Seminar Nasional : Reformasi Pertanian Terintegrasi Menuju Kedaulatan Pangan
PELARUTAN FOSFAT DARI TRIKALSIUM FOSFAT OLEH PSEUDOMONAD PENDARFLUOR ISOLAT PAMEKASAN PADA MEDIA NUTRIEN BROTH Gita Pawana Jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo Madura Korespondensi : Jl. Raya Telang Kamal-Bangkalan,
ABSTRAK Mikroba pelarut fosfat merupakan penentu dinamika ketersediaan fosfat bagi tanaman. Telah dilakukan isolasi dan uji pelarutan fosfat pada media Pikovskaya padat terhadap pseudomoad pendarfluor isolat Pamekasan. Pada isolat yang diuji, waktu generasi yang singkat tidak menentukan tingkat kelarutan fosfat yang tinggi. Pada kultur dengan tingkat pH 8, konsentrasi fosfat terlarut menurun seiring dengan berjalannya waktu, sedangkan pada pH 6 seiring dengan berjalannya waktu diperoleh akumukasi konsentrasi fosfat. Kata kunci: Pesudomonad pendarfluor; Pelarutan fosfat; Waktu generasi; Pola pelarutan PENDAHULUAN Latar Belakang Fosfor (P) merupakan unsur makro setelah setelah nitrogen yang keberadaannya sangat diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Cadangan P di dalam tanah dapat berupa fosfat anorganik yang berasal dari batuan fosfat, hasil pengendapan atau sedimentasi yang berasal dari tempat lain, juga hasil pengkelatan pupuk fosfat yang diaplikasikan secara teratur dalam aktifitas budidaya tanaman, atau fosfat organik yang berasal dari bahan organik ataupun penyusun struktur organisme. Mineral fosfat hasil pelapukan batuan fosfat dan hasil pengkelatan pupuk fosfat yang meliputi varisit [Al(OH)2H2PO4], strengit [Fe(OH)2H2PO4], flourapatit [Ca10PO4F2], hidroksiapatit [Ca3(PO4)3OH], trikalsium fosfat Ca3(PO4)2, dan fosfat-fosfat organik seperti inositol heksafosfat merupakan fosfat yang tidak larut dalam larutan tanah sehingga tidak dapat diserap atau tidak tersedia bagi tanaman. Sejumlah P yang diaplikasikan sebagai pupuk fosfat akan menjadi tidak tersedia bagi tanaman melalui reaksi pengkelatan oleh Al3+ dan Fe3+ pada tanah masam dan Ca2+ pada tanah basa dan normal (Gyaneshwar et al, 2002), sehingga efiseinsi dari keseluruhan pemupukan fosfat hanya sekitar 10-25% (Isherword, 1998), kondisi tersebut berdampak pada tingkat konsentrasi P yang tersedia bagi tanaman sangat rendah, 1 mg kg-1 tanah (Goldstein, 1994). Dinamika P tanah dikarakteristikkan oleh proses psikokimia (sorption-desorption) dan biologi (immobilisation-mineralization). Mikroorganisme tanah berperan sebagai kunci dalam dinamika P yang selanjutnya menyediakan fosfat bagi tanaman. Ada fakta yang kuat bahwa bakteri tanah mampu merubah fosfat tanah menjadi bentuk yang tersedia bagi tanaman melalui proses mineralisasi dan pelarutan fosfat anorganik (Hilda dan Fraga, 2000; Khiari dan Parent, 2005). Sebagian besar rhizobakteri dari genus Pseudomonas, Bacillus dan Rhizobium merupakan pelarut fosfat yang kuat (Rodriguez, H., R. Fraga. 