vykazuje nejvyšší citlivost (110).

Tabulka č. 7. Hranice prokazatelnosti E.coli Nissle ve stolici.

Hranice prokazatelnosti E.coli Nissle 1917 ve stolici, CFU= colony forming unit (jednotka vytvářející kolonii) Muta 5/6 10 na 4 CFU/ml Muta 7/8 10 na 4 CFU/ml Muta 9/10 10 na 3 CFU/ml

V experimentu byl in vitro prokázán vliv E.coli Nissle na epiteliální genovou regulaci, což ukazuje na nové mechanismy účinku probiotika, které ovlivňuje rovnováhu mezi pro- a protizánětlivými cytokiny a posiluje bariérovou funkci střevního epitelu. E coli Nissle vedl ke zvýšené regulaci následných reakcí (111):


kapaB (budí translokaci NF-kapaB v jádrech buněk)




CLARP (prodlužuje životnost enterocytů)




IP3A (stimuluje chemotaxi makrofágů)




NFATC3 (ovlivňuje tvorbu cytokinů T buněk podle antigenní stimulace) a snížení genové exprese




MIF (reguluje aktivitu makrofágů)




GUCY-2C (blokuje receptory pro enterotoxiny)

g) Evakuace žaludku Vzhledem k tomu, že pacienti s jaterní cirhózou mívají řadu zažívacích potíží a na střevní dysmikrobii se může podílet i porucha motility střeva, vyšetřovali jsme skupinu zařazených pacientů také pomocí dynamické scintigrafie žaludku hodnotící rychlost evakuace žaludku. Vyšetření motorické funkce žaludku pomocí radionuklidů popsal poprvé Griffith roku 1966. 62

V současné době se nejčastěji k vyšetření používá strava značená 99mTc sirným koloidem (SC). SC se ze zažívacího traktu téměř nevstřebává, a tak je minimalizována radiační zátěž. Rovněž uvolňování Tc z vazby je malé, a proto nevede k signifikantnímu vychytávání v žaludeční sliznici a tím ke zkreslení výsledků. Vyšetření evakuace žaludku je jednoduché a přesné, v gastroenterologii často indikované a pro objektivní stanovení rychlosti vyprazdňování žaludku je nezbytné. Celá řada pacientů udává stejné pocity a potíže jak u zrychleného tak zpomaleného transportu stravy žaludkem. Nemůžeme se tedy řidit jen subjektivnímu potížemi nemocného. Vlastní vyšetření se provádělo vsedě, což odpovídá fyziologickým podmínkám při příjmu stravy, nalačno. Vyšetřovanému bylo podáno 200 gramů rýže nebo rizota značeného 30-40 MBq 99mTc SC. Dynamickou scintigrafií byla snímána oblast žaludku 60-90 minut, jednotlivé obrazy trvaly obvykle jednu minutu. Vyšetření bylo provedeno na gamakameře MB9200 firmy Gama müvek (Budapest, Hungary), dále byl potřebný paralelní kolimátor s vysokým rozlišením. Snímaná data byla uložena na IBM AT kompatibilním mikropočítači a zpracována programem DIAG AT firmy Mediso (Budapest, Hungary). Vyhodnocení rychlosti evakuace žaludku je jednoduché. Nejprve je generován sumační obraz několika prvních minut po podání stravy, v tomto obraze je ručně vykreslena oblast žaludku a pozadí. Po zakreslení se generuje křivka průběhu aktivity. Typická normální křivka evakuace žaludku začíná různě dlouhou fází, ve které žaludek strava neopouští (LAG fáze) a nebo jen velmi pomalu. Trávením a pohyby žaludku je strava rozmělňována až na částečky menší než 1mm. Tato fáze je závislá na řadě faktorů, trvá obvykle několik minut, může ale i chybět. V této době je strava v žaludku rozmělňována na menší částečky, promíchávána se žaludečním chymem a dochází k natrávení. Poté začíná vyprazdňování žaludku, které se projeví poklesem aktivity žaludku. Křivka poklesu aktivity mívá většinou exponenciální průběh. Vyhodnocena je obvykle hodnota T/2, což je doba nutná k poklesu aktivity nad žaludkem na polovinu. Nejjednodušší způsob zhodnocení je proložení exponenciální závislosti změřenou aktivitou a výpočet T/2. Tyto jednoduché operace matematické analýzy obsahuje přímo vyhodnocovací zařízení gamakamery. Přesné hodnoty jsou získány po korekci na poločas rozpadu. Normální hodnoty poločasu evakuace na použitém přístroji jsou 81,7 min, s.o. 20,0 min a LAG fáze 3,6 min, s.o. 4,4 min po podání radiofarmakem značené rýže nebo rizota. Tuto stravu lze dobře a homogenně označit radionuklidem a je vyšetřovanými výborně tolerována.

11.3 Výsledky

a) mikrobiologický nález ve stolici 63

K umožnění statistického zpracování byl bakteriologický nález hodnocen jako 1 při nálezu fyziologické střevní flóry včetně laktobacilů a bifidobakterií, které jsou ukazatelem příznivého střevního osídlení, jako 2 pokud byla přítomna střevní flóra s příznivým poměrem aerobních a anaerobních bakterií, avšak bez laktobacilů a bifidobakterií, jako 3 při nálezu potenciální patogenní mikroflóry (Citrobacter spp., Proteus spp., Morganella sp, Providencia sp., E.coli hemolytické). Nejzávažnější nález hodnocený jako 4 v případě nálezu obligátních střevních patogenů (Salmonella spp., Shigella spp.). Ve skupině léčené Escherichia coli Nissle došlo po šesti týdnech ke statisticky významnému zlepšení mikrobiologického nálezu ve stolici. Střevní dysmikrobie byla prokázána v úvodu u 22 nemocných. Při podávání Mutafloru došlo po šesti týdnech ke statisticky významnému snížení počtu potenciálních patogenů ve stolici (např. Citrobacter spp., Proteus spp., Morganella sp.), p < 0,001. U nemocných, u nichž ve vstupním vzorku nebyly přítomny laktobacily ani bifidobakterie, jsme tyto po léčbě prokázali, a u nemocných, u nichž ve vstupním vzorku byly laktobacily a bifidobakterie přítomny, jsme prokázali jejich významný nárůst. Obligatorní střevní patogeny jsme nenalezli u žádného pacienta. Zlepšení bakteriologického nálezu ve stolici vyšetřovaných cirhotiků přetrvávalo po dalších šesti. týdnech léčby, tedy i 84. den. Žádný obligátní patogen nebyl opět prokázán. Statistické hodnocení porovnání mikrobiologického nálezu ve stolici v úvodu studie a po šesti týdnech léčby probiotikem je uveden v tabulce č. 8. Grafické znázornění bakteriologického nálezu je uvedeno v grafu č. 1.

Tabulka č. 8. Mikrobiologický nález ve stolici v den 0 a 42

Mutaflor Placebo

n 22 17

Den 0 2,0 ± 0,7 2,2 ± 0,7 n.s.

Graf č. 1. Mikrobiologický nález ve stolici v den 0, 42 a 84.

64

Den 42 1,5 ± 0,6 2,3 ± 0,5 p < 0,001

10 9 8 7 6

1.

5

2.

4

3.

3

4.

2 1 0 den 0

den 42

den 84

1. fyziologická flóra včetně laktobacilů a bifidobakterií 2. střevní flóra s příznivým poměrem aerobních a anaerobních bakterií bez laktobacilů a bifidobakterií 3. potenciálně patogenní mikroflóra 4. obligátní střevní patogeny (blíže viz text)

b) střevní propustnost - LAMA test Při vyšetření střevní propustnosti LAMA testem (testem s laktulózou a manitolem) jsme nenalezli patologický nález před podáním preparátu ani změny v 6. a 12. týdnu sledování. Poměr laktulóza/manitol v jednotlivých dnech a rozdíly mezi úvodním nálezem a po šesti týdnech léčby a mezi šestým a dvanáctým týdnem léčby je uveden v tabulce č. 9.

Tabulka č. 9. LAMA test u nemocených léčených Mutaflorem

průměr s.o. Σ

den 0. 0,080 0,149

den 42. 0,056 0,089

den 84. 0,071 0,138

0-42 0,027 0,179 p = 0,156

42-84 0,016 0,056 p = 0,191

c) hladina endotoxinu Při stanovení endotoxémie (koncentrace endotoxinu je uváděna v mezinárodních jednotkách EU/ml vzorku, EU = endotoxin unit) jsme nalezli trend naznačující možnou statistickou významnost při

65

větším počtu nemocných. Hladina endotoxinu poklesla ve 42. dnu (p = 0,07), ale v 84. dnu se opět zvýšila k původním hodnotám. Výsledky v tabulce č. 10 a 11 a v grafu č. 1.

