PENENTUAN KADAR INULIN DALAM EKSTRAK BUAH PISANG (Musa paradisiaca, Linn.) SEBAGAI PREBIOTIK DENGAN METODE KLT - DENSITOMETRI Yuni Retnaningtyas1) Lestyo Wulandari1)Rahayu Mustika Sari2)
ABSTRACT Banana is one of prebiotic resource food which is duitable nutrition for bactery either bifidobacterium, eubacterium or lactobacillus, but it is not suitable for bad bactery such as clostridium, shigella, and veillonella. The advantages of prebiotic come from Inulin which is a polimer compound comes from fructose units.This research aimed to develop a Thin Layer Chromatography – Densitometry method of inulin analysis in Banana. Separation of inulin from the sample was performed using Silica Gel F254 with isocratic elution system using acetonitrile : acetone: acetate acid (5:5:4) as mobile phase and detected by using UV detector at wavelength 366 nm . This method validation showed a good linearity with correlation coefficient (r) of 0.9979 while the coefficient of variation of the regression function (Vx0) was 2%. The limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) of the method were respectively 6,86 ng and 20,59 n,. The mean absolute recovery of inulin from the simulation sample was 99,50 % ± 1,75 and the method precision was less than 1,97%. The proposed method applied to the determination of inulin in the banana showed concentration 2,10% ((w/w). So, the proposed TLC- Densitometry method is rapid, simple, and selective for routine analysis.
Key words: inulin, banana, TLC-Densitometric.
eubacterium,
PENDAHULUAN
dan
lactobacillus,
tapi tidak cocok bagi bakteri jahat Pisang merupakan salah satu makanan
sumber
prebiotik
yang
mampu membantu kekebalan tubuh
semisal
clostridium,
shigella,
dan
veillonella (Modler, 1990). Manfaat
prebiotik
tersebut
dalam masa pertumbuhan, menjadikan
berasal dari inulin yaitu suatu senyawa
anak tahan dalam menghadapi demam,
polimer dari unit-unit fruktosa. Inulin
nyeri tenggorokan, dan diare. Prebiotik
bersifat larut dalam air, tetapi tidak
merupakan nutrisi yang sesuai bagi
dapat dicerna oleh enzim-enzim dalam
bakteri baik seperti bifidobacterium,
sistem pencernaan mamalia sehingga
1) Dosen Fakultas Farmasi Universitas Jember 2) Mahasiswa Fakultas Farmasi Universitas Jember
mencapai usus besar tanpa mengalami
Franck et al telah melakukan analisis
perubahan
Meskipun
kimia dan determinasi inulin yaitu
demikian, inulin dapat mengalami
menggunakan metode HPLC, Gas
fermentasi akibat aktivitas mikroflora
Chromatography (GC), dan analisis
yang terdapat di dalam usus besar
HPAEC. Untuk metode KLT sendiri
sehingga berimplikasi positif terhadap
telah dilakukan oleh peneliti asal
kesehatan tubuh (Widowati, 2005).
Slovenia yaitu B. Simonowska, tiga
struktur.
Dari penelitian terdahulu telah dilakukan ekstrak
uji
aktivitas
inulin,
tahun kemudian dilakukan penelitian
prebiotik
kembali
bahwa
HPTLC.
diketahui
endapan isolat berwarna putih, tidak
menggunakan
metode
Metode KLT-Densitometri ini
berbau, larut dengan air. Berdasarkan
dipilih
uji kualitatif yang telah dilakukan
dengan metode lain, metode KLT
diduga isolat yang diperoleh adalah
memiliki kelebihan yaitu preparasi
inulin atau fruktooligosakarida karena
sampel lebih cepat dan penanganan
mempunyai sifat-sifat
yang mirip.
sampel dalam jumlah besar lebih
Namun perlu dilakukan penelitian
mudah dilakukan, selain itu biaya
lebih
operasional juga relatif lebih kecil
lanjut
dengan
menggunakan standar
inulin
dan
pengujian
seperti
uji
lainnya
kromatografi lapis tipis (Yudi et al, 2007).
karena
jika
dibandingkan
(Suryadi et al, 2005).
METODE PENELITIAN Bahan dan Alat
Penelitian
ini
bertujuan
Bahan
yang
digunakan:
mengembangkan suatu metode KLT-
standart inulin, diphenilamin, anilin,
densitometri
asam
untuk
menentukan
fosfat
85%,
metanol
p.a,
kandungan inulin dalam buah pisang.
acetonitril p.a, etanol 95 %, aceton p.a,
Penelitian tentang penentuan kadar
asam asetat p.a, sampel ekstrak Buah
inulin
Pisang .
sebelumnya
dilakukan
sudah
diantaranya
oleh
pernah Anne
Alat – alat yang digunakan
Optimasi Kondisi Analisis
adalah timbangan analitik Sartorius,
Optimasi Eluen
mikropipet,
camag,
Dilakukan pemilihan eluen dengan
lempeng KLT Silica Gel F254, scanner
komposisi: Acetonitril : aceton : air
Densitometer
(5:5:5),
vial,
bejana
winCATS
Camag,
perangkat komputer dengan program winCATS, pengering, oven, alat- alat gelas
yang
biasa
digunakan
di
laboratorium kimia.
Acetonitril:
Acetonitril
:
Acetonitril
aceton
(4:1),
aceton
:
aceton
(1:4),
:
natrium
hidroksida (5:7:2), Acetonitril: aceton : asam asetat (5:5:4).
Prosedur Kerja
Optimasi Penampak Noda meliputi:
Preparasi Sampel Sampel
Reagen Penampak Noda
sebanyak
25mg
dilarutkan dalam 25ml etanol 95% dan disentrifus selama 10 menit.
Dilakukan pemilihan reagen penampak noda dengan komposisi: Vanilin-sulfuric acid, 5% asam sulfat dalam
Preparasi Larutan Standar Larutan standar dibuat dengan cara melarutkan sejumlah
diphenilamin,
2%
DAP
(2%
anilin
dalam
metanol, 15 ml asam phospat 85%).
standar inulin
hingga diperoleh larutan standar induk
Konsentrasi Penampak Noda Pemilihan
dengan konsentrasi 2000ppm. Dari larutan standar
metanol,
induk dibuat larutan
standar dengan konsentrasi 50ppm, 100ppm, 200ppm, 300 ppm, 400ppm, 500ppm, 600ppm, 700ppm, 800ppm.
konsentrasi
penampak noda dilakukan dengan menaikkan noda
konsentrasi
terpilih
konsentrasi
penampak
sehingga
penampak
diperoleh noda
yang
optimum. Suhu dan Lama Pemanasan Dilakukan pemanasan
pemilihan
dengan
suhu
memanaskan
lempeng
pada
suhu
antara
Kondisi Analisis Yang Optimum
95 °C - 120 °C dan dilanjutkan dengan
Berdasarkan hasil optimasi dapat
menghitung lama pemanasan yang
diketahui
diperlukan untuk membentuk noda
digunakan adalah etanol 95%. Fase
yang berwarna dan dinyatakan dalam
gerak
satuan menit.
kromatogram efisien adalah acetonitril
Optimasi panjang gelombang dilakukan dengan scanning noda analit pada Camag TLC Scanner 3 (Densito dan
program
winCATS.
Penilaian panjang gelombang optimum dengan melihat spektrum analit yang terbaca
pada
panjang
gelombang
maksimal dimana tidak ada spektrum komponen
pengotor
pelarut
yang
yang
menghasilkan
: aceton : asam asetat (5:5:4), karena
Optimasi panjang gelombang
scanner)
bahwa
yang
mengganggu. Bila ada Komponen pengotor maka dihitung nilai Rs
memenuhi syarat parameter efisiensi kromatogram yaitu memiliki nilai theoretical platei (N) yang besar, nilai H (Height Equivalent to a Theoritical Plate) yang paling kecil, nilai Resolusi (Rs) ≥ 1,5 dan nilai Rf masuk dalam rentang 0,30 sampai dengan 0,70. Fase diam Lempeng KLT Silika Gel F254. Scanning
panjang
gelombang
dilakukan pada panjang gelombang (λ) 366 nm. Sebagai
penampak noda
digunakan DAP dengan konsentrasi
dengan persyaratan ≥ 1,5.
2% diphenilamin, 2% anilin dalam metanol, 15 ml asam phospat 85% .
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada dilakukan
penelitian penetapan
ini
telah
kadar
inulin
dalam sampel buah pisang. Kadar inulin dalam penelitian ini ditetapkan dengan menggunakan metode KLTDensitometri yang sudah dioptimasi dan divalidasi.
Pemanasan lempeng dilakukan pada suhu 100OC selama 10 menit.
Gambar 1. Spektra standard Inulin pada panjang gelombang 200 – 700 nm
Gambar 2. Kromatogram standart Inulin dengan eluen yang optimum
Validasi Metode Analisis Validasi
metode
yang
Selektivitas / Spesifisitas dilakukan
Selektivitas
merupakan
meliputi Selektivitas / Spesifisitas,
kemampuan suatu metode yang dapat
Linearitas, Limit of Detection (LOD)
mengukur zat tertentu saja secara
dan Limit of Quantitation (LOQ),
cermat dan seksama dengan adanya
Keseksamaan
komponen lain yang mungkin ada
(precision),
Kecermatan (accuracy).
dan
dalam matriks sampel. Selektivitas
ditentukan
melalui
nilai
resolusi.
Penilaian nilai resolusi dapat dilihat
berdasarkan profil kromatogram pada gambar 3 berikut.
= kromatogram standart inulin = kromatogram sampel
Gambar 3. Profil kromatogram standart Inulin dan sampel buah Pisang pada λ = 366 nm Berdasarkan gambar 3 dapat diketahui bahwa sampel memiliki matriks
pengganggu,
pengganggu sempurna karena nilai Resolusi ≥ 1,5.
sehingga
Spesifisitas adalah kemampuan
perhitungan parameter selektivitas dari
suatu
metode
yang
hanya
dapat
nilai resolusi diperlukan. Dari hasil
mengukur zat tertentu saja (analit).
perhitungan didapat nilai Rs = 11,55
Kespesifikan dapat dilihat melalui uji
untuk puncak 1 dan Rs = 6,9 untuk
kemurnian (purity) dan uji identitas
puncak 2. Maka dapat dikatakan
(identity) yang dapat dilihat pada
pemisahan analit inulin dengan matriks
gambar 4 berikut.
= spektra standard Inulin = spektra sampel Gambar 4. spektra sampel dan standart pada uji purity
Berdasarkan gambar 4 dapat
dalam sampel terdapat senyawa Inulin.
dilihat bahwa spektra standart dan
Perhitungan korelasi spektra pada uji
sampel pada panjang gelombang (200
kemurnian dan identitas dapat dilihat
nm - 700 nm) memiliki spekta yang
pada tabel 1.
hampir sama. Hal ini berarti bahwa di
Track 1 2
Rf 0,72 0,71
Tabel 1. Hasil scanning spektrum dari densitometri Senyawa r(s,m) r(m,e) Kesimpulan Inulin 0,997232 0,999941 ok Inulin 0,998032 0,995999 ok
Pencocokan
spektra
Identitas Inulin Inulin
sampel
lebih dari 0,990; selain itu dari data
dan standart Inulin dapat dilihat pada
yang diperoleh menunjukkan bahwa di
tabel 1, diketahui bahwa perhitungan
dalam sampel terdapat inulin.
korelasi spektra dari data densitometri
dalam
Linieritas Pada
penelitian
reagen
penampak
noda,
linieritas
dipanaskan kemudian discanning dan
digunakan konsentrasi standart 100,4
dihasilkan data area standar seperti
ng; 204 ng; 408 ng; 612 ng; 816 ng;
yang ditunjukkan pada tabel 2.
1626 ng. Standart dieluasi, dicelupkan Tabel 2. Koefisien korelasi konsentrasi dan area standart inulin pada uji linieritas Konsentrasi Konsentrasi Area (ng) (log) 100,4 2,001734 807,39 204,0 2,309630 1488,440 408,0 2,610660 2084,240 612,0 2,786751 2492,040 816,0 2,911690 2644,510 1626,00 3,211121 3256,420 Hubungan liniritas antara
masing konsentrasi ditotolkan 2 µL
konsentrasi dalam bentuk logaritma
pada lempeng Silika Gel F254
dengan
menggunakan kondisi terpilih lalu
area
menghasilkan
persamaan regresi y = 2016,9x –
di
3193 dengan R = 0,9979 dan hasil
Densitometri
ini memenuhi persyaratan linieritas dimana nilai r = +1 atau –1
dan
ditentukan
persamaan regresinya dan koefisien korelasinya yang ditunjukkan pada regresi ini kemudian ditentukan
Sensitivitas
nilai LOD dan LOQ sehingga
Penentuan menetapkan
menggunakan
tabel 3. Berdasarkan persamaan
(Harmita, 2004) .
metode
scanning
sensitivitas
diperoleh nilai batas deteksi (LOD)
dengan
sebesar 6,86527400 ng dan batas
deteksi
kuantitasi
dilakukan nilai
batas
(LOQ)
(LOD) dan batas kuantitasi (LOQ).
20,59582000 ng.
Dibuat konsentrasi analit standar
.
kafein 10,4ng – 204 ng masing-
adalah
Tabel 3. Koefisien korelasi konsentrasi dan area standar inulin pada percobaan LOD dan LOQ Koefisien korelasi 0,9999
Persamaan Regresi y = 6,08683000x + 290,6929 deviasi (RSD). Kepresisian dilakukan
Presisi Presisi
merupakan derajat
kesesuaian
diantara
hasil
dan
uji
masing-masing
ditentukan
dengan
lima kali replikasi dengan pengukuran selama tiga hari yang berbeda, dan didapatkan hasil seperti pada tabel 4.
menghitung nilai relatif standart Tabel 4. Data presisi tiga hari percobaan dengan n=5 Hari RSD (n=5) % b/b 1 2,16% 1,98 2 2,23% 2,07 3 1,52% 2,25 Rata-rata 1,97% 2,10% Berdasarkan diketahui
bahwa
variasi-nya
tabel
4
dapat
(perolehan
kembali).
nilai
koevisien
keakuratan
pada
adalah
Perhitungan
penelitian
ini
2,10%.
digunakan metode penambahan baku.
Disimpulkan bahwa metode ini telah
Pengukuran dilakukan dengan 3 kali
memenuhi syarat kepresisian dengan
replikasi sehingga didapatkan data
nilai relatif standart deviasi ≤ 2,7%
seperti tabel 5.
untuk kadar analit 1% - 10% (Huber L., 2007). Akurasi Akurasi
merupakan
ukuran
yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya, yang ditentukan dengan menghitung
nilai
persen
recovery
Tabel 5. Hasil rata- rata akurasi Kadar rata-rata (%) b/b
Penambahan
% Recovery
2,10%
30 % 45 % 60 %
99,04 101,43 98,04 99,50 % ± 1,75
Rata - rata Berdasarkan Tabel 5 diketahui
KESIMPULAN
% Perolehan kembali (%recovery)
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
pada berbagai penambahan adalah
bahwa :
99,50 % ± 1,75. Dimana nilai ini
1. Preparasi sampel yang optimum
berada
pada
rentang
yang
dilakukan dengan menggunakan
diperbolehkan yaitu 97 sampai 103 %
pelarut etanol 95%, volume pelarut
(Huber L., 2007), sehingga metode ini
sebanyak 25 ml, lama ultrasonik
memenuhi syarat keakuratan.
selama 10 menit. 2. Kondisi optimum metode KLT-
Penentuan Kadar Inulin Dalam
Densitometri untuk analisis inulin
Sampel Ekstrak Buah Pisang
dalam Buah Pisang yaitu diamati
Penentuan kadar inulin dalam
pada panjang gelombang 366 nm,
sampel ekstrak Buah Pisang dilakukan
menggunakan pelarut etanol 95%,
dengan preparasi standart, preparasi
eluen acetonitrile: acetone: asam
sampel, dieluasi, dicelupkan dalam
asetat (5:5:4), dan menggunakan
reagen penampak noda, dipanaskan
fase diam lempeng KLT silica gel
dan
F254.
dilakukan
scanning
dengan
densitometer. diketahui kadar inulin
3. Metode KLT-Densitometri untuk
dalam buah Pisang adalah sebesar
inulin
2,10 %
spesifik
memberikan
hasil
yang
karena
tidak
ada
pengganggu, memiliki
linier
koefisien
karena korelasi
=
0,9979, seksama karena RSD-nya
= 1,97% peka karena memiliki 6,86527400
ng
dan
batas
kuantitasi adalah 20,59582000 ng, serta akurat karena menghasilkan % recovery 99,50 % ± 1,75. 4. Kadar inulin dalam ekstrak buah Pisang sebesar 2,10%.
Laboratories 2nd. Informa Healthcare New York USA. Indrayanto, A., Indrayanto G., & Muhammad, M. 2003, Validation Method of Analysis v1.03. Software from General Public Licence. Faculty of Pharmacy. Surabaya : Airlangga University. Low H. N., McLaughlin A.M., Page W. S., Canas J. B., Brause R.A., Low
SARAN
H. N., (2001)Identification of
Berdasarkan penelitian dapat
Hydrolyzed Inulin Syrup and
disarankan bahwa :
High-Fructose Corn Syrup in
1. Perlu dilakukan penelitian analisis
Apple Juice by Capillary Gas
inulin pada sampel lain yang
Chromatography PVM 4:1999,
mengandung inulin seperti dalam
Journal of AOAC International,
bawang
p.486-492
merah, bawang putih,
asparagus, gandum, dan barley karena kadar inulin dalam buah pisang relatif kecil.
DAFTAR PUSTAKA Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian.Vol. I, no.3, 117 – 135. Desember 2004. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Huber,
L. 2007. Validation and Qualification Analytical
Meyer, D. & B. Tungland. 2001. Inulin A Pure Soluble Dietary Fibre. [serial on line]. http://www.nutraceuticalsnow. com/issues/back/2001winter/in ulin.php. [17 Maret 2007] Modler, H.W.; R.C. McKellar & M. Yaguchi. 1990. Bifidobacteria and Bifidogenic FactorsReview. di dalam Tungland, B.C. 2000. Inulin A Comprehensive Scientific Review. Duncan Crow Wholistic Consultan. [serial on line]. http://members.shaw.ca/duncan crow/inulin_review.html. [17 Maret 2007]
Prosek,
M., Simonovska, B., Golcwondra,T., Vovk, I., Andrensek, S., Micovic, E., Golob, T., (2007), Use of HPTLC for Quantitative Evaluation of Inulin in Food Product, Journal of Planar Chromatography- Modern TLC, 0933-4173, 58-62
Satiadarma, Mulja, Thahjono & Kartasasmita. 2004. Asas Pengembangan Prosedur Analisis. Edisi Pertama. Surabaya: Airlangga University Press. Sherma, J & Fried, B. 2004. Hand Book of Thin Layer Chromatography. 3rd edition, revised and expanded. New York: Marcel Dekker, Inc. Simonovska, B.(2000), Determination of Inulin in Food, Journal of AOAC International, 83,675-678
Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung: Penerbit ITB.
TLC
Scanner 3 with Software. www.camag.com
Touchstone, J.C. & Dobbins, M. F. 1983. Practice of Thin Layer Chromathography. 2nd ed., John Willey and Sons. Universitas Jember. 2006. Pedoman Penulisan Karya Ilmiah. Jember: Badan Penerbit Universitas Jember. Wicaksono, Yudi., Suryanto, Yuni Retnaningtyas & Lestyo W. 2007. Pemanfaatan Ekstrak Inulin Buah Pisang (Musa paradisiaca, Linn.) Sebagai Tablet Kunyah Prebiotik. Universitas Jember. Widowati,
S.
2005.
Karakterisasi,
Ekstraksi,
dan
Kajian
Potensi Prebiotik Inulin Umbi Dahlia Seminar
Suryadi, H., Kurniadi M., &Yohanes A. 2005. Analisis Kuantitatif Aflatoksin dalam Bumbu Pecel secara KLT Densitometri. Departemen Farmasi FMIPA, Universitas Indonesia. Kampus UI, Depok. [serial on line]. http.//www.ns.ui.ac.id/seminar 2005/Data/SPF-03.pdf. [13 Juni 2007]
WinCATS 2007.
Tanaman
(Dahlia pinnata L.). Rutin Pangan,
Puslitbang Bogor.
[serial on line] [16 Juni 2005] Zuleta A., Simbucetti, M. E. (2001), Inulin Determination for Food Labeling, Agric. Food Chem, 49(10), 4570-4572