Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy v Praze Katedra parazitologie
In vitro transformace larev helmintů infekčních pro definitivního hostitele
Petr Máslo Bakalářská práce Praha, 2008
Školitel: Mgr. Marta Chanová
Obsah Abstrakt ...............................................................................2 Úvod....................................................................................4 2. In vitro kultivace ..............................................................5 3. Helminti...........................................................................8 3. 1 Systematický přehled jednotlivých skupin helmintů .......8 3. 2 Biologie a kultivace.......................................................9 3. 2. 1 Motolice (Trematoda) ................................................9 3. 2. 1. 1 Cyklus ...................................................................9 3. 2. 1. 2 In vitro kultivace vybraných skupin motolic...........10 3. 2. 1. 2. 1 Fasciolidae ........................................................11 3. 2. 1. 2. 2 Echinostomatidae...............................................11 3. 2. 1. 2. 3 Schistosomatidae ...............................................12 3. 2. 1. 2. 3. 1 Zdroje pokusného materiálu ...........................12 3. 2. 1. 2. 3. 2 Aktivace infekčních stadií a následná kultivace........................................................12 3. 2. 1. 2. 4 Ostatní...............................................................12 3. 2. 2 Cestoda .....................................................................13 3. 2. 2. 1 Životní cyklus .......................................................13 3. 2. 2. 2. Kultivace ..............................................................14 3. 2. 3 Monogenea................................................................14 3. 2. 3. 1 Životní cyklus .......................................................15 3. 2. 3. 2 Kultivace ...............................................................15 3. 2. 4 Acanthocephala .........................................................15 3. 2. 4. 1 Životní cyklus .......................................................15 3. 2. 4. 2 Kultivace ...............................................................16 3. 2. 5 Nematoda ..................................................................16 3. 2. 5. 1 Životní cyklus .......................................................16 3. 2. 5. 2 Kultivace ...............................................................17 4. Závěr ...............................................................................18 5. Použitá literatura ..............................................................19
1
Abstrakt Tato práce shrnuje poznatky o in vitro kultivacích některých skupin helmintů. Jedná se především o motolice (Trematoda) s důrazem na čeleď Schistosomatidae, dále tasemnice (Cestoda), hlístice (Nematoda), vrtejše (Acanthocephala) a monogenea (Monogenea). Zabývá se kultivačními metodami a technikami, podmínkami kultivace a metodami in vitro transformace infekčních larev v dospělce. Klíčová slova: in vitro kultivace transformace helmint Trematoda Cestoda Nematoda Schistosomatidae
Abstract This work gathers known facts of in vitro cultivations of chosen groups of helminths: trematodes (Trematoda), with extra attention given to the family Schistosomatidae, cestodes (Cestoda), nematodes (Nematoda), acanthocephalans (Acanthocephala) and monogeneans (Monogenea). The focus of this work is gathering information about cultivation methodes and techniques, cultivation conditions and methodes of transformation in vitro from larval to adult stage. Key words: in vitro cultivation transformation
2
helminth Trematoda Cestoda Nematoda Schistosomatidae
3
Úvod Parazitismus je velmi rozšířeným fenoménem mezi téměř všemi skupinami živočichů. Helminti jsou systematicky poměrně nesourodá skupina, v mnoha ohledech však vykazuje společné znaky a trendy vývoje. Studiem interakcí s hostitelem je možno odhalit zásadní poznatky o imunologii, fyziologii nebo evoluční biologii. Nemoci, způsobené helminty, jsou také velmi významné medicínsky. Mezi 10 nejvýznamnějších parazitóz podle WHO spadají 2 helmintózy – schistosomiáza a onchocerkóza (http://www.who.int/tdr/diseases). Studie in vitro umožňují zkoumat biologii helmintů bez potřeby hostitele a detailněji popsat životní pochody parazitů. Dále umožňují nacházet možné antigeny pro další imunologické využití nebo články metabolismu, na něž je možno působit léčivy. Tato práce vznikla za účelem shrnutí metodiky in vitro kultivací některých skupin helmintů s důrazem na motolice čeledi Schistosomatidae. Jejich výzkum a v současné době i in vitro kultivace provádí laboratoř prof. Petra Horáka, kde bych chtěl pokračovat v navazujícím magisterském studiu a kde jsem se začal věnovat práci na kultivacích ptačích schistosom.
