PEMANFAATAN KONSORSIA OLEAGINOUS UNTUK PRODUKSI BIODIESEL MENGGUNAKAN SUBSTRAT PALM OIL MILL EFFLUENT (POME)
LISNAWATI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Pemanfaatan Konsorsia Oleaginous untuk Produksi Biodiesel Menggunakan Substrat Palm Oil Mill Effluent (POME) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh LIPI atas nama Prof. Dr. I Made Sudiana MSc. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, April 2014
Lisnawati NIM G84100049
* Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait.
ABSTRAK LISNAWATI. Pemanfaatan Konsorsia Oleaginous untuk Produksi Biodiesel Menggunakan Substrat Palm Oil Mill Effluent (POME). Dibimbing oleh MEGA SAFITHRI dan I MADE SUDIANA. Mikrobia Pengakumulasi Lipid (Oleaginous) merupakan jenis mikroba yang dapat mengkonsumsi lipid dan mengakumulasinya dalam sel. Mikrobia tersebut mampu menggunakan selulosa sebagai sumber karbon. Selulosa pada POME (Palm Oil Mill Effluent) dapat digunakan mikrobia sebagai sumber karbon. Selulosa dipecah menjadi senyawa sederhana oleh aktivitas mikroba hidrolitik. Isolat fungi hidrolitik yang digunakan adalah ATH 2147, jamur S-30, dan jamur S-50, untuk oleaginous microbes yang digunakan adalah Y34. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan efektivitas hidrolisis dan akumulasi lipid yang paling optimal dalam produksi biodiesel dan mengetahui pengaruh suhu, inokulan mikroba, dan lama waktu inkubasi pada proses hidrolisis dan akumulasi lipid. Proses hidrolisis dilakukan dengan optimasi pada suhu 30oC dan 50oC, begitu pula proses akumulasi lipid dilakukan pada suhu yang sama. Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan, POME yang ditambahkan mikroba ATH 2147+Y34 menghasilkan aktivitas enzim selulase tertinggi pada suhu 50oC hari ke-4 dan akumulasi yang tertinggi pada suhu 30oC hari ke-6 pada pH 4.3. Untuk jenis lipid tertinggi adalah metil butanoat dan lipid untuk produksi biodiesel yaitu asam lemak palmitat dan asam lemak stearat. Konsorsia ini dapat digunakan penelitian lanjutan energi terbarukan generasi kedua. Kata kunci: Biodiesel, Mikrobia Pengakumulasi Lipid, Palm Oil Mill Effluent.
ABSTRACT LISNAWATI. Oleaginous Concortial for Biodiesel Production Using POME Substrate. Supervised by MEGA SAFITHRI and I MADE SUDIANA. Oleaginous accumulate lipid in the bodies and able to use cellulose in POME (Palm Oil Mill Effluent) as sole carbon source for lipid accumulation. Enzyme produce by microorganism is able to hydrolyze cellulose into fermentable sugar. Hydrolytic fungi used in study ATH 2147, S-30, S-50, and oleaginous yeast selected was Y34. The purpose of this study is to determine the hydrolysis activities and the most optimal lipid accumulation biodiesel production and determine the effect of temperature, microbial inoculants, and the incubation time on hydrolysis and lipid accumulation. Hydrolysis and lipid accumulation process at 30oC and 50oC. Based on the analysis, it was found that consortia of ATH 2147+Y34 produce highest cellulose enzyme activity at a temperature of 50oC at day 4 and the highest lipid accumulation at 30oC at pH 4.3 after 6 days cultivation. Fatty acid methyl ester composition was dominated by methyl butanoate, palmitic acid, and stearic acid. These consortia could be used for second-generation biofuel research. Keywords: Biodiesel, Oleaginous microbes, Palm Oil Mill Effluent.
PEMANFAATAN KONSORSIA OLEAGINOUS UNTUK PRODUKSI BIODIESEL MENGGUNAKAN SUBSTRAT PALM OIL MILL EFFLUENT (POME)
LISNAWATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014
Judul Skripsi : Pemanfaatan Konsorsia Oleaginous untuk Produksi Biodiesel Menggunakan Substrat Palm Oil Mill Effluent (POME) Nama : Lisnawati NIM : G84100049
Disetujui oleh
Dr. Mega Safithri. SSi., MSi. Pembimbing I
Prof. Dr. I Made Sudiana. MSc. Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Bismillahirrahmaanirrahiim Puji dan syukur kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan usulan penelitian yang berjudul Pemanfaatan Konsorsia Oleaginous untuk Produksi Biodiesel Menggunakan Substrat Palm Oil Mill Effluent (POME). Penelitian ini dilaksanakan mulai dari bulan Oktober 2013 di Laboratorium Mikrobiologi, Bidang Fisiologi Pusat Penelitian Biologi-LIPI Cibinong. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Mega Safithri, S.Si., M.Si dan Prof. Dr. Ir. I Made Sudiana, M.Sc selaku pembimbing, atas bimbingan serta arahan mengenai kritik dan sarannya dalam menyusun usulan penelitian ini. Ucapan terima kasih tak lupa penulis berikan kepada Ibu Atit, Mbak Senlie, Mbak Anis, Mas Helbert, dan Mbak Tutus sebagai analis yang telah banyak membantu penulis dalam segala hal saat penelitian di LIPI. Serta terima kasih penulis ucapkan untuk ibu, Irfan, keluarga, dan Biokimia 47 yang senantiasa selalu mendukung dan memberi motivasi setiap harinya. Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk memperbaiki tulisan ini. Atas kritik dan saran yang diberikan, penulis ucapkan terima kasih. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat baik bagi penulis maupun pembaca.
Bogor, April 2014
Lisnawati
DAFTAR ISI
DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN METODE Bahan dan Alat Metode Penelitian HASIL PEMBAHASAN SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
viii viii viii 1 2 2 3 5 10 15 15 16 16 20 27
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Seleksi mikroba hidrolitik pada medium CMC Seleksi mikroba hidrolitik pada médium N-limited Aktivitas enzim selulase hari ke-2 Aktivitas enzim selulase hari ke-4 Aktivitas enzim selulase hari ke-6 Aktivitas lipogenesis hari ke-3 Aktivitas lipogenesis hari ke-6 Penurunan kadar TOC Mekanisme hidrolisis selulosa Proses pembentukan triasilgliserol Proses transesterifikasi Struktur metil butanoat Kurva standar gula reduksi Kurva standar lipid Kurva standar TOC
6 6 7 7 8 8 9 9 11 13 14 15 22 22 23
DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Indeks selulotik inokulan pada medium CMC Profil pH pada suhu 30oC dan 50oC hari ke-6 Komposisi lipid pada Y34 + ATH 2147 Absorbansi pengukuran glukosa standar Absorbansi pengukuran lipid standar Absorbansi pengukuran TOC standar Aktivitas hidrolisis hari ke-2 Aktivitas hidrolisis hari ke-4 Aktivitas hidrolisis hari ke-6 Aktivitas lipogenesis hari ke-3 Aktivitas lipogenesis hari ke-6 Profil TOC awal Profil TOC akhir
6 9 10 22 22 23 23 23 24 24 24 25 25
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3
Alur penelitian Parameter GCMS yang digunakan Hasil Penelitian
20 21 22
PENDAHULUAN Kelapa sawit merupakan salah satu komoditas yang penting dalam perekonomian Indonesia, karena dapat menjadi sumber devisa negara. Produksi kelapa sawit di Indonesia yang selalu meningkat setiap tahunnya menyebabkan peningkatan limbah yang dihasilkan dari proses pengolahan buah kelapa sawit menjadi CPO (Crude Palm Oil). Saat ini Indonesia menjadi penghasil minyak kelapa sawit terbesar di dunia, bahkan mulai tahun 2007 Indonesia mengalahkan produksi kelapa sawit Malaysia yang hanya menghasilkan 14000 ton dan menempati posisi pertama produsen sawit dunia sebesar 16000 ton (DJP 2009). Luas perkebunan kelapa sawit di Indonesia meningkat setiap tahunnya, pada tahun 2013 mencapai 5592 Ha (BPS 2013). Proses ekstraksi kelapa sawit menjadi CPO membutuhkan air dalam jumlah besar, dan 50% dari air tersebut menjadi limbah efluen minyak kelapa sawit atau POME (Palm Oil Mill Effluent). Limbah POME memiliki kandungan senyawa kompleks yang tinggi karbohidrat, protein, lemak, dan mineral. POME merupakan cairan kental berwarna coklat, pH 4.2, memiliki Chemical oxygen Demand (COD) sekitar 53,630 mg/L dan Biological Oxygen Demand (BOD) sebesar 25,000 mg/L, minyak dan lemak sebanyak 0.6%, serta total solid 43,635 mg/L (Ma et al. 2000). Limbah POME ini mempunyai dampak yang buruk bagi lingkungan bila dibuang tanpa ada pengolahan terlebih dahulu, terutama berbahaya bagi lingkungan perairan seperti sungai karena dapat menjadi agen pencemar lingkungan. Oleh karena itu untuk mengurangi toksisitas limbah POME dilakukan sistem pengolahan yang efisien dan efektif sesuai standar mutu air bersih. Limbah POME dapat dijadikan substrat dalam produksi biofuel (Conley dan Tao 2007). Biodiesel merupakan suatu jenis secondary biofuels yang berbentuk cair. Biodiesel merupakan bahan bakar alternatif dari sektor biofuel cair dalam dekade terakhir. Secara konvensional biodiesel diperoleh melalui reaksi transesterifikasi triasilgliserol yang berasal dari renewable lipid dan menghasilkan monoalkil ester dengan asam lemak berantai panjang dan rantai alkohol pendek (Dai et al. 2007). Pada penelitian Ma et al. (2008) pembentukan biodiesel biasa berasal dari tumbuhan, namun metode tersebut membutuhkan biaya produksi yang besar dan bahan bakunya sangat tergantung dengan lahan, musim, dan iklim. Selain itu dibutuhkan waktu yang panjang hingga masa panen. Salah satu cara yang sedang dikembangkan, yaitu produksi biodiesel dengan memanfaatkann konsorsia oleaginous (Ma et al. 2008). Metode produksi biodiesel dengan memanfaatkan konsorsia oleaginous ini sangat efektif, karena tidak dipengaruhi iklim dan musim, selain itu tidak membutuhkan lahan produksi yang luas (Pan et al. 2009). Kebaruan dari penelitian ini adalah adanya optimasi suhu yang dilakukan pada suhu 30oC dan 50oC secara aerobik, serta penggunaan konsorsia oleaginous, yaitu Candida sp. (Y34), Flavodon flavus (ATH 2147), jamur sludge, dan campuran Y34 + ATH 2147. Pada konsorsia Y34 + ATH 2147 terdapat dua jenis mikroba, yaitu Candida sp. (Y34) yang bekerja untuk menghidrolisis dan Flavodon flavus (ATH 2147) untuk akumulasi lipid. Mikroba yang bekerja untuk menghidrolisis
2
memiliki kemampuan menghasilkan enzim selulase, enzim ini bekerja untuk mendegradasi selulosa yang ada pada POME menjadi monomernya. Mikroba yang bekerja untuk akumulasi lipid memiliki ATPcitrate constant lyase (ACL), acetyl-CoA karboksilase, dan malic enzyme (ME) yang berfungsi dalam proses biosintesis lipid saat jumlah glukosa banyak dan N terbatas (Meng et al. 2008). Ketiga jenis mikroba tersebut memiliki efektivitas yang berbeda dalam hidrolisis POME, harapannya semakin tinggi hidrolisis POME yang dilakukan oleh ketiga mikroba, semakin tinggi pula produksi akumulasi lipid yang dihasilkan. Optimasi saat hidrolisis dan fermentasi sangat penting untuk meningkatkan akumulasi lipid yang ingin diperoleh, karena itu dilakukan optimasi suhu pada suhu 30oC dan 50oC. Pada penelitian ini dilakukan perlakuan tambahan untuk mengetahui jenis lipid yang dihasilkan dan kadar TOC (Total Organik Karbon) pada POME setelah perlakuan. Selain itu, dilakukan pula pengujian pada konsorsia jamur S-30 dan S-50 sebagai pembanding yang belum diketahui aktivitasnya. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Oktober hingga bulan Maret 2014 di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Biologi bidang Mikrobiologi, Cibinong-Jawa Barat. Tujuan dari penelitian ini untuk menentukan efektivitas perlakuan pada proses hidrolisis dan akumulasi lipid dalam produksi biodiesel dengan bantuan konsorsia oleaginous. Selain itu untuk mengetahui kondisi suhu, jenis inokulan mikroba, dan lama waktu inkubasi yang paling optimal dalam produksi biodiesel. Penelitian ini diharapkan menghasilkan manfaat bahwa limbah POME hasil dari produksi CPO dapat dimanfaatkan kembali dan tidak berbahaya untuk lingkungan. Selain itu, diperoleh metode untuk produksi biodiesel yang lebih efektif, cepat, dan tidak membutuhkan tempat yang luas.
METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah POME dari PT. Perkebunan Nusantara VIII Malimping, Banten. Kultur murni khamir yang digunakan, yaitu Candida sp. Y34, koleksi dari InaCC, Indonesia LIPI Biologi, Cibinong. Kultur murni fungi yang digunakan adalah Flavodon flavus ATH 2147, Jamur S-30, dan Jamur S-50 koleksi Laboratorium Ekologi Fisiologi Mikrobia Pusat Penelitian Biologi. Bahan untuk pembuatan CMC (Carboxymethyl Cellulose), yaitu CMC, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, agar, aquades, dan pepton. Untuk medium akumulasi lipid bahan yang digunakannya adalah KH2PO4, yeast extract, NH4NO3, CaCl2.7H2O, aquades, agar, MgSO4, dan glukosa. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis indeks selulotik, yaitu reagen Congo red 0.2% dan garam fisiologis NaCl, untuk aktivitas enzim, yaitu bubuk DNS dan NaOH, untuk pengukuran total lipid, yaitu Suddan Black 0.03% dan alkohol 70%. Untuk metode esterifikasi menggunakan bahan NaOH, metanol, aquades, asam hidroklorit, metil alkohol, heksana, dan metilter-butil eter.
3 Alat yang digunakan diantaranya adalah autoklaf Tomy 5x-500, laminar air flow cabinet Hitachi Clear Bench, botol beling, inkubator Central Kagaku Corp CB-5, CB-L 30oC dan 50oC, sentrifugasi KOKUSAN H-15FR Pupick Fled, peralatan gelas pyrex, spektrofotometer UV-Vis MAPADA V-1100D, magnetic stirer, kapas, plastik, alumunium foil, Furnish Ep-type Isuzu Seisa Kusho Co.Ltd, cawan, spatula, cawan petri, Shaker BR-3000LF, tusuk sate, vortex SIBATA TTM-1, tusuk gigi, sedotan, tabung eppendorf, spatula drygalski, pipet mikro 1000 µL dan 200 µL, tip 1000 µL dan 200 µL, Kromatografi GasSpektrofotometri Massa (GCMS) QP2010, dan pH meter Az 86505.
Metode Penelitian Penentuan Aktivitas Hidrolisis (Mun et al. 2008) Penentuan aktivitas hidrolisis ditentukan dari jumlah gula reduksi dan aktivitas enzim selulase. Sampel sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf lalu di sentrifus 4oC pada kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil 0.5 mL untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan aquades 0.5 mL ditambahkan. Untuk Go ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan dipanaskan selama 7 menit, kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Untuk Gt diinkubasi pada suhu 30oC selama 60 menit, setelah itu ditambahkan 0.2 mL larutan DNS dan dipanaskan selama 7 menit. Kembali diukur absorban dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Total Gula Reduksi = Absorbansi saat t (Gt) - Absorbansi saat 0 (Go) Pembuatan Kurva Standar Glukosa (Mun et al. 2008) Kurva standar glukosa dibuat dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan konsentrasi 0 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 400 ppm, 500 ppm dan 1000 ppm. Larutan glukosa standar kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm, Hasil pengukuran tersebut dibuat grafik lalu dicari persamaan garisnya. Persamaan garis yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung konsentrasi lipid (ppm). Seleksi Mikroba Hidrolitik (Mun et al. 2008) Mikroba yang memiliki kemampuan hidrolitik dibuktikan pada medium CMC, ditumbuhkan dan diuji secara kualitatif sehingga terbentuk zona jernih disekitar koloni. Pengujian dilakukan dengan menggunakan pewarna congo red sebanyak 3 mL secara merata ke dalam koloni dan dibiarkan selama 10 menit kemudian dicuci dengan larutan NaCl steril 0.1 N dan sisa larutan dibuang. Indeks selulotik = Penentuan aktivitas lipogenesis (Khot et al. 2012) Penentuan aktivitas lipogenesis diukur dari total lipid metode Sudan Black. Sebanyak 1 ml sampel dimasukan ke dalam tabung Eppendorf lalu ditambahkan dengan 1 ml reagen Sudan Black B, selanjutnya divortex
4
menggunakan SIBATA Test Tube Mixer TTM-1. Sampel diinkubasi dalam Shaker BR-23FP pada temperatur 28oC selama 30 menit. Sampel diukur absorbansinya dengan menggunakan MAPADA V-1100P Spectrophotometer pada panjang gelombang 580 nm. Sampel disentrifugasi menggunakan KOKUSAN H-15FR selama 10 menit pada temperatur 15oC dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diukur kembali absorbansinya pada panjang gelombang 580 nm sedangkan pelet dibuang. Total lipid = OD sebelum centrifuge – OD setelah centrifuge Pembuatan kurva standar lipid (Khot et al. 2012) Kurva standar lipid dibuat dengan menggunakan poly-ß-hydroxybutyrate (PHB) dengan konsentrasi 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm 500 ppm dan 1000 ppm. Larutan PHB kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 580 nm dengan menggunakan MAPADA V-1100P Spectrophotometer. Hasil pengukuran tersebut dibuat grafik lalu dicari persamaan garisnya. Persamaan garis yang diperoleh kemudian digunakan untuk menghitung konsentrasi lipid (ppm). Seleksi Mikroba Akumulasi Lipid (Khot et al. 2012) Sampel yang memiliki kemampuan akumulasi lipid ditumbuhkan pada medium N-limited padat dengan metode sebar. Metode sebar bertujuan untuk mendapatkan bakteri yang bersifat aerob. Sampel disebarkan dengan menggunakan spatula drygalski dan dilakukan inkubasi di dalam inkubator dengan suhu 30oC selama 3 hari. Pengamatan pertumbuhan koloni diamati. Medium N-limited untuk volume 200 mL, KH2PO4 sebanyak 0.076 g, yeast extract 0.15 g, NH4NO3 0.03 g, CaCl2.7H2O 0.05 g, dan MgSO4 0.05 g dilarutkan dalam 100 mL aquades lalu diaduk dalam shaker. Setelah itu 8 g glukosa ditambahkan dengan 100 mL aquades dalam tabung Erlenmeyer yang berbeda dan diaduk dalam shaker. Campuran glukosa dan aquades ditambahkan ke tabung Erlenmeyer awal dan diaduk dalam shaker kembali, setelah tercampur disterilisasi dan dituang dalam cawan petri. Penghitungan berat kering isolat (Khot et al. 2012) Sebanyak 2 mL sampel ke tabung Eppendorf lalu disentrifugasi menggunakan KOKUSAN H-15FR selama 10 menit temperatur 15oC dengan kecapatan 5000 rpm. Wadah yang akan digunakan dikeringkan lalu ditimbang terlebih dahulu. Pellet yang dihasilkan dikeringkan ke dalam oven suhu 80oC dan ditimbang kembali. Karena hasil yang diperoleh masih dalam g/mL maka dikonversi terlebih dahulu menjadi mg/L atau ppm. Berat kering biomassa dihitung dengan rumus: Berat kering biomassa = (Berat bahan kering+wadah) – Berat wadah kering Pengukuran kadar Total Organik Karbon (TOC) (Mushtaque et al. 2013) Pengukuran TOC dilakukan mengikuti modifikasi metoda phenolpersulfate. Sampel disentrifus kecepatan 2000 rpm sebanyak 6 mL. Supernatan dijadikan berbagai konsentrasi yaitu 1000 ppm, 2000 ppm, 3000 ppm, 4000 ppm,
5 5000 ppm, dan 500 ppm. Diambil 500 µL ke Eppendorf, lalu ditambahkan 50 µL HCl ke dalamnya dan dipanaskan 2 jam. Setelah itu ditambahkan 50 µL fenol 5% dan 250 µL H2SO4 pekat, lalu dipanaskan selama 1 jam. Absorban diukur pada panjang gelombang 490 nm . Kadar TOC (%) = Profil pH pada Perlakuan Lipogenesis (Bhatia et al. 2007) POME yang sudah ditumbuhkan mikroba dan diberi perlakuan diukur pHnya pada hari ke-6 dengan menggunakan pH-meter Az 86505. Identfifikasi lipid dengan GC-MS (Zheng et al. 2012) Isolat terpilih kemudian diidentifikasi jenis lipid yang dihasilkan dengan menggunakan analisis GC-MS. Terdapat lima tahap dalam preparasi sampel untuk analisis GC-MS, yaitu: Pemanenan khamir. Isolat khamir yang memiliki nilai total lipid tinggi diambil 4 mm loop dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi kecil bertutup. Saponifikasi. Sebanyak 1mL reagen 1 (45 g NaOH + 150 mL metanol + 150 mL aquades) ditambahkan, kemudian dikocok dengan menggunakan vortex selama 10 detik. Selanjutnya dipanaskan pada temperatur 100ºC selama 5 menit, lalu dikocok dengan menggunakan vortex kembali selama 10 detik dan dipanaskan kembali pada temperatur 100ºC selama 25 menit. Metilasi. Sebanyak 2 mL reagen 2 (325 mL asam hidroklorit + 275 mL metil alkohol) ditambahkan, kemudian dikocok dengan menggunakan vortex selama 10 detik dan dipanaskan selama 10 menit pada temperatur 80ºC. Ekstraksi. Sebanyak 1,25 mL reagen 3 (200 mL heksana + 200 mL methyltert-butil eter) ditambahkan sehingga terbentuk dua lapisan, kemudian tabung reaksi dibolak-balik selama 10 menit. Selanjutnya lapisan bawah dipipet/dibuang. Pencucian sampel. Sebanyak 3 mL reagen 4 (10,8 g NaOH dilarutkan dalam 900 mL akuades) ditambahkan, kemudian tabung reaksi dibolak-balik selama 5 menit dan terbentuk 2 lapisan, lapisan atas digunakan untuk analisis GCMS.
HASIL Mikroba Hidrolitik dan Akumulasi Lipid Potential Untuk mengetahui kemampuan mikroba sebagai mikroba hidrolitik dapat digunakan medium CMC dan pewarna congo red. Berdasarkan Tabel 1, diperoleh bahwa ATH 2147 memiliki kemampuan hidrolitik yang tinggi daripada yang lain, yaitu 1.76, sedangkan yang lain Y34 sebesar 1.56, Jamur S-30 sebesar 1.21, dan Jamur S-50 sebesar 1.40. Aktivitas hidrolisis dapat dilihat pada Gambar 1, semua jenis inokulan dapat tumbuh pada medium CMC. Untuk mengetahui kemampuan mikroba pengakumulasi lipid dapat digunakan dengan medium N-limited padat. Aktivitas mikroba akumulasi lipid
6
dapat terlihat pada medium N-limited Gambar 2, semua mikroba yang ditumbuhkan pada medium N-limited mengalami pertumbuhan. Tabel 1 Indeks selulotik inokulan pada medium CMC Mikroba
Diameter koloni
Diameter zona bening
Indeks selulotik
Y34
3.00
4.70
1.56
ATH 2147
2.50
4.40
1.76
Jamur S-30
1.65
2.00
1.21
Jamur S-50
1.50
2.10
1.40
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 1 Seleksi mikroba hidrolitik pada medium CMC(a) Y34(b) ATH 2147 (c) Jamur S-30 (d) Jamur S-50
(a)
(b)
(c)
(d)
Gambar 2 Seleksi mikroba hidrolitik pada medium N-limited padat (a) Y34 (b) ATH (c) Jamur S-30 (d) Jamur S-50 Aktivitas Hidrolisis Mikroba Selulotik Aktivitas hidrolisis diperoleh dari pengukuran jumlah gula reduksi yang dapat dihasilkan oleh sampel, baik suhu 30oC dan 50oC. Setelah itu jumlah gula reduksi yang diperoleh dikonversi ke dalam kurva standar dan dijadikan konsentrasi dalam bentuk ppm. Konsentrasi yang diperoleh akan dibagi 180 menjadi satuan unit enzim selulase. Pengukuran yang dilakukan pada hari ke-2, ke-4, dan ke-6 diperoleh pada hari ke-2 baik suhu 30oC maupun 50oC aktivitas enzim selulasenya tidak berbeda nyata dan aktivitasnya masih belum signifikan terlihat pada Gambar 3, namun saat hari ke-4 pada Gambar 4 aktivitas enzimnya mulai terlihat, untuk semua mikroba lebih tinggi aktivitas enzimnya pada suhu 50oC dan nilai yang dicapai pun lebih maksimum dari pada hari selanjutnya terlihat pada Gambar 5. Pada hari ke-6 aktivitas enzim selulosa semakin turun dan nilai aktivitas enzim pun semakin kecil (Gambar 5). Namun bila disimpulkan antara suhu 30oC dan 50oC aktivitas enzim selulase yang paling maksimum terdapat pada suhu 50oC oleh Y34+ATH 2147 pada hari ke-4, karena dapat menghasilkan aktivitas enzim selulase 2.95 unit.
7
Gambar 3 Aktivitas enzim selulase hari ke-2. ■ 30°C □ 50°C * Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
Gambar 4 Aktivitas enzim selulase hari ke-4. ■ 30°C □ 50°C *Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
Gambar 5 Aktivitas enzim selulase hari ke-6. ■ 30°C □ 50°C *Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
8
Aktivitas Lipogenesis Untuk penentuan aktivitas lipogenesis dilihat dari jumlah total lipid yang dihasilkan. Total lipid yang diperoleh merupakan hasil bagi konsentrasi lipid per bobot keringnya. Berdasarkan Gambar 6 pada hari ke-3 jumlah total lipid masih rendah dan peningkatan jumlah total lipid terjadi pada hari ke-6. Total lipid yang tertinggi yaitu Y34+ATH 2147 pada suhu 30oC hari ke-6 sebesar 86.88% per berat kering terlihat pada Gambar 7. Untuk jumlah berat kering yang diperoleh dapat berkisar 15-6.1 gL-1.
Gambar 6 Aktivitas lipogenesis medium POME steril hari ke-2. ■ 30°C □ 50°C *Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
Gambar 7 Aktivitas lipogenesis medium POME steril hari ke-6. ■ 30°C □ 50°C *Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
Profil TOC Selama Kultivasi Untuk mengukur kadar TOC (Total Organik Karbon) digunakan HCl, fenol 5%, dan H2SO4 pekat. Sebelumnya dilakukan pengukuran untuk menentukan kurva standar dengan konsentrasi 50,100, 200, 300, 400, dan 500, sehingga diperoleh persamaan garis y=0.1231x-0.0306, r=0.9949. Setelah itu
9 dilakukan pengujian untuk setiap sampel, diperoleh hasil terjadi penurun kadar TOC POME awal dan TOC POME akhir. Berdasarkan Gambar 8 dapat terlihat yang mengalami penurunan TOC tertinggi terdapat pada sampel Y34+ATH 2147, yaitu sebesar 77.33%.
Gambar 8 Penurunan kadar TOC. ■ 30°C □ 50°C *Angka yang diikuti huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan ada beda nyata antar kelompok perlakuan pada taraf 5%.
Profil pH pada Perlakuan Lipogenesis Pada hari terakhir hari ke-6 sampel akan diukur kadar pH, dan berdasarkan hasil pada Tabel 3 setiap perlakuan tidak mempengaruhi kadar pH sampel. Hasil pH yang diperoleh berkisar 4 atau bersifat asam. Tabel 2 Profil pH sampel setelah perlakuan pada suhu 30oC dan 50oC Sampel Y34 ATH Y34+ATH Jamur S-30 Jamur S-50
Suhu 30oC
Suhu 50oC
4.32 4.32 4.31 4.31 4.31
4.32 4.31 4.32 4.32 4.30
Komposisi Lipid dengan GCMS Analisis komposisi lipid pada sampel yang memiliki total lipid tertinggi yaitu Y34+ATH 2147 suhu 30oC. Berdasarkan Tabel 4 komposisi lipid yang tertinggi pada sampel Y34+ATH 2147 adalah metil butanoat, jumlah konsentrasi sebesar 14.56%. Untuk komposisi lipid yang berpotensi produksi biodiesel yaitu metil palmitat, metil oleat, metil linoleat, dan metil stearat, setelah diukur pada GCMS konsentrasi metil palmitat pada Y34+ATH 2147 sebesar 8.14%, oleat sebesar 9.17%, linoleat sebesar 6.53%, dan stearat sebesar 6.1% (Tabel 3).
10
Tabel 3 Komposisi lipid pada Y34+ATH 2147 suhu 30oC MulaiRT
AkhirRT
2.005
2.09
2.09 7.56
Nama
Jumlah
Konsentrasi (%)
Metil butanoat
0.08
1.94
2.275
Metil caproat
0.18
4.24
7.75
Metil miristat
0.19
4.35
10.68
11.035
Metil palmitat
0.35
8.14
14.095
14.365
Metil stearate
0.27
6.19
14.365
14.765
Metil oleat
0.40
9.17
15.175
15.46
Metil linoleat
0.28
6.53
17.855
17.995
Metil undecanoat
0.14
3.21
17.995
18.17
Metil undecanoat
0.17
4.01
18.17
18.32
Metil undecanoat
0.15
3.44
18.32
18.72
Metil margarat
0.40
9.17
19.395
19.78
Metil cis-12-Octadecenoat
0.38
8.83
21.69
22.07
Metil cis-13,16-Docosadienat
0.38
8.71
22.26
22.585
Metil pentadecanoat
0.32
7.45
23.055
23.69
Metil butanoat
0.63
14.56
Total
4.36
PEMBAHASAN Aktivitas Hidrolisis Aktivitas hidrolisis dilihat dari aktivitas enzim selulase setiap sampel pada suhu 30oC dan 50oC, pengukuran dilakukan pada hari ke-2, ke-4, dan ke-6. Pemilihan perlakuan pada suhu 30oC dan 50oC serta hari pengukuran ditentukan pada penelitian sebelumnya. Berdasarkan penelitian sebelumnya, saat suhu 30oC dan 50oC menghasilkan gula reduksi yang tertinggi, begitu pula pengukuran hari. Pada hari ke-2, ke-4, dan ke-6 terlihat perubahan aktivitas enzim yang jelas (Lisnawati 2013). Penentuan aktivitas hidrolisis dilakukan dengan metode reagen DNS (dinitro salisilat), metode ini dilakukan secara kimiawi. DNS ini merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula dalam suasana basa, dan dapat dibaca pada panjang gelombang 540 nm. Semakin banyak gula reduksi pada sampel, makin tinggi nilai absorbannya. Uji ini akan berwarna jingga kemerahan jika hasilnya positif. Dalam pembuatan reagen DNS terjadi penambahan NaOH ke dalam larutan untuk memberikan suasana basa saat reaksi nanti. Reaksi DNS ini merupakan reaksi redoks pada gugus aldehid gula dan teroksidasi menjadi gugus karboksil, sedangkan DNS oksidator akan tereduksi membentuk 3-amino dan 5nitrosalicylic acid (Sastrohamidjojo 2005). Enzim selulase merupakan enzim ekstraseluler yang bersifat indusibel, dan enzim ini dapat dihasilkan oleh mikroba jika mikroba berada dalam medium yang mengandung induser. Induser berupa selulosa yang dapat mengaktifkan gen
11 untuk produksi enzim selulase. Aktivitas enzim selulase yang masih rendah pada hari ke-2 dikarenakan selulosa belum terhidrolisis secara sempurna dan mikrobia membutuhkan waktu untuk menghidrolisis, karena selulosa merupakan senyawa polisakarida yang kompleks dan sulit larut dalam air namun larut pada senyawa klorida, hidroksi, dan alkali. Enzim selulosa juga bersifat represible, yang akan menurun saat produksinya tinggi (Zhiliang F et al. 2006). Pada penelitian sebelumnya, penentuan aktivitas enzim selulase dilakukan pada Aspergillus niger suhu 50oC sebesar 0.0505 unit (Yusak 2004). Bila dibandingkan dengan hasil penelitian, aktivitas enzim yang dihasilkan oleh inokulan Y34+ATH 2147 lebih tinggi karena dapat menghasilkan aktivitas enzim 2.95 unit pada suhu 50oC. Enzim selulosa yang bekerja pada hidrolisis ini terdapat 3 jenis, yaitu endo 1,2 β-D glukanase, exo 1,4 β-D glukanase, dan β-glukosidase. Ketiga enzim tersebut berperan penting dalam proses hidrolisis, untuk endo 1,2 βD glukanase bekerja untuk memecah selulosa dan memotong selulosa pada bagian amorf ikatan α 1-4 glikosida sehingga mmenghasilkan substrat baru untuk enzim exo 1,4 β-D glukanase. Pada enzim exo 1,4 β-D glukanase berfungsi untuk memecah ujung gula pereduksi dan non pereduksi dan memutus pada bagian kristalin sehingga menghasilkan selobiosa. Enzim β-glukosidase untuk mengubah selobiosa menjadi glukosa (Gambar 9) (Zhiliang F et al. 2006).
Endo 1.4 β-D glukanase Selulosa
Selulosa (Krinstal)
Endo 1.4 β-D glukanase
Selobiase Glukosa
Selobiosa
Gambar 9 Mekanisme hidrolisis selulosa (Zhiliang F et al. 2006) Berdasarkan Gambar 1 menunjukan semua mikroba mampu tumbuh di medium CMC dengan indeks selulotik yang berbeda-beda tergantung pada sifat genetis mikroba dalam mengabsorbsi CMC. Untuk yang tertinggi pada mikroba ATH 2147 dengan indeks selulotik sebesar 1.76, hal ini menjelaskan bahwa mikroba tersebut aktivitasnya tertinggi dalam menggunakan nutrient untuk kebutuhan sel. Hal ini terjadi karena enzim selulase yang dihasilkan mikroba akan memecah CMC menjadi glukosa sehingga sel mudah mengabsorpsi glukosa sebagai sumber karbon dalam pertumbuhan sel dan sumber energi (Prescott 2002).
12
Hasil degradasi selulosa tersebut ditunjukkan dengan adanya zona bening disekitar koloni dan reagen Congo red hanya akan mewarnai polisakarida (selulosa), sedangkan hasil pemecahan tidak terwarnai dan terbentuklah zona bening. Penelitian sebelumnya telah menguji aktivitas enzim selulosa pada medium CMC dari Aspergillus niger sebesar 0.923 (Sohail et al. 2009), hal ini menandakan bahwa aktivitas enzim selulosa pada ATH 2147 sangat tinggi. Aktivitas Lipogenesis Untuk penentuan aktivitas lipogenesis dilihat dari jumlah total lipid yang dihasilkan pada suhu 30oC dan 50oC. Pengukuran dilakukan pada hari ke-3 dan ke-6. Pemilihan perlakuan pada suhu 30oC dan 50oC serta hari pengukuran ditentukan pada penelitian sebelumnya. Berdasarkan penelitian sebelumnya, saat suhu 30oC dan 50oC menghasilkan total lipid yang tertinggi, begitu pula pengukuran hari. Pada hari ke-3 dan ke-6 terlihat perubahan total lipid yang dihasilkan secara jelas (Lisnawati 2013). Penentuan aktivitas lipogenesis ini dilakukan dengan metode reagen Sudan Black untuk mengukur kadar lipid yang dihasilkan. Metode ini lebih cepat, sensitif, non toksik, dan sangat efisien untuk mengestimasi akumulasi lipid oleh mikroba secara kualitatif maupun kuantitatif. Pewarnaan dengan suddan black menyebabkan sel berwarna biru tua hingga hitam karena Suddan Black B biasa digunakan untuk pengecatan senyawa lipid seperti triasilgliserol, fosfolipid, dan lipoprotein di dalam sel (Khot et al 2012). Pengukuran secara kuantitatif dilakukan dengan cara mengurangkan nilai OD 580 sampel dan Sudan Black dengan perbandingan 1:1 sebelum sentrifugasi dengan nilai OD 580 setelah sentrifugasi. Nilai OD 580 sebelum sentrifugasi menunjukkan Sudan Black yang terdapat pada medium sedangkan nilai OD 580 sesudah sentrifugasi menunjukkan Sudan Black yang tidak terikat oleh sel yang mengandung lipid. Dengan demikian, hasil pengurangan merupakan Sudan Black yang diikat oleh sel yang mengandung lipid (Khot et al 2012). Total lipid yang masih rendah pada hari ke-2 dikarenakan aktivitas enzim yang masih rendah, karena aktivitas enzim yang masih rendah menyebabkan gula reduksi yang dihasilkan pun masih sedikit sehingga total lipid yang dihasilkan masih rendah. Kerja enzim selulase dari ATH 2147 mengalami peningkatan dari hari ke-4 dan gula reduksi yang dihasilkan telah digunakan kembali oleh Y34 untuk mengakumulasi lipid, sehingga pada hari ke-6 total lipid tinggi. Menurut Beopoulos et al. (2009) mengatakan bahwa, apabila mikrobia tersebut memiliki kemampuan untuk mengakumulasi lipid lebih dari 20% dari biomassanya maka mikrobia tersebut disebut oleaginous. Berdasarkan total lipid yang dihasilkan dari semua sampel baik suhu 30oC dan 50oC merupakan oleaginous., karena dapat menghasilkan total lipid yang dihasilkan berkisar 23% hingga 61.46% dari biomassanya (>20%). Selain itu penelitian terdahulu akumulasi lipid dengan menggunakan Trichosporon fermentans menghasilkan akumulasi lipid sebesar 40,1% per berat kering sel serta jumlah minyak dan lemak yang terkandung pada POME konsentrasi sebesar 6000 ppm (Huang et al. 2009). Hal ini menunjukan Y34+ATH 2147 lebih tinggi dalam menghasilkan total lipid.
13 Akumulasi lipid ini terjadi karena pada medium kekurangan unsur nitrogen dan kelebihan glukosa hasil dari hidrolisis, sehingga memicu sintesis lipid pada sitoplasma. Glukosa diubah menjadi piruvat dan akan dibawa ke mitokondria untuk dijadikan sitrat. Produksi ATP dalam sel pun meningkat dan AMP, yang berguna untuk menginaktivasi NAD+ turun. Akumulasi sitrat tersebut akan diubah menjadi acetyl co-A dan masuk ke jalur biosintesis lipid (Gambar 10) (Meng et al. 2008).
Gambar 10 Proses pembentukan triasilgliserol (Meng et al. 2008) Profil TOC Selama Kultivasi Total Oganik Karbon (TOC) adalah jumlah karbon yang terikat dalam senyawa organik. Penentuan TOC merupakan suatu cara analisis senyawa organik dengan menentukan kadar karbon secara total dari proses oksidasi sempurna. Metode TOC secara sederhana adalah proses oksidasi kimia yang bertujuan untuk mengubah karbon organik menjadi karbon dioksida (Potter dan Wimsatt 2003). Pengukuran TOC pada penelitian ini untuk mengetahui penurunan karbon organik pada POME (Palm Oil Mill Effluent) yang telah digunakan untuk pembentukan gula reduksi dan lipid. Metode yang dilakukan pada penelitian ini merupakan modifikasi dari pengukuran TOC secara langsung, Direct TOC atau dikenal Non-Purgable Organic Carbon (NPOC) ini prinsipnya mengurangkan hasil karbon total dengan karbon anorganik menggunakan senyawa asam untuk menghilangkan karbon IC (Inorganic Carbon). IC tersebut akan dioksidasi melalui proses pemanasan dan nanti sisa karbon akan dibaca pada spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm (Suligundi 2013). Berdasarkan penelitian sebelumnya diketahui bahwa kadar TOC pada POME sebesar 33 mgL-1 (Rupani 2010), dan dari hasil penelitian diperoleh
14
penurunan TOC tertinggi terdapat pada sampel Y34 + ATH 2147, yaitu sebesar 77.33%. Hal ini menandakan bahwa penelitian ini dapat menurunkan kadar TOC mencapai 77.33% dari 33 mgL-1 konsentrasi TOC POME awal. Kadar TOC yang turun juga mendukung kesimpulan pada bab sebelumnya, yang menjelaskan bahwa campuran Y34 + ATH 2147 menghasilkan lipid yang tertinggi. Hal ini karena sumber karbon organik yang ada telah digunakan sehingga penurunan TOC pun tinggi. Semakin tinggi persen penurunan TOC menandakan semakin banyak karbon yang digunakan, TOC yang rendah ini berguna membantu untuk mengontrol tingkat endotoksin dan mikroba dan mengetahui efek sampel terhadap lingkungan atau kesehatan manusia (Hendrick 2007). Oleh karena itu jenis inokulan ini dapat digunakan untuk penjernihan air, karena dapat menurunkan persen TOC sebesar 77.33%. Pada hari terakhir sampel akan diukur kadar pH, dan berdasarkan hasil pada Tabel 3 setiap perlakuan tidak mempengaruhi kadar pH sampel. Hasil pH yang diperoleh berkisar 4 atau bersifat asam, karena saat aktivasi sel menghasilkan metabolit yang berupa asam-asam organik (Siwi 2011).
Komposisi lipid dengan GCMS Hasil sampel yang memiliki total lipid tertinggi diidentifikasi komposisi lipidnya dengan kromatografi GCMS. Analisis GCMS dilakukan untuk mengetahui komposisi lipid yang terkandung pada sampel, yaitu Y34 + ATH 2147. Analisis juga dilihat dari segi jenis lipid tertinggi yang terkandung dalam sampel dan konsentrasi jenis lipid untuk produksi biodiesel. Karakteristik kromatografi GCMS yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu column oven temperature 150oC, injection temperature 250oC, injection mode split, dan karakteristik lainnya (Lampiran 2). Metode ini merupakan metode pemisahan senyawa organik dengan menggunakan dua metode analisis, yaitu GC untuk mengukur jumlah senyawa kuantitatif, dan masa untuk analisis struktur molekul. Prinsip pembacaan alat ini dengan melihat banyaknya puncak dalam spektra berdasarkan data waktu retensi literatur (Suirta 2009). Berdasarkan Tabel 4, hasil dari GCMS, komposisi lipid pada Y34 + ATH 2147 suhu 30oC bermacam-macam dan mengandung 15 jenis lipid yang berbeda, hal ini terjadi karena adanya proses transesterifikasi yang dimodifikasi sehingga dapat mendeteksi kandungan lipid yang maksimal dalam sampel. Pada Gambar 11 merupakan proses transesterifikasi yang dilakukan pada penelitian ini dengan menambahkan metanol.
Trigliserida
Metanol
Ester metil asam lemak (Biodiesel)
Gambar 11 Proses transesterifikasi (Meng et al. 2008).
Gliserol
15 Penelitian ini menghasilkan jenis lipid yang paling tinggi adalah metil butanoat sebesar 14.56%. Hal ini menjelaskan bahwa hasil lipid yang diperoleh oleh Y34 + ATH 2147 suhu 30oC 14.56% dari komposisi lipidnya merupakan metil butanoat, seperti pada Gambar 12 merupakan struktur dari metil butanoat.
Gambar 12 Struktur metil butanoat (Thomson et al 2006). Metil butanoat pada Gambar 12 merupakan icon dari biodiesel, karena menurut penelitian sebelumnya, metil butanoat ini merupakan hasil primer dari produksi biodiesel, karena rantainya yang pendek sehingga memudahkan terjadinya proses pembakaran (Thomson et al 2006). Hal ini dibuktikan pada penelitian Kuang et al. (2012) yang menjelaskan bahwa, adanya efek metil ester pada struktur metil butanoat menyebabkan sensivitas rendah, namun gugus metil ester ini menyebabkan produksi signifikan dari karbon monoksida dan karbon dioksida. Hal ini juga terjadi karena adanya jalur tambahan melalui metil etanoat radikal yang mengarah pada pembentukan karbon monoksida, jalur ini berfungsi pada pengurangan produksi prekursor jelaga yang terkait dengan oksidasi metil butanoat. Oleh karena itu, metil butanoat bukanlah molekul pengganti ideal untuk oksidasi biodiesel/pembakaran, namun dapat berfungsi sebagai titik awal studi metil ester yang lebih besar (Dooley et al 2008). Pada biasanya yang memenuhi standar komposisi biodiesel adalah asam lemak yang mengandung C-16 (asam palmitat) dan C-18 (asam stearat) (Setyawardhani et al. 2009). Senyawa metil ester yang diperoleh sesuai dengan kandungan asam lemak yang terdapat pada basan dasar minyak kelapa sawit yang sering digunakan untuk biodiesel, antara lain metil palmitat sebesar 8.14%, miristat 4.35%, linoleat 6.53%, oleat 9.17%, dan stearat sebesar 6.19%. Jumlah jenis lipid ini masih rendah bila dibandingkan dengan kandungan palmitat dan stearat pada minyak standar, yaitu 9.92% untuk palmitat dan 8.34% pada stearat (Thomson et al 2006). Hal ini menandakan bahwa Y34+ATH 2147 dapat digunakan untuk produksi biodiesel karena mengandung jenis lipid yang sama dengan kelapa sawit, namun perlu penambahan substrat lain agar jumlah lipid untuk produksi biodieselnya lebih tinggi.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Mikroba Oleaginous dapat digunakan untuk produksi biodiesel dan produksi tertinggi akumulasi lipid yaitu Y34+ATH 2147. Aktivitas enzim selulosanya tertinggi pada suhu 50oC oleh Y34+ATH 2147 pada hari ke-4 sebesar 2.95 unit. Total lipid yang tertinggi diperoleh oleh mikrobia Y34+ATH 2147 pada hari ke-6 suhu 30oC sebesar 86.88% per berat kering dengan pH konstan 4.3.
16
Komposisi lipid yang tertinggi pada Y34+ATH 2147 adalah metil butanoat, dan komposisi lipid yang biasa untuk produksi biodiesel, yaitu metil palmitat sebesar 8.14% dan metil stearat sebesar 6.1%.
Saran Penelitian lanjutan untuk mencari metode atau penggunaan substrat lain selain POME dan air untuk menghasilkan asam lemak yang lebih tinggi untuk produksi biodiesel, serta pengujian nilai mutu standar Nasional Indonesia dan kelayakan uji coba komposisi biodiesel tersebut pada mesin diesel.
DAFTAR PUSTAKA Badan Pusat Statistika. 2013. Luas tanaman perkembangan besar menurut jenis tanaman Indonesia 1995-2013 [Internet]. [diunduh 29 Mei 2014]. Tersedia pada: http://www.bps.go.id. Beopoulos, Cescut AJ, Haddouche, Uribellarea J, Jouve CM, Nicaud J. 2009. Yarrowia lipolytica as a model for bio-oil production. Progress in Lipid Research. 48: 375-387. Bhatia S, Abdullah AZ, Abdullah H. 2007. Preatreatment of Palm Oil Mill Effluent (POME) using moringa olifera seeds as natural coagulant. Journal of Hasardous Materials. 145: 6-120. Conley SP, Tao B. 2007. Bioenergy. Amerika: Perdue University Pr. Dai et al. 2007. Biodiesel generation from oleaginous yeast Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity [Internet]. [diunduh 12 Desember 2010]. Tersedia pada: http://www.academicjournals.org. Direktorat Jenderal Perkebunan. 2009. Statistik kelapa sawit 2005. Jakarta (ID): Departemen Pertanian Pr. Dooley S, Curran HJ, Simmie JM. 2008. Autoignition measurements and a validated kinetic model for the biodiesel surrogate methyl butanoate. Renewable Energy Journal. 153: 2-32. Hendrik B, David. 2007. Water treatment unit process: Physical and chemical. Boca raton: CRC Pr. Huang C, Zong M, Wu H, Liu Q. 2009. Microbial oil production from rice straw hydrolysate by Trichosporon fermentans. Bioresource Technology. 100 : 4535–4538. Khot M, Kamat S, Zinjarde S, Pant A, Chocpade B, Ravikumar A. 2012. Single cell oil of oleaginous fungi from the tropical mangrove wetlands as a potential feedstock for biodiesel. Journal Microbial Cell Factories. 11: 71. Kuang C, Jason YW, Violi A. 2012. The role of the methyl ester moiety in biodiesel combustion: A kinetic modeling comparison of methyl butanoate and n-Butanoate. Energy Journal. 92: 16-26. Lisnawati. 2013. Optimasi produksi lipid menggunakan jamur Flavodon flavus pada limbah POME (Palm Oil Mill Effluent). [laporan praktik lapang]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
17 Ma AN. 2000. Environmental management for the oil palm industry. Palm Oil Dev. 30: 1-10. Ma AN, Toh TS, Chua NS. 2008. Improvement of lipid accumulation in an oleaginous yeast. Journal of Biotechnology. 136S: S402-S459. Meng X, Yang J, Xu X, Zheng C, Nie Q, Xian M. 2008. Biodiesel production from oleagineous microorganism. Reneawable Energy. 34 : 1-5. Mun WK, Rahman NA, Aziz S, Sabartnam V, Hasan MA. 2008. Enzimatic hydrolysis of palm oil mill effluent solid using mixed cellulases from locally isolated fungi. Research Journal of Microbiology. 3 (6): 474-481. Mushtaque et al. 2013. Mechanism of Persulfate Activation by Phenols. Environ Science Technology. 47: 5864-5871. Pan LX, Yang DF, Saho L, Li W, Cheng GG, Liang ZQ. 2009. The acid, tolerance and antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus. Journal Food Control. 20: 598-602. Potter, Wimsatt. 2003. Determination of total organic carbon and specific UV absorbance at 254 nm in source water and dringking water. National Exposure Research Laboratory Office of Research and Development. 451(3): 1-56. Prescott, Harley LM, Klein. 2002. Microbiology, 5th ed. New York: Mc-Graw Hill Companies. Rupani PF, Singh RP, Ibrahim MH. 2010. Review of current Palm Oil Mill Effluent (POME) treatment methods vermicomposting as a suistainable practice. World Applied Sciences Journal. 11 (1): 70-81. Sastrohamidjojo. 2005. Kimia Organik, Sterokimia, Lemak, dan Protein. Yogyakarta: Gadjah Mada University Pr. Setyawardhani DA, Distantina S, Utami MD, Dewi N. 2009. Hidrolisis multi stage dan acid pre-treatment untuk pembuatan biodiesel dari minyak biji karet. Simposium Nasional RAPI. 8: 38-43. Siwi. 2011. Karakterisasi dan identifikasi khamir anggota filum Ascomycota yang berpotensi sebagai oleaginous yeast. [skripsi]. Yogyakarta (ID): Universitas Gajah Mada. Suirta IW. 2009. Preparasi biodiesel dari minyak jelantah kelapa sawit. Jurnal Kimia. 3 (1): 1-6. Suligundi. 2013. Penurunan kadar COD (Chemical Oxygen Demand) pada limbah cair karet dengan menggunakan reaktor biosand filter yang dilanjutkan dengan reaktor activated carbon. Jurnal Teknil Sipil Untan. 13 (1): 29-44. Sohail M, Naseeb S, Sherwani. 2009. Distribution of hydrolytic enzymes among native fungi: Aspergillus the pre-dominant genus of hydrolase producer. Pakistan Journal Botani. 41 (5): 2567-2582. Thomson MJ, Gail S, Sarathy SM, Syed SA, Dagaut P. 2006. Sebuah studi luas kinetik pemodelan metil butanoat pembakaran. Prosiding Pembakaran Institute. 31: 305. Yusak. 2004. Pengaruh suhu dan pH buffer asetat terhadap hidrolisa CMC oleh enzim selulase dari ekstrak Aspergillus niger dalam media campuran onggok dan dedak. Jurnal Sains Kimia. 8 (2): 35-37. Zheng Y, Yu X, Dorgan KM, Cheng S. 2012. Oleaginous yeast Cryptococcus curvatus for biofuel production. Ammonia Effect Biomass and Bioenergy. 37: 114-121.
18
Zhiliang F, Lee R. 2006. Conversion of paper sludge to ethanol. Process Design and Economic Analysis. 30: 35-45.
LAMPIRAN
20
Lampiran 1 Alur Penelitian Preparasi sampel
Pengujian kualitatif medium CMC dan N-limited
Pengujian total lipid
Pengujian aktivitas
dan berat kering
hidrolisis
Pengukuran
Pengukuran
TOC
pH
Analisis komposisis lipid dengan GCMS
21 Lampiran 2 Parameter GC-MS yang digunakan Kondisi percobaan Suhu kolom oven Suhu injeksi oven Kolom Volum injeksi Volum mencuci Model injeksi Gas pembawa Arus mode kontrol Tekanan Jumlah arus Kolom baris Rasio split Suhu sumber ion Suhu sumber Waktu pemotongan
150oC 250oC 30 m x 0.25 mmID x 0.25 umdf 1.00 8µL Split Mati Tekanan 92.3 kPa 14 mL/min 1.00 mL/min 10 200oC 230oC 2 min
22
Lampiran 3 Hasil pengukuran standar glukosa, lipid, dan TOC Tabel 4 Absorbansi pengukuran glukosa standar pada berbagai konsentrasi Konsentrasi Glukosa (ppm)
Absorbansi (nm)
0
0.12
50
0.25
100
0.33
150
0.42
200
0.54
250
0.61
Gambar 13 Kurva standar gula reduksi Tabel 5 Absorbansi pengukuran lipid standar pada berbagai konsentrasi Konsentrasi PHB (ppm) 0 50 100 150 200 250 300
Gambar 14 Kurva standar lipid
Absorbansi (nm) 0.05 0.16 0.23 0.32 0.38 0.45 0.52
23 Tabel 6 Absorbansi pengukuran TOC standar pada berbagai konsentrasi Konsentrasi (ppm) 50 100 200 300 400 500
OD 580 nm 0.142 0.284 0.406 0.516 0.672 0.749
Gambar 15 Kurva standar TOC Tabel 7 Aktivitas hidrolisis hari ke-2 A 30oC (nm)
