PLAZMIDY • rozsáhlá skupina extrachromozomálních genomů • jsou tvořeny kruhovou dsDNA, která se replikuje nezávisle na chromozómu • velikost od 1,5 do 400 kb (1 kilobaze - jeden gen) • kryptické plazmidy nesou pouze geny pro existenci plazmidu • plazmidy mohou nést geny, které samy nepotřebují a doplňují genetickou informaci bakterie, což jí může zvýhodnit (adaptace na změny prostředí) Vir, Col, R plazmidy
PŘENOS GENETICKÉ INFORMACE •intracelulárně •intercelulárně vertikální přenos na přímé potomstvo kopií chromozomu, profágů nebo plazmidů horizontální přenos mezi nepříbuznými buňkami (i mezi různými druhy, rody)
A. INTERCELULÁRNÍ PŘENOS GI je zajišťován transdukcí, transformací a konjugací. 1.TRANSDUKCE je přenos zprostředkovaný bakteriofágy – přenášen je jakýkoliv fragment chromozomální nebo plasmidové DNA svou délkou odpovídající maximálně délce genomu fága, proto, že při maturaci fága může být omylem vbalen do kapsidy místo DNA vlastní (frekvence přenosu určitého genu je10-4 - 10-8)
– recipient se získanými vlastnostmi se označuje transduktant
2. TRANSFORMACE je přenos GI přímo čistou DNA, která vnikla do buňky recipienta z vnějšího prostředí.
•
frekvence přenosu max. 5.10-2
•
transformovaný příjemce se nazývá transformant
•
zvláštním případem transformace je transfekce (vnesení purifikovaného genomu fága vede k infekci a vytvoření kompletních bakteriofágů) mechanismus transformace je důležitým nástrojem šíření genů mezi bakteriemi uměle se vpravuje DNA do buněk elektroporací (vystavení buněk el. šoku, což vede ke krátkodobé depolarizaci BM a to umožní vniknutí cizorodé DNA do buněk) pro udržení a expresi musí být fragmenty DNA integrovány do chromozomu, plazmidu nebo profága
• •
•
3. KONJUGACE je přenos fragmentu DNA plasmidem z dárce na příjemce po navázání přímého kontaktu obou buněk pomocí sex pili dárce. – je to jednosměrný proces – fenotypicky změněný recipient je transkonjugant
B. INTRACELULÁRNÍ PŘENOS GI zajišťují transponovatelné elementy, inserční sekvence a transposony. Inserční sekvence (IS) - sobecké geny – IS jsou úseky DNA dlouhé 750-1500bp, které mají na koncích 20-40 párů bazí odpovídajících si pořadím v invertované repetici (IR). Proto se IS s pomocí IR mohou navzájem vázat – IS obsahují dále geny pro vlastní replikaci, vložení nové kopie do jiného místa téhož nebo jiného genomu, informaci pro tvorbu represoru, který brzdí replikaci a transpozici, aby nedošlo k inaktivaci genomu buňky porušením genů – v IS nebyly prokázány geny měnící fenotyp bakterie
Transposony (Tn) „skákavé geny“ jsou transponovatelné elementy dlouhé několik tisíc nukleotidů, které kromě genů pro translokaci a represi nesou ještě další, pro sebe nepotřebné informace – nejdůležitější vektor v intracelulárním přenosu GI – může přenést geny rezistence z chromozomu na plazmid a opačně – v Tn byly nalezeny geny řídící rezistenci k antibiotikům a chemoterapeutikům, těžkým kovům, UV záření, řídící tvorbu enterotoxinů, adherenčních fimbrií
Integrony jsou delší úseky DNA, které se mohou, podobně jako transposony, intracelulárně přemístňovat do různých míst DNA. Integron je to tedy integrovaný segment DNK, kterýobsahuje integrázu, promotor a integrační místo pro genové kazety – pravidelně obsahují gen řídící rezistenci k sulfonamidům – je součástí Tn 21 a některých R plasmidů Bakteriofág MU (mutátor) má unikátní způsob množení, DNA se replikuje reduplikací za současné translokace fágového genomu na různá místa chromozomu hostitele. – působí jako bakteriofág transdukující
ZMĚNY GENOMU BAKTERIÍ • mohou vznikat rekombinací nebo mutací Rekombinace je nové uspořádání znaků uvnitř genomu nebo výměna částí mezi různými genomy. Mutace jsou dědičné změny genomu vedoucí ke změněné funkci jeho složek. Vitální mutace - změna fenotypu buňky. Letální mutace - zahynutí buňky Spontánní mutace - změny genetického základu, které vznikají vlivem záření radionuklidů zemské kůry, kosmickým zářením, chemickými vlivy, chybami v replikaci (průkaz fluktuačním testem). Indukované mutace - vznikají záměrným zásahem člověka fyzikálními a chemickými mutageny (UV záření, beta částice, akriflavinová barviva, aktinomycin D).