4
2. In vitro kultivace In vitro kultivace se provádějí z několika důvodů. Jedním z prvních je získání čisté kultury pro další výzkum, případně pro diagnostické účely, zejména v případě mikroorganismů. Dále v případě
méně běžných nebo obtížně
získatelných organismů, když je potřeba větší množství nepoškozených organismů, například pro morfologické srovnávací studie. In vitro kultivace jsou také vhodnou metodou pro studium biochemie a molekulární biologie kultivovaných organismů. V tomto případě je možno studovat metabolismus, sekreční a exkreční produkty, případně vliv různých látek na život kultivovaných organismů v dobře definovaném prostředí, s minimalizací rušivých vlivů. Pro užití in vitro kultivací v případě zkoumání parazitů může být dalším důvodem také minimalizovat potřebu hostitelských organismů v některých typech studií, ať již z technických či humánních důvodů. In vitro kultivace začaly s nástupem mikrobiologie. První kultivace prováděl Louis Pasteur v roce 1861, pomocí nichž zavrhl teorii samoplození živých organismů. Pasteur kultivoval bakterie v kapalných mediích, založených na masovém bujonu. V 80. letech 19. století Robert Koch zavedl kultivace na pevných mediích. V téže době také Petri vynalezl misku, která byla pro účely kultivace velmi vhodná. Kultivační systém pevného agarového media v Petriho misce je dodnes univerzálním a rutinně užívaným systémem pro kultivace bakterií. (http://nobelprize.org/) Roku 1885 Wilhelm Roux dokázal, že je možné uchovat živé tkáně ve fyziologickém roztoku. Ross G. Harrison v letech 1907 – 1910 provedl pokusy, podle nichž poté zformuloval metodiku kultivace tkáňových kultur. V 50. letech 20. století Harry Eagle studoval minimální nároky zvířecích buněk v kultuře a vyvinul medium, známé jako EMEM (Eagle´s Minimal Esential Medium, synonymum BME – Basam Medium Eagle). Toto přesně definované medium, obsahující aminokyseliny, vitaminy, soli a glukosu, modifikoval R. Dulbecco. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) je dodnes hojně používané medium. Oproti EMEM obsahuje více aminokyselin, glukosy, vitaminů a železo. (www.sigma-aldrich.com)
5
V 60. letech 20. století L. Hayflick a G. E. Moore, kteří se zabývali kulturami lidských fibroblastů, sestavili RPMI medium (Roswell Park Memorial Institute medium), které se rovněž dodnes využívá pod označením RPMI 1640. Toto medium je určené pro užití v atmosféře s 5% podílem oxidu uhličitého. In vitro kultivace helmintů se začaly rozvíjet v 50. letech 20. století, kdy byl zkoumán vývoj parazitů nebo jejich metabolismus a vliv prostředí na něj (např. Smyth 1949). Později byly zkoumány látky, které ovlivňují vývoj, metabolismus či schopnost nakazit dalšího hostitele. Tyto výzkumy v jisté míře pokračují i dnes. Jsou však stále častěji zastiňovány imunologickými studiemi, kdy jsou studovány molekuly vhodné jako antigeny pro vývoj vakcín (Romeih et al. 2008). Kultivace jsou prováděny za různých podmínek. Zásadní rozdíly jsou ve stavové fázi média a míře definovanosti systému. Fáze kultivačního média závisí spíše na kultivovaném organismu. Běžné je užití kapalných médií, pevných médií, ztužených nejčastěji agarem, a někdy se užívá také bifazických médií, kdy je část média kapalná a část pevná. Kapalná část obsahuje většinu potřebných zdrojů, pevná fáze slouží spíše jako substrát k uchycení organismů. Bifazických médií se využívá například při kultivaci některých tasemnic (Smyth, et al. 1966). Nejlépe definovaná média jsou ta, u kterých jsou známy všechny složky i jejich koncentrace a dovolují např. přesná měření metabolických aktivit. Při kultivacích, kdy není cílem zkoumat biochemické a metabolické procesy, je možno použít systémy s nižší mírou definovanosti. Zvláště v případě parazitů je často nutné dodávat suplementy, které jsou příliš komplexní, než aby je bylo možno dostatečně přesně popsat. Tyto suplementy mohou být pro život či správný vývoj in vitro nezbytné, nebo značně ovlivňují kvalitu kultivovaného materiálu (Douvres 1962). Často používanými a nezbytnými suplementy jsou různé buněčné kultury, např. BGE – Biomphallaria glabrata embryonic cells při kultivaci mezihostitelských stadií motolic, krvinky např. lidské erytrocyty při kultivaci lidských schistosom (Basch 1981) a krevní séra, ať již rozpuštěná, nebo jako pevná fáze kultivačního systému např. při kultivaci tasemnic (Smyth et al. 1966). V případě parazitů trávicí soustavy je
6
často nutné přidání žluči, žlučových kyselin nebo jejich solí, jako látek, stimulujících aktivaci infekčních stadií. Další podmínky, jako teplota, pH, osmolarita, zastoupení plynů v okolní atmosféře, osvit, apod., jsou dány především fyziologickými potřebami kultivovaného organismu a mohou rovněž značně ovlivňovat průběh kultivace, aktivaci infekčních stadií a dobu přežívání kultivovaných organismů v in vitro systému. Například nízké pH neumožňuje aktivaci larev vrtejšů, přestože ostatní podmínky jsou příznivé (Lackie 1974). Pro udržení sterility medií jsou kultivované organismy často ještě před kultivací omývány roztoky antibiotik (např. penicilin, gentamycin, streptomycin) a antimykotik (např. amfotericin B). Antibiotika jsou také často přidávána do medií, ovšem v mnohem menších koncentracích. Jelikož jsou některé složky kultivačních medií často citlivé na vyšší teploty, jsou media sterilizována filtrací (Milipore).
