PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER DNA DALAM IDENTIFIKASI SEL GONAD IKAN GURAME (Osphronemus gouramy) DAN IKAN NILA (Oreochromis niloticus) MENGGUNAKAN PCR
MARLINA ACHMAD
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Agustus 2009
Marlina Achmad NIM C151060021
ABSTRACT
MARLINA ACHMAD. Establishment of DNA Molecular Marker in Gonad Cell Identification of Gouramy (Osphronemus gouramy) and Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) Using PCR. Under direction of ODANG CARMAN, and ALIMUDDIN The technology of fish germ cell transplantation had been established to create broodstock systems by which a target offspring can be produced from a surrogate parent. This technique successfully applied in salmonid. Donor cell for transplantation is derived from transgenic fish carrying green fluorescent protein gene functions as a marker to distinguish the donor from recipient cell. In this study, we developed an alternative technique for identifying gouramy-derived donor cell and nile tilapia as recipient by PCR amplification method using growth hormone (GH) and vasa genes as a molecular marker. Beta actin gene was used as an internal control of DNA loading. The result showed that a specific PCR amplification product of 340 and 300 bp in length was obtained for GH and vasa, respectively. Both of evaluated molecular markers could be used to distinguish the donor cell, and GH marker showed higher sensitivity than vasa marker. Keywords: transplantation, GH, vasa, marker, gouramy.
RINGKASAN
MARLINA ACHMAD. Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR. Dibimbing oleh ODANG CARMAN, dan ALIMUDDIN. Teknologi transplantasi sel germinal ikan telah dikembangkan baru-baru ini untuk merekayasa produksi benih ikan melalui induk “semang” (surrogate broodstock. Teknologi induk “semang” tersebut dilakukan dengan cara mentransplantasikan primordial germ cells (PGC) atau sel spermatogonia di dalam rongga perut larva ikan resipien, selanjutnya sel transplan berdiferensiasi menjadi telur atau sperma. Pemijahan ikan resipien yang membawa sperma dan telur yang berkembang dari sel donor, akan menghasilkan ikan target. Transplantasi sel germinal dari ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) pada ikan salmon masu (Oncorhynchus masou) menghasilkan anak berupa ikan rainbow trout. Teknik ini berpotensi digunakan untuk merekayasa produksi benih ikan-ikan di Indonesia, khususnya ikan yang matang gonad relatif lambat seperti ikan gurame. Identifikasi sel donor atau sel tranplan dalam individu ikan resipien umumnya dilakukan dengan cara mengamati pendaran sel transplan yang mengekspresikan gen GFP (Green Fluorescent Protein) mengunakan mikroskop fluorescent. Sel tranplan tersebut diperoleh dari ikan transgenik. Akan tetapi, produksi ikan transgenik membutuhkan waktu yang cukup lama, dan ketersediaan mikroskop fluorescent masih terbatas di Indonesia. Selain dengan GFP, marka PKH26 juga telah digunakan untuk mengidentifikasi sel donor. Akan tetapi, karena harga PKH26 yang relatif mahal, sehingga metode ini kurang efisien diaplikasikan di Indonesia. Dengan demikian, pada penelitian ini ingin dikembangkan metode alternatif yang, yakni menggunakan marka mlebih aplikatifolekuler berupa primer spesifik, yang diamplifikasi dengan PCR. Primer spesifik tersebut didisain dari sekuen gen sebagai marka molekuler untuk ikan donor. Pada ikan gurame, sekuen gen yang tersedia adalah growth hormone (GH) dan vasa. Penelitian ini dilakukan untuk mengevaluasi cara alternatif pendeteksi sel gonad donor dalam individu resipien pada proses transplantasi menggunakan PCR. Tahapan penelitian yang dilakukan untuk mencapai tujuan penelitian, dilakukan dengan empat kegiatan yaitu disain primer, eksraksi DNA, amplifikasi DNA dengan PCR, uji spesivitas primer, dan uji sensitivitas PCR dalam membedakan ikan gurame dan ikan nila. Disain primer spesifik untuk marka GH dan vasa dilakukan dengan menyejajarkan sekuen GH dan vasa gurame dan nila menggunakan program GENETYX versi 7.0. Sebagai kontrol internal loading DNA untuk kedua primer spesifik ikan gurame digunakan beta aktin yang bersifat universal dan dapat mengikat sekuen DNA gurame maupun nila. Primer forward dan reverse β-aktin adalah F (5’-GTGCCCATCTACGAGGGTTA-3’) dan R (5’-TTTGATGTCACGCACGATT-3’). DNA diekstraksi dari potongan sirip ikan gurame, menggunakan KIT (Gentra, Minneapolis, USA) yang dilakukan sesuai prosedur manual KIT. Setelah DNA genom diperoleh, dilanjutkan dengan proses
