ISBN :978-602-73159-0-7
SEMINAR NASIONAL KIMIA DAN PENDIDIKAN KIMIA VII “Penguatan Profesi Bidang Kimia dan Pendidikan Kimia Melalui Riset dan Evaluasi” Program Studi Pendidikan Kimia Jurusan P.MIPA FKIP UNS Surakarta, 18 April 2015
MAKALAH PENDAMPING
BIOKIMIA
ISBN :978-602-73159-0-7
PREDIKSI MODEL PROTEIN PcpB DARI PENTAKLORPSEUDILIN BIOSINTESIS GEN KLUSTER DENGAN MENGGUNAKAN SWISS-MODEL Sri Mulyani1*, dan Karl-Heinz van Pee2 1 Prodi 2
P.Kimia, Fakultas KIP, Universitas Sebelas Maret, Surakarta, Indonesia
Institute for Biochemistry, Faculty of Mathematics and Nature Science, Technische Universitāt Dresden, Dresden, Germany
* Keperluan korespondensi, tel/fax : 0271-646994 ext 376, email:
[email protected]
ABSTRAK Expresi dan purifikasi protein dugaan NRPS domain PcpB dari Pentaklorpseudilinebiosyntesis gene cluster sudah dilakukan. Prediksi fungsi protein tersebut bisa dilakukan antara lain bila diketahui struktur proteinnya. SWISS-MODEL adalah salah satu program untuk memprediksi struktur protein berdasarkan homology modeling. Pembuatan model struktur berdasarkan homology modeling dilakukan dengan membandingkan sekuen homolog antara protein target dengan protein lain yang sudah diketahui struktur tiga dimensinya untuk dijadikan sebagai induk atau cetakan. Dalam hal ini diperlukan persamaan sekuen antara protein target dengan protein cetakan yang lebih besar dari 30% agar menghasilkan model yang baik, Model protein PcpB sudah dilakukan dengan program SWISS-MODEL dan menggunakan cetakan model NRPS adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A), Non-ribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A), dan Dalaninepoly(phosphoribitol) ligase (3dhv.1.A) yang masingmasing mempunyai kesamaan sekuen sebesar 37,23%; 35,90 % dan 33,62 %.
Kata Kunci: PcpB, Pentachloropseudilin, SWISS-MODEL dijumpai pada organisme daratan. Sebagi-
PENDAHULUAN Metabolit yang mengandung halogen
an besar metabolit berhalogen mempunyai
banyak ditemukan di alam. Untuk metabolit
aktivitas antibiotik, diantaranya pentaklor-
yang mengandung halogen
pseudilin
klor banyak
(Gambar
1).
ISBN :978-602-73159-0-7 Cl
Cl
SWISS-MODEL adalah salah satu
OH Cl
program untuk memprediksi struktur protein
Cl
N H
berdasarkan
homology
modeling
[6].
Pembuatan model struktur berdasarkan
Cl . Gambar 1.Struktur kimia pentaklorpseudilin
homology
dilakukan
modeling
dengan
membandingkan sekuen homolog antara protein target dengan protein lain yang
Pentaklorpseudilin
diproduksi
oleh
sudah diketahui struktur tiga dimensinya
bakteri Actinoplanes sp. ATCC 33002,
untuk
merupakan
template.
antibiotika
spektrum
luas
dijadikan Dalam
sebagai hal
ini
induk
atau
diperlukan
terutama untuk melawan bakteri gram
kesamaan sekuen antara protein target
positif dan negatif, jamur, dan dermatofita
dengan protein template yang lebih besar
[1]. Melalui studi pustaka genom terhadap
dari 30% agar menghasilkan model yang
DNA genom Actinoplanes sp. ATCC 33002
baik. Data base struktur template yang
diperoleh Cosmid pIWcos10 yang berukur-
digunakan oleh SWISS-MODELL diturun-
an 45.100 pasang basa [2]. Dari cosmid
kan dari Bank Data Protein.
tersebut telah diisolasi dan dikarakterisasi
Membangun Model homologi terdiri
diketahui
dari empat langkah utama, yaitu: (1)
berpartisipasi di dalam proses klorinasi
identifikasi struktur template, (2) alignment
selama biosintesis Pentaklorpseudilin [3].
urutan target dan struktur template, (3)
Selanjutnya
Cosmid
pembentukan model, dan (4) evaluasi
pIWcos10 dengan enzim restriksi SacI,
kualitas Model. Keempat langkah ini dapat
proses hibridisasi dengan gen halogenase
diulang sampai dicapai hasil pemodelan
dan studi homologi dengan data Gene
memadai.
gen
halogenase
Bank
dari
halB
yang
subkoning
dapat diidentifikasi 13 gen yang
langkah
Masing-masing memerlukan
dari
empat
perangkat
lunak
terlibat dalam Pentaklorpseudilin biosyn-
khusus serta akses ke urutan protein dan
thesis gene cluster, salah satunya adalah
database struktur yang up-to-date [6].
Gen pcpB [4]. Protein PcpB yang diduga bagian dari domain Non Ribosomal Peptide
METODE PENELITIAN
Synthetase (NRPS) yang terlibat dalam
Isolasi, Sub Kloning, Sekuensing pcpB
pembentukan pyrroyl-2-carboxy-S-PCP te-
Gen pcpB diisolasi dari pIwCos10
lah diexpresikan dan dimurnikan [5]. Untuk
dengan metode PCR yang menggunakan
prediksi
bisa
primer PcpB_for2 dan PcpB_rev [5].Hasil
dilakukan antara lain bila diketahui struktur
PCR dipotong dari gel dan diekstraksi
proteinnya. Untuk memprediksi struktur
dengan GeneJET Gel Extraction Kit dari
protein dapat dilakukan dengan metode
Fermentas
homology modelling. Metode ini membutuh-
enzim NcoI/EcoRI. Fragment NcoI/EcoRI
kan program khusus dan urutan serta
hasil PCR diligasi ke dalam vector ekspresi
database struktur yang up-to-date.
pMAL-c5X menghasilkan palsmid pSM-
fungsi
protein
tersebut
kemudian
dipotong
dengan
pcpB. Selanjutnya plasmid pSM-PMpcpB
ISBN :978-602-73159-0-7 ditransformasikan ke dalam E. coli TG1 dan discreening.
Plasmid pSM-PMpcpB yang
telah diisolasi dengan GeneJET plasmid miniprep
kit
dikirim
ke
MWG
untuk
disekuensing gen pcpB yang dikandungnya [5].
Ekspresi dan Purifikasi Protein PcpB Plasmid mengandung
pSM-PMpcpB gen
pcpB
yang
diekspresikan
dalam E. coli Rossetta 2 (DE3) pLysS dengan menggunakan medium LB yang mengandung
antibiotik
Ampicillin
dan
chloramphenicol. Kondisi optimum ekspresi dicari dengan memvariasi bufer dan pH ekstraksi, konsentrasi IPTG untuk induksi, temperatur dan waktu inkubasi. Purifikasi dilakukan dengan metode amylose affinity chromatography
dengan
menggunakan
bufer kromatografi dan bufer elusi seperti yang disarankan [7].
Prediksi Model Protein PcpB Prediksi
model
protein
PcpB
dilakukan dengan program SWISS-MODEL bedasarkan homology modeling [6,8].
HASIL DAN PEMBAHASAN Gen pcpB yang diisolasi dari plasmid pIwCos10 dengan metode PCR berukuran
Gambar 1. Urutan DNA gen pcpB. Urutan tidak bergarisbawah adalah primer PCR.
1507 pb dengan start codon GAC. Insersi gen tersebut kedalam vektor pMAL-c5X membentuk plasmid pSM-PMpcpB yang berukuran 7258 pb. Hasil sekuensing pcpB dapat dilhat dalam Gambar 1.
Gen
pcpB
dalam
plasmid
pSM-
PMpcpB berhasil diekspresikan dalam E. coli Rossetta 2 (DE3) pLysS dalam keadan larut. Untuk keperluan purifikasi ekspresi dilakukan
dalam
mengandung Ampicilin
medium
0,02%
dan
glukosa,
LB
yang
antibiotik
Chloramphenicol
dan
diinduksi dengan 0,6 mM IPTG setelah kultur diinkubasi pada 37oC selama 3 jam
ISBN :978-602-73159-0-7 (OD600 sekitar 0,6). Inkubasi kemudian dilanjutkan pada
30oC
selama semalam
dilakukan
dengan
menggunakan
satu
afinitas
langkah
kromatografy
PcpB
dengan resin amilosa. MalE-PcpB yang
berhasil dilakukan dengan menggunakan
terikat pada resin amilosa kemudian dielusi
buffer Kalium fosfat 0,1 M pH 7,2. Secara
oleh
teoritis PcpB mempunyai pI 5,8 sehingga
kromatografi (20mM Tris-Cl, 0,2 M NaCl,
tidak digunakan buffer pH sekitar 5,8
dan 1 mM EDTA).
(16-20
jam).
Ekstraksi
protein
10
mM
maltosa
dalam
bufer
akan
SWISS-MODEL workspace diguna-
mengendap bila dilarutkan dalam buffer
kan untuk memprediksi model protein
pada pH sama dengan pI nya. Oleh karena
PcpB.
itu untuk mengekstraksi PcpB dipilih buffer
model NRPS adenylation proteine CytC1,
dengan pH 7,2.
nama cetakan 3vnq.1.A (/templates/3e7x.1)
karena
secara
teoritis
PcpB
Dengan
menggunakan
cetakan
diperoleh model-template alignment dalam Hasil SDS PAGE ekspresi protein PcpB di dalam E. coli Rossetta 2 (DE3) pLysS berukuran 96 kDa. Ukuran ini merupakan
ukuran
fusi
protein
PcpB
dengan MalE. MalE tersusun dari 487 asam amino mempunyai ukuran 42,481 KDa.
Dengan
program
Expacy
PcpB
diketahui berukuran 53,759 KDa dengan pH isoelektrik (pI) sebesar 5,80 sedangkan Mal E mempunyai pI sebesar 5,08. Oleh karena
protein
hasil
ekspresi
berfusi
dengan MalE, maka ukuran ekspresi PcpB sebesar 96,240 KDa dan ukuran ini sesuai dengan yang terlihat dalam SDS PAGE. Vektor metode
pMAL-c5X
untuk
dan
memurnikan protein yang dihasilkan dari kloning gen. Gen PcpB yang disisipkan pada hilir dari gen malE dari E. coli, yang mengkode maltosa-binding protein (MBP), sehingga
di
dalam
ekspresinya
akan
menghasilkan fusi MalE-PcpB. MBP di dalam
vektor
pMAL-c5X
ini
telah
direkayasa untuk dapat mengikat amilosa dengan lebih kuat. Vektor ini menggunakan promotor “tac” dan sinyal inisiasi translasi malE untuk memberikan ekspresi tingkat tinggi
dari
kloning.
Purifikasi
gambar 2B Sedangkan bila menggunakan cetakan
model
Non-ribosomal
nama
synthetase,
(/templates/4gr5.1)
peptide
cetakan
4gr5.1.A
diperoleh
model-
template alignment dalam gambar 3A dan model proteinnya dalam gambar 3B. Kedua model cetakan ini diambil karena dari alignment cetakan terpilih mempunyai nilai kesamaan sekuen terhadap protein PcpB terbesar yaitu 37,23 % untuk model NRPS adenylation proteine CytC1 dan 35,90 % untuk
model
Non-ribosomal
peptide
synthetase (NRPS). Nilai ini memenuhi
menyediakan
mengekspresikan
gambar 2A dan model proteinnya dalam
dapat
untuk
menghasilkan
model
yang
baik
karena lebih besar dari 30%. Dari
kedua
model
cetakan
yang
dilpilih dan yang mempunyai kesamaan sekuen yang terbesar menunjukkan bahwa PcpB merupakan protein potensial yang mengkatalisis
proses
adenilasi
dari
kompleks enzim NRPS. Ini berdasarkan
ISBN :978-602-73159-0-7
B Gambar 3. (A) Model-template alignment dari PcpB terhadap cetakan model NRPS (4gr5.1.A) dan (B) model struktur protein-nya.
A
hasil analisis homologi dengan data GenBank menggunakan program Basic Local Alignment Search
B
Tool(BLAST)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) menunjukkan bahwa urutan asam amino PcpB
Gambar 2. (A) Model-template alignment dari PcpB terhadap cetakan model NRPS adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan (B) model struktur proteinnya.
mempunyai homologi tinggi dengan L-prolylAMP ligase dari S. rishiriensis (CouN4, 56% identity), S. roseochromogenes (CloN4, 56% identity), P. fluorescens Pf-5 (PltF, 49% identity),
Streptomyces
coelicolor A3(2)(RedM, 41% identity), Nocardia sp. CS682 (NgnN4, 58% identity), dan protein proline adenilasi dari Sorangium cellulosum (Leu5,
37%
homolologi
identity). tersebut,
mengusulkan A
merupakan
Berdasarkan maka
bahwa superfamily
grup
data kami
PcpB
merupakan
enzim
pembentuk
adenilat (AMP ligase) yang mengubah prolin dengan adanya ATP menjadi intermediet aktif AMP-prolin melaui reaksi adenilasi [9-15].
KESIMPULAN Model dilakukan
struktur dengan
protein
program
PcpB sudah SWISS-MODEL
ISBN :978-602-73159-0-7 dengan menggunakan cetakan model NRPS adenylation proteine CytC1 (3vnq.1.A) dan Nonribosomal peptide synthetase (4gr5.1.A) yang masing-masing mempunyai kesamaan sekuen sebesar 37,23% dan 35,90 %. Berdasarkan model struktur di atas dan hasil analisis homologi
dapat
diusulkan
bahwa
PcpB
merupkan AMP ligase bagian dari NRPS yang mengkatalisis melalui reaksi adenilasi untuk mengubah prolin menjadi intermediet aktif AMPprolin.
UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada Direktur DP2M Dikti yang telah memberikan dana penelitian melalui Hibah Kompetensi TA 2014 – 2015.
DAFTAR RUJUKAN [1] Cavalleri, B., Volpe, G., Tuan, G. Berti, M., Parenti., F., 1978, Curr. Microbiol. 1, 319324 [2] Wynands.I., 2007, Detektion und Uberexpression von Genen FADH2- abhängiger Halogenasen aus Actinoplanes sp. ATCC 33002Dissertation, Technische Universität Dresden, Dresden.
cluster homologous to NRPS domains involved in formation of pyrroyl-2-carboxylS-PCP”, Disampaikan dalam 7th International Seminar Indonesian Society For Microbiology (ISISM 2014) “Microbil Use for Human Welfare”, Padang, 13-18 Oktober, 2014. [6] Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., and Schwede, T., 2006, Bioinformatics, 22, 195-201. [7] New England Biolabs, 2014, pMAL Protein Fusion & Purification System, Instruction Manual, ed. Online: www.neb.com., diakses 16 Juni 2014. [8] Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., and Schwede, T., 2009, NatProtoc., 4, 1-13. [9] Kopp, M., Irschik, H., Gemperlein, K., Buntin, K., Meise, P., Weisssman, K.J., Bode, H.B., and Muller, R., 2011, Mol BioSyst, 7:15491563. [10] Maharjan, S., Aryal, N., Bhattaral, S., Koju, D., Lamchhane, J., and Sohng, J.K., 2012, Appl Microbiol Biotechnol, 93:687696 [11] Nowak-Thompson, B., Chaney, N., Wing, J.S., Gould, S.J., and Loper, J.E., 1999, J Bacteriol181:2166-74. [12] Pojer, F., Li, S.M., and Heide, L., 2002, Microbiology,148, 3901-3911.
[3] Wynands I., van Pee, K-H., 2004. FEMS Microbiol Lett, 237, 363-367.
[13] Thomas, M.G., Burkart, M.D., and Walsh, C.T., 2002, Chem Biol 9:171-184.
[4]
[14] Wang, Z.X., Li, S.M., and Heide, L., 2000, Antimicrob Agents Chemother,44:30403048.
Mann, K., 2005,Molekulargenetische Untersuchungen zur Biosynthese des Antibiotikums Pentachlorpseudilin. Dissertation, Technische Universität Dresden, Dresden.
[5] Mulyani, S., Dirgahayu, P., Weichold, V., and van Pee, K.-H., 2014. “Expression and Purification of 3 genes of the pentachlorpseudilin biosynthetic gene
[15] Xu, H., Wang, Z-X., Schmidt, J., Heide, L., and Li, S-M., 2002, Mol Genet Genomics, 268,387-396.