1999). Aktifitas pelarutan fosfat dari fosfat anorganik ditentukan oleh produksi metabolit (asam organik) dan penurunan pH. Proton (H+) yang berasal dari asam organik akan mengikat anion fosfat, gugus hidroksil dan karboksilnya mengkelat (ikatan) kation fosfat (Bagyaraj et al., 2000; Khan et al., 2009), namun juga dinyatakan bahwa tingkat kelarutan fosfat tidak selalu proporsional terhadap penurunan pH artinya dengan pH akhir yang lebih rendah belum tentu diperoleh pelarutan fosfat yang lebih banyak. Di sisi lain Fankem et al., 2008, mengemukakan bahwa bakteri penghuni rhizosfir barangkali tidak dapat mengubah pH rhizosfir (terdapatnya kapasitas penyanggah tanah) maka anion dari asam karboksilat lebih berperanan dalam memobilisasi fosfat. Hal ini ditunjukkan bahwa anion karboksilat dapat mengganti kedudukan fosfat dari komplek jerapan dan mengkelat kation Fe dan Al. 1 Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo 20 Oktober 2011
Permasalahan dan tujuan Perbedaan jenis anion karboksilat sebagai wujud kompleksitasnya, menunjukkan perbedaan kemampuan untuk mengkelat kation Fe, Al dan Ca, yang paling kuat adalah anion sitrat yang diikuti oleh malat, tartat, laktat, glokonat, asetat dan format. Adapun wujud dari kompleksitas tersebut dikendalikan oleh genetic, fisiological, nutrisi dan kondisi pertumbuhan kulturnya (Reyes et al., 2007). Dikemukakan oleh Bagyaraj et al., (2000) bahwa analisis terhadap bakteri yang berbeda menunjukkan kelarutan fosfat yang bervariasi dari 4,36-59,4% dan diantara isolat terdapat keragaman yang sangat tinggi dalam kemampuan melarutkan fosfat. Berdasarkan kondisi ini dapat dikemukakan bahwa penting untuk melakukan analisis perilaku aktifitas pelarutan (trikalsium fosfat) oleh bakteri pelarut fosfat terkait dengan waktu generasi, dan kelarutan fosfat pada pH yang berbeda dalam periode waktu tertentu. METODE PENELITIAN. Bahan dan Alat: NaCl, media King’s B, media Pikovskaya, media NB (nutrien broth), NaOH, asam asetat, tricalsium fosfat, autoklaf, cawan petri, pH meter, mikro pipet, spektrofotometer. Isolasi isolat pseudomonad pendarfluor Sampel tanah diambil dari zona rhizosfir tembakau, pada lokasi-lokasi penghasil komodeti tersebut di Madura. Sampel tanah dimasukkan dalam kantong plastik yang diletakkan dalam kotak dingin untuk dibawa ke laboratorium. Selanjutnya sampel disimpan pada suhu 40C di dalam refrigerator sampai isolasi dilakukan (tdk lebih dari 72 jam). Isolasi dilakukan dengan mensuspensikan setiap 10 g sampel tanah dalam 90 mL larutan 0,85% NaCl steril. Suspensi yang terbentuk kemudian diencerkan dengan larutan NaCl steril berjenjang dari 10-8 sampai dengan 10-10. Masing-masing konsentrasi dikulturkan pada media King’s B, diinkubasikan pada suhu kamar selama 48-72 jam. Jika dijumpai koloni terpisah dengan menghasilkan pigmen kuning kehijauan merupakan indikasikan sebagai isolat pesudomonads pendarluor, koloni kuning kehujauan berpendar di bawah cahaya ultra violet (panjang gelombang 336 nm). Selanjutnya isolat disimpan pada agar nutrien miring. Uji pelarutan fosfat pada media pikovskaya padat Uji pelarutan fosfat bertujuan untuk menentukan isolat yang mempunyai kapasitas sebagai pelarut fosfat. Pengujian dengan menggunakan biakan bakteri yang telah berumur 24 jam. Satu ose isolat bakteri diinokulasikan pada medium Pikovskaya (lampiran 1) kemudian diinkubasikan dalam suhu kamar selama 5-7 hari. Isolat yang positif melarutkan fosfat ditentukan berdasarkan adanya pembentukan zona jernih disekeliling koloni sebagai indikasi terjadinya pelarutan atau pelepasan ortofosfat. Uji kapasitas pertumbuhan dan aktifitas pelarutan fosfat Metode pelaksanaan kapasitas pertumbuhan: Sebanyak 0,1 mL suspensi isolat pseudomonad pendarfluor yang telah berumur 24 jam dengan kepadatan populasi sel 106 cfu/mL dikulturkan dalam 10 mL media NB, selanjutnya diinkubasikan pada temperatur ruang dan dengan metode pencawanan diamati pertumbuhan populasinya setiap 2 jam sampai diperoleh kurva pertumbuhan. Bersamaan dengan itu dilakukan pengamatan OD (optic density). Selanjutnya ditentukan persamaan yang menyatakan hubungan antara populasi kepadatan sel tiap mL dengan OD (pada rentang fase log). OD ditentukan dengan persamaan: OD = - log % T = 2 - log T T: nilai transmisi yaitu panjang gelombang cayaha yang diteruskan. Kemudian dilakukan pengkulturan kembali, yaitu sebanyak 0,1 mL suspensi isolat pseudomonad pendarfluor yang telah berumur 24 jam dengan kepadatan populasi sel 106 cfu/mL dikulturkan dalam 10 mL media NB, selanjutnya diinkubasikan pada temperatur ruang. Kemudian berdasarkan kurva pertumbuhan yang diperoleh dilakukan pengukuran kepadatan populasi sel pada
Seminar Nasional : Reformasi Pertanian Terintegrasi Menuju Kedaulatan Pangan
selang waktu di titik waktu (a) dan titik waktu (b) di saat fase log. Pengukuran kepadatan populasi sel berdasarkan pada nilai OD. Waktu generasi (g) dihitung berdasarkan persamaan: t g = -------------------3,32 (log b – log a) g: waktu generasi sebagai waktu yang dibutuhkan oleh suatu populasi untuk bertambah secara teratur menjadi dua kali lipat t: selang waktu pengukuran jumLah sel dalam fase log antara titik waktu (a) dengan titik waktu tertentu (b) a: kepadatan populasi sel awal b: kepadatan populasi sel setelah t waktu Metode pelaksanaan aktifitas pelarutan fosfat Pengujian aktifitas pelarutan fosfat dilakukan dengan sebanyak 1 mL suspensi dari masingmasing isolat pseudomonad pendarfluor yang telah berumur 24 jam dengan kepadatan populasi sel 106 cfu/mL diinokulasikan pada 14 mL medium NB yang ditambahkan 5 g Ca3(PO4)2 dalam 1000 mL. Kemudian diinkubasikan dalam suhu kamar dan diamati fosfat terlarut yang terjadi setelah 24, 48 dan 72 jam dalam satuan ppm. Pengamatan pelarutan fosfat dilakukan dengan melakukan sentrifugasi terhadap medium pada 15000 rpm selama 30 menit. Kemudian pada supernatan yang diperoleh dilakukan penentuan fosfat terlarut menurut metode Olsen. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Berdasarkan hasil isolasi dengan metode pourplate, diperoleh diameter koloni yang tidak sama besar. Berdasarkan diameter koloni ini dipilih 20 isolat Pf
Koloni pseodomonad pendarfluor pada media King’s
Isolat pseudomonad pendarfluor pada agar miring King’s B
Kemudian berdasarkan hasil uji pelarutan fosfat, dengan menggunakan media Pikovskaya padat, dinyatakan bahwa semua isolat yang diperoleh mampu melarutkan fosfat (dari tricalsium fosfat)
3 Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo 20 Oktober 2011
Zona jernih menunjukkan adanya pelarutan fosfat pada media Pikovskaya Adapun hasil pengukuran waktu generasi yang diperoleh dapat di lihat pada tabel 1. Seperti telah disebutkan di atas waktu generasi adalah waktu yang diperlukan untuk melakukan 1 kali penggandaan dirinya. Pada tabel tersebut tampak ada 2 isolat yang mempunyai waktu generasi terpendek, namun dengan tingkat pH yang tidak sama ternyata diperoleh waktu generasi yang tidak sama. Tabel1: Waktu generasi pada pH yang berbeda pH Isolat Pf No.
8 Wg
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
6 Sd
Wg
Sd
1,76 5,54 0,32 3,75 5,83 1,12
0,1 0,62 0,06 2,4 0,89 0,1
0,84 7,8 0,54 2,11 3,35 0,75
0,14 0,9 0,14 0,17 0,1 0,12
0,8 0,46 2,23 4,32 1,74 2,7 3 0,93 6 1,2 0,59 0,74
0,1 0,02 0,06 1,7
0,5 0,96 4,77 5,06 0,7 2,4 8,4 0,74 4 1,74 0,3 0,67
0,07 0,08 0,66 1,66 0,07 0,25 0,87 0,5 0,36 1,57 0,06 0,09
0,9 1,19 0,26 0,7 0,47 0,19 0,1
Pada tabel tersebut tampak isolat Pf nomor 4 dan 19 mempunyai waktu generasi tersingkat dibandingkan dengan isolat lainnya. Namun pada isolat No. 4 waktu generasi terpendeknya berada pada pH 8 sedangkan pada isolat No. 19 terdapat pada pH6. Adapun hasil aktifitas pelarutan fosfat dari tricalsium fosfat pada media nutrien broth tampak pada tabel 2 dan 3. Pada tabel 2 tampak pada tingkat pH 8, semua isolat mampu melakukan pelarutan
Seminar Nasional : Reformasi Pertanian Terintegrasi Menuju Kedaulatan Pangan
fosfat, namun dengan berjalannya waktu ternyata jumlah fosfat terlarut tidak meningkat namun justeru semakin menurun. Adapun pada tingkat pH 6 (pada tabel 3) terjadi sebaliknya, yaitu umumnya dengan bertambahnya waktu semua isolat memberikan pelarutan fosfat yang meningkat, namun pada isolat No. 1, tampak dengan berjalannya waktu jumlah fosfat terlarut semakin menurun, pada isolat No.2 dan 6 tampak pada 24 jam kedua terjadi penurunan fosfat terlarut, namun pada 24 jan ke tiga terjadi kenaikan kembali. Adapun pada isolat No. 3, 9, 12 dan 14 justeru terjadi sebaliknya yaitu pada 24 jam ke 2 terjadi penurunan fosfat terlarut, namun pada pada 24 jam 3 terjadi peningkatan jumlah fosfat terlarut, dengan akumulasi yang lebih banyak dibandingkan pada saat 24 jam pertama. Tabel 2. Jumlah fosfat terlarut dari tricalsium fosfat (ppm) Isolat Pf No:
pH 8 24 jam
48 jam
72 jam
Rata-rata
1 2 3 4
25,05 24,2 21,5 20,71
23,24 22,24 14,75 14,02
16,9 16,9 9,8 11,93
21,74 21,19 15,34 15,55
5 6 7 8 9 10
29,5 24,7 24,8 22,1 27,32 26,8
25,01 20,92 23,24 15,22 24,11 17,03
19,33 13,46 10,78 11,52 18,9 10,23
24,61 19,69 19,62 16,28 23,44 18,03
11 12 13 14 15
24,9 21,45 25,42 21,74 19,5
18,67 21,04 23,16 16,67 18,57
17,13 16,27 16,88 16,19 7,35
20,22 19,59 21,82 18,2 15,14
16 17 18 19 20
22,9 23,5 27 20 22,2
16,19 18 22,37 15,02 24,81
16,86 9,87 20,96 9,01 11,29
18,62 17,14 23,44 14,68 19,43
Pembahasan Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat dikemukakan bahwa waktu generasi yang mencerminkan tingkat pertumbuhan yaitu semakin pendek waktu generasinya pertumbuhannya akan semakin cepat, yang berarti aktifitasnya juga semakin tinggi, sehingga semestinya metabolit (asam organik) yang dihasilkan juga akan semakin banyak, yang selanjutnya akan memberikan akumulai konsentrasi fosfat yang semakin banyak pula. Namun demikian ternyata fenomena yang ada tidak seperti yang diperkirakan. Kondisi ini bisa di lihat bahwa walaupun isolat No.4 dan 19 mempunyai waktu generasi yang singkat namun isolat tersebut tidak memberikan akumulasi konsentrasi fosfat yang terbanyak. Akumulasi konsentrasi fosfat tertinggi justeru terdapat pada isolat No. 5 baik pada pada pH 8 ataupun pH 6.