PCR. Dalam proses PCR, dilakukan optimasi beberapa kombinasi suhu annealing dan durasi ekstensi untuk memperoleh kondisi PCR yang optimal bagi masingmasing primer hasil disain. Suhu annealing yang dicobakan adalah untuk primer GH adalah 58 dan 59oC, sedangkan vasa adalah 59, 60, dan 61oC. Lama waktu ekstensi yang diujikan untuk sama untuk masing-masing primer yaitu 30 dan 45 detik. Setelah kondisi optimal diperoleh, dilanjutkan pada tahap pengujian spesivitas primer hasil disain. Tahap ini dilakukan dengan masing-masing DNA gurame dan nila di PCR, selanjutnya di elektroforesis, dengan harapan hasil amplifikasi menunjukkan pita produk PCR secara spesifik hanya pada ikan gurame. Setelah dilakukan pengujian spesivitas, dilanjutkan pada tahap akhir yakni pengujian sensitivitas PCR dalam membedakan DNA ikan gurame dan DNA ikan nila. Pengujian sensitivitas dilakukan dengan menghitung konsentrasi masing-masing DNA menggunakan GENEQUANT,selanjutnya membuat pencampuran DNA gurame dan nila dengan berbagai rasio secara gradual. Pencampuran DNA dari berbagai rasio di PCR, kemudian di elektroforesis, dengan harapan sensitivitas PCR dapat menunjukkan konsentrasi terendah DNA gurame di dalam DNA nila dengan primer spesifik yang berbeda. Hasil penyejajaran primer GH diperoleh sepasang primer forward dan reverse spesifik ikan gurame dengan sekuen masing-masing F1GH (5’-TGTTCTCTGACGGCGTGGTT-3’) dan R1GH (5’-GCAACAAAAAACCACCAGAAAGAG-3’). Sama halnya GH, dari penyejajaran vasa juga diperoleh sepasang primer forward dan reverse spesifik ikan gurame yakni F2VSGR (5’-TGAAGAAGAGTGGGAGTAGAAGG-3’) dan R3VSGR (5’-ACGTTCTGTCTGTCAGACACATTG-3). Untuk kondisi yang optimal, primer GH menggunakan suhu annealing 58oC dengan durasi ekstensi 45 detik, sedangkan vasa dengan suhu annealing 61oC dan lama waktu ekstensi 45 detik. Berdasarkan uji spesivitas primer, baik primer GH maupun vasa menunjukkan spesifik hanya bagi DNA ikan gurame saja. Hal ini ditunjukkan dengan pita yang jelas dan konsisten pada masing-masing sampel DNA gurame. Dengan demikian, membuktikan bahwa bahwa primer GH dan vasa hasil disain hanya dapat mengikat sekuen DNA gurame secara spesifik, tidak dapat mengikat sekuen DNA nila. Primer beta aktin tidak bersifat spesifik karena dapat mengikat kedua sekuen DNA baik gurame maupun nila. Hasil sensitivitas PCR menunjukkan bahwa primer GH dapat mendeteksi sampai konsentrasi terendah DNA gurame 1 ng/μL, sedangkan vasa hanya mendeteksi sampai 50 ng/μL masing-masing di dalam konsentrasi DNA nila 700 ng/μL. Hal ini mengindikasikan bahwa primer GH lebih sensitif dibanding vasa dalam membedakan DNA gurame setelah terinkorporasi di dalam DNA nila. Berdasarkan penyetaraan konsentrasi DNA dan jumlah sel, diduga bahwa dengan marka molekuler GH dapat mendeteksi 1 sel gurame di dalam 104 sel nila Kata kunci : Ikan gurame, GH, vasa, marka, transplantasi.
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2009 Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencatumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PENGEMBANGAN MARKA MOLEKULER DNA DALAM IDENTIFIKASI SEL GONAD IKAN GURAME (Osphronemus gouramy) DAN IKAN NILA (Oreochromis niloticus) MENGGUNAKAN PCR
MARLINA ACHMAD
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Dinamella Wahjuningrum, S.Si, M.Si
Judul Tesis
:
Nama NIM
: :
Pengembangan Marka Molekuler DNA dalam Identifikasi Sel Gonad Ikan Gurame (Osphronemus gouramy) dan Ikan Nila (Oreochromis niloticus) Menggunakan PCR Marlina Achmad C151060021
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Ir. Odang Carman, M.Sc Ketua
Dr. Alimuddin, S.Pi, M.Sc Anggota Diketahui
Ketua Program Studi Ilmu Perairan
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. Ir. Enang Harris, M.S
Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
Tanggal Ujian: 20 Agustus 2009
Tanggal Lulus:
