Etgeniall (3) Juli 2005
PENGGUNMN PENANDA MOLEKULER RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD} UNTUK ANALISIS KERAGAMAN GENETIK KELAPA WEST AFRICAN TALL IWAT} Edy F. Lengkongl dan S.D. Runtunuwul,2 ABSTRACT Lengkong, E.F. and s.D. Runtunuwu. 2005. use of Molecular Marker Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) to Genetic Diversity anatysis of west African Tall(WATICoconut. Eugenia 11 (3): 210-217. ;
lnformation on genetic divercity of crop germplasm has several important implications for plant breeder. Among others is to help the breeders to decide what sour@s to cross so as to making new genetic mmbinatbn. The Use of molecular marker to genetic diversity analysis on DNA level is usefull, because it provides an opportunity to more precisely measure genetic relationships as well as is not affecfed by the environment. The objective of this researcfr was to anatyze genetic diversity of West Atiran Tall (WAT) using molecular marker
MPD. Five abritrary 1O-mer primers were used to amplifo total DM genom, and
to generate 44 band DNA with 26 band or 59 % were polymorphic band. lt was revealed that genetic diversity within population of WAT comcnut was 14 %. Based on cluster analysis, at the genetic similarity 85 0/o or genetic diversity 15 % the population was separated on three clusters. This researdr mnduded
that the population of WAT coconut grown ftom open pollinated seeds has difierent gerptype one
each
others.
Keywords : West African Tall (WAT), Coconut RAPD
kegiatan pemuliaan kelapa yang dilakukan saat ini membufuhkan wakfu yang cu-
PENDAHULUAN Program pemuliaan kelapa di lndo-
nesia bertujuan menghasilkan
kelapa
yang mempunyai karakteristik antara lain berbunga cepat, habitat pohon pendek, resisten terhadap hama dan penyakit, hasil kopra persatuan areal tinggi dengan pemupukan rendah, ukuran buah besar,
daging buah tebal, kandungan minyak
tinggi, dan kandungan air rendah. (Rompas, Luntungan, dan Novarianto 1988).
Permasalahan pemuliaan kelapa di lndonesia saat ini adalah walaupun terse-
dia cukup banyak tanaman calon tetua potensial, namun informasi tentang keragaman genetika pada umumnya belum cukup tersedia. Selain masalah tersebut, 1
2
kup lama (sekitar 7-8 tahun) baru dapat diketahui hasil dari suatu persilangan yang telah dilakukan. Kelapa WAT (West ltfiican lal/) merupakan salah satu tetua jantan potensial untuk program pemuliaan kelapa, berasal
dari Pantai Gading dan rnerupakan tetua
jantan dari kelapa hibrida
P8121 (MYD/GKN x WAT), sifatnya berproduksi tinggi, kandungan minyak tinggi, buah besar tetapi tidak tahan terhdap penyakit busuk pucuk lnformasi tentang keragaman genetika plasma nutfah tanaman memiliki beberapa fungsi penting yang dapat dimanfaatkan pemulia tanaman dalam pengembangan tanaman unggul. Penentuan hubu-
Lab. Genetika dan Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian UNSRAT Manado, 951 15 Lab. Fisiologi Tanaman Fakuftas Pertanian UNSRAT Manado, 95.1 15
210
I I
Lengkong, E.F- dan S.D. Runtuntrwu : penggunaan penanda Molekuler.
ngan genetika dari sumber plasma nutfah spesmk juga sangat berguna untuk menentukan galur atau populasi mana yang
akan dipertahankan untuk memaksimal-
kan keragaman genetika plasma nutfah (Thormann and Osbom 1992). lnformasi yang akurat tersebut tidak dapat diperoleh
dengan hanya menggunakan penanda morfologis atau sitologis karena kedua penanda jenis ini selain pemanfaatannya terbatas juga memperlihatkan sifat pewarisan yang dominan atau resesif, memiliki
tingkat polimorfisme yang sedikit, dan dipengaruhi oleh lingkungan (Aswidinnoor 1991).
