PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM. Különböző neuroprotektív anyagok hatásainak vizsgálata retinadegenerációs modelleken patkányban

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola Összehasonlító Neurobiológia Program

Különböző neuroprotektív anyagok hatásainak vizsgálata retinadegenerációs modelleken patkányban

PhD értekezés tézisei

Atlasz Tamás

Témavezető: Dr. Gábriel Róbert egyetemi tanár Dr. Reglődi Dóra egyetemi docens

PÉCS, 2008.

PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com

BEvezetés A retina anatómiája A retina több rétegből álló, fényérzékelésre specializálódott szövet. Több millió sejtet tartalmaz, amelyek együttesen a fénysugarak felfogására és azok kémai energiává történő átalakítására képesek. Az emlős retina 10 rétegből épül fel, melyek kívülről befelé haladva a következők: 1.

Pigmenthám rétege (PE; az itt található sejtek, a retinális idegsejtek támasztására szolgálnak).

2.

Fotoreceptor sejtek rétege (PL; a fény- és színérzékeny sejtek: csapok és pálcikák).

3.

Külső határmembrán (OLM; a réteg a fotoreceptorok sejttesteit választja el a belső szegmenseiktől). A Müller-sejtek végtalpaiból álló nem folytonos réteg.

4.

Külső sejtes réteg (ONL; a csapok és pálcikák sejttesteit tartalmazza).

5.

Külső rostos réteg (OPL; az első réteg, ahol a fotoreceptorok, bipoláris sejtek, valamint horizontális sejtek nyúlványai szinaptizálnak).

6.

Belső sejtes réteg (INL; a horizontális-, a bipoláris-, az amakrin- valamint a Müller-sejtek sejttesteit tartalmazza).

7.

Belső rostos réteg (IPL; a bipoláris sejtek axonjai, az amakrin sejtek nyúlványai, illetve a dúcsejtek dendritjei itt kapcsolódnak).

8.

Ganglionsejtek rétege (GCL; a ganglionsejtek sejttestei és az ún. „displaced” amakrin sejtek alkotják).

9.

Optikus rostok rétege (NFL; a ganglionsejtek axonjaiból összeszedődő rostköteg, amely az ingerületet a felsőbb központok felé továbbítja).

10.

Belső határmembrán (ILM; a retinát az üvegtesttől a Müller-sejtek végtalpaiból létrejövő határhártya választja el).

A retina szerkezeti felépítése biztosítja a szemben a látás neuronális hátterét, első lépését képezve a szín, illetve a kontraszt érzet kialakulásának.

Retinadegenerációs modellek

A szakirodalomban számos retinadegenerációs modell található, amelyeket két nagy csoportra oszthatunk. Az egyik csoportba tartoznak a genetikai háttérrel rendelkezők, míg a


másikba a metabolikus, vagy traumatikus eseményeken alapulók. Az utóbbi csoportba sorolhatók többek között a glaukóma, az ischaemia okozta neuronális károsodások, a diabeteses retinopathia, az autoimmun betegségek, toxikus ágensek hatására kialakuló degenerációs jelenségek, valamint az erős fény okozta elváltozások. A glutamát

receptorok patológiás aktivációja kulcsszerepet

játszik számos

idegrendszeri degenerációban. Ide sorolhatóak a glutamát receptorok túlműködésén alapuló retinális eredetű elváltozások is. Az extracelluláris glutamát koncentráció megnövelésével jól modellezhetők különböző krónikus szembetegségek. Ilyen hatás érhető el többek között a Na(monosodium)-L-glutamát (MSG) szubkután (s.c.) injekció formájában történő adásával, mely meghatározott feltételek mellett alkalmazva az egész belső retina pusztulását okozza. A kétoldali arteria carotis communis (bilateral common carotid artery occlusion, BCCAO) permanens lekötése a véráramlás drasztikus csökkenésével biokémiai és viselkedésbeli változásokat indukál. Hisztológiai és immuncitokémiai vizsgálatokkal kimutatható, hogy a hosszú ideig fennálló BCCAO, a mielinhüvelyek szétesését, asztrogliózisos elfajulást és mikroglia aktivációt okoz. Ismert, hogy a BCCAO a retinában olyan karakterisztikus patológiás elváltozást indukál, amely megfelel a humán arteria carotis elzáródásával

kialakuló

retinopathiának.

Az

elektroretinográfiás

és

a

morfológiai

tanulmányok igazolják, hogy a BCCAO a retina sérüléséhez vezet. A sejtpusztuláshoz vezető retinális elváltozások rendkívül összetettek, ezért a patológiás folyamatok megállítására, ill. kivédésére számos farmakológiai vegyület áll rendelkezésünkre. Mindezek a patológiás folyamatok magukban foglalják a szabad gyökök számának

megnövekedését,

illetve

a

Ca2+-szint

csökkentését,

a

mitokondriumok

pusztulásának kivédését, az apoptotikus kaszkádfolyamatok beindulását, a gyulladáskeltő anyagok

mennyiségének csökkentését, valamint

az endogén protektív folyamatok

megjelenését.

A hipofízis adenilát cikláz-aktiváló polipeptid (PACAP)

A

hipofízis

adenilát

cikláz-aktiváló

polipeptidet

(PACAP)

először

birka

hipotalamuszban azonosították, később a központi idegrendszer egyéb területéről is sikerült kimutatni. Ismert, hogy a központi idegrendszerbe juttatott PACAP neurotrofikus és neuroprotektív hatást fejt ki. Kísérletes állatmodellekben in vivo PACAP beadás hatására csökken a globális- és fokális agyi ischaemia mértéke. A PACAP előfordulását leírták a perifériás idegrendszerben és az érzékszervekben, így a szemben is. A retinában PACAP-


immunpozitivitás a horizontális, és az amakrin sejtekre jellemző. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy in vitro körülmények között a PACAP a retinában védelmet nyújt a glutamát okozta toxicitás ellen.

Diazoxid (7-chloro-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine-1,1-dioxide; DIAZ)

A retinában bekövetkező sejthalál egyik fő oka a mitokondriumok funkciózavara. A 7chloro-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine-1,1-dioxide (diazoxid, DIAZ) egy mitoKATPcsatorna aktiváló vegyület, melynek szív- és agyi ischaemia elleni protektív hatását korábban már kimutatták. Az eddig megjelent közlemények ellenére azonban csak nagyon keveset tudunk a DIAZ lehetséges retinoprotektív szerepéről. Korábbi tanulmányok igazolták, hogy a DIAZ növeli a retinális ganglionsejtek túlélésének esélyét, in vitro körülmények között védelmet nyújt a retinális neuronoknak a glutamát indukálta mitokondriális depolarizáció ellen. Bizonyították, hogy a DIAZ in vitro képes blokkolni a hypoxia indukálta depolarizáció kialakulását horizontális sejtekben, továbbá, hogy a DIAZ előkezelés eredményesen alkalmazható ischaemia okozta neuronális károsodások esetén. A DIAZ közvetlenül a retinára kifejtett protektív hatásairól in vivo modellekben azonban ezidáig nem közöltek adatokat. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során célul tűztük ki: -

a különböző PACAP kezelések retinán kifejtett idegsejtvédő hatásának vizsgálatát MSG-indukálta excitotoxikus sérülésekkel szemben.

-

a PACAP neuroprotektív hatásának vizsgálatát BCCAO okozta retinális ischaemiás károsodás esetén.

-

MSG-okozta retinális degeneráció csökkentésének tanulmányozását intravitreális DIAZ injekció alkalmazásával.

-

a DIAZ kezelés protektív hatásának vizsgálatát mesterségesen létrehozott ischaemia okozta sejtpusztulás esetén.

Továbbá szerettük volna felmérni:


a PACAP/DIAZ kezelés specifikus hatását a pusztuló, illetve túlélő sejtek pontosabb azonosítása céljából 3x MSG-, illetve BCCAO-okozta retinális degeneráció esetén patkányban. Kísérleteinkhez a következő sejtspecifikus immuncitokémiai markereket alkalmaztuk: - vezikuláris glutamát transzporter-1 (VGLUT-1), - vezikuláris GABA transzporter (VGAT), - Ca2+-kötő fehérjék (calbindin, calretinin, parvalbumin), - protein-kináz Cα(PKCα), - gliális fibrilláris savas protein (GFAP). ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK MSG kezelés Kísérleteinkben újszülött patkányok (n=75) bőre alá inzulinos-fecskendő segítségével a születés utáni első (PD 1), ötödik (PD 5), illetve kilencedik (PD 9) napon szubkután (s.c.) 100 µl fiziológiás sóoldatban oldott 2 mg/testtömeg gramm MSG-t juttattunk. Kontroll kísérleteinknél (n=25) az állatok a fent említett térfogattal megegyező fiziológiás sóoldatot kaptak. Újszülött Wistar patkányok jobb szemébe az üvegtestbe injektálva az MSG kezelést követően 100 pmol egyszer (PD 1), kétszer (PD 1, 5) vagy (PD 1, 5, 9) háromszor alkalmazott, 5µl fiziológiás sóoldatban oldott PACAP-ot (n=30) vagy háromszor 2µl 0,01M NaOH-ban és 0,2M foszfát pufferes sóoldatban (PBS) oldott 0,172µg DIAZ-t (n=20) juttattunk. Az állatok bal szemébe azonos mennyiségben csak vivőanyagot (PBS) adagoltunk, így a bal szem a kezelt preparátum kontrolljaként szolgált. Három hét eltelte után, 21 napos korukban az állatokat túlaltattuk, retinájukat pedig szövettani vizsgálatok céljára eltávolítottuk.

BCCAO modell

A permanens BCCAO-t felnőtt, ivarérett 250 – 300g súlyú Wistar patkányokon végeztük (n=69). Az állatok mindkét oldali arteria carotis communisát isoflurannal való altatás közben, 3-0-ás sebészi fonal segítségével, középvonali bevágást követően, véglegesen lekötöttük. Kontrollként áloperált (sham) állatokat (n=16) használtunk, azaz ezeken az állatokon is végrehajtottuk az altatási és műtéti procedúrát, kivéve az érlekötési folyamatot.


Hamilton fecskendő segítségével intravitreálisan PACAP-ot (100pmol / 5µl fiziológiás sóoldat, n=29) vagy DIAZ-ot (0,43µg 0,01M NaOH és 0,2 M PBS elegyében oldva, n=24) juttattunk a kísérleti állatok jobb szemébe. Az állatok bal szeme vizsgálataink során kontrollként (sham) szolgált. Két hetes túlélési idő letelte után az állatokat túlaltattuk, retinájukat eltávolítottuk és morfológiai, illetve morfometriai analízisnek vetettük alá.