7
3. Helminti V následující kapitole je uveden taxonomický systém vybraných skupin helmintů, jejich životní cyklus a kultivace in vitro. V částech, zabývajích se kultivacemi in vitro, budou uvedeny především podmínky kultivace, nároky daných organismů a některé metody, používané při indukci transformace a při následné kultivaci. Zvláštní důraz je kladen na motolice, čeleď Schistosomatidae.
3. 1 Systematický přehled vybraných skupin helmintů podkmen: Neodermata třída: Trematoda čeleď: Fasciolidae Echinostomatidae Schistosomatidae Diplostomidae Microphallidae Cestoda Monogenea Acanthocephala Nematoda
8
3. 2 Biologie a kultivace 3. 2. 1 Trematoda Motolice jsou početná skupina obligátně parazitických helmintů se složitými vývojovými cykly. Cyklus může zahrnovat dva nebo tři hostitele. Definitivním hostitelem je obratlovec, ve kterém dochází k pohlavnímu rozmnožování. Mezihostiteli jsou bezobratlí nejrůznějších taxonomických skupin, prvním mezihostitelem bývá měkkýš. Z medicínského i veterinárního hlediska jde o významné parazity. 3. 2. 1. 1. Životní cyklus Motolice jsou většinou hermafroditi, výjimku tvoří gonochoristická čeleď Schistosomatidae. Po kopulaci v těle definitivního hostitele jsou produkována vajíčka. Tato jsou kladena v místech, odkud mohou opustit tělo hostitele, např. žlučovody (Fasciola hepatica), mezenterické cévy (Schistosoma mansoni), cévy močového měchýře (Schistosoma haematobium), lumen střeva (Notocotylus), nosní dutina (Trichobilharzia regenti). Z vajíčka se zpravidla ve vodním prostředí líhne larva zvaná miracidium. Miracidium je volně pohyblivé a nepřijímá potravu, energii získává ze zásobních látek. Do těla hostitele miracidium aktivně proniká penetrací tělní stěny nebo stěny trávicí soustavy (např. čeleď Notocotylidae). Miracidium odhazuje povrch (ciliární destičky) a mění se ve sporocystu. Povrch sporocysty tvoří syncitium a výživa probíhá přes něj. Další vývoj se mezi jednotlivými skupinami liší. Z mateřské sporocysty se mohou vytvořit dceřiné sporocysty (např. u čeledi Schistosomatidae) nebo redie (např. Echinostomatidae). Dceřiné sporocysty jsou lokalizovány v hepatopankreatu mezihostitele, nemají vyvinutou trávicí soustavu a živiny přijímají povrchem těla. Redie mají vyvinutou trávicí soustavu a aktivně přijímají potravu, kterou mohou být hostitelské tkáně nebo i motolice jiných druhů. Redie mohou produkovat ještě dceřiné redie a takto se v mezihostiteli významně namnožit. Klíčovou úlohou vývojových stadií, přítomných v měkkýších, je tvorba cerkárií. Cerkárie většinou opouštějí tělo mezihostitele. Jejich životaschopnost je časově značně omezená, protože postrádají trávicí soustavu a energii získávají
9
pouze ze zásobních látek. Cerkárie jsou pohyblivé a mohou, podobně jako miracidia, aktivně hledat dalšího hostitele a aktivně penetrovat do jeho těla. Při průchodu do těla hostitele odhazují glykokalyx a ocásek. Takto se chovají douhostitelské motolice např. z čeledi Schistosomatidae. Mnohé motolice však vytvářejí metacerkárie, ať již ve vnějším prostředí, nebo ještě v mezihostiteli (např. čeleď Leucochloridiidae). Metacerkárie jsou odolnější encystované infekční larvy, k vytvoření cysty jim slouží sady žláz. Do těla dalšího hostitele se dostávají pasivně s přijímanou potravou. Po proniknutí do těla hostitele metacerkárie excystují a larvy se usazují v preferované části trávicí soustavy, kde dospívají. Dospělé motolice mohou osidlovat i jiná místa v organismu, na která pronikají v průběhu transformace larva/dospělec. Příkladem takových lokalizací je Fabriciova burza ptáků (Leucochloridiidae),
