PERUBAHAN STRUKTUR FENANTRENA SELAMA PROSES BIODEGRADASI OLEH BAKTERI BACILLUS ALTITUDINIS
LAELA ROCHDIANA
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK LAELA ROCHDIANA. Perubahan Struktur Fenantrena Selama Proses Biodegradasi oleh Bakteri Bacillus altitudinis. Dibimbing oleh CHARLENA dan MUHAMMAD KHOTIB. Pencemaran lingkungan oleh hidrokarbon polisiklik aromatik (PAH) yang diketahui bersifat toksik, mutagenik, dan karsinogenik telah meluas di lingkungan. Beberapa jenis bakteri dapat menggunakan PAH sebagai sumber energi untuk metabolisme. Fenantrena merupakan salah satu PAH dengan 3 cincin aromatik, dan senyawa ini dapat didegradasi oleh bakteri Bacillus altitudinis. Hasil yang diperoleh selama 28 hari kultivasi dengan fenantrena 50 ppm dengan tambahan Tween 80 sebagai surfaktan menunjukkan laju degradasi sebesar 14%. Parameter yang diamati adalah total plate count (TPC) dan pH. Nilai TPC meningkat dari hari ke-0 hingga hari ke–28. Nilai pH juga mengalami peningkatan selama 28 hari kultivasi. Perubahan struktur yang terjadi selama 28 hari kultivasi diduga terjadi melalui jalur asam ftalat yang ditunjukkan dengan adanya spektrum massa asam ftalat pada waktu retensi 7.607 dengan mutu kemiripan sebesar 72. Kata kunci: biodegradasi, fenantrena, bacillus altitudinis
ABSTRACT LAELA ROCHDIANA. Structural Changes of Phenanthrene On Biodegradation by Bacillus altitudinis. Supervised by CHARLENA and MUHAMMAD KHOTIB. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are toxic, mutagenic, and carcinogenic pollutants that are present in environment. Some bacterial species have ability to metabolize these compounds and use them as energy sources for their growth. Bacillus altitudinis was used to degrade phenanthrene, a three-ring aromatic PAH. The maximum degradation rate (14%) was obtained when Bacillus altitudinis was cultured for 28 days after the addition of 50 ppm phenanthrene to the liquid medium. Furthermore, the degradation was affected by addition of Tween 80 as surfactants. The observation parameters were total plate count (TPC) and pH. The value TPC increased for 28 days cultivation and pH value increased too from 6 to 8 during the 28 days cultivation. The mechanism of degradation was determined through identification of metabolites, the possible pathway of phenanthrene degradation is via phthalic acid. It has been proofed by a mass spectrum of phthalic acid at retention time of 7.607 with match quality of 72. Keyword : biodegradation, phenanthrene, bacillus altitudinis
PERUBAHAN STRUKTUR FENANTRENA SELAMA PROSES BIODEGRADASI OLEH BAKTERI BACILLUS ALTITUDINIS
LAELA ROCHDIANA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul Nama Nrp
: Perubahan Struktur Fenantrena Selama Proses Biodegradasi oleh Bakteri Bacillus altitudinis : Laela Rochdiana : G44062794
Menyetujui Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Charlena, M.Si NIP 196712221994032002
Muhammad Khotib, S.Si, M.Si NIP 197810182007011002
Mengetahui Ketua Departemen Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB
Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS NIP 195012271976032002
Tanggal lulus :
PRAKATA Segala puji bagi Allah SWT berkat limpahan rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Januari sampai Juli 2011 yang bertempat di Laboratorium Terpadu, kampus Institut Pertanian Bogor Baranangsiang dan Laboratorium Kromatografi Pusat Laboratorium Forensik, Jakarta. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Charlena, M. Si selaku pembimbing pertama dan Bapak M.Khotib, S. Si, M. Si selaku pembimbing kedua yang telah banyak memberikan petunjuk dan dukungan kepada penulis. Penulis juga mengucapkan kepada Bapak M.Farid, S. Si dan M.Zaki, STP yang telah memberikan arahan dan masukan dalam menyusun karya ilmiah ini dan kepada Bapak Jaswanto dari Pusat Laboratorium Forensik yang telah membantu dalam menggunakan instrumen di Laboratorium Forensik. Ungkapan terima kasih kepada Ayah, Mama, Kakak (Wachyu Maslecha), dan seluruh keluarga atas semangat, kasih sayang, dan dukungannya. Ucapan terima kasih kepada Mba Lita yang telah bersama-sama melakukan penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada sahabat-sahabat Nadya, Shelin, Echy, Witi yang telah memberikan bantuan, semangat, motivasi, dan dorongan dalam menyusun karya ilmiah ini dan kepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat menambah wawasan ilmu pengetahuan bagi penulis khususnya dan pembaca umumnya.
Bogor, November 2011
Laela Rochdiana
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta, 14 Mei 1988 sebagai anak kedua dari dua bersaudara, putri dari pasangan Tarmudji dan Kiki. Tahun 2006 penulis lulus dari SMA Negeri 49 Jakarta dan melanjutkan studi di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB melalui jalur USMI. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Anorganik S–1 Kimia pada tahun ajaran 2009/2010. Pada tahun 2008 penulis juga pernah mengikuti kegiatan Praktik Lapangan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Minyak dan Gas Bumi PPPTMGB “LEMIGAS” dengan judul laporan Pembuatan Aditif Peningkat Indeks Viskositas Minyak Lumas dari Kopolimerisasi LKA-Stirena dengan Inisiator Benzoil Peroksida.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... vii DAFTAR TABEL .......................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... vii PENDAHULUAN ..........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Hidrokarbon Aromatik Polisiklik (PAH) ............................................. Fenantrena ........................................................................................... Biodegradasi ....................................................................................... Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Biodegradasi ................................ Surfaktan dan Tween 80 ......................................................................
1 2 2 3 4
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .................................................................................... Pembiakan Isolat ................................................................................. Uji Toksisitas ...................................................................................... Preparasi Inokulum pada Media Kaya dan Media Minimal .................. Aplikasi pada Sampel Fenantrena ........................................................ Analisis TPC ....................................................................................... Analisis pH ......................................................................................... Analisis GC-MS ..................................................................................
4 4 5 5 5 5 6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Peremajaan Bakteri ............................................................................. Uji Toksisitas ...................................................................................... Aplikasi pada Fenantrena ....................................................................
