PREZENTACE VLASTNÍHO VÝZKUMU A VÝZKUM FUNKČNÍCH PLÁNŮ ORGANISMŮ

Od fyziologie k medicíně

PREZENTACE VLASTNÍHO VÝZKUMU A VÝZKUM FUNKČNÍCH PLÁNŮ ORGANISMŮ Eva Matalová, Marcela Buchtová, Jaroslav Doubek

Projekt „Od fyziologie k medicíně“ CZ.1.07/2.3.00/09.0219 je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

Ústav fyziologie Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Ústav živočišné fyziologie a genetiky AV ČR, v.v.i., Brno

Vydala Veterinární a farmaceutická univerzita Brno 2010 ISBN 978-80-7305-102-0

1. vydání, neprodejné

Od fyziologie k medicíně Prezentace vlastního výzkumu a výzkum funkčních plánů organismů

Doc. RNDr. Eva Matalová, Ph.D. ([email protected]) RNDr. Marcela Buchtová, Ph.D. ([email protected]) Prof. MVDr. Jaroslav Doubek, CSc. ([email protected])

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno ISBN 978-80-7305-093-1

2

3

PANEL 1: UPLATNĚNÍ

VĚDA-VÝZKUM-VZDĚLÁVÁNÍ-MEZINÁRODNÍ

TÉMA 3: PREZENTACE VLASTNÍHO VÝZKUMU A VÝZKUM FUNKČNÍCH PLÁNŮ ORGANISMŮ

REGION: BRNO

TERMÍNY: 23. dubna 2010 24. dubna 2010 26. dubna 2010 30. dubna 2010

Místo konání: Ústav fyziologie VFU Brno

4

ZAČLENĚNÍ VLASTNÍHO VÝZKUMU DO KONCEPCE AKTUÁLNÍCH VĚDECKÝCH POZNATKŮ Jedním z nejdůleţitějších předpokladů úspěšné vědecké práce je orientace v aktuálních publikovaných výsledcích týkajících se daného směru výzkumu. Taková znalost umoţňuje efektivní naplánování experimentu, který buď rozvíjí publikovaná data nebo přináší něco zcela nového v dané oblasti. V obou případech je nezbytné začlenit výsledky výzkumu do konceptu současných znalostí a diskutovat jejich význam a přínos v konkrétní i obecné rovině poznání. Z těchto poţadavků vychází i vlastní členění původních vědeckých článků: v úvodu (Introduction) je čtenář přehledně seznámen s poznatky v dané oblasti a je nastolen problém, tedy proč se tato nová studie vlastně dělala a co měla přinést. Jedná se tedy o představení „hypotézy“, která je danými experimenty ověřována. Metody a experimentální přístupy, kterých má být cílů dosaţeno, jsou rozpracovány v části materiál a metody (Material and Methods) – tato část je někdy uváděna aţ na závěr celé práce. Výsledky, které daná studie přinesla, jsou shrnuty ve výsledkové části (Results) a následně diskutovány (Discussion), jak zapadají nebo nezapadají (a proč) do současných znalostí, co přinášejí atp. Závěr můţe být buď součástí diskuze nebo samostatně (Conclusion, Concluding remarks). Výsledky experimentální práce jsou dokládány obrázky, grafy a tabulkami, na které je odkazováno ve výsledkové části. Kaţdý obrázek a tabulka pak mají vlastní popis (Figure legends). Na dalších stranách stručně seznamujeme s vyuţitím dvou nejpouţívanějších databází v oblasti fyziologie a medicíny: Web of Science, která je součástí Web of Knowledge (WOK) a PubMed. 5

VĚDECKÉ DATABÁZEWEB OF KNOWLEDGE A PUBMED Základní pravidla vyhledávání

WEB OF KNOWLEDGE (http://apps.isiknowledge.com)

6

WOK - Zadávání klíčových slov pro vyhledávání

7

WOK - Práce s vyhledanou literaturou

8

Kliknutím na odkaz Full Text se otevře pdf celého znění tohoto článku. Není-li Full Text dostupný přes WOK, lze vyuţít jiné databáze, případně oslovit přímo autora pro korespondenci, kterým je vţdy jeden člen autorského týmu. Adresu pro korespondenci lze nalézt pod abstraktem článku, který se zobrazí po kliknutí na modře zvýrazněný název práce (Title).

Současně se na této straně zobrazuje, o jaký článek se jedná (Document Type), coţ je buď původní vědecká práce (Article) nebo přehledová studie (Review) a v jakém jazyce byla práce publikována (Language), coţ je v drtivé většině případů angličtina. Dále jsou na této straně zobrazena klíčová slova k dané práci zadaná autory pro usnadněné vyhledávání (Author Keywords) a také adresa pracovišť autorů a adresa, kde lze ţádat o zaslání výtisku práce (Reprint Address). V současné době je však obvyklé pracovat s pdf verzemi. 9

PubMed (www.pubmed.com)

PubMed zahrnuje databáze, které se týkají nejenom článků v odborných časopisech, ale také řadu dalších. Ty zahrnují například informace o genomech jednotlivých druhů, proteinech s relevantními literárními odkazy, seznam dostupných sond na mapování, údaje o sekvenovaných genomech, které se vztahují k jednotlivým druhům atd. PubMed zahrnuje také on-line databázi OMIM: On-line Mendel Inheritance in Man, která poskytuje s přehledem genů, jejich lokalizaci, strukturu, funkci, vazbu na další geny, výsledky klonování a další související informace. V časopisové databázi se vyhledává obdobně jako na Web of Knowledge s vyuţitím spojek AND a OR. 10

Odborné články v časopisech na PubMed – vyhledávání Např. zadání: mouse AND immunity AND 2009 zobrazí všechny články, kde se objevují slova „mouse“ a „immunity“ a byly publikovány v roce 2009.

Kliknutím na název práce (modře) se obdobně jako u Web of Science zobrazí abstrakt dané práce, pracoviště autorů a (byl-li autory poskytnut) e-mailový kontakt pro korespondenci. 11

Některé další databáze pod PubMed Databáze proteinů

OMIM

12

PREZENTACE VÝSLEDKŮ VÝZKUMU Díky celé řadě přehledných databází jsou v dnešní době vědecké články publikované v mezinárodních časopisech snadno dostupné odborníkům z celého světa. Další formou prezentace vědeckých výsledků, především těch nejaktuálnějších, které ještě nebyly publikovány v ţádném časopise, jsou příspěvky na vědeckých konferencích. Základními formami prezentací na konferencích jsou přednášky a plakátová sdělení (postery).

Jedním ze softwarových programů využívaných na přípravu posterů je Corel. Plakáty jsou poté tištěny pro prezentaci v posterových sekcích konferencí. Autor sdělení je v určené době přítomen a probíhá diskuze jeho příspěvku. 13

Asi nejrozsáhlejší vyuţití při konferenční prezentaci vědeckých výsledků má aktuálně program PowerPoint. Tento program lze vyuţívat pro přípravu posterů, postup je stejný jako při tvorbě snímků, ale velikost snímku musí být nastavena na finální velikost posteru – většinou formát A0. PowerPoint je rovněţ nejrozšířenějším grafickým programem pro zpracování přednášek. Vytváření atraktivních a kvalitních prezentací v PowerPointu je součástí samostatné publikace projektu „Od fyziologie k medicíně“, která vyšla pod ISBN 978-80-7305-101-3 a praktická zkušenost je součástí kurzu „Prezentace vlastního výzkumu a výzkum funkčních plánů organismů“.

14

PRÁCE S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY ►HISTORIE pouţívání zvířat k pokusům – přelomová období • Staré Řecko K pokusům pouţívána domácí i divoká zvířata. • 19. století (doba F. Magendieho, 1783-1855 a C. Bernarda, 18131878) Doba je vnímána jako počátek pouţívání laboratorních zvířat: potkana, myši, morčete, králíka. Výhody jejich pouţívání: - přizpůsobivost, - hospodárnost -- vysoká reprodukční schopnost, -- malé chovné prostory, -- nenáročné krmení (dnes komerční diety). • Polovina 20. století (doba po 2. světové válce) Rozvoj chovu a vyuţívání laboratorních zvířat - dáno potřebami základního a vojenského výzkumu. • Konec 50. let SPF (prosté specifických patogenů) chovy (1959) – laboratorní myš, laboratorní potkan, morče. • 80. léta Transgenní zvířata. • Konec 20. století Vznik „vědy o laboratorních zvířatech“ – zkoumá laboratorní zvířata pod úhlem: - biologie, - chovu, - medicíny, - experimentů. 15

Začínají vycházet specializované časopisy (např. Laboratory Animals Journal). ►VÝZNAM pokusů na zvířatech (z pohledu fyziologie – medicíny) Získávání a ověřování poznatků na úseku: • podstaty a mechanismů ţivotních procesů na různých úrovních zdravého a nemocného organismu, • prevence, diagnostiky a léčby nemocí člověka a zvířat, • profesní dovednosti, • formování vztahu k nemocným zvířatům v duchu etiky. ►Významná data z historie ochrany zvířat 1824 - Královská společnost pro prevenci krutosti ke zvířatům (UK) 1876 - Zákon o krutosti ke zvířatům Spojeného království 1978 - Deklarace všeobecných práv pro zvířata (UNESCO, FELASA) 60.-80. léta 20. století - legislativa v řadě zemí 1980 - Americká organizace Lidé za etické zacházení se zvířaty (PETA) 1985 - Mezinárodní předpisy pro biomedicínský výzkum na zvířatech (Rada mezinárodních organizací lékařských věd, CIOMS) 1986 - Evropská konvence o ochraně obratlovců pro pokusné a jiné vědecké účely (Evropský parlament) 1992 - Zákon ČNR č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání 1994 - Nadace na ochranu zvířat (spoluzakladatel VFU Brno) ►ETICKÝ PŘÍSTUP k pokusům 1. Ideový předpoklad: Slogan 3 „R“ (Russell a Burch, 1959), který znamená:

16

- Replacement („nahrazení“, tj. vhodné pokusné objekty včetně alternativ) - Reduction („omezení, zmenšení“, tj. co nejmenší počet pokusných objektů) - Refinement („zjemnění“, tj. co nejlepší podmínky pro pokusné objekty) 2. PRÁVNÍ PŘEDPISY v ČR ve vztahu: A) K přímé ochraně pokusných zvířat proti týrání: - Zákon č. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání, ve znění platných předpisů. Citace ze zákona: Účelem zákona je chránit zvířata, jeţ jsou ţivými tvory schopnými pociťovat bolest a utrpení, před týráním, poškozováním jejich zdraví a jejich usmrcením bez důvodu, pokud byly způsobeny, byť i z nedbalosti, člověkem. (§ 1 odst. 1) Zvířetem (se rozumí) kaţdý ţivý obratlovec, kromě člověka, nikoliv však plod nebo embryo. (§ 3 písm. a) Pokusným zvířetem (se rozumí) kaţdé zvíře, které je nebo má být pouţito k pokusům, včetně volně ţijícího zvířete, samostatného ţivota schopné larvální formy nebo rozmnoţování schopné larvální formy. (§ 3 písm. j) Laboratorním zvířetem (se rozumí) zvíře, které bylo odchováno v chovném zařízení speciálně pro pokusné účely. (§ 3 písm. l) Pokusem (se rozumí) jakékoliv pouţití zvířete k pokusným nebo jiným vědeckým účelům, které u zvířete vyvolá nebo je způsobilé vyvolat bolest, úzkost nebo utrpení, anebo které můţe vést k trvalému poškození nebo ke ztíţení přirozeného způsobu ţivota zvířete, anebo které v důsledku provedených zákroků nebo provedených úkonů vede nebo můţe vést k tomu, aby se zvíře 17

s takovým poškozením narodilo; za pokus se povaţují i případy, kdy bylo u zvířete vyloučeno utrpení nebo trvalé poškození úspěšným pouţitím prostředků pro celkové nebo místní znecitlivění, prostředků sniţujících bolest nebo jiných metod. (§ 3 písm. u) Projektem pokusů (se rozumí) písemně vyjádřený záměr a cíl pokusu na zvířeti, který musí obsahovat identifikaci uţivatelského zařízení a údaje o jeho akreditaci (§ 15 odst. 2), zejména označení osoby zodpovědné za péči o zvířata v uţivatelském zařízení; projekt pokusů musí dále obsahovat označení osoby, která je oprávněna pokus řídit (vedoucí pokusu), zdůvodnění pokusu, označení druhu pokusných zvířat, jejich počet a původ, stanovení podmínek provádění pokusu a veterinárních podmínek, včetně stanovení závazné metodiky pokusů a způsobu provedení a ukončení pokusu. (§ 3 písm. v) Chovným zařízením (se rozumí) zařízení, v němţ jsou chována laboratorní zvířata. (§ 3 písm. x) Dodavatelským zařízením (se rozumí) zařízení, které dodává za úplatu laboratorní zvířata. (§ 3 písm. y) Uživatelským zařízením (se rozumí) zařízení, v němţ jsou zvířata poţívána k pokusům. (§ 3 písm. z) Pokusy na zvířatech lze provádět pouze za účelem (§ 15 odst. 1) a) odvrácení nebo prevence nemocí, zdravotních poruch a jiných anomálií nebo jejich následků u člověka, zvířat nebo rostlin, včetně výroby a zkoušení jakosti, účinnosti a neškodnosti léčiv, látek nebo výrobků, b) provádění diagnostiky nebo léčby onemocnění, zdravotních poruch nebo jiných anomálií a jejich následků u člověka, zvířat nebo rostlin, c) zjišťování, vyhodnocování, řízení nebo modifikace fyziologických stavů u člověka, zvířat nebo rostlin,

18

d) ochrany ţivotního prostředí v zájmu zdraví nebo dobrých ţivotních podmínek lidí nebo zvířat, e) provádění výuky, pokud účelu nelze dosáhnout jinak, f) zachování nebo rozmnoţování ţivého materiálu pro vědecké účely, g) provádění vědeckého výzkumu, h) konání soudního řízení. - Vyhláška č. 207/2004 Sb., o ochraně, chovu a vyuţití pokusných zvířat, ve znění vyhlášky č. 39/2009 Sb., která nabyla účinnosti 4.2.2009. Citace z vyhlášky: Tato vyhláška zapracovává příslušné předpisy Evropských společenství a upravuje poţadavky a podmínky ochrany pokusných zvířat proti týrání, podmínky chovu, vyuţití a přepravy pokusných zvířat. (§ 1 odst. 1) - Vyhláška č. 3/2009 Sb., o odborné způsobilosti k výkonu dozoru na úseku ochrany zvířat proti týrání, která nabyla účinnosti 22.1.2009. Citace z vyhlášky: Tato vyhláška upravuje obsah a rozsah odborného kurzu pro získání odborné způsobilosti k výkonu dozoru na úseku ochrany zvířat proti týrání, poţadavky na školící pracoviště, sloţení zkušební komise, průběh zkoušky, podmínky a způsob vydávání osvědčení o odborné způsobilosti k výkonu dozoru na úseku ochrany zvířat proti týrání a vzor osvědčení o odborné způsobilosti k výkonu dozoru na úseku ochrany zvířat proti týrání. (§ 1) B) K nepřímé ochraně zvířat proti týrání: zákon č. 166/1999 Sb., o veterinární péči a o změně některých souvisejících zákonů (veterinární zákon), ve znění platných předpisů.

19

Organizace na ochranu zvířat: • První hnutí proti pokusům na zvířatech zaloţil Bentham (1789), • „militantní“ organizací je Fronta za osvobození zvířat (ALF), zaloţil Lee (1976), • dnes ve světě kolem 300 organizací na ochranu zvířat ve více neţ šedesáti zemích, • v Londýně v roce 1924 zaloţena Světová organizace na ochranu zvířat, • 25. duben vyhlášen Světovou organizací na ochranu zvířat Mezinárodním dnem boje proti pokusům na zvířatech, • 4. říjen (den narození Františka z Assisi, patrona zvířat) vyhlášen Světovým dnem zvířat. PŘEHLEDY týkající se pouţívání laboratorních zvířat

20

21

22

OSVĚDČENÍ PRO PRÁCI S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY Osvědčení pro práci s laboratorními zvířaty na úrovni plánování, vedení a provádění pokusů v ČR.

Evropské osvědčení pro práci s laboratorními zvířaty vydávané FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) http://www.felasa.eu/. 23

PROJEKT POKUSU Projekt pokusu je předkládán v každém případě, kdy se pro vědecké, vzdělávací nebo jiné účely plánuje využití laboratorních zvířat. Projekty schvaluje odborná komise na ochranu zvířat dané instituce a předává je k vyjádření nadřízené odborné komisi.

Projekty pokusů jsou součástí grantových aplikací, tedy žádostí o finanční podporu vědy, výzkumu a aplikací (např. GA ČR, FRVŠ).

24

VÝZKUM FUNKČNÍCH PLÁNŮ ORGANISMŮ Kaţdý ţivý organismus při svém vzniku získává unikátní plán (genom), který mu umoţňuje vybudování funkčního komplexu buněk, tkání a orgánů tvořících organismus a také jeho údrţbu. Genom je tedy informační genetickou výbavou buňky, resp. organismu. V centru zájmu vědců i široké veřejnosti je genom především proto, ţe představuje program pro ţivot kaţdého jedince i vývoj daného druhu. Genom je uloţen v jádře buňky. Pohlavní buňky mají tzv. haploidní genom (obsahují jednu chromozomovou sadu), ostatní buňky (somatické) pak diploidní (obsahují dvě chromozomové sady). Genom pro analýzu lze získat z libovolné tkáně, nejčastěji se vyuţívají bílé krevní buňky – leukocyty (odběr krve), případně buňky bukální sliznice (stěr výstelky dutiny ústní). Genom je lokalizován na jednotlivých úsecích DNA, které jsou strukturovány do chromozomů. Funkce chromozomů v dědičnosti byla objasněna v roce 1933 (Morgan). Později bylo zjištěno, ţe změny v počtu chromozomů vedou k některým specifickým onemocněním (např. u člověka trizomie 21 - Downův syndrom), stejně jako delece (chybění části chromozomu), aberace (zlomy na chromozomech), translokace (přemístění části chromozomu na jiný) apod. Chromozomovou analýzou se zabývá cytogenetika, která patří mezi důleţité oblasti medicínské diagnostiky. V posledních letech se dostává do centra zájmu tzv. molekulární cytogenetika, která vyuţívá např. metody FISH (fluorescenční in situ hybridizace). Touto technikou lze přesně lokalizovat hledané sekvence (např. gen zodpovědný za chorobu) v rámci karyotypu (normální haploidní n. diploidní sestava chromozomů jednoho jádra s ohledem na velikost, 25

tvar a počet charakteristický pro daný druh). Jde o velmi elegantní metodu, která zahrnuje přípravu specifické fluorescenčně značené DNA sondy (komplementárně odpovídající hledané sekvenci), její hybridizaci (komplementární spojení) s analyzovanou DNA a následnou detekci (ve fluorescenčním mikroskopu). Připravit lze nejen genové sondy, ale také např. chromozomové (detekce translokací), případně genomové. Chromozomy jsou tvořeny jednak bílkovinami (především histony) a hlavně vlastním nosným médiem genetické informace deoxyribonukleovou kyselinou (DNA). Struktura DNA byla objevena v roce 1953 a za tento objev získali v roce 1962 Nobelovu cenu za fyziologii/medicínu F. H. C. Crick, J. D. Watson a M. H. F. Wilkins.