A 50 oC (nm)
Go
Gt
Go
Gt
Kontrol
0.15
0.19
0.33
Y34
0.38
0.30
ATH 2147 Y34+ATH 2147 S-30
0.29
S-50
Sampel
0.30
Total G.red 30 oC (nm) 0.23
Total G.red 50 oC (nm) 0.27
70.22
Aktv. enzim 30 oC (nm) 0.26
Aktv. enzim 50 oC (nm) 0.39
0.30
0.32
0.22
42.44
109.11
0.24
0.61
0.30
0.32
0.31
0.30
92.44
86.89
0.51
0.48
0.38
0.40
0.30
0.42
0.40
153.56
142.44
0.85
0.79
0.30
0.30
0.33
0.30
0.38
86.89
131.33
0.48
0.73
0.22
0.30
0.30
0.38
0.35
131.33
114.67
0.73
0.64
Total G.red 50 oC (nm) 0.18
[G.red] 30 oC (nm)
[G.red] 50 oC (nm)
15.22
20.22
Aktv. enzim 30 oC (nm) 0.08
Aktv. enzim 50 oC (nm) 0.11
[G.red] 30 oC (nm)
[G.red] 50 oC (nm)
46.33
0.34
0.31
0.35
0.28 0.25
Tabel 8 Aktivitas hidrolisis hari ke -4 A 30oC (nm)
A 50 oC (nm)
Go
Gt
Go
Gt
Kontrol
0.23
0.20
0.16
0.17
Total G.red 30 oC (nm) 0.17
Y34
0.23
0.21
0.29
0.32
0.19
0.35
25.78
114.67
0.14
0.64
ATH 2147 Y34+ATH 2147 S-30
0.28
0.28
0.27
0.42
0.28
0.57
75.78
236.89
0.42
1.32
0.33
0.33
0.20
0.65
0.33
1.10
103.56
531.33
0.58
2.95
0.32
0.30
0.28
0.24
0.28
0.20
75.78
31.33
0.42
0.17
S-50
0.22
0.24
0.39
0.34
0.26
0.29
64.67
81.33
0.36
0.45
Sampel
24
Tabel 9 Aktivitas hidrolisis hari ke-6 A 30oC (nm)
A 50 oC (nm)
Go
Gt
Go
Gt
Kontrol
0.27
0.21
0.26
Y34
0.27
0.21
ATH 2147 Y34+ATH 2147 S-30
0.24
S-50
Sampel
0.21
Total G.red 30 oC (nm) 0.16
Total G.red 50 oC (nm) 0.16
Aktv. enzim 30 oC (nm) 0.04
Aktv. enzim 50 oC (nm) 0.05
0.23
0.30
0.15
125.78
0.02
0.70
0.22
0.28
0.38
31.33
186.89
0.17
1.04
0.24
0.24
0.26
0.52
53.56
209.11
0.30
1.16
0.25
0.23
0.21
0.17
36.89
14.67
0.20
0.08
0.20
0.31
0.42
0.19
15.56
25.78
0.85
0.14
[G.red] 30 oC (nm)
[G.red] 50 oC (nm)
6.33
8.56
0.37
3.56
0.20
0.48
0.39
0.24
0.21
0.19
0.21
0.20
Contoh perhitungan: Sampel Y34 hari ke-2 suhu 30 oC Total Gula Reduksi = (2xGt)-Go = (2 x 0.30) – 0.38 = 0.22 nm Konsentrasi Gula reduksi Persamaan kurva standar gula reduksi y = 0.0018x + 0.1436 y = 0.0018x + 0.1436 0.22 = = 0.0018x + 0.1436 [Gula reduksi] = = 42.44 ppm Aktivitas enzim = [G.red]/180 = 0.24 unit
Tabel 10 Aktivitas lipogenesis hari ke-3 Sampel Y34 ATH 2147 Y34 + ATH 2147 S-30 S-50
A 30 oC (nm) A B 1.93 0.67
A 50 oC (nm) A B 2.30 0.99
[Lipid] 30 oC (ppm) 789.27
[Lipid] 50 oC (ppm) 829.93
2.35
1.49
2.01
1.34
523.27
2.21
1.47
2.13
1.28
1.57 1.50
0.58 0.74
1.52 1.62
1.05 0.89
Cawan kosong (g)
Cawan+isi (g)
Total lipid (%)
30 oC 28.07
50 oC 27.87
30 oC 28.11
50 oC 27.92
30 oC 58.18
50 oC 53.54
393.93
28.41
27.11
28.44
27.13
55.67
50.72
445.93
523.93
27.11
25.54
27.12
25.57
73.10
67.46
608.60 461.93
264.60 433.93
29.41 30.93
29.41 28.07
29.44 30.96
29.42 28.09
57.24 45.74
50.24 61.99
Tabel 11 Aktivitas lipogenesis hari ke-6 Sampel Y34 ATH 2147 Y34 + ATH 2147 S-30 S-50
A 30 oC (nm) A B 2.47 0.91
A 50 oC (nm) A B 2.13 0.58
[Lipid] 30 oC (ppm) 991.93
[Lipid] 50 oC (ppm) 987.27
2.52
1.39
2.36
1.51
701.27
2.67
1.40
2.53
1.29
1.89 2.23
0.91 1.38
1.84 1.92
1.18 0.76
Cawan kosong (g) o
o
Cawan+isi (g) o
Total lipid (%)
30 C 28.07
50 C 27.87
30 C 28.11
50 C 27.92
30 oC 73.12
50 oC 63.69
519.27
28.41
29.40
28.44
29.43
76.22
61.57
799.27
777.93
28.41
27.11
28.44
27.14
86.88
72.25
603.27 514.60
392.60 722.60
30.25 27.11
29.40 30.25
30.27 27.14
29.42 30.28
72.98 55.73
61.03 75.01
Contoh perhitungan: Y34 suhu 30oC hari ke-3 Lipid = Sebelum sentrifus – Setelah sentrifus = 1.93-0.67 = 1.26 nm
o
25 Konsentrasi lipid Persamaan kurva standar lipid y = = 0.0015x + 0.0721 y = 0.0015x + 0.0721 1.26 = 0.0015x + 0.0721 [lipid] = Berat kering =
= 789.27 ppm x 1000 = 13.33 ppm
Total lipid = Lipid/Berat kering = 789.27/13.33 = 58.18%
Tabel 12 Profil TOC awal selama kultivasi Sampel
TOC awal
[TOC]
Mean [TOC]
POME kons 2000
0.27
23.84
POME kons 3000 POME kons 4000
0.48 0.50
38.88 30.87
POME kons 5000
0.69
37.25
SD
32.71
0.01
Tabel 13 Profil TOC akhir selama kultivasi 30 oC Sampel Y34 kons 2000 Y34 kons 3000 Y34 kons 4000 Y34 kons 5000 ATH kons 2000 ATH kons 3000 ATH kons 4000 ATH kons 5000 Y34+ ATH kons 2000 Y34+ ATH kons 3000
50 oC
TOC 30oC
TOC 50 oC
[TOC]
0.23
0.19
17.47
11.09
0.28
0.23
17.09
11.75
Mean [TOC]
19.80
SD
0.04
% Penurunan TOC
[TOC]
39.48
0.39
0.28
21.56
12.74
0.48
0.41
23.07
19.01
0.22
0.21
16.32
14.53
0.25
0.23
13.82
11.75 16.50
0.04
49.57
0.32
0.31
15.84
15.11
0.43
0.32
19.99
12.74
0.13
0.18
1.45
9.62 7.41
0.18
0.21
5.98
0.05
77.33 9.14
% Penuruna n TOC
Mean [TOC]
SD
13.65
0.01
58.27
13.53
0.05
58.63
11.80
0.07
63.93
26
Y34+ ATH kons 4000 Y34+ ATH kons 5000 Jamur S-30 kons 2000 Jamur S-30 kons 3000 Jamur S-30 kons 4000 Jamur S-30 kons 5000 Jamur S-50 kons 2000 Jamur S-50 kons 3000 Jamur S-50 kons 4000 Jamur S-50 kons 5000
0.24
0.29
9.22
13.47
0.32
0.35
13.00
14.96
0.18
0.15
8.97
5.05
0.27
0.18
15.68
6.20 13.56
0.04
58.55
0.34
0.29
17.31
13.23
0.31
0.26
12.28
8.88
0.18
0.25
8.97
13.61
0.25
0.25
13.28
13.61 21.85
0.14
33.22
0.4
0.27
22.46
11.84
0.58
0.55
29.80
27.84
Contoh perhitungan: TOC Y34 konsentrasi 2000 [TOC] = x = 17.47 ppm SD = %Penurunan = (
=
= 0.04 )=
= 39.48%
8.34
0.06
74.51
17.76
0.14
45.70
RIWAYAT HIDUP Penulis yang lahir di Bogor tanggal 18 Februari 1993 adalah anak tunggal dari Bapak Achmad Kuryana (Alm) dan Ibu Kurniati. Penulis memulai pendidikan kegiatan belajar dari TK Darul Falah, lalu SDN Gunung Batu 01 Bogor, SMPN 4 Bogor, SMAN 5 Bogor, dan sekarang di Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor. Selama kuliah penulis pernah mengikuti unit kegiatan kampus, seperti PSM Agriaswara dan Koran Kampus. Penulis juga aktif mengikuti organisasi kemahasiswaan sebagai anggota divisi Internal BEM FMIPA 2011-2012, anggota divisi fundrising acara MPKMB 48 IPB, anggota divisi konsumsi acara Konser Metamorphosa PSM Agriaswara 2011, anggota divisi logstran acara Pesta Politik TPB IPB 2011, sekertaris divisi logstran KPR IPB 2011 dalam acara PEMIRA KM 2011, anggota divisi fundrising acara IDEA 2011, sekertaris divisi humas acaa SPIRIT 2011, ketua divisi humas acara Seminar Nasional Kesehatan 2011, anggota divisi LO acara Pesta Sains Nasional 2012, sekertaris divisi humas acara MPD 48, ketua divisi humas acara Seminar dan Kajian Ilmiah Kehalalan 2012, bendahara divisi PDD acara Pesta Sains Nasional 2013, sekertaris divisi Internal BEM FMIPA IPB 2012-2013, sekertaris umum acara Studi Banding BEM FMIPA 2013.
