Setkání uživatelů Průtokové cytometrie Beckman Coulter v Mikulově, 8.-10.5.2016
Proč a jak analyzovat minimální reziduální nemoc (MRN) u mnohočetného myelomu Říhová L, Všianská P, Bezděková R Oddělení klinické hematologie, FN Brno, Brno Babákova myelomová skupina, UPF, LF MU, Brno
Mnohočetný myelom 2. nejčastější hematologická malignita přítomnost klonu plazmocytů (PC) v kostní dřeni (KD) produkujících monoklonální Ig (MIG) kombinace nových léčiv s autologní transplantací periferních kmenových buněk ▫ zásadní prodloužení přežívání pacientů ▫ nízce rizikoví pacienti chronické on. ▫ dřeňový relaps je stále častý kratší trvání remise Hajek 2013, Pour 2014
Proč stanovovat MRN u MM I. Detekce minimální reziduální nemoci (MRN) - standardní procedura u potenciálně vyléčitelných hematologických malignit (ALL)
Mnohočetný myelom (MM) - nevyléčitelné onemocnění, relaps navzdory dosažení CR
Pokroky v léčbě MM - nová léčiva a léčebné strategie zvýšily počet dosažených remisí Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015
Proč stanovovat MRN u MM II. Citlivý přístup pro porovnání efektivity rozdílných léčebných strategií Individualizované monitorování léčby s cílem zabránění pře- či nedo-léčenosti Biomarker nezbytný pro včasnou a spolehlivou předpověď přežívání pacientů, který může urychlit uvolnění nových léčiv na trh (OS, PFS) Paiva 2015; Brando 2015; Munshi and Anderson 2013; Oldaker 2015
Vývoj definice CR u MM Historicky - snížení MIG až o 75% (menšina pac.) Nepřítomnost měkkotkáňového plasmocytomu, < 5% PC, negativní imunofixace v moči a séru (až 30% pac.) ▫
Přísná (stringent) CR = CR + normalizace sFLC + absence fenotypově aberantních PC
pacienti v CR (jejíž kvalita se velmi liší) přesto relabují, tedy výše uvedené parametry neodrážejí klinický význam MRN
Munshi and Anderson 2013
Dosažení CR Nedávné studie s novými léčivy (s/bez ASCT) vysoký počet CR u pac. starších 65 let, vysoce rizikových a relabujících/refrakterních MM
Dosažení nejhlubší remise je předpokladem k prodloužení OS a k vyléčení ▫
10% suboptimálních odpovědí (blízká CR, VGPR) je bez relapsu 10 let (MGUS-like základní profil)
▫
12% neudržitelných CR (přetrvávající FC-MRD + vysoce-rizikový cytogenetický základní profil) Paiva 2012 and 2015a, b; Barlogie 2014
Celkový počet nádorových buněk
Hloubka léčebné odpovědi A. MGUS-like pacienti B. neudržitelná vs. udržitelná CR
C. kontrolovaná hladina detekovatelné MRN
MRN
D. pozdní relaps při nedetekovatelné MRN nedetek. MRN
E. dlouhodobá kontrola nemoci při nedetekovatelné MRN
operační léčba
stanovení dg konec léčby
doba do progrese onemocnění (TTP) Paiva 2015
Citlivost MRN Počet nádorových buněk 10%
Rezistence (Morfologie…)
0.01% 0.001% 0.0001%
10-1 10-2
1% 0.1%
Detekční limit
Kompletní remise (FISH) Imunologická CR (MFC) Molekulární CR (PCR)
Terapie
10-3 10-4 10-5 10-6
Techniky dostupné pro MRN MFC (≥8colours)
ASO-PCR
NGS
PET/CT
aplikovatelnost
~100%
60-70%
~90%
~100%
reprodukovatelnost
vysoká
vysoká
?
střední
dostupnost
vysoká
střední
omezená
střední
diag. vzorek
není nezbytný
nezbytný
nezbytný
není nezbytný
doba analýzy
2-3h
≥5dní
≥7dní
2h
cena analýzy
~350 USD
~500 USD
~700 USD
~2000 USD
citlivost
10-5-10-6
10-5-10-6
10-6
vysoká
standardizace
Euroflow
EuroMRD
?