Tabulka č. 10. Hladina endotoxinu u nemocných léčených Mutaflorem. den 0. 0,014 0,021 0,007

endotoxin max. min.

den 42. 0,011 0,019 0,003

den 84. 0,015 0,024 0,006

Graf č. 2. Hladina endotoxinu ve skupině léčené Mutaflorem

Hladina endotoxinu

0,022

j/ml

0,017 0,012 0,007 0,002 den 0.

den 42. 0- 42 p=0,07

den 84. 0 - 84 ns

Tabulka č. 11. Statistické zhodnocení endotoxémie u pacientů léčených Mutaflorem

endotoxin

N (počet pacientů) Signifikance 0.- 42.den Signifikance 42.-84.den 22 p = 0,07 Nesignifikantní

d) CHILD-PUGH klasifikace Jaterní funkce byla hodnocena Child-Pughovou klasifikací. Po podání E. coli Nissle dochází ke snížení počtu bodů v Child-Pughově klasifikací, hodnoty však nejsou statisticky významné, jde

66

pouze o trend. Porovnání mezi dnem 0 a dnem 42 je p = 0,07, mezi dnem 42 a 84 je p = 0,06. Výsledky v tabulce č. 12, 13 a grafické znázornění v grafu č. 2.

Tabulka č. 12. Child-Pugh score u nemocných léčených Mutaflorem. den 0. 7,8 10,06 5,54

CHILD-PUGH score max. min.

den 42. 7,0 8,9 5,1

den 84. 6,9 9,0 4,8

Graf č. 3. Child Pughova klasifikace ve skupině léčené Mutaflorem

CHILD-PUGH klasifikace 11 10

body

9 8 7 6 5 4 den 0.

den 42.

0 - 42 p=0,07

den 84. 0 - 84 p=0,06

Tabulka č. 13. Statistické porovnání Child-Pugh score u pacientů léčených Mutaflorem

Child-Pugh score

N (počet pacientů) Signifikance 0.- 42.den Signifikance 42.-84.den 22 p = 0,07 p = 0,06

e) test spojování čísel (number connecting test), hodnocení minimální jaterní encefalopatie Při hodnocení testu spojování čísel jsme hodnotili jako patologický nález vyřešení testu za více než 50 sekund a zlepšení jen v případě rozdílu většího než 15% oproti původní hodnotě. Patologické hodnoty jsme nalezli jen u 14 nemocných léčených Mutaflorem, a přestože došlo ke zlepšení u 63% 67

nemocných, nebyl tento nález vzhledem k malému počtu a velké směrodatné odchylce statisticky významný. Výsledky v tabulce č. 14 a grafu č. 3. Tabulka č. 14. Test spojování čísel u nemocných léčených Mutaflorem. den 0. 76 101 51

NCT (s) Max. hodnota (s) Min. hodnota (s)

den 42. 72,1 102,6 41,6

den 84. 68,4 110,3 26,5

Graf č. 4. Test spojování čísel ve skupině léčené Mutaflorem

NCT 120 100 80 s 60 40 20 den 0.

den 42. 0 - 42 ns

den 84. 0 - 84 ns

f) stanovení přítomnosti E.coli Nissle ve stolici metodou PCR Bakterii E.coli Nissle se podařilo pomocí PCR prokázat u všech nemocných, kterým bylo verum – probiotikum podáváno, čímž bychom mohli potvrdit přežívání bakterií v zažívací traktu a mimojiné i spolupráci zařazených pacientů ve studii. 68

g) evakuace žaludku značeným radionuklidem Vyšetření evakuace žaludku bylo nemocným provedeno před zařazením do studie a následně po ukončení léčby. Průměrná hodnota poločasu evakuace žaludku byla 41,8 min (s.o. 26,95 min), LAG fáze 2,0 min (s.o. 4,08 min). Při statistickém hodnocení t-testem jsme prokázali signifikantní zrychlení evakuace žaludku u naší skupiny nemocných s jaterní cirhózou na 0,1% hladině významnosti. Hodnoty LAG byly statisticky shodné se skupinou zdravých. Užívání probiotik LAG fázi ani evakuaci žaludku signifikantně neovlivnilo. Na obrázku č. 6 a 7 je graficky znázorněna normální a velmi zrychlená evakuace žaludku. Na obrázcích č. 8 a 9 jsou znázorněny barevné obrázky z gamakamery, zapůjčeno od Doc. MUDr.Práška, CSc.

Obr. č. 6 Normální evakuace žaludku.

Obr. č. 7. Velmi zrychlená evakuace žaludku (T/2 = 18 minut).

Obr. č. 8. Normální evakuace žaludku

69

Obr. č. 9. Změny distribuce aktivity stravy v průběhu prvních 40 minut u normální rychlosti evakuace žaludku. Je vidět postupný přesun aktivity z antra distálně.

11.4 Statistické hodnocení

70

Výsledky byly statisticky zhodnoceny t-testem a dvouvýběrovým t-testem. Jako statisticky významné jsme hodnotili hladiny významnosti menší než 5%, hladinu významnosti mezi 5 a 10% jsme hodnotili jako trend, který by při větších počtech nemocných mohl být statisticky významný. Mimo rozdílu ve skupinách byly v léčené skupině hodnoceny rozdíly mezi dnem 0 a dnem 42 a dnem 42 a dnem 84. V kontrolní skupině pacientů, jímž bylo podáváno placebo, nedošlo k žádným statisticky významným změnám.

12. Diskuze U pacientů s jaterní cirhózou jsou infekční komplikace nejčastěji způsobeny gramnegativními bakteriálními kmeny, které pocházejí z trávicího traktu. U těchto nemocných bylo prokázáno bakteriální přerůstání ve střevě a následná zvýšená bakteriální translokace v důsledku 71

dysfunkce střevní slizniční bariéry, roli hraje také narušená motilita tenkého střeva. U zdravých osob je množství bakterií v tenkém střevě malé, což je ovlivněno působením žaludečních kyselin, žlučí a správnou motilitou střeva. Primární funkcí střevní slizniční bariéry je udržení integrity hostitele monitorováním střevního osídlení a zabráněním invaze patogenními bakteriemi či jejich toxiny. Střevní epiteliální buňky tvoří důležitou fyzikální bariéru mezi střevním lumen a hostitelským organismem a strukturální ochranu proti bakteriální translokaci. Epiteliální buňky využívají různé obranné systémy, např. hlen, těsná spojení (tight junctions) nebo defensiny (malé peptidy s vysokým obsahem cysteinu s vysokou antimikrobiální účinností). Přítomnost komenzální bakteriální mikroflóry je důležitá pro všechny tyto obranné systémy. Porušení normální mikrobiální rovnováhy (např. u jaterní cirhózy) vede k dysfunkci slizniční bariéry, vzestupu bakteriální translokace, a mimo střevo se tak dostávají potenciálně patogenní bakterie (112, 113, 114). Střevní

imunitní

systém

je

schopen

rozlišit

mezi

nebezpečnými

invazivními

mikroorganismy a neškodnými antigeny jako jsou např. proteiny obsažené v potravě. Primární imunologickou bariéru tvoří vrstva střevních epiteliálních buněk, které jsou schopny rozpoznat zachovalé mikrobiální struktury pomocí tzv. toll-like receptorů. Aktivací těchto receptorů iniciují lipopolysacharidy – endotoxiny (součástí stěny gramnegativních bakterií) nebo kyselina lipoteichoová (součást stěny grampozitivních bakterií) proces vyúsťující v zánětlivou a imunitní obrannou odpověď. Když bakterie poruší slizniční linii enterocytů, setkají se buňky vrozeného imunitního systému, např. makrofágy, a dendritické buňky, jejichž úkolem je monitorace střevního obsahu. Dlouhé výběžky dendritických buněk vyčnívají do střevního lumen, aniž by došlo k narušení pevného spojení mezi epiteliálními buňkami. Tyto dendrity vzorkují intraluminální bakterie a ostatní antigeny a předkládají je střevnímu imunitnímu systému – buňkám GALT. Tímto způsobem je udržována kontinuální komunikace mezi střevními bakteriemi a GALT. Určitá bakteriální translokace je fyziologická, avšak posun v rovnováze střevního osídlení vede k infekčním komplikacím, proto vyvážená gastrointestinální mikroflóra a intaktní strukturální a imunologická slizniční bariéra hrají nezbytnou roli v prevenci vzniku infekce (115, 116, 117). Z toho vyplývá, že prevence bakteriálního přerůstání, podpora slizničních bariér a modulace imunitní odpovědi jsou nezbytné pro prevenci časných i pozdních infekčních komplikací u těžce nemocných a imunokompromitovaných pacientů, mezi něž pacienti s jaterní cirhózou patří. K prevenci translokace patogenních bakterií ze střeva se v minulých desetiletích široce používala antibiotika. Podávala se s cílem redukovat v intraluminálním obsahu potenciálně patogenní bakterie, což mělo vést k redukci bakteriální translokace a sepse u těžce nemocných pacientů. Selektivní dekontaminace střevního traktu vykazovala dobré výsledky, ale záhy bylo

