KE DAFTAR ISI J/6
ISSN 0216 - 3128
Widyastut, dkk.
PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99mTc- PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG Widyastuti,
Sri Aguswarini,
Cecep Taufik, Anna Roseliana, Agus Ariyanto,
Abdul Mutalib
Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka - BATAN
ABSTRAK PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99mTc_PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG. Telah dilakukan penelitian terhadap 2 jenis senyawa HYNIC sebagai ligand penghubung pada penandaan 2 macam senyawa peptida yaitu BPTl dan TOC dengan 99mTc.Penandaan peptida tersebut dengan 99mTcdilakukan dengan menggunakan 2 macam metoda konjugasi , dimana untuk BPTI digunakan NHS-HYNIC sedangkan untuk TOC digunakan BOCHYNIC, kemudian akan dibandingkan ejisiensi penandaan kedua hasil konjugasi ini serta stabilitas peptida bertandanya. Hasil konjugasi diidentifikasi dengan HPLC fasa balik dan kemurnian radiokimia dianalisa dengan HPLC dan kromatograji lapis tipis/ kromatograji kertas. Vji biodistribusi dilakukan pada tikus normal untuk melihat sifat farmakokinetika peptida bertanda tersebut. Dilakukan juga uji stabilitas in vitro menggunakan cystein challenge sebagai simulasi stabilitas di dalam tubuh. Hasil pengujian dengan HPLC menunjukkan polaritas yang mirip antara kedua peptida yang belum dan yang sudah ditandai dengan 99mTc. Kemurnian radiokimia 99mTc_HYNIC_BPTI dan 99mTc-HYNIC-TOC yang dianalisis dengan kromatograji kertas/lapis tipis berturut-turut adalah 87.33 % dan 85.88 %. Hasil uji biodistribusi menunjukkan akumulasi tertinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan cacahan pada organ dan jaringan lainnya relatifrendah. Ilasil uji stabilitas dalam cystein (cystein challenge) setelah satl/jam inkl/hasi I/ntuk kedua sediaan tersebut tidak menunjl/kkan penl/runan kemurnian radiokimia yang herarti. Ilasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNIC demikian juga perbedaan metoda konjugasi tidak memberikan perbedaan yang berarti pada ejisiensi penandaan 99mTc_peptida, tetapi metoda konjugasi menggunakan BOC-HYN IC memerlukan waktu pengerjaan yang lama serta jenis reagen yang lebih banyak. Kedua sediaan peptida tersebut mempunyai sifat farmakokinetika yang memenuhi syarat untuk digunakan sebagai perunut. Kata kunci : Peptida, 99mTc, ligan, penandaan
ABSTRACT COMPARISON
OF 99mTc_PEPTIDE LABELING
METHOD
USING TWO KINDS OF HYNIC LIGAND
AS LINKER. Experiment using 2 kinds of HYN IC in 99mTclabeling on 2 kinds of peptides .i.e BPTI and TOC has been carried out. Labeling of these peptides with 99mTc were carried out using different conjugation methods and different kinds of HYNIC, for this purpose NHS-HYNIC was used for BPTl while BOC-HYNIC was used for TOC, and then their labelling efficiency and stability were compared. Labeling efficiency was analysed using RP-HPLC and paper chromatography and thin layer chromatography (TLC), and biodistribution study to examine their pharmacokinetic behavior was done I hour after injection on normal mice. HPLC results showed that all radiolabeled peptides have similar polarity as their unlabeled conjugates, and chromatography result (from both paper and TLC) showed that the labeling efficiency of99m Tc - HYNIC-BPTI and 99mTc-HYNIC_TOC were 87.33% and 85.88% respectively. The cystein challenge test for 99mTc_HYNIC_BPTI and 99mTc_HYNIC_TOC after I hour did not give significant difference. Biodistribution study showed that all labeled peptides were accumulated mainly in kidney and bladder. Both NHS-HYNIC and BOC-HYNIC, as well as the different conjugation methods do not give significant difference in labeling efficiency of99mTc-peptides, but conjugation method using BOC-HYNIC is more time consuming and need more various reagents. It can be concluded that these peptide based radio pharmaceuticals have a good prospects to be used as imaging agents. Keywords: Peptide, 99mTc, ligand, labeling
PENDAHULUAN Peptida berukuran keeil pemanear yang dilabel dengan telah Te99m atau radioisotop y lainnya
tumor dan beberapa penyakit lainnya dalam kedokteran nuklir. Peptida merupakan salah satu senyawa yang diandalkan dalam penelitian radiofarmaka dewasa ini, disebabkan oleh beberapa
diketahui mempunyai potensi sebagai perunut Prosiding PPI - PDIPTN 2006 Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 10 Juli 2006
Il7
ISSN 0216-3128
Widyastut, dkk.
