Průkaz viru influenzy u vakcinovaných koní v ČR v roce 2008 Doc. MVDr. Petr Lány, Ph.D., Mgr. Kateřina Rosenbergová, Ph.D., Mgr. Vojtěch Baláž* Ústav infekčních chorob a mikrobiologie, FVL, VFU Brno, *Ústav biologie a chorob volně žijících zvířat, FVHE, VFU Brno Palackého 1-3, 612 42,
[email protected] Souhrn V roce 2008 došlo k onemocnění vakcinovaných anglických plnokrevníků. Z 27 výtěrů vyšetřených RT nested PCR bylo 14 pozitivních na přítomnost virů influenzy. Kultivací na kuřecích embryích se podařilo izolovat dva kmeny A/Eq/Brno/1/08 a A/Eq/Brno/2/08. U viru A/Eq/Brno/1/08 byl sekvenován segment RNA pro hemaglutinin. Pro porovnání byly také sekvenovány stejné segmenty RNA vakcinačních kmenů A/Eq/Brno/M2/95 (evropská větev) a A/Eq/Brno/97 (americká větev). Fylogenetická analýza přiřadila terénní kmen do sublinie Florida 2 americké větve virů influenzy koní H3N8. Porovnáním dedukovaných aminokyselin mezi terénním kmenem a vakcinačními kmeny americké větve virů influenzy koní byly nalezeny dvě rozdílné aminokyseliny v antigenním místě B a jedna rozdílná aminokyselina v místě C. Tyto rozdíly byly pravděpodobnou příčinou, proč protektivní efekt vakcíny s novějším kmenem z roku 1997 nebyl dostačující k zabránění vzniku ohniska nákazy. Z těchto nálezů vyplývá doporučení na rozšíření ochranných opatření z pouhé vakcinace ještě na důsledně dodržovanou izolaci koní navracejících se z hromadných akcí před jejich zařazením mezi ostatní koně. Úvod Influenza koní je akutní hromadné infekční onemocnění koní virového původu, postihující horní cesty dýchací. Původce, virus influenzy koní H7N7 (dříve subtyp 1), byl poprvé izolován v roce 1956 v bývalém Československu. Od roku 1978 již nebyl v chovech koní zjištěn. V roce 1963 byl izolován v Miami (USA) jiný virus influenzy koní (dříve subtyp 2), dnes označovaný jako H3N8. Tento virus způsobuje malé či velké epizootie v chovech koní na celém světě až doposud. Infekce se mezi zvířaty šíří hlavně kašlem – infekčními kapénkami, možná i aerosolem, ale také i přímým kontaktem zvířat nebo nepřímo pasivním vektorem – např. člověkem nebo dopravní prostředky. Největší množství viru je vylučováno hlavně na začátku klinických příznaků. K profylaxi influenzy koní se používá vakcinace. Do nedávné doby byly v Evropě registrovány pouze inaktivované vakcíny. Viry influenzy koní H3N8 nejsou příliš antigenní a po vakcinaci je nutno provést nejméně ještě jednu revakcinaci. Interval revakcinací se řídí doporučením výrobce vakcín (za 6 až 12 měsíců). I přes používání vakcín probíhají v chovech koní vlny vzplanutí nákazy v různých časových intervalech. Rizikovými se ukazují chovy nebo období s velkým pohybem koní, například hřebčíny v připouštěcím období, nebo velké sportovní či dostihové soutěže. Jaké jsou možné příčiny selhání ochranného efektu vakcinace? Vzplanutí nákazy může mít různé důvody. Například, že po použití aktuálních vakcín již došlo k poklesu hladin protilátek na úroveň, která už nechrání, nebo používané vakcíny obsahují starší neaktuální kmeny, které již nechrání proti novým terénním kmenům.