STRUKTURA a REPLIKACE ŽIVOČIŠNÝCH VIRŮ • • • • • •
velikost virů od 20-300 nm viry nerostou, nedělí se a nemetabolizují viry mají genetický kód pro vlastní replikaci gen. informace je zapsána jen v jediném typu NK hostitelská buňka zpracovává virovou genetickou informaci jako svoji vlastní replikace virů se realizuje transkribcí a translací virového genomu prostřednictvím výbavy hostitelské buňky
•
viry nelze kultivovat v prostředí bez buněk
•
viry jsou tedy pomnožovány hostitelskou buňkou
Virion - virová částice Genom • cirkulární nebo lineární – DNA (Parvoviridae - jednovláknová) – RNA » +RNA - povaha iRNA » -RNA (přepis RNA polymerázou) » 2 komplementární vlákna RNA (Reoviridae)
• segmentace genomu (značná proměnlivost v antigenních a biologických vlastnostech) Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Reoviridae)
Kapsida - proteinový plášť - viry obalené - neobalené - helikoidální
a kubická symetrie
6
STRUKTURA A MNOŽENÍ MEDICÍNSKY VÝZNAMNÝCH KVASINEK • •
•
jsou to heterotrofní eukaryotní mikroorganismy (český název od zkvašovat) tvar buněk souvisí se způsobem vegetativního rozmnožování (pučením nebo dělením) - elipsoidní, vejčitý, lahvicovitý…Preudomycelium - dlouhá vlákna vznikající pučením u některých rodů se vytváří pravé mycelium vznikající příčným dělením protáhlých buněk (např. rod Candida)
MECHANISMUS ROZMNOŽOVÁNÍ KVASINEK • Vegetativní rozmnožování – pučení • Pohlavní rozmnožování – jedná se o spájení dvou haploidních buněk včetně jejich jader (karyogamie) – diploidní jádro se dělí meiozou ve čtyři haploidní jádra – haploidní jádra jsou základem spor nebo vznikají až další mitózou – v životním cyklu kvasinek se tedy pravidelně střídá haploidní a diploidní fáze buněk
PLÍSNĚ • •
mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy stélku plísní tvoří vlákna (hyfy), která jsou jednobuněčná (bez přepážek - třída Zygomycetes) nebo vícebuněčná s přepážkami
ROZMNOŽOVÁNÍ PLÍSNÍ • •
rozrůstáním hyf spory – vegetativním způsobem (nepohlavní spory) – spájením (pohlavní spory) Vegetativní spory se tvoří na vegetativních hyfách nebo na zvláštních fruktifikačních orgánech. Pohlavní spory vznikají spájením dvou buněk. • Homothalické rody (kmeny nejsou pohlavně rozlišeny) • Heterothalické rody (kmeny jsou typu + a -)
Přehled sterilizačních postupů Sterilitu farmaceutických přípravků můžeme dosáhnout v zásadě dvojím způsobem: 1) usmrcením všech mikroorganismů 2) odstraněním všech mikroorganismů Výhodnější (bohužel hůře proveditelný) je způsob druhý neboť i pozůstatky mrtvých mikrobů (endotoxiny, pyrogeny) mohou pacientovi škodit. ČSL uvádí celkem 15 sterilizačních postupů a současně udává jejich použití u jednotlivých sterilizovatelných léčiv. Uvedeme výčet lékopisných metod a parametrů jejich aplikace. a)
sterilizace teplem teplota
• •
žíhání v plameni horkovzdušná sterilizace s cirkulací vzduchu /horkovzdušný sterilizátor/
• •
zahřívání v oleji /olejový sterilizátor/ opakovaný var ve vodě /varný sterilizátor/ var ve vodě pod tlakem /tlakový sterilizátor/ opakované zahřívání v proudící páře /Arnoldův přístroj/ nasycená pára pod tlakem tlak 150 kPa 170 kPa 115°C 30 200 kPa 300 kPa
• • •
b) sterilizace zářením c) sterilizace chemická
čas (min.)