Random amplffeid potymorphic DNA (RAPD) merupakan salah satu penanda
pada tanaman kelapa mula-mula dilaporSumer et at. 1gg7 yang meng- r, analisis ker4aman genetika kelapa yang
kan oleh
terdapat di witayah pasifik Selatan. Di lndonesia sendiri penelitian penggunaan penanda RAPD untuk analisis keragaman genetika kelapa baru dimulai tahun 199g,
seperti yang dilaporkan oleh Lengkong,
Ha(ana dan Suharsono (1ggg)
yang
menganalisis keragaman genetika kelapa Genjah Kuning Nias (GKN), Genjah Kunig
Bali (GKB) dan Genjah Oranye Sagrat (GOS) yang terdapat di kebun koteksi BALITKA Manado. Runtunuwu dan Lengkong (2005) menggunakan penanda RAPD untuk melihat beberapa hasil persilangan kelapa Genjah Satak (GSK) de ngan beberapa Kelapa Dalam dalam hu-
molekuler yang dapat digunakan untuk mendeteksi keragaman genetika pada
bungannya dengan ketahanan terhadap
tingkat DNA (deoxynbonucleic rcid1,
pnyakit gugur buah.
bail
pada daerah penyandi maupun bukan daerah penyandi protein dengan cara mendeteksi sekuens polimorphis dalam rantai nuklmtida. RAPD dapat mendetek-
si
keragaman DNA dari suatu populasi
Tujuan penelitian ini adalah menganalisis keragaman genetik kelapa Wesf African lal/ (WAT) dengan memanfataan
penanda molekular Random Amptifid Polymorphic DNA (RAPD).
tanaman berdasarkan pada penggandaan DNA secara benntai (potyrnerase chain
METODE PENELITIAN
reaction, PCR). Penggunaan penanda molekuler RAPD untuk analisis keragaman genetika selain tidak dipengaruhi lingkungan, juga memberikan hasil yang lebih cepat karena dapat mendeteksi hasil per-
silangan pada saat dini (pada stadia bibit)
(Tingey
ef
aI 1992; Sambrook, ef a/.
1989) sehingga penerapannya pada tana-
man tahunan seperti kelapa akan sangat membantu dalam efisiensi waktu terutama untuk mendeteksi hasil suatu persilangan.
Penggunaan penanda molekuler RAPD untuk tujuan pemuliaan tanaman sudah banyak dilaporkan antara lain oleh Lengkong (2001) yang menganatisis ke
ragaman genetika beberapa galur padi gogo. Sriyadi et at. QA02) yang mempe
Bahan dan Cara Keria Bahan tanaman yang dianalisis yaitu
kelapa WAT berasat dari kebun pTpN
XV unit Halmahera Utara di Boyong Atas. Dari seluruh populasi dipilih secara acak 30 pohon sampel. Masing-masing tanarn an sampel diambil daunnya yang masih muda (berupa daun tombak{anur) yang akan diisolasi DNAnya untuk analisis RAPD.
lsolasi DNA total tanaman akan dilakukan mengikuti Rohde ef a/. (19g5) dengan beberapa perubahan (Runtunuwu, Hartana dan Suharsono 2002). Daun ke
g akan digerus bersama 10 mf bufer lisis (100 mM Tris HClpHS, '1,4 M NaCt,20 mM EDTA, 2 % CTAB + 0,2 % p-merkaptoetanol ditamlapa rnuda seberat 1,5
lajari hubungan kekerabatan tanaman teh.