6 6 8
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................. 10 Saran ................................................................................................... 10 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 10 LAMPIRAN ................................................................................................... 12
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur fenantrena .....................................................................................
2
2 Reaksi degradasi fenantrena .......................................................................
3
3 Struktur Tween 80 ......................................................................................
4
4 Media kaya dan blanko ...............................................................................
6
5 Media minimal dengan solar 1%, 3%, dan 5% ............................................
6
6 Uji toksisitas konsentrasi 1000 dan 500 ppm ..............................................
7
7 Uji toksisitas konsentrasi 0 dan 50 ppm .....................................................
7
8 Nilai absorbansi uji toksisitas media cair ....................................................
7
9 Hasil pengukuran pH ..................................................................................
8
10 Hasil uji TPC hari ke-0 dan 28 ...................................................................
8
11 Kromatogram fenantrena hari ke-0 dan 28 ..................................................
9
12 Kromatogram asam ftalat pada sampe hari ke-28 .......................................
9
13 Jalur perubahan struktur fenantrena ............................................................ 10
DAFTAR TABEL Halaman 1 Tabel komposisi media kaya dan minimal ..................................................
5
2 Tabel area kromatogram fenantrena ............................................................
8
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian ............................................................................... 12 2 Komposisi media marine agar. ................................................................... 13 3 Spektrum massa asam ftalat ........................................................................ 14
1
PENDAHULUAN Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) merupakan salah satu senyawa pencemar lingkungan yang bersifat toksik, mutagenik, dan karsinogenik (Hadibrata dan Tachibana 2009). Senyawa ini banyak ditemukan sebagai hasil pembakaran bahan bakar selama proses dekomposisi termal. Tumpahan hasil eksplorasi dan eksploitasi minyak bumi juga merupakan salah satu sumber cemaran PAH di lingkungan (Yirui 2010). Penyebaran PAH yang luas di lingkungan menyebabkan banyak cara dikembangkan untuk mengurangi jumlahnya di lingkungan. Biodegradasi merupakan salah satu cara yang banyak digunakan karena merupakan metode ramah lingkungan, cukup efektif dan efisien, serta ekonomis (Morgan dan Watkinson 1994). Degradasi hidrokarbon dapat dilakukan dengan memanfaatkan mikroorganisme seperti bakteri. Hal ini disebabkan oleh bakteri dilengkapi dengan sistem metabolisme yang dapat menggunakan hidrokarbon sebagai sumber energi dan karbon. Kemampuan mikroorganisme dalam mendegradasi hidrokarbon telah dieksploitasi sejak tahun 70-an dan 80-an pada lahan pertanian tempat pembuangan minyak (Bossert dan Kosson, 1997). United State Environmental Protection Agency (USEPA) telah menetapkan daftar 16 PAH yang menjadi senyawa pencemar utama di lingkungan, salah satunya adalah fenantrena. Fenantrena diketahui dapat menyebabkan alergi pada manusia. Selain itu fenantrena juga termasuk ke dalam daftar klasifikasi 16 PAH penyebab kanker pada The International Agency for Research on Cancer (IARC 2002). Biodegradasi fenantrena dibatasi oleh kemampuannya untuk larut dalam media cair. Penambahan surfaktan dapat digunakan untuk meningkatkan kelarutan fenantrena dalam air. Tween 80 telah diketahui sebagai surfaktan non ionik yang dapat meningkatkan kelarutan dan biodegradasi fenantrena dalam media cair. Penelitian Hadibrata dan Tachibana (2009) menunjukkan pengaruh penambahan surfaktan Tween 80 pada biodegradasi fenantrena oleh fungi Polyporus sp.S133. Penggunaan Tween 80 dengan konsentrasi 0.05% (b/v) menunjukkan degradasi fenantrena sebesar 92%. Peningkatan konsentrasi Tween 80 akan meningkatkan kecepatan biodegradasi fenantrena. Secara umum, bakteri akan mengoksidasi fenantrena dengan enzim dioksigenase dan menghasilkan
cis-dihidrodiol fenantrena. Metabolisme lebih lanjut akan menghasilkan asam 1-hidroksi-2naftanoat dan asam protokatekuat atau katekol (Cerniglia 1993). Penelitian Murniasih (2009) menunjukkan bahwa terjadi penurunan konsentrasi fenantrena menjadi 59.5% selama 29 hari kultivasi oleh bakteri Pseudomonas sp KalP3b22. Penentuan senyawa hasil degradasi menunjukkan adanya senyawa 1-naftalenol. Penelitian kali ini akan dilakukan pada sampel fenantrena yang diolah dengan biodegradasi dengan bakteri Bacillus altitudinis dan dianalisis perubahan senyawanya menjadi senyawa yang lebih sederhana menggunakan instrumen kromatografi gas spektroskopi (GC-MS ).