Posluchárna sira J. D. Watsona s jeho portrétem v Cold Spring Harbor Laboratories (CSHL), USA.

Pamětní medaile Mendeliana MZM v Brně udělená siru Watsonovi k 55. výročí objevu struktury DNA a životnímu jubileu v dubnu 2008.

26

Pro podrobnější analýzu lidského genomu lze DNA z buněk vyizolovat, purifikovat (odstranit především bílkoviny) a „číst“ vlastní zapsaná „písmena“ - chemické baze: adenin, cytozin, guanin a tymin. Cílem čtení je jednak získání pořadí písmen (sekvenci), ale také následné sestavování slov, vět a hledání jejich celků (genů) a zejména pak zjištění produktu realizace tohoto zápisu (proteiny jako produkty genové exprese) a jeho funkce. Získávání těchto informací zahrnuje dva základní kroky, a to fyzikální mapování chromozomů, na které navazuje vlastní sekvenování. Vytvoření fyzikální mapy genomu představuje navigační systém pro orientaci v umístění genů na chromozomech a tím vytváří zázemí pro komplexní sekvenování. Vytvoření fyzikálních map umoţnilo identifikaci řady geneticky podmíněných chorob a další jsou studovány. Hlavní výzvou je najít takové geny, které podmiňují onemocnění jako např. astma, rakovinné změny a neurodegenerativní onemocnění. V těchto případech se jedná o polygenní systémy, kdy není za průběh nemoci zodpovědný jediný gen a navíc je projev nemoci podmíněn více neţ jednou změnou (mutací). Genom vytváří sloţitou programovou síť, jejíţ jednotlivé prvky a vzájemné působení vede k různé vnímavosti jedinců k ţivotnímu prostředí, ovlivňuje náchylnost a vznik celé řady onemocnění. Léčba „na míru“ je proto obrovskou výzvou.

27

CESTA K ROZLUŠTĚNÍ GENETICKÉHO KÓDU Mezi milníky na cestě k rozluštění genetického kódu patří identifikace DNA jako genetického materiálu (O. T. Avery, C. M. MacLeod, M. McCarty), objev struktury DNA (F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins), koncept jeden gen = jeden enzym (G. W. Beadle, E. L. Tatum) a vztah RNA k proteosyntéze (J. Brachet, T. Caspersson) v padesátých letech minulého století. V dalších studiích byl stanoven koncept RNA jako templátu pro proteosyntézu, chyběl však přímý biochemický důkaz. M. W. Nirenberg vstoupil do této problematiky během svého postdoktorandského působení v National Institute of Health, kde začal studovat souvislosti propojující DNA, RNA a proteiny. Nejprve začal pracovat se syntézou penicilinázy mimo buňku, kde stavěl na poznatcích M. R. Pollocka a jeho kolegů. Zaměřil se zejména na vliv reakčních podmínek, nukleových kyselin a dalších faktorů na syntézu proteinů. M. W. Nirenberg a H. Matthaei ukázali, ţe RNA připravená z ribozomů stimuluje inkorporaci aminokyselin do proteinu a ţe transferová tRNA nenahrazuje RNA templát. Pro další experimenty získali RNA z dalších zdrojů a určovali jejich aktivitu a specificitu jako templátu pro syntézu proteinů. Výsledky prokázaly, ţe RNA je templátem pro proteiny, ţe uridin (U) v poly-U-sekvenci odpovídá fenylalaninu v cílovém proteinu a ţe translace mRNA je ovlivněna strukturou RNA. Genetický kód byl rozluštěn ve dvou experimentálních fázích. Nejprve byla určena kompozice kodónů a obecný princip genetického kódu. Dále bylo odhaleno pořadí bází v kodónu pro určení aminokyseliny. Sekvence zaloţené na principu kodónů byly stanoveny vazbou AA-tRNA k ribozomům s trinukleotidy známé sekvence a také stimulací in vitro proteosyntézy na základě polyribonukleotidů obsahujících opakující se dublety, triplety a tetrametry o známé sekvenci. 28

Další otázky, které zbývalo zodpovědět, byly spojeny s interpunkcí genetického kódu, iniciací a terminací transkripce a translace a také s redundancí kodónů. Výsledky mnoha studií ukázaly, ţe odlišné formy ţivota vyuţívají v podstatě tentýţ genetický jazyk. Téměř identickou translaci nukleotidových sekvencí prokázali M.W. Nirenberg, R. Marshall a T. Caskey v experimentech s bakteriemi, obojţivelníky i savci. Byla objevena univerzalita genetického kódu. Nobelovu cenu za interpretaci genetického kódu a jeho funkce v syntéze proteinů získali v roce 1968 Robert W. Holley (Cornell University, New York), Har Gobind Khorana (University of Wisconsin in Madison, USA) a Marshall W. Nirenberg (National Institutes of Health in Bethesda, USA). Při příleţitosti jejího udělení byl zmíněn i počátek genetiky, který se vztahuje k osobnosti J. G. Mendela a jeho působení v Brně: „Na podzim roku 1868 izoloval mladý švýcarský lékař jménem Friedrich Miescher novou složku buněčného jádra. Nazval ji nuklein a dnes jí říkáme nukleová kyselina. O dva roky později Gregor Mendel (Miescherovi neznámý) ukončil ve městě Brně sérii experimentů, jež se nakonec ukázaly úzce propojené s Miecherovým objevem. Na základě velmi jednoduchých pokusů s hrachem Mendel objevil, že naše dědičnost je obsažena v mnoha nezávislých jednotkách (genech). Mendelova práce byla začátkem genetiky jako vědy … Během 19. století ještě nebyly Nobelovy ceny zavedeny. Pokud by existovaly, je málo pravděpodobné, že by byly uděleny za objevy nukleových kyselin a genů. Miescherovy výsledky byly v plném znění publikovány až po jeho smrti v roce 1890. Mendel tiskem zveřejnil svá pozorování v roce 1866, vzbudilo to však pramálo zájmu a brzy bylo zapomenuto“…

29

Genius loci vytvořený dlouholetým působením a vědeckou činností J. G. Mendela v Brně dává Brnu unikátní postavení na současné vědecké mapě Evropy. 100 let mezi objevem genetické informace (J. G. Mendel) a rozluštěním genetického kódu (M. W. Nirenberg a spol.) – symbolické setkání v Brně 2006.

Pochopení Mendela je klíčem k pochopení molekulární biologie, která nás dělá tím, čím jsme – Eric Wieschaus, nositel Nobelovy ceny z roku 1995. 30

PROJEKT MAPOVÁNÍ LIDSKÉHO GENOMU (Human Genome Project, HGP) 26. června 2000 oznámil americký prezident B. Clinton a britský premiér T. Blair historickou událost: mezinárodní Projekt lidského genomu (Human Genome Project) a společnost Celera Genomics ukončily první kapitolu sekven(c)ování lidského genomu. Výsledky projektů sekvenování lidského genomu otevírají cestu pro prevenci, diagnostiku a léčbu mnoha závaţných geneticky podmíněných chorob. Změny v lidských genech jsou zodpovědné za více neţ 5000 dědičných chorob jako Huntingtonova choroba, cystická fibróza, srpkovitá anémie. Genetický vliv je však sledován při vzniku tisíců dalších onemocnění. Zjištění spojitosti určitého genu s danou chorobou je časově velice náročný proces, uváţíme-li, ţe lidský genom tvoří několik desítek tisíc genů. Rozvoj vědeckého poznání, technologie a bioinformatiky tento proces stále výrazněji zefektivňuje. V roce 1989 nalezli vědci po 9 letech práce gen pro cystickou fibrózu. Díky mezinárodnímu propojení a koordinaci vědeckých sil v projektech jako HGP byl např. gen pro Parkinsonovu chorobu zmapován za pouhých 9 dní. HGP představuje třináctileté mezinárodní úsilí zaměřené na odhalení všech předpokládaných 20 – 25 tisíc genů v lidském genomu a jejich zpřístupnění pro další studium. Dalším krokem byla sekvence všech 3 miliard párů chemických bazích (nukleotidů), které tvoří lidskou DNA. Nemalá část projektu byla věnována také nehumánním organismům vyuţívaným jako modelové druhy, bakterii E. coli, drozofile a laboratorní myši, a to z důvodu rozvoje technologií vyuţitelných pro výzkum lidského genomu.

31

Hlavní cíle HGP: Identifikace genů na lidských chromozomech Určení sekvence chemických bazí v lidské DNA Ukládání všech získaných informací do databází Zkvalitňování nástrojů pro analýzu dat Přenos souvisejících technologií do privátního sektoru Řešení etických, právních a společenských otázek, které vyvstanou během projektu Projekt byl zahájen v říjnu 1990 a byl plánován na 15 let. Vzhledem k prudkému rozvoji technologií však bylo vytčených cílů dosaţeno jiţ v roce 2003, kdy byl projekt oficiálně ukončen. Nicméně navazující výzkum stále bouřlivě pokračuje, zejména v oblastech určení funkce identifikovaných genů a jejich interakcí na různých úrovních exprese. Předprojektová fáze: 1983 – začátek DNA knihoven, PCR (polymerázová řetězová reakce) 1984 – rozvoj rekombinantních DNA technologií 1985 – odborné setkání týkající se sekvenování lidského genomu (Robert Sinsheimer, University of California, Santa Cruz) 1986 – první oficiální konference „Sekvenování lidského genomu“ (Santa Fe, New Mexico), DOE vyhlašuje Human Genom Initiative a poskytuje finanční prostředky na pilotní projekty 1987 – DOE navrhuje 15letý multidisciplinární vědecký a technologický plán na mapování a sekvenování lidského genomu 1988 – zaloţení HUGO (HUman Genome Organisation) s cílem mezinárodní koordinace mapování lidského genomu, DOE a NIH 32

podepisují memorandum spolupráce na mapování lidského genomu, osekvenovány telomerové části chromozomů (LANL) 1989 – nová strategie pro sekvenování (STS - Sequence Tagged Site), STS je krátká sekvence DNA, která jednoznačně identifikuje mapovaný gen – můţe se tedy v celém genomu vyskytovat pouze jednou, pořadí a dostupy těchto sekvencí tvoří tzv. STS mapy – urychlení a zjednodušení fyzického mapování chromozomů, zaloţení ELSI (Ethical, Legal and Social Issues) pro etické, právní a společenské otázky související s mapováním genomu V roce 1990 před zahájením Projektu mapování lidského genomu bylo identifikováno asi 5000 genů. Genová mapa z roku 1996 obsahovala 16 tisíc genů, v roce 1998 uţ 30 tisíc. Stanovení přesného počtu genů je ztíţeno skutečností, ţe řada z nich se překrývá a některé mohou uniknout dostupným detekčním technikám. Mapování dalších savčích genomů (Mammalian Genome Project) přineslo osekvenování genomu laboratorní myši (2002), laboratorního potkana (2004), šimpanze (2005) a dalších. V současnosti probíhá řada dalších projektů, např. Human Microbiome Project – Projekt lidského mikrobiomu, který má za cíl zmapování mikrobiálního osídlení organismu člověka. Hlavními cíli je zjištění, které mikroorganismy se nacházejí u všech lidí, které jsou specifické a zda existuje souvislost se sloţením mikrobiomu a manifestací některých onemocnění.(http://nihroadmap.nih.gov/hmp/)

33

SEKVENOVÁNÍ Sekvenování genomů je zaloţeno na různých modifikacích základní metody zavedené v roce 1977 (Sanger, Maxam a Gilbert) a umoţňuje stanovení pořadí jednotlivých bazí v řetězci DNA. Tyto báze jsou čtyři, komplementárně se párují, čímţ spojují oba řetězce dvoušroubovice DNA. Tyto řetězce lze experimentálně oddálit (např. denaturací) a jeden z nich pouţít jako matrici pro sekvenování. Vzhledem k tomu, ţe délka molekuly DNA v jedné buňce je více neţ 1 m, probíhá sekvenování v mnohem menších úsecích. Tyto úseky lze připravit enzymaticky pomocí tzv. restrikčních endonukleáz, působících jako nůţky na DNA. Po připravení matrice, tedy úseku DNA, který chceme sekvenovat, je nutné vytvořit tzv. primer, coţ je komplementární druhý řetězec počátečního úseku naší matrice. Tento primer je nezbytný pro působení polymerázy, která je schopna připojovat k primeru jednotlivé nukleotidy, komplementární k matrici. Taková komplementární výroba DNA je běţnou reakcí (tzv. replikace) při kaţdém buněčném dělení a zajišťuje předávání programu ţivota dalším generacím buněk. Problémem sekvenování je však určit, jaký nukleotid polymeráza připojuje. K tomu se vyuţívá tzv. stop nukleotidů, coţ jsou uměle modifikované nukleotidy tak, aby se mohly vázat pouze k předchozímu nukleotidu, ale další aby uţ na sebe připojit nemohly, čímţ zastaví syntézu komplementárního řetězce. Tím získáme úsek DNA, který končí přesně v místě, kde se navázal modifikovaný nukleotid. Délku tohoto řetězce a tím pozici nukleotidu lze zjistit po gelové elektroforéze. V elektroforetickém poli putuje záporně nabitá DNA k anodě, čím kratší úsek, tím rychleji. Závěrem pak stačí odečíst pozici jednotlivých stop nukleotidů (na základě radioaktivního nebo fluorescenčního značení), poskládat je za sebe a pak seřadit 34

jednotlivé nastříhané úseky, jak jdou po sobě. V moderních sekvenátorech je vyhodnocení zaloţeno na vyzáření odlišného barevného spektra po začlenění jednotlivých modifikovaných

nukleotidů. Výsledkem jsou pak barevné píky, které vyhodnocuje počítač. Zdokonalování metod sekvenování je na prudkém vzestupu, čímţ se výrazně zvyšuje efektivita. Zatímco přečtení prvního genomu člověka (Celera Genomics, HGP) trvalo několik let, genom objevitele struktury DNA, sira J. Watsona byl osekvenován za několik měsíců v roce 2008. SEKVENOVÁNÍ - základní princip Matrice (DNA sekvence, která nás zajímá) Např. ATCCGTAAACGGTCCGTACGTTAGCATTCGGA Příprava primeru – komplementární k počátku matrice (nukleotidové „očko“ pro syntézu komplementárního řetězce) TAGGCATTTGCCA 35

Příprava modifikovaných nukleotidů (modifikace OH skupiny + radioaktivní, resp. fluorescenční značení) Normální nukleotid

Modifikovaný nukleotid

Příprava čtyř zkumavek 1) matrice + primer + DNA-polymeráza + nukleotidy (A, T, C, G) + modifikovaný nukleotid A 2) matrice + primer + DNA-polymeráza + nukleotidy (A, T, C, G) + modifikovaný nukleotid T 3) matrice + primer + DNA-polymeráza + nukleotidy (A, T, C, G) + modifikovaný nukleotid C 4) matrice + primer + DNA-polymeráza + nukleotidy (A, T, C, G) + modifikovaný nukleotid G 36

Enzymatická syntéza komplementárního řetězce (obdoba replikace), např. zkumavka 1: průběh následujícím způsobem matrice ATCCGTAAACGGTCCGTACGTTAGCATTCGGA /zde 32 nukleotidů/ primer TAGGCATTTGCCA /zde 13 nukleotidů/ syntéza TAGGCATTTGCCAGGCA-stop /zde17 nukleotidů/ TAGGCATTTGCCAGGCATGCA-stop /zde 21 nukleotidů/ TAGGCATTTGCCAGGCATGCAA-stop /zde 22 nukleotidů/ TAGGCATTTGCCAGGCATGCAACGTA-stop /zde 26 nukleotidů/ TAGGCATTTGCCAGGCATGCAACGTAA-stop /zde 27 nukleotidů/ TAGGCATTTGCCAGGCATGCAACGTAAGCCTkonec /zde 32 nukleotidů – celá délka matrice/ Rozdělení řetězců DNA dle délky v elektrickém poli na gelu (elektroforéza DNA) – kratší fragmenty putují rychleji Zjištění pozice stop nukleotidu (na kterém místě se nachází – zde T matrice, tj. A nového řetězce na pozici 17, 21, 22, 26, 27, 32) Analogickou reakci získáme i v ostatních třech zkumavkách – určení pozice A, G a C v matrici Kombinací všech čtyř bazí získáme úplné pořadí bazí sekvenované molekuly DNA (matrice)

37

VYUŢITÍ VÝSLEDKŮ PROJEKTU MAPOVÁNÍ LIDSKÉHO GENOMU











 

Molekulární medicína varování pro pacienty s rizikem vzniku choroby: při znalosti, které změny DNA sekvence v genu jsou zodpovědné za vznik choroby, jako např. cukrovka či rakovina prostaty propukající ve vyšším věku, pak lze pacienta varovat, provádět včasná pozorování, případně onemocnění předejít nebo je včas diagnostikovat a započít vhodnou léčbu, spolehlivě předpovědět průběh choroby: lze určit např. agresivitu nádoru (na základě tzv. otisků prstů DNA - DNA fingerprint) a tím vhodně a včas navrhnout odpovídající léčbu, přesně diagnostikovat chorobu a ihned aplikovat nejefektivnější léčbu (léky přímo na míru daného genomu): např. nádory jsou děleny do řady skupin, kaţdá jinak reaguje na danou terapii, zjištění, o jakou změnu ve struktuře DNA se jedná, by umoţnilo ihned zvolit nejlepší variantu, genové terapie: náhrada defektního (poškozeného, vadného) genu (alely) nepoškozeným. Forenzní medicína identifikace kaţdého individua na základě nezaměnitelné struktury určitých úseků DNA z jediné buňky (krevní, vlasová cibulka, sliznice). Evoluční studia analýza DNA umoţňuje srovnávací studia o příbuznosti druhů. Prenatální diagnostika znalost lidského programu ţivota by umoţnila případné redukce neţádoucích odchylek ještě nenarozených dětí apod. Zpomalení stárnutí 38

 také stárnutí a smrt jsou řízeny geny, jejich ovlivnění by umoţnilo prodlouţení aktivních období ţivota. Dopad na kvalitu ţivota  znalost genomu konkrétního člověka s potenciálními riziky a onemocněními by mohla silně zasáhnout do partnerských vztahů, zaměstnaneckých poměrů, pojišťovacích smluv apod. GENOMIKA se zabývá studiem genomů jednotlivých organismů. Zajímá ji nejenom DNA sekvence, ale také interakce mezi genovými lokusy (specifické pozice genů na chromozomech) a alelami (forma genu umístěná na stejném místě homologního chromozomu v rámci genomu). Zakladatelem je zmíněný Frederick Sanger, který v roce 1977 osekvenoval první celý DNA genom bakteriofága Φ-X174. První volně ţijící osekvenovaný organismus byl Haemophilus influenzae. Tyto základní cíle „klasické“ genomiky jsou stále rozšiřovány. FUNKČNÍ GENOMIKA je oblastí molekulární biologie, která usiluje o vyuţití dat získaných sekvenováním genomů pro zjištění funkce daného genu a souvisejících interakcí. Na rozdíl od genomiky a proteomiky je zaměřena na dynamické sledování genové exprese. Funkční genomika má tedy za cíl zodpovědět otázky týkající se funkce DNA na úrovni genů, RNA transkriptů a proteinových produktů. KOMPARATIVNÍ GENOMIKA vyuţívá dostupnosti sekvencí genomu člověka, ale také modelových organismů. Komparativní genomika vychází z porovnávání dostupných sekvencí pro odhalování nových genů, jejichţ existence je poté laboratorně ověřena. Celogenomové analýzy totiţ ukazují na vysokou konzervovanost některých sekvencí u různých ţivočišných druhů.

39

Jedním z moţných přístupů testování funkce určitého genu je vytváření tzv. knock-out zvířat, kdy daný gen je vyřazen („knockoutován“). Obrázek A ukazuje sagitální histologický řez hlavou mutantního myšího embrya (knock-out) pro kaspázu-3, obrázek B pak obdobný řez „normálním“ embryem (wild type). Hvězdička ukazuje přerůstající mozkovou tkáň u mutanta, která následně zcela deformuje obličejovou část i další kraniofaciální struktury (např. šipky ukazují zubní základy, které jsou u mutanta sagitálně v opačném pořadí – nejdříve řezáky, poté moláry).

Dalším přístupem je vytváření rekombinantních imbredních kmenů, kdy opakovaným cíleným kříţením vznikají kmeny nesoucí ve svém genomu specifickou kombinaci alel rodičovských kmenů. Např. myši na předchozím obrázku jsou kmene C57BL/6.

40

GENOVÁ EXPRESE Od genu k proteinu, od plánu k realizaci funkcí Mapování genomů jednotlivých organismů zaměstnává řadu výzkumných laboratoří na celém světě. Genom představuje kompletní informaci obsaţenou v buňce, tedy soubor jejích genů. Gen je určitá informace uloţená ve struktuře dvoušroubovice DNA, uspořádané do chromozomů, a to na místě zvaném lokus. Identifikace lokusů umoţňuje přesný popis strukturních jednotek genu – nukleotidů, které tvoří jednotlivá písmena genetického jazyka. Tento jazyk umoţňuje buňce vyuţití informací ţivota uloţených v genomu a jejich realizaci v proteomu, který představuje soubor všech proteinů obsaţených v buňce za určitého stavu a v určitém čase. Proteom je tedy na rozdíl od genomu velmi dynamický a odráţí aktuální stav vyuţití genetické informace buňkou pro realizaci jejích funkcí. Věda zabývající se studiem proteomu se nazývá proteomika. Oba směry výzkumu – genomika a proteomika - se doplňují a s přibývajícími znalostmi upřesňují význam genetické informace, mechanismy její realizace a regulace, stejně jako moţná vyuţití v klinické oblasti. Mezi genomem a proteomem stojí ještě tzv. transkriptom, tedy úroveň RNA. DNA sama o sobě neřídí syntézu proteinů, je však jakýmsi zápisem plánu, jehoţ realizace ve správný čas na správném místě zajišťuje správnou funkci buněk, tkání, orgánů a organismů.

41

Transkripce V kaţdé buňce našeho těla se kaţdou sekundu odehrávají tisíce genových expresí. Zdrojem informací pro tyto procesy jsou geny uloţené v DNA – obdobně jako jednotlivé soubory uloţené na hard disku počítače. DNA je chráněna v jádře, stejně jako procesor je ukryt uvnitř samotného počítače. Jde přece o naprosto nezbytné a ţivotně důleţité informace! Tyto se však z jádra musejí předávat dál a k tomu slouţí u počítačů přenosná média (diskety, CD atd.), u buněk pak jiný druh nukleové kyseliny (ribonukleová kyselina, RNA). Předání genetické informace ze struktury DNA do řetězce molekuly RNA je prvním krokem genové exprese a celý proces se nazývá transkripce neboli přepis. Informace je sice kopírována do jiné chemické formy (DNA – RNA), ale s vyuţitím stejného způsobu zápisu – nukleotidů. Podle jednoho genu můţe vzniknout mnoho kopií RNA, stejně jako informace z počítače lze nakopírovat na celou řadu disket. Tato amplifikace (namnoţení) urychluje syntézu proteinů v dalším kroku genové exprese, kde RNA slouţí jako templát. Také exprese genů je regulována podle okamţité potřeby buňky, coţ umoţňuje udrţování dynamické rovnováhy jejího vnitřního prostředí (homeostázy). Stejně jako DNA je také RNA sloţena ze čtyř typů podjednotek (písmen) spojených navzájem fosfodiesterovými vazbami, odlišným aspektem je však jednak cukerná sloţka nukleotidů (u DNA deoxyribóza, u RNA ribóza – proto tzv. ribonukleotidy) a dále odlišnost jednoho z písmen pouţívané abecedy (thymin – DNA, uracil – RNA). Velmi odlišná je také celková struktura obou molekul, kdy DNA bývá dvouřetězcová, zatímco RNA pouze jednořetězcová. 42

Proces transkripce začíná na startovacím místě genu (promotor), kde dojde k rozvolnění řetězců DNA a napojení přepisujícího enzymu, tzv. RNA polymerázy. Jeden z řetězců DNA pak slouţí jako templát pro zápis do RNA. Přepis je ukončen tzv. terminátorem genu. Transkripce - přepis z DNA do RNA – z „pevného disku“ (DNA) na „přenosný“ (RNA) A – adenin, C – cytozin, G – guanin, T – thymin, U - uracil

43

Translace RNA získaná přepisem DNA podléhá ještě v jádře úpravám (tzv. posttranskripční úpravy). Původní, tzv. hnRNA (heterogenic nuclear – heterogenní jaderná) je upravena na vlastní templát pro syntézu bílkovin, tzv. mRNA (messenger – posel). Jednou z nejdůleţitějších úprav je vyštěpení nekódujících sekvencí, které jsou v původním transkriptu obsaţeny. Jedná se o tzv. introny, které jsou vloţeny mezi vlastní informaci genu, tzv. exony. Tato úprava se nazývá sestřih RNA (RNA splicing) a vede ke značnému zkrácení molekuly RNA před jejím opuštěním buněčného jádra. Opět lze tento proces přirovnat k seřazení souborů do sloţek na disketě před odesláním pro tiskárnu. Přestoţe se přítomnost nekódujících intronů v buňce zdá zbytečným plýtváním, toto uspořádání má zřejmě význam, jak evolučně pro urychlení vzniku nových proteinů, tak pro rekombinaci exonů (vzájemná výměna částí mezi geny). Sestřih lze také provádět více způsoby, tudíţ jeden gen můţe kódovat více různých mRNA – alternativní sestřih. Tím se zvyšuje kódující potenciál genomu. mRNA se tedy dostává do buněčné cytoplazmy a nese informaci pro uspořádání cílového proteinu vyráběného na tzv. ribozomech. Ribozomy jsou cytoplazmatické organely tvořené ribozomální RNA (rRNA) a proteiny a jsou místem konečného překladu (translace) informace obsaţené v mRNA do aminokyselinového řetězce proteinů. O překlad se jedná proto, ţe se vyuţívá jiného jazyka – tedy nikoliv nukleotidových písmen, ale aminokyselinových tripletů. Tyto triplety jsou uspořádány v tzv. antikodónu umístěném na tRNA (transferová), která na základě identifikace kodónu (trojice písmen – nukleotidů) v RNA je schopna přiřazení odpovídající aminokyseliny. Jeden kodón (tedy tři nukleotidy) kóduje jednu aminokyselinu. Některé kodóny značí počátek a konec translace, většina však kóduje 44

některou z 21 aminokyselin. Aminokyseliny se spojují peptidickou vazbou do řetězce proteinu. Také po translaci probíhají některé úpravy proteinových molekul, které pak zaujmou své finální prostorové uspořádání a jsou buňkou vyuţity (enzymy, strukturní proteiny, transportní proteiny, signální proteiny, regulační proteiny, zásobní proteiny, …). Translace genu - překlad z RNA do proteinu – „tisk“ na ribozomech

45

CÍLENÉ ZÁSAHY DO FUNKČNÍCH PLÁNŮ - některé příklady KLONOVÁNÍ  Molekulární klonování Klonováním DNA se rozumí izolace určitého úseku DNA (např. genového lokusu) z celkové buněčné DNA, ale také vytvořením mnoha identických kopií molekuly DNA.  Embryonální klonování Získání geneticky identických jedinců (klonů) rozdělením embryonálních buněk blastocysty a dalším samostatným vývojem embryí.  Transnukleární klonování Získávání klonů buněk, příp. organismů tzv. přenosem jader, a to jádra buňky somatické do cytoplazmy buňky pohlavní.