faktor antara lain mudah diperoleh dari hasil sintesa, afinitas yang tinggi terhadap reseptor pada jaringan sasaran dan ukuran molekulnya kecil sehingga mudah diekskresi dari sistim peredaran darah (2,3). Ketersediaan Tc-99m di rumah-sakit rumahsakit dalam bentuk generator Tc-99m membuat para ilmuwan tertarik untuk dapat menandai peptida dengan Tc-99m, tetapi hasil yang diperoleh masih belum memuaskan. Hal ini disebabkan oleh tingginya aktivitas farmakologi dari beberapa jenis peptida yang digunakan. Oleh karena itu jumlah peptida yang digunakan harus sekecil mungkin, sehingga diperlukan efisiensi yang tinggi pada proses penandaan dan stabilitas kompleks yang tinggi pula. Untuk itu diperlukan suatu senyawa pengkhelat yang dapat mengikat Tc-99m sekaligus mengikat peptida yang disebut "bifunctional chelator" (BFC), dan salah satu senyawa BFC yang memenuhi syarat untuk itu ialah Hydrazino Nicotinamid (HYNIC) (I). Penandaan peptida dengan Tc-99m menggunakan HYNIC sebagai BFC berbeda dengan pengkhelat lainnya, karena disini Tc-99m berikatan dengan gugus hydrazino membentuk ikatan Tc-N yang kurang stabil, sehingga diperlukan suatu co-ligand untuk menstabilkan molekul tersebut, dimana salah satunya adalah trisin. Dalam penelitian ini akan dikaji hasil penandaan 2 macam peptida dengan Tc-99m menggunakan HYNIC sebagai BFC dan trisin sebagai co-ligand melalui serangkaian pengujian antara lain kemurnian radiokimia, stabilitas in vitro dan biodistribusi (untuk melihat sifat farmakokinetikanya). Peptida yang akan digunakan dalam penelitian ini ialah Tyr3 -octreotide (TOC) dan BPTI. TOC merupakan analog somatostatin yang telah diketahui mempunyai afinitas yang tinggi pada tumor, sedangkan BPTI merupakan peptida yang mirip (ukuran maupun sifat farmakokinetika) dengan HNE-2, dimana HNE-2 telah dibuktikan pada beberapa publikasi internasional mempunyai sifat dapat terlokalisasi secara spesifik pada jaringan yang mengalami intlamasi/infeksi. Pada penelitian ini BPTI digunakan sebagai model pengganti HNE-2, karena BPTI tersedia di pasaran.
BAHAN DAN TAT A KERJA Bahan dan Peralatan Bahan yang digunakan ialah NHS-HYNIC (Polatom, Poland), BPTI (Aprotinin, Sigma
A 1153), Tricine (Sigma), buffer NH4-asetat 0.25 M pH 5.2, buffer fosfat-salin (PBS) 0.5 M pH 7.2, N,N-Dimetil formamida anhidrat (DMF, Aldrich), SnC12.2H20 (Merck), Generator Tc-99m (BATEK), BOC-HYNIC (P2RR), BOC-TOC, 0(7-azabenzotriazolil)-I, I ,3,3-tetrametiluronium heksatlorofosfat (HA TU, Aldrich), N,NDiisopropiletilamin (Aldrich), Tioanisol (Aldrich), asetonitril (Merck), Asam tritluoroasetat (Merck), air demin, air bidestilata steril (IPHA), larutan HCI 0.0 I N, larutan NaOH I N, gas nitrogen, dan lain lain. Alat alat yang digunakan ialah peralatan gelas, misalnya vial 2 cc, 5 cc dan 10 cc, tabung mikro, tabung reaksi, dan lain lain, pipet eppendorf berbagai ukuran, syringe berbagai ukuran, kolom Sephadex G-25 (PD-IO, Pharmacia), kolom Seppak C-18 (Waters), timbangan, pH-meter, kertas indikator pH, spektrofotometer UV dengan mikro kuvet, HPLC (Shimadzu) dengan kolom C 18, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis, alat pencacah gamma (GiC & mini assay), dan lain lain.
Tata Kerja a. Konjugasi
HYNIC-BPTI 0.2-1 mg larutan BPTI dicampurkan dengan larutan NHS-HYNIC (dalam DMF bebas air), jumlah molar NHS-HYNIC 3 atau 5 kali molar BPTl, dan volume DMF tidak lebih dari 10 % volume total campuran reaksi. Campuran reaksi diinkubasi pad a suhu ruangan selama 30-60 men it, kemudian dimurnikan melalui kolom Sephadex G-25 (PD- I0) dengan eluen buffer NH4-asetat 0.25 M pH 5.2. Kadar konjugat ditentukan dengan spektrofotometer UV pada 280 nm, dan konjugat dapat disimpan pad a 20DC bila tidak akan langsung digunakan.
HYNIC-TOC 1.3 mg BOC-HYNIC, 2 mg HA TU dan 5 mg diisopropiletiamin (DEA) dalam 300 J.llDMF kering direaksikan selama 30 menit pada suhu ruangan. 60 J.l1dari larutan ini direaksikan dengan I mg BOC- TOC (yang telah dilarutkan dalam 20 J.l1DMF + 5 J.l1air) dan diinkubasi selama I jam. Perbandingan molar BOC-HYNIC dan HATU terhadap BOC-TOC kurang lebih 1.5 : I. Larutan reaksi ditambah 5 ml air untuk menghentikan reaksi, kemudian dilewatkan ke dalam kolom SEPP AK C 18 yang telah dikondisikan, dibilas dengan 5 ml
Prosiding PPI • PDlPTN 2006 Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 10 Juli 2006
/18
ISSN 0216 - 3128 air dan dielusi dengan I ml asetonitril. Larutan reaksi diuapkan dalam vakum hingga volume 100 Ill, kemudian ditambahkan 10 III tioanisol dan 300 III TFA dan diinkubasi selama 5 menit untuk menghilangkan gugus BOC (deproteksi) kemudian diuapkan hingga kering, dan dilarutkan dalam 100 Ill.etanol 50 %. Konjugat HYNIC-TOC dianalisa dengan HPLC fasa balik dengan eluen 0.1 % TF A/air dan asetonitril secara gradien. Konjugat disimpan pada -20°C bila tidak akan langsung ditandai.
b.
Penandaan
Widyastut, dkk. kontrol dilakukan pengerjaan yang sarna tetapi tanpa menambahkan cystein.
e. Uji biodistribusi Uji biodistribusi dilakukan dengan menyuntikkan 0.2 ml (50 -150 IlCi) peptida bertanda pada mencil. Setelah I jam hewan dikorbankan dan organ organ tennasuk sampel darah dan tulang dicacah radioaktifitasnya.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tc99m-HYNIC-peptida
Hasil pengujian dengan HPLC untuk kedua peptida memberikan waktu retensi yang sarna yaitu 15-16 men it, sedangkan masing masing konjugatnya memberikan waktu retensi pad a 17 men it, baik untuk konjugat bertanda maupun tidak bertanda.
10 - 50 Ilg konjugat direaksikan dengan larutan trisin (100 mglml dalam air), 1-5 mCi Tc99m dan 5-25 'Ill larutan SnC12.2H20 (I mgllml dalam HCI O.OIN bebas oksigen), dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. c. Analisa Konjugat bertanda diidentifikasi dengan HPLC (dengan metoda yang sarna dengan identifikasi konjugat tidak bertanda) dan tiap menit eluat ditampung dalam tabung reaksi dan diukur radioaktifitasnya. Kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas dengan eluen aseton untuk menentukan % Tc99m bebas dan kromatografi lapis tip is dengan eluen campuran ammonium asetatmetanol (I: I) untuk menentukan % Tc99m koloid. d.
