PENGARUH FERMENTASI TERHADAP KANDUNGAN SENYAWA BIOAKTIF DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BUAH BAKAU MERAH (Rhizophora stylosa Griff.)
DHIO ANUGRAH PRATAMA
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pengaruh Fermentasi terhadap Kandungan Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Antioksidan Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa Griff.) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, November 2014
Dhio Anugrah Pratama NIM C34100072
* Perlimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait
ABSTRAK DHIO ANUGRAH PRATAMA. Pengaruh Fermentasi terhadap Kandungan Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Antioksidan Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa Griff.). ELLA SALAMAH dan SRI PURWANINGSIH. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan pengaruh fermentasi terhadap kandungan senyawa bioaktif dan aktivitas antioksidan pada buah bakau merah (Rhizophora stylosa). Fermentasi buah bakau dilakukan dengan penambahan ragi dan garam. Pengamatan dilakukan pada minggu ke 0, 2, 4, 6 dan 8. Komponen bioaktif yang terkandung dalam fermentasi buah bakau adalah steroid,saponin, dan tanin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fermentasi buah bakau meningkatkan aktivitas antioksidan pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8. Hasil uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menunjukan toksisitas rendah dengan nilai LC50 antara 200 ppm hingga 700 ppm pada seluruh minggu pengamatan. Kata kunci: antioksidan, buah bakau, fermentasi, komponen bioaktif, toksisitas.
ABSTRACT DHIO ANUGRAH PRATAMA. The Influence of Fermentation to Bioactive Compounds and Antioxidant Activity of Red Fruit Mangrove (Rhizophora stylosa Griff.). ELLA SALAMAH and SRI PURWANINGSIH. The aim of this research was to determine the influence of fermentation to bioactive compound and antioxidant activity of red mangrove fruit (Rhizophora.stylosa Griff.). Red mangrove fruit was fermented by added yeast and salt. In this study, the data were conducted in week of 0, 2, 4, 6, and 8. The bioactive compounds detected in fermented extract of fruit mangrove were steroid, saponin, and tannin. The result showed that fermented extract of red mangrove fruit increased antioxidant activity in week 0 until week 8. The toxicity Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) showed low toxicity with LC50 value were between 200 ppm until 700 ppm in whole week. Keywords: antioxidant, bioactive compound, fermentation, fruit mangrove, toxicity.
PENGARUH FERMENTASI TERHADAP KANDUNGAN SENYAWA BIOAKTIF DAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN BUAH BAKAU MERAH (Rhizophora stylosa Griff.)
DHIO ANUGRAH PRATAMA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Departemen Teknologi Hasil Perairan
DEPARTEMEN TEKNOLOGI HASIL PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi
: Pengaruh Fermentasi terhadap Kandungan Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Antioksidan Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) Nama : Dhio Anugrah Pratama NIM : C34100072 Program Studi : Teknologi Hasil Perairan
Disetujui oleh
Dra Ella Salamah, MSi Pembimbing I
Dr Ir Sri Purwaningsih, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2014 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah subhanahu wa ta’ala, atas berkat rahmat dan anugerah-Nya penulis dapat menyelesaikan Skripsi dengan judul Pengaruh Fermentasi terhadap Kandungan Senyawa Bioaktif dan Aktivitas Antioksidan Buah Bakau Merah (Rhizophora Stylosa). Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana perikanan pada Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, terutama kepada: 1. Dra Ella Salamah, MSi dan Dr Ir Sri Purwaningsih, MSi selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan dalam penyusunan skripsi. 2. Dr Desniar SPi MSi selaku dosen penguji yang telah memberikan pengarahan dalam penyusunan skripsi. 3. Prof Dr Ir Joko Santoso, MSi selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan. 4. Dr Ir Iriani Setyaningsih, MS selaku Ketua Program Studi Teknologi Hasil Perairan. 5. Ayah, Ibu tercinta dan keluarga besar yang telah memberikan semangat, dukungan moril, materi serta cinta yang luar biasa kepada penulis. 6. Teman Laboratorium Biokimia (Risvan, Mahisha, Dhio, Indah, Anisa), Bejo, Tebe, Mayang, Anastasia, Zeta, Emilia, dan seluruh keluarga besar THP 47 atas segala bantuan, doa, semangat, dan dukungan yang telah diberikan. 7. Teman Smanda (Egi, Dicky, Bayu, Hilman, Ade, Rayhan, Fahmy) atas semangat, dukungan, bantuan, dan doa yang telah diberikan. Kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan untuk perbaikan di masa depan. Demikian skripsi ini disusun, semoga bermanfaat.
Bogor, 19 November 2014
Dhio Anugrah Pratama
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ................................................................................................ ii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... ii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ ii PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 Latar Belakang ................................................................................................. 1 Perumusan Masalah .......................................................................................... 2 Tujuan Penelitian .............................................................................................. 2 Manfaat Penelitian ............................................................................................ 2 Ruang Lingkup Penelitian ................................................................................ 2 METODE PENELITIAN ..................................................................................... 3 Waktu dan Tempat ........................................................................................... 3 Bahan dan Alat ................................................................................................. 3 Prosedur Penelitian ........................................................................................... 3 Karakterisasi Buah Bakau (Rizophora stylosa) ............................................ 4 Preparasi sampel ........................................................................................... 4 Fermentasi..................................................................................................... 4 Uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (Meyer et al. 1982) .................... 5 Uji aktivitas antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2009) ................................. 5 Uji fitokimia (Harborne 1987) ...................................................................... 6 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................ 7 Karakteristik Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa)................................... 7 Toksisitas Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) .......... 8 Aktivitas Antioksidan Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora.stylosa)......................................................................................... 9 Komponen Aktif Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) 12 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................ 17 Kesimpulan ....................................................................................................... 17 Saran ................................................................................................................. 17 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 18 LAMPIRAN ......................................................................................................... 21 RIWAYAT HIDUP .............................................................................................. 26
DAFTAR TABEL
1 Hasil pengukuran morfometrik buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ......... 2 Hasil uji toksisitas filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) .......................................................................................... 3 Hasil uji aktivitas antioksidan filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) .......................................................................................... 4 Hasil uji fitokimia filtrat fermentasi minggu ke- 8 buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ..........................................................................................
7 8 10 12
DAFTAR GAMBAR
1 Diagram alir prosedur penelitian ....................................................................... 2 Gambar pengukuran morfometrik buah bakau merah (Rhizophora stylosa) .... 3 Struktur kimia alkaloid (Sumber: Robinson 1991) ........................................... 4 Struktur kimia flavonoid (Sumber: Harborne 1987) ......................................... 5 Struktur kimia steroid (Sumber: Sirait 2007) .................................................... 6 Struktur kimia fenol hidrokuinon (Sumber: Harborne 1987) ............................ 7 Struktur kimia saponin (Sumber: Sirait 2007)................................................... 8 Hasil identifikasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ............................... 9 Hasil uji Meyer .................................................................................................. 10 Hasil uji Wagner .............................................................................................. 11 Hasil uji flavonoid, tanin, dan saponin ............................................................
4 7 13 14 15 16 16 22 24 24 25
DAFTAR LAMPIRAN
1 Identifikasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ........................................ 2 Filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ............................... 3 Foto fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ................................. 4 Hasil uji fitokimia buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ............................. 5 Hasil uji antioksidan buah bakau merah (Rhizophora stylosa) .........................