TINJAUAN PUSTAKA Hidrokarbon Aromatik Polisiklik (PAH) Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) merupakan golongan senyawa organik yang tersusun dari gabungan dua atau lebih cincin aromatik. Terdapat lebih dari 100 jenis PAH, baik dalam bentuk gas maupun padatan tidak berwarna, putih, atau kuning kehijauan. Secara umum PAH terdapat sebagai campuran yang kompleks bukan sebagai senyawa tunggal (ATSDR 1990). PAH seringkali ditemukan secara alami, namun dapat dibuat sebagai senyawa tunggal untuk keperluan penelitian. Sumber alami PAH berasal dari emisi gunung berapi dan kebakaran hutan. PAH yang dihasilkan dari sumber buatan jumlahnya lebih besar dibandingkan sumber alami. PAH yang terdapat di atmosfer dapat berasal dari pembakaran tidak sempurna batu bara, minyak, gas, kayu, sampah, atau bahan organik lainnya. Emisi kendaraan bermotor juga merupakan salah satu sumber utama cemaran PAH di atmosfer. PAH juga dapat ditemukan di tanah dan permukaan air. PAH yang mencemari permukaan air dan tanah dapat berasal dari buangan industri atau tumpahan hasil eksplorasi dan eksploitasi minyak bumi (ATSDR 1990). PAH dapat berpindah dari media yang berbeda di lingkungan, seperti atmosfer, air, tanah, dan sedimen (Yirui 2010). Pergerakan PAH di lingkungan bergantung pada kemampuannya untuk larut dalam air dan kemudahannya menguap di udara. Secara umum, PAH memiliki kelarutan yang rendah di air dan afinitas tinggi terhadap karbon organik. PAH yang terdapat di udara dapat berada dalam bentuk uap atau menempel pada per-
2
mukaan partikel padatan. PAH akan tetap berada di udara hingga turun hujan dan jatuh ke permukaan atau terjadinya pengendapan partikel. Beberapa PAH menguap ke atmosfer dari permukaan air, namun karena sifatnya yang hidrofobik, sebagian besar ditemukan terjerap pada partikel yang mengendap di bawah permukaan air atau tersuspensi pada air. Pada tanah, PAH sebagian besar terikat kuat pada partikel tanah. Beberapa jenis senyawa PAH yang banyak ditemukan pada lingkungan antara lain asenaftena, antrasena, krisena, fluorantena, fluorena, fenantrena, dan pirena (ATSDR 1990). Banyak PAH yang diketahui sebagai senyawa polutan yang bersifat toksik, karsinogenik, dan mutagenik sehingga berpotensi merusak kesehatan manusia. (Dipple 1990). Hal ini dikarenakan sifatnya yang lipofilik. PAH dapat masuk ke dalam semua jaringan tubuh manusia yang mengandung lemak. Senyawa ini cenderung akan terakumulasi di ginjal, liver, dan lemak. Pada jumlahnya yang lebih sedikit, PAH akan tersimpan pada limfa, kelenjar adrenalin, dan ovarium. PAH diubah menjadi zat yang berbeda dalam jaringan manusia. Beberapa zat akan bersifat lebih berbahaya dan beberapa lainnya kurang berbahaya dibandingkan senyawa PAH semula. Beberapa penelitian pada hewan menunjukkan bahwa PAH tidak akan tersimpan dalam tubuh untuk waktu lama. Beberapa PAH yang masuk ke tubuh akan keluar dari tubuh melalu feses dan urin setelah beberapa hari (ATSDR 1990). Fenantrena Berdasarkan jumLah cincin aromatiknya, PAH dapat dibagi menjaid dua jenis, yaitu Low Molecular Weight (LMW) dengan 2-3 cincin aromatik dan High Molecular Weight (HMW) dengan cincin aromatik lebih dari 4. Secara umum, kecepatan degradasi akan berbanding lurus dengan jumalah cincin aromatiknya. Sehingga LMW PAH seperti naftalena, antrasena, dan fenantrena akan lebih mudah didegradasi dan biasanya digunakan sebagai contoh PAH untuk pemahaman mekanisme degradasi pada HMW-PAH (Cerniglia dan Sutherland 2010). Fenantrena merupakan salah satu jenis PAH yang terdiri dari 3 cincin aromatik. Senyawa ini memiliki rumus molekul C14H10 dengan massa molar 178.2 g mol-1. Fenantrena merupakan padatan tidak berwa-rna dengan titik lebur 100oC dan titik didih 340oC. Seperti PAH yang lain, fenantrena memiliki sifat
hidrofobik, dengan kelarutan sebesar 1.2 mg L-1 (Gambar 1).
dalam
air
Gambar 1 Struktur fenantrena Fenantrena biasanya digunakan untuk membuat plastik, pestisida, bahan peledak, dan obat-obatan. Ketika PAH seperti fenantrena terlepas di lingkungan, tidak selalu terjadi pemaparan ke manusia. Seseorang dapat terpapar PAH dengan bernafas, makan, atau minum bahan yang mengandung PAH. Banyak faktor yang mempengaruhi efek bahaya yang timbul akibat terpapar PAH, diantaranya adalah dosis, waktu, jalur masuk PAH (pernafasan, pencernaan,atau kontak langsung dengan kulit), paparan bahan kimia lainnya, dan beberapa sifat individu seperti umur, jenis kelamin, dan keturunan (ATSDR 1990). The International Agency for Research on Cancer telah mengklasifikasikan 16 PAH (termasuk fenantrena) yang menjadi polutan utama untuk dijadikan tinjauan ulang oleh USEPA (IARC 2002). Selain itu, beberapa penelitian menunjukkan bahwa fenantrena dapat menyebabkan kanker (Gold man 2001). Fenantrena secara umum mempunyai bay-region dan k-region. Secara umum, degradasi fenantrena oleh bakteri terjadi pada bay-region (posisi C3 dan C4 atau C5 dan C6). Namun, pada beberapa bakteri seperti Streptomyces flavovirens dan sianobakteri laut seperti Agmenellum quadru-plicatum memetabolisme fenantrena pada k-region. Biodegradasi Biodegradasi secara garis besar didefinisikan sebagai pemecahan senyawa organik oleh mikroorganisme sehingga membentuk biomassa dan senyawa yang lebih sederhana yang akhirnya menjadi air, karbondioksida atau metana (Walter dan Crawford 1997). Biodegradasi merupakan suatu proses yang penting artinya bagi rehabilitasi lingkungan yang tercemar oleh minyak bumi maupun produk-produknya. Berdasarkan hasil penelitian-penelitian sebelumnya yang dirangkum oleh Citroreksoko (1996), diketahui bahwa kemampuan biodegradasi terhadap beberapa