72

jasné, že tato léčba je drahá a navíc dochází k selekci multirezistentních bakteriálních kmenů. V posledních letech se dostává do popředí alternativní strategie, a sice podávání probiotik, živých mikroorganismů s potenciálním příznivým působením na svého příjemce, která ukazuje dobré výsledky v mnoha randomizovaných placebem kontrolovaných studiích. Výzkumy jsou zaměřeny na efekt probiotik na mikroflóru zodpovědnou za infekce, jejichž původci vycházejí z gastrointestinálního traktu. Probiotické kmeny jsou bezpečné, po enterálním podávání osídlí střevo, jsou zde schopny přežívat a mají široké zdraví prospěšné vlastnosti. Předpokládá se, že probiotika mají příznivý účinek na všechny tři mechanismy, které jsou spojeny s bakteriální translokací, tedy na střevní motilitu a přerůstání bakterií v tenkém střevě, strukturální slizniční bariérovou funkci a na imunitní systém. Doklady o zdraví prospěšném působení bakterií přijatých potravou se datují až do období vzniku Starého zákona. Mečnikov počátkem dvacátého století uveřejnil teorii antibiózy, tj. potlačování růstu a jiných životních projevů jednoho mikroorganismu jiným mikroorganismem. Prvním praktickým výstupem této teorie byl Flemingův objev penicilinu, který zahájil éru antibiotik. Mečnikov však spatřoval realizaci své teorie v mikrobiální interferenční terapii. Jejím principem je podávání živých mikroorganismů lidského původu s cílem využít jejich vlastností k úpravě střevní mikroflóry s následným zlepšením zdravotního stavu hostitele, prevencí a léčením některých chorob. Tato pozorování vedla ke vzniku pojmu probiotika odvozenému z řečtiny („pro bios“ = „pro život“). Podle Organizace spojených národů pro výživu a zemědělství (Food and Agriculture Organization – FAO) a Světové zdravotnické organizace jsou probiotika definována jako živé mikroorganismy převážně lidského původu, které, aplikovány v přiměřeném množství, ovlivňují příznivě zdravotní stav hostitele (1). Probiotika jsou v posledních deseti letech předmětem rostoucího zájmu humánní a veterinární medicíny, mikrobiologie, imunologie a molekulární genetiky, ale i farmaceutického a potravinářského průmyslu. Dokladem je růst publikací zabývajících se touto problematikou. Databáze MEDLINE registrovala v roce 1998 přes 100 citací, v roce 2003 více než 1 000 citací a v červenci 2007 překročil jejich počet 3 500. Jako probiotika se používají zejména kmeny laktobacilů a bifidobakterií, některé nepatogenní kmeny Escherichia coli a kvasinka Saccharomyces boulardii. Probiotika prokazují v různé míře vlastnosti, které jsou předpokladem jejich léčebného účinku. Patří k nim: kompetice s patogeny v adhezi na epitelie, tvorba bakteriostatických a baktericidních substancí, regulace funkcí střevní bariéry a mikrobiální translokace, modulace vrozené i získané imunity, regulace apoptózy, stimulace eliminace toxinů, tvorba steroidů z cholesterolu a ovlivnění střevních funkcí (vstřebávání, sekrece, motility a průtoku krve splanchnikem). Tyto vlastnosti jsou

73

doloženy experimenty in vitro a v modelových studiích chorob trávicího ústrojí (např. enterokolitid, kolorektálního karcinomu, jaterních chorob, akutní pankreatitidy, infekce H. pylori) i jiných afekcí (syndrom multiorgánové dysfunkce, alergická dermatitida). Klinické aplikace zahrnují idiopatické střevní záněty, různé infekční enterokolitidy, syndrom dráždivého střeva, symptomatickou nekomplikovanou divertikulární nemoc tračníku, jaterní choroby, akutní pankreatitidu, infekci H. pylori, intoleranci laktózy, ale také atopická onemocnění, kritické stavy a abdominální chirurgii, urogenitální choroby či stomatitidy. Probiotické preparáty mohou být jednosložkové (obsahují jeden bakteriální kmen) nebo vícesložkové (více kmenů). Žádný jednotlivý kmen nebo preparát není optimální pro všechny indikace. Jednotlivé probiotické kmeny se liší svým genomem a v závislosti na něm i svými účinky v různých indikacích. U vícesložkových preparátů může být charakter interakcí jednotlivých kmenů různý (aditivní, synergický, ale také kompetitivní). Proto jsou vícesložkové probiotické preparáty přijatelné pouze za předpokladu dostatečně detailní definice jednotlivých kmenů. Přibývající možnosti aplikace probiotik v různých klinických situacích s sebou přinášejí významné problémy v obchodní oblasti. V řadě zemí včetně České republiky je v současné době dostupná řada probiotických a prebiotických preparátů i jejich kombinací. Tím vzniká nepřehledná situace nejen pro pacienty, ale také pro lékaře a lékárníky. Naprostá většina těchto preparátů je u nás uváděna jako potravinové doplňky, což přináší výrobcům a dodavatelům značné finanční úspory spojené s registrací léčiv. Probiotika však nepochybně představují novou metodu biologické terapie se značnými perspektivními možnostmi. Je proto třeba, aby byla vytvořena kritéria pro probiotická léčiva (řádné označení, registrační dokumentace, dodržení podmínek dobré výrobní praxe, doložení terapeutické účinnosti stanoveným minimálním počtem kontrolovaných klinických studií). Tímto postupem se odliší léčiva od potravinových doplňků, což je nejen v zájmu poskytovatelů a konzumentů zdravotní péče, ale také předpokladem objektivizace a dalšího rozvoje probiotické terapie. V současné době dělíme probiotika do dvou skupin podle jejich možného patogenního působení. První skupinu tvoří pro probiotickou terapii nejvíce používané mikroorganismy – bakterie mléčného kvašení (lactic acid bakteria – LAB). Tato skupina obsahuje heterogenní směs grampozitivních bakterií se striktně fermentativním metabolismem vyúsťujícím hlavně v tvorbu kyseliny mléčné s ochranným antimikrobiálním efektem. Mezi nejvíce používané bakterie jako probiotické ze skupiny bakterií mléčného kvašení jsou rody Lactobacillus, Bifidobacterium a Lactococcus. Z různých důvodů, ostatní rody jako Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus a Propionibacterium jsou používány méně často. Druhá skupina probiotických mikroorganismů patří do rodů, které nejsou všeobecně uznávané za bezpečné, ale jejich použití je

74

založeno na principu „boje bakteriálních patogenů s jejich nepatogenními příbuznými“. Tyto probiotické bakterie jsou schopny redukovat výskyt průjmových onemocnění, alergií, udržovat remisi nespecifických střevních zánětlivých onemocnění a mohou předcházet kolonizaci nozokomiálními patogeny u předčasně narozených dětí (118). Patří mezi ně Escherichia coli, nově je za potenciálně probiotický kmen považováno i Clostridium butyricum pro jeho schopnost produkce kyseliny máselné, mastné kyseliny s krátkým řetězcem, která je důležitým zdrojem energie pro epiteliální buňky tlustého střeva, a předpokládá se, že má protizánětlivou aktivitu. Také kvasinky se mohou uplatnit jako probiotika. Saccharomyces boulardii je nepatogenní kvasinka, která pomáhá v léčbě postantibiotických průjmů (1, 118). Probiotika jsou schopna zeslabit produkci virulentních faktorů a následně pomoci množení prospěšných bakterií (119). Toto může být potenciálním mechanismem probiotik vedoucím k prevenci bakteriálních chorob. V naší studii jsme nemocným s jaterní cirhózou podávali probibotikum E. coli Nissle s cílem prokázat jeho potenciálně příznivý vliv zejména na bakteriologické osídlení střeva, hladinu endotoxinu jako markeru bakteriální translokace, na minimální jaterní encefalopatii a jaterní funkce. V porovnání s dosud provedenými publikovanými pracemi jsou naše výsledky srovnatelné, stejně tak parametry souboru našich nemocných jsou obdobné. Z literatury je známo, že bakteriální infekce je u nemocných s jaterní cirhózou přítomna poměrně často, až u 40% těchto pacientů. Nejde jen o nejčastěji se vyskytující močové infekce, ale zejména závažnou a nebezpečnou spontánní bakteriální peritonitidu u nemocných s ascitem. Bakteriální infekce ovlivňuje také primární hemostázu, a představuje tak jednu z možných příčin vzniku akutního varikózního krvácení. Proto důsledná profylaxe vzniku infekce a její eradikace se zdá být základem léčby pacientů s jaterní cirhózou a jednou z možných cest jak snížit mortalitu těchto nemocných. Nejčastějšími bakteriemi prokazatelnými u cirhotiků jsou gramnegativní bakterie, což podporuje hypotézu o bakteriální střevní translokaci na vzniku infekce u nemocných s portální hypertenzí. Infekce močového traktu se vyskytují u cirhotiků až ve 40%, infekčním agens bývá nejčastěji Escherichia coli. Dále často nacházíme potenciálního patogena ve stolici, cca ve 30%, obvykle prokazujeme enterobakterie, zejména opět Escherichia coli. V případě infekce ascitu (kolem 20%) prokážeme nejčastěji zlatého stafylokoka a E. coli. Poměrně vysoký výskyt grampozitivních bakterií v ascitu lze vysvětlit narůstajícími invazivními vyšetřeními (opakované punkce ascitu, zavádění permanentních žilních a močových katetrů) u těchto nemocných. Stejně tak nacházíme často bakterie z čeledi Enterobacteriacae, které se fyziologicky nacházejí ve střevě. Jsou potenciálními patogeny, což znamená, že jejich patogenní vliv se může projevit při