Hisztológiai vizsgálatok

A fent említett kezelések után az állatokat túlaltattuk, szemüket eltávolítottuk, majd 4%-os, 0,1 M PB-ben feloldott paraformaldehidben 24 órán keresztül fixáltuk. A kísérleti preparátumokat Durcupan ACM gyantába ágyaztuk, majd a kész szöveti blokkokból 2 µm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeket toluidinkék festékkel megfestettük. A különböző rétegek vastagságát a retina azonos régióiból készült metszeteken mértük. A mérések

legkevesebb

3

állat

egyenként

6

retina

blokkjából

készültek

(n =2-5 mérés/retinablokk). Azokat a metszeteket, ahol a GCL vastagsága egy sejtsornál nagyobbnak mutatkozott, a kiértékelésnél nem vettük figyelembe. A morfológiai és morfometriai analízishez a következő paramétereket vizsgáltuk: (i) a retina keresztmetszete a külső határmembrántól a belső határmembránig (OLM – ILM), (ii) az ONL, OPL, INL, IPL vastagsága és (iii) a 100 µm retinahosszra eső, GCL rétegben található sejtek száma. A statisztikai elemzéshez ANOVA tesztet használtunk, amit Tukey’B post hoc analízis követett.

Immuncitokémiai vizsgálatok

A szemserleg preparátumokat blokkokba ágyaztuk, majd azokból kriosztáttal 14-16 µm-es sorozatmetszeteket készítettünk, végül adhéziós anyaggal bevont tárgylemezre helyeztük. Kísérleteinkhez a következő mono-, illetve poliklonális antitesteket használtuk: VGLUT-1 (vezikuláris glutamát transzporter); VGAT (vezikuláris GABA transzporter); Ca2+kötő fehérjék: calretinin (CALR), calbindin (CALB), parvalbumin (PARV); protein-kináz Cα (PKCα); gliális fibrilláris savas protein (GFAP). Ezt követően 6x5 perces PBS-sel való mosás következett, majd a metszeteket a megfelelő koncentrációra hígított szekunder antitesttel (anti-rabbit Texas-red, IgG, anti-mouse FITC IgG) reagáltattuk.


EREDMÉNYEK MORFOLÓGIAI ÉS MORFOMETRIAI VIZSGÁLATOK

A PACAP hatása MSG- vagy BCCAO-indukálta retinadegenerációs modellekben

Az MSG kezelések látható, kísérletesen jól reprodukálható változásokat idéztek elő a retina morfológiájában. Kontroll állatokban a retina rétegei jól elkülönültek, a sejtek szabályos elrendezést mutattak. Az 1x MSG kezelés nem okozott látható mértékű változást fénymikroszkópos szinten, a rétegek vastagsága a kontroll retinának megfelelő volt. A metszetekből jól kitűnt, hogy a szövetben a degeneratív folyamatok már elindultak, ezt a megduzzadt sejtek és idegrendszeri elemek, szövethézagok, piknotikus sejtmagok jelenléte is igazolja. A sötét szögletes sejtmagjáról felismerhető Müller-féle gliasejteket a glutamátroncsolt retinában nehezen lehetett felismerni. A háromszori MSG kezelést követően a külső sejtes, illetve a külső rostos rétegben kifejezett elváltozást nem tapasztaltunk, de a belső sejtes réteg és a ganglionsejtek rétege fúzionált. A ganglionsejt rétegben a sejtek száma szignifikáns csökkenést mutatott. A fent említett 3x alkalmazott MSG-vel egyidőben egyszer (PD 1), kétszer (PD 1, 5), vagy háromszor (PD 1, 5, 9) 100 pmol intravitreálisan adott PACAP-pal kezeltük az állatok jobb szemét. Egyszeri PACAP kezelés hatására nem tapasztaltunk számottevő változásokat a 3xMSG-vel kezelt retinához képest. A rétegek vastagsága nem változott, a fúzió okozta torzulás a retina belső rétegeiben nagyrészt megmaradt. Kétszeresen, vagy háromszorosan alkalmazott PACAP adagolás szignifikánsan csökkentette az MSG kezelés indukálta retinális károsodást. A retina mindhárom belső rétege jól elkülönült, az IPL észrevehető maradt, az INL megtartotta 2-4 sejtsorát. A GCL-ben található sejtek száma a kontroll retinához viszonyítva változatlan maradt. Két hét posztoperatív idő elteltével a BCCAO-n átesett állatok retinájának rétegvastagságai az áloperált állatokéval összehasonlítva jelentős változást mutattak. A kezelt állatok ideghártyájának minden rétegében nyilvánvaló degenerációs elváltozások voltak láthatók. A legfeltűnőbb redukció a plexiform rétegekben történt, aminek következtében az OLM-ILM határmembrán távolsága a kontrollhoz képest jelentősen lecsökkent. A fotoreceptorok rétegének vastagsága szintén csökkent. A csapok és pálcikák külső szegmensei kisebbek lettek, valamint szabályos geometriai elhelyezkedésük rendezetlenné vált. A fotoreceptorok sejttestei között számos sejthézag jelent meg. Ennek következtében az ONL rétegvastagsága jelentősen, ám nem szignifikánsan csökkent a kontroll, áloperált állatok


retinájához képest. Hasonló szövetközti hézagokat, valamint degenerálódott képleteket figyelhettünk meg az INL-ben is. A belső sejtes réteg vastagsága szignifikánsan kisebb volt a kontroll mintához képest. Az IPL-ben számos, körülbelül 1µm átmérőjű denz foltot láthattunk, melyek fénymikroszkópos képen is jól detektálhatóak. A denz foltok egyenletes eloszlása a bipoláris sejtterminálisok degenerálódására utalt. A retina külső rétegeiben is jól kvantifikálható sejtkárosodások történtek. Az OPL vastagsága jelentősen redukálódott, mely néhány helyen az ONL és az INL teljes fúziójához vezetett. A GCL-ben jelentős mértékű sejtdegenerációt tapasztaltunk. A BCCAO-t követő, intraokulárisan alkalmazott PACAP kezelés hatására a retinális rétegek fénymikroszkópos anatómiája a kontrollhoz képest alig változott, és ezt a morfometriai analízis is alátámasztotta. A retina rétegeinek vastagsága majdnem megegyezett az áloperált állatokéval, és szignifikánsan nagyobbnak bizonyult a carotis műtéten átesett mintákban mérhető értékekhez viszonyítva. Ez különösen az OPL-ben volt szembetűnő, ami PACAP-kezelt állatokban jól látható volt, míg BCCAO-n átesett állatok retinájában az ONL és INL fúziójának következtében szinte teljesen eltűnt. PACAP kezelés hatására csak a GCL-ben található sejtek száma mutatkozott változatlanul alacsonyabbnak az áloperált állatokhoz képest.

A DIAZ hatása MSG- vagy BCCAO-indukálta retinadegenerációs modellekben

A háromszori MSG kezelésen átesett állatok retináján számos neurodegenerációs jegyeket mutató struktúra volt látható, ahogy azt már korábban leírtuk. Az IPL teljesen eltűnt, az INL és a GCL pedig fúzionált. A morfometriai vizsgálatok adatai alapján a retina teljes vastagsága szignifikánsan csökkent, csak a fotoreceptorok rétege tűnt változatlannak. A lokálisan alkalmazott DIAZ kezelés hatására a retina struktúrája a kontrollban látott normál állapothoz hasonlónak bizonyult. A GCL-ben a sejtek számának szignifikáns csökkenése elmaradt. A kezelés hatására az IPL láthatóvá vált, az INL és a GCL elkülönült. Permanens BCCAO-t követően a retina struktúrája jelentős mértékben degenerálódott. Morfológiai és morfometriai vizsgálatainkból kiderült, hogy a sham-operált retinához képest a retina rétegeinek vastagsága jelentősen redukálódik. Intravitreálisan adott DIAZ ebben a modellben is retinoprotektívnek bizonyult: a szövettani analízis azt mutatta, hogy az ONL-t kivéve a retina valamennyi rétegében szignifikáns változások történtek. Kvantitatív vizsgálataink azt mutatták, hogy DIAZ kezelés hatására a ganglionsejtes rétegben a sejtek száma közelít a normál értékhez.


IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK

A patkány kontroll retinában erőteljes VGLUT-1 jelölést találunk az OPL-ben és az IPL-ben egyaránt. Az OPL-ben elsősorban a fotoreceptor sejtek, míg az IPL-ben a bipoláris sejtek terminálisai jelölődtek. A retina rétegei összehasonlítva a kontroll, vagy sham-operált állatok retinájával mind az MSG, mind a BCCAO kezelés hatására erőteljes degenerációt mutattak. BCCAO kezelésen átesett állatok retinájában az OPL rétegben lokalizálható fotoreceptor terminálisok redukálódtak. Excitotoxikus, vagy ischaemiás károsodást követően, a vitreumba alkalmazott PACAP beadás hatására a VGLUT-1 immunreaktivitás a kontrollnak megfelelőnek bizonyult. A protektív hatást bizonyítja az IPL-ben található bipoláris sejtterminálisok, valamint az OPL-ben előforduló fotoreceptor terminálisok megtartása. A DIAZ kezelés következtében a kontroll/sham állapottal szinte teljesen megegyező VGLUT-1 immunreaktivitást tapasztaltunk mind az OPL, mind az IPL területén. Kontroll/sham állatok retinájában VGAT-ot expresszáló retinális képletek főként az OPL-ben és az IPL-ben azonosíthatóak. AZ IPL-ben erősebb, míg az OPL-ben gyengébb VGAT immunexpresszivitás tapasztalható. Glutamát-okozta excitotoxikus állapotban a VGAT immunreaktivitás jelentősen redukálódott. PACAP vagy DIAZ kezelés hatására az említett rétegekben továbbra is jelentős VGAT immunreaktivitás volt látható. BCCAO okozta ischaemiás állapotban a retina sejtjeinek VGAT immunexpresszivitása az áloperált retinához képest csökkent, és ez PACAP/DIAZ kezeléssel jelentősen növelhető volt. A Ca2+-kötő fehérjék kontroll/sham retinában a következő sejtspecifikus jelölődést mutatták: az AII amakrin sejtek parvalbumin, a horizontális sejtek calbindin, míg a ganglionsejtek és néhány amakrin sejt calretinin immunopozitív. MSG kezelés hatására a következő változások voltak megfigyelhetőek: PARV esetén a jelölt sejtek száma csökkent; CALB esetén az immunreaktivitás intenzitásában kismértékű változást tapasztaltunk; CALR esetében az immunreaktivitás erőssége, valamint a jelölt sejtek száma egyaránt csökkent. Intravitreálisan alkalmazott PACAP/DIAZ hatására a Ca2+-kötő fehérjéket tartalmazó sejtek túlélési aránya jelentős mértékben megnőtt. A másik kísérleti modellünkben (BCCAO) CALB-immunpozitivitás nem volt látható. A PARV- és CALR-immunexpresszivitás az MSG kezelésen átesett retinával megegyezőnek bizonyult. PACAP/DIAZ adagolás következtében a Ca2+-kötő fehérjét tartalmazó sejtek immunpozitivitása az áloperált állatok retinájához hasonlónak mutatkozott. Kontroll/sham retinában PKCα aktivitást lehet megfigyelni mind a pálcika bipolárisok sejttesteiben,

mind

nyúlványrendszereikben

egyaránt.