3
senyawa berbeda-beda. Kecenderungan hidrokarbon alifatik untuk terdegradasi pada umumnya lebih mudah dibandingkan dengan senyawa aromatik. Hidrokarbon alifatik rantai lurus pada umumnya lebih mudah terdegradasi daripada hidrokarbon rantai bercabang. Hidrokarbon jenuh lebih mudah terdegradasi daripada hidrokarbon tidak jenuh. Hidrokarbon rantai panjang lebih mudah didegradasi daripada hidrokarbon rantai pendek. Proses terpenting dalam degradasi PAH pada air antara lain fotooksidasi, oksidasi kimiawi, dan bidegradasi oleh mikroorganisme air. Hidrolisisis bukan merupakan proses yang penting dalam degradasi PAH. Penelitian Nagata dan Kondo (1977) menunjukkan bahwa antrasena, fenantrena, dan benz[a]antrasena rentan terhadap fotobiodegradasi. Menurut Murniasih (2009) bakteri Pseudomonas sp Kalp3b22 mampu mendegradasi fenantrena menjadi senyawa naftalenol. Gambar 2 berikut adalah struktur fenantrena dan 1- naftalenol. Jalur metabolik biodegradasi fenantrena dengan naftalen dengan bakteri tertentu sangat berhubungan satu sama lain, sehingga pembentukan senyawa turunan naftalena, dalam hal ini naftalenol pada metabolisme fenantrena dapat terjadi. Hasil akhir yang diharapkan pada proses biodegradasi adalah senyawa yang lebih sederhana yang akhirnya menjadi karbondioksida dan air. Jalur yang mungkin terjadi pada metabolisme fenantrena dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2 Reaksi degradasi fenantrena
Faktor-faktor yang mempengaruhi Biodegradasi Keberhasilan proses degradasi banyak ditentukan oleh aktivitas enzim. Untuk itu perlu mikroorganisme yang berpotensi menghasilkan enzim pendegradasi hidrokarbon, kemudian aktivitasnya dioptimisasikan dengan pengaturan kondisi dan penambahan suplemen yang sesuai antara lain oksigen, kandungan air, pH, suhu, nutrient yang tersedia dan ada tidaknya material toksik (Udiharto 1996). Beberapa faktor tersebut antara lain oksigen, kelembaban, pH, suhu, dan nutrisi. Keberadaan oksigen merupakan faktor pembatas laju degradasi hidrokarbon dan juga dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri aerob. Kebutuhan akan oksigen digunakan untuk mengkatabolisme senyawa hidrokarbon dengan cara mengoksidasi substrat dengan katalis enzim oksidase. Kelembaban merupakan salah satu faktor penting dalam bioremediasi. Kelembaban sangat penting untuk hidup, tumbuh dan aktivitas metabolik mikroorganisme. Tanpa air mikroorganisme tidak dapat hidup dalam limbah minyak bumi. Mikroorganisme akan hidup aktif di daerah antara minyak dan air. Tingkat keasaman (pH) merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi laju pertumbuhan mikroorganisme (Fletcher 1991). Kemampuan mikroorganisme dalam membangun sel, transportasi melalui membran sel dan keseimbangan reaksi katalis (Cookson 1995). Kebanyakan bakteri dapat tumbuh dengan baik pada kisaran pH netral (pH 6,5-7,5). Tingkat keasaman (pH) dapat berubah selama pertumbuhan mikroorganisme. Peningkatan pH dapat terjadi jika adanya proses reduksi nitrat membentuk ammonia atau gas nitrogen. Sedangkan penurunan pH terjadi apabila terbentuknya asam-asam organik sebagai hasil proses fermentasi (Tanner 1997). Suhu akan berpengaruh dalam proses biodegradasi, terutama terhadap sifat fisik dan kimia komponen-komponen minyak bumi, kecepatan degradasi oleh mikroorganisme, dan komposisi komunitas mikroorganisme. Suhu yang optimal untuk degradasi hidrokarbon adalah 30-40 oC. Pada suhu rendah viskositas minyak akan meningkat mengakibatkan volatilitas alkana rantai pendek yang bersifat toksik menurun dan kelarutannya dalam air akan meningkat sehingga proses biodegradasi akan terhambat. Efek penghambatan tersebut juga disebabkan
4
oleh penurunan aktivitas enzim mikrobial (Leahy and Colwell 1990). Mikroorganisme membutuhkan nutrisi sebagai sumber karbon, energi dan keseimbangan metabolisme sel. Dalam penanganan limbah minyak bumi biasanya penambahan nutrisi antara lain sumber nitrogen dan fosfor, sehingga proses degradasi oleh mikroorganisme berlangsung lebih cepat dan pertumbuhannya meningkat (Leahy and Colwell 1990; Rosenberg dan Ron 1998). Surfaktan dan Tween 80 Surfaktan merupakan molekul amfoterik yang mengandung gugus hidrofobik yang nonpolar, biasanya hidrokarbon rantai lurus atau bercabang, atau fluorokarbon yang memiliki 8-18 atom karbon, yang diikat dengan gugus polar atau hidrofilik. Gugus hidrofilik dapat berupa nonionik, ionik, atau zwitter ionik. Rantai hidrokarbon berinteraksi lemah dengan molekul air dalam lingkungan berair, sedangkan kepala polar atau ionik berinteraksi kuat dengan molekul air melalui interaksi dipol atau ion-dipol. Ini merupakan interaksi yang kuat dengan molekul air yang menyebabkan surfaktan larut di dalam air. Tindakan kooperatif dispersi dan ikatan hidrogen antar molekul air cenderung menekan rantai hidrokarbon keluar dari air dan oleh sebab itu rantai ini disebut hidrofobik (Tadros 2005). Salah satu aplikasi dari surfaktan adalah sebagai pengemulsi. Emulsi merupakan dispersi suatu cairan dengan cairan lain yang tidak bercampur. Ada dua macam emulsi, yaitu emulsi minyak dalam air dan emulsi air dalam minyak. Pada emulsi minyak dalam air, surfaktan memecah minyak menjadi dropletdroplet kecil (tetesan) di bagian antarmuka dan mencegahnya untuk kembali bersatu (koalesensi). Stabilitas emulsi merupakan parameter untuk melihat sejauh mana kemampuan surfaktan dalam mencegah koalesensi (Bajpai & Tyagi 2007).