75

mimostřevní lokalizaci. Vzhledem k výše uvedenému (vysoká cena antibiotik, riziko selekce multirezistentních bakteriálních kmenů, plísňové superinfekce) se stávají probiotika novou možností léčby infekčních komplikací u nemocných s jaterní cirhózou, mohou nahradit antibiotika a potencovat účinek prebiotik, stejně tak v prevenci a léčbě jaterní encefalopatie. Byla publikována práce, v níž autoři u nemocných s jaterní cirhózou prokázali signifikantně významné bakteriální přerůstání E. coli a Staphylococcus spp. ve střevě pomocí modulace střevní mikroflóry synbiotiky (směsí čtyř druhů probiotik a vlákniny). Suplementace synbiotiky vedla po 30 dnech k signifikantnímu poklesu těchto bakterií ve stolici, jejichž množství odpovídalo nálezu u zdravých kontrol. Došlo ke snížení množství fusobakterií a naopak k nárůstu laktobacilů. Laktobacily se tak staly dominantními mikroorganismy při bakteriologickém vyšetření stolice. Dále byly popsány nesignifikantní změny v počtu bifidobakterií, pseudomonád, enterokoků. U skupiny nemocných, jimž byla podávána vláknina samotná, tedy prebiotikum, došlo také k signifikantnímu nárůstu bifidobakterií a naopak poklesu počtu E. coli a fusobakterií. Predominantními bakteriemi se staly bifidobakterie. K významnému poklesu počtu E. coli došlo již po 14 dnech užívání prebiotika, časově stejně došlo i k popsaným změnám ve střevním osídlení při užívání synbiotika. U kontrolní skupiny nebyly zaznamenány žádné signifikantní změny (24). Stejně tak v naší skupině cirhotiků, jimž bylo podáváno jednosložkové probiotikum obsahující živou lyofilizovanou E. coli Nissle, došlo ke statisticky významnému zlepšení mikrobiologického nálezu ve stolici. Po šesti týdnech užívání statisticky významně pokleslo množství potenciálních patogenů ve stolici (např. Citrobacter spp., Proteus spp., Morganella spp.), p < 0,001. U nemocných, u nichž ve vstupním vzorku nebyly přítomny žádoucí bakterie (laktobacily a bifidobakterie), jsme tyto po léčbě prokázali, a u nemocných, u nichž ve vstupním vzorku laktobacily a bifidobakterie přítomny byly, jsme prokázali jejich významný nárůst. Zlepšení mikrobiologického nálezu ve stolici vyšetřovaných cirhotiků přetrvávalo po dalších šesti. týdnech léčby probiotikem. Obnova „fyziologičtější“ mikroflóry podáním E. coli tudíž patrně umožní i snadnější osídlení střeva ostatními fyziologickými bakteriemi, které jsou přítomny ve stravě, ale jejichž osídlení je za patologické situace obtížné. Tento nález by mohl být důležitý při otázce, zda existuje rozdíl v účinku jednotlivých probiotických kmenů u různých chorob. Potvrdí-li se náš závěr, že podávání jednoho druhu může usnadnit osídlení i jiným fyziologickým druhem, nemusí hrát různý obsah bakterií v probioticích zásadní roli. Také čínští autoři popsali změny střevní mikroflóry po podání probiotika u pacientů s jaterní cirhózou. Zahrnuto bylo padesát cirhotiků, probiotikum bylo podáváno dva týdny, jedna skupina užívala vícesložkové probiotikum obsahující bifidobakterie, laktobacily a enterokoky, druhé

76

probiotikum obsahovalo kmen Bacillus subtilis a Enterococcus faecium. Nejzávažnější střevní dysmikrobie byla prokázána u nemocných Child-Pugh C, po podání probiotik došlo v obou skupinách k signifikantnímu nárůstu bifidobakterií. Dále hodnotili pH stolice, hladinu amoniaku a hladinu endotoxinu v periferní krvi, po probioticích došlo k.signifikantnímu poklesu pH stolice a amoniaku. Ve skupině léčené probiotikem obsahujícím Bacillus subtilis a Enterococcus faecium došlo také k poklesu hladiny endotoxinu (120). V léčené skupině cirhotiků jsme nalezli dva zajímavé trendy. Jednak došlo ke snížení hladiny endotoxinu, což svědčí pro příznivé ovlivnění bakteriální translokace, a ke zlepšení Childovy-Pughovy klasifikace. Zlepšení funkční schopnosti jater po probioticích bylo již v literatuře popsáno, ale přesné vysvětlení chybí. Lze však předpokládat, že obnova fyziologické mikroflóry v trávicím traktu sníží zátěž jater potenciálními vstřebanými toxickými metabolity a především endotoxinem. Endotoxémie je u nemocných s jaterní cirhózou častá a bylo prokázáno, že endotoxin stimuluje sekreci cytokinů. Cytokiny, jako např. TNF-α, IL-1 a IL-6, mohou ovlivnit tvorbu a degradaci extracelulární matrix, což je důležité při rozvoji jaterní fibrózy i cirhotické přestavby. Po probioticích bylo popsáno snížení hladiny jak endotoxinu, tak i cytokinů, především však u cirhóz etylické etiologie. Také v naší studii (s většinou nemocných toxonutritivní etiologie) jsme tento trend nalezli. V publikované již výše zmíněné práci byla po 30 dnech užívání jak synbiotika (směs čtyř druhů probiotik a vlákniny), tak prebiotika stanovena hladina endotoxinu, přičemž došlo ke statisticky významnému snížení hladiny endotoxinu v krvi, kdežto ve skupině s placebem tomu tak nebylo Dále byly hodnoceny jaterních funkce standardně Child-Pugh skórem. Opět ve skupině léčené synbiotiky a prebiotiky došlo k poklesu hladiny bilirubinu, ALT, vzestupu albuminu a snížení protrombinového času (24). V další práci - experimentu byl popsán pokles endotoxémie při léčbě mléčnými bakteriemi v experimentálním modelu alkoholového poškození jater krys (121). Zdá se, že laktobacily produkující oxid uhličitý a kyselinu mléčnou z cukrů jako je glukóza, mají největší přínos v terapii jaterní encefalopatie (1, 10). Důležitou roli v patogenezi jaterní encefalopatie hraje amoniak, který je jednak produkován střevními bakteriemi a jednak je přiváděn do organismu potravou. U cirhotiků byla prokázána zvýšená propustnost hematoencefalické bariéry pro amoniak a zrychlený metabolismus amoniaku v mozkové tkáni (6). Jestliže dochází k vysokému zatížení organismu aminokyselinami stravou bohatou na proteiny, může potom rozpad proteinů způsobit výrazný vzestup amoniaku v krvi a tkáních až do toxických koncentrací (54). Současná standardní terapie jaterní encefalopatie zahrnuje laktulózu a nevstřebatelná antibiotika jako je rifaximin. Cílem léčby jaterní encefalopatie je snížit produkci střevního amoniaku, což je