mezenterické
cévy
či
cévy
močového
měchýře
(Schistosoma), srdce (Sanguicola), nosní dutina (Trichobilharzia regenti). Dospělé motolice mají vyvinutou trávicí soustavu a vyživují se střevní tráveninou nebo okolními tkáněmi. 3. 2. 1. 2. In vitro kultivace vybraných skupin motolic: Při kultivaci motolic jsou předmětem zájmu především dospělci a infekční larvy, tj. cerkárie nebo metacerkárie. Jako zdroj cerkárií či metacerkárií je možno použít buď laboratorní chovy, pokud se daří celý cyklus úspěšně udržovat v laboratorních podmínkách (např. Kook et al. 1997). Časté je získávání pokusného materiálu z přírodních zdrojů (např. Fredensborg a Poulin 2005) Je také možno použít dospělé motolice, získané pitvou definitivních hostitelů (McConville et al 2007). 3. 2. 1. 2. 1. Fasciolidae Cyklus F. hepatica je udržitelný v laboratorních podmínkách (Smyth 1990) a je tedy možno získat metacerkárie v libovolném množství. Excystace metacerkárií je stimulována snížením pH, zvýšením teploty a především působením žluči (Smyth 1990). Pro kultivaci dospělých stadií je možno úspěšně použít komerčně dostupného RPMI 1640 media s přídavkem 50% lidského krevního séra a 10
červených krvinek, při 37°C v atmosféře 8% CO 2 ve vzduchu. Vývoj in vitro je za těchto podmínek porovnatelný s vývojem in vivo v myších, s několika rozdíly. Pohlavní soustava se vyvíjí pouze rudimentálně a vývoj je celkově zpomalený (Smyth 1990). 3. 2. 1. 2. 2 Echinostomatidae V případě echinostomních motolic se kultivují jak dospělci, tak redie, vzhledem k hypotetickému využití v boji proti jiným motolicím. Tato práce je však zaměřena na transformaci posledních larválních stadií v dospělce a jejich následnou kultivaci in vitro. Redie se získávají především pitvou plžů a následným očištěním redií od hostitelských tkání. In vitro kultivovat redie je možno v mediu L-15, při 14°C, pH 7,8 a cca 780 mOsm (Gorbushin a Shaposhnikova 2002). Dospělé motolice je nejlépe získat excystací metacerkarií. Excystaci je nejlépe provést chemicky. Při mechanické
excystaci
(např.
jehlami)
dochází
často
k poškození
larev.
Excystační medium obvykle obsahuje 0,5% trypsinu a 0,5% žlučových solí v Earlově roztoku při pH 7,8 (Fried a Johnson 2005). 3. 2. 1. 2. 3 Schistosomatidae Dvouhostitelské motolice z čeledi Schistosomatidae jsou pravděpodobně nejvíce prozkoumané kvůli medicínskému významu. Cyklus je snadno udržitelný v laboratorních podmínkách s využitím vodních plicnatých plžů jako mezihostitelů a teplokrevných obratlovců jako definitivních hostitelů. 3. 2. 1. 2. 3. 1 Zdroje pokusného materiálu V případě
lidských
schistosom
(rod
Schistosoma)
je
používaným
mezihostitelem Biomphalaria glabrata a hlodavec – např. křeček, myš, potkan (Basch 1981; Eveland a Moorse 1975). V případě ptačích schistosom (rod Trichobilharzia) Lymnaea stagnalis, případně rod Radix, jako mezihostitel a kachna jako definitivní hostitel (Howell a Bourns 1974, Horák et al. 2002). Cerkárie opouštějí tělo hostitele ve zvýšené míře při intenzivním osvitu, čehož se využívá při jejich sběru. Dále je možno je znehybnit podchlazením na 11
cca 10°C (Smyth 1990) a koncentrovat jemnou centrifugací nebo volnou sedimentací a následnou dekantací. 3. 2. 1. 2. 3. 2 Aktivace infekčních stadií a následná kultivace První pokusy s in vitro kultivacemi prováděl Clegg (1965). Transformace byla zahajována využitím živých myší. 7 dní po penetraci do těla hostitele byly z plic získány již částečně transformované larvy, které byly dále kultivovány. In vitro transformace cerkárie na schistosomulum se dají bez užití živých hostitelů indukovat mechanicky nebo inkubačně. Mechanické způsoby zahrnují centrifugaci, míchání vortexem a opakované nasávání injekční stříkačkou (Basch 1981). Zejména opakované nasávání injekční stříkačkou je poměrně spolehlivé a technologicky snadné. Inkubační metody jsou založeny na využití aktivačních stimulů, které spouští odhazování glykokalyx a transformaci cerkárie ve schistosomulum. Inkubace je možno provádět za použití peritoneální tekutiny, získané z difusních komor pokusných zvířat, např. potkanů (Eveland a Morse 1975), v mediu zbaveném komplementu (Wang et al. 2006) nebo za použití ztužených želatinových membrán (Howell a Bourns 1973). Kultivace stadií, parazitujících v obratlovcích, probíhá v atmosféře 5% CO 2 ve vzduchu, při 37°C v případě savčích motolic (Basch 1981) a při 39 – 40°C v případě ptačích motolic (Howell a Bourns 1973). Jako základ kultivačního media se jeví vhodné Eaglovo medium (Basch 1981) nebo DMEM (Wanget al. 2006), s přidáním séra a krvinek hostitelských organismů (Basch 1981, Wang et al. 2006). Výsledky kultivací jsou srovnatelné s podmínkami in vivo, dochází však k tvorbě pouze malého počtu neživotaschopných a abnormálních vajíček (Smyth 1990). 3. 2. 1. 2. 4 Ostatní Kultivace ostatních skupin motolic jsou prováděny zejména při zvýšení výskytu nákaz lidí (Kook et al. 1997) a následné poptávce po antigenech, vhodných pro diagnostiku. Podmínky kultivace jsou v mnoha ohledech podobné jako při kultivacích výše zmíněných motolic, liší se zejména použitím tkání či tkáňových frakcí (séra, krvinky, apod.) a teplotou kultivace. Tyto faktory se přímo odvíjejí od biologie 12
přirozených
hostitelů.
Např.
při
kultivaci
Maritema
novaezealandesis
(Microphallidae) od stadia metacerkárie po dospělce se osvědčilo NCTC 109 medium, suplementované kuřecím sérem (Fredensborg a Poulin 2005). Zajímavé je využití kuřecích embryí, přesněji chorioallantois, při kultivacích Fibricola seoulensis (Diplostomidae). Tento systém vykazuje poměrně dobré výsledky, ale vývoj orgánových soustav je stále zpomalený a produkovaná vajíčka nejsou životaschopná. (Seo 1989.)
3. 2. 2 Cestoda Tasemnice jsou velmi rozšířenou a významnou skupinou střevních helmintů. Člověk a hospodářská zvířata mohou být jak definitivním hostitelem, tak mezihostitelem, a jedná se tedy o medicínsky i veterinárně velmi důležitou skupinu. 3. 2. 2. 1 Životní cyklus K pohlavnímu rozmnožování dochází ve střevě obratlovců. Tasemnice jsou hermafroditi, k oplození vajíček dochází buď mezi různými jedinci, nebo mezi různými články jednoho jedince. V tom případě dříve dozrávají samčí pohlavní žlázy, články se zralými samičími žlázami jsou tedy umístěny distálně od skolexu. Tasemnice nemají vyvinutou trávicí soustavu, potravu z okolní tráveniny přijímají celým povrchem těla. Z vajíčka, která mohou opouštět tělo hostitele jednotlivě, nebo ještě v uvolněném článku, vzniká první infekční larva (lykofora, onkosféra, nebo pohyblivé koracidium). Pozřením infekční larvy se nakazí mezihostitel. Mezihostitelem může být bezobratlý nebo obratlovec, v závislosti na skupině tasemnic. V mezihostiteli se první larva přeměňuje na stadium zvané metacestod, které se vyživuje povrchem těla a je infekční pro definitivního hostitele. Vývojový cyklus může zahrnovat pouze definitivního hostitele bez mezihostitele (např. rod Hymenolepis) nebo dva mezihostitele a definitivního hostitele (např. Ligula). U některých tasemnic je také běžné využívání paratenických hostitelů (např. Spirometra).
13
3. 2. 2. 2 Kultivace Kultivována jsou zejména larvální stadia, kdy je snahou transformace v dospělce. Smyth (1949) kultivoval plerocerkoidy Ligula intestinalis v peptonu při 40°C do stadia dospělce. Vývoj však byl výrazně zpomalený a vajíčka, produkovaná dospělými červy, nebyla životaschopná. Častým problémem v kapalných mediích je nedostatečná stimulace transformace v dospělé tasemnice (Smyth a Davies 1975). Tyto problémy mohou být způsobeny absencí pevného substrátu jako stimulačního agens. V případě Echinococcus granulosus se ukazuje být vhodným stimulantem psí nebo hovězí sérum koagulované teplem. Při použití séra rozpuštěného v mediu dochází pouze k vývinu cyst, stejně jako při použití agaru bez živin (Smyth et al. 1966). Systém, který dostatečně nestimuluje k transformaci v dospělce,
připomíná
situaci, kdy se cysta v hostiteli poškodí či je pozřena nevhodným hostitelem a dochází k vývoji dalších cyst a nikoliv dospělých červů. Berntzen (1962) publikoval také práci, ve které popisuje kultivační systém, v němž je možno kultivovat Hymenolepis nana od stadia cysticerkoidů po dospělce, vytvářející infekční vajíčka. Celý systém zajišťuje průtok čerstvého media přes kultivované organismy, výměnu plynů nad kapalnou fází media a užívá vcelku dobře definovaných kultivačních medií vlastní výroby. Nevýhodou je poměrně složitá konstrukce celého zařízení. Jako jedinou vhodnou atmosféru autor uvádí 5% CO 2 v N 2 . Další směsi plynů (100% N2 , 100% CO 2 , 5% CO 2 v O 2 a vzduch) se jsou pro správný vývoj nevhodné. Autor popisuje kultivaci při 37°C a 39°C, kdy vhodnější je teplota 39°C.
3. 2. 3 Monogenea Monogenea jsou skupinou helmintů, která parazituje zejména na rybách, případně žábách a některých bezobralých.
Většinou se jedná o ektoparazity,
výjimečně parazitují v močovém měchýři, močovodu nebo střevě. Vzhledem ke způsobu života jsou medicínsky úplně zanedbatelní, mohou však způsobovat značné škody na hospodářky významných druzích ryb, zejména v sádkách. Jediným známým druhem, který parazituje na teplokrevných obratlovcích, je Oculotrema hippopotami, parazitující v oku hrocha obojživelného.
14
3. 2. 3. 1 Životní cyklus Cyklus je přímý, bez mezihostitelů. Monogenea jsou hermafroditi, na hostiteli dochází k oplození a kladení vajíček do vody. Z vajíček se líhne infekční larva onkomiracidium, která hledá nového hostitele, přichycuje se na něm a dospívá. Zajímavostí je druh Diplozoon paradoxum, u kterého dochází na hostiteli ke splynutí 2 jedinců až na úroveň orgánů. 3. 2. 3. 1 Kultivace Jelikož se jedná většinou o ektoparazity volně žijících zvířat a jsou mimo medicínský zájem, jsou kultivace in vitro spíše ojedinělé a netýkají se dlouhodobého udržení dospělých červů. Tubbs et al. (2005), popisuje vliv teploty na líhnutí a další vývoj dvou druhů monogeneí (Benedenia seriolae a Zeuxaupta seriolae). Oba druhy byly vystaveny teplotě 13, 17,5 a 21°C. Výzkum byl prováděn pro zlepšení efektivity akvakultur kranase amerického (Seriola lalandi). 3. 2. 4 Acanthocephala Vrtejši jsou skupina helmintů, parazitujících v dospělosti ve střevě obratlovců. Veterinárně jsou vrtejši jen málo významní, medicínsky prakticky zanedbatelní, jelikož se u lidí vyskytují velmi zřídkavě a u hospodářských zvířat nezpůsobují významné škody. Vzhledem k menšímu významu pro člověka, v porovnání
například
s motolicemi
či
tasemnicemi,
jsou
vrtejši
méně
prozkoumanou a méně často studovanou skupinou. 3. 2. 4. 1 Životní cyklus Cyklus zahrnuje obratlovce jako definitivního hostitele a členovce, obvykle korýše nebo hmyz, jako mezihostitele. Vrtejši jsou gonochoristé, ve střevě obratlovce dochází k páření a kladení vajec. Vajíčka obsahují vyvinutou infekční larvu, nazývanou akantor. Ta se po pozření mezihostitelem uvolňuje a proniká do tělní dutiny mezihostitele. V tělní dutině vytváří poslední larvální stadium zvané cystakant, které je infekční pro definitivního hostitele. Po pozření mezihostitele definitivním hostitelem se cystakant uvolňuje a uchycuje se na střevní sliznici otrněným chobotem, případně penetruje stěnu střeva.