46

47

48

Metoda CNR (Cell Nuclear Replacement) – terapie vyuţívající přenosu jader (transnukleární klonování) umoţňuje přeprogramování jader buněk dospělého organismu. Technika CNR zahrnuje náhradu jádra oocytu (vaječné buňky) jádrem buňky dospělého organismu za účelem klonování a následné aktivace oocytu k vývoji bez oplození. Oocyt je schopen „přeprogramovat“ vnesené jádro jiţ diferencované buňky, které je pak schopno řídit vývoj celého organismu, a to dle genetického programu „nového“ jádra. Metoda CNR tudíţ umoţňuje zisk totipotentních klonů. Molekulární mechanismy tohoto procesu nejsou zcela objasněny, metodou CNR vznikla např. hojně diskutovaná ovečka Dolly. Většina takto získaných embryí se však nevyvíjí normálně a k úplnému zdokonalení této techniky vede ještě dlouhá cesta. Navíc většina států nezastává vyuţívání metody CNR u lidských buněk, i kdyţ by mohla být úspěšně pouţita jak pro základní, tak aplikovaný výzkum (např. řešení neplodnosti, která je narůstajícím problémem industriálních zemí).

Terapeutické klonování kombinuje metodu CNR, kultury lidských kmenových buněk a terapie vyuţívající buněk kmenových. Cílem je zisk jakékoliv zdravé buňky pacienta, její přeprogramování metodou CNR, obnovení jejího embryonálního potenciálu, namnoţení blastocystových

49

kmenových buněk v kultuře, jejich stimulace k diferenciaci v poţadovaný typ buněk a následná transplantace pacientovi. V tomto případě by nedocházelo k odmítnutí následkem imunitní nekompatibility, protoţe pacient by byl sám sobě dárcem.

Kromě ovce Dolly byl dalším známým zvířetem vytvořeným transnukleárním klonováním pes Snuppy (Seoul National University Puppy).

atelier.wordpress.com

50

RESTRIKCE Restrikce DNA označuje štěpení DNA na menší úseky. Restrikční enzymy rozeznávají určité sekvence nukleotidů a ve všech místech genomu, kde se tyto sekvence nacházejí, pak dochází ke štěpení DNA. Výsledkem jsou tzv. restrikční fragmenty, které se dále analyzují a vyuţívají (např. při klonování). K přirozené restrikci (a následně ligaci) dochází také při oddělování intronů a exonů na úrovni hnRNA (čistý přepis DNA) a mRNA (sestříhaná RNA pro translaci na ribozomech).

51

OBJEV RESTRIKČNÍCH ENZYMŮ „Jejich metody otevírají možnost kopírování lidských bytostí v laboratořích, vytvářet geniální bytosti, vyrobit spousty pracovních sil nebo také vytvořit kriminálníky“ – tak reagovala švédská televize na zveřejnění laureátů Nobelovy ceny za fyziologii/medicínu v roce 1978, kterými se stali Werner Arber (Švýcarsko), Daniel Nathans (USA) a Hamilton O. Smith (USA). V roce 1962 nalezl Werner Arber enzymatický systém, který umoţňuje bakteriím rozeznat cizí DNA a zničit ji, zatímco současně modifikují svou vlastní DNA, aby zabránily autodestrukci. Následně W. Arber, S. Linn, M. Meselson a R. Yuan (Harvard University) izolovali extrakt z Escherichia coli, který efektivně rozkládal DNA fágů. Tento extrakt obsahoval první známou restrikční endonukleázu, která rozeznávala a štěpila specifickou sekvenci v DNA. Endonukleázy obecně štěpí DNA uprostřed řetězce, zatímco exonukleázy z konců DNA molekuly. Objev restrikčních enzymů bezesporu znamenal počátek nové éry molekulární biologie a genetiky. Bylo umoţněno rozčlenění celého genomu na menší části, čímţ bylo výrazně usnadněno jeho čtení. Byly vytvořeny restrikční mapy jednotlivých organismů. Restrikce umoţnila snadné klonování menších úseků DNA a jejích umisťování (ligaci) do naštěpených pozic v jakékoliv molekule DNA. 52

RESTRIKČNÍ ENZYMY A JEJICH APLIKACE Restrikční endonukleázy (restriktázy) jsou enzymy schopné rozeznat specifické místo na DNA a následně rozštěpit danou sekvenci reproduktivním způsobem. V současné době jsou hojně vyuţívaným nástrojem v biotechnologiích. Restrikční endonukleázy jsou členy velké skupiny enzymů, které se nazývají nukleázy. Tyto štěpí fosfodiesterovou vazbu, která je připojena k okolním nukleotidům DNA. Místo štěpení DNA se označuje jako restrikční místo. Některé endonukleázy také mohou modifikovat DNA, např. přidáním metylenových skupin ke specifickým nukleotidům uvnitř sekvence a tak ochránit DNA před štěpením. Tyto modifikace znemoţňují restrikčním enzymům rozeznání sekvence specifických vazebných míst hostujícího organismu. Fenomén restrikčních modifikací nebyl vyuţit jako nástroj molekulární biologie do roku 1970, kdy H. Smith a K. Wilcox (Johns Hopkins University) izolovali enzym z Haemophilus influenzae. Enzym nazvaný HindII nevykazoval řádnou modifikační aktivitu a byl schopen štěpit DNA přesně v místě, které rozeznával. První restrikční endonukleázy totiţ nebyly prakticky vyuţitelné, jelikoţ štěpily DNA daleko od místa, které byly schopny rozeznat. V dnešní době se popisují tři hlavní třídy restrikčních endonukleáz: typ I, II a III. Enzymy typu I a III mají restrikční i modifikační aktivitu a štěpí DNA po stranách vně rozlišitelné sekvence. S vyuţitím ATP jako zdroje energie se enzymy pohybují podél DNA molekuly od místa, které rozlišují, k místu štěpení. Tento poţadavek přidání ATP z nich činí prakticky málo vyuţitelnou skupinu enzymů. Zatímco enzymy typu II slouţí jako ideální nástroj pro manipulace s DNA molekulami. Tyto enzymy nevykazují modifikační aktivitu, ale pouze restrikční. Jako koenzym potřebují pouze ionty hořčíku 53

jako kofaktor a štěpí DNA předvídatelným způsobem. V současné době byly izolovány endonukleázy z velkého počtu různých organismů a více neţ 200 je jiţ komerčně dostupných. Názvy restrikčních enzymů odpovídají jejich původu: EcoRI E – rod Escherichia co - druh coli R – kmen RY13 I – první identifikovaná endonukleáza Příklady některých endonukleáz: Organismus Enzym Rozpoznávací sekvence Bacillus amyloliquefaciens H BamHI G GATCC Escherichia coli RY13 EcoRI G AATTC Haemophilus influenzae HindIII A AGCTT Providentia stuartii PstI CTGCA G Serratia marcescens SmaI CCC GGG Endonukleázy rozeznávají sekvence o 4 aţ 8 nukleotidech. Tyto sekvence jsou obyčejně palindromické (jsou stejné i na opačném řetězci). Např. pro BamHI: 5´GGATCC3´ 3´CCTAGG5´ Výsledkem štěpení enzymem BamHI jsou dva fragmenty s těmito konci: 5´G GATCC3´ 3´CCTAG G5´ Komplementární jednořetězcové konce vznikající po štěpení DNA jsou nezbytné pro genové klonování. 54

D. Nathans (Johns Hopkins University) jako první ukázal širokou pouţitelnost restrikčních endonukleáz ve spojení s gelovou elektroforézou. Pouţil enzym HindII pro štěpení purifikované DNA malého viru, který infikuje opice (SV40). Následně pouţil elektroforézu pro separaci fragmentů na základě jejich velikosti a ze získaných výsledků vytvořil restrikční mapu viru. Podobné vyuţití restrikčního štěpení DNA molekuly pro tvorbu restrikčních map bylo vyuţito při mapování lidského genomu. Restrikční mapy Restrikční endonukleázy se vyuţívají k tvorbě restrikčních map, které nám zobrazují polohu restrikčních míst na DNA. Porovnáním přítomnosti či absence jednotlivých restrikčních míst na analyzovaném úseku DNA můţeme sledovat nově vzniklé mutace v genomu při studiu vývojových malformací či rekonstrukcích fylogeneze. Další vyuţití restrikčních enzymů: - studium genetické proměnlivosti v populacích, - stanovení rodičovství, - forenzní analýzy, - v zoologii při studiu pohlavního výběru, - studium molekulární evoluce. Pozn.: Polymorfismus délky restrikčních fragmentů umoţňuje tzv. RFLP analýzy. Polymorfismus znamená přítomnost většího počtu alel daného genu v populaci. Po štěpení konkrétní restrikční endonukleázou vzniká u kaţdé alely variabilní délka DNA fragmentů, čímţ lze stanovit, o kterou alelu se jedná.

55

Gelová elektroforéza Gelová elektroforéza představuje jiţ klasicky pouţívanou metodu, která se stala jednou ze základních technik molekulární biologie. Separace DNA a jejích fragmentů s vyuţitím elektroforézy je umoţněna schopností DNA (je negativně nabita) pohybovat se v nosném gelu a závisí na velikosti DNA (DNA fragmentů). Po umístění DNA do elektrického pole jsou její molekuly přitahovány k pozitivnímu poli (anodě). Během elektroporace jsou DNA fragmenty uspořádány podle velikosti v gelu. Tento gel působí jako síť, kterou se malé molekuly pohybují snadněji, zatímco velké molekuly pomaleji. Tak vzdálenost, kam molekuly docestují, odpovídá velikosti jejich molekulární hmotnosti. První analýzy vyuţívající polyakrylamidový gel byly velmi obtíţné a vyţadovaly značení vzorků radioaktivní značkou. Následně byl gel rozřezán na řadu vzorků a stupeň radiaktivity byl stanoven v scintilátoru. J. Sambrook (Cold Spring Harbor Laboratory) nahradil polyakrylamidový gel agarózou (purifikovanou formou agaru), která dokáţe efektivně separovat větší DNA fragmenty od velikosti 100 nukleotidů do 50 000 nukleotidů. Nízká koncentrace agarózy (níţe neţ 0,3%) separuje větší fragmenty, zatímco vyšší koncentrace (výš neţ 2%) gelu separuje malé fragmenty. J. Sambrook současně pouţil fluorescenční barvu ethidium-bromid pro obarvení DNA, coţ mu umoţnilo analyzovat fragmenty v UV světle. Tato technika je velmi senzitivní a umoţňuje analyzovat jiţ 5ng DNA. Takto zavedená metody je pouţívaná s malými obměnami dodnes.

56

RNA INTERFERENCE, UMLČOVÁNÍ GENŮ DVOUŘETĚZCOVOU RNA Andrew Fire a Craig Mello (nositelé Nobelovy ceny za fyziologii a medicínu v roce 2006) objevili, ţe základním mechanismem řídícím tok genetické informace je dvouřetězcová RNA. Jejich klíčový experiment představoval injekci RNA odpovídající genu pro svalovou funkci hlístice Caenorhabditis elegans. Jednořetězcová RNA neměla ţádný vliv, dvouřetězcová RNA však způsobila svalové záškuby, které odpovídají projevům při ztrátě odpovídajícího genu. Tím bylo prokázáno, ţe dvouřetězcová RNA eliminuje cílovou mRNA. K této tzv. RNA interferenci (RNAi) dochází v kaţdém typu buňky u ţivočichů i rostlin. Dvouřetězcová RNA (dsRNA) se váţe k proteinovému komplexu Dicer, který štěpí dsRNA na malé kousky. Jeden z řetězců RNA reaguje s dalším proteinovým komplexem RISC a váţe se na mRNA (mechanismus párování bazí). mRNA je poté rozštěpena a nemůţe dojít k syntéze odpovídajícího proteinu. Výsledný efekt je tedy stejný jako při nefunkčnosti výchozího genu. RNA interference se tedy mohou stát slibnou cestou pro řadu terapií, protoţe umoţňují „umlčení genů“ bez riskantních zásahů do genomu buněk pacientů. Tyto postupy se aktuálně testují např. pro makulární degenerace oka, kdy dochází k nadměrné produkci cév v sítnici, které sniţují schopnost vidění. RNAi je zacílena proti VEGF (endoteliální růstový faktor cév), coţ vede k omezení růstu cév v postiţené oblasti oka. Další oblasti uplatnění RNAi se otevírají u virových onemocnění (chřipka, HIV), ale také aterosklerózy, kde dvouřetězcová RNA umoţní zablokování produkce škodlivých LDL (lipoproteiny s nízkou hustotou), které se usazují v aterosklerotických plátech. Řada těchto postupů je v současné době ve fázi klinického testování. 57

Dvouřetězcová RNA (ds – double stranded) se váže k proteinu Dicer (zeleně), který štěpí dsRNA na malé fragmenty. Jeden z RNA řetězců je navázán na komplex RISC (žlutě), který mRNA váže na základě párování bazí. V tomto komplexu je mRNA štěpena a degradována. Odpovídající protein (produkt takto „umlčeného“ genu) tedy není syntetizován. RNAi zasahuje v místě po transkripci, kdy dochází ke štěpení RNA matrice. Transkripce tedy probíhá normálně, k translaci však nedochází. 58

SPECIFICKÉ GENOVÉ MODIFIKACE U MYŠÍ S VYUŢITÍM EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK Kmenové buňky (viz také publikace z předchozích kurzů, ISBN 97880-7305-097-9) jsou základem embryonálního vývoje a nezbytností pro obnovu orgánů a tkání. Tyto buňky se mohou nejenom sebeobnovovat, ale současně diferencovat v rozmanité buněčné typy. Takové buňky jsou tedy i lákavým cílem pro terapie, které by kmenové buňky diferencovaly do nových tkání. Sir Martin Evans izoloval embryonální kmenové buňky, v buněčné kultuře je s vyuţitím virového vektoru geneticky modifikoval, injikoval tyto buňky do blastocysty, kterou zavedl do „náhradní“ matky pro vytvoření geneticky upraveného potomstva. Kultivované embryonální kmenové buňky tak byly vyuţity pro vytvoření transgenních zvířat. Mario Capecchi a Oliver Smithies nezávisle na sobě pouţili metodu homologické rekombinace, která umoţňuje obdobné modifikace embrya. Znalosti týkající se biologie kmenových buněk a technologie tzv. genově modifikovaných (pozměněných) myší umoţňují rychlé pokroky v pochopení normálního embryonálního vývoje, souvisejících abnormalit a onemocnění a také navrţení účinných prevencí a terapií. Genom myší i člověka má obdobný počet genů, asi 22,5 tisíc. Genetickou manipulací embryonálních kmenových buněk lze vytvářet i myší modely lidských onemocnění. Na takových zvířecích modelech pak mohou být sledovány nejenom přesné příčiny daných onemocnění, ale především jejich moţná léčba. Moţné je ovlivnění genů pouze v určitých tkáních umístěním genové modifikace za tkáňově specifický promotor. Za tyto objevy získali M. Evans, M. Capecchi a O. Smithies v roce 2007 Nobelovu cenu za fyziologii/medicínu. 59

Obecná strategie modifikace genů u myší. Kmenové buňky nesoucí vložený gen (růžově) jsou injikovány do blastocysty, která je implantována náhradní matce. Narozené potomstvo je potom chimerické (tělo je tvořeno jak původními, tak upravenými buňkami). Takové potomstvo se dále kříží pro získání čistých linií.

Generace genově manipulovaných myší. U chimerických myší dochází k tvorbě spermií, z nichž některé nesou vložený gen a jiné jsou normální. Pokud normální myš oplodní spermie nesoucí vložený gen, tento je předán potomstvu. V druhém případě se narodí normální potomstvo.

60

Jak dál – některá etická stanoviska a doporučení 1) Je nutné provádět paralelně výzkumy na kmenových buňkách odvozených z embryonálních a fetálních tkání, stejně jako z dospělého organismu. Klíčovou otázkou je, do jaké míry se tyto jednotlivé typy kmenových buněk liší. Např. délka ţivota, jak je obtíţné jejich laboratorní namnoţení, rozsah buněčných typů, které mohou produkovat a také zjištění molekulárních signálů řídících tuto diferenciaci. 2) Dále je nezbytné provádět výzkum v oblasti imunologické tolerance, resp. rejekce transplantátů v případě, ţe dárce není geneticky totoţný s příjemcem. 3) Je nutno brát v potaz etické úvahy týkající se problematiky výzkumu a experimentování s lidskými kmenovými buňkami. Kaţdá práce s lidskými buňkami by měla podléhat jasné a přísné legislativě. Vědecká komunita by pak měla zajistit dodrţování zákonů a nařízení v praxi. 4) V legislativním přístupu týkajícímu se výzkumu kmenových buněk jsou velké rozdíly u jednotlivých zemí. V rámci evropských států by měla být zavedena jednotná legislativa z důvodu spolehlivější kontroly laboratoří a práce vědců zainteresovaných ve výzkumu kmenových buněk. 5) V rámci legislativy by měly být uváţeny výstupy a výsledky dosaţené v oblasti výzkumu kmenových buněk a zpřístupnění následně dostupných terapií pacientům. 6) Ve většině evropských zemí je zakázáno reprodukční klonování za účelem získání nové lidské bytosti jiným způsobem neţ fertilizací (oplozením) vaječné buňky spermatickou. Tento fakt je dán etickými aspekty a současnou nedostatečnou znalostí této oblasti (a především následků). 7) Terapeutické klonování, kde je uplatňován přenos jader ze somatických buněk do oocytů, má významný potenciál pro léčebné terapie. Z tohoto důvodu by měl být podporován výzkum týkající se technik uplatňovaných v této oblasti, nicméně pod kontrolou státu. 8) Výzkum v oblasti chimerických embryí (vzniklých fúzí jádra buňky jednoho ţivočišného druhu s oocytem jiného ţivočišného druhu) by

61

měl být omezen na jiné druhy neţ člověka. Také především v případech, které mohou být eticky zdůvodněny, např. záchrana ohroţených druhů. 9) Většina dosud provedeného výzkumu v této oblasti byla financována komerčními organizacemi. Pro zajištění dostupnosti pro veřejnost, důvěry a lepší kontroly je nutné, aby byla poskytnuta finanční podpora pro výzkum také z veřejných zdrojů a aby byl zajištěn dohled nezávislých odborníků. 10) Vědecký pokrok v této oblasti je podstatně rychlejší neţ vývoj legislativy. Proto je nezbytné zabezpečit přehled o nových výsledcích, moţnostech a aplikacích.