Gambar 3 Struktur Tween 80
Tween 80 atau Polisorbat 80 merupakan salah satu surfaktan nonionik yang berasal dari polietoksilat sorbitan dan asam oleat. Gugus hidrofilik Tween 80 merupakan suatu polieter yang biasa dikenal sebagai golongan polioksietilena yang merupakan suatu polimer eilena oksida (Gambar 3). Tween 80 merupakan cairan dengan viskositas tinggi berwarna kuning yang lebih mudah larut dalam air. Selain itu Tween 80 juga larut dalam metanol, toluena, minyak jagung, dan etil asetat namun tidak larut dalam minyak.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan yaitu isolat bakteri Bacillus altitudinis, air laut, marine agar (Lampiran 2), solar, fenantrena, Tween 80, n-heptana, diklorometana, alkohol, H2SO4 pekat, dan Na2SO4 anhidrat. Alat-alat yang digunakan yaitu tabung reaksi, labu erlenmeyer, gelas ukur, cawan petri, ose, pipet volumetrik, pipet mohr, pipet mikro, tip, neraca analitik, autoklaf, inkubator, inkubator goyang, Spektrofotometri 20D+, instrumen Kromatografi Gas Spektroskopi Massa (GC-MS), dan laminar Metode Pembiakan Isolat Pembiakan isolat bakteri dilakukan pada media miring marine agar (MA) (Lampiran 2). Sebanyak 100 mL MA disiapkan dalam labu erlenmeyer dan dipipet sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi. Tabung disumbat dengan sumbat kapas dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Tabung diletakkan pada papan miring dan dibiarkan hingga agar dingin dan memadat. Bakteri diinokulasikan secara aseptis pada agar miring dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam. Bakteri yang ditumbuhkan pada agar miring digunakan sebagai stock. Uji Toksisitas Media Cair Larutan fenantrena dengan konsentarsi 0, 50, 500, dan 1000 ppm dibuat dengan melarutkan padatan fenantrena ke dalam larutan surfaktan Tween 80 dengan konsentrasi 0.05% dalam air laut. Larutan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit beserta media cair yang berisi marine broth (MB). Secara aseptis bakteri diinokulasikan ke dalam media cair
5
dan ditambahkan larutan sampel fenantrena. Bakteri diinkubasi selama 3 hari dan dilakukan pengukuran absorbansi. Uji Toksisitas Media Padat Media MA disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit, media dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan hingga agar dingin dan memadat. Bakteri diinokulasikan secara aseptis ke dalam cawan petri dengan metode sebar. Bulatan kertas saring yang telah dibasahi dengan larutan fenantrena dengan konsentrasi 0, 50, 500, dan 1000 ppm diletakkan di atas media berisi bakteri. Cawan diinkubasi selama 2×24 jam pada suhu 37 oC. Metode dilakukan juga terhadap blanko. Pembentukan zona bening disekitar kertas saring menunjukkan bakteri tidak tumbuh. Preparasi Inokulum pada Media Kaya dan Media Minimal Media kaya (Tabel 1) dibuat dalam labu erlenmeyer 250 mL, diberi sumbat kapas dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Bakteri dari stock diinokulasikan dengan ose secara aseptis. Bakteri pada media kaya diinkubasi pada inkubator goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 3 hari. Tabel 1 Komposisi media kaya dan media minimal Komposisi (gram per 100 mL air laut) Bahan Media Media Kaya Minimal Yeast 0.3 0.1 Ekstrak Pepton 1.5 0.5 Solar *) 5 Keterangan : *) disterilisasi secara terpisah Sebanyak 1 mL bakteri dari media kaya dipindahkan ke dalam media minimal yang telah disterilisasi. Solar yang telah disterilisasi secara terpisah dengan UV selama 15 menit ditambahkan ke dalam media minimal. Bakteri pada media minimal diinkubasi pada inkubator goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 7 hari. Pembiakan pada media minimal dilakukan sebanyak 3 kali. Bakteri yang dibiakkan pada media minimal digunakan untuk apikasi pada sampel.
Penerapan pada Sampel Fenantrena Larutan fenantrena dengan konsentrasi 50 ppm dibuat dengan melarutkan padatan fenantrena pada larutan surfaktan Tween 80 dengan konsetrasi 0.05% dalam air laut. Sebanyak 100 mL media minimal baru disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Secara aseptis sebanyak 5 mL bakteri hasil aklimatisasi diinokulasikan ke dalam media minimal baru. Sebanyak 10 mL sampel diambil ke dalam media berisi bakteri. Bakteri diinkubasi pada inkubator goyang dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 28 hari. Penentuan pH, konsentasi PAH, dan perubahan struktur PAH dilakukan pada hari ke-0; 3; 5; 7; 14; 21; dan 28. Analisis TPC (Hadioetomo 1998) Larutan garam fisiologis dibuat dengan konsentrasi NaCl 0.85% (b/v) dalam akuades. Larutan garam fisiologis ini dimasukkan masing-masing 9 mL ke dalam tabung ulir menggunakan pipet mikro dengan label 10-1 sampai 10-8. Tabung ulir disterilisasi dengan isinya pada 121 oC selama 15 menit. Selain itu, disterilisasi juga pada suhu dan selang waktu yang sama yaitu marine agar, cawan petri, dan tip untuk mikropipet yang akan digunakan. Setelah sterilisasi selesai, tabung ulir dinginkan. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-1. Tabung ulir dikocok sehingga benar-benar merata pencampurannya. Sebanyak 1 mL dari tabung ulir yang berlabel 10-1 dipipet lalu dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-2. Tabung ulir dengan label 10-2 dikocok lalu sebanyak 1 mL dimasukkan dalam tabung ulir yang berlabel 10-3. Pemindahan dan pengocokan ini dilakukan pada setiap tabung ulir sampai dengan pengenceran/tabung ulir berlabel 10-8. Dari semua tabung ulir (10-1–10-8), dipindahkan masing-masing 1 mL ke dalam cawan petri terpisah (berlabel 10-1 sampai 10-8) yang sudah disterilisasi. Larutan marine agar (MA) yang sudah agak dingin dan belum padat dituang ke cawan petri. MA ditunggu hingga padat lalu dimasukkan ke dalam inkubator, lalu diinkubasi selama 1–2 hari. Koloni yang tampak terbentuk pada cawan petri dihitung setelah 1 atau 2 hari tersebut. Analisis pH Nilai pH diukur dengan menggunakan indikator pH universal. Kertas indikator dicelupkan ke dalam sampel, lalu dibaca nilai pH-nya.
6
Analisis Biodegradasi Fenantrena dengan GC-MS Ekstraksi sampel. Sebanyak 50 mL sampel di masukkan ke dalam corong pisah dan ditambahkan 10 mL diklorometana. Pengocokan dilakukan beberapa menit dalam corong pisah. Cairan dalam corong pisah dibiarkan hingga benar-benar terpisah menjadi dua lapisan. Lapisan organik dikeluarkan dari corong pisah. Hasil ekstraksi ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk sejumLah menghilangkan sisa air. Sebanyak 1 µL ekstrak diinjeksikan ke instrumen GC-MS.
HASIL DAN PEMBAHASAN Peremajaan Bakteri Isolat bakteri Bacillus altitudinis dibiakkan pada media kaya selama 3 hari untuk mempercepat pertumbuhan bakteri. Pertumbuhan tersebut dapat ditandai dengan kekeruhan yang terjadi pada media selama 3 hari (Gambar 4). Proses aklimatisasi terjadi selama pembiakan pada media minimal, yaitu proses penyesuaian isolat tehadap lingkungan baru, dalam hal ini lingkungan yang kaya hidrokarbon sehingga isolat dapat diterapkan terhadap sampel fenantrena. Solar yang ditambahkan pada media berfungsi sebagai salah satu sumber hidrokarbon untuk energi selain nutrisi dari media bagi isolat bakteri yang ada.