160°C 60 170°C 30 180°C 20 160°C 30 100°C 30 (opakuje se 3x po 24 h) 134°C 30 100°C 45 (opakuje se 3x po 24 h) 110°C 40 /autokláv/ 120°C 134°C
(doplnit rámeček) • záření gama v dávce 25 kGy
20 10
Kontrola sterilizačních postupů Až dosud měla u nás prioritu kontrola sterility, zaváděním lepších technologií a přechodem na evropské normy se prvořadou stává kontrola sterilizace. Kontrola sterilizačních procesů je nedílnou součástí správné výrobní praxe. Smyslem této kontroly je pravidelné ověřování efektivity sterilizačního děje a spolu s kontrolou sterility produktů slouží ke stanovení mikrobiologické nezávadnosti daného lékového přípravku. Protože existuje sterilizačních mechanismů, existují i rozdílné způsoby jejich kontroly. Nejčastěji se používají metody založené na registraci sterilizačních podmínek, dále se vyhodnocují změny fyzikálních nebo chemických indikátorů proběhlé sterilizace. Důležitá je biologická kontrola, při níž se používá nejodolnějších mikroorganismů vložených do sterilizačních prostor. Následná kultivace určí, zda byly testovací mikroorganismy usmrceny. Pokud ano, považuje se sterilizační proces za dostatečný i pro ostatní, méně odolné mikroby. •
Registrace sterilizačních podmínek se provádí pomocí zařízení zapisujících průběh fyzikálních veličin sterilizačního děje jako např. teplota, tlak, intenzita záření popř. koncentrace sterilizační látky atp. Většina moderních sterilizačních přístrojů má registrační zařízení, jeho záznam se stává součástí dokumentace každé výrobní šarže. Uvedený způsob neinformuje, zda sterilizace proběhla, ale dokládá, zda byly podmínky proto, aby sterilizace proběhnout mohla.
•
Indikátory sterilizačního děje (především tepelného) jsou tvořeny soustavami, které mění svou barvu nebo konzistenci, pokud bylo dosaženo žádané teploty a pokud tato působila patřičnou dobu. Dnes již obsolentní indikátor tohoto typu představuje ampulka se sráženou sírou, která taje při teplotě kolem 120°C a mění se v síru plastickou. Současně indikační systémy jsou dokládány ve formě samolepek, adhesivních pásek nebo jako součásti obalů pro balení sterilizovaného materiálu. Vedle toho jsou k dispozici trubičky obsahující indikátor sestavený tak, aby barevná změna nastala pouze v situaci (teplota, čas), která zcela odpovídá předepsaným podmínkám. Pro různé typy sterilizace jsou určeny odlišné indikátory, které nejsou navzájem zaměnitelné. Indikační trubičky umožňují kontrolu všech míst sterilizačního prostoru, pro jejich rozmisťování platí pravidla, jež mají zaručit objektivní výsledek kontroly. Biologické testy sterilizace využívají odolných spór bakteriálních druhů z rodu Bacillus. Spóry jsou většinou umístěny ve vhodném nosiči (keramické válečky, ampule, soustavy obsahující současně živné médium atd.). Při kontrole je třeba rozmístit nosiče spór rovnoměrně v celém prostoru, zejména do míst, kde lze očekávat nejmenší sterilizační účinek. Jeden nosič z použité série se ponechá mimo sterilizátor jako pozitivní kontrola růstu spór. Za účinný sterilizační proces lze považovat ten, při němž byly zničeny všechny životaschopné spóry (= žádný projev růstu při kultivaci) v nosičích podrobených sterilizaci. Rezistence použitých spór musí být dostatečná, tzn. musí být (alespoň několik v daném nosiči) schopno přežít podmínky jen o málo mírnější než předepsané sterilizační.
•
Příklady použitých spór bakterií a jejich kriterií rezistence: Sterilizace vodní parou pod tlakem nebo formaldehydem: B. stearothermophilus, musí přežít teplotu 120°C po dobu 5 minut (včetně odvzdušnění, sušení atd.), nesmí přežít stejné podmínky působící 15 minut. Sterilizace horkovzdušná: B. subtilis, musí přežít teplotu 160°C po dobu 9 minut. Stejné podmínky působící 30 minut musí všechny spóry likvidovat. Sterilizace etylénoxidem (EO): B. subtilis, musí přežít při koncentraci EO 600 plus-mínus (opravit!) 60g/l po dobu 15 minut. Stejné podmínky působící 120 minut musí všechny spóry likvidovat.