77

možné ovlivněním střevní mikroflóry a následným snížením produkce amoniaku střevními bakteriemi. Střevní mikroflóra může být ovlivněna antibiotiky, prebiotiky či probiotiky. Probiotika přirozeně potlačí růst bakterií produkujících amoniak, pomáhají štěpit nevstřebatelné cukry s tvorbou krátkých mastných řetězců a oxidu uhličitého, dochází k průjmu, a střevo se pak snadněji zbavuje mikroorganismů obsahujících ureázu a deaminázy, a ve střevě se tak sníží množství toxinů. Slovenští autoři publikovali roku 2004 práci, v níž sledovali zlepšení jaterní encefalopatie při léčbě probiotiky. V průběhu léčby prokázali zkrácení NCT, zlepšení mentálního stavu, ústup asterixe, snížení hladiny amoniaku v séru (82). Tato práce navazovala na studii italských autorů (Loguercio a spol.), kteří dokumentovali v souboru cirhotiků zlepšení jaterní encefalopatie (hodnocením NCT, hladinou amoniaku) při léčbě probiotiky. A tyto změny byly srovnatelné se skupinou léčenou laktulózou (122). V jiné práci hodnotili minimální jaterní encefalopatii také pomocí testu spojování čísel a evokovaných potenciálů. Po léčbě synbiotikem se zlepšila minimální jaterní encefalopatie u 50% cirhotiků, stejně tak ve skupině léčené prebiotikem, přičemž tyto výsledky nebyly ovlivněny věkem ani etiologií cirhózy (24). V našem souboru nemocných jsme také hodnotili minimání jaterní encefalopatii pomocí NCT, ke zlepšení došlo u 63% vyšetřovaných po léčbě probiotikem, výsledky však nebyly vzhledem k malému souboru statisticky významné. Translokace střevních bakterií do systémové cirkulace představuje důležitý faktor při rozvoji infekčních komplikací jaterní cirhózy. Snížená motilita střeva usnadňuje bakteriální přerůstání v zažívacím traktu. Zvýšený počet bakterií v GIT potencovaný zvýšenou střevní propustností způsobenou poklesem přirozené funkční bariéry sliznice střeva zvyšuje riziko bakteriální translokace. Spontánní bakteriální peritonitida představuje běžné, ale závažné onemocnění u pacientů s jaterní cirhózou a ascitem, a vzniká bez viditelného zdroje infekce. Důležitou roli v patogenezi hraje také právě bakteriální translokace a je zřejmé, že zdrojem těchto bakterií je střevo. Změny střevní motility společně se střevním přerůstáním a zvýšenou střevní propustností se při translokaci uplatňují. Při portální hypertenzi dochází v důsledku žilní a lymfatické kongesce k edému sliznice splanchnického řečiště a zvýšené propustnosti kapilár ve střevní stěně. Volné kyslíkové radikály vznikající při oxidativním stresu při splanchnické hypoperfuzi a narušených imunitních pochodech se mohou podílet na poškození střevní stěny, zvýšení střevní propustnosti a následné bakteriální translokaci ( 9, 10, 11). V našem souboru jsme hodnotili motilitu horní části zažívacího traktu pomocí značeného radionuklidu, vyšetřovali jsme evakuaci žaludku před zařazením do studie a následně po ukončení

78

léčby. Při statistickém hodnocení t-testem jsme prokázali signifikantní zrychlení evakuace žaludku u nemocných s jaterní cirhózou na 0,1% hladině významnosti. Průměrná hodnota poločasu evakuace žaludku byla 41,8 min. Hodnoty LAG byly statisticky shodné se skupinou zdravých (LAG fáze 2,0 min). Užívání probiotik však LAG fázi ani evakuaci žaludku signifikantně neovlivnilo. Střevní propustnost jsme testovali pomocí testu s laktulózou a manitolem, LAMA testu. Laktulóza je markerem paracelulární absorpce a např. při céliakii dochází k rozvolnění buněčných vazeb, rozšíření těsné-zóny a zvýšení prostupu laktulózy. Manitol je markerem aktivního transportu přes buňku (enterocyt) a při céliakii je absorpce manitolu snížena redukcí aktivního povrchu při atrofii střevní sliznice. LAMA testu střevní permeability lze využít také např. při monitorování postoperační chemoterapie (106). Analýza jednotlivých cukrů je provedena technikou plynové chromatografie, vypočteny jsou relativní množství jednotlivých cukrů v poměru k podanému množství a konečné indexy permeability LA/MA a LA/XY. V našem souboru jsme neprokázali patologický LAMA test ani při vstupním vyšetření a ani po léčbě probiotikem či placeba. Je možné, že tento test není nejvhodnější pro monitoraci střevní propustnosti u cirhotiků. Byla publikována práce, v níž byla prokázána zvýšená střevní propustnost u nemocných s jaterní cirhózou a byla prokazatelně vyšší u nemocných s komplikovanou jaterní cirhózou, s ascitem a jaterní encefalopatií. Střevní propustnost byla hodnocena stejně jako v naší práci LAMA testem, ve skupině bylo zahrnuto 79 cirhotiků (123). Španělští autoři publikovali práci, v niž dokumentovali zvýšenou bakteriální translokaci střevních mikroorganismů do mesenteriálních lymfatických uzlin u nemocných s jaterní cirhózou. Zahrnuto bylo celkem 101 cirhotiků před ortotopní transplantací jater nebo před resekcí jater pro hepatocelulární karcinom a 35 kontrol operovaných z jiného důvodu. U 79 cirhotiků bez selektivní střevní dekontaminace byla prevalence bakteriální translokace signifikantně zvýšena v souvislosti s tíží jaterního poškození hodnocené Child-Pugh skórem (Ch-P), 3,4% u Ch-P A, 8,1% u skupiny s Ch-P B a 30,8% u pacientů s Ch-P C, p < 0,05. Nicméně translokace bakterií rodu Enterobacteriacae, které patří mezi častá agens při SBP, byla zjištěna pouze ve 25% případů. Prevalence bakteriální translokace u cirhotiků Child-Pugh B a C, u nichž proběhla selektivní střevní dekontaminace před operací, byla 4,5%. Child-Pugh skóre bylo nezávislým prediktivním faktorem bakteriální translokace (p=0,02). U osob bez jaterního onemocnění byly střevní mikroorganismy z lymfatických uzlin vykultivovány pouze v 8,6% případů (124). V experimentu byla prevalence bakteriální translokace do mesenteriálních lymfatických uzlin prokázána u 40% cirhotických krys s ascitem a u 80% cirhotických krys se spontánní

79

bakteriální peritonitidou. U krys s jaterní cirhózou a ascitem přerůstaly bakterie z rodu Enterobacteriacae a translokovaly do mesenteriálních lymfatických uzlin. Kmeny izolované z mesenteriálních lymfatických uzlin těchto zvířat byly geneticky identické s kmeny působícími SBP (25, 36). V další práci publikované roku 2002 byla v experimentu na krysím modelu cirhózy prokázána prospěšnost kombinace probiotického kmene Lactobacillus johnsonni La1 a antioxidantů (vitamín C + glutamát) v prevenci bakteriální translokace. Došlo k poklesu endotoxémie a zlepšení kultivačního nálezu ve stolici cirhotických krys (121). V rámci naší práce jsme současně hodnotili přítomnost probiotické bakterie E. coli Nissle ve stolici pomocí PCR analýzy. Prokázali jsme přítomnost této bakterie u všech nemocných, kterým bylo probiotikum podáváno, což nám podává informaci nejen o compliance pacientů, ale také o přežívání bakterie v zažívacím traktu v průběhu léčby. Zajímavé by jistě bylo vyšetřování stolice po doužívání probiotika ke stanovení doby, po kterou je schopna bakterie ve střevě přežít a na jak dlouhou dobu je schopna zlepšit mikrobiologické osídlení střeva. Toto je však předmětem práce do budoucna. Probiotika se mohou uplatnit v léčbě jaterních onemocnění a jejich komplikací, zejména v léčbě jaterní encefalopatie, kde mohou nahradit antibiotika a potencovat účinek prebiotik, či v prevenci a léčbě infekčních komplikací, zejména spontánní bakteriální peritonitidy. Probiotika se uplatňují také v terapii nealkoholické steatohepatitidy potlačením prozánětlivých mediátorů, mohou snížit hladinu aminotransferáz a zlepšit jaterní histologický nález. V současné době probíhá řada klinických i experimentálních prací se snahou pomocí molekulárních metod osvětlit interakce mezi probiotiky a střevní flórou, objasnit principy střevní propustnosti, bakteriální translokace a infekčních komplikací při jaterním onemocnění a portální hypertenzi. Spektrum působení probiotik je široké a mechanismus působení je u různých probiotických kmenů podobný (125). V hepatologii by probiotika mohla být úspěšná především při léčbě či prevenci komplikací chronických jaterních onemocnění, především infekcí, spontánní bakteriální peritonitidy, a jaterní encefalopatie. U 50 – 70% těchto nemocných dochází v tenkém střevě k mikrobiálnímu přerůstání v důsledku kontaminace gramnegativní kolonickou mikroflórou. Důsledkem je porucha střevní bariéry, zvýšení bakteriální translokace se zvýšeným rizikem infekcí a systémovou endotoxémií, která má za následek nejen poškození jaterních funkcí, ale např. vzestupem portálního tlaku a zhoršením hemostázy se může podílet i na vzniku varikózního krvácení Doposud byla největší část výzkumu lidské endogenní mikroflóry zaměřena na patogenní složky. V poslední době však byla pozornost obrácena na původní nepatogenní mikroorganismy.