22 23 24 24 25
PENDAHULUAN Latar Belakang Tanaman bakau di Indonesia merupakan tanaman yang terbanyak di dunia, baik dari segi kuantitas area (±42.550 km2) maupun jumlah spesies (±45 spesies). Noor et al. 2006 menyatakan secara umum keberlangsungan hidup tanaman ini cukup tinggi karena menghasilkan bunga dan buah sepanjang tahun, namun terdapat beberapa spesies yang keberlangsungan hidupnya kecil. Tanaman bakau mempunyai banyak manfaat, mulai dari manfaat ekologi sampai dengan sebagai sumber pangan dan obat. Sejumlah spesies tanaman bakau secara turun-temurun digunakan sebagai obat dan saat ini ekstraknya telah terbukti menyembuhkan penyakit pada manusia dan hewan termasuk penyakit yang disebabkan oleh bakteri, fungi dan virus (Akhyar 2010). Tanaman bakau mempunyai beberapa spesies yang salah satunya adalah tanaman bakau merah (Rhizophora stylosa). Zulkarnaen et al. 2012 menyatakan Rhizophora stylosa termasuk famili Rhizophoraceae. Spesies ini dalam bahasa Indonesia disebut bakau merah, dalam bahasa jawa disebut juga dengan “tanjang lanang”. Tumbuhan ini memiliki daun berbentuk lonjong dan runcing pada ujungnya dan terdapat bintik-bintik hitam pada bagian belakang daunnya, kulit batang berwarna keabuabuan, dan memiliki bunga sebanyak 4 pasang. Tumbuhan Rhizophora stylosa merupakan salah satu jenis tumbuhan yang keberadaannya melimpah di kawasan pulau-pulau bagian timur Indonesia. Rhizophora stylosa telah dimanfaatkan oleh masyarakat tradisional sebagai obat-obatan untuk berbagai penyakit. Di India digunakan sebagai terapi penyakit diabetes, dan diare. Ekstrak beberapa spesies dari genus ini telah dilaporkan memiliki aktivitas antibakteri, dan aktivitas antiinflamasi. Kemampuan tanaman bakau untuk dijadikan sebagai sumber pangan yang bergizi dan dijadikan sebagai obat tentunya karena terdapat kandungan senyawa bioaktif dalam tanaman bakau tersebut. Rohaeti et al. (2010) melaporkan bahwa buah bakau memiliki beberapa senyawa komponen bioaktif, yaitu flavonoid, saponin, tanin, dan triterpenoid yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan. Berbagai bukti ilmiah menunjukkan bahwa senyawa antioksidan mengurangi resiko terhadap penyakit kronis seperti kanker dan penyakit jantung koroner. Karakter utama senyawa antioksidan adalah kemampuannya untuk menangkap radikal bebas. Fermentasi dapat meningkatkan aktivitas antioksidan yang terdapat dalam suatu bahan (Aruben 2010). Fermentasi mempunyai pengertian suatu proses terjadinya perubahan kimia pada suatu substrat organik melalui aktivitas enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme (Suprihatin 2010). Fermentasi merupakan proses yang relatif murah yang pada hakikatnya telah lama dilakukan oleh nenek moyang kita secara tradisional dengan produk-produknya yang sudah biasa dimakan orang sampai sekarang, seperti tempe, oncom, tape, dan lain-lain. Perlu dilakukan penelitian dengan cara fermentasi buah bakau Rhizophora stylosa agar dapat meningkatkan aktivitas antioksidan dan bisa dimanfaatkan sebagai sumber pangan bergizi, suplemen atau obat-obatan serta mengetahui kandungan senyawa bioaktif dan aktivitas antioksidan pada buah
2
bakau Rhizophora stylosa agar kandungan senyawa bioaktif yang terdapat pada buah bakau tersebut tetap tinggi untuk dikonsumsi. Hal tersebut dilakukan untuk memberikan informasi ilmiah kepada masyarakat tentang pengaruh fermentasi terhadap kandungan senyawa bioaktif dan aktivitas antioksidan buah bakau Rhizophora stylosa dan meningkatkan daya guna dari tanaman bakau agar dapat dipakai secara luas oleh masyarakat.
Perumusan Masalah Pemanfaatan buah bakau jenis Rhizophora stylosa oleh masyarakat sebagai bahan pangan dan sebagai obat tradisional belum maksimal. Penelitian tentang pengaruh fermentasi pada buah bakau Rhizophora stylosa dapat mempengaruhi kandungan senyawa bioaktif dan aktivitasnya yang terdapat pada buah bakau tersebut.
Tujuan Penelitian Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan informasi tentang pengaruh fermentasi terhadap kandungan senyawa bioaktif dan aktivitas antioksidan buah bakau merah (Rhizophora stylosa). Tujuan khusus yang ingin dicapai adalah mentukan kandungan senyawa bioaktif menggunakan uji fitokimia setelah fermentasi, menentukan aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH setelah fermentasi, dan menentukan toksisitas buah bakau menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test setelah fermentasi.
Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi kepada masyarakat luas mengenai pengaruh fermentasi dari buah bakau merah (Rhizophora stylosa) terhadap kandungan senyawa bioaktif dan aktifitasnya.
Ruang Lingkup Penelitian Ruang lingkup dari penelitian ini adalah proses fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa), kandungan senyawa bioaktif, aktivitas antioksidan, dan toksisitas buah bakau merah (Rhizophora Stylosa).
3
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada bulan Februari hingga Agustus 2014. Identifikasi sampel bertempat di Herbarium Bogoriense, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Pusat Penelitian Biologi, Cibinong, Bogor. Karakterisasi dan preparasi sampel bertempat di Laboratorium Biokimia Hasil Perairan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Proses evaporasi, uji fitokimia, uji aktivitas antioksidan, dan uji toksisitas bertempat di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka.
Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah bakau merah (Rhizophora stylosa) yang diperoleh dari Pulau Untung Jawa, Kecamatan Kepulauan Seribu Selatan, Kabupaten Administrasi Kepulauan Seribu, Jakarta. Bahan yang digunakan untuk fermentasi adalah akuades, garam, dan ragi. Bahan yang digunakan untuk uji fitokimia meliputi pereaksi Wagner pereaksi Meyer, pereaksi Dragendroff, kloroform, anhidrat asetat, asam sulfat pekat, serbuk magnesium, amil alkohol, air panas, larutan HCl 2 N, etanol 95%, larutan FeCl 3 5%, peraksi Molisch, asam sulfat pekat, pereaksi Benedict, pereaksi Biuret dan larutan Ninhidrin 0,10%. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhdrazyl metanol, dan vitamin C sebagai kontrol positif. Bahan yang digunakan untuk uji toksisitas adalah larva udang Artemia salina dan air laut steril. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau, talenan, toples besar dan kecil, panci, wadah, gelas ukur, batang pengaduk, labu takar, sumur uji, lampu TL, aerator, tabung reaksi, labu Erlenmeyer, penangas air, corong gelas, sudip, pipet tetes, pipet volumetrik, micropipette, EpochTM Microplate Spectrophotometer, inkubator dan vortex.
Prosedur Penelitian Penelitian ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu identifikasi dan karakterisasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) dengan pengukuran morfometrik, preparasi sampel, fermentasi menggunakan ragi dan larutan garam, uji toksisitas filtrat fermentasi, uji antioksidan filtrat fermentasi, dan uji fitokimia filtrat fermentasi dengan aktivitas antioksidan tertinggi. Diagram alir prosedur penelitian dapat dilihat pada Gambar 1.
4
Buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Karakterisasi
Preparasi sampel (Pengupasan kulit dan pemotongan)
Fermentasi buah bakau
Morfometrik (30 buah) Morfologi
Filtrat fermentasi
Analisis :
1. Uji Toksisitas 2. Uji Antioksidan 3. Uji Fitokimia
Gambar 1 Diagram alir prosedur penelitian Karakterisasi Buah Bakau (Rizophora stylosa) Karakterisasi terdiri dari identifikasi dan pengukuran morfometrik. Sampel buah bakau merah (Rhizophora stylosa) didapatkan langsung dari pohon dan dibawa menggunakan trashbag ke laboratorium. Buah bakau dipilih sebanyak 30 buah selanjutnya dilakukan pengukuran morfometrik meliputi pengukuran panjang, lebar, dan bobot dari buah bakau merah (Rhizophora stylosa). Preparasi sampel Buah bakau yang telah diidentifikasi dan diukur morfometriknya, lalu dipreparasi. Persiapan bahan baku untuk proses fermentasi dilakukan dengan membuang kulit luar buah bakau yang masih segar. Bahan yang telah dibuang kulitnya lalu dipotong-potong sekitar 1cm. Fermentasi Fermentasi ini mengacu pada Tri dan Agusto, (1990) yang telah dimodifikasi. Sampel ditimbang sebanyak 500 g. Sampel direndam dengan akuades sebanyak 1,6 L hingga melewati batas permukaan sampel di dalam toples besar selama 12 jam agar dapat melunakkan sampel tersebut. Sampel yang telah direndam direbus selama 2 jam untuk melunakkan sampel agar komponen zat yang terdapat pada sampel mudah untuk dikeluarkan. Air rebusan dipisahkan dari
5
sampel buah bakau dan dimasukkan kembali ke dalam toples lalu ditambah garam 20%. Buah bakau yang telah direbus, dipisahkan, ditiriskan dan diberi ragi tape 5% untuk memecah pati yang terdapat pada sampel menggunakan enzim dari ragi tape tersebut, lalu disimpan pada suhu kamar selama 5 hari. Buah bakau yang sudah diberi ragi dimasukkan kembali ke dalam toples yang berisi larutan garam dan dilakukan fermentasi selama dua bulan. Gambar dapat dilihat pada Lampiran.3. Filtrat diambil pada minggu ke 0, 2, 4, 6, 8 lalu dilakukan evaporasi dengan rotary evaporator untuk analisis uji fitokimia, uji antioksidan, dan uji toksisitas. Uji toksisitas Brine Shrimp Lethality Test (Meyer et al. 1982) Persiapan larva Artemia salina dengan menetaskan telur larva selama 48 jam sebelum dilakukan uji. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur tersebut dalam air laut di dalam wadah yang diberi suplai oksigen dari aerator dan diberi penerangan dengan lampu TL 20 Watt. Pelaksanaan uji dilakukan dengan memasukkan larva ke dalam sumur uji dengan empat kelompok perlakuan yang berisi larutan 50, 100, 500, dan 1000 ppm dari filtrat hasil fermentasi minggu ke 0, 2, 4, 6, 8 dari Rhizophora stylosa. Masing-masing sumur uji berisi 10 ekor larva dan volume akhir setiap sumur sebesar 2 ml. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Inkubasi dilakukan selama 24 jam, selanjutnya dihitung jumlah larva yang mati. Nilai LC50 diperoleh dengan cara menghitung menggunakan rumus y = a + bx. Nilai a dan b diperoleh dengan perhitungan menggunakan rumus regresi linier berdasarkan data dari titik konsentrasi yang digunakan. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi larutan yang menyebabkan kematian terhadap 50% larva. Uji aktivitas antioksidan (Salazar-Aranda et al. 2009) Aktivitas antioksidan diukur dengan metode DPPH yang mengacu pada penelitian Salazar-Aranda et al. (2009). Pengujian aktivitas antioksidan ini menggunakan filtrat fermentasi buah bakau yang telah dipekatkan kemudian dilarutkan dalam etanol p.a. Konsentrasi campuran filtrat hasil fermentasi dan etanol yang digunakan dalam penelitian ini antara lain 0,5 ppm, 2,5 ppm, 12,5 ppm, 62,50 ppm, dan 312,5 ppm. Kontrol positif menggunakan asam askorbat (Vitamin C) dengan konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, dan 10 ppm. Larutan blanko dengan konsentrasi 125 μM dibuat menggunakan kristal DPPH yang dilarutkan dalam etanol p.a. Proses pembuatan larutan DPPH dilakukan dalam kondisi terlindung dari cahaya matahari. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan berdasarkan kemampuan sampel yang digunakan dalam mereduksi radikal bebas DPPH. Kontrol positif menggunakan larutan asam askorbat 100 ppm yang dibuat dengan cara melarutkan kristal asam askorbat pada etanol p.a. Larutan DPPH dengan konsentrasi 125 μM diambil sebanyak 100 μL dan ditambah dengan 100 μL ekstrak, kemudian dimasukkan ke dalam microplate yang telah disiapkan. Campuran larutan tersebut dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama 30 menit. Serapan yang dihasilkan diukur dengan menggunakan EpochTM Microplate Spectrophotometer pada panjang gelombang 517 nm.
6
Presentase penghambat aktivitas radikal bebas (%inhibisi) diperoleh dari nilai absorbansi sampel. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan persen inhibisi. Nilai konsentrasi penghambat aktivitas radikal bebas sebanyak 50% (IC50) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear yaitu y = ax+b. Nilai IC50 diperoleh dengan memasukkan y = 50 serta nilai a dan b yang telah diketahui. Uji fitokimia (Harborne 1987) Pengujian kandungan senyawa bioaktif yang terkandung dalam filtrat hasil fermentasi ini dilakukan secara kualitatif dengan metode uji fitokimia yang meliputi uji alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, fenol hidrokuinon, dan tanin. Uji alkaloid Sebanyak 0,05 g ekstrak ditambah beberapa tetes asam sulfat 2 N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkaloid yaitu, pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, dan pereaksi Wagner. Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Meyer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorf. Uji flavonoid Sebanyak 0,05 g ekstrak ditambahkan serbuk magnesium 0,10 mg dan 0,40 ml amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 ml alkohol kemudian campuran dikocok. Warna merah, kuning atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. Uji saponin Saponin dideteksi dengan uji busa pada 0,05 g ekstrak dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang setelah ditambahkan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin. Uji steroid Sebanyak 0,05 g filtrat hasil fermentasi dilarutkan dalam 2 ml kloroform, 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Larutan berwarna merah yang terbentuk untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau, menunjukkan reaksi positif. Uji fenol hidrokuinon Sebanyak 1 g filtrat hasil fermentasi ditambahkan dengan 20 ml etanol 70%. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl3 5%. Warna hijau atau hijau biru yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan. Uji Tanin Sebanyak 1 g filtrat hasil fermentasi ditambahkan ke dalam 100 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 ml filtrat ditambah FeCl3 1%. Hasil positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman.
7
HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) Buah bakau Rhizophora stylosa termasuk salah satu famili Rhizophoraceae. Famili Rhizophoraceae merupakan salah satu famili tumbuhan yang sebagian besar tumbuh di daerah pesisir pulau-pulau di Indonesia. Famili Rhizoporaceae terdiri dari 11 spesies yang semua anggotanya terdiri dari atas pohon meliputi, Bruguiera cylindrica, B.exaristata, B. gymnorrhiza, B.sexangula, Ceriops decandra, C. tagal, Kandelia candel, R. apiculata, R. mucronata, dan R. stylosa. Tumbuhan Rhizophora stylosa merupakan salah satu jenis tumbuhan yang keberadaannya melimpah di Indonesia. Buah bakau yang digunakan pada penelitian ini diperoleh dari Pulau Untung Jawa, Kecamatan Kepulauan Seribu Selatan, Kabupaten Administrasi Kepulauan Seribu, Jakarta. Sampel diidentifikasi untuk dilihat spesiesnya agar sampel yang digunakan pada penelitian ini benar yaitu buah Rhizophora stylosa. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1. Pengukuran morfometrik buah bakau disajikan pada Gambar 2.
Lebar
Panjang hipokotil Panjang total Gambar 2 Gambar pengukuran morfometrik buah bakau merah (Rhizophora stylosa) Sebanyak 30 buah bakau digunakan untuk pengukuran morfometrik. Hasil pengukuran morfometrik buah bakau merah (Rhizophora stylosa Griff.) disajikan dalam Tabel 1 Tabel 1 Hasil pengukuran morfometrik buah bakau merah (Rhizophora stylosa) No 1 2 3 4 5
Parameter Panjang hipokotil Panjang total Berat hipokotil Berat total Diameter (lebar)
Nilai 30,51 ± 1,96 (cm) 33,23 ± 1,96 (cm) 24,14 ± 3,67 (gram) 31,53 ± 4,07 (gram) 0,93 ± 0,17 (cm)
Nilai (*) 28,75 cm 30,00 cm 0,50 cm
Keterangan: data diperoleh dari 30 sampel buah bakau *Setyawan et al. (2014)
Buah bakau yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah bakau Rhizophora stylosa yang telah matang. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Setyawan et al. (2014) yang menyatakan buah bakau merah (R. stylosa) yang sudah matang memiliki panjang hipokotil 28,75 cm dan panjang total 30 cm.
