Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
PEMAKAIAN ULANG FASA GERAK TETRASIKIAN DALAM ANALISIS ANTIBIOTIKA PADA ALAT KHROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI HENY YUSRINI Balai penelitian Veteriner, ARE Martadinata No: 30, Bogor 16114
RINGKASAN Tetrasiklin adalah salah satu jenis Antibiotika yang banyak digunakan dibidang petemakan untuk tujuan pengobatan dan pemacu pertumbuhan pada temak. Penggunaan yang tidak mematuhi aturan pakai dan pemotongan temak sebelum waktu hentinya tercapai akan mengakibatkan timbulnya residu pada produk petemakan . Untuk mengetahui kandungan residu Antibiotika dalam produk petemakan, maka perlu dilakukan analisa yang salah satunya dapat dilakukan secara fisika kimia dan dideteksi dengan alat KCKT. Dalam upaya penghematan bahan kimia yang digunakan dalam proses pendeteksian dengan alat KCKT, telah dilakukan suatu percobaan dengan pemakaian ulang fasa gerak Tetrasiklin. Hasil yang diperoleh bila dibDANingkan dengan cara konvensional tidak ditemukan adanya perbedaan dari hasil uji perolehan kembali dari contoh yang diperiksa .
PENDAHULUAN Antibiotika adalah suatu bahan yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme yang dapat menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroorganisme dalam konsentrasi yang sangat rendah . Antibiotika digunakan secara leas dalam bidang petemakan sebagai bahan untuk pengobatan maupun pemacu pertumbuhan. Salah satu Antibiotika yang paling banyak digunakan adalah Antibiotika Tetrasiklin HCL . Penggunaan dalam bidang petemakan biasanya langsung diberikan atau ditambahkan pada pakan (SIREGAR S .B, 1994). Penggunaan Antibiotika yang tidak sesuai dengan dosis (aturan pakai) dan pada waktu pemotongan hewan yang belum sampai pada waktu hentinya akan mengakibatkan terdeteksinya residu pada produk petemakan seperti daging, telur maupun susu (MURDIATI DAN BAHRI, 2000). Pada umumnya proses ekstraksi untuk menganalisa residu Antibiotika menggunakan bahan kimia organik maupun bahan kimia anorganik. Bahan kimia adalah salah satu komponen yang sangat penting pada suatu analisa suatu contoh baik berupa pakan, telur, susu, daging ataupun organ lainnya . Tanpa adanya bahan kimia suatu analisa tidak akan terlaksana akibat mahalnya harga bahan kimia tersebut dan penelitianpun tidak akan berjalan lancar .
219
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Salah satu bahan kimia penting yang digunakan sebagai fasa gerak untuk mendeteksi residu Tetrasiklin dengan menggunakan alat KCKT adalah asetonitril , dimana asetonitril yang diperlukan tersebut harus benar-benar murm dan harganya cukup mahal. Untuk menanggulangi masalah mahalnya bahan kimia, maka salah satu upaya pemecahannya adalah dengan penghematan pemakaian bahan kimia tersebut. Dengan pemakaian ulang fasa gerak dalam menganalisa residu antibiotika tetrasiklin, maka pemakaian bahan kimia relatif lebih sedikit namun analisa masih dapat terlaksan dengaan hasil yang masih akurat. Prinsip pemakaian ulang fasa gerak pada alat KCKT adalah dengan mensatu wadahkan fasa gerak yang digunakan untuk menganalisa dengan fasa gerak yang dibuang sebagai buangan.
BAHAN DAN CARA Bahan kimia : Asetonitril grade, Metanol grade, Asam oksalat, Bahan uji standaroksitetrasiklin, tetrasiklin dan klortetrasiklin . Alat : Satu unit alat KCKT merck Hitachi yang terdiri dari pompa L 7100 ; injektor; detektor UV L 400; interface D 700 ; seperangkat komputer sebagai alat perekam data dan printer HP deskjet 810 C sebagai pencetak data . Cara pembuatan larutan standar Pembuatan larutan baku standar a.