80

Vzniká tak nová a poměrně rychle se rozvíjející oblast medicíny, kdy jsou studovány synbiotické vztahy mezi hostitelem a mikroby. Probiotika se tak stávají moderním přístupem léčby nejen v gastroenterologii. Toto nesmírně zajímavé téma potřebuje však nadále další řádně vedené studie, neboť je evidentní, že střevo hraje zásadní roli v etiologii komplikací portální hypertenze. Je potřeba identifikovat molekulární mechanismy, které činí enterocyty vnímavé k poškození a vedou k bakteriální translokaci, a tak napomoci formulovat profylaktické a terapeutické postupy.

13. Závěr Ve skupině cirhotiků léčené probiotikem Escherichia coli Nissle došlo po šesti týdnech ke statisticky významnému zlepšení mikrobiologického nálezu ve stolici: snížení počtu potenciálních patogenů, nárůstu laktobacilů a bifidobakterií. Toto zlepšení přetrvávalo i po dalších šesti týdnech 81

léčby. Obligatorní bakterie nebyly nalezeny u žádného pacienta. Ve skupině léčené placebem nedošlo k žádným statisticky významným změnám. Při stanovení endotoxémie jsme nalezli trend naznačující možnou statistickou významnost při větším počtu nemocných. Hladina endotoxinu poklesla ve 42. dnu (p = 0,07), ale v 84. dnu se opět zvýšila k původním hodnotám. Při vyšetření střevní propustnosti LAMA testem (testem s laktulózou a manitolem) jsme nenalezli patologický nález před podáním preparátu ani změny v 6. a 12. týdnu sledování. Jaterní funkce byla hodnocena Child-Pughovou klasifikací. Po podání E. coli Nissle dochází ke snížení počtu bodů v Child-Pughově klasifikací, hodnoty však nejsou statisticky významné. Stejně tak nebyly statisticky významné hodnoty NCT - testu spojování čísel hodnotící minimální jaterní encefalopatii, přestože došlo procentuelně ke zlepšení u 63% nemocných. Vyšetřovaní pacienti s jaterní cirhózou měli signifikantně zrychlenou evakuaci žaludku (0,1% hladina významnosti). Užívání probiotik LAG fázi ani evakuaci žaludku signifikantně neovlivnilo. Probiotika se stávají důležitou součástí léčby nejen gastrointestinálních onemocnění. Z našich dosavadních zkušeností s podáváním probiotik u nemocných s jaterní cirhózou vyplývá, že probiotika mohou být u těchto imunokompromitovaných nemocných přínosná. Probiotický kmen Escherichia coli Nissle normalizuje střevní osídlení, omezí střevní bakteriální přerůstání a bakteriální translokaci, a tak její podávání může zabránit vzniku a snížit výskyt komplikací jaterní cirhózy, zejména jaterní encefalopatie, může snížit endotoxémii a tím zabránit vzniku život ohrožujících infekčních komplikací jako je spontánní bakteriální peritonitida, a mohou přispět ke zlepšení funkčních schopností jater. Bude však zapotřebí dalších řádně vedených randomizovaných studií ke stanovení vhodných probiotických kmenů, jedno čí vícesložkových, a jejich dávkovacích schémat a to nejen u jaterních onemocnění.

14. Závěry pro praxi
po šesti týdnech užívání probiotika Escherichia coli Nissle došlo ke statisticky významnému zlepšení mikrobiologického nálezu ve stolici: snížení počtu potenciálních patogenů, nárůstu

82

laktobacilů a bifidobakterií, toto zlepšení přetrvává i po dalších šesti týdnech léčby
při užívání probiotického kmene Escherichia coli Nissle došlo ke snížení hladiny endotoxinu jako markeru bakteriální translokace
pozorovali jsme určité zlepšení jaterních funkcí hodnocené Child-Pughovou klasifikací – výsledky však nedosáhly hladiny statistické významnosti
test střevní propustnosti - LAMA test - neprokázal zvýšenou střevní propustnost v hodnocené skupině cirhotiků
obecně byla u nemocných s jaterní cirhózou prokázána signifikantně zrychlená evakuace žaludku, užíváním probiotika nebyla ovlivněna
zlepšení minimální jaterní encefalopatie hodnocené testem spojování čísel při podávání probiotika nedosáhlo v naší skupině statistické významnosti
přítomnost bakterie ve střevě je možno prokázat pomocí PCR analýzy
probiotikum bylo u všech nemocných dobře snášeno a upravilo jejich zažívací potíže
nežádoucí účinky při užívání probiotického kmene E.coli Nissle jsme nepozorovali

15. Literatura 1. Timmerman HM. Multispecies probiotics – composition and functionality. 1st ed. Utrecht, PA: Multimedia (Esther Beekman) 2005: 10-21, 34, 108-114, 265, 290. 2. Fixa B, Komárková O. Mikroflóra trávicího ústrojí za fyziologických a některých

83

patologických podmínek. In: Aktuality v gastroenterologii. AZ servis Praha 1994: 57-82. 3. Hentges DJ. Does diet influence human fecal microflora composition? Nutr Rev 1980; 38: 323 4. Kong SS, Swenson RM. Developement of anaerobic fecal flora in healthy newborn infants. J Pediatr 1977; 91: 298-301 5. Hooper LV. Bacterial contribution to mammalian gut developement. Trends Microbiol 2004; 12 (3): 129-134 6. Hooper LV, Gordon JI. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science 2001; 292 (5519): 1115-1118. 7. Van der Waaij D, Berghuis-de Vries JM, Leekerkerk JE. Colonisation resistance of the digestive tract and the spread of bacteria to the lymphatic organs in mice. J Hyg 1972; 70 (2): 335-342 8. Miller MB, Bassler BL. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev Microbiol 2001; 55: 165199 9. Verhoef-Verhage EAE, van der Waaji D, Schaafsma G et al. In: Inside story: A guide to the intestinal microflora. Yakult Nederland B.V. 1996: 11-44 10. Frič P. Probiotika a prebiotika – renesance terapeutického principu. Postgraduální medicína 2005; 7 (5): 472-477, 588-591 11. Mc Ghee JR, Lamm ME, Strober W. Mucosal immune responses: an overview. In OGRA, PL. (Ed.), Mucosal Immunology. San Diego: Academic Press 1999: 485-506 12. Zbořil V et al. Mikroflóra trávicího traktu - klinické souvislosti. Praha: Grada Publishing a.s. 2005: 23-34, 55-56, 105, 106 13. Ingledew WJ, Poole RK. The respiratory chains of Escherichia coli, Microbiol Rev 1984; 48: 222-271 14. Van der Waaij D. The ecology of the human intestine and its consequences for overgrowth by pathogens such as Clostridium difficile. Ann Rev Microbiol 1980; 43: 69-87 15. Hoverstad T. Studies of short chain fatty acids absorption in man. Scand J Gastroenterol 1986; 21: 257-260 16. Roediger WEW. Role of anaerobic bacteria in the metabolic welfare of the colonic mucosa in man. Gut 1980; 21: 793-798 17. Kvietys PR, Grander DN. Effect of volatile fatty acids on blood flow and oxygen uptake by the dog colon. Gastroenterology 1981; 80: 962-969 18. Binder HJ, Mehta P. Short-chain fatty acids stimulate active sodium and chloride absorption in vitro in the rat distal colon. Gastroenterology 1989; 96: 989-996