Influenzové viry mají schopnost drobných antigenních změn povrchových proteinů hemaglutininou a neuraminidázy, tento jev je nazýván antigenní drift. Jeho principem je záměna nukleotidů v řetězci RNA s navazující změnou aminokyselin v důležitých antigenních místech. U hemaglutininu je jich popisováno pět a jsou značena písmeny A-E1 . První antigenní drift s následnou epizootii i u vakcinovaných koní byl zaznamenán na přelomu 70. a 80. let v západní Evropě. V rozmezí let 1987 až 1988 se virus rozštěpil na dvě antigenně odlišné větve – euroasijskou a americkou. V euroasijské větvi došlo k dalším významným antigenním driftům v roce 1989 a 19952 . Americká větev se rozdělila na kentuckou a floridskou linii, která se v roce 2003 dále rozdělila na sublinie Florida 1 a Florida 23 . Viry americké větve nejsou omezeny pouze na americký kontinent, ale vyskytují se i Asii, Austrálii či Evropě4 . K omezení vzniku epizootii influenzy koní má Světová organizace pro zdraví zvířat (OIE) skupinu odborníků, kteří na základě výsledků referenčních laboratoří OIE dávají doporučení výrobcům vakcín na zástupce virů do vakcín. Tato komise doporučovala v roce 2008, aby každá vakcína obsahovala obě geograficky odlišné větve virů H3N8 a to pro euroasijskou větev viry podobné viru A/Eq/Newmarket/2/93 a pro americkou větev viry podobné viru A/Eq/Newmarket/1/935 . V lednu roku 2008 bylo v tréninkovém středisku anglických plnokrevníků na území ČR diagnostikováno ohnisko influenzy koní. Vzhledem k tomu, že koně byli řádně vakcinování v šestiměsíčních intervalech registrovanými vakcínami, zaměřili jsme se v naší práci na možnost driftové změny nového kmene influenzového viru. Materiál a metodika Materiál Postiženi byli angličtí plnokrevníci vakcinovaní 2x ročně. Praktická veterinární lékařka odebrala do virologických transportních medií 27 výtěrů z nozder koní s příznaky horečnatého respiračního onemocnění. Vzorky byly doručeny do laboratoře ještě týž den. Médium z každého výtěru bylo rozděleno na dvě části a do dalšího vyšetření byly uloženy do -80ºC. První část sloužila k izolaci RNA a druhá část ke kultivaci na kuřecích embryích. Detekce viru pomocí RT-nested PCR Přítomnost viru influenzy rodu A ve vzorcích byla provedena pomocí metody RT - nested PCR založené na detekci sekvence genu pro matrix protein viru influenzy rodu A. Kultivace viru Vzorky s pozitivním výsledkem v RT-nested PCR byly kultivovány v alantoidních vacích 9 denních kuřecích embryí6 . Sekvenované viry Izolovaný kmen A/Eq/Brno/08 Vakcinační kmen evropské větve A/Eq/Brno/M2/95
Vakcinační kmen americké větve A/Eq/Brno/97 Sekvenace virů influenzy koní Ze vzorků virů byla izolována RNA pomocí komerční soupravy RNeasy Mini Kit (Quiagen) dle návodu od výrobce. Pomocí RT-PCR byla amplifikována sekvence hemaglutininu H3 (segment 4) virů influenzy koní (oblast 7 - 1277 dle sekvence č. AF197241). Sekvenace byla provedena metodou kapilární elektroforézy s laserovým detektorem a automatickým genetickým analyzérem "CEQ™ 8000 Genetic Analyzer" (Beckman Coulter) na Ústavu biologie a chorob volně žijících zvířat, Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Ze získaných sekvenačních dat byla pomocí programu AlignX (Vector NTI Suite 5,5, INFORMAX) provedena fylogenetická analýza úseků jednotlivých segmentů viru influenzy jejich srovnáním se sekvencemi z genové banky NCBI (GenBank). Výsledky Z 27 výtěrů vyšetřených RT nested PCR bylo 14 pozitivních. Z nich se podařilo vykultivovat 2 kmeny, které jsme označili A/eq/Brno/1/08 a A/eq/Brno/2/08. Výsledky dedukovaných sekvencí aminokyselin hemaglutininu sekvenovaných virů jsme porovnali se sekvencemi virů z dostupných databází, včetně vakcinačních kmenů (obr. 1). Nově izolovaný virus A/eq/Brno/1/08 byl zařazen do sublinie Florida 2 americké větve virů influenzy koní H3N8. Vakcinační kmen A/Eq/Brno/M2/95 byl zařazen mezi starší evropské kmeny a vakcinační kmen A/Eq/Brno/97 byl zařazen mezi starší americké kmeny. Porovnáním nového kmene s vakcinačními kmeny americké větve byly zjištěny rozdíly ve dvou aminokyselinách v antigenním místě B a v jedné aminokyselině v antigenním místě C (tabulka č.1). Nový kmen se ještě lišil od vakcinačních kmenů dalšími šesti aminokyselinami, které však nebyly v antigenně důležitých místech. Diskuse Vakcíny používané u našich postižených anglických plnokrevníků obsahovaly zástupce virů influenzy koní jak evropské, tak americké větve, dle doporučení OIE z roku 2008. Přes to byl z námi vyšetřovaných koní izolován virus influenzy koní H3N8. Podobné viry byly izolovány u našich sousedů v Polsku v roce 2005, kdy to byly viry euroasijské větve a v roce 2006, kdy se jednalo o viry americké větve sublinie Florida 2 7 . Pro přesnou typizaci našeho