Uji stabilitas
dalam cystein
100 III larutan peptida bertanda direaksikan dengan larutan 0.1 M cystein (dalam PBS pH 7.2), perbandingan molar peptida terhadap cystein dibuat I : 1000, diinkubasi pada suhu 37°C selama 0 jam, I jam dan 24 jam, kemudian dianalisa dengan kromatografi lapis tipis (KL T) dengan eluen metil etil keton (MEK) untuk menentukan % Tc bebas (Rf=I), dan eluen PBS pH 7.2 untuk menentukan % Tc-peptida (Rf=O). Sebagai
Hasil pengujian dengan KLT/ kromatografi kertas untuk Tc99m-HYNIC-TOC dan Tc99mHYNIC-BPTI berturut-turut ialah 85.88 % dan 87.33 %. Hasil pengujian dengan cystein (cystein challenge) setelah I jam untuk kedua jenis peptida bertanda tidak menunjukkan penurunan % yang berarti, hal ini menunjukkan kedua senyawa ini akan stabil di dalam tubuh setelah I jam. Pengamatan lebih dari I jam belum sempat dilakukan. Hasil uji biodistribusi untuk kedua pcptida bertanda menunjukkan radioaktifitas yang tinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan relatif rendah pada organ organ lain, sedangkan adanya radioaktifitas pad a lambung menunjukkan % Tc99m bebas yang masih cukup tinggi. Tingginya perbandingan % radioaktifitas pad a sistim ekskresi (ginjal dan kandung kemih) terhadap organ organ lain menunjukkan sifat fannakokinetika yang diharapkan dari sediaan penatah tumor atau infeksi, sehingga apabila terdapat tumor atau infeksi di dalam tubuh diharapkan akan diperoleh gambaran gamma kamera yang cukup jelas.
DATA HASIL PENGAMATAN Tabel1.Data MEK, Rf=1
kemurnian
radiokimia
% Tc koloid perhitungan 7.087.33 9.76 4.3685.88 5.64 NH4Ac/MeOH Rf=O% Tc bebas % Tc-Hynic-peptida
Prosiding PPI - PDIPTN 2006 Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 10 Juli 2006
ISSN 0216 - 3128
Widyastut, dkk.
JJ9
Tabel 2. Uji Stabilitas dalam cystein Waktu pengamatan 0
c"
84.2385.91 85.8887.33 % Tc-HYNIC-BPTI % Tc-HYNIC-TOC
70
~ 60 E 50
~
" "c .c
::' 40 Q,
30
"
~ 20 ••
10
orgen
Gambar /. Uji biodistribusi 99mTc_HYNIC_BPTI dan 99mTc_HYNIC_TOC 90000 80000 70000 (IJ
~=-
60000
~ 50000 .S! 40000 'C 11:1
~ #-
30000 20000 10000 o
o ..-
M ..-
0) ..-
..-
N CD
menit Gambar 2. Kromatogram HPLC 99mTc-H YNIC-BPTI
70000 E 60000
i i" Q,
••
~
50000 40000
'6 ~
3QOO)
:J<
.!"
20000
••
:: 10000 o 3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
no. frek".
Gambar 3. Kromatogram HPLC Tc99m-HYNIC-TOC
Prosiding PPI - PDlPTN 2006 Pustek Akselerator dan Proses Bahan· BATAN Yogyakarta. 10 Juli 2006
27
29
ISSN 0216 - 3128
/20
Widyastut, dkk.
!!!!!!!!!!