15
3. 2. 4. 2 Kultivace Protože jsou vrtejši mimo hlavní výzkumný zájem (především ve vztahu k medicíně), jsou i in vitro kultivace méně častým předmětem výzkumu. Lackie (1973) zkoumá stimuly, aktivující cystakanty Polymorphus minutus in vitro. Zásadním faktorem se jeví být pH a teplota, kdy při hodnotách pH 7,0 probíhá aktivace nejvíce, při mírně vychýlených hodnotách (pH 7,4; 6,7) je úspěšnost aktivace již výrazně nižší (cca 60%) a při poklesu pod pH 6,0 klesá pod 10%. Optimální teplota je 44°C. Významné jsou také žlučové soli, přidání kachní žluči či taurocholátu sodného významně přispělo k aktivaci cystakantů. 3. 2. 5 Nematoda Hlístice jsou zřejmě nejrozšířenější a nejvýznamnější skupinou helmintů. Nejedná se o ryze parazitickou skupinu, mnoho zástupců je volně žijících nebo fakultativně parazitujících. Hrají značnou roli jak medicínsky, tak veterinárně a hospodářsky. Jsou parazity nejrůznějších obratlovců, bezobratlých a jsou také významnými škůdci zemědělských plodin. V některých případech je také možno je využít pro biologický boj s hmyzem (např. Steinernematidae). 3. 2. 5. 1 Životní cyklus Hlístice jsou gonochoristé, ovšem časté jsou případy partenogeneze, hermafroditismu, aj. Hlístice jsou velmi různorodá skupina, společným znakem ve vývoji jsou 4 larvální stadia. Larvy mohou být přímo infekční, nebo mohou nějaký čas žít ve vnějším prostředí. Vývoj může být buď přímý, nebo s mezihostitelem. Časté jsou infekce paratenických hostitelů. V definitivním hostiteli jsou kladena vajíčka. Nejsou však příliš ojedinělé skupiny viviparní či ovoviviparní. Z vajíček se líhne larva L1, která může přímo ještě v hostiteli pronikat do dalších tkání (např. Trichinella), přežívat omezenou dobu ve vnějším prostředí (např. Ancylostoma), může být pozřena mezihostitelem (Dracunculus). Následně se mění v larvu L2. Tato může opět žít ve volném prostředí či se měnit v poněkud odolnější dauer larvu. Larva L3 bývá již
16
většinou infekční a nakažuje hostitele buď aktivně (např. Ancyloma) nebo je pozřena (např. Dracunculus nebo Filariodea). 3. 2. 5. 1 Kultivace Kultivace in vitro se zabývají především parazity savců a vývojem infekčních stadií po stadium dospělce. V případě tkáňových parazitů je vhodným kultivační mediem RMPI 1640 s přídavkem inaktivovaného hovězího séra s 5% CO2 v plynné fázi (Iglesias et al. 2002). Douvres a Tromba (1970) popisují použití NCTC 109 media s přídavkem kvasinkového extraktu, peptonu a dextrosy pro kultivaci Ascaris suum s poměrně dobrými výsledky, ovšem plného vývoje dosahují kultury v mediu vlastní přípravy KW-1A, při pH 6,9, 39°C s 5% CO2 v plynné fázi. Při kultivaci filárií Dipetalonema vitae bylo použito směsi NCTC 135 s RPMI 1640 s příměsí 20% fetálního hovězího séra (Franke a Weinstein 1984). V kultuře docházelo k vývoji L3 po adulty. Iglesias (2001) popisuje přidání pepsinu, jako klíčové složky pro kultivaci Anisakis simplex od stadia L3 do adulta. Pro kultivaci parazitů trávicího traktu jsou media většinou hůře definovaná, používá se často také trávenina odebíraná z pokusných zvířat (Hertzberg et al. 2002).
17
4. Závěr Kultivace in vitro jsou v současné době standardní metodou pro výzkum některých skupin parazitických helmintů, především těch skupin, které jsou v centru medicínského zájmu (tasemnice, hlístice, motolice). Podmínky kultivací jsou velmi podobné, souvisí spíše s podobnostmi a rozdíly hostitelských organismů nebo lokalizací parazita. Společným znakem bývá potřeba 5% CO2 a suplementace media tkáněmi či tkáňovými frakcemi. Právě tyto suplementy svojí komplexitou často omezují používání některých metod (např. biochemické a proteinové analýzy) a tím i případný aplikovaný výzkum. Častým jevem je také neschopnost kultivovaného organismu pohlavně dospívat nebo vytvářet životaschopná vajíčka. Základní výzkum podmínek pro kultivace in vitro je proto velmi potřebný, ale obvykle se mu nedostává dostatečné pozornosti.
18
5. Použitá literatura Smyth JD. 1990. In vitro cultivation of parasitic helminths. CRC Press. pp276 Franke ED, Weinstein PP. 1984. In vitro cultivation of Dipetalonema vitae thirdstage larvae: evaluation of culture media, serum and other suplements. J. Parasit. 70: pp618 - 628 Herzberg H, Huwyler U, Kohler L, Rehbein S, Wanner M. 2002. Kinetics of exsheathment of infective ovine and bovine strongylid larvea in vivo and in vitro. Parasitology 125: pp65 – 70 Smyth JD, Davies Z. 1975. In vitro suppression in Echinococcus multilocularis with morphological transformation of protoscoleces into monozoic adults. Parasitology 71: pp125 - 135 Fredensborg
BL,
novaezealandensis
Poulin
R.