10 mgram standarar Oksitetrasiklin HC dimasukkan kedalam labu takar 10 ml dan dilarutkan dengan methanol pa sebagai standar OTC 1000 ppm. b. 10 mgram standar Tetrasiklin HCL dimasukkan kedalam labu takar 10 ml dan dilarutkan dengan methanol pa sebagai sebagai standar TC 1000 ppm. c. 20 mgram standar Chlortetrasiklin HCL dimasukkan kedalam labu takar 10 ml dan dilarutkan dengan methanol pa sebagai standar CTC 2000 ppm . Pembuatan larutan standar campuran
Pipet masing-masing 200 ul dari larutan standar baku a,b dan c dengan menggunakan mikropipet 0-200 ul. Masukkan kedalam labu takar 10 ml dan ditepatkan sampai standar batas dengan methanol pa, maka akan diperoleh larutan standar campuran dengan konsentrasi OTC 20 ppm, TC 20 ppm dan CTC 40 ppm. Larutan ini adalah sebagai larutan standar pembanding yang akan digunakan dalam menganalisis residu dalam contoh . Pembuatan fasa gerak Ditimbang 0,126 gram asam oksalat, dimasukkan kedalam gelas ukur 500 ml dan dilarutkan dengan aquadest 400 ml, kocok sampai larut; kemudian tambahkan 100 ml asetonitril HPLC grade dan kocok kembali sampai menyatu. Fasa gerak ini disaring dengan memakai vakum dan didegas.
220
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Cara kerja
Injek 20 ul larutan standarcampuran kedalam injektor. Larutan tersebut akan dipompakan kedalam kolom dan akan dideteksi dengan detektor dan data yang diperoleh akan direkam oleh komputer yang kemudian hasil/ data yang diperoleh akan dicetak . Kondisi KCKT yang digunakan adalah : fasa gerak 8 bagian asam oksalat 0,0025 M dengan 2 bagian asetonitril, dengan flow rate 1,5 ml/menit; panjang gelombang 356 nm. Dalam penggunaannya fasa gerak yang keluar (buangan) dari alat KCKT dikembalikan kedalam wadah yang sama dan digunakan kembali untuk mendeteksi contoh berikutnya .
HASIL DAN PEMBAHASAN Dari beberapa penginjekkan standar tetrasiklin yang dilakukan baik dengan fasa gerak mumi dan langsung dibuang maupun fasa gerak yang dipergunakan kembali temyata tidak ada bedanya dalam waktu tambat dan konsentrasi yang bisa terlihat pada tabel 3, gambar 2 karena konsentrasi standarcampuran tetrasiklin yang terkandung pada fasa gerak cukup kecil. Biasanya untuk satu kali penginjekkan baik standar maupun contoh diperlukan 30 ml fasa gerak dan untuk mengkondisikan kolom diperlukan fasa gerak sebanyak 100 ml. Jadi untuk menganalisa 50 contoh diperlukan fasa gerak sebanyak 50 x 30 ml = 1500 ml sedangkan bila memakai ulang fasa gerak , pemakaian larutan organik menjadi lebih hemat, hanya diperlukan 500 ml saja. Tentunya pada pemakaian fasa gerak ulang, akan mengandung tetrasiklin standar yang sudah diinjekkan, tetapi tidak akan terdeteksi oleh alat KCKT. Biasanya standaryang diinjekkan kedalam alat KCKT sebanyak 20 ul dari standarcampuran 20 ppm OTC, 20 ppm TC dan 40 ppm CTC , sehingga dalam 20 ul standarcampuran mengandung 0,4 ug OTC ; 0,4 ug TC ; 0,8 ug CTC . Pada 50 kali penginjekkan standartetrasiklin yang terkandung menjadi = 50 x 0,4 = 20 ug untuk OTC dan TC sedangkan untuk CTC = 50 x 0,8 = 40 ug. Jadi dalam 500 ml fasa gerak ulang akan terkandung sebanyak 20 ug/500 ml = 0,04 ppm untuk TC dan OTC sedangkan untuk CTC 40 ug/500 ml = 0,08 ppm . Tabel 1 .