A

fent

említett

sejtek

dendritrendszereinek OPL területén való elhelyezkedése az, sejttesteik axonjainak vertikális lefutása, illetve a sejtek terminálisainak IPL-ben való jelenléte alapján jellemezhetőek. Toxikus károsodások esetén a PKCα−immunreaktivitás csökkent, a pálcika bipolárisok nyúlványai valószínűleg megrövidültek, de PKC-expressziójuk megmaradt. PACAP vagy DIAZ kezelt állatokon a szövetroncsolódás progressziójának lassulását, illetve a degeneráció mértékének jelentős csökkenését tapasztaltuk. Az INL a kontroll/sham retinához hasonlónak bizonyult, a retina belső rétegeinek vastagsága az eredeti retinához képest alig változott. A retinában normál körülmények között végtalpaik kivételével a Müller-féle gliasejtekben

gyenge

GFAP-specifikus

immunpozitivitás

tapasztalható.

Különböző

traumatikus események (MSG, BCCAO) után a GFAP szintjének masszív emelkedése figyelhető meg, melynek következményeként a Müller-sejtek erős immunpozitivitást mutattak a retina teljes területén. Háromszoros PACAP injekció hatására a retina rétegei elkülönültek, ellentétben a GFAP jelerősséggel, ami nem csökkent. Ezzel ellentétben, ha DIAZ kezeléssel ellensúlyoztuk a toxikációs hatásokat, akkor a gliasejtek GFAP szintje jelentősen csökkenthető volt.

EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE

A vizuális információ feldolgozásának vertikális útvonalát kialakító retinális sejtekben a gerinces állatok egyik legfontosabb ingerületátvivő anyaga a glutaminsav. A belső retina sejtjei az ON bipoláris sejtek kivételével mind rendelkeznek ionotróp glutamát receptorokkal, így valamennyi ilyen receptorral rendelkező sejt célpontja lehet az MSG-okozta toxicitásnak. Ismeretes, hogy ugyanezen sejtcsoportok PACAP receptorokat is expresszálnak. Ez a tény és a sejtekben magas koncentrációban előforduló PACAP magyarázatul szolgál arra, hogy ezeken a sejteken az excitotoxikus behatással szemben jelentős védő hatás érvényesül. Eredményeink azt mutatták, hogy MSG és PACAP kombinált adását követően az IPL vastagsága kevésbé csökkent. Továbbá azt tapasztaltuk, hogy kétszeresen alkalmazott PACAP intravitreális adása elegendő dózist jelent a neuroprotekció kialakulásához. Mindezek alapján lehetséges, hogy az ismételt PACAP beadások hosszan tartó neuroprotekciós hatással bírnak a patkány retinában. Munkánk során kimutattuk, hogy a PACAP kezelés hatásosan csökkenti a BCCAOindukálta retinadegeneráció mértékét felnőtt patkányokban. A morfológiai eredmények összefüggnek a korábban leírtakkal, miszerint a PACAP receptorok jelenléte szerepet játszik a PACAP protektív hatásában, valamennyi belső retinális rétegben. Az irodalomból számos


antiapoptotikus ágens (pl.: kaszpáz-gátlók) ismeretes. Előzetes eredmények a PACAP nagyfokú antiapoptotikus hatásáról számolnak be, mind sejtkultúrákban in vitro, mind az agyszövetben in vivo, cerebrális ischaemia után. Kutatócsoportunk vizsgálatai rávilágítottak arra, hogy a PACAP gátolja a proapoptotikus jelátviteli útvonalat, valamint antiapoptotikus szignálmolekulákat stimulál glutamát-indukálta retinális sérülésekben, in vivo körülmények között. Az oxidatív stressz szintén kitüntetett szerepet játszik ischaemia indukálta retinadegenerációban. A PACAP képes az oxidatív stressz indukálta apoptotikus folyamatok lassítására idegi, valamint nem idegi eredetű sejtekben egyaránt. Ismeretes, hogy a retinában a mitokondriumok kulcsfontosságú szerepet játszanak a neuronális sejthalálban. Előzetes eredményeink szerint, az intravitreálisan alkalmazott PACAP képes gátolni a citokróm-c és az apoptózist indukáló faktor (AIF) mitokondriumból való ürülését, valamint megszüntetni a glutamát-okozta

excitáció

miatt

bekövetkező

phospho-bad

csökkenést.

Mindezek

egybevágnak azokkal a megfigyelésekkel, miszerint a PACAP védelmet jelent a mitokondriumból felszabaduló apoptotikus vegyületek káros hatásával szemben. A mitokondriális jelátviteli út változtatásának másik módja, ha módosítjuk a mitokondriális membrán ionpermeabilitását. ATP-függő K+-csatornák a sejtek különböző részein lokalizálhatók, beleértve a mitokondrium belső membránrendszerét. A mitokondriális K+-függő ATP–csatornák (mitoKATP-csatorna) alaposan tanulmányozott struktúrák a szívben és az agyszövetben, mivel ezeknek a csatornáknak farmakológiai vagy fizikai stimulusokkal való szelektív aktivációja ischaemiával vagy kémiai stresszel szemben protektív hatású. A neuroprotekció ezen típusa egy olyan új mechanizmust reprezentál, mely nem függ össze a glutamát receptorok blokkolásával. A DIAZ egy mitoKATP–csatorna aktiváló hatású farmakon, amelyet, mint antihipertenzív és antihipoglikémiás drogot, széles körben alkalmaznak

neuroprotekció

céljából

a

humán

terápiában,

valamint

alkalmazott

neuroprotektív ágnes különböző állatkísérletekben. Előzetesen igazolták, hogy ha az inzultus előtt alkalmazunk DIAZ-ot in vitro, akkor képes megvédeni a sejteket az oxidatív stressz, vagy a glutamát-okozta toxicitástól. Korábbi tanulmányok a DIAZ in vivo neuroprotektív hatásairól is beszámoltak cerebrális ischaemiás állatmodellekben. Tanulmányok igazolták a DIAZ protektív hatását - preischaemiás és posztischaemiás kezeléssel – a korábban említett hipoperfúziós modellekben. A szakirodalomban jelentős ellentmondást találunk a DIAZ lehetséges neuroprotektív hatásának magyarázatára. Az eddig megjelent számos közlemény ellenére a DIAZ retinára kifejtett neuroprotektív és neurotrofikus hatásáról csak nagyon kevés ismeret áll rendelkezésünkre. MitoKATP–csatornákat találunk számos helyen a retina területén. Ezen csatornák nyitása különböző ágensek segítségével, beleértve a DIAZ-ot is, növeli a


retinális ganglionsejtek túlélésének esélyét glutamát indukálta sejthalállal szemben in vitro. Kimutatták továbbá, hogy a DIAZ képes ellensúlyozni a glutamát indukálta mitokondriális depolarizációt. Eredményeink azt mutatták, hogy a DIAZ képes csökkenteni a glutamát, valamint a BCCAO indukálta neuronális sejtpusztulás mértékét. DIAZ alkalmazásával ischaemia/hypoxia, illetve egyéb depolarizációt kiváltó folyamatokban a neuronális protekció a mitokondriális Ca2+-szintet csökkentő mechanizmusokon keresztül valósul meg. Eredményeinkből jól látható, hogy az általunk használt két neurodegenerációs modell eltérő patológiai elváltozásokat okoz a retinában, ennek ellenére a DIAZ mind a két modellben (MSG, BCCAO) jelentős neuroprotektív hatással bír. Morfológiai, morfometriai és immuncitokémiai analízissel megállapítottuk, hogy a mesterségesen indukált retinadegeneráció mellett intravitreálisan alkalmazott PACAP és DIAZ jelentős védőhatással bír az általunk használt különböző retinadegenerációs modellekben. Mindezen kutatások alapján a PACAP és a DIAZ hosszú távon hozzájárulhat a különböző retinális elváltozásokkal járó kórképek hatékonyabb kezeléséhez.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek Dr. Gábriel Róbert professzornak és Dr. Reglődi Dóra egyetemi docensnek, hogy mindenre kiterjedő önzetlen segítségükkel támogatták tudományos tevékenységemet. Dr. Csoknya Mária professzorasszonynak, az oktatásban nyújtott segítő útmutatásaiért, áldozatkészségéért, aki fáradságot nem kímélve lektorálta dolgozataimat. Ezúton szeretném megköszönni Dr. Hernádi Istvánnak az elektrofiziológiai kísérletekben nyújtott segítséget. Továbbá külön köszönöm kutatócsoportunk tagjainak Dr. Babai Norbert, Szabadfi Krisztina, Dr. Kiss Péter, Dr. Rácz Boglárka, Dr. Tamás Andrea és Kőszegi Zsombor szakmai segítőkészségét, kedvességét, támogatását. Köszönöm Jacsó Ildikó és Molnár Dóra asszisztensek technikai segítségét. Végül, de nem utolsó sorban ezúton mondok köszönetet családom minden tagjának, akik szeretete, segítése, támogatása és megértése nélkül ez a munka nem születhetett volna meg.


PUBLIKÁCIÓK

Disszertáció alapjául szolgáló tudományos közlemények

1. Atlasz, T., Szabadfi, K., Kiss, P., Babai, N., Kőszegi, Zs., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2008) PACAP-mediated neuroprotection of neurochemically identified cell types in MSG-induced retinal degeneration. J. Mol. Neurosci., közlésre elfogadva (2007. IF: 1.735) 2. Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Bari, F., Domoki, F., Gábriel, R. (2007) Diazoxide is protective in the rat retina against ischemic injury induced by bilateral carotid occlusion and glutamate-induced degeneration. Neurotox. Res., 12:105-111. (2007. IF: 5.234) 3. Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Szabadfi, K., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2007) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is protective in bilateral carotid occlusion-induced retinal lesion in rats. Gen. Comp. Endocrin., 153:108-114. (2007. IF: 2.562) 4. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2006) Search for the optimal monosodium glutamate treatment schedule to study the neuroprotective effects of PACAP in the retina. Ann. NY. Acad. Sci., 1070:149155. (2006. IF: 1.93) 5. Rácz, B., Reglődi, D., Kiss, P., Babai, N., Atlasz, T., Gábriel, R., Lubics, A., Gallyas, F.Jr., Gasz, B., Tóth, G., Hegyi, O., Tamás, A. (2006) In vivo neuroprotection by PACAP in excitotoxic retinal injury: review of effects on retinal morphology and apoptotic signal transduction. Int. J. Neuroprot. Neurodeg., 2:80-85. 6. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2005) Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. Neurotox. Res., 8:227-233. (2005. IF: 1.664) Disszertáció alapjául szolgáló konferencia előadások és poszterek

1. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Molnár, A., Gábriel, R. (2008) A PACAP és a DIAZOXID neuroprotektív hatása különböző mesterségesen indukált retinadegenerációs modelleken patkányban. 14. Magyar Látás Szimpózium, Pécs, Hungary, előadás 2. Atlasz, T., Szabadfi, K., Kiss, P., Reglődi, D., Gaál, V., Tamás, A., Molnár, A., Lubics, A., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of PACAP in several models of neurodegeneration in the rat retina. 4th Pannonian symposium (CNS injury), Pécs, Hungary, poszter absztrakt


3. Atlasz, T., Babai, N., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Reglődi, D., Gábriel R. (2007) The neuroprotective effects of PACAP in glutamate-induced retinal degeneration: immunocytochemical investigations. 8th Symposium on VIP, PACAP, and Related Peptides, Manchester and Burlington, Vermont, USA, poszter absztrakt 4. Gaál, V., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R., Koppán, M., Reglődi, D. (2007) Morphology of the retina in toxic and hypoxic/ischemic retinal degeneration and possible protection by the neuropeptide PACAP in the neonatal rat. Joint Congress of SOE/AAO, Vienna, Austria, poszter absztrakt 5. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Reglődi, D. (2007) Comparison of diazoxide and PACAP as neuroprotective compounds on different retina degneration models: histological and immuncytochemical investigations III. Neurotoxicity Society Meeting, Pucon, Chile, poszter absztrakt 6. Reglődi, D., Kiss, P., Farkas, J., Szalai, M., Lubics, A., Tamás, A., Lengvári, I., Szőgyi, D., Atlasz, T., Babai, N., Gábriel, R., Koppán, M. (2007) Effects of hypoxic injuries on neurobehavioral development in newborn rats. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, oral presentation 7. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Fekete, É., Zorilla, E.P., Reglődi, D. (2007) Különböző neuroprotektív anyagok hatásai retina degenerációs modellekben. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, poszter absztrakt 8. Kiss, P., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Schäffer, D., Lubics, A., Reglődi, D., Tóth, G., Hegyi,O., Gábriel, R. (2006) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects rat retina against hypoxic/ischemic injury. 23rd Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Manchester, UK, poszter absztrakt 9. Atlasz, T., Babai, N., Kiss, P., Tamás, A., Reglődi, D., Domoki, F., Bari, F., Gábriel, R. (2006) The neuroprotective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and diazoxide on the retina: histological investigations. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.2, poszter absztrakt 10. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006) Evaluation of different neurodegeneration models in the rodent retina. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.3, poszter absztrakt 11. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Kovács, P., Tamás, A., Reglődi, D. (2006) The effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on the glutamatergic system: electrophysiological and histological investigations. Int. Brain Res. Org. (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poszter absztrakt 12. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006) Comparison of three different neurodegeneration models in the rat retina: monosodium-glutamate (MSG), hypoxic insult combined with unilateral carotis occlusion and bilateral carotis occlusion. Int. Brain Res. Org. (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poszter absztrakt


13. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2005) Degree of damage compensation by various PACAP treatment regimes in monosodium glutamateinduced retinal degeneration. VIIth International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Rouen, France, poszter absztrakt 14. Kőszegi, Zs., Kovács, P., Atlasz, T., Reglődi, D., Tamás, A., Tóth, G., Hernádi, I., Gábriel, R. (2005) In vivo iontophoretically applied PACAP blocks the excitatory effects of kainic acid. VIIth International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides , Rouen, France, poszter absztrakt Egyéb tudományos közlemények

1. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Molnár, A., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP1-38) and its fragments on retinal degeneration induced by neonatal MSG treatment. Ann. NY. Acad. Sci., közlésre elfogadva (2007. IF: 1.731) 2. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Tamás, A., Reglődi, D., Kovács, P., Hernádi, I., Gábriel, R. (2006) Microiontophoretically applied PACAP blocks excitatory effects of kainic acid in vivo. Ann. NY. Acad. Sci., 1070:143-148. (2006. IF: 1.93) 3. Atlasz, T., Kellényi, L., Kovács, P., Babai, N., Thuróczy, G., Hejjel, L., Hernádi, I. (2006) The application of surface plethysmography for heart rate variability analysis after GSM radiofrequency explosure. J. Biochem. Biophys. Methods, 69:233-236. (2006. IF: 1.403) 4. Kőszegi, Zs., Kovács, P., Wilhelm, M., Atlasz, T., Babai, N., Kállai, V., Hernádi, I. (2006) Microiontophoretic investigation of the effects of mast cells on neurons in the rat brain in vivo. J. Biochem. Biophys. Methods, 69:227-231 (2006. IF: 1.403) Egyéb konferencia előadások és poszterek

1. Szabadfi, K., Atlasz, T., Reglődi, D., Kiss, P., Dányádi, B., Szabó, K., Molnár, A., Tamás, A., Fekete, É., Zorrilla, EP., Gábriel, R. The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration. 24th Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Genova, Italy, P86, poszter absztrakt 2. Gaál, V., Atlasz, T., Reglődi, D., Szabadfi, K., Hamza, L., Ságvári, O., Kiss, P., Márton, Zs.,Tamás, A., Lubics, A., Gábriel, R. A hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) protektív hatása UV-besugárzás indukálta retinális degenerációban. A Magyar Szemorvostársaság 2008. évi Kongresszusa, Pécs, Hungary, poszter absztrakt


3. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Molnár, A., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of PACAP-fragments in MSG-induced neurodegeneration in rat retina. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P8, poszter absztrakt 4. Szabadfi, K., Atlasz, T., Reglődi, D., Kiss P., Tamás, A., Dányádi, B., Fekete, É.M., Zorrilla, E. P., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration: histological and immuncytochemical preparations. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P16, poszter absztrakt 5. Kiss, P., Horváth, G., Farkas, J., Szőgyi, D., Szabadfi, K., Atlasz, T., Tamás, A., Falko, F., Németh, J., Lubics, A., Gábriel, R., Reglődi, D. (2008) Ingergazdag környezet hatása az újszülött patkányok idegrendszeri fejlődésére. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P68, poszter absztrakt 6. Farkas, J., Kiss, P., Horváth, G., Szőgyi, D., Falko, F., Németh, J., Gaszner, B., Szabadfi, K., Atlasz, T., Tamás, A., Gábriel, R., Reglődi, D. (2008) Maternális depriváció hatása az újszülött patkányok idegrendszeri fejlődésére. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P37, poszter absztrakt 7. Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Babai, N., Hamza, L., Gábriel, R., Fekete, É.M., Zorrilla, E.P., Atlasz, T. (2008) The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration. IBRO International Workshop, Debrecen, Hungary, P138, poszter absztrakt 8. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Hohmann, J., Hernádi, I.: Az Aconitum alkaloid szongorin GABA-A receptoron kifejtett hatása. A MGYT Gyógynövény Szakosztályának rendezvénye, Szeged, Hungary, előadás 9. Szabadfi, K., Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Csupor, D., Kovács, P., Hohmann, J., Hernádi, I. (2007) Fiziológiai hatású Aconitum-alkaloidok in vivo vizsgálata patkány központi idegrendszerében. A MGYT Gyógynövény Szakosztályának rendezvénye, Szeged, Hungary, poszter absztrakt 10. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Hohmann, J., Hernádi I. (2007) Aconitum alkaloid songorine acts as a potent gabaa receptor agonist in the rat brain in vivo. Polish Neuroscience Society 8th International Congress, Krakow, Poland, P9.05, poszter absztrakt 11. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Szabadfi, K., Hohmann, J., Hernádi I. (2007) Akonitum alkaloid songorine GABAA receptorokon kifejtett hatása patkányban, in vivo. MÉT LXXI. Vándorgyűlése, Pécs, Hungary, P68, poszter absztrakt 12. Németh, Á., Ajtay, Z., Atlasz, T., Hejjel, L., Hernádi, I., Thuróczy, Gy., Kellényi, L. (2007) Szívfrekvencia-variabilitás (HRV) elemzése GSM mobiltelefon rádiófrekvenciás (RF) sugárzásának hatására fiatal felnőttekben és idősebb szívműtötteknél. MÉT LXXI. Vándorgyűlése, Pécs, Hungary, P70, poszter absztrakt