8
Menurut FAO (2007), buah bakau merah (R. stylosa) yang sudah matang memiliki hipokotil lurus dengan panjang sekitar 20-35 cm dan bisa juga mencapai 54 cm. Perbedaan ukuran morfometrik ini dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Sukardjo (1984) menyatakan setiap tipe mangrove yang terbentuk berkaitan erat dengan faktor habitatnya, di antaranya tanah, genangan air pasang, salinitas, erosi, penambahan lahan pesisir, fisiografi, kondisi sungai dan aktivitas manusia.
Toksisitas Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) Buah bakau merah (Rhizopohora stylosa) difermentasi menggunakan ragi dan larutan garam. Filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizopohora stylosa) selanjutnya dilakukan analisis uji toksisitas, uji antioksidan, dan uji fitokimia. Filtrat fermentasi ini diambil pada minggu ke 0, 2, 4, 6, dan 8. Terjadi perubahan kenampakan warna pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8. Warna filtrat fermentasi buah bakau merah pada minggu ke- 0 terlihat sangat keruh dan berwarna keputihan yang disebabkan oleh ragi yang ditambahkan pada filtrat fermentasian, namun dengan semakin bertambahnya waktu fermentasi warna filtrat fermentasi buah bakau merah ini semakin bening atau tidak keruh hingga minggu ke- 8. Kenampakan filtrat fermentasi buah bakau merah dapat dilihat pada Lampiran 2. Toksisitas adalah kemampuan suatu molekul atau senyawa kimia dalam menimbulkan kerusakan pada bagian yang peka di dalam maupun di bagian luar tubuh makhluk hidup. Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Uji toksisitas menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT) terhadap larva Artemia salina dilakukan untuk mengamati tingkat kematian larva Artemia salina yang disebabkan oleh ekstrak kasar sampel. Aktivitas sitotoksik yang ditemukan dalam uji BSLT menunjukkan senyawa tersebut memiliki potensi sebagai senyawa antikanker dan antitumor baru (Peteros & Mylene 2010). Meyer et al. (1982) menyatakan bahwa tingkat kematian atau mortalitas dari larva udang selanjutnya dianalisis probit untuk menentukan LC50 (lethal concentration 50%), yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian populasi larva Artemia salina sebesar 50% dari populasi total. Metode BSLT dipilih karena metode ini sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak karena sederhana, cepat, mudah, murah, dapat dipercaya, dan hasilnya representatif. Hasil uji toksisitas dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Hasil uji toksisitas filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) Perlakuan Minggu keMinggu keMinggu keMinggu keMinggu ke-
0 2 4 6 8
Mortalitas % 50 20 6,67 0 0 13,33
100 46,7 23,33 10 6,67 20
500 53,3 36,67 30 26,67 43,33
1000 83,3 73,33 73,33 73,33 56,67
LC50 (ppm) 211,33 502,86 603,38 625,68 700,49
Kategori Toksik rendah Toksik rendah Toksik rendah Toksik rendah Toksik rendah
9
Hasil uji toksisitas menunjukan bahwa LC50 filtrat hasil fermentasi buah bakau paling rendah terdapat pada minggu ke- 0 yaitu sebesar 211,33 ppm. Semakin lama waktu fermentasi maka nilai LC50 semakin tidak toksik. Perlakuan pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8 terjadi peningkatan nilai LC50. LC50 pada minggu ke- 8 memiliki nilai tertinggi yaitu 700,49 ppm. Kategori toksik pada fermentasi buah bakau merah disemua perlakuan ini tergolong toksik rendah. Hal ini sesuai menurut McLaughlin et al. (1998) yang mengatakan, senyawa dengan LC50 ≤ 30 ppm dinyatakan sangat toksik, LC50 antara 31-200 ppm dinyatakan toksik, LC50 antara 201-1000 ppm dinyatakan toksik rendah, dan nilai LC50 >1000 ppm dinyatakan tidak toksik. Hasil pada penelitian ini juga sesuai dengan hasil penelitian Diastuti dan Suwandri (2009) yang menunjukan bahwa nilai LC50 dari ekstrak kloroform buah bakau Rhizophora sebesar 744,31 ppm dan dikategorikan sebagai golongan toksik rendah. Tamat et al. (2007) menyatakan bahwa ekstrak tersebut termasuk golongan tidak toksik maka kemungkinan dapat dikembangkan untuk tujuan yang luas, misalnya sebagai suplemen atau bahan baku kosmetika, sedangkan apabila termasuk golongan senyawa toksik maka kemungkinan dapat dikembangkan sebagai bahan baku obat.
Aktivitas Antioksidan Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora.stylosa) Pengertian senyawa antioksidan adalah senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa ini memiliki berat molekul kecil, tetapi mampu menginaktivasi berkembangnya radikal bebas melalui reaksi oksidasi. Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksigen sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut dapat dihambat. Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang sifatnya sangat tidak stabil dan tidak memiliki pasangan elektron pada orbit terluarnya. Ketidakstabilan ini disebabkan atom tersebut hanya memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Pembentukan senyawa radikal bebas tidak hanya terjadi dari proses kimia dalam tubuh, akan tetapi bisa terbentuk dari senyawa lain yang sebenarnya bukan radikal namun sifatnya dapat berubah menjadi radikal. Antioksidan bekerja berdasarkan mekanisme menyumbangkan satu atau lebih elektron untuk meredam radikal bebas (Handayani & Sulistyo 2008). Astuti (2008) menambahkan radikal bebas yang berikatan dengan molekul protein maupun lemak di dalam sel akan menyebabkan kerusakan pada sel. Antioksidan dapat diketahui aktivitasnya dengan menggunakan uji DPPH. Zhang & Zhou (2013) menyatakan, aktivitas antioksidan dinyatakan dengan presentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh dari nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sampel. Persen inhibisi ini didapatkan dari perbedaan serapan antara absorban DPPH dengan serapan ekstrak yang diukur dengan spektrofotometer. Sebagian besar senyawa antioksidan diketahui memiliki gugus fenolat yang mudah mendonorkan radikal hidrogen kepada radikal DPPH. Antioksidan pembanding yang digunakan adalah vitamin C sebagai antioksidan standar yang merupakan senyawa murni sehingga penghambatan radikal DPPH lebih efektif dengan konsentrasi yang rendah. Pengujian aktivitas
10
antioksidan dari filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) dilakukan dengan lima perlakuan yaitu fermentasi pada minggu ke- 0, minggu ke- 2, minggu ke- 4, minggu ke- 6, dan minggu ke- 8 dengan menggunakan konsentrasi 0,5 ppm, 2,5.ppm, 12,5 ppm, 62,5 ppm, dan 312,5 ppm. Intensitas perubahan warna yang terjadi diukur absorbansinya dengan menggunakan EpochTM Microplate Spectrophotometer dengan panjang gelombang 517 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum DPPH. Hasil uji aktivitas antioksidan fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Hasil uji aktivitas antioksidan filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa) Perlakuan Minggu ke-0 Minggu ke-2 Minggu ke-4 Minggu ke-6 Minggu ke-8 Vit C
0,5 ppm 0,47 1,93 2,32 2,54 3,93
2,5 ppm 1,54 2,08 2,46 3,31 4,09
1,25 ppm 15,76
2,5 ppm 24,63
% Inhibisi 12,5 ppm 2,23 3,08 3,31 3,78 4,85 5 ppm 50,24
62,5 ppm 3,24 4,62 7,17 7,32 7,79
312,5 ppm 6,78 7,94 10,41 11,41 13,81
10 ppm 77,83
20 ppm 86,69
Aktivitas antioksidan ekstrak buah bakau (R. stylosa) dinyatakan dalam persentase inhibisi radikal bebas DPPH. Filtrat fermentasi buah bakau merah (R..stylosa) pada semua perlakuan dan semua konsentrasi ini memiliki nilai persentase inhibisi kecil, sehingga nilai IC50 dari filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) ini > 312,5 ppm. Hal ini tidak sesuai dengan hasil penelitian Priyanto (2012), bahwa ekstrak buah bakau Rhizophora segar tanpa proses fermentasi memiliki nilai persentase inhibisi yang tinggi. Sebagai contoh pada konsentrasi 62,5 ppm buah bakau memiliki persen inhibisi sebesar 42,44% berbeda dengan filtrat fermentasi buah bakau pada penelitian ini yang hanya mempunyai nilai persen inhibisi tertinggi sebesar 7,79% pada konsentrasi 62,5.ppm. Proses fermentasi dilakukan dalam kisaran suhu 20-30 °C menggunakan ragi tape yang mengandung Saccharomyce cerevisiae. Kumalasari (2011) menyatakan bahwa S.cerevisiae akan tumbuh optimal dalam kisaran suhu 30-35 °C. Jika suhu terlalu rendah, maka fermentasi akan berlangsung secara lambat dan sebaliknya jika suhu terlalu tinggi maka Saccharomyces cerevisiae akan mati sehingga proses fermentasi tidak akan berlangsung. Hal ini yang menyebabkan dalam waktu 8 minggu filtrat fermentasi mempunyai persen inhibisi yang masih kecil. Fermentasi pada buah bakau merah (Rhizophora stylosa) ini termasuk fermentasi tidak spontan, karena pada proses fermentasi ditambahkan mikrorganisme dalam bentuk starter atau ragi, dimana mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembang biak secara aktif merubah bahan yang difermentasi. Berdasarkan sumber mikroorganisme, proses fermentasi dibagi 2 yaitu fermentasi spontan dan fermentasi tidak spontan. Fermentasi spontan, adalah fermentasi bahan pangan dimana dalam pembuatannya tidak ditambahkan mikroorganisme dalam bentuk starter atau ragi, tetapi mikroorganisme yang berperan aktif dalam proses fermentasi berkembang baik secara spontan karena lingkungan hidupnya
11
dibuat sesuai untuk pertumbuhannya, dimana aktivitas dan pertumbuhan bakteri asam laktat dirangsang karena adanya garam, contohnya pada pembuatan sayur asin. Fermentasi tidak spontan adalah fermentasi yang terjadi dalam bahan pangan yang dalam pembuatannya ditambahkan mikrorganisme dalam bentuk starter atau ragi, dimana mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembangbiak secara aktif merubah bahan yang difermentasi menjadi produk yang diinginkan, contohnya pada pembuatan tempe dan oncom (Suprihatin 2010). Aruben (2010) menyatakan fermentasi menggunakan ragi dapat meningkatkan aktivitas antioksidan. Pada saat proses fermentasi dilakukan proses penambahan ragi tape yang mengandung Saccharomyces cerevisiae dengan kondisi anaerob. Oksigen secara tidak langsung mempengaruhi fermentasi yang dilakukan oleh Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae dapat tumbuh dengan baik pada kondisi aerob. Menurut Kunaepah (2008), Saccharomyces cerevisiae tumbuh dengan baik pada kondisi aerob. Pada kondisi aerob Saccharomyces cerevisiae menghidrolisis gula menjadi air dan CO2, tetapi dalam keadaan anaerob gula akan diubah oleh Saccharomyces cerevisiae menjadi alkohol dan CO2. Hal ini yang menyebabkan belum optimalnya proses fermentasi untuk meningkatkan aktivitas antioksidan pada buah bakau merah yang digunakan karena masih terdapat kesalahan pada metode fermentasi dengan membiarkan sampel yang diberi ragi disimpan pada kondisi anaerob. Muhiddin et al. (2001) menyatakan Saccharomyces cerevisiae dapat mengkonversi gula menjadi etanol karena adanya enzim invertase dan zimase. Dengan adanya enzim-enzim ini Saccharomyces cerevisiae memiliki kemampuan untuk mengkonversi baik gula dari kelompok monosakarida maupun dari kelompok disakarida. Jika gula yang tersedia dalam substrat merupakan gula disakarida maka enzim invertase akan bekerja menghidrolisis disakarida menjadi monosakarida. Setelah itu, enzim zymase akan mengubah monosakarida tersebut menjadi alkohol dan CO2. Filtrat hasil fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8 tidak berpotensi memiliki aktivitas antioksidan. Hal ini juga disebabkan tidak terdapatnya senyawa-senyawa bioaktif dalam filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) ini seperti senyawa alkaloid, fenol hidrokuinon dan flavonoid yang telah dilakukan melalui uji fitokimia. Senyawa – senyawa tersebut memiliki aktivitas antioksidan. Hal ini sesuai dengan penelitian dari Atta au rahman et al. (2001), bahwa senyawa yang berpotensi memiliki antioksidan umumnya adalah senyawa flavonoid, alkaloid dan fenolat yang merupakan senyawa-senyawa polar. Aktivitas antioksidan dari sampel ditunjukkan dengan perubahan warna pada larutan DPPH yang semula berwarna ungu pekat menjadi kuning cerah. Hasil uji aktivitas antioksidan pada penelitian ini tidak ada perubahan warna pada larutan DPPH dalam etanol yang semula berwarna ungu pekat menjadi kuning. Hal ini tidak sesuai dengan pernyataan Andayani et al. (2008) bahwa adanya aktivitas antioksidan dari sampel mengakibatkan perubahan warna pada larutan DPPH dalam etanol yang semula berwarna ungu pekat menjadi kuning. Larutan DPPH pada penelitian ini tetap berwarna ungu dan dapat dilihat pada Lampiran 5. Hal ini juga menunjukan bahwa kecilnya persen inhibisi pada filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8 karena besarnya nilai IC50 yang diperoleh. Suratmo (2009) menyatakan bahwa
12
IC50 adalah konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan persen inhibisi 50%. Nilai IC50 yang semakin kecil menandakan bahwa sampel yang digunakan memiliki aktivitas antioksidan yang kuat dan penggunaan ekstrak dalam menghambat 50% aktivitas radikal bebas semakin sedikit. Pendapat ini diperkuat oleh pernyataan Molyneux (2004) bahwa semakin kecil nilai IC50 berarti aktivitas antioksidannya semakin tinggi. Qusti et al. 2010 menyatakan aktivitas antioksidan dapat diakibatkan oleh beberapa faktor yaitu varietas tanaman, kondisi tempat tumbuh, tingkat kematangan, musim, lokasi geografis yang berbeda, jenis tanah dan jumlah sinar matahari yang diterima. Senyawa aktif yang ada dalam tiap tanaman juga turut mempengaruhi hasil antioksidan. Menurut Yulianto & Widyaningsih (2013) kandungan kimia didalam tanaman dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, perbedaan varietas, keadaan iklim, tempat tumbuh, cara pemeliharaan tanaman, cara pemanenan, kematangan pada waktu panen, dan kondisi penyimpanan setelah panen.