Pengamatan visual selama 21 hari menunjukkan adanya perubahan kekeruhan pada media yang diberi isolat bakteri Bacillus altitudinis (Gambar 5). Kekeruhan yang terjadi disebabkan oleh tumbuhnya mikroorganisme pada media. Terdapat gelembung pada batas antara media dengan solar. Gelembung ini terbentuk karena adanya biosurfaktan yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Biosurfaktan sebagai bagian dari surfaktan akan menurunkan tegangan antarmuka suatu fasa yang berbeda derajat polaritasnya yaitu antara media yang bersifat polar dengan solar yang bersifat nonpolar. Pada awal pemberian solar ke dalam media, bakteri akan mulai meningkatkan kontaknya dengan solar. Pada saat meningkatkan kontak, bakteri melakukan adhesi/adsorpsi yaitu kontak antara permukaan membran sel yang bersifat hidrofobik kemudian bakteri melakukan pembelahan sel. Ketika permukaan solar menjadi jenuh oleh bakteri maka pertumbuhan bakteri dibatasi oleh ketersediaan permukaan solar (Rosenberg dan Ron 1998). Dengan keterbatasan ini, bakteri akan menggunakan solar sebagai media tumbuh dengan sebelumnya mengemulsi campuran larutan tersebut dengan mengeluarkan biosurfaktan. Pemeliharaan isolat selama 21 hari bertujuan untuk menjaga kemampuan isolat agar tetap menghasilkan enzim oksigenase yang diperlukan untuk mendegradasi hidrokarbon (Yani & Akbar 2004; Hadi 2004). Uji Toksisitas
Gambar 4 Media kaya (kiri) dan blanko (kanan) selama 3 hari
Gambar 5 Media minimal dengan solar 1, 5, dan 10% (kiri ke kanan)
Uji Toksisitas dilakukan untuk menentukan konsentrasi fenantrena yang dapat digunakan untuk aplikasi bakteri pada sampel. Toksisitas fenantrena dapat ditandai dengan tidak tumbuhnya bakteri di sekitar kertas saring yang telah dibasahi oleh larutan fenantrena, sehingga akan terbentuk zona bening di sekitar kertas saring. Pada Gambar 6 terlihat terbentuk zona bening di sekitar kertas saring yang telah dibasahi oleh fenantrena 1000 ppm dan 500 ppm. Zona bening tidak tebentuk disekitar kertas saring dengan konsentrasi fenantrena 0 ppm (Gambar 7) yang menunjukkan bakteri dapat tumbuh dengan baik, sedangkan pada konsentrasi fenantrena 50-1000 ppm terbentuk zona bening, tetapi pada konsentrasi 50 ppm masih terlihat pertumbuhan bakteri di kertas saring.
7
1 0,8 0,6 0,4 Gambar 6 Uji toksisitas pada fenentrena dengan konsentrasi (a) 1000 dan (b) 500 ppm.
i ran so b A
(a)
0,2 0 3 6 9 24 29 34 48 53 58 72 waktu (jam) 1 0,8
Gambar 7 Uji toksisitas pada fenentrena dengan konsentrasi (a) 0 dan (b) 50 ppm
0,6 i an rb so
A
Uji toksistas juga dilakukan pada media cair. Pertumbuhan bakteri dapat diamati dengan nilai absorbansi media cair. Absorbansi media cair dengan konsentrasi fenantrena 0-500 ppm pada 24 jam pengamatan tidak berbeda (Gambar 8). Pola pengamatan absorbansi media cair dengan konsentrasi fenantrena 50-1000 ppm selama 24 jam lebih rendah dibandingkan dengan konsentrasi fenantrena 0 ppm (kontrol). Hal ini menunjukkan adanya hambatan pertumbuhan bakteri akibat adanya penambahan fenantrena. Pertumbuhan bakteri pada media dengan konsentrasi fenantrena 50 ppm menunjukkan pola absorbansi yang mengalami peningkatan paling tinggi dibanding dengan konsentrasi fenantrena 500 dan 1000 ppm hingga 72 jam. Berdasarkan hasil uji toksisitas media padat dan cair, konsentrasi fenantrena yang dapat digunakan adalah 50 ppm. Konsentrasi tersebut yang kemudian akan digunakan pada penerapan dengan bakteri.
(b)
0,2 0 3 6 9 24 29 34 48 53 58 72 waktu (jam) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
i ran so b A
(c)
3 6 9 24 29 34 48 53 58 72 waktu (jam)
Penerapan pada Fenantrena i ran so b A
Penerapan pada sampel fenantrena dilakukan selama 28 hari. Konsentrasi fenantrena yang digunakan didasarkan pada hasil uji toksisitas yaitu 50 ppm. Penambahan Tween 80 bertujuan meningkatkan kelarutan fenantrena yang bersifat hidrofobik sehingga dapat menyediakan permukaan senyawa hidrokarbon yang lebih luas melalui pembentukan mikroemulsi dan ketersediaan biologis untuk keperluan metabolisme mikroorganisme.
0,4
b
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
(d)
3 6 9 24 29 34 48 53 58 72 waktu (jam) Gambar 8 Nilai absorbansi uji toksisitas media cair (a) konsentrasi 0 ppm; (b) konsentrasi 50 ppm; (c) konsentrasi 500 ppm; (d) konsentrasi 1000ppm
8
2 -
Jumlah sel (1x106 CFU/ml)
Adanya peningkatan kontak antara hidrokarbon dan air akan mempermudah masuknya asupan oksigen dan nutrisi yang dibutuhkan mikroorganisme pada permukaan senyawa hidrokarbon tersebut. Kondisi ini sangat membantu mikroorganisme untuk lebih cepat dapat mendegradasi hidrokarbon. Penelitian Hadibrata dan Tachibana (2009) pada biodegradasi fenantrena oleh fungi Polyporus sp.S133 menggunakan 80 menunjukkan peningkatan Tween kelarutan fenantrena dalam air dan biodegradasinya. Konsentrasi Tween 80 sebesar 0.05% (b/v) dapat mendegradasi fenantrena sebesar 92%. Hal ini menunjukkan bahwa surfaktan juga dapat menghambat degradasi hidrokarbon. Kekeruhan media meningkat berdasarkan pengamatan visual selama 28 hari, yang menjadi indikasi bakteri mengalami pertumbuhan. Parameter petumbuhan lainnya seperti pH juga diamati pada hari ke 0; 3; 5; 7; 21; dan 28 dan diperoleh ph media cair antara 6-8 (Gambar 9). Nilai pH dalam penelitian memungkinkan bakteri dapat tumbuh dengan baik sehingga dapat melakukan berbagai aktivitas selulernya.