Data hasil penggunaan fasa gerak yang langsung dibuang (A) Nama stndar Waktu retensi (menit) Peak area
OTC TC CTC
5,77 7,78 20,02
5,75 7,73 19,81
5,69 7,66 19,91
220660 25146 10546
20995 23827 10541
23099 26585 11907
22 1
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Karena limit deteksi alat KCKT untuk Antibiotika Tetra adalah 0,5 ppm maka penggunaan pelarut ( fasa gerak ulang ) untuk penginjekkan 50 kali dalam percobaan ini masih cukup baik karena kandungan OTC, TC clan CTC sebanyak konsentrasi tersebut diatas tidak akan terdeteksi oleh alat KCKT . Tabel 2 .
Data hasil penggunaan fasa gerak yang diulang (B)
Nama stndar
Waktu retensi ( menit )
OTC TC CTC Tabel 3 .
5,85 7,44 18,87
TC
CTC
5,49 7,34 18,88
25272 27184 11646
22899 25705 10530
23200 26604 10804
Data hasil perbandingan antara penggunaan fasa gerak yang langsung dibuang dengan yang dipakai kembali .
Nama standar OTC
5,53 7,34 18,73
Peak area
Waktu retensi (menit) A B 5,77 5,85 5,75 5,53 5,69 5,49 7,78 7,44 7,73 7,34 7,66 7,34 20,02 18,87 19 .81 18,73 19,91 18,88
Konsentrasi ( ppm ) A B 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 40 40 40 40 40 40
KESIMPULAN Dari data yang dihasilkan antara pemakaian ulang fasa gerak dengan fasa gerak yang langsung dibuang tidak ada bedanya dalam hal waktu tenggang clan konsentrasi standar yang diinjekkan, juga penghematan fasa gerak dapat dilaksanakan karena hanya dengan 500 ml atau sepertiganya fasa gerak yang dibutuhkan , percobaan masih dapat terlaksana dengan baik .
SARAN Pemakaian fasa gerak yang berulang akan mengotori kolom pada alat KCKT, maka pencucian kolom harus sangat diperhatikan . Biasanya kolom dicuci dengan pencucian bertingkat. Tahap pertama kolom harus dicuci dengan aquadest kurang lebih 500 ml, tahap kedua kolom harus dicuci dengan aquadest-methanol : 50-50 kemudian methanol 100% clan flow ratenyapun harus bertahap untuk mencegah tidak meratanya penyerapan pada kolom .
22 2
Temu Teknis Fungsional Non Peneliti 2001
Adapun semua fasa gerak atau larutan yang masuk kedalam kolom pada alat KCKT harus selalu telah disaring dan didegass.
UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis tidak lupa mengucapkan banyak terima kasih kepada Dr. Rapaella Widiastuti juga kepada Tim Makalah yang telah memberi bimbingan dan bantuan perbaikkan selama penulisan makalah ini sehingga dapat terselesaikan dengan baik.
DAFTAR BACAAN MURDIATI, T.B. DAN S. BAHRI. 1995. Residu dan Cemaran dalam Bahan Pangan Asal Hewan. Balai Penelitian Veteriner, Bogor. MURDIATI, T.B. 1997. Pemakaian Antibiotika dalam Usaha Petemakan. Majalah Semi Ilmiah Petemakan. Vol. 6, No . 1 . Pusat Penelitian dan Pengembangan Ternak. Departemen Pertanian . WOODBINE, M. 1977. Antibiotics DAN Antibiosis in Agriculture . Butter Worth . BRDANER, G.C . DAN D.M. PUGH . 1977. Veterinar y Applied Pharmacology DAN Therapeutics . Edition Third . Bailliere Tindall, London . GRITTER, R.J., JAMES M. BOBBITT, DAN ARTHUR E. SCHWARTING . 1991 . Pengantar Kromatografi . Edisi 2 . Penerbit ITB, Bandung . RAHAYU, SN. 2000. Analisis Residu Oksitetrasiklin, Tetrasiklin Klortetrasiklin dalam daging sapi secara KCKT. ISTN, Jakarta .
dan
SIREGAR, S.B. 1994. Residu obat hewan pada produk ternak upaya pengamanannya dalam Lokakarya Obat Hewan dan Munas III Asosiasi Obat Hewan Indonesia, Jakarta .