84

19. James SP, Kiyono H. Gastrointestinal lamina propria T-cells. In OGRA, PL. (Ed.), Mucosal Immunology. San Diego: Academic Press 1999: 381-396 20. Fasano A. Regulation of intercellular tight junctions by zonula occludens toxin and its eucaryotic analogue zonulin. Ann N Y Acad Sci, 2000, 915: 214-222 21. Zbořil V. Zánětlivá onemocnění střevní stěny. Sanguis 2000; 6: 22-27 22. Zbořil V. Fyziologie mikroflóry trávicího traktu. Vnitř Lék 2002; 48: 300-303 23. Hanson LA. Yolken RH. In: Probiotics, other nutritional factors and intestinal microflora. Philadelphia: Lippincot-Raven 1999: 18-67 24. Ramachandran A, Balasubramanian K. Intestinal dysfunction in liver cirrhosis. Its role in spontaneous bacterial peritonitis. J Gastroenterol Hepatol 2001; 16: 607-612 25. Guarner C, Runyon BR, Young S et al. Intestinal bacterial overgrowth and bacterial translocation in cirrhotic rats with ascites. J Hepatology 1997; 26: 1372-1378 26. Ersöz G, Aydin A, Erdem S et al. Intestinal permeability in liver cirrhosis. Europian J Gastroent Hepatol 1999; 11: 409-412 27. Goulis J, Patch D, Burrougs AK. Bacterial infection in the patogenesis of variceal bleeding. Lancet 1999; 353: 139 28. Schöffel U. Translocation-physiologic mechanics or clinical problem? Dig Surg 1997; 14: 221 29. Hubaczová M. Bakteriální translokace u akutní pankreatitidy. Bulletin HPB 2000; 8: 1 30. Mao Y, Nobaek S, Adawi D et al. Comparison of the effects of different strains of Lactobacillus in reducing bacterial translocation in methotrexate-induced enterocolitis in rats. Dig Surg 1997; 14: 284-291 31. Özcelik MF, Pekmeczi S, Altinli E et al. Lactulose to prevent bacterial translocation in biliary obstruction. Dig Surg 1997; 14: 267-271 32. Strauss EJ, Falkow S. Microbial pathogenesis: genomics and beyond. Science 1997; 22 (76): 707-712 33. Finley BB, Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited, Microbiolo. Mol. Biol Rew 1997; 61: 136-169 34. Kenn B, De Vinney R, Stein M et al. Enteropathogenic E.coli (EPEC) transfers its receptor intimate adherence into a mammalian cells. Cell 1997; 91: 511-520 35. Fasano A. Toxins and the gut: a role in human disease. Gut 2002; 50 (Suppl III): 1114-1119 36. Llovet MJ, Bartoli M, March F et al. Translocated intestinal bacteria cause spontaneous bacterial peritonitis in cirrhotic rats: molecular epidemiologic evidence. J Hepatol 1998; 28: 307-313

85

37. Wyke RJ. Problems of bacterial infection in patients with liver disease. Gut 1987; 28: 623641 38. Hoefs JC, Canawati HN, Sapico FL et al. Spontaneous bacterial peritonitis. Hepatology 1982; 2: 399-407 39. Runyon BA, Squier S, Borzio M. Translocation of gut bacteria in rats with cirrhosis to mesenteric lymph nodes partially explains the pathogenesis of spontaneous bacterial peritonitis. J Hepatol 1994; 21: 792-796 40. Rimola A, Garcia-Tsao G, Navasa M et al. Diagnosis, treatment and prophylaxis of spontaneous bacterial peritonitis: A consensus document. J Hepatol 2000; 32: 142-153 41. Jayaraj K, Di Bisceglie AM, Gibson S. Spontaneous bacterial peritonitis caused by infection with Listeria monocytogenes: A case report and review of the literature. Am J Gastroenterol 1998; 93: 1556-1558 42. Al-Balder AA, Mathew TC, Abul H et al. Bacterial translocation in thioacetamide induced liver cirrhosis in rats. J.R.Coll Surg Edinb 1998; 43: 278-282 43. Konturek JW, Domschke W. Nitric oxide in regulation of gastrointestinal and biliary motility. Z Gastroenterol 1994; 32: 460-464 44. Alexander JW, Boyce ST, Babcock GF et al. The process of microbial translocation. Ann Surg 1990; 212: 496-510 45. Brodanová M, Kordač V. Klinická hepatologie. Praha: Grada Avicenum 1993: 552. 46. Sherlocková S, Dooley J. Nemoci jater a žlučových cest. Hradec Králové: grafické a reklamní studio Olga Čermáková 2004, 11. vydání: 326, 365-377, 417 47. Ehrmann J jr, Schneidera P, Ehrmann J. Alkohol a játra. Praha: Grada publishing 2006: 168. 48. Ehrmann J a kol. Ikterus – diferenciální diagnostika. Praha: Grada Publishing a.s. 2003: 276. 49. Horák J., Stříteský J. Chronické hepatitidy, Grada Publishing, 1999, Praha, 1. vydání, 173 50. Lata J, Vaňásek T et al. Kritické stavy v hepatologii. Praha: Grada Publishing 2005: 92, 168 51. Lochs H, Plauth M. Liver cirrhosis: rational and modalities for nutritional support – the European Society of Parenteral and Enteral Nutrition consensus and beyond. Curr Opin in. Nutr Metabol Care 1999; 2: 345 52. Brůha R, Drastich P, Erman J et al. Léčba ascitu při jaterní cirhóze. Doporučený postup České hepatologické společnosti. Dostupné na http://www.ceska-hepatologie.cz 53. Guidelines České hepatologické společnosti. Léčba hepatorenálního syndromu. Dostupné na http://www.ceska-hepatologie.cz 54. Lata J et al. Portální hypertenze při jaterní cirhóze a její důsledky. Plzeň: GAAN CZ 5/2000: 9-15, 41-56, 69-76, 77-78,

86

55. Brodanová M, Kordač V. Klinická hepatologie. Praha: Grada Avicenum 1993, 1. vydání: 552 56. Campillo B. Nosocomial spontaneous bacterial peritonitis and bacteremia in cirrhotic patients. Clin. Infect. Dis. 2002; 35: 1-10 57. Deschenes M, Villeneuve JP. Risk factors for the development of bacterial infections in hospitalized patients with cirrhosis. Am J Gastroenterol 1999; 94: 2193-2197. 58. Bleichner G, Boulanger R, Sguara P et al. Frequency of inf. ections in cirrhotic patients presenting with acute gastrointestinal hemorrhage. Br J Surg 1986; 73: 724–726. 59. Navasa M, Rimola A, Rodes J et al. Bacterial infections in liver disease. Seminars in Liver Disease 1997; 17: 323 – 333 60. Kienslichová E. Sepse u nemocných s jaterním selháním. Bulletin HPB 2002; 10: 2-3, 63-66 61. Goulis J, Patch D, Burroughs AK. Bacterial infection in the pathogenesis of variceal bleeding. Lancet 1999; 353: 139-42 62. Guarner C, Soriano G. Spontaneous bacterial peritonitis. Seminars in Liver Disease 1997; 17: 203-217 63. Arroyo V, Navasa M, Rimola A. Spontaneous bacterial peritonitis in liver cirrhosis: treatment and prophylaxis. Infection 1994; 22 (3): 167-175 64. Thulstrup AM. Population–based study of the risk and short-term prognosis for bacteremia in patients with liver cirrhosis. Clin Infect Dis 2000; 31: 1357-1361 65. Bernard B, Grande JD, Khac EN et al. Antibiotic profylaxis for the prevention of bacterial infection in cirrhotic patients with gastrointestinal bleeding: a meta-analysis. Hepatology 1999; 29: 1655-1661. 66. Fernández J, Navasa M, Gómez J et al. Bacterial infections in cirrhosis: Epidemiological changes with invasive procedures and norfloxacin profylaxis. Hepatology 2002; 35: 140148 67. Soares–Weiser K, Brezis M, Tur–Kaspa R. et al. Antibiotic prophylaxis reduces mortality and bacterial infection in cirrhosis and gastrointestinal bleeding, commentary. APC Journal Club 2002; 137: 94 68. Navasa M, Fermández J, Rodés J. Prophylaxis of spontaneous bacterial peritonitis. The problem of spontaneous bacterial peritonitis by quinolone-resistant bacteria. In: Arroyo V, Bosch J, Bruix J et al. Therapy in Hepatology. Barcelona, Ars Medica 2001: 65-71 69. Guldberg V., Deibert P, Ochs A et al. Prevention of infections complications after transjugular intrahepatic portosystemic shunt in cirrhotic patients with single dose of ceftriaxone. Hepato-Gastroenterology 1999; 46: 1126 – 1130

