PENDAHULUAN Penyakit asam urat (gout) sudah dikenal sejak 2000 tahun yang lalu dan menjadi salah satu penyakit tertua yang dikenal manusia. Diperkirakan bahwa penyakit asam urat terjadi pada 840 orang setiap 100 000 orang (Juandy 2008). Penyakit asam urat sangat berhubungan dengan hiperurisemia akibat kelebihan produksi dari asam urat dan dipengaruhi oleh tingginya masukan makanan yang kaya akan asam nukleat, seperti jeroan, kacang-kacangan, makanan hasil laut, dan makanan hasil fermentasi (Owen & Jhons 1999). Obat sintetik yang biasa dikonsumsi untuk mengobati asam urat adalah alopurinol. Alopurinol merupakan obat medis yang digunakan untuk menghambat enzim xantin oksidase (XO), tetapi obat ini memberikan banyak efek samping seperti radang hati dan reaksi alergi. Dengan demikian, perlu obat alternatif yang memiliki aktivitas pengobatan lebih baik dan efek samping yang rendah (Chiang et al. 1994). Senyawa flavonoid dan alkaloid pada tanaman dapat berperan sebagai obat untuk penyakit gout dengan menghambat kerja XO (Cos et al. 1998; Milián et al. 2004). Penggunaan bahan alam sebagai obat memiliki kelebihan, yaitu meskipun penggunaannya dalam waktu lama tetapi efek samping yang ditimbulkan relatif kecil sehingga dianggap lebih aman (Katno & Pramono 2002). Penelitian penghambat aktivitas XO telah banyak dilakukan pada berbagai tanaman obat yang berpotensi sebagai obat antigout. Penelitian yang dilakukan Kong et al. (2000) melaporkan bahwa ekstrak metanol Cinnamomum cassia, Chrysanthemum indicum, dan Lycopus europaeus memiliki aktivitas menghambat XO lebih besar dari 50%. Ekstrak tanaman Hexachlamys edulis dan Tamus communis L. memiliki aktivitas penghambat XO karena mengandung senyawa flavonoid dan tanin (Schmeda et al. 1996; Boumerfeg et al. 2009). Senyawa 6aminopurine yang berasal dari daun gandum memiliki daya inhibisi yang kuat dengan nilai IC50 10.89 µM (Hsieh et al. 2007). Hasil penelitian Iswantini dan Darusman (2003) menunjukan peran ekstrak kasar flavonoid herba sidaguri sebagai penghambat aktivitas XO dengan daya inhibisi terkuat bila dibandingkan dengan produk jamu komersial antigout lainnya yang beredar di pasaran. Kemampuan ekstrak kasar flavonoid sidaguri sebagai penghambat aktivitas XO mencapai
55.29% melalui mekanisme inhibisi kompetitif (Hidayat 2007). Kelopak rosela kaya flavonoid antosianin, asam sitrat, asam askorbat, tanin, saponin, dan triterpenoid (Mlati et al. 2007). Sementara ciplukan mengandung saponin, flavonoid (luteolin), polifenol, alkaloid, fisalin, asam palmitat, dan asam stearat (Edeoga et al. 2005). Kandungan senyawa flavonoid, tanin, dan alkaloid pada ekstrak kasar herba ciplukan dan rosela berpotensi mampu menghambat XO (Schmeda-Hirschmann et al. 1996; Cos et al. 1998; Milian et al. 2004). Berdasarkan kandungan senyawa yang terdapat pada tanaman rosela dan ciplukan dilakukan uji khasiat ekstrak tanaman terhadap pengobatan gout melalui evaluasi pengamatan pada laju pembentukkan kristal natrium urat dari larutan lewat jenuh. Nilai indeks laju turbiditas (TRI) kristal natrium urat ditentukan untuk menunjukkan efek penghambatan ekstrak rosela dan herba ciplukan pada pembentukkan kristal natrium urat. Penentuan nilai TRI dilakukan menggunakan metode turbidimetri berdasarkan metode Kavanagh et al. (2000) dengan memodifikasi konsentrasi, jenis kristal, dan penentuan waktu pengukuran. Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan ekstrak kasar kelopak rosela dan ciplukan mampu menghambat aktivitas XO secara in vitro dan mampu menurunkan nilai TRI kristal natrium urat, serta mengetahui potensinya sebagai antigout dan membandingkannya dengan obat alopurinol.
TINJAUAN PUSTAKA Rosela (Hibiscus sabdariffa) Rosela merupakan tanaman asli Afrika. Rosela didomestikasi pada awal abad 4000 SM di Sudan. Sekarang rosela secara luas menyebar ke negara-negara tropik dan subtropik. Tumbuhan ini umumnya dikenal masyarakat dengan nama rosela, garnet balonda (Sunda), mrambos {Jawa Tengah), dan kasturi roriha (Ternate). Berdasarkan ilmu taksonomi tumbuhan rosela dapat diklasifikasikan dalam divisi Spermatophyta, kelas Magnoliopsida, bangsa Malvales, suku Malvaceae, marga Hibiscus, dan jenis H. sabdariffa (Gambar 1).
tumbuhan ciplukan dapat diklasifikasikan dalam divisi Spermatophyta, kelas Dicotyledonnae, bangsa Solanales, suku Solanaceae, marga Physalis, dan jenis P. angulata.
Gambar 1 Kelopak rosela. Kelopak bunga rosela kaya akan antosianin, asam sitrat, dan pektin. Rosela mengandung flavonoid gosipetin, quarsetin, hibisketin dan sabdaretin. Selain itu juga mengandung mineral seperti zat besi, natrium, kalsium, kalium, karbohidrat, serat, gula, dan vitamin (Duke 2008). Dalam kelopak kering rosela mengandung 1.7–2.5% antosianin (Blunden et al. 2005). Ekstrak rosela mengandung 51% antosianin dan antioksidan 24% (Tsai et al. 2002). Salah et al. (2002) melaporkan kandungan flavonoid kuarsetin, luteolin, dan luteolin glikoksida pada ekstrak rosela. Zat-zat seperti gosipetin, antosianin, dan hibiskin glikosida dipercaya sebagai diuretik (peluruh air seni) dan efek koleretik (pengeluaran empedu oleh hati) (Blunden et al. 2005). Rosela biasa digunakan sebagai obat tradisional untuk penyakit tekanan darah tinggi, penyakit hati, dan demam (Wang et al. 2000; Ross 2003; Mojiminiyi et al. 2007). Pigmen merah antosianin pada kelopak rosela dapat digunakan sebagai pewarna makanan (Esselen & Sammy 1975). Sementara kandungan terbesar dalam ekstrak air rosela ialah asam sitrat, asam askorbat, dan malat (Blunden et al. 2005). Kamhi et al. (2000) merekomendasikan penggunaan herba rosela kepada dokter sebagai pengganti obat medis hipertensi karena rasio dan risiko penggunaan herba rosela lebih aman dan lebih baik dibanding kandungan obat medis. Ciplukan (Physalis angulata) Ciplukan adalah tumbuhan asli Amerika yang kini telah tersebar secara luas di daerah tropis. Di Jawa tumbuh secara liar di kebun, tegalan, tepi jalan, semak, dan tepi hutan. Ciplukan di masyarakat Sunda disebut cecenet, sedangkan di Jawa disebut sebagai ceplukan, serta di masyarakat Bali disebut angket, kepok-kepokan, atau keceplokan. Di Inggris dikenal dengan nama morel berry (Gambar 2). Berdasarkan ilmu taksonomi
Gambar 2 Tanaman ciplukan. Ciplukan adalah tumbuhan yang tersebar sepanjang daerah tropis dan subtropis dunia. Penggunaan tumbuhan ini populer dalam pengobatan menyembuhkan luka, radang hati, malaria, penyakit kelamin, rematik, sakit telinga (Freiburghaus et al. 1996; Schimmer et al. 2001; Ankrah et al. 2003; Choi.& Hwang 2003). Ciplukan mengandung saponin, flavonoid (luteolin), polifenol, alkaloid, steroid, vitamin C, asam palmitat, dan asam stearat (Edeoga et al. 2005). Tanaman ciplukan bersifat analgetik (penghilang nyeri), detoksikan (penetral racun) serta pengaktif fungsi kelenjar-kelenjar tubuh. Saponin dan alkaloid yang terkandung dalam ciplukan memberikan rasa pahit dan berkasiat sebagai anti tumor dan menghambat pertumbuhan kanker, terutama kanker usus besar (Lin et al. 1992; Bastos et al. 2006). Ekstrak etanol ciplukan memiliki aktivitas antibakteri (Nayeemulla et al. 2006). Asam Urat Penyakit asam urat atau sering disebut artritis gout merupakan kelainan metabolik akibat deposisi kristal natrium urat pada jaringan atau akibat supersaturnasi asam urat di dalam cairan ekstra seluler. Asam urat adalah senyawa alkaloid turunan purin (xantin). Senyawa asam urat yang ditemukan pertama kali oleh Scheele pada tahun 1776 merupakan produk akhir dari metabolisme nitrogen. Asam urat diperoleh dari hasil ekskresi pada urin hewan pemakan daging. Asam urat (C5H4N4O3) merupakan kristal putih, tidak berbau dan berasa, mengalami dekomposisi dengan pemanasan menjadi asam sianida (HCN), sangat sukar larut dalam air, larut dalam gliserin dan alkali. Asam urat dapat larut pada larutan dengan pH tinggi dan
dapat pula dipanaskan untuk membantu kelarutannya hingga suhu 60 °C. Natrium urat adalah kristal yang terbentuk akibat tingginya konsentrasi asam urat dalam darah. Kristal natrium urat terkumpul pada persendian dan tulang rawan. Natrium urat sama halnya dengan asam urat, sukar larut dalam air. Faktor yang mempengaruhi pembentukan kristal natrium urat ialah pH, suhu, kekuatan ionik, dan konsentrasi Na+. Bentuk geometris kristal natrium urat adalah triklin atau berbentuk jarum (Rinaudo & Boistelle 1982). Penyakit asam urat umumnya menyerang lebih banyak pria daripada perempuan. Hal ini dikarenakan perempuan memiliki hormon estrogen yang ikut membuang asam urat melalui urin (Mansjoer et al. 2004). Kadar asam urat rata-rata di dalam darah atau serum bergantung pada usia dan jenis kelamin. Pada laki-laki, sebelum pubertas kadarnya sekitar 3,5 mg/dl. Setelah pubertas, kadarnya meningkat secara bertahap dan dapat mencapai 5,2 mg/dl. Pada perempuan kadar asam urat biasanya tetap rendah, baru pada usia pramenopause kadarnya di dalam darah rata-rata sekitar 4 mg/dl. Setelah menopause, kadarnya meningkat lagi sampai 4,7 mg/dl (Dalimartha 2006). Hiperurisemia adalah peningkatan kadar asam urat serum di atas nilai normal, yang pada laki-laki di atas 7 mg/dl dan pada perempuan di atas 6 mg/dl. Hiperurisemia bisa menimbulkan penyakit gout. Pengobatan dan pencegahan asam urat bisa dilakukan dengan beberapa cara. Pengobatan secara medis, yaitu dengan menghambat proses sintesis asam urat melalui pemberian alopurinol dan menghambat masuknya leukosit ke dalam sendi yang terkena deposit asam urat dengan kolkisin, atau dengan pemberian obat AINS (antiinflamasi nonsteroid) (Johnstone 2005). Pengobatan dan pencegahan penyakit gout bisa dilakukan dengan beberapa cara, yang pertama melakukan pola diet makanan, seperti menghindari makanan kaya purin, menghindari alkohol, dan banyak minum air putih. Pengobatan dengan memberikan ramuan tradisional telah terbukti melalui penelitian bahwa beberapa jenis tanaman mengandung berbagai senyawa aktif kimia yang dapat meluruhkan asam urat dengan cepat dan tuntas. Dalam pengobatan asam urat, obat tradisional memiliki beberapa fungsi, yaitu menetralisisr tumpukan sisa asam urat, toksin pada otot, tulang, dan sendi, serta membantu proses pembuangan. Selain
itu juga dapat melancarkan sirkulasi darah sehingga menghilangkan peradangan secara lembut dan aman serta mengurangi rasa nyeri (Dalimartha 2006). Xantin Oksidase Xantin aksidase (XO) berperan penting dalam katabolisme purin. XO mempunyai 2 bentuk, yaitu XO dan xantin dehidrogenase (XDH). XDH dapat dikonversi menjadi XO pada mamalia, baik dalam reaksi reversibel maupun irreversibel. XO merupakan enzim yang tersebar luas dalam beberapa spesies dari bakteri hingga manusia. Di dalam tubuh, XO ditemukan di sel hati dan otot, tetapi tidak ditemukan di dalam darah. XO merupakan suatu kompleks enzim yang terdiri atas 1332 residu asam amino, molibdenum (HO2SMo), FAD, dan Fe2S2 sebagai pusat reaksi redoks, dengan bobot molekul sebesar 275 000 Dalton membentuk 2 subunit yang saling setangkup (Hart et al. 1970). Menurut Westerfeld et al. (1959) Senyawa yang dapat berfungsi sebagai penstabilisasi XO diantaranya adalah salisilat, sistein, histamin, dan versenat. Sementara senyawa yang dapat menginhibisi XO berupa ion logam, urea, purin-6-aldehida, dan 2amino-4-hidroksipteridin-6 aldehida. XO mengkatalis oksidasi hipoxantin menjadi xantin lalu menjadi asam urat yang berperan penting pada penyakit gout. Pada saat bereaksi dengan xantin untuk membentuk asam urat, atom oksigen ditransfer dari molibdenum ke xantin. Perombakan pusat molibdenum yang aktif terjadi dengan penambahan air (Cos et al. 1998) (Gambar 3). Xantin+ 2O2 + H2O Xantin+O2+ H2O
Gambar 3
asam urat + 2O2*-+2H+ asam urat + H2O2
Skema reaksi xantin oksidase yang mengkonversi hipoxantin menjadi xantin dan asam urat (Cos et al. 1998).
Selama proses oksidasi molekul, oksigen bertindak sebagai akseptor elektron menghasilkan radikal superoksida (O2*) dan hidrogen peroksida (Ramdhani 2004). Satu unit XO dapat mengkonversi satu mikromol substrat (xantin) menjadi asam urat tiap satu menit pada pH optimum (pH 7.5) dan suhu optimum (25 °C). Apabila substratnya hipoxantin, aktivitasnya menjadi 50% atau setengahnya. XO dapat diisolasi dari berbagai macam sumber seperti susu, mikroorganisme, dan buttermilk. XO memiliki pengaruh antitumor dan berperan aktif dalam timbulnya panas akibat penyimpanan hepatik ferritin dalam plasma. Selain itu, XO diketahui dapat mengkatalisis reduksi nitrat dan nitrit menjadi nitrit oksida (Millr et al. 2002) dan sekaligus menyebabkan pembentukan radikal superoksida yang dapat menyebabkan peradangan (Bodamyali et al. 2002). Produksi asam urat berlebih dapat menyebabkan hiperurisemia namun ketika asam urat disimpan di dalam persendian akan menyebabkan peradangan dan penyakit gout. Penelitian untuk penghambat XO akan menguntungkan bukan saja untuk mengobati gout tetapi juga untuk menyerang berbagai penyakit lain (Kadota et al. 2004). Flavonoid Flavonoid tersebar luas di alam, terutama dalam tumbuhan tingkat tinggi dan jaringan muda. Sekitar 5–10% metabolit sekunder tumbuhan adalah flavonoid. Flavonoid merupakan grup senyawa alami dengan ragam struktur fenolat yang dapat ditemukan pada buah, sayuran, gandum, batang, akar, cabang, bunga, teh, dan anggur (Middleton 1998). Flavonoid mempunyai kerangka dasar yang terdiri atas 15 atom karbon dengan 2 cincin benzena terikat pada suatu rantai propana membentuk susunan C6-C3-C6 (Gambar 4). Susunan tersebut dapat menghasilkan 3 struktur, yaitu 1,3-diaril propana (flavonoid), 1,2-diarilpropana (isoflavonoid), dan 1,1-diarilpropana (neoflavonoid) (Markham 1988).
Flavonoid sebagai derivat benzo-γ-piron mempunyai banyak kegunaan di samping fungsinya yang pokok sebagai vitamin P untuk meningkatkan resistensi dan menurunkan permeabilitas kapiler darah. Efek lain flavonoid sangat banyak macamnya terhadap berbagai organisme dan efek ini dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung flavonoid dipakai dalam pengobatan. Flavonoid dapat bekerja sebagai antivirus, antialergi, antimikroorganisme, dan antioksidan untuk mengendalikan radikal bebas yang dapat menyebabkan tumor (Middleton 1998). Flavonoid dikenal sebagai antioksidan dan memberikan daya tarik sejumlah peneliti untuk meneliti flavonoid sebagai obat yang berpotensi mengobati penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas. Flavonoid juga penghambat efektif dari beberapa enzim termasuk XO, siklooksigenase, dan lipooksigenase (Ruangrungsi et al. 1981; Hoorn et al. 2002; Hayashi et al. 1988). Flavonoid berpotensi dapat digunakan sebagai obat untuk penyakit gout dan ischemia dengan cara menurunkan konsentrasi asam urat dan penangkapan aktivitas superoksida dalam jaringan manusia (Cotelle et al. 1992). Flavon memiliki aktivitas inhibisi lebih kuat dibandingkan flavonol. Senyawa krisin, apigenin, luteolin, galangin, kaempferol, dan quarsetin memiliki aktivitas penghambat XO dan senyawa yang memiliki aktivitas inhibisi paling kuat adalah senyawa luteolin (Cos et al. 1998). Struktur senyawa flavonoid ditunjukan pada Table 1. Tabel 1 Struktur senyawa flavonoid Senyawa
R3
R5
R6
R7
R3'
R4'
Krisin
H
OH
H
OH
H
H
Apigenin
H
OH
H
OH
H
OH
Luteolin
H
OH
H
OH
OH
OH
Galangin
OH
OH
H
OH
H
H
Kaemferol
OH
OH
H
OH
H
OH
Kuarsetin
OH
OH
H
OH
OH
OH
Turbidimetri
Gambar 4 Kerangka dasar flavon
The America Public Health Association (APHA) mendefinisikan dari sifat optik yang menyebabkan cahaya dihamburkan dan ditransmisikan secara lurus pada sampel. Turbiditas bukanlah ukuran langsung dari partikel suspensi dalam air, tetapi ukuran dari
efek hamburan partikel yang terkena cahaya. Intensitas cahaya yang dihamburkan dan diserap oleh suspensi adalah fungsi konsentrasi jika kondisi lainnya konstan (Khopkar 1984). Kavanagh et al. (2000) menyatakan bahwa indeks laju turbiditas adalah nilai percobaan hasil pengukuran sifat turbiditas reaksi pembentukan suatu kristal. Dalam kaitannya dengan batu kristal natrium urat, nilai ini merupakan dugaan yang memadai terhadap nilai konstanta laju dan karakteristik bentuk kristal natrium urat, dan kedua parameter ini mewakili proses terbentuknya batu kristal natrium urat di dalam ginjal. Pendekatan pengukuran konstanta laju dan karakteristik kristal natrium urat berdasarkan perubahan turbiditasnya dapat dihitung dari persamaan berikut: Ln (∆D/mint=0) ≈ ln (Ka) – n ln (Sprod) + (n x 0,81) ln ([Na]t=0) + n ln ([Urat]t=0) Dimana (∆D/mint=0) = nilai perubahan pembentukan kristal, K = konstanta laju, a = karakteristik kristal, n = orde reaksi, Sprod = perubahan kelarutan, [Na]t=0 dan [urat]t=0 adalah konsentrasi natrium dan urat pada saat t = 0. Indeks laju turbiditas dari kristal natrium urat didapatkan dari anti-ln intersep kurva antara ln (∆D/mint=0) dan ln [Urat]t=0 . Jika percobaan dilakukan dengan penambahan konsentrasi urat yang berbedabeda tapi pada pH, suhu, dan [Na] yang tetap, kemudian diplotkan ln (∆D/min) pada ln [Urat] maka akan diperoleh gradien garis lurus dan sebuah intersep dimana berkaitan langsung dengan ln (Ka) (Kavanagh et al. 2000).
BAHAN DAN LINGKUP KERJA Alat dan Bahan Bahan yang digunakan ialah serbuk kelopak rosela, serbuk herba ciplukan, alopurinol, xantin oksidase, xantin, Tween 80, kista A. salina Leach, asam urat, dan natrium asetat. Bahan baku kelopak rosela dan herba ciplukan diperoleh dari UPT Kebun Percobaan Pusat Studi Biofarmaka LPPMIPB, Bogor. Alat analitis yang digunaka ialah spektrofotometer UV-Vis Hitachi 2800 dan turbidimeter 2100P HACH. .
Lingkup Kerja Penelitian ini dilakukan beberapa tahap, yaitu persiapan sampel, penentuan kadar air, ekstraksi, uji fitokimia, uji toksisitas ekstrak terhadap A. salina Leach, uji inhibisi ekstrak terhadap aktivitas xantin oksidase secara in vitro. Diagram alir penelitian disajikan pada Lampiran 1. Persiapan sampel Kegiatan Sortasi basah bertujuan memisahkan kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari tanaman yang akan diteliti. Pekerjaan dilanjutkan dengan pencucian untuk menghilangkan tanah dan pengotor lainnya yang masih menempel pada bahan yang sudah disortasi basah. Tahap berikutnya adalah perajangan bertujuan mempermudah proses pengeringan dan penggilingan. Tahap terakhir pengeringan dilakukan dengan udara kering hingga kadar air kurang dari 10% agar bahan yang diperoleh tidak mudah rusak akibat dari mikroorganisme. Penentuan kadar air (AOAC 1984) Cawan porselen dikeringkan dalam oven pada suhu 105 ºC selama 30 menit, lalu cawan porselen didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan ditimbang bobot kosongnya. Sampel ditimbang sekitar 3 g dan dimasukkan ke cawan porselen. Sampel beserta cawannya dipanaskan pada suhu 105°C selama 3 jam di dalam oven. Setelah didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, cawan beserta isinya ditimbang. Prosedur dilakukan berulang kali sampai didapatkan bobot tetap dengan selisih kurang dari 1 mg. Penentuan kadar air dilakukan sebanyak 3 kali ulangan (triplo). Persen kadar air kelopak rosela dan herba ciplukan dihitung dengan persamaan: a-b % Kadar Air = x 100% a dengan a = bobot sebelum dikeringkan (g) b = bobot setelah dikeringkan (g) Ekstraksi air (BPOM 2004) Serbuk kelopak rosela dan herba ciplukan diekstraksi dengan nisbah sampel pelarut air 1:10 menggunakan metode maserasi selama 6 jam sambil sekali-sekali diaduk, kemudian didiamkan sampai 24 jam. Maserat dipisahkan dan proses diulangi 1 kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Semua maserat dikumpulkan dan diuapkan dengan radas penguap berputar hingga diperoleh ekstrak kering (Lampiran 2).