izolátu jsme provedli sekvenaci jeho segmentu RNA kódujícího hemaglutinin a porovnali pořadí nukleotidů s dostupnými sekvencemi ostatních virů influenzy koní H3N8. Fylogenetická analýza přiřadila náš izolát k virům americké větve, sublinie Florida 2. Viry této sublinie se v Evropě objevily poprvé ve Velké Británii, kde byly v roce 2003 příčinou onemocnění anglických plnokrevníků imunizovaných vakcínou, která jako zástupce americké větve obsahovala virus A/Eq/Newmarket/1/93 8 . Z Velké Británie tato sublinie rozšířila i na evropský kontinent a v současné době je dominantním původce ohnisek influenzy koní v Evropě 3 . Neúčinost vakcín, obsahujících jako zástupce americké větve virus A/Eq/Newmarket/1/93 byla potvrzena již ve Velké Británii8 , ale nedostatečně protektivní efekt měla i vakcína obsahující novější kmen americké linie A/Eq/Brno/97. Přesto, že se vakcinační viry z roku
1993 a 1997 lišily dvěmi aminokyselinami, ani jedna z těchto změn nebyla v důležitých antigenních lokalizacích A – E. To je možný důvod, proč protektivní efekt vakcíny s novějším kmenem nebyl dostačující k zabránění vzniku ohniska nákazy. Ukazuje se tedy, že i když se u našich dostihových koní používají vakcíny, které obsahují oproti ostatním vakcínám novější kmeny, nemusí ani taková vakcinace stačit k zamezení vzplanutí nákazy nově driftovaným kmenem, jako tomu bylo v tomto případě. Předepsané udržování koní v imunitě proti influenze má zabránit jak zavlečení viru na tuto akci, tak jeho další šíření v chovech, kam se koně vracejí. Je několik možností, jak vakcinaci nahradit nebo doplnit její očekávané účinky. Nelze stoprocentně zajistit, aby koně z chovů s respiračním onemocněním, byť klinicky zdraví, nenavštěvovali hromadné akce. Proto by se měla preventivní opatření rozšířit i na zamezení kontaktu koní v chovu s koňmi potencionálně infikovanými, což jsou všichni koně vracející se z hromadných akcí. Takové koně je nutno izolovat nejméně po 14, lépe 28 dní. Důležité je také dbát na řádnou desinfekci rukou, obuvi a oblečení lidí přicházejících do kontaktu s těmito koňmi a to i z jiných chovů. Závěr Influenza koní je stále aktuální infekční onemocnění, které se velmi rychle šíří v populacích vnímavých zvířat, v některých případech i u vakcinovaných koní. V lednu roku 2008 bylo v tréninkovém středisku na území ČR diagnostikováno ohnisko influenzy koní, přestože koně byli udržováni v imunitě vakcínami dle doporučení OIE. Z nemocných koní byly izolovány dva viry a z nich byl virus A/Eq/Brno/08 pomocí sekvenace hemaglutininu zařazen mezi viry americké větve a to do sublinie Florida 2. Od používaných vakcinačních kmenů se odlišoval třemi aminokyselinami ve dvou antigenních místech. Z těchto nálezů vyplývá doporučení na rozšíření ochranných opatření z pouhé vakcinace ještě na důsledně dodržovanou izolaci koní navracejících se z hromadných akcí před jejich zařazením mezi ostatní. Literatura 1. Wilson, I.A., Cox, N.J. Structural basis of immune recognition of influenza virus hemagglutinin. Annu Rev Immunol 1990; 8: 737– 771. 2. Daly, J. M., Lai, A. C., Binns, M. M., Chambers, T. M., Barrandeguy, M., Mumford, J. A. Antigenic and genetic evolution of equine H3N8 influenza A viruses. J Gen Virol 1996; 77:661-71
3. Bryant, N.A., Rash, A.S., Russell, C.A., Ross, J., Cooke, A., Bowman, S., MacRae, S., Lewis, N.S., Paillot, R., Zanoni, R., Meier, H., Griffiths, L.A., Daly, J.M., Tiwari, A., Chambers, T.M., Newton, J.R., Elton, D.M. Antigenic and genetic variations in European and North American equine influenza virus strains (H3N8) isolated from 2006 to 2007. Vet Microbiol 2009; 138: 41–52., 4. Virmani, N., Bera, B.C., Singh, B.K.,Shanmugasundaram, K., Gulati, B.R., Barua, S.,Vaid, R.K., Gupta, A.K., Singh, R.K. Equine influenza outbreak in India (2008–09): Virus isolation, sero-epidemiology and phylogenetic analysis of HA gene. Vet Microbiol 2010; 143: 224 - 237 5. OIE Report of the meeting of the OIE Biological Standards Commission, 76th General Session, International Committee, World Organization for Animal Health, Paris, 25th to 30th May, 2008, 28
6. Lány, P., Pospíšil, Z., Zendulková, D., Číhal, P., Jahn, P. An epizootiologic study of an outbreak of equine influenza in the Czech Republic in the fall of 1995. Vet Med (Praha) 1997; 42: 39-42.
7. Rozeka, W., Purzyckaa, M., Polaka, M. P., Gradzkib, Z., Zmudzinski, J. F. Genetic typing of equine influenza virus isolated in Poland in 2005 and 2006. Vir Res 2009; 145: 121 126 8. Newton, J.R., Daly, J.M., Spencer, L., Mumford, J.A. Description of the equine influenza (H3N8) outbreak in the United Kingdom during 2003, during which recent vaccination failed to prevent disease in racehorses in Newmarket. Vet Rec 2006; 158: 185–192