Komponen Aktif Filtrat Fermentasi Buah Bakau Merah (Rhizophora stylosa) Uji fitokimia merupakan uji yang digunakan untuk memberikan informasi jenis senyawa aktif yang terkandung dalam tumbuhan. Ekstraksi bahan alam adalah ekstraksi komponen aktif yang terdapat pada bahan alam yang didasari pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut. Analisis fitokimia dilakukan untuk menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek bermanfaat yang ditunjukkan oleh ekstrak kasar bila diuji dengan sistem biologi (Harborne 1987). Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) diuji fitokimia pada sampel yang memiliki nilai persentase inhibisi paling besar untuk membuktikan senyawa bioaktif yang terdapat pada filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa). Uji fitokimia ini meliputi uji alkaloid, flavonoid, steroid, fenol hidroquinon, saponin, dan uji tanin. Hasil uji fitokimia pada filtrat fermentasi minggu ke- 8 buah bakau merah (R. stylosa) dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Hasil uji fitokimia filtrat fermentasi minggu ke- 8 buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Alkaloid
Parameter Wagner Mayer Dragendorf
Flavonoid Steroid Fenol Hidrokuinon Saponin Tanin Keterangan: (+) = terdeteksi (-) = tidak terdeteksi
Hasil Negatif (-) Negatif (-) Negatif (-) Negatif (-) Positif (+) Negatif (-) Positif (+) Positif (+)
Adanya senyawa alkaloid Wagner ditunjukan dengan endapan merah atau jingga, Mayer ditunjukkan dengan endapan putih kekuningan, Dragendorf
13
ditunjukkan dengan endapan coklat. Adanya senyawa flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya lapisan amil alkohol berwarna merah atau kuning atau jingga. Steroid ditunjukkan dengan perubahan dari merah menjadi biru atau hijau. Fenol hidrokuinon ditunjukkan dengan warna hijau atau hijau biru. Saponin ditunjukkan dengan adanya busa yang stabil setelah didiamkan selama 30 menit pada pereaksi. Tanin ditunjukkan dengan warna hijau kebiruan/hijau kehitaman (Priyanto 2012) Alkaloid merupakan golongan senyawa sekunder yang bersifat basa, mengandung satu atau lebih atom hidrogen (Harborne 1987). Pengujian alkaloid dilakukan menggunakan pereaksi pengendapan untuk memisahkan jenis alkaloid. Pereaksi yang umum digunakan adalah pereaksi Meyer yang mengandung kalium iodida dan merkuri klorida. Pereaksi Dragendorf mengandung bismuth nitrat dan merkuri klorida dalam nitrit berair. Alkaloid dalam tanaman digunakan sebagai bentuk pertahanan diri tanaman terhadap pemangsa. Alkaloid sering dijumpai pada tumbuhan hijau pada biji, daun, ranting, buah dan kulit batang. Kadar alkaloid yang dihasilkan oleh tumbuhan hijau tidak sama pada semua jaringan dan pada setiap tahap pertumbuhan serta lokasi geografis yang mempengaruhinya (Robinson 1991). Hampir semua alkaloid yang ditemukan di alam mempunyai keaktifan biologis tertentu, ada yang sangat beracun tetapi ada pula yang sangat berguna dalam pengobatan, misalnya kuinin, morfin dan stiknin adalah alkaloid yang terkenal dan mempunyai efek fisiologis dan psikologis. Alkaloid tidak mempunyai tata nama sistematik, oleh karena itu suatu alkaloid dinyatakan dengan nama trivial yang beakhiran –in atau – ina. Struktur kimia alkaloid dapat dilihat pada Gambar 3.
Nikotina
Koniina
Gambar 3 Struktur kimia alkaloid (Sumber: Robinson 1991) Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) tidak mengandung alkaloid karena tidak memberi hasil positif pada pereaksi Wagner, Meyer, dan Dragendorf. Hal ini berbeda dengan penelitian Nurdiani et al. (2012) yang menyatakan bahwa pereaksi Wagner, Meyer, dan Dragendorf memberi hasil positif yang artinya ekstrak buah bakau memiliki kandungan alkaloid (R.mucronata) menggunakan pelarut metanol. Hasil yang berbeda ini disebabkan pelarut yang digunakan berbeda. Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah pelarut air. Alkaloid mudah larut dalam pelarut organik dan sukar larut dalam air, sehingga komponen alkaloid pada filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) tidak terdeteksi. Hasil uji Wagner dan Meyer dapat dilihat pada Lampiran 4. Flavonoid terdapat pada seluruh bagian tanaman termasuk pada buah, tepung sari, dan akar. Flavonoid berperan terhadap warna dalam organ tumbuhan,
14
misalnya bunga, buah, dan daun. Flavonoid diketahui merupakan senyawa golongan polifenol yang dikelompokan menjadi 9 kelas yaitu, antosianin, proantosianin, flavonol, flavon, glikoflavon, biflavonil, chlacone, dan aurone, isoflavon dan flavonon. Kegunaan flavonoid bagi tumbuhan berguna untuk menarik serangga dan binatang lain untuk membantu proses penyerbukan dan penyebaran biji. Bagi manusia, flavonoid dalam dosis kecil bekerja sebagai stimulan pada jantung dan pembuluh darah kapiler. Berbagai hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa flavonoid mempunyai aktivitas antioksidan yang beragam pada berbagai jenis sereal, sayuran dan buah-buahan (Redha 2010). Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) tidak memiliki kandungan flavonoid karena tidak memberikan hasil positif dengan ciri tidak terbentuknya lapisan amil alkohol berwarna merah/kuning/jingga. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian Priyanto (2012) bahwa ekstrak dari buah bakau (R.mucronata) memberikan hasil positif yang artinya memiliki kandungan flavonoid. Pelarut yang digunakan berbeda, pelarut air tidak dapat mengekstrak dengan baik sehingga kandungan flavonoid tidak terdeteksi. Senyawa flavonoid dapat diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, oleh karena itu warnanya berubah bila ditambah basa atau amoniak (Harborne 1987) Hasil uji flavonoid dapat dilihat pada Lampiran 4. Flavonoid diketahui dapat digunakan sebagai penampung atau mencegah reaksi oksidasi enzimatis maupun oksidasi non-enzimatis hal ini berkaitan dengan aktivitas antioksidan yang tinggi pada senyawa flavonoid. Hal ini diperkuat oleh pernyataan Atta-au-rahman et al. (2001) yang menyatakan bahwa senyawa yang berpotensi memiliki antioksidan umumnya adalah senyawa flavonoid, alkaloid dan fenolat yang merupakan senyawa-senyawa polar. Struktur kimia flavonoid dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Struktur kimia flavonoid (Sumber: Harborne 1987) Flavonoid mampu dikatakan sebagai sumber antioksidan akibat kemampuannya dalam mendonorkan atom hidrogen atau kemampuannya dalam mengkelat logam (Redha 2010). Akhlghi dan Bandy (2009) menambahkan bahwa flavonoid mampu mengkelat logam sehingga dapat mencegah terjadinya reaksi redoks yang menghasilkan senyawa radikal bebas Selain kemampuan dalam menangkal radikal bebas, senyawa aktif flavonoid juga mampu menginhibisi enzim tirosinase. Secara umum senyawa steroid banyak terdapat dalam tumbuhan dan berasal dari senyawa yang sama yaitu molekul isoprene. Steroid atau triterpenoid pada
15
tumbuhan berbiji umumnya dalam bentuk triterpenoid nonglikosida dan pada tumbuhan primitif dalam bentuk triterpenoid pentasiklik (Robinson 1991). Steroid adalah molekul kompleks yang larut di dalam lemak dengan empat cincin yang saling bergabung. Steroid yang paling banyak adalah sterol yang merupakan steroid alkohol. Kolesterol merupakan sterol utama pada jaringan hewan. Kolesterol dan senyawa turunan esternya, dengan lemaknya yang berantai panjang merupakan komponen penting dari plasma lipoprotein dan dari membran sel sebelah luar. Membran sel tumbuhan mengandung jenis sterol lain terutama stigmasterol yang berbeda dari kolesterol hanya dalam ikatan ganda di antara karbon 22 dan 23. Rantai samping delapan-karbon yang terdapat dalam lanosterol juga terdapat dalam steroid terutama dari sumber hewan, namun kebanyakan steroid tumbuhan mempunyai satu atau dua atom karbon tambahan (Sirait 2007). Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) memiliki kandungan steroid dengan ciri berubahnya warna merah menjadi berwarna hijau biru. Hal ini sesuai dengan penelitian Priyanto (2012) bahwa ekstrak buah bakau (R.mucronata) memiliki kandungan steroid. Struktur kimia steroid dapat dilihat pada Gambar 5.