European Science Foundation Policy (http://www.esf.org/activities/science-policy.html, [email protected])

62

PRAKTICKÉ ÚKOLY MANIPULACE S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY - Laboratorní potkan

Uchopení před fixací

Fixace pro nitrobřišní aplikaci

Fixace pro podkožní aplikaci

63

ODBĚR KRVE U LABORATORNÍHO POTKANA

Fixace laboratorního potkana pro odběr krve z ocasní žíly

Odběr krve z ocasní žíly laboratorního potkana

Celkový objem krve laboratorního potkana činí 55-70 ml na kg ţivé hmotnosti. Maximum krve spolehlivě získané při jednom odběru bez ohroţení ţivota zvířete je 5 ml na kg ţivé hmotnosti. Objem krve získatelný při exsanguinaci (vykrvácení) je cca 20 ml na kg ţivé hmotnosti. Hodnota hematokritu je 0,39-0,50, koncentrace hemoglobinu 120175 g/l, počet erytrocytů 7,0-9,5 x 1012/l. Počet leukocytů 5,0-25,0 x 109/l, trombocytů 1 100-1 380 x 109/l. 64

Laboratorní potkan – další parametry Ţivá hmotnost: ♂250-500 g, ♀200-350 g Pohlavní dospělost: 35-60 dnů Věk doţití: 3-3,5 roku Březost: 21-23 dnů Počet mláďat ve vrhu: 6-10 Laktace: 21-28 dnů Pohlavní cyklus: polyestrický, celoročně, 4-5 dnů Zubní vzorec: 1003/1003 (1 řezák, 3 moláry) Otevření zevních zvukovodů: 2-3 dny Otevření očních štěrbin: 14-17 dnů Tělesná teplota: 37,5-39,0 °C Srdeční frekvence: 260-450/min Dechová frekvence: 65-115/min Dechový objem: 0,60-1,25 ml Celkový objem plic: 6,0-6,5 ml Spotřeba kyslíku: 0,8 ml/g/h Podmínky chovu Optimální rozsah teploty: 20-24 °C Minimální plocha podlahy pro jedno zvíře: 350 cm2 Minimální výška klece: 18 cm

65

IZOLACE DNA Izolace DNA pomocí kitu Dneasy (QIAGEN) - pracuj a centrifuguj při pokojové teplotě (15-25 °C)

1. Pipetuj 20 l proteinázy K do 1,5ml zkumavky. Přidej 100 l krve a uprav objem do 220 l pouţitím PBS. 2. Přidej 200 l pufru AL. Mixuj vortexováním. Inkubuj 10 minut v inkubátoru při teplotě 56 °C. 3. Přidej 200 l etanolu (100%). Mixuj vortexováním. 4. Pipetuj směs do Dneasy Mini kolonek umístěných v 2ml zkumavkách. Centrifuguj 1 minutu při 8 000 rpm. Vylij tekutinu a vyhoď zkumavku. 66

5. Umísti kolonku do nové 2ml zkumavky. Přidej 500 l pufru AW1. Centrifuguj 1 minutu při 8 000 rpm. Vylij tekutinu a vyhoď zkumavku. 6. Umísti kolonku do nové 2ml zkumavky. Přidej 500 l pufru AW2. Centrifuguj 3 minuty při 13 000 rpm. Vylij tekutinu a vyhoď zkumavku. 7. Umísti kolonku do nové 1,5ml zkumavky. Přidej 20 l depc vody pro eluci DNA. Inkubuj 1 minutu při pokojové teplotě. Centrifuguj 1 minutu při 8 000 rpm. 8. Zopakuj krok 7 pro zvýšení výtěţku DNA.

67

RESTRIKČNÍ ANALÝZA PURIFIKOVANÉ DNA 1. Do 1,5ml eppendorfky napipetuj směs dle následujícího návodu: Depc H20 10x pufr H DNA Enrym Eco RI Celkový objem

14,5 l 2 l 2 l 0,5 l 20 l

2. Promíchej pipetováním bez tvorby bublin 3. Umísti zkumavku do lázně vyhřáté na 37 °C na 1 hodinu 4. Pro zastavení reakce umísti zkumavku na led

68

PŘÍPRAVA 1% AGARÓZOVÉHO GELU 1. Navaţ 0,5 g agarózy 2. Odměř 50 ml pufru TAE 3. Smíchej obě sloţky v Erlenmeyerově baňce 4. Vloţ na 1 minutu do mikrovlnné trouby (protokol „High“) 5. Nech zchladnout na 37 °C. 6. Přidej 2 l Gold View (na obarvení DNA) a opatrně zamíchej bez tvorby bublin. 7. Vylij směs do gelové vaničky a vloţ hřebínek 8. Nechej alespoň 10 minut zatuhnout.

69

GELOVÁ ELEKTROFORÉZA DNA

1. Umísti gel do elektroforetické vany a přelij ji TAE pufrem 2. Smíchej vzorek DNA s nanášecím pufrem (celkový objem podle velikosti pouţitých komůrek, např. 20 μl) 3. Nanes vzorek na dno komůrek (přesně cílit, gel nesmí být protrţen a vzorek nesmí vyplavat) 4. Pro kontrolu elektroforézy a moţnost určení délky fragmentů nanes do jedné komůrky směs standardů (DNA marker) 5. Uzavři elektroforetickou vanu, zapoj elektrody ke zdroji, spusť zdroj elektrického proudu 70

6. Po proběhnutí elektroforézy výsledek zhodnoť s vyuţitím transiluminátoru (vazba Gold View barvy na řetězce DNA)

71

MĚŘENÍ KONCENTRACE DNA - s vyuţitím spektrofotometru Nanodrop 1. Spusť program na počítači 2. Nanes 1 l depc vody na kovovou ploténku a zapni měření (program se standardizuje) 3. Opatrně otři ploténku do sucha 4. Znovu nanes 1 l depc vody na kovovou ploténku a zapni „blank“, kterých se načte pozadí 5. Opatrně otři ploténku do sucha 6. Nanes 1 l vzorku a zapni „measure“, které ti stanoví koncentraci a čistotu DNA ve vzorku 7. Opatrně otři ploténku do sucha a je moţné pokračovat dalšími vzorky

72

Obsah ESF projekt „Od fyziologie k medicíně“ ZAČLENĚNÍ

VLASTNÍHO

2 VÝZKUMU

DO

5 KONCEPCE AKTUÁLNÍCH VĚDECKÝCH POZNATKŮ VĚDECKÉ DATABÁZE WEB OF KNOWLEDGE A 6 PUBMED 13 PREZENTACE VÝSLEDKŮ VÝZKUMU 15 PRÁCE S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY HISTORIE VÝZNAM ETICKÉ ASPEKTY PRÁVNÍ PŘEDPISY PŘEHLEDY OSVĚDČENÍ PRO PRÁCI S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY PROJEKT POKUSU VÝZKUM FUNKČNÍCH PLÁNŮ ORGANISMŮ CESTA K ROZLUŠTĚNÍ GENETICKÉHO KÓDU PROJEKT MAPOVÁNÍ LIDSKÉHO GENOMU SEKVENOVÁNÍ VYUŢITÍ VÝSLEDKŮ MAPOVÁNÍ LIDSKÉHO GENOMU GENOVÁ EXPRESE Transkripce Translace CÍLENÉ ZÁSAHY DO FUNKČNÍCH PLÁNŮ KLONOVÁNÍ RESTRIKCE Objev restrikčních enzymů Restrikční enzymy a jejich aplikace 73

15 16 16 17 20 23 24 25 28 31 34 38 41 42 44 46 46 51 52 53

RNA INTERFERENCE, UMLČOVÁNÍ GENŮ DVOUŘETĚZCOVOU RNA 57 MODIFIKACE U MYŠÍ S VYUŢITÍM EMBRYONÁLNÍCH KMENOVÝCH BUNĚK 59 PRAKTICKÉ ÚKOLY MANIPULACE S LABORATORNÍMI ZVÍŘATY LABORATORNÍ POTKAN ODBĚR KRVE U LABORATORNÍHO POTKANA PARAMETRY U LABORATORNÍHO POTKANA IZOLACE DNA RESTRIKČNÍ ANALÝZA PURIFIKOVANÉ DNA PŘÍPRAVA 1% AGARÓZOVÉHO GELU GELOVÁ ELEKTROFORÉZA DNA MĚŘENÍ KONCENTRACE DNA (NANODROP)

74

63 63 63 64 65 66 68 69 70 72