13. Kőszegi, Zs., Kállai, V., Atlasz, T., Babai, N., Kovács, P., Vecsei, Zs., Wilhelm, M., Hernádi I. (2007) The effects of mast cell degranulation on neuronal activity in the thalamus of normal and ovariectomized rats. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, P2, poszter absztrakt 14. Szabadfi, K., Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Kovács, P., Hohmann, J., Hernádi, I. (2007) Fiziológiailag aktív aconitum-alkaloidok neuronális hatásának in vivo vizsgálata patkány központi idegrendszerében. Hung. Neurosci. Assoc.Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, P7, poszter absztrakt 15. Gomes, J.R., Melo, CV., Atlasz, T., Reglődi D., Gábriel, R., Duarte, CB. (2006) Calpain cleaves the vesicular GABA transporter (VGAT) into a new stable form, under excitotoxic conditions and in vivo ischaemia. XVth National Congress of Biochemistry, Aveiro, Portugal, poszter absztrakt 16. Szabadfi, K., Atlasz, T., Csupor, D., Kőszegi, Zs., Kovács, P., Babai, N., Hohmann, J., Hernádi, I. (2006) In vivo electrophysiological effects of aconitum alcaloids in the mammalian brain. MÉT LXX. Vándorgyűlése, Szeged, Hungary, P15, poszter absztrakt 17. Uzsoki, B., Tóth, M., Vas, G., Kovács, L., Atlasz, T., Hernádi, I. (2006) Novelty-response of rats determines the behavioural effects of the alpha-2A agonist guanfacine. MÉT LXX. Vándorgyűlése, Szeged, Hungary, P78, poszter absztrakt 18. Uzsoki, B., Tóth, M., Kovács, L., Vass, G., Atlasz, T., Hernádi, I. (2006) Reverse effects of the alpha-2A adrenoceptor anagonist guanfacine on the anxiety of different novelty-responder rats. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A161.24, poszter absztrakt 19. Atlasz, T., Kovács P., Uzsoki B., Babai N., Hernádi, I. (2006) A yohimbin specifikus alfa 2-A/D noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. A Magyar Tudomány Ünnepe, Természettudományi PhD kiállítás, Pécs, Hungary, poszter absztrakt 20. Atlasz, T., Kovács, P., Kellényi, L., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Babai, N., Hernádi I. (2005) The effects of GSM mobile phones on heart rate and heart rate variability in young adults. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Graz, Austria, poszter absztrakt 21. Kovács, P., Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Hernádi, I., Wilhelm, M. (2005) Mast cells modulate neuronal activity in the thalamus of the rat. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Graz, Austria, poszter absztrakt 22. Kovács, P., Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Kállai, V., Molnár, D., Hernádi, I., Wilhelm, M. (2005) Changing estrogen level modifies mast cell-neuron interactions in the rat thalamus. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) X., Pécs, Hungary, Clin.Neurosci./Ideggy. Szle., Vol 58, suppl 1, p1-112, poszter absztrakt


23. Kellényi, L., Kovács, P., Atlasz, T., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Hernádi, I. (2005) The effects of GSM mobile phones on the autonomic regulation of the heart in young adults. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) X., Pécs, Hungary, Clin.Neurosci./Ideggy. Szle., Vol 58, suppl 1, p1-112, poszter absztrakt 24. Kovács, P., Atlasz, T., Hernádi, I. (2004) The action of alpha-2 adrenergic agents on the firing properties of prefrontal cortical neurons in the rat in vivo: a combined electrochemical and electrophysiological study. 4th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Lisbon, Portugal, Abstr., Vol 2, A011.1, poszter absztrakt 25. Uzsoki, B., Kovács, P., Atlasz, T., Hernádi, I. (2003) Does yohimbine act as a subtype specific presynaptixc alpha-2A(D) adrenoceptor antagonist? In vivo electrophysiological and behavioural studies in rats. Europ. Behav. Pharmacol Soc. (EBPS) X. meeting, Antwerp, Belgium, Vol 14, suppl 1, p33, poszter absztrakt 26. Atlasz, T., Babai, N., Uzsoki, B, Kovács, P., Hernádi, I. (2003) A yohimbin specifikus preszinaptikus alfa-2A/D noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. MITT IX., Balatonfüred, Hungary, Clin. Neurosci./Ideggy. Szle., Vol 56, suppl 2, poszter absztrakt

Összes publikáció kumulatív impakt faktora: 34.386 Összes publikációk impakt faktora: 19.592 Témához kapcsolódó publikációk impakt faktora: 13.125 Összes idézettség: 23 Összes idegen idézettség: 7


UNIVERSITY OF PÉCS Biological Doctoral School Comparative Neurobiology Program

Analysis of the effects of different neuroprotective compounds in retinal degeneration models in rats

PhD thesis

Tamás Atlasz

Thesis supervisors: Róbert Gábriel DSc Dóra Reglődi MD, PhD

PÉCS, 2008.


Introduction Anatomy of the retina

The retina is a multi-layered sensory tissue that lines the back of the eye. It contains millions of specific retinal cells that capture photons rays and translate light signals into electrical potential changes. The vertebrate retina has ten distinct layers. From outermost to innermost, they include: 1.

Retinal pigment epithelium (PE; supporting cells for the neural portion of the retina).

2.

Photoreceptor layer (PL; composed of light and colour sensitive cells called rods and cones).

3.

Outer limiting membrane (OLM; a layer which imperfectly separates the inner segment portions of the photoreceptors from their cell bodies). This layer is built up from adherens junctions between Müller cells and photoreceptor cell inner segments.

4.

Outer nuclear layer (ONL; contains cell bodies of rods and cones).

5.

Outer plexiform layer (OPL; the first layer, where connections between photoreceptors, and vertically running bipolar cells and horizontally oriented horizontal cells occur).

6.

Inner nuclear layer (INL; somata of horizontal, bipolar and amacrine cells, main distribution of Müller cells).

7.

Inner plexiform layer (IPL; in this layer bipolar cells synaps with different varieties of functionally specialized amacrine cells and dendrites of the various ganglion cells).

8.

Ganglion cell layer (GCL; the layer of the retina containing primarily the cell bodies of ganglion cells, giving rise to optic nerve fibers, and some displaced amacrine cells).

9.

Nerve fiber layer (NFL; fibers from ganglion cells traversing the retina to leave the eyeball at the optic disk).

10.

Inner limiting membrane (ILM; inner surface of the retina bordering the vitreous body and thereby forming a barrier between neural retina and vitreous humor).


This structure provides the neuronal background of the first steps in processing contrast, colour and motion.

Retina degeneration models

There are many types of retina degeneration models described in the literature. They can be grouped into two main categories, (i) with a known genetic background or (ii) induced by metabolic or traumatic events. These induced retinal degenerations, among others, may be caused by aging, glaucoma, ischemic damage, autoimmune processes, diabetes, toxic agents and exposure to extremely strong light. Over-activation of glutamate receptors is a central contributor to neuronal cell death in the brain and in the retina in numerous pathological conditions. Experimental elevation of glutamate concentrations can model several ophthalmic diseases. Direct increase of glutamate concentration can be reached by monosodium L-glutamate (MSG) administration, which finally leads to the destruction of the entire inner retina. In the same way, bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) leads to moderate reduction in the cerebral blood flow in rats leading to subtle changes in biochemical and behavioral measures. It has been shown that BCCAO causes long-lasting white matter lesion, neuronal degeneration, microglial activation, astrocytosis, behavioral deficits and changes in several biochemical parameters. In the retina, it produces a characteristic pathologic appearance, paralleling the retinopathy of carotid artery occlusive disease in humans. Electroretinographical and morphological studies also show that BCCAO leads to ischemic damage of the retina. The events finally leading to retinal cell death are very complex, providing an opportunity for a variety of protective pharmacological approaches. These involve reducing the detrimental effects of free radicals and increased Ca2+ levels, counteracting mitochondrial failure, prevention of apoptotic cascades, anti-inflammatory strategies and potentiating endogenous protective mechanisms.

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP)

Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) is a neuropeptide first isolated from the hypothalamus, and later demonstrated in other areas of the central nervous system. PACAP exerts neurotrophic and neuroprotective effects in vitro and in animal models


in vivo, adding PACAP to the growing family of trophic factors in the nervous system. PACAP has been shown to reduce the damaged brain area in global and focal ischemia. The distribution of PACAP has also been described in various peripheral and sensory organs, including the eye. In the retina, PACAP immunoreactivity is present in the amacrine and horizontal cells, in the IPL, in the GCL and in the NFL. Recent studies have shown that PACAP attenuates glutamate toxicity in the retina in vitro.

Diazoxide (7-chloro-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine-1,1-dioxide; DIAZ)

Mitochondrial dysfunction is involved in many key events of neuronal cell death in the retina. 7-chloro-3-methyl-4H-1,2,4-benzothiadiazine-1,1-dioxide (Diazoxide, DIAZ) is a mitochondrial ATP-sensitive K+-channel-opener that has been implicated in cytoprotection in cardiac and cerebral ischemia, but relatively little is known about its putative protective effects in the retina. It has been shown that DIAZ enhances survival of retinal ganglionic cells, protects retinal neurons against excitotoxicity and inhibits the glutamate-induced mitochondrial depolarization in vitro. DIAZ has also been reported to block the hypoxiainduced horizontal cell depolarization and the reduction of the light-evoked hyperpolarization in vitro. In vivo, ischemic preconditioning can effectively be mimicked by DIAZ. However, the direct protective effect of DIAZ in different in vivo models of retinal degeneration has not yet been shown. AIMs OF THE STUDY The main goals of this study were to investigate: -

the optimal model for examining the neuroprotective effects of PACAP in MSGinduced retinal degeneration.

-

whether PACAP could be effective in retinal ischemia induced by BCCAO.

-

the effects of local administration of DIAZ in retinal degeneration induced by neonatal MSG treatment.

-

the putative effects of DIAZ in BCCAO-induced ischemic damage of the retina.


We would also like to determine the effects of PACAP/ DIAZ treatments in some welldefined cell types after three times of MSG- or BCCAO-induced retinal degeneration in rats. Therefore, the expression of: -

vesicular glutamate transporter-1 (VGLUT-1),

-

vesicular GABA transporter (VGAT),

-

Ca2+-binding proteins (calbindin, calretinin, parvalbumin),

-

protein-kinase Cα (PKCα),

-

glial fibrillary acidic protein (GFAP) was determined by immunhistochemistry.

These markers are found in neurochemically and morphologically identified retinal cell populations.

MATERIALS AND METHODS MSG treatment schedule

Newborn rats (n=75) were injected subcutaneously (s.c.) with 2 mg/g body weight MSG dissolved in 100 µl physiological saline on postnatal days 1, 5 and 9 according to previous descriptions. Normal control animals (n=25) were given the same volume of physiological saline solution. Treatments were given immediately following each MSG injection on days 1, 5 and 9. PACAP (100 pmol in 5µl saline, n=30) or DIAZ (0.172 µg dissolved in 2 µl 0.01 M NaOH and phosphate buffered saline, PBS, n=20) was injected with a Hamilton syringe into the right vitreous body of animals. The left eyes received the same volumes of vehicle treatment (saline or PBS) and served as control MSG-treated eyes. Animals were sacrificed under anesthesia at the age of 21 days. The eyes were processed for histological observations as described below.

BCCAO operation

Adult male Wistar rats weighing 250-300 g were subjected to permanent BCCAO (n=69) under isoflurane anesthesia. The carotid region was exposed through a midline cervical incision. The common carotid arteries were ligated with a 3-0 mm suture. Sham/operated animals (n=16) underwent the same procedure except for ligation of the carotid arteries. PACAP (100 pmol in 5µl saline, n=29) or DIAZ (0.172 µg dissolved in 2 µl 0.01 M NaOH and phosphate buffered saline, PBS, n=24) was injected with a Hamilton


syringe into the right vitreous body of animals. The left eyes received the same volumes of vehicle treatment (saline or PBS) and served as control ischemic eyes. After two weeks of survival the animals were sacrificed under anesthesia and the eyes were processed as described below.

Histology

The eyes were immediately dissected in ice-cold phosphate buffered saline and fixed in 4% paraformaldehyde dissolved in 0.1 M phosphate buffer. Tissues were embedded in Durcupan ACM resin, cut at 2 μm and stained with toluidine blue. Six tissue blocks from at least three animals were prepared and central retinal areas within 1 and 2 mm from the optic nerve were used for measurements (n=2-5 measurements from one tissue block). Sections where the GCL appeared thicker than a single cell row, were excluded from evaluation. The following parameters were measured: (i) cross-section of the retina from the outer limiting membrane to the inner limiting membrane; (ii) the width of the outer and inner nuclear and plexiform layers (ONL, OPL, INL, IPL), respectively; (iii) the number of cells/100 µm section length in the ganglion cell layer (GCL). Results are presented as mean ± S.E.M. Statistical comparisons were made using the ANOVA test followed by Tukey-B`s post hoc analysis.

Immunocytochemical investigations

The eye-cup preparations, made from animal’s eyes were cut in a cryostat and the slices were put on a gelatin-coated microscopic slide. We used the following primary monoclonal or polyclonal antibodies: anti-VGLUT-1 (vesicular glutamate transporter-1); VGAT (vesicular GABA transporter); Ca2+-binding proteins: calretinin (CALR), calbindin (CALB), and parvalbumin (PARV); PKCα (protein-kinase Cα); GFAP (glial fibrillary acidic protein). After several washes in PBS, sections were incubated with the corresponding secondary antibodies (anti-rabbit Texas Red IgG, anti-mouse FITC IgG). For control experiments, primary antisera were omitted, and after protocol, specific cellular staining was not found.


RESULTS MORPHOLOGY AND MORPHOMETRIC ANALYSIS

Effects of PACAP in MSG or BCCAO-induced retinal degeneration models

Repeated application of MSG causes severe alteration in retinal morphology. In control preparations all the layers characteristic for the mammalian retina are well visible. Under the pigment epithelium, several rows of photoreceptors are present, followed by the thin outer synaptic layer. The INL usually consists of 4-5 rows of cells, followed by a thick inner synaptic layer. Finally, cells in the GCL layer are frequent but not side by side. One time MSG treatment at postnatal day 1 does not cause a marked damage to the retina. The layers are similar in size to those of the control, although signs of degenerative processes, such as swollen cells and nervous profiles, small holes in the tissue, some pyknotic cell nuclei could be seen. The otherwise characteristic Müller glial cells identified on the basis of their dark rectangular nuclei are difficult to find in these preparations. When 3x MSG was applied the inner retinal layers were fused, and the number of cells in the GCL was significantly reduced. In the next series of experiments we used 3x MSG application with varying PACAP treatments. If only one time PACAP treatment was made at the first MSG application, it did not change the degenerative capacity of MSG. The retinal layers remain fused, although in some preparations more than two cell layers could be discerned in the inner retina. However, if animals received PACAP into the vitreous of the eye at the first 2 or all 3 times during MSG application, a substantial protective effect could be observed. The IPL remained well discernible, the INL was prominently present and retained 2-4 cell rows. The number of cells in the GCL was not significantly less than that of the control retina. BCCAO resulted in severely reduced thickness of retinal layers as observed two weeks after ligation. All retinal layers bore the signs of degeneration with individual variations. The most marked reduction in thickness was found in the plexiform layers, and as a consequence, the distance between OLM-ILM was significantly less than in control preparations. The PL was also reduced. The outer segments were shorter than usual, their geometric arrangement was disturbed. Several empty cell body-shaped spaces were seen in the layer of photoreceptor cell nuclei. As a result of this anatomical situation the thickness of the ONL was markedly, though not significantly, less than in sham-operated animals. Similar empty spaces were also seen in the INL. This layer was significantly thinner than that of the control specimens. In the


IPL of several, but not all ischemic animals, dense dots of about 1 µm in diameter were seen, assumed to be degenerating bipolar cell terminals. Parallel with this process, OPL was narrower, leading to the fusion of the ONL and INL in several cases. Many cells in the GCL also suffered degeneration, shown by holes and necrotic cells in this layer. This fact is well reflected in the reduced number of cells in the GCL. Intraocular PACAP treatment following BCCAO led to a nearly intact appearance of the retinal layers. This is well reflected in the morphometric measurements. The thickness of the major retinal layers was almost identical with that of the sham-operated animals and was significantly larger than that of the carotid occluded retinas. This was especially conspicuous in the OPL, which disappeared in several ischemic animals and was preserved in all PACAP-treated animals. This resulted in the clear separation of the nuclear layers in contrast to the bilateral carotid occluded rats, where the ONL and INL fused in most animals. Only the number of cells in the GCL seemed to be lower than in the sham-operated animals.

Effects of DIAZ in MSG- or BCCAO-induced retinal degeneration models

Retinal tissue from animals treated with MSG showed severe degeneration compared to control retinas, as described above. Much of the IPL disappeared and the INL and GCL were intermingled. As a consequence, the total thickness of the retina was significantly reduced, only the photoreceptor layer seemed unchanged. Local DIAZ treatment resulted in a retained retinal structure that was similar to that of the normal control retina. The number of cells in the GCL was not significantly less than in the untreated retina. The IPL remained visible, the INL and GCL were clearly separated at all places. Carotid occlusion led to a severe reduction in thickness of retinal layers compared to sham-operated control rats, as described above, with all retinal layers displaying marks of serious degeneration. DIAZ proved to be retinoprotective also in this model: differences between sham-operated and DIAZ-treated retinas were statistically significant in almost all retinal layers, except for the ONL. Quantitative analysis demonstrated that DIAZ administration protected the cells in the GCL.

IMMUNOHISTOCHEMISTRY

In our normal control preparations, VGLUT-1 immunopositive structures were also present in the OPL and IPL. VGLUT-1 staining in the OPL and IPL of the rat retina shows the


terminals of photoreceptors and bipolar cells, respectively. Retinal tissue from animals treated with MSG or BCCAO showed severe degeneration compared to control or sham-operated retinas. Much of the IPL disappeared and the inner nuclear layer (INL) and ganglion cell layer (GCL) were intermingled. In BCCAO-treated retinas substantial reduction was found in the size of the terminals of photoreceptor cells in the OPL. Intraocular PACAP treatment following MSG application or ischemic injury led to a nearly intact appearance of VGLUT-1 immunoreactivity in retinal structures if animals received PACAP into the vitreous of the right eye. In this case, a substantial protective effect could be observed: the bipolar cell terminals in the IPL remained well discernible and the OPL was nearly intact. In the case of DIAZ treatment, the control/sham-operated retina preparation displayed VGLUT-1 immunopositive structures in the OPL and IPL. DIAZ also proved to be retinoprotective in these models. We were able to verify the cellular localization of the VGAT in the OPL and IPL in control/sham retinas. Strong VGAT immunoreactivity could be detected in the IPL and weaker immunopositive structures were present in the OPL. After 3x MSG application, the strength of positive VGAT-immunoreactive structures was reduced. The entire inner retina, especially the IPL, was only faintly labeled. PACAP or DIAZ treatment significantly ameliorated the toxic effects of MSG. Under ischemic conditions, the strength of immunoreactivity was reduced, while PACAP or DIAZ diminished these harmful effects of ischemia. In control/sham conditions the calcium binding proteins labeled as follows. In the case of PARV: AII amacrine cells; CALB: horizontal cells, CALR: ganglion and some amacrine cells. MSG treatment caused alterations in these labelings; PARV: the number of the stained cells were reduced; CALB: small alteration in the intensity of the immunoreactivity was observed; CALR: immunoreavtivity was weaker and the number of stained cells was decreased. PACAP or DIAZ treatment counteracted the MSG-induced changes in calcium binding protein immunolabeling. Conversely, the number of the labelled cells and the strength of stained neurons increased. In contrast, we observed that, in retinal ischemia caused by BCCAO the CALB-positive structures completely disappeared. Under this condition, PARV and CALR immonoreactivity patterns were the same as in MSG-treated retinas. After application of PACAP or DIAZ staining of retinas was similar to that of sham eyes, with no alterations in immunoreactivity patterns for the investigated calcium binding proteins. It is known that rod bipolar cells show PKCα-immunoreactivity in the control/shamoperated retinas. The rod bipolar cell is characterized by a tight cluster of dendrites in the


OPL, oval cell body located in the INL, and a vertically directed axon, which expands into clusters of terminals in the IPL. Following MSG injections or ischemia, large and rapid reduction in PKCα intensity was observed. However, in the PACAP or DIAZ administered retinas the total amount of immunoreactivity was similar that of the control/sham-operated slides. GFAP filaments are normally in the inner half of the Müller cells and their endfeet, as in our control/sham preparations, but following trauma to the retina such as excitotoxicity (MSG) or ischemia/hypoxia (BCCAO), GFAP is massively upregulated and found throughout the cell from the OLM to the ILM. The distribution pattern of GFAP in PACAP injected retinas was similar to that of the injured ones. In DIAZ-treated retinas, GFAP immunoreactivity was found at the inner margin of the retina, similarly to the control/sham situations.