87

70. Sabat M, Kolle I, Ortiz J et al. Parenteral antibiotic prophylaxis of bacterial infections does improve cost-efficacy of oral norfloxacin in cirrhotic patients with gastrointestinal bleeding. Am J Gastroenterol 1998; 93: 2457 – 2462 71. Spanisch group of the study of bacterial infections in cirrhosis. Norfloxacin versus ofloxacin in the prophylaxis of infection in cirrhotic patients with gastrointestinal hemorrhage. J Hepatol 1998; 28 (1): 80 72. Soriano G, Guarner C, Tomas A et al. Norfloxacin prevents bacterial infections in cirrhotic with gastrointestinal hemorrhage. Gastroenterology 1992; 103: 1267–1272 73. Blaise M, Paterton D, Trinchet JCP et al. Systemic antibiotic therapy prevents bacterial infections in cirrhotic patients with gastrointestinal hemorrhage. Hepatology 1994; 20: 34– 38 74. Pauwels A, Mostefa–Kara N, Debenes A et al. Antimicrobial prophylaxis after gastrointestinal hemorrhage for cirrhotic patients with a high risk of infection. Hepatology 1996; 24: 802–806 75. Hsieh WJ, Lin HC, Hwang SJ et al. The effect of ciprofloxacin in the prevention of bacterial infection in patients with cirrhosis after upper gastrointestinal bleeding. Am J Gastroenterol 1998; 93: 962–966 76. Soares–Weiser K, Brezis M, Tur – Kaspa R et al. Antibiotic prophylaxis for cirrhotic patients with gastrointestinal bleeding. The Cochrane Library 2005; 4: 46 77. Ronaldo N, Gimson A, Philpott–Howard J et al. Infections sequelae after endoscopic sclerotherapy of oesophageal varices: role of antibiotic prophylaxis. Journal of Hepatol 1993; 18: 290–294 78. Selby WS, Norton ID, Pokorny CS et al. Bacteriemia and bacterascites after endoscopic sclerotherapy for bleeding esophageal varices and prevention by intravenous cefotaxime: A randomized trial. Gastrointestinal endoscopy 1994; 40: 680–684 79. Husová L, Lata J, Šenkyřík M et al. Přítomnost bakteriální infekce u pacientů s akutním krvácením v důsledku portální hypertenze – naše zkušenosti. Vnitř lék 2003; 49, 4: 258-262 80. Soares–Weiser K, Paul M, Brezis M et al. Antibiotic treatment for spontaneous bacterial peritonitis. BMJ 2002; 324: 100-102 81. Liu Q, Duan ZP, Ha DK et al. Synbiotic modulation of gut flora: effect on minimal hepatic encefalopathy in patients with cirrhosis. Hepatology 2004; 5: 1441-1449 82. Boča M, Vyskočil M, Mikulecký M a spol. Komplexná liečba chronickej hepatálnej encefalopatie doplnená probiotikom. Čas lék čes 2004; 143: 324-328 83. Guidelines České hepatologické společnosti. Diagnostika a léčba jaterní encefalopatie.

88

Dostupné na http://www.ceska-hepatologie.cz/editor/genhtml.pl?loc=hepatologie&table= jaterni. 84. Ballongue J, Schumann C, Quignon P. Effects of lactulose and lactitol on colonic microflora and enzymatic activity. Scan J Gastroenterol 1997; 32: 222: 41-44 85. Uribe-Esquivel M, Moran S, Poo JL et al. In vitro and in vivo lactose and lactulose effects on colonic fermentation and portal-systemic encephalopathy parameters. Scan J Gastroenterol 1997; 32: 222: 49-52 86. Conn HO, Levy CM, Vlahcevic ZR et al. Comparisonof lactulose and neomycin in the treatment of chronic portal-systemic encefalopathy: a double blind controlled trial. Gastroenterology 1997; 72: 573-583 87. Horsmans Y, Sollbreux PM, Daenens C et al. Lactulose improves psychometric testing in cirrhotics patients with subclinical encephalopathy. Alim Pharm Ther 1997; 11 (1): 165-170 88. Festi D, Maazzella G. Rifaximin in the treatment of chronic hepatic nencefalopathy: results of a multicentric study of efficacy and safety. Cur Ther Res 1993; 54 (5): 598-609 89. Williams R, James OFW. Evaluation of the efficacy and safety of rifaximin in the treatment of hepatic encefalopath: a double blind, randomised dose-finding multicentre study, Gastroenterol Hepatol 2000; 12: 203-208 90. Panichi G. Probiotics in human health. Colonisation of the gastrointestinal tract, nutritive and therapeutic aspects. In: Corazziari E. Chronic gastrointestinal disorders. Messaggi, s.r.l. Milano 1999: 473-491 91. Přecechtěl F. a kol. Lékařská mikrobiologie. Brno: Vydavatelství MU 1995: 27-35 92. Hynie S. Farmakologie v kostce. Praha: Triton 1999: 355-360 93. Krčméry V. Manuál antimikrobiálnej chemoterapie. Osveta 1993: 214-216, 273-281 94. Endotoxin – lipopolysacharidový komplex. Dostupné na http://www.zuova.cz/informace/ nrlpab09.php 95. Howell WH. Observations upon chemical composition and coagulation of the blood of Limulus polyphemus, Callinectes hastatus and Cucumaria sp. Johns Hopkins University Circular 43: 4-5 96. Bang FB. The toxic effect of a marine bacterium on Limulus and the formation of blood clots. Biol Bull. Woods Hole, MA 1995: 105: 361-362 97. Levin J, Bang FB. A description of cellular coagulation in the Limulus. Bull.Johns Hopkins Hosp. 1965; 115: 337-345. 98. Short C. Living it up for dinner. Chemistry and industry 1998; 4: 300-303 99. Frič P. Probiotika v terapii chorob trávicího ústrojí. Interní medicína pro praxi 2005; 10:

89

434-436 100. Metchnikoff E. Prolongation of life. New York: Putnam 1908 101. Döderlein A. Das Scheidensekret und seine Bedeutung für das Puerperalfieber. (The vaginal transsudate and its significance for childbed fever) Centralblatt für Bacteriologie 1892; 11: 699–700 102. Supplement: Functional significance of the bowel microflora in gastrointestinal health: proceeding of a roundtable discussion. Am J Gastroenterol 2000; 95 (1) 103. Frič P. Probiotika v gastroenterologii. Aktuální přehled. Čes a slov Gastroent a Hepatol 2001; 55: 237-241 104. Fedorak RN, Madsen KL. Probiotics and prebiotics in gastrointestinal disorders. Current opinion in gastroenterology 2004; 20: 146-155 105. Pelech T., Frič P., Fixa B et al. Srovnání Mutafloru a mesalazinu v udržovací léčbě inaktivní idiopatické proktokolitidy. Prakt lék 1998; 78: 556-558 106. Laktulózo/mannitolový test střevní propustnosti. Dostupné na http://www1.lf1.cuni.cz/ ~kocna/glab/gl_lakto2.htm 107. Levin J, Bang FB. Clottable protein in Limulus: its location and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thormb. Diath. Haemorrh. 1968; 19: 186-197 108. Levin J, Bang FB. The role of endotoxin in the intracellular coagulation of Limulus blood. Bull.Johns Hopkins Hosp.1964; 115: 265-274 109. Nakamura S, Morita T, Iwanaga S et al. A sensitive substrate for the clotting enzyme in horseshoe crab hemocytes. J Biochem 1977; 81: 1567-1569 110. Blum-Oehler G, Oswald S, Eiteljörge K et al. Specific detection of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 in fecal samples. Gastroenterology 2003; 124(Suppl): 478 111. Herman TA, Cichon Ch, Enders C et al. Characterization of the cellular responses of polarized T84 epithelial cells induced by the probiotic E.coli strain Nissle 1917 using DNA microarrays. Gastroenterology 2003; 124 (Suppl): 479 112. Berg R, Garlington A. Translocation of certain indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric lymph nodes and other organs in a gnotobiotic mouse model. Infect Immun 1979; 23: 403-411 113. Guarner F, Malagelada J. Gut flora in health and disease. Lancet 2003; 361: 512-519 114. Hooper L, Gordon J. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science 2001; 292: 1115-1118. 115. Mowat A, Thomas J, MacKenzie S et al. Divergent effect of bacterial lipopolysaccharide

90

on imunnity to orally administered protein and particulate antigens in mice. Immunology 1986; 58: 677-83 116. Macpherson A, Uhr T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science 2004; 303:1662-1665 117. Sansonetti P. War and peace at mucosal surfaces. Nat Rev Immunol 2004; 4: 955-964 118. Schultz M, Strauch U, Linde H et al. Preventive effects of Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute and chronic intestinal inflammation in two different murine models of colitis. Clin Diagn Lab Immunol 2004; 11(2): 372-8). 119. Reid G, Howars J, Gan B: Can bacterial interference prevent infection? Trends Microbiol 2001; 9(9):424-8 120. Zhao HY, Wang HJ, Lu Z et al. Intestinal microflora in patients with liver cirrhosis. Chin J Dig Dis 2004; 5(2): 64-67 121. Nanji AA, Khettry U, Sadrzadeh SMH. Lactobacillus feeding reduces endotoxemia and severety of experimental alcoholic liver (disease). Proc Soc Exp Biol Med 1994; 205: 243247 122. Loguercio C, Abbiati R, Rinaldo M et al. Long term effects of Enterococcus faecium SF68 versus lactulose in the treatment of patients with cirrhosis and grade 1-2 hepatic encefalopathy. J Hepatology 1995; 23: 39-46 123. Pascual S, Such J, Esteban A et al. Intestinal permeability is increased in patients with advanced cirrhosis. Hepato-gastroenterology 2003; 50: 1482-486 124. Cirera I, Bauer TM, Navasa M et al. Bacterial translocation of enteric organisms in patients with cirrhosis. J Hepatology 2001; 34: 32-37 125. Isolauri E, Rautava S, Kalliomaki M et al. Role of probiotics in food hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2002; 3: 263-271

91