1 0 0
28
Waktu (hari)
Gambar 10 Hasil uji TPC hari ke -0 dan 28 Hasil analisis TPC pada media uji menunjukkan bakteri dapat tumbuh dengan baik yang ditandai dengan meningkatnya nilai TPC hari ke-0 (0.32 x 106 CFU/mL) hingga hari ke-28 (1.82 x 106 CFU/mL). Pertumbuhan bakteri yang baik didukung oleh kondisi lingkungan yang baik, nutrisi yang cukup, dan pH yang sesuai. Kondisi ini juga dicapai pada penelitian yaitu dengan pH berkisar 6-8. Bakteri yang tumbuh baik pada penelitian ini menunjukkan aktivitas degradasi fenantrena oleh bakteri dapat berlangsung. Hal ini dapat ditunjukkan dengan penurunan area fenantrena hasil analisis GC-MS pada hari ke-0 dan hari ke-28 (Tabel 2). Persentase penurunan sekitar 14%. Tabel 2 Area kromatogram fenantrena Hari keArea
Gambar 9 Hasil pengukuran pH Indikator kuantitatif untuk melihat pertumbuhan bakteri adalah dengan melakukan analisis Total Plate Count (TPC) yang menghitung jumlah bakteri yang tumbuh pada media agar pada suhu dan waktu yang ditetapkan (SNI 2008). Perhitungan dapat dilakukan dengan hitung cawan tanpa menggunakan mikroskop. Jumlah koloni berkaitan dengan persentase degradasi. Secara umum semakin besar jumlah koloni mikroba maka semakin tinggi persentase degradasinya.
0
97674858
28
83642440
Hasil penelitian ini menunjukkan degradasi fenantrena yang belum maksimal yang ditunjukkan dengan masih adanya fenantrena pada hari ke-28. Kromatogram sampel pada hari ke-0 dan 28 menunjukkan adanya senyawa fenantrena pada waktu retensi 11.20 (Gambar 11). Hal tersebut didukung oleh data yang terdapat pada MSD CHEMSTATION dengan mutu kemiripan sebesar 98. Terdapatnya fenantrena pada hasil akhir pengamatan dapat dikarenakan waktu kultivasi bakteri yang kurang untuk pemecahan senyawa fenentrena. Penelitian Hadibrata dan Tachibana 2009 menunjukkan laju biodegradasi fenantrena sebesar 92% mengunakan fungi Polyporus sp.S133 selama 28 hari kultivasi.
9
Gambar 11 Kromatogram fenantrena hari ke-0 (garis hitam) dan ke-28 (garis hijau)
Gambar 12 Kromatogram asam ftalat pada sampel hari ke-28 Bakteri yang digunakan pada biodegradasi ini merupakan isolat tunggal. Nilai TPC yang meningkat menunjukkan bakteri dapat tumbuh pada media yang mengandung fenantrena, namun kemampuannya mendegradasi senyawa tunggal fenantrena belum menghasilkan hasil akhir yang optimum, hal tersebut terlihat dari masih terdapatnya senyawa fenantrena di akhir kultivasi selama 28 hari. Penggunaan konsorsium sebagai mikroorganisme pendegradasi juga telah banyak dilaporkan. Janbadhu dan Fulekar 2001 melakukan biodegradasi fenantrena dengan bakerti kosorsium menghasilkan 100% , 59.9%, dan 25.8% bidegradasi fenantrena untuk konsentrasi 100mg/L, 250 mg/L, dan 500mg/L selama 14 hari. Secara umum, biodegradasi dengan isolat tunggal tidak dapat menunjukkan jalur biodegradasi secara tepat, karena di alam, bioremediasi bergantung kepada aktifitas metabolisme dari campuran populasi mikroorganisme.
Salah satu keuntungan menggunakan konsorsium dalam biodegradasi fenantrena adalah kemampuan proses metabolisme yang beragam akan menigkatkan efisiensi proses bioremediasi. Kromatogram GC-MS menunjukkan adanya senyawa asam ftalat pada waktu retensi 7.607 (Gambar 12) dan spektrum massa sampel menunujukkan mutu kemiripan sebesar 72 dengan spektrum massa asam ftalat pada MSD CHEMSTATION (Lampiran 3). Adanya senyawa asam ftalat dapat memungkinkan jalur metabolisme fenantrena pada biodegradasi kali ini adalah melalui jalur asam ftalat. Penelitian Murniasih (2009) menunjukkan perubahan struktur fenantrena menjadi senyawa 1-naftalenol selama 29 hari proses biodegradasi. Secara umum, metabolisme degradasi fenantrena diawali dengan hidroksilasi pada bay-region oleh enzim dioksigenase menjadi cis-3,4-fenantrenadihidrodiol.
10
Enzim dihidrodiol dehidrogenase akan merubah cis-3,4-fenantrenadihidrodiol menjadi 3,4-dihidroksi fenantrena yang kemudian dimetabolisme kembali menjadi asam 1-hidroksi-2-naftoat. Metabolisme asam 1-hidroksi-2-naftoat dapat melalui dua jalur. Pertama melalui dekarboksilasi oksidatif menjadi 1,2-dihidroksi naftalena dan akan mengalami metabolisme lanjutan sesuai jalur naftalena melalui senyawa asam salisilat dan katekol. Jalur lain adalah melalui metabolisme lanjutan melalui jalur asam ftalat (Mallick et al. 2007). Jalur degradasi fenantrena dapat dilihat pada Gambar 13.
sampel. Perubahan struktur yang terjadi diduga melalui jalur asam ftalat. Hal tersebut dikarenakan terdapat spektrum massa asam ftalat pada kromatogram fenantrena hari ke 28 pada waktu retensi 7.607 dengan mutu kemiripan sebesar 72. Saran Penelitian lebih lanjut dengan konsorsium perlu dilakukan untuk meningkatkan kemampuan bakteri dalam mendegradasi fenantrena dan dengan waktu kultivasi yang lebih lama fragmentasi sehingga dapat diperoleh perubahan struktur yang lebih akurat.