2005.
(Microphallidae):
In
vitro
cultivation
the
effect
of
culture
of
Maritema
medium
on
excystation, survival and egg production. Parasitol. Res. 95: pp310 – 313 Smyth JD, Howkins AB, Barton M. 1966. Factors controlling the differentiation of the hydatid organism, Echinococcus granulosus, in cystic or strobilar stages in vitro. Nature 211: pp1374 – 1377 Howell MJ, Bourns TKR. 1974. In vitro culture of Trichobilharzia ocellata. Int. J. Parasit. 4: pp471 – 476 Eveland LK, Morse SI. 1975. Schistosoma mansoni: in vitro conversion of cercariae to schistosomula. Parasitology 71: pp 327 – 335 Douvres FW. 1962.The in vitro cultivation of oesophagostomum radiatum, the nodular worm of cattle. I. Development in vitamin-supplemented and nonsupplemented media. J. Parasit. 48: pp314-320
19
Kook J, Lee SH, Chai JY. 1997. In vitro cultivation of Gymnophalloides seoi metacercariae (Digenea: Gymnophallidae). Korean J. Parasit. 35: pp25 – 29 Basch PF. 1981. Cultivation of Schistosoma mansoni In vitro. I. Establishment of Cultures from Cercariae and Development until Pairing. J. Parasit. 67: pp179 – 185 Gorbushin AM, Shaposhnikova TG. 2002. In vitro culture of the avian echinostome Himasthla elongata: from redia to marita. Exp. Parasit. 101: pp234 – 239 Seo BS. 1989. Comparative growth and development of the metacercariae of Fibricola seoulensis (Trematoda: Diplostomidae) in vitro, in vivo and on the chick chorioallantois. Korean J. Parasit. 27: pp231 – 248 Fried B, Johnson PTJ. 2005. In vitro excystment of metacercariae of Ribeiroia ondatrae. Parasitol. Res. 95: pp293 – 295 Wang W, Kirschfink M, Ruppel A. 2006. Schistosoma japonicum and S. mansoni cercariae: different effects of protein in medium, of mechanical stress, and of an intact complement system on in vitro transformation to schistosomula. Parasitol. Res. 99: pp269 – 274 McConville M, Brennan GP,
McCoy
M, Castillo R, Hernandez-Campos A,
Ibarra F, Fairweather I. 2006. Immature triclabendazole-resistant Fasciola hepatica: tegumental responses to in vitro treatment with the sulphoxide metabolite of the experimental fasciolicide compound alpha. Parasitol. Res. 100: pp365–377 Smyth JD. 1949. Studies on tapeworm physiology. IV Further observations of the development of Ligula intestinalis in vitro. J. Exp. Biology 26: pp1 – 14
20
Berntzen AK. 1962. In vitro cultivation of tapeworms. II. Growth and maintenance of Hymenolepis nana in vitro (Cestoda: Cyclophyllidea). J. Parasit. 48: pp785 – 797 Tubbs LA, Poortenaar CW, Sewell MA, Diggles BK. 2005. Effects of temperature on fecundity in vitro, egg hatching and reproductive development of Benedenia seriolae and Zeuxapta seriolae (Monogenea) parasitic on yellowtail kingfish Seriola lalandi. Int. J. Parasit. 35: pp315 – 327 Douvres FW, Tromba FG. 1970. Influence of pH, serum and cell cultures on development of Ascaris suum to fourth stage in vitro. J. Parasit. 56: pp238 – 248 Clegg JA. 1965. In vitro cultivation of Schistosoma mansoni. Parasitology 16: pp133 – 147 Romeih MH, Hassan HM, Shousha TS, Saber MA. 2008. Immunization against Egyptian Schistosoma mansoni infection by multivalent DNA vaccine. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 40(4): pp327-38 Horák P, Kolářová L, Adema CM. 2002. Biology of Schistosome genus Trichobilharzia. Adv. Parasit. 52: pp156 – 233 Lackie
AM.
1974.
Activation
of
cystacanths
of
Polymorphus-minutus
(Acanthocephala) in vitro. Parasitology 68: pp135 – 146 Iglesias L, Valero A, Gálvez L, Benítez R, Adhorer FJ. 2002. In vitro cultivation of Hysterothylacium aduncum (Nematoda: Anisakidae) from 3-rd stage larvae to egg-laying adults. Parasitology 125: pp467 – 475 Iglesias L, Valero A, Benítez R, Adhorer FJ. 2000. In vitro cultivation of Anisakis simplex: pepsin increases survival and moulting from fourth larval to adult stage. Parasitology 123: pp285 – 291 URL: <www.sigmaaldrich.com>, [2008-08-10] 21
URL: <nobelprize.org>, [2008-08-10]
22