ne Paiva 2015
Vývoj FC-MRN Standardní multiparametrová FC (MFC) ▫
<1 MM PC mezi 104 PC v 3x105 buněk, 3x4 znaky
Imunophenotypová odpověď (iCR = sCR+) ▫
absence myelomových PC mezi 2x106 dřeňových buněk analyzovaných MFC (≥4 znaky = 3x4)
Pokročilá MFC (kvantifikace MRN) ▫
Log deplece (<0.01% MRN), 5x105 buněk, 6 znaků
Euroflow přístup - 2x8 znaky, Infinicyt SW Next Generation Flow - 2 Euroflow zkumavky spoj. Paiva 2008, 2011; Rawstron 2015
Vysoce citlivá FC-MRD
Pro potřebnou přesnost je vyžadován mnohabarevný přístup (≥ 8 barev) a pro potřebnou citlivost je požadován vysoký počet analyzovaných bb (106)
Kvantitativní analýza MRD se senzitivitou 10-5 je více informativní než stanovení CR poz/neg a zlepšuje předpověď chování on. u pacientů s MM
Vnitřní QC k odhadu kvality vzorku, interní kontroly pro hodnoty cut-off Brando 2015; Arroz 2015; Rawstron 2015
Kvalita FC-MRN u MM Kvalita FC-MRD testování je vztažena a dramaticky ovlivněna mnoha důležitými faktory: množství a kvalita vzorku KD proces zpracování (barvení) použitá kombinace reagencií proces získání vlastních dat vč. počtu analyzovaných buněk
standardizace/harmonizace nezbytná! Stetler-Stevenson 2011
Kvalita vzorku pro MRN Nevhodný/nereprezentativní vzorek KD: převaha kontaminace periferní krví ▫
přítomnost bazofilů, plazmablastů
▫
chybění HSC vč. B progenitorů, žírných buněk…
starý vzorek (48 hodin od odběru) viditelné sraženiny
Arroz 2015; Brando 2015
Detekční/kvantifikační limity celkový počet analyzovaných leukocytů počet událostí neoplastických buněk nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné detekci populace neoplastických PC: 25 events = LOD nejnižší počet událostí nezbytný k opakovatelné kvantifikaci populace neoplastických PC: 50 events = LOQ Arroz 2015
LOD, LOQ a senzitivita Leukocyty
% LOD
% LOQ
Senzitivity
50.000
0,05
0,1
10-3
100.000
0,025
0,05
10-4
500.000
0,005
0,01
10-4
1.000.000
0,0025
0,005
10-5
2.500.000
0,001
0,002
10-5
5.000.000
0,0005
0,001
10-5
PC fenotyp Normální
Neoplastické
CD56 CD19 CD28 CD27 CD117 CD45 CD20 CD81 CD33… CD44… 0.3 ≤ cκ κ/λ ratio ≤ 3 0.3 ≥ cκ κ/λ ratio ≥ 3 CD38 (+++ vs. ++) CD138
Detekce PC
3.303.193 událostí ve 140ul plné KD 2.300.219 leukocytů (70% events) 9.155 PC (0,4%)
Detekce PC
vs. 50.000 událostí vs. 35.000 leukocytů vs. 200 PC
Negativní MRN
10.000.000 událostí ve 320 ul plné KD 7.141.637 leukocytů (74 %) a 27.850 PC (0,39 %) aPCs = 0; senzitivita: 6,97x10-6
Pozitivní MRN
1.443.600 událostí v 500 ul plné KD 1.352.988 leukocytů (74 %) a 4.914 PC (0,36 %) a-PCs = 40; % a-PC = 2,96x10exp-5 = 0,00296 %; senzitivita: 3,68x10-5 = 0,0037 %
Euroflow Standardizace 8-barevná FC - Euroflow MoAb kombinace ▫
Euroflow nestavení
▫
min. 3x106 leukocytů a 500 PC
▫
detekce aberrantního fenotypu PC + analýza klonality - v kalkulovaných datech
horší identifikace PC, proto proběhla výměna fluorochromů a znaků zejména pro detekci MRN - 2. generace panelu Euroflow
Vývoj panelu pro FC-MRN PB
PO
FITC
PE
PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7
CD45 CD138 CD38 CD28
CD27
CD19
CD117
CD81
CD45 CD138 CD38 CD56
β2m
CD19
cIgκ κ
cIgλ λ
BV421 BV510 FITC
PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-C750
CD138 CD27 CD38 CD56
CD45
CD19
CD117
CD81
CD138 CD27 CD38 CD56
CD45
CD19
cIgκ κ
cIgλ λ
BV421 BV510 BV605 FITC PE PCP-Cy5.5 PC7 APC APCA700 APCC750 CD138 CD27 CD117 CD38 CD56 CD45
CD19 cIgλ λ cIgκ κ
CD81 Flores-Montero 2015
Problémy v detekci MRN léčba MoAb anti-CD38 (Daratumumab) ▫
obsazení vazebných epitopů CD38 terapeutickou MoAb - nedostupné pro vizualizační MoAb
využití multiepitopové CD38 v kombinaci s cyCD38 využití CD229 - slabá denzita exprese
Problémy v detekci MRN
„Problémy“ s FC-MRN vysoká finanční nákladnost ▫
nutno používat vyšší objemy MoAb - pracuje se s 10x106 buněk (nestačí titrace na 1x106 bb)
časová náročnost ▫
vlastní příprava vzorku - předlyzační krok (bulk lysis) + intracelulární analýza
▫
analýza vzorku na cytometru - 20-30 min sběr
▫
vyhodnocení vzorku - „hledání“ klonu PC
Závěr Polychromatická FC je validním nástrojem pro kvantifikaci MRN, standardizace zatím v procesu příprav Senzitivita - při analýze dostatečného počtu bb vzrostla na 10-6 a je srovnatelná s molekulárními přístupy Kvantifikace MRN by měla být využita jako nový biomarker umožňující predikovat přežívání pacientů
Poděkování
Prof. MUDr. Roman Hájek, CSc. FC Lab, OKH, FN Brno a LF MU, Brno BMG, ÚPF, LF MU, Brno IHOK, FN Brno a LF MU, Brno
Děkuji za pozornost!