DISCUSSION The vertebrate retina uses glutamate as neurotransmitter in a so-called throughpathway (that is, the photoreceptor, bipolar and ganglion cells, connected with synapses in this order). The inner retinal cells, with the exception of ON bipolars, bear functional ionotropic glutamate receptors. Therefore, these cells are all potential targets of MSG toxicity. On the other hand, nearly the same set of neurons bear PACAP receptors. This explains why these cells could be able to survive the excitotoxic injury if PACAP is present in high concentration at the same time of the insult. The IPL remained slightly reduced after combined MSG and PACAP treatment in our experiments. We found that after the second PACAP injection, no further neuroprotection could be achieved with subsequent injection of PACAP. It is possible that repeated injection of PACAP leads to a primed state, which provides a long-lasting protection. In the present study, we also showed that PACAP treatment effectively reduced retinal damage caused by BCCAO in adult male rats. The present morphological findings showed that PACAP protected all inner retinal layers, correlate with previous results which showed the distribution of PAC1 receptor in the retina. This pattern of receptor expression provides basis for the sites of action by intraocular PACAP administration in our present study. Apoptosis plays a major role in several retinal pathologies, including retinal ischemia. Antiapoptotic agents have been shown to attenuate ischemic damage in the retina, including inhibition of caspases. PACAP is a very potent anti-apoptotic agent, which has been shown in


several cell types in vitro, and in the brain in vivo after cerebral ischemia. In the retina, we have recently shown that PACAP inhibits proapoptotic signaling pathways and stimulates anti-apoptotic signaling molecules in MSG-induced retinal damage in vivo. Oxidative stress is thought to play an important role in ischemic retinal cell death. Although the effects of PACAP in retinal oxidative stress has not been investigated yet, PACAP is able to ameliorate oxidative stress-induced apoptosis in neuronal and non-neuronal cells. Mitochondria are involved in many key events of neuronal cell death in the retina. We have recently shown that PACAP inhibits translocation of cytochrome- c and apoptosis inducing factor from the mitochondria and abolished the MSG-induced reduction of phospho-bad. This, along with other observations, indicates that PACAP attenuates the effects of stressors on mitochondria. Another way of interfering with mitochondrial pathways is to alter ion permeability of the mitochondrial membrane. ATP-sensitive K+ channels are located in different parts of the cell, including the inner mitochondrial membrane. The mitochondrial ATP-sensitive K+ channels have been extensively studied in the heart and brain. The selective activation of these channels by means of pharmacological or physiological stimuli has been shown to be cytoprotective against ischemia or chemical stress. This type of neuroprotection represents a new mechanism of protection which is not dependent on blocking glutamatergic receptors or scavanging free radicals. DIAZ treatment also targets the mitochondria and induces a chain of intracellular protective mechanisms. DIAZ is a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel opener that is mostly used as an antihypertensive and antihypoglycemic drug in human therapy and has been applied as a neuroprotective agent in animal studies. When DIAZ is used prior to the insult in vitro, it protects against neuronal cell death induced by oxidative stress or glutamate. In vivo, it has neuroprotective effects in various cerebral ischemic experimental conditions. BCCAO, which was also used in our studies, is mainly applied to induce cerebral hypoperfusion, where the protective effects of DIAZ have been described both using pre- and postischemic administration. Despite the numerous pieces of evidence showing the neuroprotective effects of DIAZ, little is known about its effects in the retina. The mitochondrial ATP-sensitive K+ channels are also present in the retina, where the stimulatory effects of DIAZ have been reported. In vitro, the opening of these channels with different agents, including DIAZ, enhances survival of retinal ganglionic cells and protects retinal neurons against glutamate-induced excitotoxicity. DIAZ has also been shown to inhibit the glutamate-induced mitochondrial depolarization. Our present study provides in vivo evidence that local DIAZ administration attenuates both MSG- and ischemia-induced retinal degeneration. The mechanism could be multiple, including acute cytoprotective effects of the


drug as well as early and late preconditioning. If DIAZ is available for the cells at the time of the ischemia/hypoxia or other kind of depolarization, its protective mechanism can be mediated by reduction of the mitochondrial calcium load. Although the morphological appearance of the two retinal degeneration models is different, our present study shows that DIAZ is able to attenuate the degeneration induced by both MSG and BCCAO. In summary, the present study showed that the severe degeneration of the retinal layers caused by neonatal MSG treatment or BCCAO was significantly attenuated by PACAP or DIAZ, also supported by immunocytochemical observations. PACAP and DIAZ may have further clinical implication in ophthalmic diseases induced by ischemia or excitotoxicity.

Acknowledgements I would like to thank my tutors Róbert Gábriel DSc and Dóra Reglődi MD, PhD who have made it possible to carry out this projects and who always supported my scientific career. I wish to thank Mária Csoknya CSc for her guidance at the whole of my scientific work. I also thank my colleague, István Hernádi PhD for the help in the electrophysiological examination. I express my gratitude the members of our research group Norbert Babai PhD, Krisztina Szabadfi, Péter Kiss MD, Boglárka Rácz PhD, Andrea Tamás MD, PhD and Zsombor Kőszegi. I would also like to acknowledge the help of Ildikó Jacsó and Dóra Molnár in technical support. Financial support from the Gedeon Richter Centenary Foundation (Gedeon Richter Ltd.) is gratefully acknowledged. At last but not at least, this work would have never been realized without the support and help of my family.

PUBLICATIONS

Publications related to the thesis

7. Atlasz, T., Szabadfi, K., Kiss, P., Babai, N., Kőszegi, Zs., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2008) PACAP-mediated neuroprotection of neurochemically identified cell types in MSG-induced retinal degeneration. J. Mol. Neurosci., in press (2007. IF: 1.735)


8. Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Bari, F., Domoki, F., Gábriel, R. (2007) Diazoxide is protective in the rat retina against ischemic injury induced by bilateral carotid occlusion and glutamate-induced degeneration. Neurotox. Res., 12:105-111. (2007. IF: 5.234) 9. Atlasz, T., Babai, N., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Szabadfi, K., Tóth, G., Hegyi, O., Gábriel, R. (2007) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide is protective in bilateral carotid occlusion-induced retinal lesion in rats. Gen. Comp. Endocrin., 153:108-114. (2007. IF: 2.562) 10. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2006) Search for the optimal monosodium glutamate treatment schedule to study the neuroprotective effects of PACAP in the retina. Ann. NY. Acad. Sci., 1070:149155. (2006. IF: 1.93) 11. Rácz, B., Reglődi, D., Kiss, P., Babai, N., Atlasz, T., Gábriel, R., Lubics, A., Gallyas, F.Jr., Gasz, B., Tóth, G., Hegyi, O., Tamás, A. (2006) In vivo neuroprotection by PACAP in excitotoxic retinal injury: review of effects on retinal morphology and apoptotic signal transduction. Int. J. Neuroprot. Neurodeg., 2:80-85. 12. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Tóth, G., Kiss, P., Gábriel, R. (2005) Degree of damage compensation by various PACAP treatments in monosodium glutamate-induced retinal degeneration. Neurotox. Res., 8:227-233. (2005. IF: 1.664) Conference abstracts related to the thesis

15. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Molnár, A., Gábriel, R. (2008) A PACAP és a DIAZOXID neuroprotektív hatása különböző mesterségesen indukált retinadegenerációs modelleken patkányban. 14. Magyar Látás Szimpózium, Pécs, Hungary, oral presentation 16. Atlasz, T., Szabadfi, K., Kiss, P., Reglődi, D., Gaál, V., Tamás, A., Molnár, A., Lubics, A., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of PACAP in several models of neurodegeneration in the rat retina. 4th Pannonian symposium (CNS injury), Pécs, Hungary, poster abstract 17. Atlasz, T., Babai, N., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Reglődi, D., Gábriel R. (2007) The neuroprotective effects of PACAP in glutamate-induced retinal degeneration: immunocytochemical investigations. 8th Symposium on VIP, PACAP, and Related Peptides, Manchester and Burlington, Vermont, USA, poster abstract 18. Gaál, V., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R., Koppán, M., Reglődi, D. (2007) Morphology of the retina in toxic and hypoxic/ischemic retinal degeneration and possible protection by the neuropeptide PACAP in the neonatal rat. Joint Congress of SOE/AAO, Vienna, Austria, poster abstract 19. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Reglődi, D. (2007) Comparison of diazoxide and PACAP as neuroprotective compounds on different


retina degneration models: histological and immuncytochemical investigations III. Neurotoxicity Society Meeting, Pucon, Chile, poster abstract 20. Reglődi, D., Kiss, P., Farkas, J., Szalai, M., Lubics, A., Tamás, A., Lengvári, I., Szőgyi, D., Atlasz, T., Babai, N., Gábriel, R., Koppán, M. (2007) Effects of hypoxic injuries on neurobehavioral development in newborn rats. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, oral presentation 21. Babai, N., Atlasz, T., Kiss, P., Gábriel, R., Bari, F., Domoki, F., Fekete, É., Zorilla, E.P., Reglődi, D. (2007) Különböző neuroprotektív anyagok hatásai retina degenerációs modellekben. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, poster abstract 22. Kiss, P., Atlasz, T., Babai, N., Tamás, A., Schäffer, D., Lubics, A., Reglődi, D., Tóth, G., Hegyi,O., Gábriel, R. (2006) Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) protects rat retina against hypoxic/ischemic injury. 23rd Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Manchester, UK, poster abstract 23. Atlasz, T., Babai, N., Kiss, P., Tamás, A., Reglődi, D., Domoki, F., Bari, F., Gábriel, R. (2006) The neuroprotective effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and diazoxide on the retina: histological investigations. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.2, poster abstract 24. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006) Evaluation of different neurodegeneration models in the rodent retina. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A111.3, poster abstract 25. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Kovács, P., Tamás, A., Reglődi, D. (2006) The effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) on the glutamatergic system: electrophysiological and histological investigations. Int. Brain Res. Org. (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poster abstract 26. Babai, N., Atlasz, T., Schäffer, D., Reglődi, D., Tamás, A., Kiss, P., Szalai, M., Gábriel, R. (2006) Comparison of three different neurodegeneration models in the rat retina: monosodium-glutamate (MSG), hypoxic insult combined with unilateral carotis occlusion and bilateral carotis occlusion. Int. Brain Res. Org. (IBRO) Workshop, Budapest, Hungary, Vol. 59(S1)1-72, poster abstract 27. Babai, N., Atlasz, T., Tamás, A., Reglődi, D., Gábriel, R. (2005) Degree of damage compensation by various PACAP treatment regimes in monosodium glutamateinduced retinal degeneration. VIIth International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Rouen, France, poster abstract 28. Kőszegi, Zs., Kovács, P., Atlasz, T., Reglődi, D., Tamás, A., Tóth, G., Hernádi, I., Gábriel, R. (2005) In vivo iontophoretically applied PACAP blocks the excitatory effects of kainic acid. VIIth International Symposium on VIP, PACAP and Related Peptides, Rouen, France, poster abstract


Publications not related to the thesis

5. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Molnár, A., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) Effects of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP1-38) and its fragments on retinal degeneration induced by neonatal MSG treatment. Ann. NY. Acad. Sci., in press (2007. IF: 1.731) 6. Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Babai, N., Tamás, A., Reglődi, D., Kovács, P., Hernádi, I., Gábriel, R. (2006) Microiontophoretically applied PACAP blocks excitatory effects of kainic acid in vivo. Ann. NY. Acad. Sci., 1070:143-148. (2006. IF: 1.93) 7. Atlasz, T., Kellényi, L., Kovács, P., Babai, N., Thuróczy, G., Hejjel, L., Hernádi, I. (2006) The application of surface plethysmography for heart rate variability analysis after GSM radiofrequency explosure. J. Biochem. Biophys. Methods, 69:233-236. (2006. IF: 1.403) 8. Kőszegi, Zs., Kovács, P., Wilhelm, M., Atlasz, T., Babai, N., Kállai, V., Hernádi, I. (2006) Microiontophoretic investigation of the effects of mast cells on neurons in the rat brain in vivo. J. Biochem. Biophys. Methods, 69:227-231 (2006. IF: 1.403) Conference abstracts not related to the thesis

27. Szabadfi, K., Atlasz, T., Reglődi, D., Kiss, P., Dányádi, B., Szabó, K., Molnár, A., Tamás, A., Fekete, É., Zorrilla, EP., Gábriel, R. The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration. 24th Conf. Europ. Comp. Endocrinologists (CECE), Genova, Italy, P86, poster abstract 28. Gaál, V., Atlasz, T., Reglődi, D., Szabadfi, K., Hamza, L., Ságvári, O., Kiss, P., Márton, Zs.,Tamás, A., Lubics, A., Gábriel, R. A hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) protektív hatása UV-besugárzás indukálta retinális degenerációban. A Magyar Szemorvostársaság 2008. évi Kongresszusa, Pécs, Hungary, poster abstract

29. Atlasz, T., Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Tóth, G., Molnár, A., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of PACAP-fragments in MSG-induced neurodegeneration in rat retina. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P8, poster abstract 30. Szabadfi, K., Atlasz, T., Reglődi, D., Kiss P., Tamás, A., Dányádi, B., Fekete, É.M., Zorrilla, E. P., Szabó, K., Gábriel, R. (2008) The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration: histological and immuncytochemical preparations. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P16, poster abstract


31. Kiss, P., Horváth, G., Farkas, J., Szőgyi, D., Szabadfi, K., Atlasz, T., Tamás, A., Falko, F., Németh, J., Lubics, A., Gábriel, R., Reglődi, D. (2008) Ingergazdag környezet hatása az újszülött patkányok idegrendszeri fejlődésére. MÉT LXXII. Debrecen, Hungary, P68, poster abstract 32. Farkas, J., Kiss, P., Horváth, G., Szőgyi, D., Falko, F., Németh, J., Gaszner, B., Szabadfi, K., Atlasz, T., Tamás, A., Gábriel, R., Reglődi, D. (2008) Maternális depriváció hatása az újszülött patkányok idegrendszeri fejlődésére. MÉT LXXII., Debrecen, Hungary, P37, poster abstract 33. Szabadfi, K., Reglődi, D., Kiss, P., Tamás, A., Babai, N., Hamza, L., Gábriel, R., Fekete, É.M., Zorrilla, E.P., Atlasz, T. (2008) The neuroprotective effects of urocortin in bilateral common carotid artery occlusion induced retinal degeneration. IBRO International Workshop, Debrecen, Hungary, P138, poster abstract 34. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Hohmann, J., Hernádi, I.: Az Aconitum alkaloid szongorin GABA-A receptoron kifejtett hatása. A MGYT Gyógynövény Szakosztályának rendezvénye, Szeged, Hungary, oral presentation 35. Szabadfi, K., Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Csupor, D., Kovács, P., Hohmann, J., Hernádi, I. (2007) Fiziológiai hatású Aconitum-alkaloidok in vivo vizsgálata patkány központi idegrendszerében. A MGYT Gyógynövény Szakosztályának rendezvénye, Szeged, Hungary, poster abstract 36. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Hohmann, J., Hernádi I. (2007) Aconitum alkaloid songorine acts as a potent gabaa receptor agonist in the rat brain in vivo. Polish Neuroscience Society 8th International Congress, Krakow, Poland, P9.05, poster abstract 37. Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Szabadfi, K., Hohmann, J., Hernádi I. (2007) Akonitum alkaloid songorine GABAA receptorokon kifejtett hatása patkányban, in vivo. MÉT LXXI. Vándorgyűlése, Pécs, Hungary, P68, poster abstract 38. Németh, Á., Ajtay, Z., Atlasz, T., Hejjel, L., Hernádi, I., Thuróczy, Gy., Kellényi, L. (2007) Szívfrekvencia-variabilitás (HRV) elemzése GSM mobiltelefon rádiófrekvenciás (RF) sugárzásának hatására fiatal felnőttekben és idősebb szívműtötteknél. MÉT LXXI. Vándorgyűlése, Pécs, Hungary, P70, poster abstract 39. Kőszegi, Zs., Kállai, V., Atlasz, T., Babai, N., Kovács, P., Vecsei, Zs., Wilhelm, M., Hernádi I. (2007) The effects of mast cell degranulation on neuronal activity in the thalamus of normal and ovariectomized rats. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, P2, poster abstract 40. Szabadfi, K., Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Csupor, D., Kovács, P., Hohmann, J., Hernádi, I. (2007) Fiziológiailag aktív aconitum-alkaloidok neuronális hatásának in vivo vizsgálata patkány központi idegrendszerében. Hung. Neurosci. Assoc.Conf. (MITT) XI., Szeged, Hungary, P7, poster abstract 41. Gomes, J.R., Melo, CV., Atlasz, T., Reglődi D., Gábriel, R., Duarte, CB. (2006) Calpain cleaves the vesicular GABA transporter (VGAT) into a new stable form, under


excitotoxic conditions and in vivo ischaemia. XVth National Congress of Biochemistry, Aveiro, Portugal, poster abstract 42. Szabadfi, K., Atlasz, T., Csupor, D., Kőszegi, Zs., Kovács, P., Babai, N., Hohmann, J., Hernádi, I. (2006) In vivo electrophysiological effects of aconitum alcaloids in the mammalian brain. MÉT LXX. Vándorgyűlése, Szeged, Hungary, P15, poster abstract 43. Uzsoki, B., Tóth, M., Vas, G., Kovács, L., Atlasz, T., Hernádi, I. (2006) Novelty-response of rats determines the behavioural effects of the alpha-2A agonist guanfacine. MÉT LXX. Vándorgyűlése, Szeged, Hungary, P78, poster abstract 44. Uzsoki, B., Tóth, M., Kovács, L., Vass, G., Atlasz, T., Hernádi, I. (2006) Reverse effects of the alpha-2A adrenoceptor anagonist guanfacine on the anxiety of different novelty-responder rats. 5th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Vienna, Austria, A161.24, poster abstract 45. Atlasz, T., Kovács P., Uzsoki B., Babai N., Hernádi, I. (2006) A yohimbin specifikus alfa 2-A/D noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. A Magyar Tudomány Ünnepe, Természettudományi PhD kiállítás, Pécs, Hungary, poster abstract 46. Atlasz, T., Kovács, P., Kellényi, L., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Babai, N., Hernádi I. (2005) The effects of GSM mobile phones on heart rate and heart rate variability in young adults. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Austria, Graz, poster abstract 47. Kovács, P., Kőszegi, Zs., Atlasz, T., Hernádi, I., Wilhelm, M. (2005) Mast cells modulate neuronal activity in the thalamus of the rat. 8th Symposium on Instrumental Analysis, Austria, Graz, poster abstract 48. Kovács, P., Atlasz, T., Kőszegi, Zs., Kállai, V., Molnár, D., Hernádi, I., Wilhelm, M. (2005) Changing estrogen level modifies mast cell-neuron interactions in the rat thalamus. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) X., Pécs, Hungary, Clin.Neurosci./Ideggy. Szle., Vol. 58, suppl 1, p1-112, poster abstract

49. Kellényi, L., Kovács, P., Atlasz, T., Thuróczy, Gy., Ajtay, Z., Hejjel, L., Hernádi, I. (2005) The effects of GSM mobile phones on the autonomic regulation of the heart in young adults. Hung. Neurosci. Assoc. Conf. (MITT) X., Pécs, Hungary, Clin.Neurosci./Ideggy. Szle., Vol. 58, suppl 1, p1-112, poster abstract 50. Kovács, P., Atlasz, T., Hernádi, I. (2004) The action of alpha-2 adrenergic agents on the firing properties of prefrontal cortical neurons in the rat in vivo: a combined electrochemical and electrophysiological study. 4th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Lisbon, Portugal, Abstr., Vol. 2, A011.1, poster abstract 51. Uzsoki, B., Kovács, P., Atlasz, T., Hernádi, I. (2003) Does yohimbine act as a subtype specific presynaptixc alpha-2A(D) adrenoceptor antagonist? In vivo


electrophysiological and behavioural studies in rats. Europ. Behav. Pharmacol Soc. (EBPS) X. meeting, Antwerp, Belgium, Vol. 14, suppl 1, p33, poster abstract 52. Atlasz, T., Babai, N., Uzsoki, B, Kovács, P., Hernádi, I. (2003) A yohimbin specifikus preszinaptikus alfa-2A/D noradrenerg receptor antagonistaként hat: elektrofiziológiai és magatartási bizonyítékok. MITT IX., Balatonfüred, Hungary, Clin. Neurosci./Ideggy. Szle., Vol. 56, suppl 2, poster abstract

Cumulative impact factor: 34.386 Impact factor of publications: 19.592 Impact factor of publications related to the thesis: 13.125 All citation: 23 Cited by others: 7


PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM. Különböző neuroprotektív anyagok hatásainak vizsgálata retinadegenerációs modelleken patkányban

Recommend Documents