KESIMPULAN
DAN SARAN
Hasil pengujian yang telah dilakukan terhadap kedua jenis HYNIC-peptida baik yang menggunakan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNIC memberikan hasil yang tidak jauh berbeda tetapi metoda yang menggunakan BOC-HYNIC memerlukan waktu pengerjaan yang lebih lama dan rumit serta memerlukan lebih banyak jenis reagen. Sejauh ini stabilitas in vitro untuk kedua sediaan peptida bertanda tidak menunjukkan perbedaan yang berarti, tetapi masih perlu dilakukan pengamatan pada interval waktu yang lebih panjang untuk memperkuat kesimpulan ini. Dan untuk membuktikan lebih jauh keunggulan metoda yang satu terhadap metoda yang lainnya perlu dilakukan juga uji stabilitas masing masing konjugat terhadap waktu penyimpanan. Uji biodistribusi pada hewan normal yang telah dilakukan hanya untuk mengetahui farmakokinetika dari kedua sediaan peptida bertanda, dan dapat disimpulkan bahwa kedua jenis sediaan ini dapat digunakan untuk penatah kelainan organ (kecuali kelainan ginjal dan kandung kemih). Untuk membuktikan bahwa sediaan ini dapat digunakan untuk menatah tumor perlu dibuktikan lebih lanjut melalui uji biodistribusi pad a hewan yang menderita tumor. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa HYNIC dapat digunakan sebagai ligand penghubung ('linker') antara Tc99m dan peptida, dan dapat dipilih peptida lain yang sesuai dengan tujuan pemakaian, misalnya HNE2 untuk penatah inflamasi atau ubiquicidin (UBI I) untuk penatah infeksi.
5.
CLEMENS DECRISTOFORO, MATHER, "Technetium-99m analogues: effect of _abelling peptide sequence", Eur J Nucl 26:869-876
6.
MARY RUSCKOWSKI, TONG QU, JAMES PULLMAN, et aI, "Inflammation and Infection Imaging with a 99mTc-Neutrophil Elastase Inhibitor in Monkeys", J Nucl Med, Vol. 41, No.2, Feb. 2000, 363-374
7.
CHARLES B. SAMPSON, Textbook of Radiopharmacv: Theorv and Practice, Third Edition, Gordon and Breach Science Publishers.
TANYAJAWAB TumpaI Pandiangan o
I. VIRGOLlNI, T. TRAUB, C. NOVOTNY, et ai, "New trends in peptide' receptor radioligands", QJ.Nucl.Med 2001; 45: 153-9
2.
T.M. BEHR, M. GOTTHARDT, A. BARTH, et aI, "Imaging tumors with peptide-based radioligands", QJ Nucl Med 200 I ;45: 189-200
3.
CLEMENS DECRISTOFORO and STEPHEN J. MATHER, "Preparation, 99mTc-Labeling, and in vitro Characterization of HYNIC and N3S Modified RC-160 and [Tyr3]Octreotide", Bioconjugate Chern., Vol. 10, No.3, 1999.
4.
ERNEST KJ. PAUWELS, V. RALPH MCCREADY, JAN H.M.B. STOaT, et ai, "The mechanism of accumulation of tumourlocalising radiopharmaceuticals", Eur J Nucl Med (1998) 25:277-305
Bagaimana cara membandingkannya dan mana yang terbaik untuk diimplementasikan ?
Widyastuti o
Kedua metode dibandingkan efisiensi pelabelannya, stabilitas in-vitro (dalam serum dan fosfat buffer salin) dan efektivitasnya sebagai pencitra tumor, serta kepraktisan dalam proses pengerjaan. Yang terbaik adalah metoda menggunakan NHS-Hynic karena lebih praktis dan efisien, sedangkan parameter lainnya yang dibandingkan tidak memberikan perbedaan yang berarti.
Gina Mondrida o
Kenapa uji biodistribusi dilakukan pad a tikus yang sehat, bukan pada tikus yang menderita tumor?
o
Uji stabilitas in-vivo kenapa tidak dilakukan ?
DAFTAR PUSTAKA I.
STEPHEN J. somatostatin methods and Med (1999)
Widyastuti Vii biodistribusi pada tikus sehat dimak.sudkan untuk melihat sifat farmakokinetik sediaan Tc99mpeptida. yang mana apabila sebagian besar terakumulasi pada saluran kemih dan ginial dan hanya sebagian kecil yang terakumulasi pada organ lain. hal ini menunjuk.kan sifat farmakokinetik yang baik/sesuai dengan kegunaan sebagai penatah tumor. Vii biodistribusi pada tikus yang sakit (menderita tumor) seharusnya dilakukan tetapi fasilitas laboratorium untuk menginduksi tumor be/um tersedia.Karena liii stabililas in-vitro yang dilakukan dalam serum manusia segar dan dapar fosfat-salin sudah mewakili kondisi in-vivo.
Prosiding PPI - PDIPTN 2006 Pustek Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 10 Jull 2006
KE DAFTAR ISI