5 Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo 20 Oktober 2011
Tabel 3. Jumlah fosfat terlarut dari tricalsium fosfat (ppm) Isolat Pf No:
pH 6 48 jam 72 jam 18,5 16,17 16,7 15,5 12,84 19,01 15,75 17,67 20,38 21,3
1 2 3 4 5
24 jam 20,11 14,63 13,46 13,92 16,99
Rata-rata 18,26 15,6 15,1 15,78 19,56
6 7 8 9 10
15,44 17,31 18,33 15,81 15,67
18,13 19,93 20,08 13,12 17,73
17,22 21,07 20,84 18,39 20,74
16,9 19,44 19,75 15,77 18,05
11 12 13 14 15
11,85 17,67 16,22 16,22 11,56
17,93 14,27 18,65 15,4 13,18
20,56 19,8 20,76 20,3 14,74
18,09 15,31 19,03 17,31 13,16
16 14,12 16,5 18,65 16,43 17 12,35 15,81 19,38 15,84 18 14,78 19,23 22,74 18,92 19 13,76 14,22 20,63 16,2 20 15,48 20,56 21,48 19,18 Kondisi ini kemungkinan menunjukkan bahwa tingkat kelarutan fosfat tidak hanya ditentukan oleh jumlah atau konsentrasi asam organik yang dihasilkan, namun tingkat kelarutan fosfat lebih ditentukan oleh jenis asam organik yang dihasilkan, hal ini sesuai dengan yang dikemukakan oleh Fankem et al.,(2008) bahwa, anion dari asam karboksilat lebih berperanan dalam memobilisasi fosfat. Adapun Arcand dan Schneider, (2006) mengemukakan bahwa kemampuan asam organik untuk melarutkan batuan fosfat, dipengaruhi oleh struktur kimianya dan juga tipe dan posisi gugus fungsional ligan organik. Selanjutnya dikemukakan oleh Vyas dan Gulati, (2009) bahwa perbedaan strain pseudomonad pendarfluor akan memberikan perbedaan kualitas dan kuantitas asam organik yang dihasilkan, dan Reyes et al., (2007) mengemukakan bahwa kompleksitas molekul asam organik yang mencerminkan jenis asam organik ditentukan oleh sifat genetic, fisiological, nutrisi dan kondisi pertumbuhan kulturnya. Selanjutnya aktifitas pelarutan fosfat yang terjadi pada tingkat pH 8, tampak menurun seiring dengan berjalannya waktu. Hal ini kontradiksi atau berlawanan aktifitas pelarutan yang terjadi pada pH 6. Kondisi yang terjadi pada tingkat pH 8 dan pola turun naiknya pelarutan fosfat pada pH6, menunjukkan bahwa disamping melakukan aktifitas pelarutan isolat pseudomonad pendarfluor tersebut juga melakukan immobilisasi fosfat. Immobilisasi tersebut dapat terjadi karena aktifitas metabolit yang dihasilkan atau digunakannya fosfat tersebut untuk memproduksi biomassanya, hal ini seperti yang dikemukakan oleh Jurinak et al., (1986) bahwa mekanisme pelarutan fosfat tergantung pada produksi biomassa mikroba. Pola pelarutan fosfat ini sama dengan yang dikemukakan oleh Suliasih dan Rahmad (2006) dan Rashid et al., (2004), bahwa pelarutan fosfat oleh mikroba pelarut fosfat dapat turun naik secara periodik atau atau tidak secara periodik tergantung pada kondisi kulturnya. Dikemukakan oleh Illmer
Seminar Nasional : Reformasi Pertanian Terintegrasi Menuju Kedaulatan Pangan
dan Schinner (1995) bahwa, di dalam larutan kultur dapat terjadi pengendapan dan pelarutan kembali terhadap fosfat organik atau anorganik yang dihasilkan, hal ini menunjukkan sangat efektifnya sistem penyerapan P yang terjadi untuk mendukung bioaktifitasnya. Pernyataan selaras dengan pseudomonad pendarfluor isolat pamekasan yang diuji ini, hal ini dikarenakan isolat tersebut diisolasi lahan tembakau dengan tingkat pH 8, sehingga saat dikulturkan kembali pada pH 8 dapat efektif melakukan penyerapan fosfat. Dikemukakan oleh Khan dan Bhatnagar (1997) bahwa, perubahan konsentrasi fosfat pada kultur dipengaruhi oleh fosfat yang mengendap karena metabolit organik dan atau pembentukan senyawa fosfat organik dengan sekresi asam organik yang selanjutnya digunakan sebagai sumber energi atau nutrisi, dimana kondisi ini akan berulang beberapa waktu di dalam kultur (Illmer dan Schinner, 1992), sedangkan Rodriguez dan Fraga (1999) mengemukakan bahwa ketika terjadi laju penyerapan yang lebih tinggi dari pelarutan akan terjadi penurunan konsentrasi fosfat terlarut, selanjutnya ketika laju penyerapan turun konsentrasi fosfat akan meningkat kembali. Disamping itu juga dikemukakan bahwa banyak strain bakteri pelarut fosfat yang memberikan ketidak stabilan dalam pelarutan fosfat. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Waktu generasi yang singkat belum tentu dapat memberikan pelarutan fosfat yang tinggi, pseudomonad pendarfluor disamping dapat melarutkan fosfat juga dapat melakukan immobilisasi fosfat. Saran Perlu dilakukan kajian terhadap keberadaan senyawa fosfat organik pada kultur pelarutan fosfat terkait dengan tingkat immobilisasi. DAFTAR PUSTAKA Arcand, M.M., K. D. Schneider. 2006. Plant and microbial based mecanism to improve the agronomic effectiveness of phosphate rock: a review. An. Acad Bras Cienc. 78 (4):791-807 Bagyaraj. D. J, P. U. Krishnaraj, S. P. S. Khanuja. 2000. Mineral phosphate solubilization: Agronomic implications, mechanism and molekular genetics. Proc. Indian natn. Sci. Acad. (PINSA) B66 Nos 2&3. 69-82 Fankem, H., L. Ngo Nkot, A. Deubel, J. Quinn, W. Merbach, F. X. Etoa, D. Nwaga. 2008. Solubilization of inorganic phosphates and plant growth promotion by strains of Pseudomonas fluorescens isolated from acidic soil of Cameroon. Afric. J. Microbiol. Research 2: 171-178. Goldstein, A. H. 1994. Involvement of the quinoprotein glucose dehydrogenises in the solubilization of exogenous phosphates by gram negative bacteria. Di dalam A. T. Gorini, E. Yagil dan S. Silver (edt). Phosphate in Microorganisms: Celluler and Molecul Biology.s: Celluler and Molecul Biology.s: Celluler and Molecul Biology. ASM Press, Washington, D. C. 197-203. Gyaneshwar, P., G. N. Kumar, L. J. Parekh dan P. S. Poole. 2002. Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. Plant Soil 245:83-93. Hilda, R dan R. Fraga. 2000. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotech. Adv. 17: 319-359 Illmer. P., F. Schinner. 1992. Solubilization of inorganic phosphate by microorganisms isolated from forest soil. Soil Biol. Biochem. 24:389-395. Illmer. P., F. Schinner. 1995. Solubilization of inorganic calcium phosphate- Solubilization mechanisms. Soil Biol. and Biochem. 7: 257-263. Isherword, K. F. 1998. Fertilizer use and environtment. Di dalam N. Ahmed dan A. Hamid (edt). Proc. Symp. Plant Nutrion Management for Sustainable Agriculture Growth. NFDC, Islamabad. 5776. Jurinak, J.J., L. M. Dudley, M. F. Allen, W. G. Knight. 1986. The role of calcium oxalate in the availability of phosphorus in soil of semiarid region: A Thermodynamic study. Soil Sci. 142:255-261. 7 Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo 20 Oktober 2011
Khan, A. A., G. Jilani, M. S. Akhtar, S. M. S. Naqvi, M. Rasheed. 2009. Phosphorus solubilizing bacteria: Occurrance, mechanisms and their role in crop production. J. Agric. Biol. Sci. 1: 4858. Khan, J. A. , R. M. Bhatnagar. Studies on solubilization of insoluble phosphate rocks by Aspergillus niger and and penicillium sp. Fertil Technol. 14:329-333. Khiari, L dan L.E. Parent. 2005. Phosphorus transformation in acid ligh-textured soils treated with dry swine manure. Can. J. Soil. Sci. 85:75-87. Rashid, M., S. Khalil, N. Ayub, S. Alam, F. Latif. 2004. Organic acids production and phosphate solubilization by phosphate solubilizing microorganisms (PSM) under in vitro conditions. Pakistan Journal of Biol. Sci. 7:187-196. Reyes, I, A. Valery, Z. Valduz. 2007. Phosphate solubilizing microorganism isolate from rhizospheric and bulk soil of colonizer plants at an abandoned rock phosphate mine. Di dalam E. Velazquez dan C. Rodriguez-Barrueco (edt). First International Meeting on Microbial Phosphate Solubilization. 69-75. Rodriguez, H., R. Fraga. 1999. Phosphate Solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Research review paper. Biotechnology Advances 17 (1999): 319-339. Suliasih dan Rahmat. 2006. Aktifitas fosfatase dan pelarutan kalsium fosfat oleh beberapa bakteri pelarut fosfat. Biodiversitas 8:23-26. Vyas, P., A. Gulati. 2009. Organic acid production in vitro and plant growth promoting in maize under controlled environment by phosphate-solubilizing fluorescent Pseudomonad. BCM Microbiology 9: 174. http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1471-2180-9-174.pdf. Diakses pada tanggal 5 Juni 2010.