DAFTAR PUSTAKA
Fenantrena dioksigenase OH H
HO
H
cis-3,4-fenantrenadihidrodiol
dihidrodiol dehidrogenase
.
OH HO
3,4-dihidroksi fenantrena
OH
Bajpai D, Tyagi VK. 2007. Laundry detergents: an Overview. J. Oleo Scie. 7:327-340. Bartha R, Bossert I. 1984. Treatment and Disposal of Petroleum Refinery Wastes. New York: Macmillan Publishers.
O
OH
asam 1-hidroksi-2-naftoat
Boopathy R. 2000. Factors limiting bioremediation technologies (review paper). Journal of Bioresource Technology. 74:63-67.
dekarboksilasi oksidatif O OH OH
OH
OH
O
1,2-dihidroksi naftalena
Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). 1990. Public Health Statement, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services.
asam ftalat
Gambar 13 Jalur degradasi fenantrena
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Biodegradasi fenantrena dilakukan oleh bakteri Bacillus altitudinis selama 28 hari. Konsentrasi fenantrena yang digunakan adalah 50 ppm setelah melalui uji toksisitas media cair dan padat. Tween 80 dengan konsentrasi 0.05 % (b/v) ditambahkan untuk meningkatkan kelarutan fenantrena. Selama 28 hari kultivasi terjadi peningkatan nilai TPC dan pH yang menunjukkan bakteri dapat berkembang dengan cukup baik pada media
Bossert ID, Kosson DS. 1997. Methods for measuring hidrocarbon biodegradation in soil. In Mannual of Environmental Microbiology. ASM Pr. Washington. 738-742. Cerniglia CE. 1993. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Curr. Opin. Biotechnol. 4:331–338. Cerniglia CE, Sutherland JB. 2010. Handbook of hydrocarbons and lipid microbiology. Germany:Berlin Heidelberg. Citroreksoko P. 1996. Pengantar Bioremediasi. Di dalam Prosiding Pelatihan dan Lokakarya Peranan Bioremediasi dalam Pengelolaan Lingkungan; Cibinong, 24-28 Juni. Cibinong: LIPI-BPPT-HSF.
11
Cookson JT. 1995. Bioremediation Engineering : Design and Application. Toronto: McGraw-Hill. Crawford R, Crawford DL. 1996. Bioremediation Principles and Applications. USA: Cambridge University Pr. Goldman R. 2001. Smoking increases polycyclic aromatic carcinogenic hydrocarbons in human lung tissue. Cancer Research 61: 6367-6371. Hadibrata T, Tachibana S. 2010. of phenanthrene Characterization degradation by strain Polyporus sp. S133. Journal of Environmental Science 22:142-149. Hadioetomo RS. 1998. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Janbandhu A, Fulekar MH. 2011. Biodegradation of phenanthrene using microbial consortium from petrochemical contaminated environment. Journal of Hazardous Material. 187:333-340. Leahy JH, Colwell R. 1990. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment. Microbiological Reviews. 54 (3):305-315. Mallick S, Subhankar Chatterjee, Tapan K Dutta. 2007. A novel degradation pathway in the assimilation of phenanthrene by Staphylococcus sp. Microbiology 153. Morgan P, Watkinson RJ. 1994. Biodegradation of Component Petroluem. C Railedge, editor. Biochemistry of Microbial Degradation. Netherlands: Kluwer Academic Pb. T, Yopi, Budiawan.2009. Murniasih Biodegradasi fenantren oleh bakteri laut Pseudomonas sp KalP3b22 asal Kumai Kalimantan Tegah. Makara Sains. 13: 7780.
Rosenberg E, Ron EZ. 1998. Bioremediation of Petroleum Contamination. Di dalam RL Crawford, DL Crawford, editor. Bioremediation Principles and Applications. Cambridge: Cambridge University Pr. [SNI 2897] Standar Nansional Indonesia. 2008. Metode Pengujian Cemaran Mikrob dalam Daging, Telur, dan Susu serta Hasil Olahannya. Jakarta: Badan Standardisasi Nasional. Tadros TF. 2005. Applied Surfactant. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. Tanner RS. Cultivation of Bacteria and Fungi. Ch 6. dalam C. J. Hurst (ed.). 1997. Manual of environmental Microbiology. ASM Press, Washington DC. Udiharto M. 1996. Bioremediasi Minyak Bumi. Prosiding Pelatihan dan Lokakarya Peranan Bioremediasi dalam Pengelolaan Lingkungan; Cibinong, 24-28 Juni. Cibinong: LIPI-BPPT-HSF. Walter MV, Crawford RL. 1997. Biotransformation and Biodegradation. Di dalam CJ Hurst, editor. Manual of Environmental Microbiology. Washington DC: ASM Pr. Yani M, Akbar Y. 2004. Proses biodegradasi minyak diesel oleh campuran bakteri pendegradasi hidrokarbon. J. Tek. Ind. Pert. 19:40-44. Yirui W. 2010. Degradation of PAHs by Mangrove Sediment Fungi. [disertasi]. Hong Kong : Citi University of Hong Kong.
12
LAMPIRAN
12
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Pembiakan isolat
Pembiakan pada media kaya
Uji toksisitas Media cair dan padat
Pembiakan pada media minimal
Penentuan konsentrasi fenantrena
Aplikasi isolat pada fenantrena
Kultivasi 28 hari
Uji pH hari ke 0; 3; 5; 7; 14; 21 dan 28
Uji TPC hari ke 0 dan 28
Penentuan peubahan struktur dengan GC-MS
13
Lampiran 2 Komposisi marine agar Bahan Yeast extract Pepton Ferric citrate NaCl MgCl2 Na2SO4 CaCl2 KCl Na2CO3 SrCl2 Asam Borat Natrium silikat Natrium flourida Amonium nitrat Na2PO4
Komposisi (g/1000 mL) 1 5 0.1 19.45 8.8 3.24 1.88 0.55 0.16 0.034 0.022 0.004 0.0024 1.6 0.008
14
Lampiran 3 Spektrum massa asam ftalat (a) sampel hari ke 28 (b) data MSD CHEMSTATION
(a)
(b)