Sitosterol
Stigmasterol Gambar 5 Struktur kimia steroid (Sumber: Sirait 2007) Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar. Kuinon untuk tujuan identifikasi dibagi menjadi empat kelompok, yaitu benzokuinon (kuinon yang kromofor terdiri atas dua gugus karbonil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon), naftokuinon, antrakuinon dan kuinon isoprenoid. Tiga kelompok pertama biasanya terhidroksilasi dan bersifat senyawa fenol serta mungkin terdapat in vivo dalam bentuk gabungan dengan gula sebagai glikosida atau dalam bentuk kuinol tanpa warna, kadang-kadang juga bentuk dimer. Dengan demikian diperlukan hidrolisis asam untuk melepaskan kuinon bebasnya (Harborne 1987) Filtrat hasil fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) tidak memiliki kandungan fenol hidrokuinon dengan ciri tidak terbentuknya warna hijau atau hijau biru. Hal ini tidak sesuai dengan penelitian Nurdiani et al. (2012) bahwa ekstrak buah bakau (R. mucronata) memiliki kandungan fenol hidrokuinon. Senyawa kuinon yang terdapat sebagai glikosida mungkin larut sedikit dalam air, tetapi umumnya kuinon lebih mudah larut dalam lemak dan akan terekstrak dari tumbuhan bersama-sama dengan karotenoid dan klorofil. Reaksi yang khas adalah reduksi bolak-balik yang mengubah kuinon menjadi senyawa tanpa warna, kemudian warna kembali lagi bila terjadi oksidasi oleh udara. Reduksi dapat
16
dilakukan menggunakan natrium borohidrida dan oksidasi ulang dapat terjadi hanya dengan mengocok larutan tersebut di udara (Harborne 1987). Senyawa fenolik erat kaitannya dengan aktivitas antioksidan pada suatu bahan tertentu. Chen dan Blumberg (2007) menyatakan bahwa mengkonsumsi senyawa fenol dipercaya dapat mengurangi resiko beberapa penyakit kronis karena senyawa ini bersifat sebagai antioksidan, anti inflamasi, detoksifikasi dan antikolesterol. Struktur kimia fenol hidrokuinon dapat dilihat pada Gambar 6.
2,6-Dimetoksibenzokuinon Gambar 6 Struktur kimia fenol hidrokuinon (Sumber: Harborne 1987) Saponin merupakan senyawa aktif permukaan dan bersifat seperti sabun dan dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa. Kandungan saponin pada tanaman dan obat-obatan memiliki beberapa macam bioaktivitas, seperti antivirus, anti-inflamasi, dan antiparasit (Navarroa et al. 2001). Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) memiliki kandungan saponin dengan ciri adanya busa yang stabil setelah didiamkan 30 menit. Hasil uji saponin dapat dilihat pada Lampiran 4. Francis et al. (2002) meyakini beberapa saponin memiliki aktivitas antioksidan dan reduksi. Saponin juga memiliki kemampuan dalam menghambat kinerja enzim. Xiong et al. (2012) menyatakan senyawa ini bersifat antioksidatif dengan membentuk hidroperoksida sebagai senyawa antara dan dapat menyumbangkan hidrogen pada senyawa radikal DPPH sehingga mengakhiri reaksi rantai radikal. Struktur kimia saponin dapat dilihat pada Gambar 7.
Sarsapogenin
Gambar 7 Struktur kimia saponin (Sumber: Sirait 2007)
17
Tanin merupakan substansi yang tersebar luas pada daun, buah, batang dan kulit kayu. Senyawa tanin pada buah yang belum matang berada dalam bentuk oksidasi tanin yang digunakan sebagai energi untuk proses metabolisme. Artati et al. (2007) menyatakan bahwa tanin merupakan senyawa fenolik yang terdiri atas bermacam-macam kelompok oligomer dan polimer. Mangrove dikenal sebagai sumber tanin yang cukup baik (Banarjee et al. 2008). Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) memberikan hasil positif yang artinya filtrat fermentasi memiliki kandungan tanin dengan ciri terbentuknya warna hijau kebiruan atau hijau kehitaman pada uji tanin. Senyawa tanin terdeteksi dengan munculnya warna hijau kehitaman pada ekstrak yang diujikan. Hasil ini sesuai dengan Negara (2013) yakni tanin terdapat pada R.mucronata. Hal ini juga sesuai dengan penelitian Priyanto (2012) bahwa ekstrak buah bakau (R. mucronata) memiliki kandungan tanin. Hagerman et al. (1998) menyatakan bahwa tanin mempunyai kemampuan menangkap radikal bebas. Tanin sangat efektif sebagai pendonor elektron atau atom hidrogen dan pengkelat logam, sebab senyawa ini memiliki gugus hidroksil dan ikatan rangkap terkonjugasi yang memungkinkan terjadinya delokalisasi elekron. Hasil uji tanin dapat dilihat pada Lampiran 4.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Waktu fermentasi memberikan pengaruh kepada kandungan senyawa bioaktif, antioksidan dan toksisitas buah bakau merah (R. stylosa). Filtrat fermentasi buah bakau merah hanya memiliki kandungan senyawa steroid, saponin, dan tanin. Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) memiliki peningkatan aktivitas antioksidan pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8. Fermentasi dapat menaikkan aktivitas antioksidan namun IC50-nya masih tinggi. Filtrat fermentasi buah bakau merah (R. stylosa) memiliki toksisitas yang semakin menurun pada minggu ke- 0 hingga minggu ke- 8 dan dinyatakan termasuk kategori toksik rendah.
Saran Saran untuk penelitian selanjutnya perlu dilakukan waktu fermentasi yang lebih lama dan menggunakan metode fermentasi lainnya seperti menggunakan Saccharomyces cerevisiae dengan kondisi aerob. Perlu dilakukan penggunaan sampel buah mangrove dari jenis spesies yang berbeda.
18
DAFTAR PUSTAKA Akhlaghi M, Bandy B. 2009. Mechanisms of flavonoid protection against myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46: 309-317. Akhyar. 2010. Uji daya hambat dan analisis KLT bioautografi ekstrak akar dan buah bakau (Rhizophora stylosa Griff.) terhadap Vibrio harveyi [skripsi]. Makasar (ID): Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin. Andayani R, Lisawati Y, Maimunah. 2008. Penentuan aktivitas antioksidan, kadar fenolat total dan likopen pada buah tomat (Solanum Lycopersium L.). Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi.13(1):1-9. Artati EK, Fadhilah. 2007. Pengaruh kecepatan putar pengadukan dan suhu operasi pada ekstraksi tanin dari jambu mete dengan menggunakan larutan aseton. Ekuilibrum. 6(2): 33-38. Aruben NW. 2010. Peningkatan konsentrasi senyawa fenolik antioksidan dari dedak dengan cara fermentasi [skripsi]. Semarang (ID): Fakultas Teknik, Universitas Diponegoro Astuti. 2008. Isoflavon kedelai dan potensinya sebagai penangkap radikal bebas. Jurnal Teknologi Industri dan Hasil Pertanian. 13(2) : 126-136 Atta-au-rahman, Coudhary MI. 2001. Bioactive natural product a potential of pharmacophorus. A Theory of Memory. Pure and Applied Chemistry. 73(2):555- 560 Banerjee D, Chakrabarti, Hazra A, Banerjee S, Ray J, Mukherjee B. 2008. Antioxidan activity and total phenolic of some mangroves in sundarbans. African Journal of Biotechnology. 7(6) : 805-810. Chen CYO, Blumberg JB. 2007. Phytochemical composition of nuts. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17(1): 329-332 Diastuti H, Suwandri. 2009. Fraksinasi dan identifikasi senyawa antikanker ekstrak kulit batang Rhizophora mucronata serta uji toksisitasnya terhadap larva udang (Artemia salina leach). Molekul. 4(2):54-61. [FAO] Food and Agriculture Organization. 2007. Mangrove Trees and Shrubs. Bangkok (TH): FAO. Francis, Kerem Z, Makkar H, Becker K. 2002. The biological action of saponin in animal system: a review. British Journal of Nutrition. 88:587-605. Hagerman AE, Riedl K, Jones A, Sovik K, Ritchard N, Hartzfeld P, Riechel P. 1998. High molecular weight plant polyphenolics (tannins) as biological antioxidants. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 46(1): 18871892. Handayani R, Sulistyo J. 2008. Sintesis senyawa flavonoid-α-glikosida secara reaksi transglikosilasi enzimatik dan aktivitasnya sebagai antioksidan. Biodiversitas. 9(1) : 1-4.