Sedangkan Fnggunaan penanda RApD
271
Eugenia 1'l (3) Juli 2005
bahkan pada saat akan digunakan) dan pasir kwarsa 70 mg lalu dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 15 ml. Setelah di_ inkubasi selama g0 menit pada 60 "C larulan yang mengandung DNA dikoleksi dengan disentrifus pada kecepatan 3500 rpm selama 15 menit lalu diekstraksi dengan kloroform. Selanjutnya DNA dipresi_
pitasi dengan menambahkan 0,g volume isopropanol lalu diendapkan dengan disentrifus pada kecepatan 3500 rpm se_ lama 15 menit. DNA dikeringkan dan dita-
rutkan dalam 100 prl akuabides steril. Konsentrasi DNA ditentukan berdasarkan nilai absorbansi Azoo, nilai Azoo = setara
dengan 50 pg DNA/ml. Sedangkan ke_ mumiannya ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi
yang murni mempunyai Azoo/Azao 1
=
1,8
Azoo/Aza0.
DNA
perbandingan
- 2,0 (SambrOOk ef aL
989).
Amplifikasi (penggandaan) pCR
DNA dilakukan menggunakan
mesin
Thermocycler Gene Amp pCR Sysfem 2700 (Applied Eiosysfem). primer yang di_
gunakan untuk proses amplifikasi pCR adalah sebanyak 5 jenis primer acak 10-
mer (Operon Technologies, Alameda Califomia), untuk masing-masing DNA sampel. Adapun komposisi dari volume reaksi PCR sebanyak S0 pl, yang m+ ngandung: bufer pCR, 200 pM dNTp (dATP, dGTP, dCTp, dan dTTp), 2,5 mM MgClr, 1 u Taq DNA polimerase (pharmacia), 5 pmol primer, dan 50 ng DNA ceta_ kan. Kondisi amplifikasi pCR yang akan digunakan adatah : (1). pra-pCR 95"C/S
menit, (2). Denaturasi g5"C/1 menit, (3).
Pelekatan primer 3T,C 11 menit, (4) l2"Cl2 menit), dan
Pemanjangan DNA
Pasca-PCR 72"CtS menit). Tahap 2 _ 4 dilakukan sebanyak 35 siklus ( Lengkong et al. 2001). Hasit amptifikasi pCR akan dielektroforesis pada 75 V selama 2 jam 30 menit datam 1 % gel agarosa talu di_ warnai dengan etidium bromida. polimor_
fisme pita DNA hasit amplifikasi pCR akan diamati dan akan didokumentasi di atas lampu UV.
Tabel 1. Primer yang Digunakan dan sekuens Nukreotidan ya (pimers were rJsed and /fs Nucleotide Seguence)
Analisis data dilakukan dengan cara pola pita DNA setiap tanaman kelapa un_ tuk setiap primer hasil elektroforesis pada
gel agarose diinterpretasi datanya berda_ sarkan pita DNA yang dihasilkan. Setiap
Q_ UE-
pita dianggap sebagai satu karakter, dan dinilai ' 1 'bila ada pita dan , 0 , bila tidak
Dimana:
ada pita yang terlihat. Berdasarkan atas
So
ada atau tidak adanya
pita DNA tersebut,
disusun matriks data biner untuk semua
212
h
primer, kemudian diturunkan matriks jar:ak kesamaan genetika antar individu tanam_ an dengan menggunakan koefisien kesa maan Jaccard, dengan persamaan :
:
A+B+C
Nilai
kesamaan genetika antara individu tanaman dan individu tanaman s
r
Lengkong, E.F. dan S.D. Runtuntrwu : Penggunaan Penanda Molekuler.
A
:
Jumlah pita DNA yang terdapat baik
dikerjakan melalui program komputer
pada individu tanaman
Numerical Taxmomy Sysfem (NTSyS-pc)
r
maupun
individu tanaman s
versi1.70.
B : Jumlah pita DNA yang hanya terdapat pada individu tanaman s C : Jumlah pita DNA yang hanya terdapat pada individu tanaman r
HASIL DAN PEMBAHASAN Profil Pita DNA Hasil Amptifikasi
Data jarak genetika antar masing-
Hasil ampltflkasi PCR dengan menggunakan 5 jenis primer random menunjuk-
masing individu tanaman ini selanjutnya digunakan untuk analisis pengelompokan secara sequential agglomerative, hierar-
kan masing-masing primer memberikan hasil penggandaanlamplifikasi pita DNA dengan polimorhisme yang beragam.
chical and nested clustering (SAHN) menggunakan metode UPGMA (unweighted pairgroup method arithmatic) dan dibentuk dendrogram untuk melihat hubungan antar individu satu dengan individu lainnya. Keseluruhan analisis data ini
Adapun ukuran pita DNA yang dihasilkan berukuran antara 15G3050 bp, dan memiliki resolusi yang berbedabeda yaitu dari yang sangat jelas dan tebal sampai yang suram dan tipis.
Gambar 1. Profll Pola Pita DNA Ketapa wAT Hasit Amptifikasi pcR Menggunakan Primer oPB-07. Lajur 1 adalah penanda DNA 1 kb Ladder, sedangkan Lajur 2-14 merupakan Sampet Kelapa WAT nomor 14-26. (Banding Pattems DNA Proftte of wAT c.acocnut Amptified by opB4T primer. tane 1 was Ladder DNA Maker, Lane 2-14 Were the Samp/e Tree no. l-i3 of WAT Cocon ut, Respectively)
2
Hasil amplifikasi PCR pada Tabet menunjukkan bahwa pada kelapa wAT dengan menggunakan 5 jenis primer random dapat diamplifikasi 44 pita DNA
de
ngan jumlah pita polimorphis sebanyak
26
banyaknya pita polimorphis akan lebih dapat menggambarkan keadaan genom ta naman dan akan memperkecil bias yang disebabkan tidak tenrakitinya bagian-bagian genom (Neinhuis ef a/. 1994). per-
pita atau sebesar 59 o/o. Jumlah pita poti- bedaan jumlah dan polimophis pita DNA morphis dalam analisis keragaman gene- yang dihasilkan setiap primer menggamtik sangat berpengaruh dalam penentuan barkan kekompleksan dari genom yang tingkat keragaman suatu populasi, karena diamati (Grattapaglia et. al.1gg2).
213
7: Eugenia 11 (3) Juli 2003
Tabel 2. Primer dan Jumrah pita DNA yang Diamprif ikasi (primer and Numbr of DNA Bands that Amptified)
WAT
Keragaman Genetik Kelapa West African Tall(WAT) Keragaman genetik populasi kelapa
WAT ditentukan berdasarkan hubungan kesamaan genetik antara satu individu ta_ naman dengan tanaman kelapa yang lain
dengan cara membandingkan pola pita DNA yang dihasitkan dariampliflkasi pCR menggunakan koefisien kesamaan jarak Jaccard. Hasil analisis kesamaan genetik menunjukkan bahwa kelapa WAT memili_
ki kesamaan genetik sebesar g6 yo atau keragaman genetik dalam populasi seb+ sar 14 %. Ker4aman tertinggi (29 Vo) di_
jumpai antara individu WAT2 dan WAT21 sedangkan yang terendah (0 o/o) dijumpai antara individu WAT 'lg dan 21.
Keragaman genetik
sehsar 14
yo
dari ke 30 ketapa WAT yang dianalisis tersebut menunjukkan bahwa populasi kela_
pa WAT yang ditanam di kebun pTpN XIV unit Hatmahera Utara di Boyong Atas
berasal dari benih hasil dari persilangan alami dengan status genotip yang tidak homogen. Hal inidisebabkan tanaman
ke_
lapa memitiki empat pola penyerbukan yaitu : alogami sempurna, autogami lang_ sung, autogami semi langsung dan auto_
gami tak langsung (Rognon 1g76). De_ ngan penyerbukan seperti ini sangat memungkinkan terjadinya penyerbukan si_ lang baik antar pohon dalam satu kultivar, ataupun antar tanaman kelapa kultivar berbeda. Akibat sistem penyerbukan se_
214
perti ini, maka buah kelapa yang dihasil_ kan baik dari satu manggar ataupun ber_ lainan manggar dalam satu pohon sulit di_ pastikan genotipenya.
Analisis pengelompokkan seperti yang terlihat pada dendrogr:am (Gambar 2)yang diturunkan dari matriks kesamaan pada kelapa WAT menunjukkan bahwa pada tingkat kesamaan genetik g5
o/o
atau
keragaman 15 o/o, maka populasi kelapa terbagi atas 3 kelompok utama yaitu, ke_ lompok I terdiri atas 8 tanaman (WAT 1,
WAT4, WAT6, WAT2, WAT7, WATg, WAT10, WATS), ketompk lt terdiri atas 20 tanaman (WAT3, WAT26, WAT16,
WAT13, WAT14, WAr27, WAT12, WAT19, WAT21, WAT22, WAT28, WAT29,
WAT11, WAT2O,
WAT18,
WAT3O, WAT17, WAT23, WAT24, dAN WAT25), dan kelompok ilt tediri atas 2 tanaman (WATS dan WAT.I5).
Pengelompokan diatas didasarkan atas kesamaan yang dimilikioleh masingmasing individu, sehingga individu_indivi_ du kelapa yang berada dalam satu kelom_ pok secar:a langsung memiliki tingkat k+ samaan genetik yang relatif sama diban_ dingkan dengan individu-individu kelapa yang ada dalam kelompok lainnya, Setiap kelompok individu tersebut selanjutnya dapat mewakili satu kelompok genetik ter_ tentu.
Lengkong, E.F. dan S.D. Runtmuwu: Penggunaan Penanda Molekuler.
0,80
0,85 I
0,90 I
0,95
1,00 I
WATI WAT4 WAT6 WAT2 WATT
WAT9 WATIO WATS
WAT3 WATz6
WATI6 WAT13
WATI4
wNt27 WATII WAT12 WAT19
WAT2l WAT2O
WAT22 WAT28
WAT29
WATl8 WAT3O
WATIT
wNr23 wNt24 WAT25 AT5
WATI5
Gambar 2. Dendrogram Kelapa West African Tall (WAI) {Dedrogram of West Nrican TallWAT Coconufl
215
Eugenla 11 (3) Juli 2005
lmplikasi dari hasil pengelompokan pertanian ll. pusat Antar Universitersebut untuk program pemuliaan tas (pAU) Bioteknologi, lp&Bogor.
kelapa
khususnya bila kelapa WAT tersebut akan digunakan sebagaitefua jantan untuk
silangan adalah dengan
per- Grattapaglia, D., J. chapano, p. wilcox, memperlakukan S. McCord, D. Wemer, H.
masing-masing tanaman
seb4ai
individu Amerson, S. McKeand, F. Bridgwater, R. Whetten, D. sertidak o'Malley, and R. sederoff. 1g92. dengan Mapping in woody ptants with tidak RAPD markers: applhation to memungkinkan karena dibutuhkan jumlah breeding in forestry and horticulserbuksari yang cukup banyak, maka ture, p. 3740. tn Application of penggabungan serbuksari disarankan haRAPD Technotogy to plant Breenya dapat dilakukan antana individu-indivi- ding. Joint ptant Breeding du pohon yang terdapat dalam satu kesymposia series, Minneapolis, lompok saja. Minnesota. yang berbeda genotipenya sehingga buksari dari populasi kelapa wAT dapat di bulk atau digabung satu yang lainnya. Kalaupun kondisinya
Lengkong,
KESIMPUIAN
1.
2.
Keragaman genetik populasi kelapa WAT sebesar 14o/o Populasi kelapa ltt/AT yang dianalisis berasal dari benih hasil penyerbukan terbuka dimana setiap individu kelapa memiliki genotipe yang berbeda satu dengan lainnya.
UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini merupakan sebagian
dari penelitian yang dibiayai oleh Riset Pengembangan Kapasitas (RpK) tahun
Bogor 123:1-12.
---, E.F. 2001, Keragaman Geneti ka Beberapa Galur padi Gogo Berdasarkan Penanda Molekuler Random Amptifted potymorphic DNA (RAPD). Eugenia 7 (4):201207.
E.F., Suharsono, D.D.
Hayati 8 (4):121-123 and
G.M. Halloran. 1997. RApD Analysis of South Pacific Coconut palm Populaton. Crop Sci. 37:992-gg7
Aswidinnoor, H. 1991. Rekayasa Genetika, p. 96-186. Dalam S. Hanan N. Ansory
(ed).
dan
Runtunuwu dan A. Hartana. 2001. Pengoptimum reaksi berantai polimerase DNA tanaman kelapa.
DAFTAR PUSTAKA
dan
Hartana
Random Amplified polynorphic DNA (RAPD). prosiding Hasit Penelitian Bidang ltmu Hayat. tpB.
2003 No. Kontrak 04/02/St(Rpru2003.
Ashbumer, R.G., W.K. Thomson,
E. F., A.
Suharsono. 1998. Keragaman Genetika Beberapa Kultivar Kelapa Genjah Berdasarkan penanda
Bioteknotogi
J. Tivang, and p. Skroch. 19%. Analysis of genetic relaUonship among genotypes based on
Nienhuis, J.,
molecular marker data, p. g-14. tn Analysis of Malecular Marker Data.
Joint Plant Breeding Symposia Series, Corvalis,
216
Lengkong, E.F. dan S.D. Runfuntrwu: Penggunaan Penanda Molekuler.
Rognon,
F.
1976. Floral biology
of
Sambrook,
J., E.F.
Fritsch, and
T.
Maniatis. 1989. Molecular cloning.
coconut duration and sequence of male and female Phase in various types of coconut. Oleagineux
A laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. CSH, New York.
31:13-17.
Sriyadi, B., R. Setiamihardja, A. Baihaki,
dan W. Astika. 2002. Hubungan Kekerabatan Genetik antar Tanaman the F1 Dari Persilangan Tri 2024xPS 1 Berdasarkan Penanda
Rohde, W,, A. Kullaya, J. Rodriquez, and E. Ritter. 1995. Genome analYsis
of
Cocos nucifera
L. bY PCR
amplification of spacer sequences separating a subset of coPralike
EcoRl repetitive elements.
RAPD. ZunalT (1) : 11-20
J.
Genet. Breed. 49:179-186.
T., H.T. Luntungan, dan h. Novarianto. 1988. Metoda Pemu-
Rompas,
liaan Kelapa. Hal. 27-39. dalam Prosiding SimPosium I Hasil Pe nelitian dan Pengembangan Tan+ man lndustri, Buku ll. KelaPa l.
Thormann, C.E. and T.C. Osborn. 1992. Use of RAPD and RFLP markers for germplasm evaluation. p. 911. ln Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. Joint Plant
Brreding Symposia
Puslitbangtri, Bogor. Runtunuwu, D.S,, A. Hartana, Suharcono.
2002. Teknik RAPD
Tingey, S.V., J.A. Rafalski, and J.G.K.
dengan
Williams. 1992 Genetic analysis
metode ekstraksi DNA dan kit PCR yang berbeda. HaYati 9 (3) : 94-
with RAPD markers, p.3-8.
96.
plant breeding. Joint
7,
PER-8, dan RAPD
Breeding Symposia Minneapolis, Minnesota.
0B17g7s
pada Kelapa Genjah Salak (GSK) dan Beberapa Hreil SilangannYa dengan KelaPa Dalam. Eugenia
ln
Application of RAPD technology to
Runtunuwu, S.D. dan E. Lengkong. 2005. ldentifikasi Penanda lzozim PER-
,
Series,
Minneapolis, Minnesota. 1 November 1992 . CSSA, Am Soc. Hoffcul. Sci., and Am. Genet. Assoc.
11
(1):8-17
217
Plant
Series,