19
Harborne JB. 1987. Metode fitokimia. Padmawinata K, Soediro I. Bandung (ID): ITB Press. Terjemahan dari: Phytochemical method 2nd. Kumalasari IJ. 2011. Pengaruh variasi suhu inkubasi terhadap kadar etanol hasil fermentasi kulit dan bonggol nanas (Ananas sativus) [skripsi]. Semarang.(ID): Universitas Muhammadiyah Semarang. Kunaepah U. 2008. Pengaruh lama fermentasi dan konsentrasi glukosa terhadap aktivitas antibakteri, polifenol total dan mutu kimia kefir susu kacang merah [tesis]. Semarang (ID): Universitas Diponegoro. McLaughlin JL, Rogers LL, Anderson JE. 1998. The use of biological assays to evaluate botanicals. Journal Drug Information. 32:513-524. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mclaughlin JL. 1982. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Journal Planta Medica. 45:31-34. Molyneux P. 2004. The use of stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (dpph) for estimating antioxidan activity. Songklanakarin Journal Sciences Technology 26(2):211-219. Muhiddin N, Juli N, Aryantha INP. 2001. Peningkatan kandungan protein kulit umbi ubi kayu melalui proses fermentasi. Jurnal Matematika dan Science. 6(1):1-12. Navarroa P, Ginera RM, Recioa MC, Maneza S, Cerda-Nicolas M, Ríosa JL (2001). In vivo anti-inflammatory activity of saponins from Bupleurum rotundifolium. Life Sci. 68(1): 1199-1206. Negara AA. 2013. Aktivitas antibakteri ekstrak daun bakau hitam Rhizophora.mucronata terhadap bakteri penyebab diare [skripsi]. Bogor.(ID): Institut Pertanian Bogor. Noor YR, Khazali M, Suryadiputra IN. 2006. Panduan Pengenalan Mangrove di Indonesia. Bogor (ID): PHKA/WI-IP. Nurdiani R, Firdaus M, Prihanto AA. 2012. Phytochemical screening and antibacterial activity of methanol extract of mangrove plant (Rhizophora.mucronata) from Porong River Estuary. Journal Basic Science and Technology. 1(2): 27-29. Peteros NP dan Mylene Uy. 2010. Antioxidant and cytotoxic activities and phytochemical screening of four Philippine medicinal plants. Journal of Medicinal Plants Research. 4(5): 407-414. Priyanto RA. 2012. Aktivitas antioksidan dan komponen bioaktif pada buah bakau (Rhizophora mucronata Lamk.) [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor Qusti SY, Khatwa AA, Lahwa. 2010. Screening of antioxidant activity and phenolic content of selected food items cited in the holly quran. EJBS. 2(1): 40-51. Redha A. 2010. Flavonoids: Struktur, sifat antioksidatif dan pernanya dalam sistem biologis. Jurnal Belian. 9(2): 196-200.
20
Robinson T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Padmawinata K. Bandung (ID): ITB Press. Terjemahan dari: The Organic Constituents of Higher Plants, 6th Edition. Rohaeti, Suratmo, Uzma N. 2010. Potensi ekstrak rhizophora sp. sebagai inhibitor tirosinase. Prosiding Seminar Nasional Sains (3). Salazar-aranda R, Perez-Lopez LA, Arroyo JL, Alanis Garza BA, de Torres NW. 2009. Antimicrobial and antioxidant activities of plants from northeast of Mexico. Journal of Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 41(2):233- 236. Setyawan AD, Yaya IU, Pandisamy R. 2014. Review: Mangrove hybrid of Rhizophora an its parental species in Indo-Malayan region. Nusantara Bioscience. 6(1): 69-81. Sirait M. 2007. Penuntun Fitokimia dalam Farmasi. Bandung: Institut Teknologi Bandung. Sukardjo S. 1984. Ekosistem mangrove. Oseana. IX(4) : 102-115. Suprihatin. 2010. Teknologi Fermentasi. Surabaya (ID): UNESA Press. Suratmo. 2009. Potensi ekstrak daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai antioksidan. Jurnal Penelitian 205(1):1-5. Tamat SR, Wikanta T, Maulina LS. 2007. Aktivitas antioksidan dan toksisitas senyawa bioaktif dari ekstrak rumput laut hijau Ulva reticulata Forskal. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. 5(1):31-36. Tri Radiyati, Agusto WM. 1990. Pendayagunaan ubi kayu. Subang (ID): BPTTG Puslitbang Fisika Terapan – LIPI. Xiong S, Hou D, Huang N, Li A. 2012. Preparation and biological activity saponin ophiogon japonicas. African Journal of Pharmacy and Pharmacology. 6(26): 1964-1970. Yulianto R, Widyaningsih TR. 2013. Formulasi produk minuman herbal berbasis cincau hitam (Mesona palustris), Jahe (Zingiber officinale), Dan Kayu Manis (Cinnamomum Burmanni). Jurnal Pangan dan Agroindustri. 1(1) : 65-77. Zhang H, Zhou Q. 2013.Tyrosinase inhibitory effects and antioxidative activities of saponins from Xanthoceras Sorbifolia nutshell. Plos One. 8(8):1-6. Zulkarnaen M, Tukiran, Syarief SH. 2012. Isolasi dan karakterisasi senyawa metabolit sekunder dari ekstrak kloroform batang tumbuhan bakau merah (Rhizophora stylosa.Griff) dan uji aktivitas biolarvasida terhadap larva Aedes aegypti. Surabaya (ID): Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa.
21
LAMPIRAN
22
Lampiran 1 Identifikasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Gambar 8 Hasil identifikasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
23
Lampiran 2 Filtrat fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Minggu ke-0
Minggu ke-2
Minggu ke-4
Minggu ke-6
Minggu ke-8
24
Lampiran 3 Foto fermentasi buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Lampiran 4 Hasil uji fitokimia buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
Gambar 9 Hasil uji Meyer
Gambar 10 Hasil uji Wagner
25
Gambar 11 Hasil uji flavonoid, tanin, dan saponin Lampiran 5 Hasil uji antioksidan buah bakau merah (Rhizophora stylosa)
26
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 18 Juni 1992. Penulis adalah anak pertama dari dua bersaudara dari Bapak Heryanto dan Ibu Fetty Rachmawati. Penulis memulai jenjang formal pada pendidikan Taman Kanak-kanak di TK Akbar Bogor, lalu penulis melanjutkan Sekolah Dasar Negeri Cibuluh 1 Bogor dan lulus pada tahun 2004. Penulis melanjutkan Sekolah Menengah Pertama di SMP Negeri 8 Bogor, Jawa Barat, dan lulus pada tahun 2007, kemudian penulis melanjutkan Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 2 Bogor. Tahun 2010 penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Selama menjalani pendidikan akademik di IPB penulis pernah aktif sebagai anggota di UKM MAX (Music Agriculture Xpression). Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum asisten praktikum Biokimia Hasil Perairan tahun ajaran 2013/2014, asisten praktikum Pengujian Bahan Baku Hasil Perairan tahun ajaran 2013/2014, dan asisten Biotoksikologi Hasil Perairan tahun ajaran 2014/2015. Penulis telah melaksanakan praktek lapangan dari tanggal 04 Juli 2013 sampai tanggal 03 Agustus 2013. Pelaksanaan praktek lapang merupakan salah satu syarat dalam menyelesaikan mata kuliah Praktek Lapang dan Integrated Quality Assurance (THP497). Bertempat di PT Satu Tiga Enam Delapan yang beralamat di Jl. Yos Sudarso No. 72 Kelurahan Klatak, Kecamatan Kalipuro, Kabupaten Banyuwangi, Jawa Timur dengan judul “Sanitasi dan Higiene Unit Pembekuan Udang Di PT Satu Tiga Enam Delapan Banyuwangi, Jawa Timur” di PT Satu Tiga Enam Delapan dibawah bimbingan Dr.Ir. Ruddy Suwandi, MS, M.Phil.
